CZ65995A3

CZ65995A3 - Method of detecting specific target cells, application of such method and means for making the same

Info

Publication number: CZ65995A3
Application number: CZ95659A
Authority: CZ
Inventors: Oystein Fodstad; Gunnar Kvalheim
Original assignee: Oystein Fodstad; Gunnar Kvalheim
Priority date: 1992-09-14
Filing date: 1993-09-10
Publication date: 1995-11-15
Also published as: DE69326956D1; SK32995A3; US6184043B1; WO1994007139A1; JP3417563B2; US6893881B1; DK0660930T3; JPH08501390A; AU2593192A; AU686569B2; DE69326956T2; HUT73741A; FI951161A; EP0660930B1; HU9500723D0; SK281566B6; FI951161A0; WO1994007138A1; CA2144328A1; ES2141170T3

Description

Způsob detekce specifických cílových buněk, užití tohoto způsobu a prostředky k provádění tohoto způsobu

Oblast techniky. j t ;

Vynález se týká způsobu imunologické detekce specifických cílových buněk v populací buněk a v r

-i.

roztocích obsahujících populace buněk. Vynález .se rovněž í týká sady nástrojů na provádění způsobu, podle vynálezu v | různých populacích buněk.

Dosavadní stav techniky.

v biologii, v biochemii a v příbuzných odvětvích je značná potřeba způsobů, kterými jsou chemické jednotky společně vázány. Tyto způsoby mají vzrůstající důležitost ve výzkumu týkajícího se normálních i abnormálních populací buněk. Zejména při použití pevných podkladů lze buňky imobilizovat, zjišťovat· a izolovat a umýt. Navíc lze obsah buněk zkoušet použitím řady vysoce náročných způsobů. Je. také důležité mít možnost izolovat buňky v Životaschopných formách. Vzájemná vazba tvoří vysoce náročný způsob spojení chemických nebo biologických jednotek. U této metody se pár vazebních partnerů,· ktérý je např. připojen k látce·, která má být vázána- váže' vzájemně na sebe při uvedení do styku. Jeden z vazebních partnerů takového spojení může být- zastoupen molekulou na povrchu buňky. Je známo několik takovýchto vazebně partnerských systémů jako např. antigen-protilátkové, enzym-receptorové, ligand-receptorové interakce na buňkách a biotin-avidinová vazba, ze kterých antigenprotilátková vazba je nej častěji používána.' Nedávno byl navržen způsob vazebního páru hapten/anti-hapten (WO 91/01368) . Při použití těchto způsobů pro izolováni specifických buněk, určených prp rozličné další zkoušky je třeba obrátit spojení bez tvorby destruktivních vlivů na vazební partnery, kteří by ideálně měli znovu nabýt

... . -_Své“funkce‘po“n’ávratu^_do“svý'ch^— původních'podmínek'.“K”tomu'

- g_e' ý'každém případu dochází, přestože je navržen

I způsob pro přiměřené štěpení antigen/anti-antigenní a

t. hapten/antihaptenní vazby (WO 91/15766, WO 91/01368).

Jsou známy i způsoby, u kterých je jeden z vazebních partnerů připojen na nerozpustný podklad, jako např. paramagnetické částice, pomocí něhož se provádí izolace cílových buněk ze smíšené populace buněk, jako buď negativní nebo jako pozitivní izolace. U postupu negativní izolace lze nežádoucí buňky-odstranit z !

buňkového preparátu inkubací buněkprotilátkou obalenými částicemi specifickými pro tyto nežádoucí buňky. Po inkubaci lze odstranit komplex pozůstávající z buňky, protilátky a částice, ponechávaje za sebou žádané cílové buňky. Tento výsledek je často nedostatečný, jelikož žádané buňky zůstávají v populaci buněk, více nebo méně vyčištěné a také protože záměr izolačního postupu.je zkoušet a/nebo provádět další studie specifických cílových buněk. Pokusy byly provedeny s použitím částic pro.pozitivní izolaci, při které žádané cílové buňky byly odstraněny ze smíšené populace buněk. Tyto postupy

Ťr----------------byly—- ale 'zaměřeny-ha' určité'cílové'buňky,'''ale' něj sou , vhodné pro všechny cílové buňkové systémy. Nedávno byl navržen pozitivní postup izolace využívající hapten/antihaptenný vazební systém (WO 91/01368) a též

