JP5371778B2 - 白血病細胞の検出方法 - Google Patents

Description

本発明は、白血病、特に急性白血病の検出方法、及び白血病の検出に用いるキットに関する。

白血病は、腫瘍化した造血細胞が無制限に増殖して血液中に出現するという、血液の悪性腫瘍に属する疾患である。赤血球系や血小板系の細胞が腫瘍化したものもあるが、多くは白血球系の細胞が腫瘍化したものであり、こうした疾患をまとめて白血病と呼ばれている。白血病には、血液細胞の分化あるいは成熟のある一定の段階で分化が停止して、それより上流の未分化な芽球細胞が増殖することにより腫瘍を構成している場合と、生体の調節能を逸脱し自律性増殖を示すものの、一応分化あるいは成熟する能力を保持している場合とがあり、前者には急性白血病が、後者には慢性白血病あるいは骨髄異形成症候群（ｍｙｅｌｏｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ；ＭＤＳ）が該当する。白血病の原因と発症機序の多くは不明であるが、早期発見と措置が治療にとって極めて重要である。

白血病の診断には、血中細胞の形態学的観察、染色体検査、又はフローサイトメトリーを用いた血中細胞の表面抗原解析検査などによって行われる。また、染色体異常や遺伝子異常を伴う白血病については、疾患特異的なプライマーを用いたＰＣＲあるいはＲＴ−ＰＣＲも行われている。さらに、ウイルムス腫瘍遺伝子１（ＷＴ−１）の定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果が白血病における腫瘍細胞の量を反映するという報告がなされている（非特許文献１）。

前記の通り、白血病の治療にあたっては、その早期発見、具体的には白血病または白血病細胞の早期検出が重要である。また治療を実行する上で、血液等、特に骨髄液に腫瘍細胞（微小残存腫瘍：ＭＲＤ）が残存しているか、さらにどのくらい残存しているかという情報は、治療効果の判定あるいはその後のさらなる治療方針を決定する上で、極めて重要である。

しかしながら、血中細胞の形態学的観察は、腫瘍細胞量が相当量に達したときにはじめて腫瘍細胞の存在を確認することが可能となるため、早期発見にも残存する腫瘍細胞の検出にも適しているとは言えない。またフローサイトメトリーを用いた血中細胞の表面抗原解析検査は、その良好な検出感度等から腫瘍細胞の早期発見等に有効であると期待できるが、腫瘍細胞に特異的な、かつ診断時に腫瘍細胞表面に存在している細胞表面抗原の組み合わせを選択する必要がある。さらに、ウイルムス腫瘍遺伝子１（ＷＴ−１）の定量的ＲＴ−ＰＣＲは、当該遺伝子の発現量が確認されない症例も報告されている。

以上のように、白血病の簡便かつ正確な検査方法、特に多くの白血病に共通して、定量性があり、かつ偽陽性の少ない検査方法の確立は、依然として望まれている。

K. Inoue et al., Blood, 84（9）3071-3079（1994）

本発明は、白血病、特に急性白血病における選択的マーカーを用いて、定量性があり、かつ偽陽性の少ない簡便かつ正確な、白血病又は白血病細胞の検出方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、ＣＤ３４陽性細胞が腫瘍化した白血病に関して、正常なＣＤ３４陽性細胞で観察されるＤＯＣＫ１８０の発現が、腫瘍化したＣＤ３４陽性細胞では低下ないし消失する傾向があることを見いだし、かかる知見に基づいて、下記の各発明を完成した。

（１）血液検体においてＤＯＣＫ１８０の発現が陰性であるＣＤ３４陽性細胞を検出することを含む、白血病細胞の検出方法。

（２）抗ＣＤ３４抗体と抗ＤＯＣＫ１８０抗体を用いた免疫学的検出法によってＤＯＣＫ１８０の発現が陰性であるＣＤ３４陽性細胞を検出する、（１）に記載の白血病細胞の検出方法。

（３）白血病細胞が急性白血病細胞である、（１）又は（２）に記載の白血病細胞の検出方法。

（４）急性白血病細胞が急性リンパ性白血病細胞である、（３）に記載の白血病細胞の検出方法。

（５）抗ＤＯＣＫ１８０抗体を含む、白血病細胞検出用キット。

（６）さらに抗ＣＤ３４抗体を含む、（５）に記載のキット。

（７）血液検体においてＤＯＣＫ１８０の発現が陰性であるＣＤ３４陽性細胞を検出し、ＤＯＣＫ１８０の発現が正常であるＣＤ３４陽性細胞に対する前記ＤＯＣＫ１８０の発現が陰性であるＣＤ３４陽性細胞の比率を測定することを含む、白血病の進行度又は退行度を検査する方法。

