JP2010133880A - 白血病細胞の検出方法、および白血病の治療抵抗性を検査する方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 白血病、特に急性白血病における選択的マーカーを用いて、定量性があり、かつ偽陽性の少ない簡便かつ正確な、白血病細胞の検出方法、および白血病の治療抵抗性の検査方法を提供する。
【解決手段】 白血病患者由来の血液検体においてＤＯＣＫ１８０の発現が正常であるＣＤ３４陽性細胞を検出する方法である。本発明によれば、白血病、特に急性白血病の腫瘍細胞におけるＤＯＣＫ１８０の特異的な発現パターンを確認することで、白血病の抵抗性を診断することができ、医師による治療に対し有益な情報を、血液検体を対象にした簡便な方法により提供することができる。
【選択図】 図５

Description

本発明は、白血病、特に急性白血病の治療抵抗性を検査する方法、および白血病の治療抵抗性の検査に用いるキットに関する。

白血病は、腫瘍化した造血細胞が無制限に増殖して血液中に出現するという、血液の悪性腫瘍に属する疾患である。赤血球系や血小板系の細胞が腫瘍化したものもあるが、多くは白血球系の細胞が腫瘍化したものであり、こうした疾患をまとめて白血病と呼ばれている。白血病には、血液細胞の分化あるいは成熟のある一定の段階で分化が停止して、それより上流の未分化な芽球細胞が増殖することにより腫瘍を構成している場合と、生体の調節能を逸脱し自律性増殖を示すものの、一応分化あるいは成熟する能力を保持している場合とがあり、前者には急性白血病が、後者には慢性白血病あるいは骨髄異形成症候群（ｍｙｅｌｏｄａｙｓｐｌａｔｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ；ＭＤＳ）が該当する。白血病の原因と発症機序の多くは不明であるが、早期発見と措置が治療にとって極めて重要である。

白血病の診断には、血中細胞の形態学的観察、染色体検査、またはフローサイトメトリーを用いた血中細胞の表面抗原解析検査等によって行われる。また、染色体異常や遺伝子異常を伴う白血病については、疾患特異的なプライマーを用いたＰＣＲあるいはＲＴ−ＰＣＲも行われている。さらに、ウイルムス腫瘍遺伝子１（ＷＴ−１）の定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果が白血病における腫瘍細胞の量を反映するという報告がなされている。

前記の通り、白血病の治療にあたっては、その早期発見、具体的には白血病または白血病細胞の早期検出が重要であるほか、骨髄移植による物理療法や投薬による化学療法等の治療に抵抗性を示すか否かを検査・検出することが重要となる。治療抵抗性を検査・検出することは、治療効果を判定するうえで、あるいはその後のさらなる治療方針を決定するうえで、極めて重要である。

白血病の治療抵抗性については、例えば、急性リンパ性白血病（ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ；ＡＬＬ）において、ＭＤＲ１（ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １）の発現量と治療不調のリスクとが関連するとの報告（非特許文献１）や、急性骨髄性白血病（ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ；ＡＭＬ）において、ＦＭＳ−ｌｉｋｅ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ３／ｉｎｔｅｒｎａｌ ｔａｎｄｅｍ ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ（ＦＬＴ ３／ＩＴＤ）陽性と治療抵抗性とが関連するとの報告（非特許文献２）がされている。

また、特開２００７−１５９４１６号公報には、慢性骨髄性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ；ＣＭＬ）患者のチロシンキナーゼ阻害剤であるダサチニブによる治療に対する抵抗性を判定する方法が開示されている（特許文献１）。

Kourti et. al., International Journal of Hematology 86 166-173 (2007) 医学検査 Ｖｏｌ．５６ Ｎｏ．５、７８５−７９０（２００７） 特開２００７−１５９４１６号公報

しかしながら、白血病の治療抵抗性を簡便かつ正確に検査する方法、特にすべての白血病に共通して、定量性があり、かつ偽陽性の少ない検査方法の確立は、依然として望まれている。

本発明は、白血病、特に急性白血病における選択的マーカーを用いて、定量性があり、かつ偽陽性の少ない簡便かつ正確な、白血病細胞の検出方法、および白血病の治療抵抗性の検査方法を提供することを目的とする。

本発明に係る白血病細胞の検出方法は、白血病患者由来の血液検体においてＤＯＣＫ１８０の発現が正常であるＣＤ３４陽性細胞を検出する方法である。

本発明においては、抗ＣＤ３４抗体と抗ＤＯＣＫ１８０抗体とを用いた免疫学的検出法によって前記ＤＯＣＫ１８０の発現が正常であるＣＤ３４陽性細胞を検出する態様でもよい。

また、本発明においては、白血病細胞が急性白血病細胞であることが好ましく、急性白血病細胞が急性骨髄性白血病細胞であることがより好ましい。

本発明に係る白血病患者由来の血液検体において検出したＤＯＣＫ１８０の発現が正常であるＣＤ３４陽性細胞の比率を測定する方法は、白血病患者由来の血液検体におけるＣＤ３４陽性細胞を検出し、健常人由来の血液検体におけるＤＯＣＫ１８０の発現が正常なＣＤ３４陽性細胞および／または白血病患者由来の血液検体におけるＤＯＣＫ１８０の発現が陰性であるＣＤ３４陽性細胞に対する比率を測定する方法である。

