JP3417563B2 - 特殊細胞集団もしくは混合細胞集団および混合細胞集団を含有する溶液中の特異標的細胞の検出方法 - Google Patents
特殊細胞集団もしくは混合細胞集団および混合細胞集団を含有する溶液中の特異標的細胞の検出方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は細胞集団および細胞集団の溶液中の特異標的
細胞の免疫磁気的検出方法（immunomagnetic method fo
r detection）に関する。また本発明は、異なる細胞集
団に上記方法を実施するのに適したキットに関する。
細胞の免疫磁気的検出方法（immunomagnetic method fo
r detection）に関する。また本発明は、異なる細胞集
団に上記方法を実施するのに適したキットに関する。
生物学、生化学さらにその隣接科学分野には、化学物
質が相互に関連した方法に対する需要が多い。このよう
な方法は、正常なおよび異常な細胞集団の両者について
研究する場合により重要となる。特に固体の支持体を用
いると、細胞は固定され、検出され、分離されて精製す
ることができる。さらに、細胞含有物は一連の高性能の
方法を用いて試験することができる。また細胞を生育可
能な形態で分離できることも重要である。
質が相互に関連した方法に対する需要が多い。このよう
な方法は、正常なおよび異常な細胞集団の両者について
研究する場合により重要となる。特に固体の支持体を用
いると、細胞は固定され、検出され、分離されて精製す
ることができる。さらに、細胞含有物は一連の高性能の
方法を用いて試験することができる。また細胞を生育可
能な形態で分離できることも重要である。
アフィニティー結合法は化学物質／生化学物質を連結
する高性能の方法である。この方法では、一対の結合パ
ートナーは（例えば連結される物質に結合される）接触
させると互いに結合する。このような結合において結合
パートナーの一方は細胞表面の一分子によって表され
る。このような結合パートナー系の多くは公知であり、
例えば細胞における抗原−抗体、酵素−受容体、リガン
ド−受容体の相互作用およびビオチン−アビジンの結合
があるが、これらのなかで抗原−抗体の結合が最も頻繁
に使用される。ハプテン／抗ハプテン結合対法も最近提
案されている（WO 91/01368）。
する高性能の方法である。この方法では、一対の結合パ
ートナーは（例えば連結される物質に結合される）接触
させると互いに結合する。このような結合において結合
パートナーの一方は細胞表面の一分子によって表され
る。このような結合パートナー系の多くは公知であり、
例えば細胞における抗原−抗体、酵素−受容体、リガン
ド−受容体の相互作用およびビオチン−アビジンの結合
があるが、これらのなかで抗原−抗体の結合が最も頻繁
に使用される。ハプテン／抗ハプテン結合対法も最近提
案されている（WO 91/01368）。
上記のような方法が特異的な細胞（その後の各種の試
験に用いる被検体）を分離するのに利用される場合、結
合しているパートナーに対して破壊作用を起こさずに結
合を切断する必要があり、理想的には、結合パートナー
は元の状態に戻ったときにその機能を回復しなければな
らない。抗原／抗抗原およびハプテン／抗ハプテンの結
合を適正に切断する方法が提案されているが（WO 91/15
766,WO 91/01368）、上記のことは必ずしも実現されて
いない。
験に用いる被検体）を分離するのに利用される場合、結
合しているパートナーに対して破壊作用を起こさずに結
合を切断する必要があり、理想的には、結合パートナー
は元の状態に戻ったときにその機能を回復しなければな
らない。抗原／抗抗原およびハプテン／抗ハプテンの結
合を適正に切断する方法が提案されているが（WO 91/15
766,WO 91/01368）、上記のことは必ずしも実現されて
いない。
結合パートナーの一方が不溶性の支持体例えば常磁性
粒子に結合されている方法は公知であり、この方法によ
って混合細胞集団中の標的細胞の分離が消極的分離もし
くは積極的分離として実施される。消極的分離法では、
不要な細胞は、不要細胞に対して特異的な抗体でコート
された粒子とともに細胞とインキュベートすることによ
って細胞試料から除くことができる。インキュベートを
行ってから、細胞／抗体／粒子複合体は粒子を用いて除
去し、必要な標的細胞を残すことができる。この結果は
不満足な場合が多い。というのは、必要な細胞は多少は
精製されているが細胞集団中に残り、またこの分離法の
目的は特異標的細胞について試験しおよび／またはさら
に研究することだからである。積極的分離を行うために
粒子を使用する試みがなされている。この場合、必要な
標的細胞が混合細胞集団から取り出される。しかしこれ
らの方法はある種の標的細胞に用いられているがすべて
の標的細胞系に対して適しているわけではない。ハプテ
ン／抗ハプテン結合系に関する積極的分離法が最近提案
されており（WO 91/01368）、また骨髄から造血前駆細
胞を分離する方法も提案されている（WO 91/09938）。
後者の方法は、特異細胞すなわち造血前駆細胞を分離し
骨髄中で増殖させるため、積極的なおよび消極的な選択
を組合わせて用い、粒子の取り出しによって行われる。
粒子に結合されている方法は公知であり、この方法によ
って混合細胞集団中の標的細胞の分離が消極的分離もし
くは積極的分離として実施される。消極的分離法では、
不要な細胞は、不要細胞に対して特異的な抗体でコート
された粒子とともに細胞とインキュベートすることによ
って細胞試料から除くことができる。インキュベートを
行ってから、細胞／抗体／粒子複合体は粒子を用いて除
去し、必要な標的細胞を残すことができる。この結果は
不満足な場合が多い。というのは、必要な細胞は多少は
精製されているが細胞集団中に残り、またこの分離法の
目的は特異標的細胞について試験しおよび／またはさら
に研究することだからである。積極的分離を行うために
粒子を使用する試みがなされている。この場合、必要な
標的細胞が混合細胞集団から取り出される。しかしこれ
らの方法はある種の標的細胞に用いられているがすべて
の標的細胞系に対して適しているわけではない。ハプテ
ン／抗ハプテン結合系に関する積極的分離法が最近提案
されており（WO 91/01368）、また骨髄から造血前駆細
胞を分離する方法も提案されている（WO 91/09938）。
後者の方法は、特異細胞すなわち造血前駆細胞を分離し
骨髄中で増殖させるため、積極的なおよび消極的な選択
を組合わせて用い、粒子の取り出しによって行われる。
WO 91/01368には、ハプテン、抗ハプテン抗体類およ
び抗細胞抗体類が互いに結合する性能を利用して、不溶
性支持体すなわち粒子と標的細胞との結合、すなわち少
なくともハプテンと抗ハプテン抗体またはハプテンと抗
ハプテン抗体および抗抗ハプテン抗体もしくは第二の抗
細胞抗体との組合わせからなる結合を形成させることに
よって、標的細胞を不溶性支持体に連結する方法が記載
されている。この複合体のその後の切断は、その複合体
をハプテンもしくはハプテン類似体に再び暴露すること
によって行われる。したがって形成された結合には一つ
以上の成分に加えて常にハプテンを含有している。この
方法は、非特異的な標的細胞に関しおよび標的細胞の分
離と不溶性支持体の放出に関する。
び抗細胞抗体類が互いに結合する性能を利用して、不溶
性支持体すなわち粒子と標的細胞との結合、すなわち少
なくともハプテンと抗ハプテン抗体またはハプテンと抗
ハプテン抗体および抗抗ハプテン抗体もしくは第二の抗
細胞抗体との組合わせからなる結合を形成させることに
よって、標的細胞を不溶性支持体に連結する方法が記載
されている。この複合体のその後の切断は、その複合体
をハプテンもしくはハプテン類似体に再び暴露すること
によって行われる。したがって形成された結合には一つ
以上の成分に加えて常にハプテンを含有している。この
方法は、非特異的な標的細胞に関しおよび標的細胞の分
離と不溶性支持体の放出に関する。
非特異的なハプテン群の化合物を含有せず、また非特
異的細胞との会合を最小限にして特異標的細胞の検出を
行って、不溶性支持体と特異標的細胞間の結合を後で切
断する必要をなくするような、標的細胞と不溶性支持体
とを連結する簡単な結合が要求されている。
異的細胞との会合を最小限にして特異標的細胞の検出を
行って、不溶性支持体と特異標的細胞間の結合を後で切
断する必要をなくするような、標的細胞と不溶性支持体
とを連結する簡単な結合が要求されている。
WO 92/04961は、コロイド状の磁性粒子を用いて非磁
性試験媒体から細胞又は異なる分子を分離するための方
法および複合化した装置を含んでいる。この方法では、
溶液内での粒子の沈殿を避けるためにまたその方法は複
雑な分離過程を必要とするので、小さな（サブミクロ
ン）粒子が使用され、その分離過程で、磁界を強める手
段が試験媒体に作用する。これは細胞に反対の影響を及
ぼす。
性試験媒体から細胞又は異なる分子を分離するための方
法および複合化した装置を含んでいる。この方法では、
溶液内での粒子の沈殿を避けるためにまたその方法は複
雑な分離過程を必要とするので、小さな（サブミクロ
ン）粒子が使用され、その分離過程で、磁界を強める手
段が試験媒体に作用する。これは細胞に反対の影響を及
ぼす。
したがって本発明の目的は、特異的標細胞を血液中お
よび骨髄中で用いた場合、正常細胞に非特異的に結合す