（８）抗ＣＤ３４抗体と抗ＤＯＣＫ１８０抗体を用いた免疫学的検出法によって、ＤＯＣＫ１８０の発現が正常であるＣＤ３４陽性細胞とＤＯＣＫ１８０の発現が陰性であるＣＤ３４陽性細胞の検出を行う、（７）に記載の検査方法。

（９）白血病が急性白血病である、（７）又は（８）に記載の検査方法。

（１０）急性白血病が急性リンパ性白血病である、（９）に記載の検査方法。

（１１）抗ＤＯＣＫ１８０抗体を含む、白血病の進行度又は回復度の検査用キット。

（１２）さらに抗ＣＤ３４抗体を含む、（１１）に記載の検査用キット。

（１３）血液検体中のＣＤ３４陽性細胞におけるＤＯＣＫ１８０の発現量を測定することを含む、白血病の検出方法。

（１４）健常な血液検体中のＣＤ３４陽性細胞におけるＤＯＣＫ１８０の発現量を指標値として、血液検体中のＣＤ３４陽性細胞におけるＤＯＣＫ１８０の発現量を測定する、（１３）に記載の白血病の検出方法。

（１５）白血病が急性白血病である、（１３）又は（１４）に記載の白血病の検出方法。

（１６）急性白血病が急性リンパ性白血病である、（１５）に記載の白血病の検出方法。

（１７）抗ＤＯＣＫ１８０抗体又はＤＯＣＫ１８０をコードするＤＮＡにハイブリダイズする核酸を含む、白血病検出用キット。

（１８）さらに抗ＣＤ３４抗体を含む、（１７）に記載のキット。

（１９）血液検体中のＣＤ３４陽性細胞におけるＤＯＣＫ１８０の発現量を測定することを含む、白血病の進行度又は退行度を検査する方法。

（２０）健常な血液検体中のＣＤ３４陽性細胞におけるＤＯＣＫ１８０の発現量を指標値として、血液検体中のＣＤ３４陽性細胞におけるＤＯＣＫ１８０の発現量を測定する、（１９）に記載の白血病の進行度又は退行度を検査する方法。

（２１）白血病が急性白血病である、（１９）又は（２０）に記載の白血病の進行度又は退行度を検査する方法。

（２２）急性白血病が急性リンパ性白血病である、（２１）に記載の白血病の進行度又は退行度を検査する方法。

本発明は、白血病、特に急性白血病の腫瘍細胞に対してＤＯＣＫ１８０の特異的な発現パターンを確認することで、医師による白血病の診断、その重傷度や回復度を診察、診断する上で有益な情報を、血液検体を対象にして簡便な方法で得て、提供することができる。

定量ＲＴ−ＰＣＲ法により測定した２９３Ｔ細胞におけるＤＯＣＫ１８０ｍＲＮＡの発現量を１０００ｕｎｉｔｓとしたときの、各種細胞におけるＤＯＣＫ１８０ｍＲＮＡの相対的発現量を表したグラフである。数値は平均値と標準偏差（正方向のみ）で示した。 実施例で調製した各種細胞に対する、抗ＤＯＣＫ１８０抗体を用いたイムノブロッティングの結果を表した図（写真）である。２９３Ｔ細胞は陽性コントロール、Ｊｕｒｋａｔ細胞は陰性コントロールとしてそれぞれ用いた。 定量ＲＴ−ＰＣＲ法により測定した２９３Ｔ細胞におけるＤＯＣＫ１８０ｍＲＮＡの発現量を１０００ｕｎｉｔｓとしたときの、初発ＣＤ３４陽性急性リンパ性白血病（ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ；ＡＬＬ）症例３例、再発ＣＤ３４陽性ＡＬＬ症例４例、初発ＣＤ３４陽性急性骨髄性白血病（ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ；ＡＭＬ）症例１４例、再発ＣＤ３４陽性ＡＭＬ症例２例、再発ＣＤ３４陽性慢性骨髄性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ；ＣＭＬ）急性転化症例２例、合計２５例の腫瘍細胞におけるＤＯＣＫ１８０ｍＲＮＡの相対的発現量を表した表である。 定量ＲＴ−ＰＣＲ法により測定した２９３Ｔ細胞におけるＤＯＣＫ１８０ｍＲＮＡの発現量を１０００ｕｎｉｔｓとしたときの、初発ＣＤ３４陽性ＡＬＬ症例３例、再発ＣＤ３４陽性ＡＬＬ症例４例、初発ＣＤ３４陽性ＡＭＬ症例１４例、再発ＣＤ３４陽性ＡＭＬ症例２例、再発ＣＤ３４陽性ＣＭＬ急性転化症例２例、合計２５例の腫瘍細胞におけるＤＯＣＫ１８０ｍＲＮＡの相対的発現量を表したグラフである。 白血病に対する治療を行って寛解した患者のＣＤ３４陽性細胞におけるＤＯＣＫ１８０の発現量の変化を定量ＲＴ−ＰＣＲ法により測定した結果を表したグラフである。