J způsob pro izolování hemapoietických buněk z kostní dřeně (WO 91/09938. Druhý z uvedených způsobů je zaměřen na využití kombinace pozitivní a negativní selekce za účelem izolování a případně i kultivování specifických buněk, tj. hemapoietických buněk,-v kostní dřeni a je závislý na odstranění částic. WO 91/01368 se týká způsobu připojení cílových buněk na na nerozpustný podklad .využitím schopností haptenných, antihaptenných protilátek a antibuňkových protilátek pro vzájemnou vazbu, čímž se vytvoří spojení mezi nerozpustným podkladem, tj. částicí a cílovou buňkou, pozůstávající nejméně z haptenné a antihaptenné protilátky nebo z kombinace haptenných a . antihaptenných protilátek nebo ze sekundárních protibuňkových protilátek. Pozdější štěpení komplex· e provádí jeho opětným vystavením haptenu nebo hapter analogii. Takto vytvořené spojení pozůstává vždy z haptenu navíc k jednomu nebo více prvkč .sob je _zaměř_en_na—nespee-i-f-i-cké^-crhové^-Bufik'· a je zaměřen na izolaci cílových buněka-uvolnění ; , ozpustného základu. Existuje potřeba jednoduché vazby to spojení cílové buňky s nerozpustným podkladem, ký rý nevyžaduje směs poněkud nespecifických haptenných skupin a který je zaměřen na detekci specifických cílových buněk při minimálním přidružení nespecifických buněk a který činí nepotřebným pozdější štěpení nerozpustného základu od specifické cílové buňky. WO 92/04961 se týká způsobu a složité sady nástrojů pro oddělování buněk nebo různých molekul od nemagnetického zkušebního média pomocí koloidních magnetických částic. Při tomto způsobu se používají malé (submikronové) částice, protože- je nutné se vyhnout srážení částic v roztoku. Tento způsob vyžaduje složitý oddělovací systém, při kterém se do zkušebního média ponořuje magnetický zesilovací prostředek. To může mít nepříznivý vliv na buňky.

Podstata vynálezu.

Cílem tohoto vynálezu je najít pro diagnostické účely specifické cílové buňky v krvi nebo v kostní dřeni bez...prchlému .vazby, na normální., buňky ._>Vynálep,. přeď^úádá .. citlivý způsob detekce různých typů buněk, takže velké množství' buněk může být zobrazeno v mikroskopu, přičemž postup je rychlý a jednoduchý. Tento způsob lze dále použít pro izolaci buněk při biochemickém, biologickém a imunologickém vyšetřování a pro studium specifických genů na zárodkové (nukleové) nebo . proteinné hladině a navíc pro kultivaci buněk bez potřeby .štěpení komplexu pozůstávajícího z buňky a částice. Dalším cílem vynálezu je poskytnout sadu nástrojů pro provozování •'.způsobu . vyznačeném v předmětu vynálezu'/ Záměry vynálezu jsou docíleny způsobem a sadou nástrojů uvedených v přiložené

..de-fini-ci. vynálezu. - -Způsob' imunomagnétické.-.detekc-e ......cílových buněk ve-smíšené populaci- buněk a ve- - fyziologických roztocích obsahujících -.populace buněk je vhodný pro detekci, ale lze jej též použít ' pro pozitivní izolaci,specifických typů jak normálních tak i patogenních buněk. Tento způsob vytváří vazbu mezi cílovou buňkou a nerozpustným podkladem, jako např. paramagnetickými částicemi, který pozůstává z jednoho nebo dvou prvků. Částice je buď obalena protibuněční protilátkou myŠŠího nebo lidského původu, zaměřeného na specifické antigenní rozhodující činitele na membránách požadovaných cílových buněk nebo jsou částice obaleny polyklonní protimyšší nebo protilidskou protilátkou schopnou vazby na Fc části specifické protibuněčné protilátky zaměřené na antigenní rozhodující činitele ná membránách cílových buněk. Namísto použití polyklonní protimyšší/protilidské protilátky pro obalení částic lze použít monoklonní krysí protimyšší/protilidské protilátky. Tato posledně uvedená protilátka může, díky svému monoklonnímu původu, částečně poskytnout specifičtější vazbu na protibuněční protilátku a snížit riziko možné příčné reakce s jinými buňkami v roztocích, jako např. krve. Dále, inkubace buňky v suspenzi s mírným detergentem a/nebo druhou sadou protilátek nebo fragmentů protilátek, předem označená nebo neoznačená fluorescenčními látkami, kovovými koloidy·,. rádioizotopy, biotinnými komplexy nebo určitými enzymy umožňujícími zviditelnění, dramaticky zvýší specifičnost tohoto

7r\i i cx·. h'.’

