KR20230153624A - 엑소좀 miRNA를 포함하는 식도암 진단용 바이오마커 조성물 - Google Patents
엑소좀 miRNA를 포함하는 식도암 진단용 바이오마커 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 엑소좀 miRNA를 포함하는 식도암 진단용 바이오마커 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 miR-205-5p, miR-429 또는 miR-375-3p를 바이오마커로 하는 식도암 진단용 조성물, 키트 및 상기 바이오마커를 이용한 식도암 진단에 필요한 정보제공방법에 관한 것이다.
상기 miR-205-5p와 miR-429는 식도편평세포암종 환자군에서 대조군에 비해 유의하게 상향 발현되며, miR-375-3p는 식도편평세포암종 환자군에서 대조군에 비해 유의하게 하향 발현되므로, 이를 식도암 진단에 이용 시 민감도와 특이도가 매우 우수하다. 따라서, 본 발명의 식도암 진단용 바이오마커 조성물 또는 키트는 식도암 진단에 유용하게 이용될 수 있다.
상기 miR-205-5p와 miR-429는 식도편평세포암종 환자군에서 대조군에 비해 유의하게 상향 발현되며, miR-375-3p는 식도편평세포암종 환자군에서 대조군에 비해 유의하게 하향 발현되므로, 이를 식도암 진단에 이용 시 민감도와 특이도가 매우 우수하다. 따라서, 본 발명의 식도암 진단용 바이오마커 조성물 또는 키트는 식도암 진단에 유용하게 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 엑소좀 miRNA를 포함하는 식도암 진단용 바이오마커 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 miR-205-5p, miR-429 또는 miR-375-3p를 바이오마커로 하는 식도암 진단용 조성물, 키트 및 상기 바이오마커를 이용한 식도암 진단에 필요한 정보제공방법에 관한 것이다.
식도암은 세계적으로 8번째로 흔한 암이며, 암과 관련된 사망의 주요 원인 중 6위에 해당하는 암이다. 식도암 환자의 5년 생존율은 15% 내지 25% 사이로 알려져 있다. 식도암은 주로 편평세포암종(squamous cell carcinoma, SCC)과 선암종(adenocarcinoma)의 조직병리학적 유형으로 구분된다. 이 두 가지 유형은 유사한 임상적 징후를 나타내지만, 종양 위치 및 위험 요소에 있어서 서로 다른 특징을 보인다.
식도편평세포암종(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)은 아시아에서 가장 흔한 식도암이며, 한국 식도암 환자의 90% 이상이 ESCC 환자이다. ESCC 환자가 질병이 진전된 단계에서 진단을 받을 경우 사망률이 높아지기 때문에, ESCC의 조기 발견 및 진단이 치료와 예후에 있어서 매우 중요하다.
그러나, 현재 ESCC 진단의 표준 양식으로 이용되는 겸자 생검(forceps biopsy)을 이용한 내시경 검사의 경우, 침습성, 높은 비용, 작은 병변들의 누락 가능성 또는 표본 추출 오류와 같은 단점들이 존재한다. SCC 항원 또는 암 태아성 항원(carcinoembryonic antigen)과 같은 비침습성 혈약 종양 마커들이 임상에서 ESCC의 진단을 위해 사용되었으나, 조기 진단 및 종양 진행 측정에 있어서 만족스러운 효과를 나타내지 못하였다.
한편, 액체 생검(liquid biopsy)은 혈액, 침, 뇌척수액 등 다양한 체액에 포함된 암 유래 물질을 분석하는 방법을 말한다. 액체 생검은 분석 대상으로 엑소좀, microRNA, 순환 종양 세포, 순환 cell-free DNA, 단백질 및 다양한 대사물을 포함한다. 이들 중 엑소좀은 DNA, RNA, 단백질, 지질 및 핵산을 포함하는 30 내지 200 nm의 직경의 막질 소포이다. 엑소좀은 혈액 세포, 내피 세포, 면역 세포 등과 같은 여러 종류의 세포로부터 방출되며, 세포 외 공간에서 순환하면서 miRNA, 지질, 단백질 및 핵산을 수용 세포에 전달함으로써 수용 세포의 생물학적 활성을 조절할 수 있다. 엑소좀의 이러한 특성들은 엑소좀이 종양의 바이오마커로 유용하게 이용될 수 있음을 시사한다.
miRNA는 17 내지 24개의 뉴클레오티드로 이루어진 작은 논코딩 RNA의 한 종류이며, 세포 증식, 분화, 이동 및 질병 개시와 진전 등과 같은 다양한 생물학적 활동에 관여하는 것으로 알려져 있다. 특히, miRNA는 종양에서 비정상적으로 발현되어 종양 유발 또는 종양 억제의 역할을 수행하므로, 종양 형성 및 발달과 관련된 종양 바이오마커로 이용될 수 있다. 최근, miRNA가 엑소좀 내에서 발견되었는데, 이들은 주변 세포 또는 먼 세포에서 흡수되어 세포 간 의사소통 매개체 역할을 수행함이 밝혀졌다. 엑소좀 miRNA(exosomal miRNA)의 양과 구성은 건강한 대조군(healthy controls, HC)과 환자 사이에서 차이가 존재하며, 엑소좀 miRNA는 내인성 리보핵산 가수분해효소(endogenous ribonuclease) 활성으로부터 보호되어 안정적이다. 따라서, 종양 세포로부터 분비되는 엑소좀 miRNA의 발현 수준은 종양의 상태를 보여주는 비침습적 바이오마커로 이용될 수 있다.
이에 따라, 본 연구에서는 인간 식도 상피 세포와 인간 ESCC 세포로부터의 엑소좀 miRNA를 조사하여, HC와 ESCC 환자의 혈장에서 얻은 엑소좀 miRNA를 검증함으로써 ESCC의 바이오마커로 이용될 수 있는 엑소좀 miRNA를 분석하였다.
일 양상은 miR-205-5p, miR-429 및 miR-375-3p로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 식도암 진단용 바이오마커 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 miR-205-5p, miR-429 및 miR-375-3p로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 식도암 진단용 키트를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 대조군 시료 및 검체로부터 분리된 시료에 포함된 miR-205-5p, miR-429 및 miR-375-3p로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA 발현 수준을 측정하는 단계;
상기 대조군 시료 및 검체로부터 분리된 시료에서 측정된 miRNA 발현 수준을 비교하는 단계; 및
상기 비교된 miRNA 발현 수준이
(i) 검체로부터 분리된 시료 내 miR-205-5p 발현 수준이 대조군 시료 내 miR-205-5p 발현 수준 보다 높은 경우,
(ii) 검체로부터 분리된 시료 내 miR-429 발현 수준이 대조군 시료 내 miR-429 발현 수준 보다 높은 경우 및
(iii) 검체로부터 분리된 시료 내 miR-375-3p 발현 수준이 대조군 시료 내 miR-375-3p 발현 수준 보다 낮은 경우로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경우에 식도암으로 진단하는 단계;를 포함하는, 식도암 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 miR-205-5p, miR-429 및 miR-375-3p로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 식도암 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 miR-205-5p, miR-429 및 miR-375-3p로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA의 발현 수준은 건강한 대조군(healthy controls, HC)과 식도편평세포암종(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC) 환자에서 서로 다르게 측정되는 바, 상기 바이오마커 조성물의 우수한 민감도 및 특이도로 인해 식도암을 효과적으로 진단할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 miR-205-5p는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것이고, miR-429는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것이며, miR-375-3p는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 miR-205-5p는 서열번호 1의 염기서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 miR-205-5p는 “UCCUUCAUUCCACCGGAGUCUG”(서열번호 1)의 염기서열로 이루어진 miRNA이다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 miR-429는 서열번호 2의 염기서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 miR-429는 “UAAUACUGUCUGGUAAAACCGU”(서열번호 2)의 염기서열로 이루어진 miRNA이다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 miR-375-3p는 서열번호 3의 염기서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 miR-375-3p는 “UUUGUUCGUUCGGCUCGCGUGA”(서열번호 3)의 염기서열로 이루어진 miRNA이다.