本発明は、血液検体中のＣＤ３４陽性細胞におけるＤＯＣＫ１８０の発現を確認、検出、ないし定量化することを要素とする、すなわちＤＯＣＫ１８０タンパク質またはそれをコードする遺伝子の発現を、白血病に関する診断用マーカーとして使用する方法に関する発明である。その様な本発明の一態様は、血液検体においてＤＯＣＫ１８０の発現が陰性であるＣＤ３４陽性細胞を検出することを含む、白血病細胞の検出方法である。前記したように、ＣＤ３４陽性細胞が腫瘍化した細胞の多くにおいて、ＤＯＣＫ１８０の発現が、正常なＣＤ３４陽性細胞と比較して低下ないし消失する傾向が認められる。このことは、ＤＯＣＫ１８０の発現が陰性であるＣＤ３４陽性細胞は腫瘍化した細胞であると判断することができることを意味する。したがって、その様な腫瘍化したＣＤ３４陽性細胞を血液検体、特に骨髄液検体において検出されたという本発明の方法における結果は、医師が、検体が白血病に罹患しているか否かを判断する上での有益な情報となる。

また本発明の別態様は、血液検体、特に骨髄液検体においてＤＯＣＫ１８０の発現が陰性であるＣＤ３４陽性細胞を検出し、ＤＯＣＫ１８０の発現が正常であるＣＤ３４陽性細胞に対する前記ＤＯＣＫ１８０の発現が陰性であるＣＤ３４陽性細胞の比率を測定することを含む、白血病の進行度や退行度を検査する方法である。例えば、血液検体、特に骨髄液検体の単位体積あたりに含まれるＣＤ３４陽性細胞の総数における、ＤＯＣＫ１８０の発現が陰性であるＣＤ３４細胞の割合に関する測定結果は、その検体における白血病の進行度や退行度を表すものであり、医師が患者の白血病の重症度や回復具合を診断する上で、より有益かつ客観的な判断材料となる。

さらに本発明は、血液検体、特に骨髄液検体中のＣＤ３４陽性細胞におけるＤＯＣＫ１８０の発現量を測定することを含む、白血病の検出方法を提供する。この方法は、血液検体、特に骨髄液検体中のＤＯＣＫ１８０の発現が陰性であるＣＤ３４陽性細胞を検出する代わりに、例えば単位体積中のＣＤ３４陽性細胞全体におけるＤＯＣＫ１８０の発現量を測定するものである。特にその測定値が、健常検体のＣＤ３４陽性細胞におけるＤＯＣＫ１８０の発現量を指標値とした場合に低下している又は低下後に上昇していることは、検査された検体にＤＯＣＫ１８０の発現が陰性であるＣＤ３４陽性細胞、あるいはＤＯＣＫ１８０の発現が正常である細胞が含まれていることを意味する。したがってその様な結果は、医師が、患者が白血病に罹患しているか否か、あるいは寛解しているか否かを判断するための材料となる。すなわち、ＣＤ３４陽性細胞におけるＤＯＣＫ１８０の発現量の度合を定量的に測定することにより、白血病の進行度や退行度を検査することができる。その検査結果は、医師が患者の白血病の重症度又は回復具合を診断する上で、より有益かつ客観的な判断材料となる。

本発明における「血液検体」は、骨髄液、静脈から採取された末梢血、及びそれらをＮｉｓｈｉｏら（Ｂｌｏｏｄ、２００５年、第１０６巻、第１０１２−１０２０頁）に記載の方法に準じ、遠心分離処理及び血球画分を調製する際の公知の化学的処理を施して、ＣＤ３４陽性細胞を含む血球画分検体としたもの、などを包含する用語である。本発明における血液検体の好ましい態様は骨髄液であり、特に好ましい態様は骨髄液から分画された血球画分検体である。

ＣＤ３４陽性細胞とは、細胞の表面に糖蛋白質ＣＤ３４を高発現している造血前駆細胞である。ＣＤ３４陽性細胞は血液、特にさい帯血、骨髄液などに含まれており、これらからＮｉｓｈｉｏら（Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ、２００１年、第２９巻、第１９−２９頁）に記載の方法に準じて検出ないし分離することが出来る。またＣＤ３４陽性細胞を血液等から分離する装置、例えばアイソレックス^ＴＭ３００ｉ（タカラバイオ）を用いて分離することも出来る。

また本発明においてＤＯＣＫ１８０とは、前癌遺伝子の発現産物であるＣｒｋ蛋白に結合する、高等真核動物細胞の増殖を制御するタンパク質の一種である。またＤＯＣＫ１８０は、Ｒａｃと呼ばれる、低分子量Ｇタンパク質を活性化するグアニンヌクレオチド交換因子（Ｇｕａｎｉｎｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｆａｃｔｏｒ、ＧＥＦ）の一つとしても知られている。ＤＯＣＫ１８０をコードするＤＮＡは既にクローニングされ、その塩基配列ならびにＤＯＣＫ１８０のアミノ酸配列も決定されている（例えば、特許文献１：特開平８−１９６２７７号公報）。