4W LA LA

V následujícím je předložen detailnější popis způsobu podle vynálezu, uvádějící rakovinné buňky jako _cílov-é_buňky_pr-o-de-tekc-i— a—mo-ž-nou—i-zo-l-ac-i-^—-Ten-to—způsob— .není ovšem'omezen jen na rakovinné buňky a popis nemá za cíl omezit způsob podle vynálezu na tuto zvláštní oblast, jelikož tento způsob je vhodný pro řadu oblastí ' cytologického výzkumu. Při práci s rakovinnými.pacienty je určení stadia nemoci, z hlediska zda je rakovina lokalizována nebo zda metastatické rozšíření postihlo i jiné tkáně, nanejvýš důležité pro volbu terapeutických alternativ pro individuální pacienty. Zhoubné buňky se rozšiřují přímým napadením okolní tkáně·, mízou nebo rozšířením novotvarových buněk obsažených v krvi do „ vzdálených orgánů, včetně kostní dřeně a centrálního nervového systému a mozkomíšního moku. Aš do nedávná detekce metastatických novotvarových buněk závisela na morfologických způsobech používajících světla a elektronové mikroskopie na biopsní vzorky novotvarů nebo· b

nátěr kostní dřeně a periferijní krve, všechny připravené na podložním skle po cytocentrifugaci různých tělních tekutin, od objevení monoklonních protilátek poznávajících antigeny převážně vyjádřené na povrchu různých druhů zhoubných buněk, identifikace metastatických buněk ve zvyšující se míře zahrnuje též imunocytochemii a imunof lurescenci. Podložní skla, připravená z biopsovaných novotvarů nebo c-y-tocent-r-i-f-ugá-t-ů—by-l-a—tedy-up-ravena-monoklonními--------pr^tTla^tkSmi”Vá^žba^běcKtd^ndvídtVáTdvyčii^buněk^iSy la^ak” zviditelněna kolometricky nebo fluorescenčně.· Poslední způsob vyžaduje použití fluorescenčního mikroskopu, nebo alternativně přípravu suspenze buněk a použití cytometrického průtokoměru. Předchozí způsoby trpí omezenou citlivostí a/nebo specifičností a jsou obvyklé pracné a časově náročné a také vyžadují vysoký stupeň odbornosti. Vyšetření průtokovou cytometrií rovněž 'vyžaduje nákladné zařízení. Morfologické způsoby detekce novotvarových buněk v krvi.a v.kostní dřeni jsou daleko méně citlivé než způsoby používající imunocytochemie a imunofluorescence (Beiské a další, Am·; J. Pa-thology 1A1 (2) , září 1992) . I poslední ' způsoby jsou však nedostatečné v případech, -kdy novotvarové buňky představují méně než 1 % z celkového počtu zárodkových buněk. Průtoková cytometriemůŽe poskytnout lepší citlivost než způsoby používající mikroskop, ale vyžaduje dostupnost vysokého počtu buněk a také nese sebou některé technické potíže. Populace buněk tudíž může způsobit problémy a tento způsob neposkytuje možnost rozlišování mezi---značkovanými -novotvarými buňkami a nespecificky----fluoreskujícími normálními buňkami. Vynález umožňuje velmi citlivou detekci např. metatatických novotvarých buněk, jelikož vysoký počet buněk lze snadno zviditelnit v mikroskopu a připojené magnetické kuličky jsou snadno rozeznatelné. Použité monoklonní protilátky se váží dostatečně specificky např. na novotvarové buňky a ne na jiné buňky než jsou cílové buňky ve smíšené buňkové suspenzi, jako jsou např. krev, kostní dřeň a jiné_fnovotvarové úkazy, takže všechny buňky s připojenými kuličkami představují cílové buňky. Tento způsob .je navíc rychlý a jednoduchý a může být prováděn každým pracovníkem s přístupem k normálnímu mikroskopu. Způsob podle vynálezu vyžaduje vazbu monoklonních protilátek, např. myšího nebo lidského původu, které specificky poznají antigeny přítomné na novotvarových buňkách a ne na normálních buňkách při vyšetřování nebo pro jiné účely na specifické subpopulace normálních buněk a na paramagnetické Částice, a to buď přímo nebo na kuličky . předem pokryté protilátkami specificky poznávajícími příslušné protilátky nebo Fc části IgG protilátek, které •se—v-á-ž-í—na—novotva-r-ové-buňk-y-—Buňky- váz-aj-í-cí— pro tiTátky— mohou být typu IgG nebo IgM nebo ab fragment IgG nebo IgM. Příklady používaných proticílových buňkových protilátek mohou být ty, které jsou namířeny proti skupinám antigenních rozhodujících činitelů, jako jsou např. CD56/NCAM antigen (MOC-1), populace 2 epiteliálních (výstelkových) antigenů (MOC-31), populace 2 (MW 40kD) antigenů (NrLulO) (Myklebust a další, Br. J. Cancer Suppl. 63, 49-5Š, 1991), HMW-melamonu přidružený antigen (9.2, 27) (Morgan a další, Hybridoma, 1, 27-36, 1981), 80kD, sarkomu přidružený antigen (TP1 a TP3) (Cancer Res. 48, 5302-5309, 1988), hlenové antigeny (Diel a další, Breast Cancer Res. Treatm., 1991), nebo EGF receptorový antigen (425.'3) (Merck), navíc k antipanlidským protilátkám (Bruland a'další, nepublikováno), které jsou vhodné pro detekci lidských buněk mezi zvířecími buňkami. Protilátka 425.3 je zaměřena na antigeny jak v normálních tak i v zhoubných buňkách. Protilátky mohou být dále zaměřeny proti receptorúm růstového faktoru, jako je např. receptor EGF, receptor PDGF (A a Β), receptor inzulinu, receptor inzulinu.podobných látek, receptor transferinu, receptory NGF a FGF, skupiny integrinů, jiné molekuly s adhezními membránami a MDR proteiny, jak v normálních buňkách tak

