JPWO2009084525A1 - 白血病細胞の検出方法 - Google Patents
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Abstract
Description
組み換え型ヒト顆粒コロニー刺激因子(recombinant human granulocyte colony stimulatory factor、以下、rhG−CSFと表す)は中外製薬から購入した。インターロイキン−3(Interleukin−3、以下、IL−3と表す)及び幹細胞因子(stem cell factor、以下、SCFと表す)はPeproTechから購入した。フィコエリスリン(phycoerythrin、以下、PEと表す)標識抗ヒトCD14抗体はBeckman Coulterから、フルオレセイン−イソチオシアネート(fluorescein−isothiocyanate、以下、FITCと表す)標識抗ヒトCD34抗体はBD Biosciencesから購入した。またネガティブコントロールは、それに対応するクラスの抗体をDakoCytomationから購入した。抗DOCK180抗体、ヤギ抗マウスIgG−HRP抗体及びヤギ抗ウサギIgG−HRPはSanta Cruz Biotechnologyから、抗β−アクチン(β−actin)抗体はSIGMA−ALDRICHからそれぞれ購入した物を使用した。
(1)単核細胞の回収およびヒトCD34陽性細胞の回収
倫理規定に基づいた同意を得て採取した健常人の骨髄液と末梢血それぞれから、Ficoll−Hypaque(Amersham)を用いた比重遠心法で、骨髄液由来の単核細胞(BM−MNC)と末梢血由来の単核細胞(PB−MNC)を分離した。また、倫理規定に基づいた同意を得た健常人成人に5μg/kgのrhG−CSFを5日間連日皮下投与して、ヒトCD34陽性細胞を動員した後に末梢血を採取し、血球分離装置を用いて白血球画分を回収し、液体窒素を用いて凍結保存した。以下、回収した白血球画分をアフェレーシスプロダクト(AP)と表す。さらに、凍結保存したAPから、比重遠心法で単核細胞(AP−MNC)を分離した。
(1)で回収したBM−CD34、AP−CD34及び急性骨髄性白血病と診断された患者の骨髄血由来のCD34陽性細胞(AML−CD34)それぞれを、0.5%牛血清アルブミンを添加したdeficient RPMI1640培地(SIGMA−ALDRICH)に1×106細胞/mLの濃度で懸濁させた後、20μg/mLのPE抗ヒトCD14抗体、20μg/mLのFITC抗ヒトCD34抗体及びそれぞれの抗体に対するマウスIgG1 negative controlを加えて氷上で30分間反応させた。反応後、遠心分離にて非付着抗体を除去し、200μLの前記培地に再懸濁させ、FACSCalibur(BD Biosciences)とBD CellQuestTM Pro version5.2(BD Biosciences)を用いて、解析を行った。その結果、純化後のBM−CD34、AP−CD34のヒトCD34陽性細胞率は、いずれも90%以上であった。またAML−CD34のCD34陽性細胞率は70%以上であった。
(1)で得たPB−MNC、GC、AP−MNC、AP−CD34、BM−MNC及びBM−CD34の各細胞5×106個から、RNeasy Mini Kit(QIAGEN)を用いて全RNAを抽出した。これをRQ1 RNase free DNase1(Promega)で処理後、SuperScriptTM First−Strand Synthesis System for RT−PCR(Invitrogen)を用いてcDNAを合成した.得られたcDNA6μLをヒトDOCK180あるいはグリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素(GAPDH)に対する特異的プライマー(TaqMan Gene Expression Assays、Applied Biosystems)とTaqMan Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems)とを全量25μLで混和し、初期変性(95℃、10分間)後、95℃で15秒間、60℃で1分間を1サイクルとするPCR反応を40サイクル行った。各サンプルのDOCK180mRNAの発現量はGAPDHのmRNAの発現量で補正し、293T細胞の発現量を1000 unitsに規定して、それに対する相対量として数値化した。