る問題を起こすことなく特異標的細胞を、診断のために
検出することである。換言すれば、多数の細胞を顕微鏡
で容易に選別することができかつ操作が迅速で簡単な、
各種細胞型の高感度検出法である。さらに本発明の方法
は、細胞−粒子複合体を分解する必要なしに、細胞を培
養後、生化学、生物学および免疫学の試験を行うためお
よびヌクレオチドまたはタンパク質のレベルで特異的な
遺伝子を試験するため細胞を分離するのに用いることが
できる。本発明の他の目的は本願の特許請求の範囲に特
定されている方法を実施するのに用いるキットを提供す
ることである。
よび骨髄中で用いた場合、正常細胞に非特異的に結合す
る問題を起こすことなく特異標的細胞を、診断のために
検出することである。換言すれば、多数の細胞を顕微鏡
で容易に選別することができかつ操作が迅速で簡単な、
各種細胞型の高感度検出法である。さらに本発明の方法
は、細胞−粒子複合体を分解する必要なしに、細胞を培
養後、生化学、生物学および免疫学の試験を行うためお
よびヌクレオチドまたはタンパク質のレベルで特異的な
遺伝子を試験するため細胞を分離するのに用いることが
できる。本発明の他の目的は本願の特許請求の範囲に特
定されている方法を実施するのに用いるキットを提供す
ることである。
本発明の目的は、本願の特許請求の範囲に特定されて
いる方法とキットとによって達成される。
いる方法とキットとによって達成される。
混合細胞集団および細胞集団含有生理学的溶液中の標
的細胞の免疫磁気検出を行う本発明の方法は、特定のタ
イプの正常細胞と病原細胞との両者を検出するのに適し
ているだけでなく、両者の積極的分離を行うのにも用い
ることができる。本発明の方法によれば、特異的な標的
細胞と常磁性粒子（一つもしくは二つの成分で構成され
ている）のような不溶性支持体との結合が形成される。
この粒子は、必要な標的細胞の膜中の特異的抗原決定基
に対するマウスもしくはヒト起源の抗細胞抗体でコート
されるか、またはこの粒子は標的細胞の膜の抗原決定基
に対する特異的抗細胞抗体のFc部分に結合できるポリク
ローナルの抗マウス抗体もしくは抗ヒト抗体でコートさ
れる。この粒子をコートするためにポリクローナルの抗
マウス抗体／抗ヒト抗体を使用する代わりに、モノクロ
ーナルのラット抗マウス／抗ヒト抗体を使用することが
できる。この最後の抗体は、部分的にモノクローナル起
源であるため、抗細胞抗体と一層特異的に結合するの
で、血液のような溶液中で他の細胞と交差反応を起こす
危険性が減少する。さらに、細胞懸濁液を、緩和な界面
活性剤および／または目視可能にする蛍光剤類、金属コ
ロイド類（metallocolloids）、放射性同位元素類、ビ
オチン複合体類もしくはある種の酵素類で予め標識をつ
けてあるかつけてない抗体類もしくは抗体フラグメント
類の第二のセットとともにインキュベートするとこの方
法の特異性が劇的に増大する。
的細胞の免疫磁気検出を行う本発明の方法は、特定のタ
イプの正常細胞と病原細胞との両者を検出するのに適し
ているだけでなく、両者の積極的分離を行うのにも用い
ることができる。本発明の方法によれば、特異的な標的
細胞と常磁性粒子（一つもしくは二つの成分で構成され
ている）のような不溶性支持体との結合が形成される。
この粒子は、必要な標的細胞の膜中の特異的抗原決定基
に対するマウスもしくはヒト起源の抗細胞抗体でコート
されるか、またはこの粒子は標的細胞の膜の抗原決定基
に対する特異的抗細胞抗体のFc部分に結合できるポリク
ローナルの抗マウス抗体もしくは抗ヒト抗体でコートさ
れる。この粒子をコートするためにポリクローナルの抗
マウス抗体／抗ヒト抗体を使用する代わりに、モノクロ
ーナルのラット抗マウス／抗ヒト抗体を使用することが
できる。この最後の抗体は、部分的にモノクローナル起
源であるため、抗細胞抗体と一層特異的に結合するの
で、血液のような溶液中で他の細胞と交差反応を起こす
危険性が減少する。さらに、細胞懸濁液を、緩和な界面
活性剤および／または目視可能にする蛍光剤類、金属コ
ロイド類（metallocolloids）、放射性同位元素類、ビ
オチン複合体類もしくはある種の酵素類で予め標識をつ
けてあるかつけてない抗体類もしくは抗体フラグメント
類の第二のセットとともにインキュベートするとこの方
法の特異性が劇的に増大する。
以下に、検出および分離を行う標的細胞として癌細胞
を用いて本発明を詳しく説明する。しかし本発明の方法
は癌細胞に限定されず、かつその開示事項はこの特定の
使用分野に本発明の方法を限定するものではない。本発
明の方法は広く細胞学の研究に適しているからである。
を用いて本発明を詳しく説明する。しかし本発明の方法
は癌細胞に限定されず、かつその開示事項はこの特定の
使用分野に本発明の方法を限定するものではない。本発
明の方法は広く細胞学の研究に適しているからである。
癌患者を管理する場合、癌が局在しているかどうか、
または転移拡散が他の組織に起こっているかどうかにつ
いて疾患の病期分類を行うことが、個々の患者に対して
治療法を選ぶ場合に最も重要である。悪性細胞は、リン
パ管を経由して周囲の組織中に直接侵入するかまたは血
液中の腫瘍細胞が骨髄および中枢神経系および脳脊髄液
を含む遠隔臓器に分散することによって広がる。
または転移拡散が他の組織に起こっているかどうかにつ
いて疾患の病期分類を行うことが、個々の患者に対して
治療法を選ぶ場合に最も重要である。悪性細胞は、リン
パ管を経由して周囲の組織中に直接侵入するかまたは血
液中の腫瘍細胞が骨髄および中枢神経系および脳脊髄液
を含む遠隔臓器に分散することによって広がる。
転移腫瘍細胞の検出は、最近まで、生検用に採取した
腫瘍試料、骨髄および末梢血液の塗抹標本および各種の
体液をサイトセントリヒューゲーション（cytosentrifu
gation）に付した後作製したスライドガラス上の試料に
対して光学顕微鏡を電子顕微鏡を用いて行う形態学的方
法によって行われてきた。抗原を認識するモノクローナ
ル抗体は主として、異なるタイプの悪性細胞の表面に出
現するので、転移細胞の同定には、免疫細胞化学と免疫
蛍光との使用が増大している。したがって、生検用に採
取した腫瘍またはサイトセントリヒューゲート（cytose
ntrifugate）から作製したスライドガラス上の試料をモ
ノクローナル抗体で処理して、これら抗体と腫瘍細胞と
の結合を着色もしくは蛍光によって目視可能にする。後
者の蛍光による方法の場合、蛍光顕微鏡を使用する必要
があり、あるいは細胞懸濁液を作製して流動細胞測定器
を使用する。
腫瘍試料、骨髄および末梢血液の塗抹標本および各種の
体液をサイトセントリヒューゲーション（cytosentrifu
gation）に付した後作製したスライドガラス上の試料に
対して光学顕微鏡を電子顕微鏡を用いて行う形態学的方
法によって行われてきた。抗原を認識するモノクローナ
ル抗体は主として、異なるタイプの悪性細胞の表面に出
現するので、転移細胞の同定には、免疫細胞化学と免疫
蛍光との使用が増大している。したがって、生検用に採
取した腫瘍またはサイトセントリヒューゲート（cytose
ntrifugate）から作製したスライドガラス上の試料をモ
ノクローナル抗体で処理して、これら抗体と腫瘍細胞と
の結合を着色もしくは蛍光によって目視可能にする。後
者の蛍光による方法の場合、蛍光顕微鏡を使用する必要
があり、あるいは細胞懸濁液を作製して流動細胞測定器
を使用する。
従来の方法は感度および／または特異性が限定され、
通常面倒でかつ時間がかかりまた高度の熟練が必要であ
る。また流動細胞測定法には高価な装置が付随してい
る。
通常面倒でかつ時間がかかりまた高度の熟練が必要であ
る。また流動細胞測定法には高価な装置が付随してい
る。
血液および骨髄中の腫瘍細胞を検出する形態学方法
は、免疫細胞化学法および免疫蛍光法を用いる方法より
感度がはるかに低い（Beiskeら,Am.J.Pathology,141巻
３号,1992年９月）。しかし後者の方法は、腫瘍細胞が
有核細胞の合計数の１％より少ない場合には不充分であ
る。流動細胞測定法は、顕微鏡を使用する方法より感度
が優れているが多数の細胞を入手できることが必要であ
り、またいくつかの技術的に難しい点がある。すなわ
ち、細胞が凝集して問題を起こすことがあり、そしてこ
の方法は標識をつけた腫瘍細胞と非特異的に蛍光を発す
る正常細胞とを識別することができない。
は、免疫細胞化学法および免疫蛍光法を用いる方法より
感度がはるかに低い（Beiskeら,Am.J.Pathology,141巻
３号,1992年９月）。しかし後者の方法は、腫瘍細胞が
有核細胞の合計数の１％より少ない場合には不充分であ
る。流動細胞測定法は、顕微鏡を使用する方法より感度
が優れているが多数の細胞を入手できることが必要であ
り、またいくつかの技術的に難しい点がある。すなわ
ち、細胞が凝集して問題を起こすことがあり、そしてこ
の方法は標識をつけた腫瘍細胞と非特異的に蛍光を発す
る正常細胞とを識別することができない。
本発明の方法は、多数の細胞を顕微鏡で容易に選別す
ることができかつ結合された磁気ビーズは容易に認識で
きるので、例えば転移腫瘍細胞を非常に高感度で検出す
ることができる。使用されるモノクローナル抗体は、例
えば腫瘍細胞と充分な特異性で結合するが、血液、骨髄
のような混合細胞懸濁液中に存在し他の腫瘍徴候を示
す、標的細胞以外の細胞には結合せず、結合したビーズ
を有する細胞はすべて標的細胞である。その上、その手
順は迅速かつ簡単に行うことができしかも従来の顕微鏡