本発明においては、抗ＣＤ３４抗体と抗ＤＯＣＫ１８０抗体とを用いた免疫学的検出法によって、前記白血病患者由来の血液検体におけるＤＯＣＫ１８０の発現が正常であるＣＤ３４陽性細胞と、前記健常人由来の血液検体におけるＤＯＣＫ１８０の発現が正常であるＣＤ３４陽性細胞および／または前記白血病患者由来の血液検体におけるＤＯＣＫ１８０の発現が陰性であるＣＤ３４陽性細胞との検出を行う態様でもよい。

また、本発明においては、白血病が急性白血病であることが好ましく、急性白血病が急性骨髄性白血病であることがより好ましい。

本発明に係る白血病の治療抵抗性を検査する方法は、前記いずれかの測定方法を含む検査方法である。

本発明に係る白血病の治療抵抗性の検査用キットは、抗ＤＯＣＫ１８０抗体またはＤＯＣＫ１８０をコードするＤＮＡにハイブリダイズする核酸を含んでいる。

本発明においては、さらに抗ＣＤ３４抗体を含んでもよい。

本発明に係る白血病の治療抵抗性を検査する方法は、健常人由来の血液検体中のＣＤ３４陽性細胞におけるＤＯＣＫ１８０の発現量を指標値として、白血病患者由来の血液検体中のＣＤ３４陽性細胞におけるＤＯＣＫ１８０の発現量を測定することにより行う検査方法である。

また、本発明においては、白血病が急性白血病であることが好ましく、急性白血病が急性骨髄性白血病であることがより好ましい。

本発明によれば、白血病、特に急性白血病の腫瘍細胞におけるＤＯＣＫ１８０の特異的な発現パターンを確認することで、白血病の抵抗性を診断することができ、医師による治療に対し有益な情報を、血液検体を対象にした簡便な方法により提供することができる。

本発明は、白血病血液検体中のＣＤ３４陽性細胞におけるＤＯＣＫ１８０の発現を確認、検出、ないし定量化することを要素とする、すなわち本発明は白血病の発症が前提となり、白血病発症後における検体中のＣＤ３４陽性細胞のＤＯＣＫ１８０タンパク質またはそれをコードする遺伝子の発現を、白血病の治療抵抗性に関する診断用マーカーとして使用する方法に関する発明である。その様な本発明の一態様は、白血病血液検体においてＤＯＣＫ１８０の発現が正常であるＣＤ３４陽性細胞を検出する、白血病細胞の検出方法である。

ＣＤ３４陽性細胞が腫瘍化した細胞では、ＤＯＣＫ１８０の発現が、正常なＣＤ３４陽性細胞と比較して著しく低下することが本発明者等により報告されている。このことは、ＤＯＣＫ１８０の発現が陰性であるＣＤ３４陽性細胞は腫瘍化した細胞であると判断することができることを意味する。

一方、治療抵抗性を示す白血病患者由来の検体においては、ＣＤ３４陽性細胞が腫瘍化した細胞では、ＤＯＣＫ１８０の発現が正常なＣＤ３４陽性細胞と同等ないし亢進するものがある。したがって、その様なＣＤ３４陽性細胞が白血病患者由来の血液検体、特に白血病患者由来の骨髄液検体において検出されたという本発明の方法における結果は、医師が、白血病検体が治療抵抗性を有しているか否かを判断するうえでの有益な情報となる。

また、本発明における白血病または白血病細胞は、急性白血病、慢性白血病、ウイルス性白血病、混合系統白血病（ｍｉｘｅｄ ｌｉｎｅａｇｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ；ＭＬＬ）、および低形成白血病（ｈｙｐｏｐｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）等の白血病とその腫瘍細胞（腫瘍化した白血球）の他、骨髄異形成症候群（ｍｙｅｌｏｄａｙｓｐｌａｔｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ；ＭＤＳ）とその細胞が含まれる。急性白血病としては、例えば、急性骨髄性白血病（ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ；ＡＭＬ）や急性リンパ性白血病（ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ；ＡＬＬ）等を挙げることができ、慢性白血病としては、例えば、慢性骨髄性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ；ＣＭＬ）や慢性リンパ性白血病群、慢性骨髄増殖性疾患群を挙げることができ、ウイルス性白血病としては、成人Ｔ細胞白血病・リンパ腫（ａｄｕｌｔ Ｔ−ｃｅｌｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ／ｌｙｍｐｈｏｍａ）を挙げることができる。さらに、慢性リンパ性白血病群としては、例えば、慢性リンパ性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ；ＣＬＬ）や前リンパ球性白血病（ｐｒｏｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ；ＰＬＬ）、毛様細胞白血病（ｈａｉｒｌｙ ｃｅｌｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ；ＨＣＬ）、大顆粒リンパ球性白血病（ｌａｒｇｅ ｇｒａｎｕｌａｒ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ；ＬＧＬＬ）等を挙げることができ、慢性骨髄増殖性疾患群としては、例えば、真性赤血球増多症（ｐｏｌｙｃｙｔｈｅｍｉａ ｖｅｒａ；ＰＶ）や本態性血小板血症（ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｈｅｍｉａ）、慢性好中球性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ；ＣＮＬ）、骨髄線維症（ｍｙｅｌｏｆｉｂｒｏｓｉｓ）等を挙げることができる。一方、ＭＤＳとしては、例えば、不応性貧血（ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ａｎｅｍｉａ；ＲＡ）や環状鉄芽球を伴うＲＡ（ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ａｎｅｍｉａ ｗｉｔｈ ｒｉｎｇｅｄ ｓｉｄｅｒｏｂｌａｓｔ；ＲＳ）、芽球増加を伴うＲＡ（ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ａｎｅｍｉａ ｗｉｔｈ ｅｘｃｅｓｓ ｏｆ ｂｌａｓｔｓ；ＲＡＥＢ）、慢性骨髄単球性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙｅｌｏｍｏｎｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ；ＣＭＭｏＬ）等を挙げることができる。