본 발명의 일 실시예에서, ESCC 환자에서 miR-205-5p의 발현 수준은 HC에서 miR-205-5p 발현 수준의 10 내지 300배, 30 내지 250배, 50 내지 250배, 50 내지 200배, 50 내지 150배, 50 내지 100배, 65 내지 80배 또는 70 내지 75배 일 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서, ESCC 환자에서 miR-429의 발현 수준은 HC에서 miR-429 발현 수준의 10 내지 300배, 50 내지 300배, 50 내지 250배, 100 내지 250배, 130 내지 230배, 150 내지 200배, 150 내지 190배, 160 내지 190배, 165 내지 185배 또는 170 내지 180배일 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서, HC에서 miR-375-3p의 발현 수준은 ESCC 환자에서 miR-375-3p 발현 수준의 10 내지 300배, 30 내지 250배, 30 내지 200배, 30 내지 150배, 30 내지 100배, 40 내지 80배 또는 50 내지 70배 일 수 있다.
본 발명에서 “민감도(sensitivity)”란, 이진 분류 검정이 상황을 얼마나 잘 올바르게 식별하는지에 대한, 예를 들어 암을 두 가지 가능한 유형 중 올바른 유형으로 얼마나 빈번히 올바르게 분류하는지에 대한 통계적 측정치를 의미하는 것일 수 있다. A 부류에 대한 민감도는, 일정 절대 기준으로 측정되는 바, “A” 부류에 속하는 사건 중 상기 검정에 의해 “A” 부류에 속하는 것으로 결정된 사건의 비율이다. 구체적으로, 식도암 환자를 식도암 환자로 예측하는 확률을 민감도라 할 수 있다.
본 발명에서 “특이도(specificity)”란, 이진 분류 검정이 상황을 얼마나 잘 올바르게 식별하는지에 대한, 예를 들어 암을 두 가지 가능한 유형 중 올바른 유형으로 얼마나 빈번히 올바르게 분류하는지에 대한 통계적 측정치를 의미하는 것일 수 있다. A 부류에 대한 특이도는, 일정 절대 기준으로 측정되는 바, “A 가 아닌” 부류에 속하는 사건 중 상기 검정에 의해 “A 가 아닌”부류에 속하는 것으로 결정된 사건의 비율이다. 구체적으로, 정상인을 정상으로 예측하는 확률을 특이도라 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 조성물의 식도암 진단에 대한 민감도는 60 내지 100%, 65 내지 100%, 70 내지 100%, 75 내지 100%, 80 내지 100%, 85 내지 100%, 90 내지 100% 또는 95 내지 100% 일 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서, 상기 조성물의 정상 진단에 대한 특이도는 60 내지 100%, 65 내지 100%, 70 내지 100%, 75 내지 100%, 80 내지 100%, 85 내지 100%, 90 내지 100% 또는 95 내지 100% 일 수 있다.
본 발명에서 “RNA”란, 리보오스(ribose)를 기반으로 뉴클레오티드를 이루는 핵산의 한 종류로서, 핵염기(nucleobase)로 DNA와 달리 티민(thymine) 대신 우라실(uracil)을 가진다.
본 발명에서 “miRNA(microRNA)”란, 식물, 동물, 바이러스 등에서 발견되는 17 내지 24개의 뉴클레오티드로 이루어진 작은 논코딩 RNA의 한 종류로, RNA 침묵과 전사 이후의 유전자 발현 조절 등을 통하여 세포 증식, 분화, 이동 및 질병 개시와 진전 등과 같은 다양한 생물학적 활동에 관여하는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 miRNA는 miR-205-5p, miR-429 및 miR-375-3p로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA일 수 있다.
본 발명에서, 상기 “miRNA의 발현 수준을 측정하는 제제”란 상기 miRNA의 발현양을 확인 또는 측정하기 위하여 miRNA를 증폭 또는 검출하는데 사용되는 제제 또는 시료에 포함된 표적 miRNA의 발현양을 측정하는 방법에 사용되는 제제를 의미한다. 상기 제제로 당업계에서 일반적으로 사용되는 시약, 기구 등을 제한없이 사용할 수 있다.
본 발명에서 “식도암”이란 식도에 생긴 악성 종양을 의미하며, 본 발명의 일 실시예에서, 상기 식도암은 식도편평세포암종(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC), 식도선암(esophageal adenocarcinoma), 평활근 육종(leiomyosarcoma), 횡문근 육종(rhabdomyosarcoma), 림프종(lymphoma) 및 흑색종(melanoma)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서 상기 식도암은 식도편평세포암종일 수 있다.
본 발명에서 “진단”이란, 특정 질병 또는 질환에 대한 개체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 개체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 개체의 예후를 판정하는 것 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 개체의 상태를 모니터링 하는 것)을 의미한다. 일 구체예에서, 상기 질병은 식도암일 수 있다.
본 발명에서 “개체”란, 식도암의 진단을 필요로 하는 대상을 의미한다. 일 구체예에서, 인간 또는 영장류, 생쥐, 쥐, 개, 고양이, 말, 돼지, 토끼 및 소 등의 포유류를 의미할 수 있다.