(3)のAP−CD34、BM−CD34、AP−MNC及びBM−MNC同じ各細胞種を、1%NP−40を含有するlysis bufferで溶解後、14000rpm、4℃で15分間遠心して上清を回収し、蛋白抽出液とした。各サンプルを7.5〜15%のポリアクリルアミノグラジエントゲル(BIO−RAD)を用いたSDS−PAGEにより電気泳動後、泳動パターンをニトロセルロース膜(PALL)に転写した。転写された膜を、5%スキムミルクを添加した1%Tween−phosphate buffered salineで30分間ブロッキング後、各一次抗体と室温で2時間反応させた。一次抗体には抗DOCK180抗体及び抗β−アクチン抗体を用いた。膜を洗浄後、それぞれに対応する二次抗体と室温で30分間反応させ、ECL Western blotting detection reagent(Amersham)を用いて発色させ、LAS1000(Fujifilm)にて画像化した。
新規発症(初発)のCD34陽性ALL症例3例、再発のCD34陽性ALL症例4例、初発のCD34陽性AML症例14例、再発のCD34陽性AML症例2例及び再発CD34陽性CML急性転化症例2例、合計25例の骨髄液を、倫理規定に基づいた患者の同意を得て採取し、この細胞から全RNAを抽出し、前記(3)同様の定量RT−PCR法でDOCK180mRNAの発現量を検討した。その結果を図3及び図4に示す。
診断時に骨髄穿刺を行った結果としてCD34陽性急性骨髄性白血病症と診断された患者に対して、イダマイシンとキロサイドからなる寛解導入治療を7日間行った。寛解導入治療前は、前記患者の骨髄は80%以上の白血病細胞で占められており、その全てがCD34陽性であった。この骨髄細胞のDOCK180を前記と同様にして測定した。また、血球の回復期の骨髄穿刺を指標として一定の治療効果が認められた患者から骨髄液検体を採取し、前記と同様にして、寛解期CD34陽性細胞におけるDOCK180の発現量を定量的RT−PCRで測定した。その結果、白血病に対するイダマイシンとキロサイドからなる寛解導入治療によって寛解した患者のCD34陽性細胞においてDOCK180が発現していることが確認された(図5)。
Claims (22)
- 血液検体においてDOCK180の発現が陰性であるCD34陽性細胞を検出することを含む、白血病細胞の検出方法。
- 抗CD34抗体と抗DOCK180抗体を用いた免疫学的検出法によってDOCK180の発現が陰性であるCD34陽性細胞を検出する、請求項1に記載の白血病細胞の検出方法。
- 白血病細胞が急性白血病細胞である、請求項1又は2に記載の白血病細胞の検出方法。
- 急性白血病細胞が急性リンパ性白血病細胞である、請求項3に記載の白血病細胞の検出方法。
- 抗DOCK180抗体を含む、白血病細胞検出用キット。
- さらに抗CD34抗体を含む、請求項5に記載のキット。
- 血液検体においてDOCK180の発現が陰性であるCD34陽性細胞を検出し、DOCK180の発現が正常なCD34陽性細胞に対する前記DOCK180の発現が陰性であるCD34陽性細胞の比率を測定することを含む、白血病の進行度又は退行度を検査する方法。
- 抗CD34抗体と抗DOCK180抗体を用いた免疫学的検出法によって、DOCK180の発現が正常であるCD34陽性細胞とDOCK180の発現が陰性であるCD34陽性細胞の検出を行う、請求項7に記載の検査方法。
- 白血病が急性白血病である、請求項7又は8に記載の検査方法。
- 急性白血病が急性リンパ性白血病である、請求項9に記載の検査方法。
- 抗DOCK180抗体を含む、白血病の進行度又は回復度の検査用キット。
- さらに抗CD34抗体を含む、請求項11に記載の検査用キット。
- 血液検体中のCD34陽性細胞におけるDOCK180の発現量を測定することを含む、白血病の検出方法。
- 健常な血液検体中のCD34陽性細胞におけるDOCK180の発現量を指標値として、血液検体中のCD34陽性細胞におけるDOCK180の発現量を測定する、請求項13に記載の白血病の検出方法。
- 白血病が急性白血病である、請求項13又は14に記載の白血病の検出方法。
- 急性白血病が急性リンパ性白血病である、請求項15に記載の白血病の検出方法。
- 抗DOCK180抗体又はDOCK180をコードするDNAにハイブリダイズする核酸を含む、白血病検出用キット。
- さらに抗CD34抗体を含む、請求項17に記載のキット。
- 血液検体中のCD34陽性細胞におけるDOCK180の発現量を測定することを含む、白血病の進行度又は退行度を検査する方法。
- 健常な血液検体中のCD34陽性細胞におけるDOCK180の発現量を指標値として、血液検体中のCD34陽性細胞におけるDOCK180の発現量を測定する、請求項19に記載の白血病の進行度又は退行度を検査する方法。
- 白血病が急性白血病である、請求項19又は20に記載の白血病の進行度又は退行度を検査する方法。
- 急性白血病が急性リンパ性白血病である、請求項21に記載の白血病の進行度又は退行度を検査する方法。
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