また、本発明の別態様は、白血病患者由来の血液検体、特に白血病患者由来の骨髄液検体においてＣＤ３４陽性細胞を検出し、健常人由来の血液検体におけるＤＯＣＫ１８０の発現が正常なＣＤ３４陽性細胞および／または白血病患者由来の血液検体におけるＤＯＣＫ１８０の発現が陰性であるＣＤ３４陽性細胞に対する白血病患者由来の血液検体、特に白血病患者由来の骨髄液検体において検出したＤＯＣＫ１８０の発現が正常であるＣＤ３４陽性細胞の比率を測定する方法である。例えば、白血病患者由来の血液検体、特に白血病患者由来の骨髄液検体の単位体積あたりに含まれるＣＤ３４陽性細胞の総数における、ＤＯＣＫ１８０の発現が正常であるＣＤ３４陽性細胞の割合に関する測定結果は、その検体における白血病の治療抵抗性を表すものであり、医師が患者の白血病の重症度等を診断するうえで、より有益かつ客観的な判断材料となる。

さらに本発明は、健常検体のＣＤ３４陽性細胞におけるＤＯＣＫ１８０の発現量を指標値として、白血病患者由来の血液検体、特に白血病患者由来の骨髄液検体中のＣＤ３４陽性細胞におけるＤＯＣＫ１８０の発現量を測定する、白血病の治療抵抗性の検査方法を提供する。この方法は、白血病患者由来の血液検体、特に白血病患者由来の骨髄液検体中のＤＯＣＫ１８０の発現が正常であるＣＤ３４陽性細胞を検出する代わりに、例えば単位体積中のＣＤ３４陽性細胞全体におけるＤＯＣＫ１８０の発現量を測定し、その測定値が、健常検体のＣＤ３４陽性細胞におけるＤＯＣＫ１８０の発現量を指標値とした場合に同等値（正常値）ないし高い値であることは、検査された白血病検体が治療抵抗性を有していることを意味する。したがってその様な結果は、医師が患者の白血病の重症度等を診断するうえで、より有益かつ客観的な判断材料となる。

本発明における「血液検体」は、骨髄液、静脈から採取された末梢血、およびそれらをＮｉｓｈｉｏ等（Ｂｌｏｏｄ、２００５年、第１０６巻、第１０１２−１０２０頁）に記載の方法に準じ、遠心分離処理及び血球画分を調製する際の公知の化学的処理を施して、ＣＤ３４陽性細胞を含む血球画分検体としたもの、等を包含する用語である。本発明における血液検体の好ましい態様は骨髄液であり、特に好ましい態様は骨髄液から分画された血球画分検体である。

ＣＤ３４陽性細胞とは、細胞の表面に糖タンパク質ＣＤ３４を高発現している造血前駆細胞である。ＣＤ３４陽性細胞は血液、特にさい帯血、骨髄液などに含まれており、これらからＮｉｓｈｉｏ等（Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ、２００１年、第２９巻、第１９−２９頁）に記載の方法に準じて検出ないし分離することができる。またＣＤ３４陽性細胞を血液等から分離する装置、例えばアイソレックス^ＴＭ３００ｉ（タカラバイオ）を用いて分離することもできる。

また本発明においてＤＯＣＫ１８０とは、前癌遺伝子の発現産物であるＣｒｋタンパク質に結合する、高等真核動物細胞の増殖を制御するタンパク質の一種である。またＤＯＣＫ１８０は、Ｒａｃと呼ばれる、低分子量Ｇタンパク質を活性化するグアニンヌクレオチド交換因子（Ｇｕａｎｉｎｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｆａｃｔｏｒ；ＧＥＦ）の一つとしても知られている。ＤＯＣＫ１８０をコードするＤＮＡは既にクローニングされ、その塩基配列ならびにＤＯＣＫ１８０のアミノ酸配列も決定されている（例えば、特許文献２：特開平８−１９６２７７号公報）。

Ｃｒｋタンパク質とＤＯＣＫ１８０の結合が細胞増殖能を活性化することが明らかにされて以来、ＤＯＣＫ１８０タンパク質は、Ｃｒｋタンパク質を発現する癌細胞の診断指標として、また各種抗癌剤によるミサイル療法等の標的として、注目されていた。本発明者らは、従来の報告とは異なり、白血病細胞、特にＣＤ３４陽性細胞が腫瘍化した細胞の多くが、ＤＯＣＫ１８０の発現が陰性である腫瘍細胞であること、および治療抵抗性を示す白血病患者由来の白血病細胞、特にＣＤ３４陽性細胞が腫瘍化した細胞の多くが、ＤＯＣＫ１８０の発現が正常である腫瘍細胞であることを見いだした。