본 발명에서 “바이오마커”란, 단백질, DNA, RNA 또는 대사 물질 등을 이용해 생체 내 변화를 측정할 수 있는 지표를 의미하고, 이를 활용해 생명체의 정상 또는 병리적인 상태, 약물에 대한 반응 정도 등을 객관적으로 측정할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 바이오마커는 miRNA일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 바이오마커는 엑소좀 miR-205-5p, miR-429 및 miR-375-3p로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 바이오마커 조성물은 miR-205-5p, miR-429 및 miR-375-3p로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA를 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 바이오마커 조성물은 miR-205-5p, miR-429, miR-375-3p, miR-205-5p 및 miR-429, miR-205-5p 및 miR-375-3p. miR-429 및 miR-375-3p, 또는 miR-205-5p, miR-429 및 miR-375-3p를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 miRNA는 엑소좀 miRNA(exosomal miRNA)일 수 있다. 엑소좀은 다양한 종류의 세포에서 방출되는 30 내지 200 nm 직경의 막질 소포로, 세포 간 miRNA, DNA, 지질 및 단백질의 운송을 매개함으로써 세포 간 신호전달 및 상호작용을 조절하는 역할을 한다. 엑소좀 miRNA는 엑소좀에서 유래한 miRNA를 의미한다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 miRNA 발현 수준을 측정하는 제제는 miR-205-5p 및 miR-429로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA 발현 수준이 대조군에 비하여 증가한지 여부를 측정하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서, 상기 miRNA 발현 수준을 측정하는 제제는 miR-375-3p miRNA 발현 수준이 대조군에 비하여 감소한지 여부를 측정하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 miRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 miR-205-5p, miR-429 및 miR-375-3p로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA와 특이적으로 결합하는 센스 또는 안티센스 프라이머, 프로브, 앱타머, 항체, 펩티드 및 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 “프라이머”란 짧은 자유 3말단 수산화기 (free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형 (template)과 염기쌍 (base pair)을 형성할 수 있고, 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 5 내지 50 nt의 핵산 서열을 의미한다. 프라이머의 서열은 반드시 주형의 서열과 정확히 같을 필요는 없으며, 충분히 상보적이어서 주형과 혼성화될 수 있으면 된다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소(polymerase) 또는 역전사 효소(reverse transcriptase)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 3인산 (nucleoside triphosphate)의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
일 구체예에서, miR-205-5p, miR-429 및 miR-375-3p miRNA의 뉴클레오티드 서열 부위의 센스(sense) 및 안티센스(antisense) 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시한 뒤 증폭된 생성물의 정량 분석(발현 수준 분석)을 통해 식도암을 진단할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 “프로브”란 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 프로브의 종류는 당업계에서 통상적으로 사용되는 물질로서, PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid), 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, RNA 또는 DNA일 수 있다. 구체적으로, DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, RNA는 게놈 RNA, mRNA, 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 단백질은 항체, 항원, 효소, 펩티드 등을 포함할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 프로브는 miR-205-5p, miR-429 및 miR-375-3p로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA와 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미할 수 있다.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
본 발명의 일 실시예에서, “항체”란 항원성 부위에 대하여 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 상기 항체는 상기 miR-205-5p, miR-429 및 miR-375-3p로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA와 특이적으로 결합하는 단백질 분자를 의미하며, 상기 항체에는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 면역 글로불린 항체가 포함될 수 있고, 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함될 수 있다. 상기 항체는 당업계의 공지된 방법으로 제조될 수 있으며, 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 상기 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv 등이 될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 용어, “앱타머”란 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 의미하는 것으로, 항체와 유사한 기능을 가져 화학적 항체 (chemical antibody)로도 불리며, 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 말한다. 상기 앱타머는 그 염기 서열에 따라 다양한 3차원 구조를 가질 수 있으며, 항원-항체 반응과 같이 특정 물질에 대하여 높은 친화력을 가질 수 있다. 또한, 앱타머는 소정의 표적 분자에 결합함으로써 소정의 표적 분자의 활성을 저해할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 앱타머는 RNA, DNA, 변형된(modified) 핵산 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 그 형태가 직쇄상 또는 환상(環狀)일 수 있으나 이들에 한정되지 아니한다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 miRNA 발현 수준은 차세대 염기서열 분석(Next generation sequencing, NGS), 중합효소반응(PCR), 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사중합효소반응(Realtime RT-PCR), 정량적 역전사중합효소반응(Quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), 웨스턴 블랏팅(Western blotting), DNA 마이크로어레이 분석법, ELISA(enzyme linked immunosorbent asay), 방사선면역분석(Radioimmunoassay; RIA), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케이트(rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation assay), 보체고정분석법 (Complement Fixation Assay) 및 FACS(Fluorescence activated cell sorter)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법으로 측정될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 식도암은 식도편평세포암종(esophageal squamous cell carcinoma)일 수 있다. 식도암은 편평세포암종(squamous cell carcinoma, SCC)과 선암종(adenocarcinoma)의 조직병리학적 유형으로 구분되며, 종양 위치 및 위험 요소에 있어서 서로 다른 특징을 나타낸다. 식도편평세포암종(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)은 아시아에서 가장 흔한 식도암 유형으로, 편평세포로 구성되어 있으며, 음주, 흡연과 관련성이 높은 것으로 알려져 있다.
본 발명은 miR-205-5p, miR-429 및 miR-375-3p로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 식도암 진단용 키트를 제공한다.
본 발명에서 상기 키트는 miR-205-5p, miR-429 및 miR-375-3p로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA의 발현 수준을 측정함으로써 식도암을 효과적으로 진단할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, ESCC 환자에서 miR-205-5p의 발현 수준은 HC에서 miR-205-5p 발현 수준의 10 내지 300배, 30 내지 250배, 50 내지 250배, 50 내지 200배, 50 내지 150배, 50 내지 100배, 65 내지 80배 또는 70 내지 75배 일 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서, ESCC 환자에서 miR-429의 발현 수준은 HC에서 miR-429 발현 수준의 10 내지 300배, 50 내지 300배, 50 내지 250배, 100 내지 250배, 130 내지 230배, 150 내지 200배, 150 내지 190배, 160 내지 190배, 165 내지 185배 또는 170 내지 180배일 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서, HC에서 miR-375-3p의 발현 수준은 ESCC 환자에서 miR-375-3p 발현 수준의 10 내지 300배, 30 내지 250배, 30 내지 200배, 30 내지 150배, 30 내지 100배, 40 내지 80배 또는 50 내지 70배 일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 키트의 식도암 진단에 대한 민감도는 60 내지 100%, 65 내지 100%, 70 내지 100%, 75 내지 100%, 80 내지 100%, 85 내지 100%, 90 내지 100% 또는 95 내지 100% 일 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서, 상기 키트의 정상 진단에 대한 특이도는 60 내지 100%, 65 내지 100%, 70 내지 100%, 75 내지 100%, 80 내지 100%, 85 내지 100%, 90 내지 100% 또는 95 내지 100% 일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 키트는 RT-PCR 키트 또는 마이크로어레이 칩 키트일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 RT-PCR 키트는 miR-205-5p, miR-429 및 miR-375-3p로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA의 발현 수준을 특이적으로 검출하기 위하여 RT-PCR을 수행하는데 요구되는 필수요소를 포함할 수 있다. RT-PCR 키트는 상기 miR-205-5p, miR-429 및 miR-375-3p로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA의 특정 부위에 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드 (dNTPs), Taq-중합효소 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-물 (DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
또한, 일 구체예에서, 상기 마이크로어레이 칩은 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드 프로브를 포함하는 것일 수 있다. 마이크로어레이는 기판 표면의 구분된 영역에 상기 프로브가 높은 밀도로 고정화되어 있는 것을 의미한다. 상기 마이크로어레이는 상기 miR-205-5p, miR-429 및 miR-375-3p로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA의 특정 부위에 특이적인 프로브를 포함하는 것을 제외하고 통상적인 마이크로어레이의 구성을 포함할 수 있다. 또한, 마이크로어레이 상에서의 핵산의 혼성화 및 혼성화 결과의 검출은 당해 분야에 잘 알려져 있다. 상기 검출은 핵산 시료를 형광 물질, 예를 들면, Cy3 및 Cy5와 같은 물질을 포함하는 검출 가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질로 표지한 다음, 마이크로어레이 상에 혼성화하고 상기 표지 물질로부터 발생하는 신호를 검출함으로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 키트에는 상기 miRNA의 발현 수준을 측정하는 제제뿐만 아니라, 식도암 진단용 키트로 사용되기에 적합하도록 사용되는 당 분야에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등이 포함될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 도구 또는 시약에는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 발색단(chromophores), 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등을 포함할 수 있다. 표지물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 담체는 가용성 담체, 불용성 담체가 있고, 가용성 담체의 일 예로 당 분야에서 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS가 있고, 불용성 담체의 일 예로 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로오스 및 이들의 조합일 수 있다.