を使っていずれの研究者でも実行できる。
ることができかつ結合された磁気ビーズは容易に認識で
きるので、例えば転移腫瘍細胞を非常に高感度で検出す
ることができる。使用されるモノクローナル抗体は、例
えば腫瘍細胞と充分な特異性で結合するが、血液、骨髄
のような混合細胞懸濁液中に存在し他の腫瘍徴候を示
す、標的細胞以外の細胞には結合せず、結合したビーズ
を有する細胞はすべて標的細胞である。その上、その手
順は迅速かつ簡単に行うことができしかも従来の顕微鏡
を使っていずれの研究者でも実行できる。
本発明の新規な方法では、腫瘍細胞に存在するが、問
題の正常細胞もしくは他の目的のための正常細胞の特定
の分集団には存在しない抗原を特異的に識別する例えば
マウスもしくはヒト起源のモノクローナル抗体を、常磁
性粒子に直接結合させるか、または腫瘍細胞に結合する
それぞれの抗体もしくはIgG抗体のFc部分を特異的に認
識する抗体で予め覆ったビーズに結合させる。細胞に結
合する抗体はIgG型もしくはIgM型でありまたはabIgGも
しくはIgMである。使用される抗標的細胞抗体の例とし
ては、抗パン・ヒト抗体（Brulandら、未刊行；動物細
胞中のヒト細胞を検出するのに適している）に加えて、
抗原決定基の群、例えばCD56/NCAM抗原（MOC−１）、ク
ラスター２上皮抗原（MOC−31）、クラスター２（MW＝
約40KD）抗原（NuLu10）（Myklebustら,Br.J.Cancer Su
ppl.,63巻、49〜53頁、1991年）、HMW黒色腫関連抗原
（9.2,27）（Morganら,Hybridoma,1巻、27〜36頁、1981
年）、80KDの肉腫関連抗原（TP1およびTP3）（Cancer R
es.,48巻、5302〜5309頁、1988年）、ムチン抗原類（Di
elら,Breast Cancer Res.Treatm,1991年）またはEGF受
容体抗原（425.3）（Merck社）に対する抗体がある。上
記の425.3抗体は正常および悪性の細胞の両者の抗原に
対する抗体である。抗体類としてはさらに、成長因子受
容体、例えばECF受容体、PDGF（ＡとＢ）受容体、イン
シュリン受容体、インシュリン様受容体、トランスフェ
リン受容体、MGFおよびFGFの受容体、インテグリン類の
群、他の接着膜分子類および正常細胞と異常細胞の両者
のMDRタンパク質、ならびに正常細胞と悪性細胞および
悪性細胞の膜および悪性細胞にのみ発現される癌産生物
例えばNeu/erb B2/HER2に加えて正常細胞の分集団に存
在する抗原に対する抗体がある。悪性細胞としては、乳
癌、卵巣癌および肺癌の細胞、黒色腫、肉腫、グリア芽
細胞腫、胃腸器官および網内系の癌細胞があり、または
標的細胞は、非新生物性疾患例えば心臓血管、神経、
肺、自己免疫、胃腸、尿生殖器、網内系などの疾患に関
連する細胞と関連している。さらに悪性細胞集団は、骨
髄、末梢血液中に存在している場合があり、胸水および
腹腔液および他の体液区分例えば尿、脳脊髄液、精液、
リンパ液由来のものがあり、または正常な組織もしくは
臓器例えば肝臓、リンパ節、脾臓、肺臓、膵臓、骨組
織、中枢神経系、前立腺、皮膚および粘膜の充実性腫瘍
由来のものがある。本発明の方法に用いる抗原決定基お
よび対応する抗体または抗体フラグメントのより完全な
一覧表を表１に示す。
題の正常細胞もしくは他の目的のための正常細胞の特定
の分集団には存在しない抗原を特異的に識別する例えば
マウスもしくはヒト起源のモノクローナル抗体を、常磁
性粒子に直接結合させるか、または腫瘍細胞に結合する
それぞれの抗体もしくはIgG抗体のFc部分を特異的に認
識する抗体で予め覆ったビーズに結合させる。細胞に結
合する抗体はIgG型もしくはIgM型でありまたはabIgGも
しくはIgMである。使用される抗標的細胞抗体の例とし
ては、抗パン・ヒト抗体（Brulandら、未刊行；動物細
胞中のヒト細胞を検出するのに適している）に加えて、
抗原決定基の群、例えばCD56/NCAM抗原（MOC−１）、ク
ラスター２上皮抗原（MOC−31）、クラスター２（MW＝
約40KD）抗原（NuLu10）（Myklebustら,Br.J.Cancer Su
ppl.,63巻、49〜53頁、1991年）、HMW黒色腫関連抗原
（9.2,27）（Morganら,Hybridoma,1巻、27〜36頁、1981
年）、80KDの肉腫関連抗原（TP1およびTP3）（Cancer R
es.,48巻、5302〜5309頁、1988年）、ムチン抗原類（Di
elら,Breast Cancer Res.Treatm,1991年）またはEGF受
容体抗原（425.3）（Merck社）に対する抗体がある。上
記の425.3抗体は正常および悪性の細胞の両者の抗原に
対する抗体である。抗体類としてはさらに、成長因子受
容体、例えばECF受容体、PDGF（ＡとＢ）受容体、イン
シュリン受容体、インシュリン様受容体、トランスフェ
リン受容体、MGFおよびFGFの受容体、インテグリン類の
群、他の接着膜分子類および正常細胞と異常細胞の両者
のMDRタンパク質、ならびに正常細胞と悪性細胞および
悪性細胞の膜および悪性細胞にのみ発現される癌産生物
例えばNeu/erb B2/HER2に加えて正常細胞の分集団に存
在する抗原に対する抗体がある。悪性細胞としては、乳
癌、卵巣癌および肺癌の細胞、黒色腫、肉腫、グリア芽
細胞腫、胃腸器官および網内系の癌細胞があり、または
標的細胞は、非新生物性疾患例えば心臓血管、神経、
肺、自己免疫、胃腸、尿生殖器、網内系などの疾患に関
連する細胞と関連している。さらに悪性細胞集団は、骨
髄、末梢血液中に存在している場合があり、胸水および
腹腔液および他の体液区分例えば尿、脳脊髄液、精液、
リンパ液由来のものがあり、または正常な組織もしくは
臓器例えば肝臓、リンパ節、脾臓、肺臓、膵臓、骨組
織、中枢神経系、前立腺、皮膚および粘膜の充実性腫瘍
由来のものがある。本発明の方法に用いる抗原決定基お
よび対応する抗体または抗体フラグメントのより完全な
一覧表を表１に示す。
本発明の方法では抗体を常磁性粒子に直接結合させる
ことからなり、またはその結合は例えばポリクローナル
抗マウス抗体類、モノクローナルラット抗マウス抗体ま
たはモノクローナル抗ヒト抗体のような、前記の個々の
抗体のFc部分を特異的に認識する表面結合抗体（surfac
e−bound antibody）に結合させることによって行うこ
とができる。抗体で被覆された常磁性ビーズを次に被検
細胞の懸濁液と混合し、次いでゆるやかに回転させなが
ら、０〜25℃好ましくは４℃で５〜10分間乃至２時間好
ましくは30分間インキュベートする。また本発明の方法
は、遊離の標的細胞の抗体を細胞懸濁液に添加し、ゆる
やかに回転しながら０〜20℃好ましくは４℃で５〜10分
間乃至２時間好ましくは30分間インキュベートし、ステ
ップの順序を変更して実施してもよい。次に抗マウス抗
体または抗ヒト抗体で予めコートした常磁性粒子を先に
述べたのと同様にして上記のインキュベートした細胞懸
濁液に添加し、得られた懸濁液をさらに、ゆるやかに撹
拌しながら０〜25℃好ましくは４℃で５〜10分間乃至２
時間好ましくは30分間インキュベートする。
ことからなり、またはその結合は例えばポリクローナル
抗マウス抗体類、モノクローナルラット抗マウス抗体ま
たはモノクローナル抗ヒト抗体のような、前記の個々の
抗体のFc部分を特異的に認識する表面結合抗体（surfac
e−bound antibody）に結合させることによって行うこ
とができる。抗体で被覆された常磁性ビーズを次に被検
細胞の懸濁液と混合し、次いでゆるやかに回転させなが
ら、０〜25℃好ましくは４℃で５〜10分間乃至２時間好
ましくは30分間インキュベートする。また本発明の方法
は、遊離の標的細胞の抗体を細胞懸濁液に添加し、ゆる
やかに回転しながら０〜20℃好ましくは４℃で５〜10分
間乃至２時間好ましくは30分間インキュベートし、ステ
ップの順序を変更して実施してもよい。次に抗マウス抗
体または抗ヒト抗体で予めコートした常磁性粒子を先に
述べたのと同様にして上記のインキュベートした細胞懸
濁液に添加し、得られた懸濁液をさらに、ゆるやかに撹
拌しながら０〜25℃好ましくは４℃で５〜10分間乃至２
時間好ましくは30分間インキュベートする。
次に細胞懸濁液の試料を細胞計数装置に移し、結合ビ
ーズを有する細胞の細胞全数に対する割合を光学顕微鏡
で測定した。細胞懸濁液に添加される、抗体でコートさ
れたビーズの数は標的細胞の数の0.5〜10倍でなければ
ならない。標的細胞の数が不明の場合、添加される被覆
ビーズの量は細胞全数の１〜10％でなければならない。
ーズを有する細胞の細胞全数に対する割合を光学顕微鏡
で測定した。細胞懸濁液に添加される、抗体でコートさ
れたビーズの数は標的細胞の数の0.5〜10倍でなければ
ならない。標的細胞の数が不明の場合、添加される被覆
ビーズの量は細胞全数の１〜10％でなければならない。
特定の場合、および標的細胞の密度が低い場合例えば
悪性細胞もしくは標的細胞の細胞全数に対する割合が非
常に低い場合（≦１％）標的細胞は、磁場内で非標的細
胞から積極的に分離することができる。次にこの分離さ
れた標的細胞は顕微鏡で数えることができ、次いで最初
の細胞懸濁液中の細胞合計数に対する標的細胞の割合を
計算することができる。さらにその標的細胞は特異的な
化学上および生物学上の特徴について特性を決定するこ