本発明において、「ＤＯＣＫ１８０の発現が正常」とは、前記白血病に罹患していない人（健常人）の腫瘍化していないＣＤ３４陽性細胞におけるＤＯＣＫ１８０の発現と比較して、同等ないし亢進することをいい、具体的には遺伝子やタンパク質の発現を確認するための一般的な手法、例えば免疫学的検出法、あるいはハイブリダイゼーションやＰＣＲ等の遺伝子工学的手法を、通常の感度を伴って利用しても、ＣＤ３４陽性細胞においてＤＯＣＫ１８０タンパク質あるいはＤＯＣＫ１８０をコードするｍＲＮＡが健常人と同等ないしそれ以上、あるいは正常なＣＤ３４陽性細胞におけるＤＯＣＫ１８０の発現量を基準としたときに、ＤＯＣＫ１８０タンパク質あるいはＤＯＣＫ１８０をコードするｍＲＮＡの発現量が６０％〜１４０％、好ましくは７０％〜１３０％、より好ましくは８０％〜１２０％、さらに好ましくは９０％〜１１０％であることを包含する意味である。

また、本発明において、「ＤＯＣＫ１８０の発現が陰性」とは、ＤＯＣＫ１８０の発現が著しく低下ないし消失している、具体的には遺伝子やタンパク質の発現を確認するための一般的な手法、例えば免疫学的検出法、あるいはハイブリダイゼーションやＰＣＲ等の遺伝子工学的手法を、通常の感度を伴って利用しても、ＣＤ３４陽性細胞においてＤＯＣＫ１８０タンパク質あるいはＤＯＣＫ１８０をコードするｍＲＮＡが確認できない、あるいは正常なＣＤ３４陽性細胞におけるＤＯＣＫ１８０の発現量を基準としたときに、ＤＯＣＫ１８０タンパク質あるいはＤＯＣＫ１８０をコードするｍＲＮＡの発現量が５０％以下、好ましくは３０％以下、より好ましくは１０％以下、さらに好ましくは５％以下であることを包含する意味である。

また、本発明においてＤＯＣＫ１８０と呼ぶときは、前記特許文献２に具体的に記載されているアミノ酸配列からなるタンパク質の他、いわゆる一塩基多形によってそのアミノ酸配列の一部が置換等されたＤＯＣＫ１８０が存在するときは、かかる多形型のＤＯＣＫ１８０も包含するものとして理解される。

本発明の方法におけるＤＯＣＫ１８０の発現の検出手段あるいは発現量の測定手段は、ＣＤ３４陽性細胞におけるＤＯＣＫ１８０タンパク質および／またはＤＯＣＫ１８０をコードするｍＲＮＡを的確に検出あるいはその量を定量することができる手段である限り、特に限定されないが、ＤＯＣＫ１８０タンパク質に対する免疫学的検出手段あるいはＤＯＣＫ１８０をコードするｍＲＮＡに対する遺伝子工学的検出手段を利用することが好ましい。

免疫学的検出手段を利用したＤＯＣＫ１８０タンパク質の検出方法あるいは発現量の測定方法では、抗ＤＯＣＫ１８０タンパク質抗体、特に抗ＤＯＣＫ１８０抗体と抗ＣＤ３４タンパク質抗体とを組み合わせて使用することが好ましい。係る抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆａｂ断片その他の、「抗体」として当業者に理解されるすべての生体分子を利用することができる。特にモノクローナル抗体の利用が特に好ましい。

モノクローナル抗体の作成は、当業者に知られた種々のモノクローナル抗体作成技術（例えば、Kohler G. et.al., Nature, 256 495-497（1975）, Kohler G. et.al., Eur. J. Immunol., 6 511-519（1976）, Kohler G. et.al., Eur. J. Immunol., 4 292-295（1976））を利用して行えばよい。典型的には、前記特許文献２に記載される配列情報を利用して、当業者に知られた遺伝子工学的手法により組み換えＤＯＣＫ１８０タンパク質や組み換えＣＤ３４タンパク質を作成し、これを抗原として動物に接種する一般的な手法にしたがって得られる抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを基にハイブリドーマを調製し、モノクローナル抗体を産生させる、というものである。また、ＤＯＣＫ１８０タンパク質やＣＤ３４タンパク質のアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチドを抗原として使用してもよい。また既に市販化されている抗ＤＯＣＫ１８０タンパク質抗体や抗ＣＤ３４タンパク質抗体を用いてもよい。

免疫学的検出手段を利用した本発明において使用する抗体は、標識物質で標識することが好ましい。標識物質は、その標識物質単独で、またはその標識物質と他の物質とを反応させることにより検出可能なシグナルをもたらす物質であり、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ；ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ；ＡＬＰ）、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ（ｇｌｕｃｏｓｅ ｏｘｉｄａｓｅ；ＧＯＤ） 、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ；Ｇ６ＰＤ）、アルコール脱水素酵素（ａｌｃｏｈｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ；ＡＤＨ）、リンゴ酸脱水素酵素（ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ；ＭＤＨ）、ペニシリナーゼ、カタラーゼ、アポグルコースオキシダーゼ、ウレアーゼ、ルシフェラーゼ、もしくはアセチルコリンエステラーゼ（ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｒａｓｅ；ＡＣｈＥ）等の酵素、フルオレスセインイソチオシアネート（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ；ＦＩＴＣ）、フィコビリタンパク、希土類金属キレート、ダンシルクロライド、もしくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ；ＴＲＩＴＣ）等の蛍光物質、^１２５Ｉ、^１４Ｃ、^３Ｈ等の放射性同位体、ビオチン、アビジン、もしくはジゴケシゲニン等の化学物質、または化学発光物質等を挙げることができる。これらの標識物質による抗ＤＯＣＫ１８０抗体の標識方法は、選択すべき標識物質の種類に応じて、既に公知となっている標識方法を適宜用いて行えばよい。