본 발명은 대조군 시료 및 검체로부터 분리된 시료에 포함된 miR-205-5p, miR-429 및 miR-375-3p로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA 발현 수준을 측정하는 단계;
상기 대조군 시료 및 검체로부터 분리된 시료에서 측정된 miRNA 발현 수준을 비교하는 단계; 및
상기 비교된 miRNA 발현 수준이
(i) 검체로부터 분리된 시료 내 miR-205-5p 발현 수준이 대조군 시료 내 miR-205-5p 발현 수준 보다 높은 경우,
(ii) 검체로부터 분리된 시료 내 miR-429 발현 수준이 대조군 시료 내 miR-429 발현 수준 보다 높은 경우 및
(iii) 검체로부터 분리된 시료 내 miR-375-3p 발현 수준이 대조군 시료 내 miR-375-3p 발현 수준 보다 낮은 경우로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경우에 식도암으로 진단하는 단계;를 포함하는, 식도암 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 miR-205-5p는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것이고, miR-429는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것이며, miR-375-3p는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 miR-205-5p는 서열번호 1의 염기서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 miR-205-5p는 “UCCUUCAUUCCACCGGAGUCUG”(서열번호 1)의 염기서열로 이루어진 miRNA이다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 miR-429는 서열번호 2의 염기서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 miR-429는 “UAAUACUGUCUGGUAAAACCGU”(서열번호 2)의 염기서열로 이루어진 miRNA이다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 miR-375-3p는 서열번호 3의 염기서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 miR-375-3p는 “UUUGUUCGUUCGGCUCGCGUGA”(서열번호 3)의 염기서열로 이루어진 miRNA이다.
본 발명의 일 실시예에서, ESCC 환자에서 miR-205-5p의 발현 수준은 HC에서 miR-205-5p 발현 수준의 10 내지 300배, 30 내지 250배, 50 내지 250배, 50 내지 200배, 50 내지 150배, 50 내지 100배, 65 내지 80배 또는 70 내지 75배 일 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서, ESCC 환자에서 miR-429의 발현 수준은 HC에서 miR-429 발현 수준의 10 내지 300배, 50 내지 300배, 50 내지 250배, 100 내지 250배, 130 내지 230배, 150 내지 200배, 150 내지 190배, 160 내지 190배, 165 내지 185배 또는 170 내지 180배일 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서, HC에서 miR-375-3p의 발현 수준은 ESCC 환자에서 miR-375-3p 발현 수준의 10 내지 300배, 30 내지 250배, 30 내지 200배, 30 내지 150배, 30 내지 100배, 40 내지 80배 또는 50 내지 70배 일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 정보제공방법의 식도암 진단에 대한 민감도는 60 내지 100%, 65 내지 100%, 70 내지 100%, 75 내지 100%, 80 내지 100%, 85 내지 100%, 90 내지 100% 또는 95 내지 100% 일 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서, 상기 정보제공방법의 정상 진단에 대한 특이도는 60 내지 100%, 65 내지 100%, 70 내지 100%, 75 내지 100%, 80 내지 100%, 85 내지 100%, 90 내지 100% 또는 95 내지 100% 일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, miR-205-5p 및 miR-429로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA의 발현 수준은 대조군 대비 ESCC 환자로부터의 시료에서 증가하며, miR-375-3p miRNA의 발현 수준은 대조군 대비 ESCC 환자로부터의 시료에서 감소하므로, miR-205-5p, miR-429 및 miR-375-3p로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA 발현 수준을 측정함으로써 식도암을 효과적으로 진단할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 비교된 miRNA 발현 수준이 상기 (i) 또는 (ii)인 경우 식도암으로 진단할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서, 상기 비교된 miRNA 발현 수준이 상기 (iii)인 경우 식도암으로 진단할 수 있다.
본 발명에서 대조군 시료 및 상기 검체로부터 분리된 시료는, 분변, 혈액, 혈장, 혈청, 림프액, 뇌척수액, 안구액, 정액, 골수액, 관절액, 흉선액, 복수액, 양막액, 분리된 조직, 분리된 세포, 타액 및 소변으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 시료일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 시료는 혈액, 혈장 및 혈청으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 시료일 수 있다.
본 발명을 통해 제공되는 식도암 진단 바이오마커 miR-205-5p, miR-429 및 miR-375-3p는 민감도와 특이도가 매우 우수하며, 혈액 또는 혈장을 통해 측정할 수 있어 안전하고 용이하게 진단할 수 있는 장점이 있다.
따라서, 본 발명에 의할 경우 식도암 환자의 조직 생검을 통하지 않고 혈장 등의 시료에 포함된 식도암 조직 유래 엑소좀을 분석함으로써 비침습적인 식도암 진단에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 원심분리 및 ExoDisc를 통해 세포 배양 상층액으로부터 엑소좀을 분리하는 과정을 나타낸 도이다.
도 2는 세포로부터 분리된 엑소좀을 투과전자현미경으로 촬영한 도이다. 도 2A는 인간 식도 상피 세포주인 Het-1A로부터 분리한 엑소좀을 촬영한 도이다. 도 2B는 ESCC(esophageal squamous cell carcinoma) 세포주인 TE8로부터 분리한 엑소좀을 촬영한 도이다. 도 2C는 ESCC 세포주인 TE9로부터 분리한 엑소좀을 촬영한 도이다.
도 3은 식도 상피 세포주 및 ESCC 세포주에서 유래한 엑소좀의 특징화를 나타낸 도이다. 도 3a는 엑소좀 마커인 CD63, TSG101 및 HSP70의 발현을 웨스턴 블랏 분석으로 나타낸 도이다. 도 3b는 엑소좀 마커 FLOT1, ICAM, ALIX, CD81, CD63, EpCAM, ANXA5 및 TSG101 관측, 골지 마커 GM130을 통한 세포 오염 여부 평가 및 양성 대조군을 포함하는 Exc-Check 엑소좀 항체 어레이 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 식도 상피 세포주와 ESCC 세포주 간 차별적으로 발현되는 엑소좀 miRNA를 나타낸 도이다. 도 4a는 차별적으로 발현되는 엑소좀 miRNA의 볼케이노 플랏을 나타낸 도이다. 도 4b는 차별적으로 발현되는 엑소좀 miRNA에 대한 계층적 클러스터링 히트맵을 나타낸 도이다.
도 5는 HC(healthy control) 20명 및 ESCC 환자 40명의 4가지 엑소좀 miRNA 발현 수준을 나타낸 도이다. 도 5A는 miR-205-5p의 발현 수준을 나타낸 도이다. 도 5B는 miR-429의 발현 수준을 나타낸 도이다. 도 5C는 miR-373-3p의 발현 수준을 나타낸 도이다. 도 5D는 miR-483-3p의 발현 수준을 나타낸 도이다.