とができる。特に重要なことは、分子生物学の研究に上
記の細胞を使うことである。本発明の方法は、従来技術
の上記の方法とは著しく異なり、常磁性粒子−標的細胞
の結合を切断することなく、標的細胞を研究し増殖させ
ることができる。いくつもの目的のために、腫瘍生検試
料中、ならびに血液、骨髄および他の体液例えば尿、脳
脊髄液、精液、リンパ液中に存在する腫瘍細胞中、また
は他の正常な組織と臓器例えば肝臓、リンパ節、脾臓、
肺臓、膵臓、骨組織、中枢神経系、前立腺、皮膚および
粘膜由来のおよび細胞学上の研究活動の他の分野での標
的細胞の純集団の特異的遺伝子をDNA、mRNAおよびタン
パク質のレベルで試験することが重要である。
悪性細胞もしくは標的細胞の細胞全数に対する割合が非
常に低い場合（≦１％）標的細胞は、磁場内で非標的細
胞から積極的に分離することができる。次にこの分離さ
れた標的細胞は顕微鏡で数えることができ、次いで最初
の細胞懸濁液中の細胞合計数に対する標的細胞の割合を
計算することができる。さらにその標的細胞は特異的な
化学上および生物学上の特徴について特性を決定するこ
とができる。特に重要なことは、分子生物学の研究に上
記の細胞を使うことである。本発明の方法は、従来技術
の上記の方法とは著しく異なり、常磁性粒子−標的細胞
の結合を切断することなく、標的細胞を研究し増殖させ
ることができる。いくつもの目的のために、腫瘍生検試
料中、ならびに血液、骨髄および他の体液例えば尿、脳
脊髄液、精液、リンパ液中に存在する腫瘍細胞中、また
は他の正常な組織と臓器例えば肝臓、リンパ節、脾臓、
肺臓、膵臓、骨組織、中枢神経系、前立腺、皮膚および
粘膜由来のおよび細胞学上の研究活動の他の分野での標
的細胞の純集団の特異的遺伝子をDNA、mRNAおよびタン
パク質のレベルで試験することが重要である。
従来技術の方法では、サザーンブロット、ノーザンブ
ロットおよびウエスタンブロット法で得られるシグナル
は、その生検試料中の正常細胞と腫瘍細胞を示す。単個
細胞懸濁液を腫瘍物質から最初に調製し、次いでその腫
瘍細胞を免疫磁気的に積極的に検出して分離すれば、こ
の物質について行われる遺伝子の試験結果は標的細胞だ
けを示す。またこの方法は例えば哺乳類の組織中に存在
する悪性細胞、例えば骨髄、末梢血液、胸水、腹腔水お
よび他の体液例えば尿、脳脊髄液、精液およびリンパ液
中の悪性細胞にも適応している。ポリメラーゼ連鎖反応
（PCR）法による試験も、本発明の新しい方法で得た純
粋の腫瘍細胞集団について実施すると特異性と信頼性と
が向上する。
ロットおよびウエスタンブロット法で得られるシグナル
は、その生検試料中の正常細胞と腫瘍細胞を示す。単個
細胞懸濁液を腫瘍物質から最初に調製し、次いでその腫
瘍細胞を免疫磁気的に積極的に検出して分離すれば、こ
の物質について行われる遺伝子の試験結果は標的細胞だ
けを示す。またこの方法は例えば哺乳類の組織中に存在
する悪性細胞、例えば骨髄、末梢血液、胸水、腹腔水お
よび他の体液例えば尿、脳脊髄液、精液およびリンパ液
中の悪性細胞にも適応している。ポリメラーゼ連鎖反応
（PCR）法による試験も、本発明の新しい方法で得た純
粋の腫瘍細胞集団について実施すると特異性と信頼性と
が向上する。
本発明の新しい方法のステップの適用法は被検組織の
種類によって異なっている。
種類によって異なっている。
ａ）充実性腫瘍の生検もしくは腫瘍の針生検由来の組織
を機械的に処理するか、またはゆるやかに酵素で処理し
て単個細胞懸濁液を調製し、その懸濁液に、一次の特異
的抗体もしくは抗体フラグメントを、直接添加するか、
またはリン酸、緩衝食塩水もしくは例えばウシ胎児血
清、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギもしくはヒトの血清のごと
き血清を含有もしくは含有しない培地で細胞懸濁液を洗
浄した後に添加する。
を機械的に処理するか、またはゆるやかに酵素で処理し
て単個細胞懸濁液を調製し、その懸濁液に、一次の特異
的抗体もしくは抗体フラグメントを、直接添加するか、
またはリン酸、緩衝食塩水もしくは例えばウシ胎児血
清、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギもしくはヒトの血清のごと
き血清を含有もしくは含有しない培地で細胞懸濁液を洗
浄した後に添加する。
ｂ）材料が胸水もしくは腹水、脳脊髄液、尿、リンパ液
または各種の形態の関節炎にかかっている患者の関節の
滲出液のような体液の試料の場合、特異的な抗体または
抗体フラグメントを試料に、直接添加するか、または試
料中の細胞を遠心分離し次いで再び懸濁させる前または
後に、洗浄もしくは洗浄せずに遠心分離した後に添加す
る。
または各種の形態の関節炎にかかっている患者の関節の
滲出液のような体液の試料の場合、特異的な抗体または
抗体フラグメントを試料に、直接添加するか、または試
料中の細胞を遠心分離し次いで再び懸濁させる前または
後に、洗浄もしくは洗浄せずに遠心分離した後に添加す
る。
ｃ）材料が血液または骨髄吸引液で構成されている場
合、単核細胞の画分は、例えばLymphoprepで勾配遠心分
離し次いで洗浄し再懸濁し、適切な抗体または抗体フラ
グメントを添加することによって分離される。
合、単核細胞の画分は、例えばLymphoprepで勾配遠心分
離し次いで洗浄し再懸濁し、適切な抗体または抗体フラ
グメントを添加することによって分離される。
ａ）とｂ）の手順の条件は確立されており、以下に述
べる成功した実験で得られた結果で例証されている。
べる成功した実験で得られた結果で例証されている。
ｃ）の方法については、試験結果は、詳細に試験され
た多数の因子によって影響を受けることが見出された。
これらの因子としては、抗体の濃度、常磁性粒子数：細
胞の数の比率、インキュベーションの時間と容積、イン
キュベーション培地の種類およびpHのレベルがある。全
試験における粒子：単核細胞の比率は、一次の特異的抗
体もしくはフラグメントの結合アフィニティーによって
0.5/1〜2/1の範囲内でなければならない。
た多数の因子によって影響を受けることが見出された。
これらの因子としては、抗体の濃度、常磁性粒子数：細
胞の数の比率、インキュベーションの時間と容積、イン
キュベーション培地の種類およびpHのレベルがある。全
試験における粒子：単核細胞の比率は、一次の特異的抗
体もしくはフラグメントの結合アフィニティーによって
0.5/1〜2/1の範囲内でなければならない。
主な問題点は、ヤギもしくはラットの抗マウス抗体だ
けで、またはさらに特異的抗体でコートされた粒子が、
正常な血液または骨髄の細胞に非特異的に結合すること
であった。試験の結果は、非特異的結合は特異的抗体が
存在しない場合に等しく高いことを示した。このこと
は、上記問題が起こるのはターゲティング抗体の正常細
胞に対する交差反応性が原因ではないことを示してい
る。最適の場合より低い特異性がイオン結合で起こる可
能性は除かれた。他の可能性は、Ｂ系統の正常細胞の分
集団が粒子−抗体複合体に粘着するかもしれないという
可能性である。しかし、特異的抗体／抗体−粒子複合体
を添加する前に細胞懸濁液からＢ細胞を免疫磁気的に除
去しても、特異的抗体／抗体−粒子複合体の特異性は改
善されなかった。
けで、またはさらに特異的抗体でコートされた粒子が、
正常な血液または骨髄の細胞に非特異的に結合すること
であった。試験の結果は、非特異的結合は特異的抗体が
存在しない場合に等しく高いことを示した。このこと
は、上記問題が起こるのはターゲティング抗体の正常細
胞に対する交差反応性が原因ではないことを示してい
る。最適の場合より低い特異性がイオン結合で起こる可
能性は除かれた。他の可能性は、Ｂ系統の正常細胞の分
集団が粒子−抗体複合体に粘着するかもしれないという
可能性である。しかし、特異的抗体／抗体−粒子複合体
を添加する前に細胞懸濁液からＢ細胞を免疫磁気的に除
去しても、特異的抗体／抗体−粒子複合体の特異性は改
善されなかった。
骨髄および末梢血液の分離された単核画分に用いた手
順に付随する問題点すなわちいくらかの非標的細胞も常
磁性粒子を捕捉するかもしれないという問題点は回避さ
れるかまたは克服された。すなわち、ヒツジ抗マウス抗
体でコートした粒子のみまたは特異的抗体によって、低
画分の血液もしくは骨髄の単核細胞に非特異的に結合し
た粒子の数は平均して10から約１まで減少し、そして粒
子を有する正常細胞の画分は平行して１〜２％から0.5
〜１％以下まで減少した。
順に付随する問題点すなわちいくらかの非標的細胞も常
磁性粒子を捕捉するかもしれないという問題点は回避さ
れるかまたは克服された。すなわち、ヒツジ抗マウス抗
体でコートした粒子のみまたは特異的抗体によって、低
画分の血液もしくは骨髄の単核細胞に非特異的に結合し
た粒子の数は平均して10から約１まで減少し、そして粒
子を有する正常細胞の画分は平行して１〜２％から0.5
〜１％以下まで減少した。
上記問題点が常磁性粒子に結合した抗体に関連する疎
水力（hydro−phobic force）によって起こる証拠が得
られた。したがって本願ではこの疎水性を減少させる方
法の特許を請求するものである。この方法の一つは、抗
体でコートされた粒子と細胞懸濁液を適切な濃度の緩和
な界面活性剤、例えば0.1％より低い濃度のTween 20
（登録商標）とともに40℃にて30分間プレインキュベー
トする方法である。標的細胞の選択が保証できるなら
ば、細胞懸濁液が含有する界面活性剤の濃度は例えば0.