Ｃｒｋ蛋白とＤＯＣＫ１８０の結合が細胞増殖能を活性化することが明らかにされて以来、ＤＯＣＫ１８０蛋白は、Ｃｒｋ蛋白を発現する癌細胞の診断指標として、また各種抗癌剤によるミサイル療法等の標的として、注目されていた。本発明者らは、従来の報告とは異なり、白血病細胞、特にＣＤ３４陽性細胞が腫瘍化した細胞の多くが、ＤＯＣＫ１８０の発現が陰性である腫瘍細胞であることを見いだした。

本発明にいうＣＤ３４細胞においてＤＯＣＫ１８０の発現が陰性であるとは、ＤＯＣＫ１８０の発現が低下ないし消失している、具体的には遺伝子やタンパク質の発現を確認するための一般的な手法、例えば免疫学的検出法、あるいはハイブリダイゼーションやＰＣＲ等の遺伝子工学的手法を、通常の感度を伴って利用しても、ＣＤ３４陽性細胞においてＤＯＣＫ１８０タンパク質あるいはＤＯＣＫ１８０をコードするｍＲＮＡが確認できない、あるいは正常なＣＤ３４陽性細胞におけるＤＯＣＫ１８０の発現量を基準としたときに、ＤＯＣＫ１８０タンパク質あるいはＤＯＣＫ１８０をコードするｍＲＮＡの発現量が５０％以下、好ましくは３０％以下、より好ましくは１０％以下、更に好ましくは５％以下であることを包含する意味である。また本発明にいう正常なＣＤ３４陽性細胞及びＣＤ３４細胞においてＤＯＣＫ１８０の発現が正常であるとは、白血病に罹患していない、すなわち腫瘍化していないＣＤ３４細胞、及び当該ＣＤ３４陽性細胞においてＤＯＣＫ１８０が発現している状態ないしその発現量を意味する。

また、本発明においてＤＯＣＫ１８０と呼ぶときは、前記特許文献１に具体的に記載されているアミノ酸配列からなるタンパク質の他、いわゆる一塩基多形によってそのアミノ酸配列の一部が置換等されたＤＯＣＫ１８０が存在するときは、かかる多形型のＤＯＣＫ１８０も包含するものとして理解される。

本発明における白血病又は白血病細胞は、急性白血病（骨髄性、リンパ性のいずれも含む）、慢性白血病（慢性骨髄性白血病ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ；ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ；ＣＬＬ）のいずれも含む）、赤白血病、又は血小板血病などの白血病とその腫瘍細胞の他、骨髄異形成症候群（ｍｙｅｌｏｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ；ＭＤＳ）とその細胞であり、特に急性骨髄性白血病（ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ；ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ；ＡＬＬ）と腫瘍化した白血球を意味する。

本発明の方法におけるＤＯＣＫ１８０の発現の検出手段あるいは発現量の測定手段は、ＣＤ３４陽性細胞におけるＤＯＣＫ１８０タンパク質及び／又はＤＯＣＫ１８０をコードするｍＲＮＡを的確に検出あるいはその量を定量することができる手段である限り、特に限定されないが、ＤＯＣＫ１８０タンパク質に対する免疫学的検出手段、あるいはＤＯＣＫ１８０をコードするｍＲＮＡに対する遺伝子工学的検出手段を利用することが好ましい。

免疫学的検出手段を利用したＤＯＣＫ１８０タンパク質の検出方法あるいは発現量の測定方法では、抗ＤＯＣＫ１８０タンパク質抗体、特に抗ＤＯＣＫ１８０抗体と抗ＣＤ３４タンパク質抗体とを組み合わせて使用することが好ましい。係る抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆａｂ断片その他の、「抗体」として当業者に理解される全ての生体分子を利用することができる。特にモノクローナル抗体の利用が特に好ましい。

モノクローナル抗体の作成は、当業者に知られた種々のモノクローナル抗体作成技術を利用して行えばよい。典型的には、前記特許文献１に記載される配列情報を利用して、当業者に知られた遺伝子工学的手法により組み換えＤＯＣＫ１８０タンパク質や組み換えＣＤ３４タンパク質を作成し、これを抗原として動物に接種する一般的な手法にしたがって得られる抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを基にハイブリドーマを調製し、モノクローナル抗体を産生させる、というものである。また、ＤＯＣＫ１８０タンパク質やＣＤ３４タンパク質のアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチドを抗原として使用してもよい。また既に市販化されている抗ＤＯＣＫ１８０タンパク質抗体や抗ＣＤ３４タンパク質抗体を用いてもよい。