도 6은 ESCC 환자와 HC를 구별할 수 있는 4가지 혈장 엑소좀 miRNA에 대한 수신자 작동 특성(Receiver-operating characteristic, ROC)곡선 분석 결과를 나타낸 도이다. 도 6A는 miR-205-5p의 ROC 분석 결과를 나타낸 도이다. 도 6B는 miR-429의 ROC 분석 결과를 나타낸 도이다. 도 6C는 miR-373-3p의 ROC 분석 결과를 나타낸 도이다. 도 6D는 miR-483-3p의 ROC 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 세포로부터 분리된 엑소좀을 투과전자현미경으로 촬영한 도이다. 도 2A는 인간 식도 상피 세포주인 Het-1A로부터 분리한 엑소좀을 촬영한 도이다. 도 2B는 ESCC(esophageal squamous cell carcinoma) 세포주인 TE8로부터 분리한 엑소좀을 촬영한 도이다. 도 2C는 ESCC 세포주인 TE9로부터 분리한 엑소좀을 촬영한 도이다.
도 3은 식도 상피 세포주 및 ESCC 세포주에서 유래한 엑소좀의 특징화를 나타낸 도이다. 도 3a는 엑소좀 마커인 CD63, TSG101 및 HSP70의 발현을 웨스턴 블랏 분석으로 나타낸 도이다. 도 3b는 엑소좀 마커 FLOT1, ICAM, ALIX, CD81, CD63, EpCAM, ANXA5 및 TSG101 관측, 골지 마커 GM130을 통한 세포 오염 여부 평가 및 양성 대조군을 포함하는 Exc-Check 엑소좀 항체 어레이 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 식도 상피 세포주와 ESCC 세포주 간 차별적으로 발현되는 엑소좀 miRNA를 나타낸 도이다. 도 4a는 차별적으로 발현되는 엑소좀 miRNA의 볼케이노 플랏을 나타낸 도이다. 도 4b는 차별적으로 발현되는 엑소좀 miRNA에 대한 계층적 클러스터링 히트맵을 나타낸 도이다.
도 5는 HC(healthy control) 20명 및 ESCC 환자 40명의 4가지 엑소좀 miRNA 발현 수준을 나타낸 도이다. 도 5A는 miR-205-5p의 발현 수준을 나타낸 도이다. 도 5B는 miR-429의 발현 수준을 나타낸 도이다. 도 5C는 miR-373-3p의 발현 수준을 나타낸 도이다. 도 5D는 miR-483-3p의 발현 수준을 나타낸 도이다.
도 6은 ESCC 환자와 HC를 구별할 수 있는 4가지 혈장 엑소좀 miRNA에 대한 수신자 작동 특성(Receiver-operating characteristic, ROC)곡선 분석 결과를 나타낸 도이다. 도 6A는 miR-205-5p의 ROC 분석 결과를 나타낸 도이다. 도 6B는 miR-429의 ROC 분석 결과를 나타낸 도이다. 도 6C는 miR-373-3p의 ROC 분석 결과를 나타낸 도이다. 도 6D는 miR-483-3p의 ROC 분석 결과를 나타낸 도이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실험예 1: 재료 및 방법
1-1. 샘플 준비
(1) 세포 배양
인간 식도 상피 세포주(Het-1A; ATCC, Rockville, MD, USA)와 두 종류의 인간 ESCC 세포주(TE8 and TE9; Riken Cell Bank, Tsukuba, Japan)를 이용하였다. Het-1A 세포는 10%의 소 태아 혈청(FBS)(Gibco, Grand Island, NY, USA)과 1%의 페니실린(Sigma, Burlington, MA, USA)을 첨가한 BEGM 배지(Lonza, Basel, Switzerland)에서 배양하였다. TE8 및 TE9 세포는 10% FBS와 1% 페니실린을 첨가한 RPMI1640 배지(Gibco, Grand Island, NY, USA)에서 배양하였다. 세포는 인큐베이터 내 37℃ 및 5% CO2 조건에서 유지되었다.
(2) 환자 혈액 샘플링
2016년 5월부터 2021년 4월까지 부산대학교 병원(Pusan National University Hospital, Busan, Korea)의 HC(healthy control) 20명 및 ESCC 환자 40명으로부터 말초(peripheral)혈액 샘플을 수집하였다. 말초혈액 샘플 3 mL에서 혈장을 분리하기 위해 800 x g로 10분간 15℃에서 원심분리하였다. 혈장 샘플은 엑소좀 분리 전까지 -80℃에서 보관하였다.
연구 프로토콜은 부산대학교 병원 기관생명윤리위원회(IRB No: H-1412-011-024)의 승인을 받았으며, 모든 HC 및 ESCC 환자로부터 혈액 수집에 앞서 서면 동의를 받았다.
1-2. 엑소좀 분리
(1) 세포주를 ExoDisc method로 처리
150 mm 세포 배양 접시 내 세포 밀도가 90 내지 100%에 이를 때, 세포를 무혈청 배지에서 48시간 인큐베이션하였다. 이후, 세포 배양 상층액 배지에서 75 mL를 얻어 즉시 300 x g로 10분간 원심분리하였다(세포 제거). 그 후, 죽은 세포를 제거하기 위해 2,000 x g로 10분간 원심분리하였고, 세포 파편을 제거하기 위해 10,000 x g로 30분간 원심분리하였다. 상층액은 Amicon® Ultra-15(Millipore, MA, USA)을 이용해 농축하였다. 마지막으로, 엑소좀은 ExoDisc(Labspinner, Ulsan, Korea)를 이용한 원심분리로 분리되었다.
(2) 혈장을 ExoQuick method로 처리
혈장 샘플(300 ㎕)에 3 ㎕의 thrombin(System Biosciences, Mountain View, CA, USA)을 첨가한 뒤 새로운 청결한 튜브에 옮겨 15℃에서 5분간 인큐베이션하였다. 이후, 10,000 rpm으로 5분간 원심분리하였으며, 상층액의 250 ㎕를 새로운 청결한 튜브에 옮긴 뒤, 63 ㎕의 ExoQuick 용액(System Biosciences)을 첨가하였다. 그 다음, 4℃에서 30분간 인큐베이션한 후 1,500 x g로 30분간 4℃에서 원심분리하였다, 상층액을 제거하고, 모든 액체를 제거하기 위해 샘플 혼합물을 1,500 x g로 5분간 원심분리하였다. 나머지 엑소좀 펠릿을 1 x 인산염 완충 식염수 300 ㎕에 재현탁시켰다.
1-3. 엑소좀 특성화
(1) 투과전자현미경
엑소좀 샘플을 1% 글루타르알데히드와 1:1 비율로 30분간 고정하였다. 고정된 샘플 6 ㎕를 탄소 코팅된 formvar 필름(EMS, Hatfield, PA, USA)과 함께 100-메쉬 구리 그리드에 파이펫하였고, 10분간 인큐베이션하였다. 초과한 액체는 블랏팅으로 제거하였다. 그리드는 100 ㎕의 증류수로 두 번 세척하였고, 초과한 액체는 블랏팅으로 제거하였다. 이후, 그리드를 1% 우라닐 아세테이트 30 ㎕로 12초간 처리하였다. 초과한 액체를 블랏팅으로 제거한 뒤, 샘플을 투과전자현미경(JEM-1200EXⅡ, JEOL, Japan)으로 관측하였다.