01％のTween 20（登録商標）のような低い濃度でなけれ
ばならない。いくつもの試験において、この手順で行っ
た場合、血液もしくは骨髄由来の単核細胞画分にみられ
る非特異的結合の問題はほとんど消失するかまたは劇的
に減少した。
水力（hydro−phobic force）によって起こる証拠が得
られた。したがって本願ではこの疎水性を減少させる方
法の特許を請求するものである。この方法の一つは、抗
体でコートされた粒子と細胞懸濁液を適切な濃度の緩和
な界面活性剤、例えば0.1％より低い濃度のTween 20
（登録商標）とともに40℃にて30分間プレインキュベー
トする方法である。標的細胞の選択が保証できるなら
ば、細胞懸濁液が含有する界面活性剤の濃度は例えば0.
01％のTween 20（登録商標）のような低い濃度でなけれ
ばならない。いくつもの試験において、この手順で行っ
た場合、血液もしくは骨髄由来の単核細胞画分にみられ
る非特異的結合の問題はほとんど消失するかまたは劇的
に減少した。
他の改良法は、改良が保証されることが分かったなら
ば、下記のように界面活性剤のステップとともに利用で
きる。
ば、下記のように界面活性剤のステップとともに利用で
きる。
一次の抗体もしくは抗体フラグメントおよび抗体でコ
ートされた常磁性粒子とともに細胞懸濁液のインキュベ
ーションを先に述べたように行ってから、その細胞懸濁
液を、標的細胞の他の細胞外決定因子もしくは細胞内決
定因子に対する抗体もしくは抗体フラグメントの第二の
セットとともに、ホルムアルデヒドまたはアルコール類
のような細胞固定液によって前処理するかまたはせずに
インキュベートする。これらの抗体もしくはそのフラグ
メントは、蛍光剤類、金属コロイド類、放射性同位元素
類、ビオチン複合体類、またはペルオキシダーゼおよび
アルカリホスファターゼのような酵素類で予め標識を付
けて、それ自体公知の方法で、顕微鏡および／または適
切な計数装置で目視可能にしなければならない。
ートされた常磁性粒子とともに細胞懸濁液のインキュベ
ーションを先に述べたように行ってから、その細胞懸濁
液を、標的細胞の他の細胞外決定因子もしくは細胞内決
定因子に対する抗体もしくは抗体フラグメントの第二の
セットとともに、ホルムアルデヒドまたはアルコール類
のような細胞固定液によって前処理するかまたはせずに
インキュベートする。これらの抗体もしくはそのフラグ
メントは、蛍光剤類、金属コロイド類、放射性同位元素
類、ビオチン複合体類、またはペルオキシダーゼおよび
アルカリホスファターゼのような酵素類で予め標識を付
けて、それ自体公知の方法で、顕微鏡および／または適
切な計数装置で目視可能にしなければならない。
標的細胞は後者の方法で目視可能になるとともにその
表面に粒子を捕捉するので、数えることができる。
表面に粒子を捕捉するので、数えることができる。
非標的細胞と標的細胞との区別を簡単にするため、細
胞懸濁液を、第二の目視化ステップを行う前に、細胞ス
ピン遠心分離にかけるか、または懸濁液の一部を、粒子
に捕捉された細胞が薄層で広げられている被覆スライド
ガラスに付着させて、二重に“ステインされた（staine
d）”細胞を認識し易くすることができる。
胞懸濁液を、第二の目視化ステップを行う前に、細胞ス
ピン遠心分離にかけるか、または懸濁液の一部を、粒子
に捕捉された細胞が薄層で広げられている被覆スライド
ガラスに付着させて、二重に“ステインされた（staine
d）”細胞を認識し易くすることができる。
本発明の新しい手順で使用するため、キットには、例
えば各モノクローナル抗体について調製した、予めコー
トされた常磁性粒子が入っている。他の実施態様では、
キットに、その一部分として、IgGイソタイプ特異的の
抗マウス抗体もしくは抗ヒト抗体で予めコートされた常
磁性粒子が入っており、および他の部分として異なる標
的細胞例えば腫瘍細胞関連の抗体が入っている。第三の
実施態様では、特異的抗標的細胞抗体に捕捉された標的
細胞関連抗体のFc部分に結合できるポリクローナル抗マ
ウス抗体、またはモノクローナルのラット抗マウス抗
体、または抗マウス抗体もしくは抗ヒト抗体のような特
異的抗Fc抗体で予めコートされた常磁性粒子がキットに
入っている。さらに別の実施態様では、所望の標的細胞
内もしくは該細胞上の抗原／受容体に対する他の特異的
抗体または抗体フラグメントがキットに入っており、前
記の抗体または抗体フラグメントは、ペルオキシダー
ゼ、アルカリホスファターゼなどの酵素に対しこれら酵
素の関連基質とともに接合されているか、または前記抗
体または抗体フラグメントは、特定の色を有するかまた
はペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼのよ
うな結合した酵素を有する非常磁性粒子に結合されてい
る。
えば各モノクローナル抗体について調製した、予めコー
トされた常磁性粒子が入っている。他の実施態様では、
キットに、その一部分として、IgGイソタイプ特異的の
抗マウス抗体もしくは抗ヒト抗体で予めコートされた常
磁性粒子が入っており、および他の部分として異なる標
的細胞例えば腫瘍細胞関連の抗体が入っている。第三の
実施態様では、特異的抗標的細胞抗体に捕捉された標的
細胞関連抗体のFc部分に結合できるポリクローナル抗マ
ウス抗体、またはモノクローナルのラット抗マウス抗
体、または抗マウス抗体もしくは抗ヒト抗体のような特
異的抗Fc抗体で予めコートされた常磁性粒子がキットに
入っている。さらに別の実施態様では、所望の標的細胞
内もしくは該細胞上の抗原／受容体に対する他の特異的
抗体または抗体フラグメントがキットに入っており、前
記の抗体または抗体フラグメントは、ペルオキシダー
ゼ、アルカリホスファターゼなどの酵素に対しこれら酵
素の関連基質とともに接合されているか、または前記抗
体または抗体フラグメントは、特定の色を有するかまた
はペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼのよ
うな結合した酵素を有する非常磁性粒子に結合されてい
る。
本発明の方法を、モデル実験、本発明の新しい方法の
有用性を示す実施例および実験の用途の実施例によって
以下に説明する。これらの実施例はいかなる場合でも本
発明を限定しない。
有用性を示す実施例および実験の用途の実施例によって
以下に説明する。これらの実施例はいかなる場合でも本
発明を限定しない。
モデル実験：
1. 本発明の新しい手順による、抗体−ビーズ複合体の
腫瘍細胞系との結合 抗体−常磁性粒子複合体を腫瘍細胞に結合させる場合
の抗体濃度と最適条件を決定するため、大パネルの癌細
胞系を用いた。常磁性ビーズは、ヒツジ抗マウス抗体
（SAM）でコートした常磁性粒子に特異的抗体をコート
するか、またはまず細胞を特異的抗体とともにインキュ
ベートし、洗浄し続いてSAMでコートされた粒子ととも
に第二のインキュベーションを行うことによって、細胞
に結合される。これらの試験の結果を表2aと2bに示す。
これらの表において＋印はいくつものヒーズがすべての
細胞に結合していることを示し、（＋）印は少数のビー
ズが各細胞に結合しているかまたはすべての腫瘍細胞で
はないがその表面にビーズが結合していることを示し、
−印は全く結合がないことを示し、および（−）印は非
常に弱い結合を示す。
腫瘍細胞系との結合 抗体−常磁性粒子複合体を腫瘍細胞に結合させる場合
の抗体濃度と最適条件を決定するため、大パネルの癌細
胞系を用いた。常磁性ビーズは、ヒツジ抗マウス抗体
（SAM）でコートした常磁性粒子に特異的抗体をコート
するか、またはまず細胞を特異的抗体とともにインキュ
ベートし、洗浄し続いてSAMでコートされた粒子ととも
に第二のインキュベーションを行うことによって、細胞
に結合される。これらの試験の結果を表2aと2bに示す。
これらの表において＋印はいくつものヒーズがすべての
細胞に結合していることを示し、（＋）印は少数のビー
ズが各細胞に結合しているかまたはすべての腫瘍細胞で
はないがその表面にビーズが結合していることを示し、
−印は全く結合がないことを示し、および（−）印は非
常に弱い結合を示す。
2. 骨髄または末梢血液の単核画分中の腫瘍細胞を検出
するため、次のようなモデル実験を行った。すなわち特
異的抗体とSAMでコートした常磁性粒子を、前記単核細
胞または細胞懸濁液に加えた。なおその場合生体外で培
養した細胞系由来の各種の数の癌細胞を前記単核細胞に
添加した。いくつかの実験では、単核細胞または悪性細
胞は、２種の細胞を区別できるように蛍光染料で予めス
テインした。すべての実験で非結合一次抗体および／ま
たはヒツジ抗マウス抗体でコートしたビーズを別個に対
照として使用した。
するため、次のようなモデル実験を行った。すなわち特
異的抗体とSAMでコートした常磁性粒子を、前記単核細
胞または細胞懸濁液に加えた。なおその場合生体外で培
養した細胞系由来の各種の数の癌細胞を前記単核細胞に
添加した。いくつかの実験では、単核細胞または悪性細
胞は、２種の細胞を区別できるように蛍光染料で予めス
テインした。すべての実験で非結合一次抗体および／ま
たはヒツジ抗マウス抗体でコートしたビーズを別個に対
照として使用した。
いくつもの試験で、単核細胞に対するいくつかの非特
異的結合が観察された。この現象は特異的抗体の種類に
は無関係であることが分かり、SAMでコートされた粒子
の場合にのみ等しく顕著であった。この非特異的結合の
程度はほとんどゼロから0.5〜２％のレベルまで変動し
た。この非特異的結合は、疎水性細胞の相互作用の問題