-i--v--abnormá-lní'ch· buňkách, a“ant'igeny“přítomné'' na ^UDpo^lacícir^brinál^ícff^ĚunSk, navíc k onkogenním produktům, vyjádřeným na membránách normálních a zhoubných buněk a jen na zhoubných buňkách, .jako např. Neu/erb B2/HER2. Pokud se týká zhoubných buněk, tyto mohou být prsní, vaječníkové a prsní rakovinné buňky, melanom, sarkom, glioblastom, rakovinné buňky trávicího traktu a retikuloendotelního systému, nebo cílové buňky mohou být spojeny s ne-neoplastickými chorobami jako jsou kardiovaskulární, neurologické, plicní, autoimunní, trávicí·','-močopohlavní, retikoluendoteiální a jiné poruchy. Dále se mohou zhoubné populace buněk nacházet v •kostnídřeni, periferijní krvi, mohou mít původ v pleurálních a pobřišnicových efúzích a jiných tělesných tekutinových oddílech, jako např. moč, mozkomišní mok, semeno, míza, nebo z pevných novotvarů v normálních tkáních a orgánech, jako např. játra, mízní uzliny, slezina, plíce, slinivka břišní, kostní dřeň, centrální nervový systém, předstojná žláza, kůže a hlenové membrány. Ucelenější seznam antigenních rozhodujících Činitelů a odpovídajících protilátek nebo protilátkových

---fragmentů -protilátek-pouŽfvaných ^_ve' spo j i t os ti” s' tímto'' zlepšeným způsobem podle vynálezu je předložen v Tabulce čís, 1. Způsob podle vynálezu pozůstává z připojení' protilátek přímo na paramagnetické Částice, nebo se připojení může uskutečnit.připojením na povrchově vázané protilátky, jako např. polyklonní protimyšší protilátky, monoklonní krysí protimyšší protilátky nebo monoklonnípiotilidské protilátky, specificky rozeznávající Fc část jednotlivých.řečených protilátek. Protilátkami obalené paramagnetické kuličky jsou pak smíšeny se suspenzí vyšetřovaných buněk a· inkubovány po dobu od 5-.10 . minut · do 2 hodin, přednostně 30 minut, .při teplotě 0-25°C, přednostně při -4°C, za mírného otáčení. Způsob podle vynálezu může být též provozován s pozměněným pořadí, kroků, při kterém se volné protilátkové cílové.buňky . přidají do suspenze buněk, inkubují se po dobu.od 5-10 minut do 2 hodin, přednostně 30 minut, při teplotě 020°C, přednostně 4° C, za mírného otáčení. Pak se do buněk, inkubovaných jak uvedeno shora, přidají' paramagnetické částice, předem-'obalené protimyššími nebo' protilidskými protilátkami a výsledná suspenze se podrobí _dalš.í_inkubac.i—po-dobu—©d—5—l-O—m-i-nut—do—2—Ησάτη; ~ přednostně 30 minut, při teplotě 0-20° C, přednostně 4°