(2) 웨스턴 블랏팅
엑소좀 단백질 농도를 BCA 단백질 어세이 키트(Thermo Fisher Scientific, Waltham, WA, USA)를 이용해 측정하였다. 동일한 양의 단백질(50 ㎍)을 포함하는 엑소좀 샘플을 4 내지 15% SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)로 분리하였고, 폴리비닐리덴 플로라이드(polyvinylidene fluoride, PVDF) 막으로 전송하였다. PVDF 막을 1%의 소 혈청 알부민 용액으로 15℃에서 1.5시간 동안 블락시켰고, 4℃에서 항-CD63(1:5000)(Abcam, Cambridge, UK), 항-TSG101(1:5000)(Abcam) 및 HSP70(1:5000)(Abcam)과 같은 일차 항체와 밤새 인큐베이션하였다. 다음 날, 막을 Tris 완충 식염수-tween 20 용액에 넣고 15℃에서 1.5시간 동안 세척하였다. 이후 막에 이차 항체를 첨가하여 15℃에서 인큐베이션하였고, 강화된 화학발광 웨스턴 블랏팅 키트로 엑소좀 마커를 관찰하였다.
(3) Exo-check 엑소좀 항체 어레이
50 ㎍의 샘플 단백질에 용해 완충액(1 x)를 첨가한 후 15℃에서 30분간 혼합하였다. 이후, 샘플 혼합물을 컬럼을 통해 여과하고, 5 mL의 블라킹 완충액으로 혼합한 뒤 막에 첨가하였다. 막을 4℃에서 흔들면서 밤새 인큐베이션하였다. 다음날, 막을 두 번 세척한 뒤 5 mL의 관측 완충액을 첨가하였고, 15℃에서 흔들면서 30분간 인큐베이션하였다. 이후, 막을 세 번 세척하였다.
1-4. RNA 시퀀싱
각각의 샘플로부터 분리된 총 RNA로 제조자의 프로토콜에 따라 SMARTer smRNA-Seq 키트 for Illumina(Takara Bio, San Jose, CA, USA)를 이용해 시퀀싱 라이브러리를 구축하였다. 인풋 RNA는 올리고-(dT) 프라이머를 위한 프라이밍 시퀀스를 제공하기 위해 폴리아데닐화되었다. cDNA 합성은 각 첫 번째 가닥 cDNA 분자의 5’-말단에 어댑터 서열을 포함한 3’-smRNA dT 프라이머에 의해 프라이밍되었다. MMLV-derived PrimeScript?? 역전사 효소가 RNA 주형 5’- 말단에 도달할 때, 민감도를 높이기 위해 잠금 핵산 기술로 강화된 SMART smRNA Oligo에 의해 결합된 비주형 뉴클레오티드를 추가하였다. 주형 교체 단계에서는, PrimeScript?? 역전사 효소가 각 첫 번째 가닥 cDNA 분자의 3’-말단에 두 번째 어댑터 서열을 추가하기 위해 SMART smRNA Oligo를 주형으로 이용하였다. 다음 단계에서, PCR 증폭 도중 전체길이 Illumina 어댑터(샘플의 멀티플렉싱을 위한 인덱스 시퀀스 포함)를 첨가하였다. 전방향 PCR 프라이머는 SMART smRNA Oligo에 의해 첨가된 시퀀스와 결합하였고, 역방향 PCR 프라이머는 3’-smRNA dT 프라이머에 의해 첨가된 시퀀스와 결합하였다. 결과 cDNA 분자 라이브러리는 Illumina 유세포 위에 응집되기 위해 필요한 시퀀스를 포함한다. 라이브러리는 Agilent Bioanalyzer(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)에서의 사이즈, 순도 및 농도를 검사하여 검증하였다. 라이브러리는 등몰(equimolar) 양으로 채워졌고 51 염기의 리드를 생성하기 위해 Illumina HiSeq 2500 기기로 시퀀싱되었다. 이미지 분해 및 품질 값 계산은 Illumina pipeline 모듈을 이용해 수행하였다.
1-5. 정량적 RT-PCR
세포 엑소좀 miRNA의 발현은 정량적 역전사 PCR(qRT-PCR)로 측정하였다. 제조사의 지시에 따라 miVana PARISTM(Thermo Fisher Scientific, Waltham, WA, USA)을 이용해 400 ㎕의 엑소좀 샘플로부터 총 RNA를 분리하였다. cDNA 합성은 TaqMan miRNA RT 키트(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)로 수행하였다. qRT-PCR은 TaqMan® Universal PCR Master Mix II로 수행하였고, RG-6000 실시간 PCR을 이용해 실시간으로 모니터링하였다. Ct(cycle threshold)값은 Rotor-Gene 6000 series 소프트웨어 1.7(Corbett Research, Sydney, Australia)을 이용해 계산하였다. 혈장 샘플 내 miRNA의 상대적인 발현 수준은 내부 대조군으로 miR-191을 이용한 2-△△Ct를 통해 정규화하였다.
1-6. 생물정보학 분석
(1) 차별적 miRNA 발현
원시 데이터(각 miRNA의 리드)는 edgeR로 M-값 방법의 트림된 평균으로 정규화하였다. 전처리를 위해, 둘 이상의 샘플에서 카운트가 0인 miRNA는 제외하였고, 다운스트림 분석을 위해 350개의 성숙한 miRNA를 남겨두었다. 플랏팅을 위한 log2 변환을 용이하게 하기 위해 여과된 miRNA의 정규화된 리드 카운트에 더미 변수 “1”을 추가하였다. 각각의 miRNA에서, 인간 식도 상피 세포와 인간 ESCC 세포주 사이에서 log 카운트/백만 및 log 폴드 변화값이 측정되었다. 두 그룹을 비교하기 위한 통계적 가설 검정은 edgeR의 exact 테스트로 수행하였다. 두 그룹 사이에서 차별적으로 발현되는 miRNA는 |폴드 변화 (FC)|≥2 및 p-값<0.05의 기준으로 관측하였다. 차별적으로 발현되는 miRNA의 볼케이노 플랏은 edgeR을 이용해 생성하였다.
(2) 계층적 클러스터링
계층적 클러스터링 분석은 |폴드 변화 (FC)|≥2 및 p-값<0.05의 기준을 만족하는 차별적으로 발현하는 miRNA의 발현 패턴을 보여주기 위해 완전 결합과 유클리드 거리를 유사성의 척도로 사용하여 수행되었다.
1-7. 통계 분석
데이터는 중위수 및 사분위수 범위(interquartile range, IQR)로 표현된다. Mann-Whitney 테스트는 ESCC 환자와 HC 간 엑소좀 miRNA의 발현 수준을 비교하기 위해 이용되었다. 수신자 작동 특성(Receiver-operating characteristic, ROC) 곡선과 곡선 아래의 영역(areas under the curve, AUCs)은 ESCC 환자를 HC로부터 구별하기 위해 선택된 4개의 miRNA 수준을 추가적으로 평가하기 위해 사용되었다. ESCC 환자를 HC와 구별하기 위한 miRNA의 민감도, 특이도 및 양 및 음의 예측 값은 95% 신뢰 구간(Cis)을 사용하여 표현하였다. 모든 통계적 분석은 IBM Statistical 패키지 for the Social Sciences (SPSS) 버전 22.0, for Windows(IBM Co, Armonk, NY, USA)로 수행되었다. 모든 p-값은 양면이고 통계적 유의성은 p<0.05로 설정하였다.