を減らすために実施した界面活性剤（Tween 20）による
ゆるやかな処理によってほとんど消失した。
異的結合が観察された。この現象は特異的抗体の種類に
は無関係であることが分かり、SAMでコートされた粒子
の場合にのみ等しく顕著であった。この非特異的結合の
程度はほとんどゼロから0.5〜２％のレベルまで変動し
た。この非特異的結合は、疎水性細胞の相互作用の問題
を減らすために実施した界面活性剤（Tween 20）による
ゆるやかな処理によってほとんど消失した。
本発明の新しい手順の有用性を示す実施例
1. 血液および骨髄の微小転移新生物疾患の検出
血液および／または骨髄への癌細胞の拡散の信頼の高
い早期診断を行うことは、応用例の実施例１に記載され
ているように、癌腫を含む多くのタイプの癌を治療でき
る最適の治療法を選択するのにますます重要になってい
る。悪性黒色腫、肉腫、神経芽腫およびその他のいくつ
かの癌に対する類似の方法が確立されたかまたは開発中
である。
い早期診断を行うことは、応用例の実施例１に記載され
ているように、癌腫を含む多くのタイプの癌を治療でき
る最適の治療法を選択するのにますます重要になってい
る。悪性黒色腫、肉腫、神経芽腫およびその他のいくつ
かの癌に対する類似の方法が確立されたかまたは開発中
である。
2. 胸水もしくは腹腔水中および尿中の悪性細胞の検出
上記の滲出液の性質は、特に、少数の癌細胞が正常な
反応性細胞または上皮細胞とともに存在しているときに
重大な診断上の問題を示す。従来の細胞学的試験法では
陰性であるか結論を出せなかった症例中、いくつかの症
例で、本発明の新しい方法を用いて的確な診断が迅速に
行われた。腎臓または尿路と膀胱の癌の症例でも類似の
利点が見られた。
反応性細胞または上皮細胞とともに存在しているときに
重大な診断上の問題を示す。従来の細胞学的試験法では
陰性であるか結論を出せなかった症例中、いくつかの症
例で、本発明の新しい方法を用いて的確な診断が迅速に
行われた。腎臓または尿路と膀胱の癌の症例でも類似の
利点が見られた。
3. 脳脊髄液中の新生物細胞の検出
多くのタイプの癌の全身治療法が改善されたので、症
状を示す（symptom−giving）脳転移を有する症例の頻
度が著しく増大し、これに平行してこのような拡散を早
期に検出することが必要になった。本発明の新しい方法
を使用すれば、少数の悪性細胞でも容易に同定できるの
で、頭蓋内腫瘍の徴候の早期段階で治療法を選択して治
療できる。
状を示す（symptom−giving）脳転移を有する症例の頻
度が著しく増大し、これに平行してこのような拡散を早
期に検出することが必要になった。本発明の新しい方法
を使用すれば、少数の悪性細胞でも容易に同定できるの
で、頭蓋内腫瘍の徴候の早期段階で治療法を選択して治
療できる。
4. 生検用に採取した組織中の癌の診断
癌の疑いがあり、外科的方法または例えば針生検によ
って組織の生検試料が得られる場合、調製された細胞懸
濁液に対して本発明の新しい方法を用いれば、従来の免
疫学的方法もしくは免疫組織学的方法もしくは細胞化学
的方法に比べてはるかに簡単でかつ迅速な診断を行うこ
とができる。
って組織の生検試料が得られる場合、調製された細胞懸
濁液に対して本発明の新しい方法を用いれば、従来の免
疫学的方法もしくは免疫組織学的方法もしくは細胞化学
的方法に比べてはるかに簡単でかつ迅速な診断を行うこ
とができる。
いくつかの種類の癌の区別は適切な抗体を用いること
によって行うことができる。
によって行うことができる。
5. 予後の指標の同定
いくつもの膜分子の発現は、いくつもの癌の悪性疾患
の進行と相関関係があることが分かったので、本発明の
方法は、例えば応用例の実施例２に記載されているよう
に予後の指標を同定するのに使用できる。
の進行と相関関係があることが分かったので、本発明の
方法は、例えば応用例の実施例２に記載されているよう
に予後の指標を同定するのに使用できる。
6. 特定の疾患または疾患の進行もしくは状態を示す細
胞の同定 各種のリューマチ性疾患（例えばリューマチ性関節
炎）ならびにアレルギー性、自己免疫性および心臓血管
の疾患において、細胞の特異的分集団がが全身に存在し
ているか局在しているかの同定は、診断および病期の決
定を行うのに重要である。したがって上記の細胞集団を
本発明の方法で迅速に検出することは診断と治療との面
で極めて重要である。
胞の同定 各種のリューマチ性疾患（例えばリューマチ性関節
炎）ならびにアレルギー性、自己免疫性および心臓血管
の疾患において、細胞の特異的分集団がが全身に存在し
ているか局在しているかの同定は、診断および病期の決
定を行うのに重要である。したがって上記の細胞集団を
本発明の方法で迅速に検出することは診断と治療との面
で極めて重要である。
7. 正常細胞の分集団の検出
いくつかの目的のため、集団中の正常細胞の特定の分
集団の画分を検出することが重要である。このことは例
えば胆管上皮抗原を発現する細胞の同定が大切である肝
臓の生検に当てはまる。同様に、種々の正常な組織から
調製した細胞懸濁液由来の特異的上皮細胞の同定と分離
とが保証される。
集団の画分を検出することが重要である。このことは例
えば胆管上皮抗原を発現する細胞の同定が大切である肝
臓の生検に当てはまる。同様に、種々の正常な組織から
調製した細胞懸濁液由来の特異的上皮細胞の同定と分離
とが保証される。
上記１〜６章に挙げた細胞膜分子のいくつかは、いく
種類もの活性化されたキラー細胞または例えば免疫毒素
に対する免疫療法に用いる標的としても用いることがで
きる。それ故に、上記の分子の発現を本発明の新しい方
法で同定することも、上記の種類の治療を用いなければ
ならない症例を決定するのに価値がある。
種類もの活性化されたキラー細胞または例えば免疫毒素
に対する免疫療法に用いる標的としても用いることがで
きる。それ故に、上記の分子の発現を本発明の新しい方
法で同定することも、上記の種類の治療を用いなければ
ならない症例を決定するのに価値がある。
本発明の実用例の実施例
実施例１
血液および／または骨髄への癌細胞の拡散を早い段階
で診断するために、本発明の新しい方法に、MOC−31、N
rLu10、BM2、BM7、12H12およびMLuClの抗癌腫抗体を用
いて、乳癌、肺癌、結腸直腸癌および前立腺癌由来の微
小転移疾患が上記体液中で高感度に同定できるか否かを
決定した。これらの抗体を用いた結果成功したがこれは
臨床上重要な意味がある。
で診断するために、本発明の新しい方法に、MOC−31、N
rLu10、BM2、BM7、12H12およびMLuClの抗癌腫抗体を用
いて、乳癌、肺癌、結腸直腸癌および前立腺癌由来の微
小転移疾患が上記体液中で高感度に同定できるか否かを
決定した。これらの抗体を用いた結果成功したがこれは
臨床上重要な意味がある。
実施例２
いくつもの細胞膜分子の発現は幾種類もの癌。したが
って、かような抗体のそれぞれの抗体との結合を検出す
ることは高い予後価（high prognostic value）の情報
を得るために使用できる。このような抗原の中には、以
下に列挙する多数の接着性分子、炭水化物抗原、糖脂
質、成長因子受容体、および癌腫マーカーがある。本発
明の新しい方法によって、粒子−抗体複合体と次のもの
すなわちCD44変異体、Ｅ−カドヘリン、LeY、CEA、EGF
−ｒ、トランスフェリン受容体、MUC−１エピトープ、L
UBCRU−G7エピトープ、前立腺癌抗原、UJ13Aエピトー
プ、β２−ミクログロブリン、HLA−抗原および細胞消
滅受容体との結合を同定した。
って、かような抗体のそれぞれの抗体との結合を検出す
ることは高い予後価（high prognostic value）の情報
を得るために使用できる。このような抗原の中には、以
下に列挙する多数の接着性分子、炭水化物抗原、糖脂
質、成長因子受容体、および癌腫マーカーがある。本発
明の新しい方法によって、粒子−抗体複合体と次のもの
すなわちCD44変異体、Ｅ−カドヘリン、LeY、CEA、EGF
−ｒ、トランスフェリン受容体、MUC−１エピトープ、L
UBCRU−G7エピトープ、前立腺癌抗原、UJ13Aエピトー
プ、β２−ミクログロブリン、HLA−抗原および細胞消
滅受容体との結合を同定した。
実施例３
悪性黒色腫にかかっていると考えられる患者から２
の胸水拡散液を得た。遠心分離を行った後、10％のウシ
胎児血清を含有するRPMI2mの容積中に細胞を懸濁さ
せ、9.2.27抗黒色腫抗体（10μg/m）とともに４℃で3
0分間インキュベートし、洗浄し、Dynabeads SAMM450/I
gG2Aとともに４℃で30分間再びインキュベートした。次
にその細胞懸濁液を顕微鏡で試験してその表面に常磁性
細胞が結合している細胞の画分を測定した。約10％の細
胞が有意な数の粒子ロゼットをもっていたとき、悪性黒
色腫の診断を確認した。
の胸水拡散液を得た。遠心分離を行った後、10％のウシ
胎児血清を含有するRPMI2mの容積中に細胞を懸濁さ
せ、9.2.27抗黒色腫抗体（10μg/m）とともに４℃で3
0分間インキュベートし、洗浄し、Dynabeads SAMM450/I
gG2Aとともに４℃で30分間再びインキュベートした。次
にその細胞懸濁液を顕微鏡で試験してその表面に常磁性
細胞が結合している細胞の画分を測定した。約10％の細
胞が有意な数の粒子ロゼットをもっていたとき、悪性黒
色腫の診断を確認した。
実施例４
小細胞肺癌もしくは悪性黒色腫の臨床指標を有する症
例の皮下腫瘍から生検組織を得た。その生検試料から単
個細胞懸濁液を調製し、二つの画分に分割し、一方を9.