免疫学的検出手段を利用した本発明において使用する抗体は、標識物質で標識することが好ましい。標識物質は、その標識物質単独で、又はその標識物質と他の物質とを反応させることにより検出可能なシグナルをもたらす物質であり、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、アルコール脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、ペニシリナーゼ、カタラーゼ、アポグルコースオキシダーゼ、ウレアーゼ、ルシフェラーゼ若しくはアセチルコリンエステラーゼ等の酵素、フルオレスセインイソチオシアネート、フィコビリタンパク、希土類金属キレート、ダンシルクロライド若しくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート等の蛍光物質、^１２５Ｉ、^１４Ｃ、^３Ｈ等の放射性同位体、ビオチン、アビジン若しくはジゴケシゲニン等の化学物質、又は化学発光物質等を挙げることができる。これらの標識物質による抗ＤＯＣＫ１８０抗体の標識方法は、選択すべき標識物質の種類に応じて、既に公知となっている標識方法を適宜用いて行えばよい。

また、本発明は上記の抗体（標識されたものを含む）を不溶性担体に固定化した固定化抗体として利用することも出来る。不溶性担体としては、一般的に用いられている各種の不溶性担体、例えば、マイクロプレートに代表されるプレート、試験管、チューブ、ビーズ、ボール、フィルター、メンブレン、あるいはセルロース系担体、アガロース系担体、ポリアクリルアミド系担体、デキストラン系担体、ポリスチレン系担体、ポリビニルアルコール系担体、ポリアミノ酸系担体、あるいは多孔性シリカ系担体等のアフィニティークロマトグラフィーにおいて用いられる不溶性担体、等が例示することができる。また、これらの不溶性担体に対する抗体の固定化方法は、不溶性担体ごとに既に確立している方法を利用して行えばよい。

免疫学的検出手段を利用したＤＯＣＫ１８０タンパク質の検出方法あるいは発現量の測定方法としては、エンザイムイムノアッセイ法、ラジオイムノアッセイ法、フローサイトメトリーによる解析、ウエスタンブロット法等を挙げることができる。それぞれの方法の原理、さらには詳細な条件、操作手順、抗原抗体複合体の検出方法などは、使用される抗体を検出対象に応じて変更することの他は、当業者に広く知られており、本発明でもその様な条件や操作に基づいて各種方法を行うことが出来る。

本発明では、抗ＣＤ３４抗体と抗ＤＯＣＫ１８０抗体とを用いたイムノアッセイ、特に当該２種の抗体を用いたフローサイトメトリーを利用したイムノアッセイが好ましい。フローサイトメトリーを用いることによって、ＤＯＣＫ１８０の発現が陰性のＣＤ３４陽性細胞とＤＯＣＫ１８０の発現が正常なＣＤ３４陽性細胞とを的確に判別し、さらに簡便に両者を分離することができ、本発明の方法又はその一部を自動化あるいは半自動化することも可能である。フローサイトメトリー法の詳細については、例えば山下（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｏｒｙ、免疫研究法ハンドブック、１９９６年、２版、第２４７−２６２頁、中外医学社）に記載されており、本願にその内容の全てが取り込まれる。

遺伝子工学的検出手段を利用したＤＯＣＫ１８０の発現の検出方法あるいは発現量の測定方法は、血液検体において発現しているＤＯＣＫ１８０をコードするｍＲＮＡを検出あるいは定量化する方法であればよく、サザンハイブリダイゼーションや、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、定量的ＰＣＲ等のＰＣＲ技術を利用することができる。好ましい方法はＰＣＲ、特に好ましくはＲＴ−ＰＣＲによる定量的ＰＣＲである。

典型的には、公知の方法に従って血液検体から抽出される全ＲＮＡに対して、あるいは全ＲＮＡから選別されたｍＲＮＡに対して、ＤＯＣＫ１８０をコードする塩基配列に対応するポリヌクレオチドを増幅用プライマーとして用いたＰＣＲ、例えばＲＴ−ＰＣＲを行って、ＤＯＣＫ１８０をコードするｃＤＮＡを増幅し、得られた増幅産物の有無やその量を定量化するというものである。上記のＰＣＲ技術は、例えば前記特許文献１に記載された塩基配列を基にして増幅用プライマーの塩基配列の設計することも含め、全て当業者により広く知られた技術であり、本発明の方法も、かかる広く知られた方法を適用して行うことができる。また、ＰＣＲ法による遺伝子発現の検出或いは定量化に際しては、様々な工夫を有するＰＣＲ法が多数報告されており、本発明ではその様な方法を利用してもよい。