C, za mírného míchání. V2orky buňkové suspenze se potom přenesou do zařízení na počítání buněk a frakce buněk s připojenými kuličkami, v poměru k celkovému počtu buněk, se určí pomocí světelné mikroskopie. Počet protilátkou obalených kuliček přidávaných do buňkové suspenze by se měl rovnat 0,5-10 násobku počtu cílových buněk. Není-li toto číslo známé, pak počet přidávaných a protilátkou obalených kuliček by se měl rovnat 1-10 % celkového počtu buněk. Pro specifické účely a v případech s nízkou hustotou cílových buněk jako např. zhoubných.buněk, nebo když cílové buňky představuj i .velmi nízkou část celkového počtu buněk (Á l %), lze cílové buňky positivně oddělit v' magnetickém poli od necílových. Izolované cílové buňky pak mohou být mikroskopicky sečteny a frakce cílových buněk v poměru k celkovému počtu buněk v původní suspenzi buněk tak vypočítána. Kromě toho lze cílové buňky charakterizovat podle přítomnosti specifických biochemických a biologických vlastností. Zvlášt důležité bude použití takových buněk při studiích v oblasti molekulární biologie. Na rozdíl od shora uvedených způsobů, citovaných v rámci známé techniky, způsob dle vynálezu umožňuje studium a růst cílových buněk bez ''provedeni^- štěpení^- vazby”mezl'^-paramagneti'ckou^--'čás'ťic'í 'a ’”c xdl1 k”uč”e1 ůlěTllaý1 mav é ''zkoumat™”””' specifické geny v čisté populaci cílových buněk na DNA, mRNA a proteinové hladině, jak při biopsii novotvarů tak i v novotvarových buňkách přítomných v krvi, kostní dřeni a jiných tělních tekutinách, jako jsou např. moč, mozkomišní mok, semeno, míza, nebo z jinak normálníchtkání a orgánů, jako jsou např. játra, mízní uzliny, slezina, plíce, slinivka břišní, kostní dř.eň, centrální nervový systém, předstojná žláza, kůže a hl.enové membrány a v jiných oblastech Činností v rámci cytologického výzkumu. U způsobů známé techniky představují v biopsii signály z jižních, severních a 'západních skvrn normální buňky jakož i zhoubné buňky. Připraví-li se napřed jednobuněční suspenze ze zhoubného materiálu a zhoubné buňky j sou pak imunoma-gne ticky pozitivně zjištěny a odděleny, jakékoliv studie genů provedené na tomto materiálu by proto představovaly jen cílové buňky. To se též vztahuje např. na zhoubné buňky přítomné v prsních tkáních, např. v kostní dřeni, periferijní krvi, pleurální a pobřišniČní efúze a na jiné tělní tekutiny, 'např močy^-mo'zkomišní m'ok/semeno 'a míza.’ .studie''týkající·· se postupu polymerační řetězové reakce (PCR) též získají na specifičnosti a spolehlivosti jsou-li prováděny na populacích čistě zhoubných buněk, získaných způsobem

JL ± podle vynálezu. Použití kroků způsobu podle vynálezu se může lišit v závislosti na typu vyšetřované tkáně.

(a) . Tkáň z pevné nebo jehlové biopsie novotvaru se připraví mechanicky nebo pomocí enzymového ošetření na jednobuněční suspenzi, do které se pak přidají primární specifické protilátky nebo fragmenty protilátek, buď přímo nebo po umytí suspenze buněk fosfátem tlumeným solným nebo kulturním médiem s nebo bez séra, jako např. telecím plodovým sérem, hovězím, koňským, prasečím, kozím nebo lidským sérem.

(b) Je-li materiál vzorek pleurální nebo ascitesní efúze, mozkomíšní mok, moč, míza nebo tělní tekutina, jako např. efúze z pacientových kloubů s různými formami zánětů kloubů, specifické protilátky nebo fragmenty protilátek se .buď přidají do vzorků přímo nebo po odstředění s nebo bez mytí před nebo po odstředění ke dnu a navrácení do suspenze. ___.__::- íc) · Pozůstává-li materiál z odsáté krve nebo kostní dřeně, frakce jednozárodkové buňky se izoluje spádovým, odstředěním na např. mízní preparát před mytím, opětnou suspenzí a přidáním příslušných protilátek nebo fragmentů protilátky.