실험예 2: 실험 결과
2-1. 엑소좀 분리 및 특성화
Het-1A, TE8 및 TE9 세포주로부터 엑소좀을 분리하고 분리된 결과물을 검증하기 위하여 아래와 같은 실험을 수행하였다. 우선, 엑소좀을 Het-1A, TE8 및 TE9의 조정배지에서 ExoDisc를 이용하여 분리하였다(도 1). 분리된 엑소좀의 직경은 대략 30 내지 200 nm이고 컵 모양의 형태를 보이고 있으며, 이는 엑소좀의 전형적인 특징을 나타낸다(도 2).
이후, 엑소좀을 특성화하기 위해, 엑소좀 표면 마커를 웨스턴 블랏팅으로 평가하였다. 그 결과, 모든 세포주에서 CD63, TSG101 및 HSP70과 같은 엑소좀 표면 마커의 발현이 관측되었다(도 3a).
또한, FLOT1, ICAM, ALIX, CD81, CD63, EpCAM, ANX5 및 TSG101와 같은 추가적인 엑소좀 마커를 확인하기 위해 Exo-Check 엑소좀 항체 어레이를 수행하였다. 그 결과, 모든 세포주에서 상기 엑소좀 마커가 관측되었으며, 양성 대조군 마커 역시 관측되었다(도 3b).
상기 실험을 통해서, Het-1A, TE8 및 TE9 세포주로부터 ExoDisc를 이용해 분리한 엑소좀이 모두 전형적인 엑소좀임을 검증하였다.
2-2. 식도편평세포암종 세포주에서 차별적으로 발현되는 엑소좀 miRNA 분석
식도편평세포암종(esophageal squamous cell carcinoma) 세포주에서 차별적으로 발현되는 엑소좀 miRNA를 확인하기 위하여, ESCC 세포주의 miRNA 시퀀싱을 수행하였다.
그 결과, 총 2,656개의 miRNA가 확인되었으나, 그 중 2,233개의 miRNA는 0 카운트 값을 가지고 있어 제외하고, 423개의 miRNA에 대하여 생물정보학적 분석을 수행하였다.
|폴드 변화 (FC)|≥2 및 p-값<0.05의 기준으로 423개의 miRNA를 필터링한 결과, 식도 상피 세포주와 비교하여 ESCC 세포주에서 차별적으로 발현되는 14개의 miRNA가 관측되었다(도 4a). 14개 중 5개의 miRNA는 상향조절되었으며, 9개의 miRNA는 하향조절되었다(표 1).
| Mature miRNA | Family | Sequence | Fold change | p-value | Expression level | |
| hsa-miR-205-5p | hsa-mir-205 | UCCUUCAUUCCACCGGAGUCUG (서열번호 1) |
4843.079 | <0.001 | Up | |
| hsa-miR-429 | hsa-mir-429 | UAAUACUGUCUGGUAAAACCGU (서열번호 2) |
267.564 | 0.020 | Up | |
| hsa-miR-375-3p | hsa-mir-375 | UUUGUUCGUUCGGCUCGCGUGA (서열번호 3) |
-29.156 | 0.020 | Down | |
| hsa-miR-6126 | hsa-mir-6126 | GUGAAGGCCCGGCGGAGA (서열번호 4) |
43.004 | 0.009 | Up | |
| hsa-miR-200c-3p | hsa-mir-200c | UAAUACUGCCGGGUAAUGAUGGA(서열번호 5) | 17.440 | 0.035 | Up | |
| hsa-miR-31-5p | hsa-mir-31 | AGGCAAGAUGCUGGCAUAGCU(서열번호 6) | 16.186 | 0.030 | Up | |
| hsa-miR-193a-5p | hsa-mir-193a | UGGGUCUUUGCGGGCGAGAUGA(서열번호 7) | -6.395 | 0.045 | Down | |
| hsa-miR-335-5p | hsa-mir-335 | UCAAGAGCAAUAACGAAAAAUGU(서열번호 8) | -7.156 | 0.031 | Down | |
| hsa-miR-935 | hsa-mir-935 | CCAGUUACCGCUUCCGCUACCGC(서열번호 9) | -8.137 | 0.029 | Down | |
| hsa-miR-664b-5p | hsa-mir-664b | UGGGCUAAGGGAGAUGAUUGGGUA(서열번호 10) | -11.285 | 0.037 | Down | |
| hsa-miR-7110-5p | hsa-mir-7110 | UGGGGGUGUGGGGAGAGAGAG(서열번호 11) | -11.416 | 0.021 | Down | |
| hsa-miR-4788 | hsa-mir-4788 | UUACGGACCAGCUAAGGGAGGC(서열번호 12) | -15.234 | 0.014 | Down | |
| hsa-miR-6089 | hsa-mir-6089-1, hsa-mir-6089-2 | GGAGGCCGGGGUGGGGCGGGGCGG (서열번호 13) |
-22.213 | 0.013 | Down | |
| hsa-miR-483-3p | hsa-mir-483 | UCACUCCUCUCCUCCCGUCUU (서열번호 14) |
-53.918 | 0.002 | Down | |
또한, 14개의 miRNA의 발현 패턴을 확인하기 위해, 계층적 클러스터링 분석을 수행한 결과, 식도 상피 세포주 및 ESCC 세포주에서의 엑소좀 miRNA 발현 패턴이 두 그룹으로 나뉘어짐을 확인하였다(도 4b).
상기 실험을 통해서, 식도 상피 세포주에서의 엑소좀 miRNA 발현 패턴과 ESCC 세포주에서의 엑소좀 miRNA 발현 패턴이 14개의 miRNA에 있어서 서로 다름을 검증하였다.
2-3. 식도편평세포암종 환자 내 표적 엑소좀 miRNA 검증
ESCC 세포주에서 식도 상피 세포주와 차별적으로 발현되는 14개의 miRNA가 ESCC 환자 혈장 내에서도 건강한 대조군(healthy control, HC) 혈장에 비해 차별적으로 발현되는지 확인하기 위한 실험을 진행하였다. 이를 위해, 14개의 miRNA에서 상위 2개의 상향조절 miRNA(miR-205-5p 및 miR-429)와 상위 2개의 하향조절 miRNA(miR-375-3p 및 miR-483-3p)를 ESCC 표적 miRNA로 선택하였고, 이들의 발현을 20명의 HC 및 40명의 ESCC 환자로부터 얻은 혈장 엑소좀 miRNA로 검증하였다.
그 결과, ESCC 환자에서 HC에 비해 혈장 엑소좀 miR-205-5p 및 miR-429가 유의하게 상향조절되었음을 확인하였다(도 5). 구체적으로, miR-205-5p의 경우, HC 그룹에서는 중위수 780.200[사분위수 범위 0.049, 5.926]으로 측정되었으나 ESCC 그룹에서는 중위수 57031.725[사분위수 범위 3.071, 179.540]로 훨씬 높게 측정되었다(p=0.001). 이와 유사하게 miR-429의 경우, HC 그룹에서는 중위수 2.355[사분위수 범위 0.263, 3.805]로 측정되었으나 ESCC 그룹에서는 중위수 413.874[사분위수 범위 1.190, 17.005]로 더 높게 측정되었다(p=0.012). 이에 반해, 혈장 엑소좀 miR-375-3p는 ESCC 그룹에서 중위수 0.201[사분위수 범위 0.038, 0.174]로 측정되어 중위수 11.838[사분위수 범위 0.064, 15.414]로 측정된 HC 그룹에 비해 유의하게 하향조절되었음을 확인하였다(p=0.002)(도 5). 혈장 엑소좀 miR-483-3p의 경우 ESCC 그룹에서는 중위수 1.955[사분위수 범위 0.710, 2.746]로 측정되었고 HC 그룹에서는 중위수 1.544[사분위수 범위 0.554, 2.147]로 측정된 바(p=0.335), 두 그룹간 유의한 차이를 보이지 않았다(도 5).