本発明は、上記に説明した各種方法に対して利用するための、抗ＤＯＣＫ１８０タンパク質抗体及び／又はＤＯＣＫ１８０をコードするＤＮＡに特異的にハイブリダイズする核酸を含むキットも提供する。当該キットは抗ＣＤ３４抗体を更に含むことが好ましい。また本発明のキットは、二次抗体、標識物質その他の免疫学的検出手段の実施に有用な物質、又は緩衝液、ＤＮＡポリメラーゼその他の遺伝子工学的検出手段の実施に有用な物質をキットの構成物として含んでいてもよい。

以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、これらの実施例により、本発明の技術的範囲が限定されるものではない。

＜試薬類＞
組み換え型ヒト顆粒コロニー刺激因子（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ、以下、ｒｈＧ−ＣＳＦと表す）は中外製薬から購入した。インターロイキン−３（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−３、以下、ＩＬ−３と表す）及び幹細胞因子（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒ、以下、ＳＣＦと表す）はＰｅｐｒｏＴｅｃｈから購入した。フィコエリスリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ、以下、ＰＥと表す）標識抗ヒトＣＤ１４抗体はＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒから、フルオレセイン−イソチオシアネート（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ、以下、ＦＩＴＣと表す）標識抗ヒトＣＤ３４抗体はＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。またネガティブコントロールは、それに対応するクラスの抗体をＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎから購入した。抗ＤＯＣＫ１８０抗体、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ抗体及びヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰはＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから、抗β−アクチン（β−ａｃｔｉｎ）抗体はＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨからそれぞれ購入した物を使用した。

＜実施例１＞
（１）単核細胞の回収およびヒトＣＤ３４陽性細胞の回収
倫理規定に基づいた同意を得て採取した健常人の骨髄液と末梢血それぞれから、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いた比重遠心法で、骨髄液由来の単核細胞（ＢＭ−ＭＮＣ）と末梢血由来の単核細胞（ＰＢ−ＭＮＣ）を分離した。また、倫理規定に基づいた同意を得た健常人成人に５μｇ／ｋｇのｒｈＧ−ＣＳＦを５日間連日皮下投与して、ヒトＣＤ３４陽性細胞を動員した後に末梢血を採取し、血球分離装置を用いて白血球画分を回収し、液体窒素を用いて凍結保存した。以下、回収した白血球画分をアフェレーシスプロダクト（ＡＰ）と表す。さらに、凍結保存したＡＰから、比重遠心法で単核細胞（ＡＰ−ＭＮＣ）を分離した。

ＢＭ−ＭＮＣから、抗ＣＤ３４磁気ビーズ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）と磁気細胞分離システム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて、ヒトＣＤ３４陽性細胞（ＢＭ−ＣＤ３４）を純化、回収した。また同様にしてＡＰ−ＭＮＣからヒトＣＤ３４陽性細胞（ＡＰ−ＣＤ３４）を純化、回収した。

さらに、倫理規定に基づいた同意を得て採取した健常人の末梢血を、湯尾（好中球、血液・腫瘍科、２０００年、第４０巻、第１０−１６頁、科学評論社）に記載された方法に従って、１％デキストラン生理食塩水と混和させ３０分間室温にて放置し、分離した上層の浮遊液をＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅを用いた比重遠心法で顆粒球と赤血球の分画を分離回収した後、赤血球を溶血させ除去し、顆粒球（ＧＣ）のみを採取した。

（２）フローサイトメトリー解析
（１）で回収したＢＭ−ＣＤ３４、ＡＰ−ＣＤ３４及び急性骨髄性白血病と診断された患者の骨髄血由来のＣＤ３４陽性細胞（ＡＭＬ−ＣＤ３４）それぞれを、０．５％牛血清アルブミンを添加したｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ＲＰＭＩ１６４０培地（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）に１×１０^６細胞／ｍＬの濃度で懸濁させた後、２０μｇ／ｍＬのＰＥ抗ヒトＣＤ１４抗体、２０μｇ／ｍＬのＦＩＴＣ抗ヒトＣＤ３４抗体及びそれぞれの抗体に対するマウスＩｇＧ１ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌを加えて氷上で３０分間反応させた。反応後、遠心分離にて非付着抗体を除去し、２００μＬの前記培地に再懸濁させ、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とＢＤ ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ^ＴＭ Ｐｒｏ ｖｅｒｓｉｏｎ５．２（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、解析を行った。その結果、純化後のＢＭ−ＣＤ３４、ＡＰ−ＣＤ３４のヒトＣＤ３４陽性細胞率は、いずれも９０％以上であった。またＡＭＬ−ＣＤ３４のＣＤ３４陽性細胞率は７０％以上であった。