また、本発明は上記の抗体（標識されたものを含む）を不溶性担体に固定化した固定化抗体として利用することも出来る。不溶性担体としては、一般的に用いられている各種の不溶性担体、例えば、マイクロプレートに代表されるプレート、試験管、チューブ、ビーズ、ボール、フィルター、メンブレン、あるいはセルロース系担体、アガロース系担体、ポリアクリルアミド系担体、デキストラン系担体、ポリスチレン系担体、ポリビニルアルコール系担体、ポリアミノ酸系担体、あるいは多孔性シリカ系担体等のアフィニティークロマトグラフィーにおいて用いられる不溶性担体等を挙げることができる。また、これらの不溶性担体に対する抗体の固定化方法は、不溶性担体ごとに既に確立している方法を利用して行えばよい。

免疫学的検出手段を利用したＤＯＣＫ１８０タンパク質の検出方法あるいは発現量の測定方法としては、エンザイムイムノアッセイ（ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ；ＥＩＡ）法、ラジオイムノアッセイ（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ；ＲＩＡ）法、ＦＡＣＩＳ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）等のフローサイトメトリーによる解析、ウエスタンブロット法等を挙げることができる。それぞれの方法の原理、さらには詳細な条件、操作手順、抗原抗体複合体の検出方法等は、使用される抗体を検出対象に応じて変更することの他は、当業者に広く知られており、本発明でもその様な条件や操作に基づいて各種方法を行うことができる。

本発明では、抗ＣＤ３４抗体と抗ＤＯＣＫ１８０抗体とを用いたイムノアッセイ、特にこれら２種の抗体を用いたフローサイトメトリーを利用したイムノアッセイが好ましい。フローサイトメトリーを用いることによって、ＤＯＣＫ１８０の発現が陰性のＣＤ３４陽性細胞とＤＯＣＫ１８０の発現が正常なＣＤ３４陽性細胞とを的確に判別し、さらに簡便に両者を分離することができ、本発明の方法またはその一部を自動化あるいは半自動化することも可能である。フローサイトメトリー法の詳細については、例えば山下（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｏｒｙ、免疫研究法ハンドブック、１９９６年、２版、第２４７−２６２頁、中外医学社）に記載されており、本願にその内容のすべてが取り込まれる。

遺伝子工学的検出手段を利用したＤＯＣＫ１８０の発現の検出方法あるいは発現量の測定方法は、血液検体において発現しているＤＯＣＫ１８０をコードするｍＲＮＡを検出あるいは定量化する方法であればよく、サザンハイブリダイゼーションや、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、定量的ＰＣＲ等のＰＣＲ技術を利用することができる。好ましい方法はＰＣＲ、特に好ましくはＲＴ−ＰＣＲによる定量的ＰＣＲである。

典型的には、公知の方法に従って血液検体から抽出されるｔｏｔａｌ ＲＮＡに対して、あるいはｔｏｔａｌ ＲＮＡから選別されたｍＲＮＡに対して、ＤＯＣＫ１８０をコードする塩基配列に対応するポリヌクレオチドを増幅用プライマーとして用いたＰＣＲ、例えばＲＴ−ＰＣＲを行って、ＤＯＣＫ１８０をコードするｃＤＮＡを増幅し、得られた増幅産物の有無やその量を定量化するというものである。上記のＰＣＲ技術は、例えば前記特許文献２に記載された塩基配列を基にして増幅用プライマーの塩基配列の設計することも含め、すべて当業者により広く知られた技術であり、本発明の方法も、かかる広く知られた方法を適用して行うことができる。また、ＰＣＲ法による遺伝子発現の検出あるいは定量化に際しては、様々な工夫を有するＰＣＲ法が多数報告されており、本発明ではその様な方法を利用してもよい。

本発明は、上記に説明した各種方法に対して利用するための、抗ＤＯＣＫ１８０タンパク質抗体および／またはＤＯＣＫ１８０をコードするＤＮＡに特異的にハイブリダイズする核酸を含むキットも提供する。当該キットは抗ＣＤ３４抗体をさらに含むことが好ましい。また本発明のキットは、二次抗体、標識物質その他の免疫学的検出手段の実施に有用な物質、または緩衝液、ＤＮＡポリメラーゼその他の遺伝子工学的検出手段の実施に有用な物質をキットの構成物として含んでいてもよい。

以下、本発明に係る白血病細胞の検出方法について、実施例に基づいて説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。

＜試薬類＞
組み換え型ヒト顆粒コロニー刺激因子（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ；以下、「ｒｈＧ−ＣＳＦ」と表す。）は中外製薬社から購入した。インターロイキン−３（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−３；以下、「ＩＬ−３」と表す。）および幹細胞因子（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒ；以下、「ＳＣＦ」と表す。）はＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社から購入した。フィコエリスリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ；以下、「ＰＥ」と表す。）標識抗ヒトＣＤ１４抗体はＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社から、フルオレセイン−イソチオシアネート（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ；以下、「ＦＩＴＣ」と表す。）標識抗ヒトＣＤ３４抗体はＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社から購入した。またネガティブコントロールは、それに対応するクラスの抗体をＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ社から購入した。抗ＤＯＣＫ１８０抗体、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ抗体およびヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰはＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から、抗β−アクチン（β−ａｃｔｉｎ）抗体はＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社からそれぞれ購入したものを使用した。