추가적으로, 혈장 엑소좀 miRNA가 ESCC 환자를 HC로부터 구별할 수 있는 잠재적인 진단 바이오마커로 활용될 수 있는지 확인하기 위하여, ROC(Receiver-operating characteristic) 곡선을 분석하였다(도 6).
그 결과, miR-205-5p의 AUC(areas under the curve)는 0.770(95% 신뢰구간 0.633-0.907, p=0.001)이고, miR-429의 AUC는 0.699(95% 신뢰구간 0.569-0.829, p=0.012)이며, miR-375-3p의 AUC는 0.741(95% 신뢰구간 0.591-0.591, p=0.002)이고, miR-483-3p의 AUC는 0.577(95% 신뢰구간 0.422-0.731, p=0.335)로 계산되었다. 각각의 컷오프 값인 5.04, 2.564, 0.136 및 1.513에서의 ESCC 진단 민감도 및 특이도는 miR-205-5p의 경우 72.5% 및 70.0%이고, miR-429의 경우 60.0% 및 60.0%이며, miR-375-3p의 경우 65.0% 및 65.0%이고, miR-483-3p의 경우 55.0% 및 55.0%로 계산되었다.
상기 실험을 통해서, ESCC 환자 혈장 샘플에서의 miR-205-5p, miR-429 및 miR-375-3p의 발현 수준이 HC 혈장 샘플에서의 발현 수준과 구별됨을 확인함으로써, miR-205-5p, miR-429 및 miR-375-3p가 ESCC의 진단을 위한 바이오마커로서 사용될 수 있음을 검증하였다.
<110> Pusan National University Hospital
<120> Biomarker composition for diagnosing esophageal cancer comprising
exosomal miRNAs
<130> PD21-479
<160> 14
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hsa-mir-205
<400> 1
uccuucauuc caccggaguc ug 22
<210> 2
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hsa-mir-429
<400> 2
uaauacuguc ugguaaaacc gu 22
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<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hsa-mir-375
<400> 3
uuuguucguu cggcucgcgu ga 22
<210> 4
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hsa-mir-6126
<400> 4
gugaaggccc ggcggaga 18
<210> 5
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hsa-mir-200c
<400> 5
uaauacugcc ggguaaugau gga 23
<210> 6
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hsa-mir-31
<400> 6
aggcaagaug cuggcauagc u 21
<210> 7
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hsa-mir-193a
<400> 7
ugggucuuug cgggcgagau ga 22
<210> 8
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hsa-mir-335
<400> 8
ucaagagcaa uaacgaaaaa ugu 23
<210> 9
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hsa-mir-935
<400> 9
ccaguuaccg cuuccgcuac cgc 23
<210> 10
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hsa-mir-664b
<400> 10
ugggcuaagg gagaugauug ggua 24
<210> 11
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hsa-mir-7110
<400> 11
ugggggugug gggagagaga g 21
<210> 12
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hsa-mir-4788
<400> 12
uuacggacca gcuaagggag gc 22
<210> 13
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hsa-mir-6089-1, hsa-mir-6089-2
<400> 13
ggaggccggg guggggcggg gcgg 24
<210> 14
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hsa-mir-483
<400> 14
ucacuccucu ccucccgucu u 21
Claims (13)
- miR-205-5p, miR-429 및 miR-375-3p로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 식도암 진단용 바이오마커 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 miR-205-5p는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것이고, miR-429는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것이며, miR-375-3p는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 것인, 바이오마커 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 miR-205-5p, miR-429 및 miR-375-3p는 엑소좀 miRNA (Exosomal miRNA)인, 바이오마커 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 miRNA 발현 수준을 측정하는 제제는 miR-205-5p 및 miR-429로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA 발현 수준이 대조군에 비하여 증가한지 여부를 측정하는 것인, 바이오마커 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 miRNA 발현 수준을 측정하는 제제는 miR-375-3p miRNA 발현 수준이 대조군에 비하여 감소한지 여부를 측정하는 것인, 바이오마커 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 miRNA 발현 수준을 측정하는 제제는 miR-205-5p, miR-429 및 miR-375-3p로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA와 특이적으로 결합하는 센스 또는 안티센스 프라이머, 프로브, 앱타머, 항체, 펩티드 및 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인, 바이오마커 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 miRNA 발현 수준은 차세대 염기서열 분석(Next generation sequencing, NGS), 중합효소반응(PCR), 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사중합효소반응(Realtime RT-PCR), 정량적 역전사중합효소반응(Quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), 웨스턴 블랏팅(Western blotting), DNA 마이크로어레이 분석법, ELISA(enzyme linked immunosorbent asay), 방사선면역분석(Radioimmunoassay; RIA), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케이트(rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation assay), 보체고정분석법 (Complement Fixation Assay) 및 FACS(Fluorescence activated cell sorter)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법으로 측정되는, 바이오마커 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 식도암은 식도편평세포암종(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC), 식도선암(esophageal adenocarcinoma), 평활근 육종(leiomyosarcoma), 횡문근 육종(rhabdomyosarcoma), 림프종(lymphoma) 및 흑색종(melanoma)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 바이오마커 조성물.
- miR-205-5p, miR-429 및 miR-375-3p로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 식도암 진단용 키트.
- 대조군 시료 및 검체로부터 분리된 시료에 포함된 miR-205-5p, miR-429 및 miR-375-3p로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA 발현 수준을 측정하는 단계;
상기 대조군 시료 및 검체로부터 분리된 시료에서 측정된 miRNA 발현 수준을 비교하는 단계; 및
상기 비교된 miRNA 발현 수준이
(i) 검체로부터 분리된 시료 내 miR-205-5p 발현 수준이 대조군 시료 내 miR-205-5p 발현 수준 보다 높은 경우,
(ii) 검체로부터 분리된 시료 내 miR-429 발현 수준이 대조군 시료 내 miR-429 발현 수준 보다 높은 경우 및
(iii) 검체로부터 분리된 시료 내 miR-375-3p 발현 수준이 대조군 시료 내 miR-375-3p 발현 수준 보다 낮은 경우로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경우에 식도암으로 진단하는 단계;를 포함하는, 식도암 진단을 위한 정보제공방법.
- 청구항 10에 있어서, 상기 miR-205-5p는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것이고, miR-429는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것이며, miR-375-3p는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 것인, 식도암 진단을 위한 정보제공방법.
- 청구항 10에 있어서, 상기 비교된 miRNA 발현 수준이 (i) 또는 (ii)인 경우 식도암으로 진단하는 단계를 포함하는, 식도암 진단을 위한 정보제공방법.
- 청구항 10에 있어서, 상기 비교된 miRNA 발현 수준이 (iii)인 경우 식도암으로 진단하는 단계를 포함하는, 식도암 진단을 위한 정보제공방법.
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