2.27抗黒色腫抗体とともにインキュベートし、他方をMO
C−31抗癌腫抗体とともにインキュベートした（両方と
もに10μg/m）。このインキュベーションは上記実施
例で利用したのと類似している。黒色腫抗体とともにイ
ンキュベートした細胞はビーズを全く捕捉しなかった
が、MOC−31とともにインキュベートしたすべての腫瘍
細胞は陽性であった。
例の皮下腫瘍から生検組織を得た。その生検試料から単
個細胞懸濁液を調製し、二つの画分に分割し、一方を9.
2.27抗黒色腫抗体とともにインキュベートし、他方をMO
C−31抗癌腫抗体とともにインキュベートした（両方と
もに10μg/m）。このインキュベーションは上記実施
例で利用したのと類似している。黒色腫抗体とともにイ
ンキュベートした細胞はビーズを全く捕捉しなかった
が、MOC−31とともにインキュベートしたすべての腫瘍
細胞は陽性であった。
実施例５
悪性黒色腫をもっている疑いがある患者から得た生検
組織を、単個細胞懸濁液を調製し、9.2.27抗黒色腫抗体
とともにインキュベートし次いで上記手順にしたがって
試験した。その細胞の大部分は陽性であり、多数の粒子
−ロゼットが細胞の膜に結合していた。
組織を、単個細胞懸濁液を調製し、9.2.27抗黒色腫抗体
とともにインキュベートし次いで上記手順にしたがって
試験した。その細胞の大部分は陽性であり、多数の粒子
−ロゼットが細胞の膜に結合していた。
実施例６
乳癌患者由来の胸水を、その液体中に腫瘍細胞を検出
できるか否かを試験するために研究した。その液体１
を遠心分離し、得られた細胞を再懸濁させ、次に別々の
バイアルびん中で、３種の異なる各抗癌腫抗体（MOC−3
1、2E11、12H12）とともにインキュベートした。前記実
施例と同様に手順を完了した後、３例すべてでほとんど
の細胞が抗体被覆粒子に結合することが見出された。
できるか否かを試験するために研究した。その液体１
を遠心分離し、得られた細胞を再懸濁させ、次に別々の
バイアルびん中で、３種の異なる各抗癌腫抗体（MOC−3
1、2E11、12H12）とともにインキュベートした。前記実
施例と同様に手順を完了した後、３例すべてでほとんど
の細胞が抗体被覆粒子に結合することが見出された。
実施例７
乳癌患者から得た骨髄懸濁液を研究して、微小転移腫
瘍細胞が存在しているか否かを試験した。単核細胞を調
製した後、この細胞を、上記実施例に使用したのと同じ
３種の抗癌腫抗体とともにインキュベートした。しかし
この場合、抗体はまずDynabeads（登録商標）SAM IgM常
磁性粒子に結合した。これらの直接コートされた粒子と
１回インキュベートした後、その細胞懸濁液を顕微鏡で
検査し、多数の細胞が陽性であることが見出され、多数
の粒子−ロゼットが細胞の膜に結合していた。
瘍細胞が存在しているか否かを試験した。単核細胞を調
製した後、この細胞を、上記実施例に使用したのと同じ
３種の抗癌腫抗体とともにインキュベートした。しかし
この場合、抗体はまずDynabeads（登録商標）SAM IgM常
磁性粒子に結合した。これらの直接コートされた粒子と
１回インキュベートした後、その細胞懸濁液を顕微鏡で
検査し、多数の細胞が陽性であることが見出され、多数
の粒子−ロゼットが細胞の膜に結合していた。
同様の試験を、乳癌の患者由来の胸水もしくは腹腔水
および骨髄のいくつかについて実施した。
および骨髄のいくつかについて実施した。
実施例８
T47Dヒト乳癌細胞を、時間を変えてヘキスト社の蛍光
塗料とともにインキュベートし次いでその標識を付けた
細胞の生存力を検査した。標識を付けた乳癌細胞の数を
変えて、健康なボランティアから得た１×106個の骨髄
細胞に添加した。異なる試験において、個々の抗癌腫抗
体（NrLu10、MOC31または12H12）でコートした常磁性の
単分散粒子（Dynabeads（登録商標）P450）を異なる濃
度で添加した。氷上で30分間インキュベートした後、異
なる試験管の試料を、計数チャンバー内で光学顕微鏡と
蛍光顕微鏡とを用いて試験した。腫瘍細胞／全有核細胞
の比率が低かった場合は、その細胞懸濁液を磁場にか
け、結合した粒子を有する細胞を分離し次いで顕微鏡で
検査した。細胞混合物中、１腫瘍細胞当たり１〜10の常
磁性ビーズという最適の比率では、すべての腫瘍細胞は
その表面に２〜15個のビーズが結合されていた。この検
出法の感度は、104個の有核細胞当たり１個の標的細胞
に近かった。正常細胞に対していくらか交差反応を有す
ることが分かっている抗体を用いて、標識をつけた腫瘍
細胞で対照試験を行い、この交差反応性が抗体でコート
された常磁性粒子にあることが確認された。腫瘍関連抗
体のコーティングなしのビーズの試験ではとの標的細胞
もビーズを全く捕捉しなかった。
塗料とともにインキュベートし次いでその標識を付けた
細胞の生存力を検査した。標識を付けた乳癌細胞の数を
変えて、健康なボランティアから得た１×106個の骨髄
細胞に添加した。異なる試験において、個々の抗癌腫抗
体（NrLu10、MOC31または12H12）でコートした常磁性の
単分散粒子（Dynabeads（登録商標）P450）を異なる濃
度で添加した。氷上で30分間インキュベートした後、異
なる試験管の試料を、計数チャンバー内で光学顕微鏡と
蛍光顕微鏡とを用いて試験した。腫瘍細胞／全有核細胞
の比率が低かった場合は、その細胞懸濁液を磁場にか
け、結合した粒子を有する細胞を分離し次いで顕微鏡で
検査した。細胞混合物中、１腫瘍細胞当たり１〜10の常
磁性ビーズという最適の比率では、すべての腫瘍細胞は
その表面に２〜15個のビーズが結合されていた。この検
出法の感度は、104個の有核細胞当たり１個の標的細胞
に近かった。正常細胞に対していくらか交差反応を有す
ることが分かっている抗体を用いて、標識をつけた腫瘍
細胞で対照試験を行い、この交差反応性が抗体でコート
された常磁性粒子にあることが確認された。腫瘍関連抗
体のコーティングなしのビーズの試験ではとの標的細胞
もビーズを全く捕捉しなかった。
他の乳癌系と小細胞肺癌細胞系の両者について類似の
試験を行った。これらの試験で類似の感度と特異性とが
得られた。
試験を行った。これらの試験で類似の感度と特異性とが
得られた。
実施例９
乳癌および卵巣癌の患者由来の胸水と腹腔水とをセン
トリフューズ（sentrifuged）、実施例１で使用したの
と同じ被覆常磁性粒子を添加し、インキュベートし、次
いで磁場内で濃縮し、そしてその懸濁液を光学顕微鏡で
試験した。一般に、腫瘍細胞の明らかな形態学的特徴を
有する細胞にはビーズが結合しており、一方少数の正常
細胞は、抗体でコートされたビーズを全く捕捉しなかっ
た。胸水の二つの例では、独立して形態学的試験をした
が腫瘍細胞は全く存在しなかったが、一方抗体でコート
したビーズを用いることによってかなりの数の悪性細胞
が検出された。いくつかの場合に、腫瘍細胞を磁場内で
分離し、乳癌細胞を増殖させるために特別に調製した増
殖培地が入っている組織培養フラスコに移して、これら
の培養物から永久細胞系を樹立することを試みた。平行
して悪性滲出液由来の細胞を、磁性ビーズによる積極的
選択なしで直接培養した。後者の場合、細胞系は全く樹
立できなかったが、積極的に選択された腫瘍細胞を用い
た場合その50％以上が細胞系の樹立に成功した。
トリフューズ（sentrifuged）、実施例１で使用したの
と同じ被覆常磁性粒子を添加し、インキュベートし、次
いで磁場内で濃縮し、そしてその懸濁液を光学顕微鏡で
試験した。一般に、腫瘍細胞の明らかな形態学的特徴を
有する細胞にはビーズが結合しており、一方少数の正常
細胞は、抗体でコートされたビーズを全く捕捉しなかっ
た。胸水の二つの例では、独立して形態学的試験をした
が腫瘍細胞は全く存在しなかったが、一方抗体でコート
したビーズを用いることによってかなりの数の悪性細胞
が検出された。いくつかの場合に、腫瘍細胞を磁場内で
分離し、乳癌細胞を増殖させるために特別に調製した増
殖培地が入っている組織培養フラスコに移して、これら