＜実施例１＞
（１）単核細胞の回収およびヒトＣＤ３４陽性細胞の回収
倫理規定に基づく同意を得て採取した健常人の骨髄液と末梢血それぞれから、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いた比重遠心法で、骨髄液由来の単核細胞（ＢＭ−ＭＮＣ）と末梢血由来の単核細胞（ＰＢ−ＭＮＣ）とを分離した。また、倫理規定に基づく同意を得た健常人成人に５μｇ／ｋｇのｒｈＧ−ＣＳＦを５日間連日皮下投与して、ヒトＣＤ３４陽性細胞を動員した後に末梢血を採取した。この末梢血から血球分離装置を用いて白血球画分を回収し、液体窒素を用いて凍結保存した。以下、回収した白血球画分をアフェレーシスプロダクト（ＡＰ）と表す。さらに、凍結保存したＡＰから、比重遠心法で単核細胞（ＡＰ−ＭＮＣ）を分離した。

ＢＭ−ＭＮＣから、抗ＣＤ３４磁気ビーズ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）と磁気細胞分離システム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）とを用いて、ヒトＣＤ３４陽性細胞（ＢＭ−ＣＤ３４）を純化し、回収した。また同様にしてＡＰ−ＭＮＣからヒトＣＤ３４陽性細胞（ＡＰ−ＣＤ３４）を純化し、回収した。

さらに、倫理規定に基づく同意を得て採取した健常人の末梢血を、湯尾（好中球、血液・腫瘍科、２０００年、第４０巻、第１０−１６頁、科学評論社）に記載された方法に従って、１％デキストラン生理食塩水と混和させ、３０分間室温にて放置し、分離した上層の浮遊液をＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅを用いた比重遠心法で顆粒球（ＧＣ）と赤血球との分画を分離回収した後、赤血球を溶血させ除去し、ＧＣのみを採取した。

（２）フローサイトメトリー解析
（１）で回収したＢＭ−ＣＤ３４、ＡＰ−ＣＤ３４および急性骨髄性白血病と診断された患者の骨髄血由来のＣＤ３４陽性細胞（ＡＭＬ−ＣＤ３４）それぞれを、０．５％牛血清アルブミンを添加したｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ＲＰＭＩ１６４０培地（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社）に１×１０^６細胞／ｍＬの濃度で懸濁させた後、２０μｇ／ｍＬのＰＥ抗ヒトＣＤ１４抗体、２０μｇ／ｍＬのＦＩＴＣ抗ヒトＣＤ３４抗体、およびそれぞれの抗体に対するマウスＩｇＧ１ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌを加えて氷上で３０分間反応させた。反応後、遠心分離にて非付着抗体を除去し、２００μＬの前記培地に再懸濁させ、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）とＢＤ ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ^ＴＭ Ｐｒｏ ｖｅｒｓｉｏｎ５．２（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて、解析を行った。その結果、純化後のＢＭ−ＣＤ３４およびＡＰ−ＣＤ３４のヒトＣＤ３４陽性細胞率は、いずれも９０％以上であった。またＡＭＬ−ＣＤ３４のＣＤ３４陽性細胞率は７０％以上であった。

（３）定量ＲＴ−ＰＣＲ法によるＤＯＣＫ１８０発現の測定
（１）で得たＰＢ−ＭＮＣ、ＧＣ、ＡＰ−ＭＮＣ、ＡＰ−ＣＤ３４、ＢＭ−ＭＮＣ、およびＢＭ−ＣＤ３４の各細胞５×１０^６個から、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。これをＲＱ１ ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ１（Ｐｒｏｍｅｇａ社）で処理後、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ^ＴＭ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡ６μＬをヒトＤＯＣＫ１８０あるいはグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）に対する特異的プライマー（ＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）とＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）とを全量２５μＬで混和し、初期変性（９５℃、１０分間）後、９５℃で１５秒間、６０℃で１分間を１サイクルとするＰＣＲ反応を４０サイクル行った。各サンプルのＤＯＣＫ１８０ｍＲＮＡの発現量はＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量で補正し、２９３Ｔ細胞の発現量を１０００ ｕｎｉｔｓに規定して、それに対する相対量として数値化した。

その結果、ＡＰ−ＭＮＣ、ＢＭ−ＭＮＣ、ＰＢ−ＭＮＣ、およびＧＣでは、ＤＯＣＫ１８０のｍＲＮＡはそれぞれ６９±５７ｕｎｉｔｓ（ｍｅａｎ±ＳＤ、ｎ＝２）、３７±３５ｕｎｉｔｓ（ｍｅａｎ±ＳＤ、ｎ＝３）、５６±４７ｕｎｉｔｓ（ｍｅａｎ±ＳＤ、ｎ＝１０）、７１±６９ｕｎｉｔｓ（ｍｅａｎ±ＳＤ、ｎ＝３）と極めてわずかに検出されたのみであった。一方、ＡＰ−ＣＤ３４とＢＭ−ＣＤ３４では、それぞれ１４５５±６８９ｕｎｉｔｓ（ｍｅａｎ±ＳＤ、ｎ＝４）、１２６３±７８３ｕｎｉｔｓ（ｍｅａｎ±ＳＤ、ｎ＝９）と、高い発現が認められた（図１）。