Podmínky postupu pro aj a b) jsou potvrzeny jak doloženo výsledky, docílenými úspěšnými pokusy popsanými níže. U .clL se ukázalo, že výsledky byly ovlivněny vysokým počtem faktorů, které byly detailně prozkoumány. Mezi ně patří koncentrace protilátek, poměr počtu paramagnetických částic k počtu, buňek, inkubační doba a' objem, typ ínkubačního média a hladina pH. Poměr Částic k jednozárodkové buňce u všech pokusů by měl být v rozsahu 0,5/1- 2/1, v závislosti na vazební přitažlivosti primárních specifických protilátek nebo fragmentů. Velkým problémem bylo nespecifické připojení částic, obalených ovčími nebo krysími protimyššími protilátkami samostatně nebo navíc specifickými protilátkami, na buňky normální krve nebo kostní dřeně. Pokusy ukázaly, Že nespecifická vazba je stejně vysoká bez přítomnosti specifických protilátek, což naznačuje, že problém není' způsoben příčnou reaktivitou cílových protilátek na normální buňky. Možnost, že méně než optimální specifičnost by -mohla-' býtzpůsobena' !onickou vazbou'byla vyloučena Γ “Jiná ’ πιο ž ňost^Hýeůbpopů í acé” normá ί η í ch buněk B-roďu by mohly přilnout ke komplexům pozůstávajícím z Částice a protilátky. Avšak imunomagnetické odstranění B-buněk ze suspenze buněk před přidáním specifických protilátek nebo komplexů pozůstávajících z protilátky a částice nezlepšilo specifičnost.posledně jmenovaného. Problém při postupu použitým pro izolaci jednozárodkových frakcí kostní dřeně a periferijní krve spočívající v tom, že některé necílové buňky by-také mohly vázat paramagnetické částice byl obešen nebo překonán. Tak u částic obalených ovčí protimyšší protilátkou samostatně nebo se specifickými ..protilátkami · byl počet částic nespecificky . připojených na malou frakci jednozárodkových krevních nebo kostnědřenních buněk snížen z průměru asi 10 na 1 a paralelně s tím se frakce· normálních buněk s částicemi snížila z 1-2' % na 0,5-1 nebo méně. Důkaz byl získán o tom, že problém mohl být .způsoben hydrofobními silami spojenými s protilátkami vázanými na paramagnetické částice. Způsob snížení .této hydrofobnosti je zudíž nárokován. Jeden takovýto způsob spočívá v předinkubaci

-protilátkami oba'1'ený'ch Částic asusp'e'nzibůněk'pbmo'c'í ' ........

slabých detergentů o vhodné koncentraci, např, Tween 20^r .

(TM) v koncentracích nižších než 0,1 % po dobu 30 minut při teplotě 4° C. Je-li opostatněna možná selekce

X J cílových buněk, suspenze buněk by měla obsahovat nízkou koncentraci .detergentu, např. 0,01 % Tween-u 20 (TM). U několika pokusů tento postup skoro vyloučil nebo dramaticky snížil problém nespecifické vazby známé u jednozárodkových buněčných frakcí z krve nebo z kostní dřeně. Následující další zlepšení, pokud budou opodstáněna, použitelná ve spojení s detergentním krokem jsou tato: Po inkubaci buňkové suspenze primárními protilátkami nebo fragmenty protilátky a paramagnetickými Částicemi obalenými protilátkami, jak popsáno shora, se suspenze buněk inkubuje druhou sadou protilátek nebo fragmenty protilátky zaměřené proti jiným mimobuněčním nebo nitrobuněčním rozhodujícím činitelům cílových buněk s nebo bez předchozího ošetření buněčnými fixativy, jako jsou např. formaldehyd nebo alkoholy, Tyto protilátky nebo jejich fragmenty by se měly předem označit fluoreskujícími látkami, kovovými koloidy, rádiozotopy, -komp-l-e-xy—b-iot-i-nů-nebo—enzymů^-ja‘ko^—j'sou peroxrdáza a alkanická fosfatáza, umožňující zviditelnění jako takové známými způsoby v mikroskopu a/nebo vhodným počítacím zařízením. Cílové buňky budou jak,zviditeliněny pomocí posledně uvedeného způsobu, přičemž budou mít na svém povrchu připojené Částice, tak i spočítány. Pro zjednodušení rozlišení mezi necílovými a cílovými buňkami lze suspenzi buněk před druhým zviditelňujícím krokem buď podrobit cytospinovému odstředění nebo připojit části suspenze.na obalená podložná skla na nichž se buňky připojené na částice rozptýlí v tenké vrstvě, což usnadní zjišťování dvojnásobně obarvené buňky. Pro .použití nového způsobu bude sada nástrojů obsahovat např. předem obalené paramagnetické částice, připravené pro každou monoklonní protilátku. V jiném provedení bude sada nástrojů na jedné straně obsahovat paramagnetické částice předem obalené IgG izotypem specifické protimyšší nebo protilidské protilátky a na druhé straně jiné cílové buňky, např. novotvarové buňky, přidružující protilátky. Třetí provedení sady nástrojů bude obsahovat paramagnetické částice předem obalené specifickými protiFc protilátkami, jako např. polyklonní protimyšší, nebo monoklonní krysí, protimyšší, nebo protimyšší, nebo protilidské protilátky schopné vazby na Fc část cílových bun ěk * př i'dr u ž U j' í c ích * p r '0' t i'l á ťky'/vázané~na“' spec řf Ťck é protilátky proticílových buněk. V dalším provedení sada nástrojů bude obsahovat jiné specifické protilátky nebo fragmenty protilátek zaměřených proti antigenúm/ receptorům uvnitř nebo na žádaných cílových buňkách, kde tyto protilátky nebo fragmenty protilátek jsou konjugovány s peroxidázou, alkalickou, fosfatázou nebo s jinými enzymy společně s'příslušnými substráty k takovým enzymům nebo kde řečené protilátky nebo fragmenty protilátek .jsou vázány na neparamagnetické částice o specifických barvách nebo s vázanými enzymy jako je např. peroxidáza nebo alkalická fosfatáza.