の培養物から永久細胞系を樹立することを試みた。平行
して悪性滲出液由来の細胞を、磁性ビーズによる積極的
選択なしで直接培養した。後者の場合、細胞系は全く樹
立できなかったが、積極的に選択された腫瘍細胞を用い
た場合その50％以上が細胞系の樹立に成功した。
実施例10
いくつかの症例について、乳癌の患者から得た骨髄お
よび末梢血液を、抗体でコートされた常磁性ビーズを加
え、４℃で30分間インキュベートし、次に磁界内で濃縮
し、そして光学顕微鏡で懸濁液を試験することによっ
て、本発明の方法で試験した。両方の場合、腫瘍細胞に
対する常磁性ビーズの結合程度は、骨髄と血液中とで有
核細胞の0.1〜１％であることが検出されたが、他のい
かなる方法も細胞を検出できなかった。
よび末梢血液を、抗体でコートされた常磁性ビーズを加
え、４℃で30分間インキュベートし、次に磁界内で濃縮
し、そして光学顕微鏡で懸濁液を試験することによっ
て、本発明の方法で試験した。両方の場合、腫瘍細胞に
対する常磁性ビーズの結合程度は、骨髄と血液中とで有
核細胞の0.1〜１％であることが検出されたが、他のい
かなる方法も細胞を検出できなかった。
実施例11
特異的細胞集団の表面に発現された特定の成長因子受
容体または他の遺伝子産物に対する抗体を用いて、これ
らの細胞を同定し次いで積極的に選択することができ
る。本発明の新規な方法で、抗トランスフェリン受容体
抗体でコートしたビーズを用いたところ、本発明の方法
は、トランスフェリン受容体を発現する細胞を同定する
迅速で簡単な高感度の方法であることが分かった。
容体または他の遺伝子産物に対する抗体を用いて、これ
らの細胞を同定し次いで積極的に選択することができ
る。本発明の新規な方法で、抗トランスフェリン受容体
抗体でコートしたビーズを用いたところ、本発明の方法
は、トランスフェリン受容体を発現する細胞を同定する
迅速で簡単な高感度の方法であることが分かった。
実施例12
各種の目的のため、正常細胞の特異的集団を分離する
ことを保証する。正常組織または腫瘍組織中の毛細血管
もしくは小血管の内側を覆う内皮細胞は、関連組織から
調製した細胞懸濁液から積極的に選択することができ
た。この方法では該内皮細胞上では発現されるが細胞混
合物の他の正常細胞上では発現されない構造に対する抗
体でコートしたビーズを用いた。
ことを保証する。正常組織または腫瘍組織中の毛細血管
もしくは小血管の内側を覆う内皮細胞は、関連組織から
調製した細胞懸濁液から積極的に選択することができ
た。この方法では該内皮細胞上では発現されるが細胞混
合物の他の正常細胞上では発現されない構造に対する抗
体でコートしたビーズを用いた。
実施例13
免疫不全のげっ歯動物に注射されたヒト細胞は、抗パ
ンヒト抗体でコートした磁性粒子を用いることによっ
て、腫瘍異種移植片および各種の宿主の臓器／組織から
調製した細胞懸濁液中に存在していることが分かった。
ンヒト抗体でコートした磁性粒子を用いることによっ
て、腫瘍異種移植片および各種の宿主の臓器／組織から
調製した細胞懸濁液中に存在していることが分かった。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 クヴァールハイム，グンナル
ノールウェー オスロ エヌ―0381 オ
ースストゥッブン 13
(56)参考文献 特開 平３−41098（ＪＰ，Ａ)
国際公開91／09938（ＷＯ，Ａ１)
国際公開91／01368（ＷＯ，Ａ１)
国際公開92／04961（ＷＯ，Ａ１)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
G01N 33/543
C12N 5/06
G01N 33/553
Claims (3)
- 【請求項１】液体中に含まれる混合細胞集団の細胞懸濁
液において特定の病気の発生、進行、状態を示す特異標
的細胞を積極的に検知する方法であって、以下のステッ
プ、すなわち、 （Ａ）常磁性の粒子またはビーズを混合細胞集団におい
て標的細胞上には発現するが非標的細胞上には発現しな
い膜構造物に特有の抗体によってそれ自体公知の方法で
コーティングする第１のステップ、 （Ｂ）第１のステップで得たコーティング済みの常磁性
粒子またはビーズを０℃〜20℃の温度で５分〜２時間の
間混合細胞懸濁液と混合する第２のステップ、 （Ｃ）標的集団細胞が血液または骨髄の吸引液中に在る
場合は、前記コーティング済みの常磁性粒子またはビー
ズおよび細胞懸濁液との混合体を洗浄剤で30分間予めイ
ンキュベートする第３のステップ、 （Ｄ）前記コーティングされた常磁性粒子またはビーズ
に付着した標的細胞を調べて個数を計算する第４のステ
ップ、 この場合、混合細胞群中の標的細胞の数は、混合細胞群
の細胞総数の１％未満であり、 さらに前記コーティングされたビードまたは粒子の数
は、混合細胞群の細胞総数の１％〜10％であり、 特異標的細胞をロゼットの観察を通じて確認する第５の
ステップ、を含むことを特徴とした特異標的細胞を積極
的に検知する方法。 - 【請求項２】液体中に含まれる混合細胞集団の細胞懸濁
液において特定の病気の発生、進行、状態を示す特異標
的細胞を積極的に検知する方法であって、以下のステッ
プ、すなわち、 （Ａ） 常磁性の粒子またはビーズを混合細胞集団にお
いて標的細胞上に発現するが非標的細胞上には発現しな
い膜構造物に特有の抗体のFc部分に結合可能の抗体によ
ってそれ自体公知の方法でコーティングし、次いで、コ
ーティングされた常磁性の粒子またはビーズを混合細胞
集団において標的細胞上に発現するが非標的細胞上には
発現しない膜構造物に特有の抗体と混合する第１のステ
ップ、 （Ｂ） 第１のステップで得たコーティング済みの常磁
性粒子またはビーズを０℃〜20℃の温度で５分〜２時間
の間混合細胞懸濁液と混合する第２のステップ、 （Ｃ） 標的集団細胞が血液または骨髄の吸引液中に在
る場合は、前記コーティング済みの常磁性粒子またはビ
ーズおよび細胞懸濁液との混合体を洗浄剤で30分間予め
インキュベートする第３のステップ、 （Ｄ）前記コーティングされた常磁性粒子またはビーズ
に付着した標的細胞を調べて個数を計算する第４のステ
ップ、 この場合、混合細胞群中の標的細胞の数は、混合細胞群
の細胞総数の１％未満であり、 さらに前記コーティングされたビードまたは粒子の数
は、混合細胞群の細胞総数の１％〜10％であり、 特異標的細胞をロゼットの観察を通じて確認する第５の
ステップ、を含むことを特徴とした特異標的細胞を積極
的に検知する方法。 - 【請求項３】前記第２のステップにおいて最終の濃度が
0.1％を超えない程度に洗浄剤を添加することを特徴と
した請求項１または２に記載の特異標的細胞を積極的に
検知する方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/NO1992/000151 WO1994007138A1 (en) | 1992-09-14 | 1992-09-14 | Detection of specific target cells in specialized or mixed cell population and solutions containing mixed cell populations |
| WO92/00151 | 1992-09-14 | ||
| PCT/NO1993/000136 WO1994007139A1 (en) | 1992-09-14 | 1993-09-10 | Improved method for detection of specific target cells in specialized or mixed cell population and solutions containing mixed cell populations |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
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