（４）イムノブロッティング法によるＤＯＣＫ１８０発現の測定
（３）のＡＰ−ＣＤ３４、ＢＭ−ＣＤ３４、ＡＰ−ＭＮＣ、およびＢＭ−ＭＮＣと同じ各細胞種を、１％ノニデットＰ４０（非イオン性界面活性剤；ＮＰ−４０）を含有するｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒで溶解後、１４０００ｒｐｍ、４℃の条件下で１５分間遠心して上清を回収し、タンパク質抽出液とした。各サンプルを７．５〜１５％のポリアクリルアミノグラジエントゲル（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにより電気泳動後、泳動パターンをニトロセルロース膜（ＰＡＬＬ社）に転写した。転写された膜を、５％スキムミルクを添加した１％Ｔｗｅｅｎ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅで３０分間ブロッキング後、各一次抗体と室温で２時間反応させた。一次抗体には抗ＤＯＣＫ１８０抗体および抗β−アクチン抗体を用いた。膜を洗浄後、それぞれに対応する二次抗体と室温で３０分間反応させ、ＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）を用いて発色させ、ＬＡＳ１０００（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ社）にて画像化した。

その結果、（３）と同様に、ＡＰ−ＣＤ３４およびＢＭ−ＣＤ３４にのみ、ＤＯＣＫ１８０の発現を認め、ＡＰ−ＭＮＣおよびＢＭ−ＭＮＣでは、ＤＯＣＫ１８０の発現は認められなかった（図２）。以上より、骨髄および末梢血いずれにおいても、ヒトＣＤ３４陽性細胞にのみ、ＤＯＣＫ１８０が発現していることが確認された。

（５）急性白血病細胞および慢性白血病細胞におけるＤＯＣＫ１８０の発現
治療抵抗性を示す症例を含まない初発ＣＤ３４陽性急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）症例３例、治療抵抗性を示す症例を２例含む再発ＣＤ３４陽性ＡＬＬ症例４例、治療抵抗性を示す症例を５例含む初発ＣＤ３４陽性急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）症例１４例、治療抵抗性を示す症例を１例含む再発ＣＤ３４陽性ＡＭＬ例２例、およびいずれも治療抵抗性を示す再発ＣＤ３４陽性慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）症例２例、合計２５例の骨髄液を、倫理規定に基づく患者の同意を得て採取し、この細胞から前記（３）と同様の手法でｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、前記（３）と同様の定量ＲＴ−ＰＣＲ法にて初診時におけるＤＯＣＫ１８０ｍＲＮＡの発現量を定量した。その結果を図３および図４に示す。

前記２５例の骨髄液検体のうち、治療抵抗性を示す初発ＣＤ３４陽性ＡＭＬ例２例（図３に示すＮｏ．８およびＮｏ．１０）、治療抵抗性を示す再発ＣＤ３４陽性ＡＭＬ症例１例（同Ｎｏ．２２）、および治療抵抗性を示す再発ＣＤ３４陽性ＣＭＬ症例１例（同Ｎｏ．２５）では、初診時におけるＤＯＣＫ１８０ｍＲＮＡの発現量は、正常のＡＰ−ＣＤ３４およびＢＭ−ＣＤ３４と比較して同等値（正常値）ないし高い値を示した。特に、前記Ｎｏ．８では、図３に示すように、初診時における前記発現量は７５１であったが、一旦寛解後に再発し、再発時における前記発現量は１４０５と初診時より増加するとともに、正常のＡＰ−ＣＤ３４およびＢＭ−ＣＤ３４と比較して同等値（正常値）を示した。

また、前記（４）と同様のＩｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇを行った結果、前記Ｎｏ．８、Ｎｏ．１０、Ｎｏ．２２、およびＮｏ．２５の骨髄液検体では、ＤＯＣＫ１８０タンパク質の発現が正常のＡＰ−ＣＤ３４およびＢＭ−ＣＤ３４と同様に認められた。

ここで、治療抵抗性を示す再発ＣＤ３４陽性ＡＬＬ症例２例（図３に示すＮｏ．４およびＮｏ．５）、治療抵抗性を示す初発ＣＤ３４陽性ＡＭＬ症例５例（同Ｎｏ．８、Ｎｏ．９、Ｎｏ．１０、Ｎｏ．１１、およびＮｏ．１２）、治療抵抗性を示す再発ＣＤ３４陽性ＡＭＬ症例１例（同Ｎｏ．２２）、ならびに治療抵抗性を示す再発ＣＤ３４陽性ＣＭＬ症例２例（同Ｎｏ．２４およびＮｏ．２５）における物理療法あるいは化学療法の内容を図５に示す。