Příklady uskutečnění vynálezu.

Způsob podle vynálezu bude v dalším ilustrován modelovými pokusy, příklady užitkovosti nového způsobu podle vynálezu a příklady praktického· použití. Tyto příklady nebudou považovány za j.akýmkoliv způsobem omezující vynález.

1. Vázání· komplexů pozůstávajících z protilátky a kuličky na odrůdy novotvarových buněk podle nového postupu: Pro zjištění koncentrace protilátek a optimálních podmínek pro vázání komplexů pozůstávajících z protilátky a paramagnetické částice na novotvarové buňky byla použita široká škála novotvarových buňek. Tyto paramagnetické kuličky byly navázány na buňky buď obalením ovčí protimyšší (sheep-anti-mouše = SAM) protilátkou paramagnetické částice předem obalené specifickou protilátkou nebo napřed inkubováním 'buněk specifickými protilátkami a mytím následovaným druhou inkubací SAM obalených částic. Výsledky těchto postupů jsou uvedeny vTabulkách 2a a 2b, ve kterých + značí vazbu několika kuliček na všechny buňky,(+) značí buď nižší počet kuliček vázaných na každou buňku nebo, Že ne všechny novotvarové buňky měly kuličky připojené na svém povrchu, kdežto - značí, že k žádné vazbě nedošlo a (-) značí velmi slabou vazbu.

2. Pro detekci novotvarových buněk v jednozárodkové frakci kostní dřeně nebo periferijní krve byly provedeny 'pokusy,, při nichž specifičíTé protilátky a SAM-em obalené paramagnetické částice byly přidány buď k takovýmto jednozárodkovým buňkám nebo k suspenzi buněk, kde různé počty ve zkumavce pěstovaných typů novotvarových buněk byly přidány k uvedeným jednozárodkovým buňkám. U některých z těchto pokusů byly jednozárodkové buňky nebo zhoubné buňky předem obarveny pomocí fluorescentního barviva pro umožnění rozlišení mezi dvěma typy buněk. U všech pokusů byly nevazbové primární látky a/nebo kuličky obalené ovčí protimnyšsí protilátkou pro kontrolu použity odděleně.