（３）定量ＲＴ−ＰＣＲ法によるＤＯＣＫ１８０発現の測定
（１）で得たＰＢ−ＭＮＣ、ＧＣ、ＡＰ−ＭＮＣ、ＡＰ−ＣＤ３４、ＢＭ−ＭＮＣ及びＢＭ−ＣＤ３４の各細胞５×１０^６個から、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて全ＲＮＡを抽出した。これをＲＱ１ ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ１（Ｐｒｏｍｅｇａ）で処理後、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ^ＴＭ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｃＤＮＡを合成した．得られたｃＤＮＡ６μＬをヒトＤＯＣＫ１８０あるいはグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）に対する特異的プライマー（ＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）とＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）とを全量２５μＬで混和し、初期変性（９５℃、１０分間）後、９５℃で１５秒間、６０℃で１分間を１サイクルとするＰＣＲ反応を４０サイクル行った。各サンプルのＤＯＣＫ１８０ｍＲＮＡの発現量はＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量で補正し、２９３Ｔ細胞の発現量を１０００ ｕｎｉｔｓに規定して、それに対する相対量として数値化した。

その結果、ＰＢ−ＭＮＣ、ＧＣ、ＡＰ−ＭＮＣ及びＢＭ−ＭＮＣでは、ＤＯＣＫ１８０のｍＲＮＡはそれぞれ５６±４７ｕｎｉｔｓ（ｍｅａｎ±ＳＤ、ｎ＝１０）、７１±６９ｕｎｉｔｓ（ｍｅａｎ±ＳＤ、ｎ＝３）、６９±５７ｕｎｉｔｓ（ｍｅａｎ±ＳＤ、ｎ＝２）、３７±３５ｕｎｉｔｓ（ｍｅａｎ±ＳＤ、ｎ＝３）と極めてわずかに検出されたのみであった。一方、ＡＰ−ＣＤ３４とＢＭ−ＣＤ３４では、それぞれ１４５５±６８９ｕｎｉｔｓ（ｍｅａｎ±ＳＤ、ｎ＝４）、１２６３±７８３ｕｎｉｔｓ（ｍｅａｎ±ＳＤ、ｎ＝９）と、高い発現が認められた（図１）。

（４）イムノブロッティング法によるＤＯＣＫ１８０発現の測定
（３）のＡＰ−ＣＤ３４、ＢＭ−ＣＤ３４、ＡＰ−ＭＮＣ及びＢＭ−ＭＮＣ同じ各細胞種を、１％ＮＰ−４０を含有するｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒで溶解後、１４０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心して上清を回収し、蛋白抽出液とした。各サンプルを７．５〜１５％のポリアクリルアミノグラジエントゲル（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにより電気泳動後、泳動パターンをニトロセルロース膜（ＰＡＬＬ）に転写した。転写された膜を、５％スキムミルクを添加した１％Ｔｗｅｅｎ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅで３０分間ブロッキング後、各一次抗体と室温で２時間反応させた。一次抗体には抗ＤＯＣＫ１８０抗体及び抗β−アクチン抗体を用いた。膜を洗浄後、それぞれに対応する二次抗体と室温で３０分間反応させ、ＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて発色させ、ＬＡＳ１０００（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）にて画像化した。

その結果、（３）と同様に、ＡＰ−ＣＤ３４とＢＭ−ＣＤ３４にのみ、ＤＯＣＫ１８０の発現を認め、ＡＰ−ＭＮＣ及びＢＭ−ＭＮＣでは、ＤＯＣＫ１８０の発現は認められなかった（図２）。以上より、骨髄および末梢血いずれにおいても、ヒトＣＤ３４陽性細胞にのみ、ＤＯＣＫ１８０が発現していることが確認された。

（５）急性白血病細胞におけるＤＯＣＫ１８０の発現
新規発症（初発）のＣＤ３４陽性ＡＬＬ症例３例、再発のＣＤ３４陽性ＡＬＬ症例４例、初発のＣＤ３４陽性ＡＭＬ症例１４例、再発のＣＤ３４陽性ＡＭＬ症例２例及び再発ＣＤ３４陽性ＣＭＬ急性転化症例２例、合計２５例の骨髄液を、倫理規定に基づいた患者の同意を得て採取し、この細胞から全ＲＮＡを抽出し、前記（３）同様の定量ＲＴ−ＰＣＲ法でＤＯＣＫ１８０ｍＲＮＡの発現量を検討した。その結果を図３及び図４に示す。

前記２５例の骨髄液検体では、正常のＢＭ−ＣＤ３４と比較して、初発ＣＤ３４陽性ＡＭＬ症例２例（図３に示すＮｏ．８及びＮｏ．１０）、再発ＣＤ３４陽性ＡＭＬ症例１例（同Ｎｏ．２２）及び再発ＣＤ３４陽性ＣＭＬ急性転化症例１例（同Ｎｏ．２５）を除き、ＤＯＣＫ１８０ ｍＲＮＡの発現は低かった（図３及び図４）。特に、ＣＤ３４陽性ＡＬＬ症例については、初発と再発とを問わず、いずれもＤＯＣＫ１８０ｍＲＮＡの発現は低かった。また、ＤＯＣＫ１８０ｍＲＮＡの発現の低い症例のうち、ＣＤ３４陽性ＡＭＬ症例４例（Ｆｒｅｎｃｈ−Ａｍｅｒｉｃａｎ−Ｂｒｉｔｉｓｈ分類のＭ０、Ｍ２、Ｍ４及びＭ７各１例であって、それぞれ図３に示すＮｏ．１８、Ｎｏ．２３、Ｎｏ．１７及びＮｏ．１９）について、前記（４）と同様のＩｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇを行った結果でも、前記４例の骨髄液検体ではＤＯＣＫ１８０タンパク質の発現は認められなかった。