以上のような実施例によれば、白血病、特に急性白血病の腫瘍細胞におけるＤＯＣＫ１８０の特異的な発現パターンを確認することで、白血病の抵抗性を診断することができる。

定量ＲＴ−ＰＣＲ法により測定した２９３Ｔ細胞におけるＤＯＣＫ１８０ｍＲＮＡの発現量を１０００ｕｎｉｔｓとしたときの、各種細胞におけるＤＯＣＫ１８０ｍＲＮＡの相対的発現量を表したグラフである。数値は平均値と標準偏差（正方向のみ）で示した。 実施例で調製した各種細胞に対する、抗ＤＯＣＫ１８０抗体を用いたイムノブロッティングの結果を表した図（写真）である。２９３Ｔ細胞は陽性コントロール、Ｊｕｒｋａｔ細胞は陰性コントロールとしてそれぞれ用いた。 定量ＲＴ−ＰＣＲ法により測定した２９３Ｔ細胞におけるＤＯＣＫ１８０ｍＲＮＡの発現量を１０００ｕｎｉｔｓとしたときの、初発ＣＤ３４陽性ＡＬＬ症例３例、再発ＣＤ３４陽性ＡＬＬ症例４例、初発ＣＤ３４陽性ＡＭＬ症例１４例、再発ＣＤ３４陽性ＡＭＬ症例２例、再発ＣＤ３４陽性ＣＭＬ症例２例、合計２５例の腫瘍細胞におけるＤＯＣＫ１８０ｍＲＮＡの相対的発現量と治療反応性とを表した表である。 定量ＲＴ−ＰＣＲ法により測定した２９３Ｔ細胞におけるＤＯＣＫ１８０ｍＲＮＡの発現量を１０００ｕｎｉｔｓとしたときの、初発ＣＤ３４陽性ＡＬＬ症例３例、再発ＣＤ３４陽性ＡＬＬ症例４例、初発ＣＤ３４陽性ＡＭＬ症例１４例、再発ＣＤ３４陽性ＡＭＬ症例２例、再発ＣＤ３４陽性ＣＭＬ症例２例、合計２５例の腫瘍細胞におけるＤＯＣＫ１８０ｍＲＮＡの相対的発現量を表したグラフである。なお、図中の◆で示す４例は、治療抵抗性を示す初発ＣＤ３４陽性ＡＭＬ例２例（図３に示すＮｏ．８およびＮｏ．１０）、治療抵抗性を示す再発ＣＤ３４陽性ＡＭＬ症例１例（同Ｎｏ．２２）、および治療抵抗性を示す再発ＣＤ３４陽性ＣＭＬ症例１例（同Ｎｏ．２５）である。 定量ＲＴ−ＰＣＲ法により測定した２９３Ｔ細胞におけるＤＯＣＫ１８０ｍＲＮＡの発現量を１０００ｕｎｉｔｓとしたときの、それぞれ治療抵抗性を示す再発ＣＤ３４陽性ＡＬＬ症例２例、初発ＣＤ３４陽性ＡＭＬ症例５例、再発ＣＤ３４陽性ＡＭＬ症例１例、再発ＣＤ３４陽性ＣＭＬ症例２例、合計１０例の腫瘍細胞におけるＤＯＣＫ１８０ｍＲＮＡの相対的発現量、治療反応性、および治療内容を表した表である。

Claims (14)

1. 白血病患者由来の血液検体においてＤＯＣＫ１８０の発現が正常であるＣＤ３４陽性細胞を検出する、白血病細胞の検出方法。
2. 抗ＣＤ３４抗体と抗ＤＯＣＫ１８０抗体とを用いた免疫学的検出法によって前記ＤＯＣＫ１８０の発現が正常であるＣＤ３４陽性細胞を検出する、請求項１に記載の白血病細胞の検出方法。
3. 前記白血病細胞が急性白血病細胞である、請求項１または請求項２に記載の白血病細胞の検出方法。
4. 前記急性白血病細胞が急性骨髄性白血病細胞である、請求項３に記載の白血病細胞の検出方法。
5. 白血病患者由来の血液検体におけるＣＤ３４陽性細胞を検出し、健常人由来の血液検体におけるＤＯＣＫ１８０の発現が正常なＣＤ３４陽性細胞および／または白血病患者由来の血液検体におけるＤＯＣＫ１８０の発現が陰性であるＣＤ３４陽性細胞に対する白血病患者由来の血液検体において検出したＤＯＣＫ１８０の発現が正常であるＣＤ３４陽性細胞の比率を測定する方法。
6. 抗ＣＤ３４抗体と抗ＤＯＣＫ１８０抗体とを用いた免疫学的検出法によって、前記白血病患者由来の血液検体におけるＤＯＣＫ１８０の発現が正常であるＣＤ３４陽性細胞と、前記健常人由来の血液検体におけるＤＯＣＫ１８０の発現が正常であるＣＤ３４陽性細胞および／または前記白血病患者由来の血液検体におけるＤＯＣＫ１８０の発現が陰性であるＣＤ３４陽性細胞との検出を行う、請求項５に記載の測定方法。
7. 前記白血病が急性白血病である、請求項５または請求項６に記載の測定方法。
8. 前記急性白血病が急性骨髄性白血病である、請求項７に記載の測定する方法。
9. 請求項５から請求項８いずれかに記載の測定方法を含む、白血病の治療抵抗性を検査する方法。
10. 抗ＤＯＣＫ１８０抗体またはＤＯＣＫ１８０をコードするＤＮＡにハイブリダイズする核酸を含む、白血病の治療抵抗性の検査用キット。
11. さらに抗ＣＤ３４抗体を含む、請求項１０に記載の検査用キット。
12. 健常人由来の血液検体中のＣＤ３４陽性細胞におけるＤＯＣＫ１８０の発現量を指標値として、白血病患者由来の血液検体中のＣＤ３４陽性細胞におけるＤＯＣＫ１８０の発現量を測定する、白血病の治療抵抗性を検査する方法。
13. 前記白血病が急性白血病である、請求項１２に記載の白血病の治療抵抗性を検査する方法。
14. 前記急性白血病が急性骨髄性白血病である、請求項１３に記載の白血病の治療抵抗性を検査する方法。