（６）白血病の寛解に伴うＤＯＣＫ１８０発現量の変化
診断時に骨髄穿刺を行った結果としてＣＤ３４陽性急性骨髄性白血病症と診断された患者に対して、イダマイシンとキロサイドからなる寛解導入治療を７日間行った。寛解導入治療前は、前記患者の骨髄は８０％以上の白血病細胞で占められており、その全てがＣＤ３４陽性であった。この骨髄細胞のＤＯＣＫ１８０を前記と同様にして測定した。また、血球の回復期の骨髄穿刺を指標として一定の治療効果が認められた患者から骨髄液検体を採取し、前記と同様にして、寛解期ＣＤ３４陽性細胞におけるＤＯＣＫ１８０の発現量を定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。その結果、白血病に対するイダマイシンとキロサイドからなる寛解導入治療によって寛解した患者のＣＤ３４陽性細胞においてＤＯＣＫ１８０が発現していることが確認された（図５）。

Claims (15)

1. 血液検体においてＤＯＣＫ１８０の発現が陰性であるＣＤ３４陽性細胞を検出することを含む、白血病細胞の検出方法。
2. 抗ＣＤ３４抗体と抗ＤＯＣＫ１８０抗体を用いた免疫学的検出法によってＤＯＣＫ１８０の発現が陰性であるＣＤ３４陽性細胞を検出する、請求項１に記載の白血病細胞の検出方法。
3. 白血病細胞が急性白血病細胞である、請求項１又は２に記載の白血病細胞の検出方法。
4. 急性白血病細胞が急性リンパ性白血病細胞である、請求項３に記載の白血病細胞の検出方法。
5. 抗ＤＯＣＫ１８０抗体を含む、白血病細胞検出用キット。
6. 下記の（ａ）又は（ｂ）の工程を有する白血病の進行度又は退行度を検査する方法；
   （ａ）血液検体においてＤＯＣＫ１８０の発現が陰性であるＣＤ３４陽性細胞を検出し、ＤＯＣＫ１８０の発現が正常なＣＤ３４陽性細胞に対する前記ＤＯＣＫ１８０の発現が陰性であるＣＤ３４陽性細胞の比率を測定する工程、
   （ｂ）血液検体中のＣＤ３４陽性細胞におけるＤＯＣＫ１８０の発現量を測定する工程。
7. 下記の（ｃ）又は（ｄ）の工程を有する、請求項６に記載の白血病の進行度又は退行度を検査する方法；
   （ｃ）（ａ）に加えて抗ＣＤ３４抗体と抗ＤＯＣＫ１８０抗体を用いた免疫学的検出法によって、ＤＯＣＫ１８０の発現が正常であるＣＤ３４陽性細胞とＤＯＣＫ１８０の発現が陰性であるＣＤ３４陽性細胞の検出を行う工程、
   （ｄ）（ｂ）に加えて健常な血液検体中のＣＤ３４陽性細胞におけるＤＯＣＫ１８０の発現量を指標値として、血液検体中のＣＤ３４陽性細胞におけるＤＯＣＫ１８０の発現量を測定する工程。
8. 白血病が急性白血病である、請求項６又は７に記載の検査方法。
9. 急性白血病が急性リンパ性白血病である、請求項８に記載の検査方法。
10. 抗ＤＯＣＫ１８０抗体を含む、白血病の進行度又は回復度の検査用キット。
11. 血液検体中のＣＤ３４陽性細胞におけるＤＯＣＫ１８０の発現量を測定することを含む、白血病の検出方法。
12. 健常な血液検体中のＣＤ３４陽性細胞におけるＤＯＣＫ１８０の発現量を指標値として、血液検体中のＣＤ３４陽性細胞におけるＤＯＣＫ１８０の発現量を測定する、請求項１１に記載の白血病の検出方法。
13. 白血病が急性白血病である、請求項１１又は１２に記載の白血病の検出方法。
14. 急性白血病が急性リンパ性白血病である、請求項１３に記載の白血病の検出方法。
15. 抗ＤＯＣＫ１８０抗体又はＤＯＣＫ１８０をコードするＤＮＡにハイブリダイズする核酸を含む、白血病検出用キット。

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