TABULKA 2a

'Ančibotíi£	3 1	'Cell lineš
	1	MCE-7 \| Sí\ii?.3	Ϊ170 \|	Í-IDA231	KOM a 5	\| DG 115 [FHEX-l j	LOX 1
1 í i 1 1 . 1 1 1- i
NrLulO	I gG2 o	• 1 -!· 1 + .	(+)	( + )	1 - 1 1	1
i‘loc3i	i/K			ω·		i -? -1 1	1
Moc i	IgCl	t 1 ( + )	(ť)	+ 1 1 1 1
12H12	If/1		-L \|			1 - í 1	1
ί.;2·εη	TsG.3 .	--4:---—-----.-r----	-=p-----j	—.—	------+ —	j-- --+—i------— 1	----- .. -..j.
5Ao. ...	^ToGÍ		! -			i , i. -a '.-J· . u	. - . o. 4
		..............—		1 1 ^v 1	, j
i 5.-2	Igí-i	t	ι ω !			1 1 1	1
! CC2	lgG2a	!	1 - !			t ‘ ! “ i	\|
CC1	ϊεϊ'ί	1	i - i			i I (.+) 1	!
' ČU1S	ZeGI '	i	! - 1		.	i i	1
CUió	IcGl	( + ) !. -	í - 'i			i !	\|
	lc.GI	- V -				i - i - ’	- - . I
1 07	IeG3	í	1 (+)			1 .!	i
EiS	Ir.Gi ?	! -η			i	1 {-) 1 -	5QÁ-+ \|
j /.jí 2			í -i-		!	1 i	+
1 Q τ -j 7 I ι 1 1 > · - - - ' 1 1 1	! 1.1 +	+
i NuCIó		! -	I	ί 1 - i -
2T2	Ϊ sG i	1	1	( I I + I
! ic?	IgGl	1	I	í .1 1 - 1
5--!2 C=2F	11)	1 1 1 Ί 1 \| i
^5N7 (^=7?	11)	ί i 1 i 1 i Ί
	• I ' í - 1.. ·· i - ! ! '
		ί	I · ' ' 1		r	1 1 · -	i
CaA		- 1	1 .		f - '	1 1	! ’ ’
GÍNTES	IcG	1 I		1	1 . -i	\| '
3C9	Ic M	i i ...	lili
HHS	ígM		! ·! 1· · -I ·
í 5?<	Igí-i	1 !	f	t 1 ! !
	IgG 1	1 !	1	I ! I !

_L. i

TABULKA 2b

-	1 Anbibodies	Ceil lineš \|
		i		Prii 1 MA-ll	ICRLii35lCEL) 7-’*0í H-ióó Coio205 I	7SÓ-0 ^:l UTDR 1
		1 ' 1		i i í 1 1 ' 1 1 !
		INrLulO	íeG2b	í - -r , τ	i -r 1 - i - 1 - 1	1 1
		Moc3!	íqGí	~ ! i ·	1 + ! * i -ř í ť , i	- 1 - i
		Noc 1	IsG i	í	1 1 1 - 1 - }	1 1
		i2Ki 2	τ c G i	- i -	1( + )1 1 - 1 - 1	- . 1 !
		2Ei Ϊ	IcC-3	(-7 1 -	i - 1 + t - 1 - . 1	1 f
		5áó	IsG i	+ \| -!	i . i ! 1 1	1 1
		5 F ? r—Z- -	IgM		i 1 i i 1	1 1
		CCd		!	i ! 1 - ! 1	- 1 .. i
		CCi	Ír-M	1	ί 1 i (+) ! i	- r I
	j C ií i * j	IgCi	i	i i l-l 1	- i ΐ
		CU4Ó	IgGi	í	1 i t - 1 i	- 1 ί
		ΊΠί	ígGi	(Ό I +	i ~ i r- i - i	1 - 1
		ID7	ígG3	j	I 1 i - ! 1	1 - i
		t/Sr	T s Γ. ρ	Λ ί J.	1 - i + )-')- \|	1 - í
		ύ ? 5 ~ 3		1 f	i f 1 1 i	I ,
		9.2.27	1	1	lilii	i
	-	tiucis	—-1		I 1 I I 1	1 1
S-, 4 ·		2s 12	IgGi	I	1 i i ! I	1
		4b“	Í°G1	i	i i l-l I	í
		5r:2 (=2f	ιυ i	* !	lili!	1
		3í'í 7 ( = 12	ií) 1	- i	1 i i i	1
		T?-3	1	1 l·	lilií	1
		TP-1	f	, !	lilii	1
		CEA	1	]	i· I ί i í	1
*·		GPiTES	laG j	1 1	i 1 l-l I	! „ 1
	I	3C9	12 M J	I	1 I 1 - i 1	1 - 1
	i	HH3	IsA3 i	]	!. 1 l-l 1	! - !
	1	5ΕΔ	i 2 í¹ í i	1	! 1 \| \| i	\| j
	1	3 F i	12G i \|	] 1	f 1 1 - 1	1·- 1

3«·

U několika pokusů byla zpozorována určitá nespecifická vazba na jednozárodkové buňky, u které bylo zjištěno, že nemá žádný vztah k charakteru specifické protilátky a která byla stejně výrazná u samotných SAM- ·, obalených protilátek. Velikost této nespecifické vazby kolísala téměř od nuly do hladiny mezi 0.5-2 %. Tato nespecifická vazba byla téměř odstraněna mírným ošetřením detergentem (Tween 20), provedeným pro snížení problému -hyd-ro-f-obn-í—buňkové-in-terakce-.-·------------------- ---------PŘÍKLADY UŽITNOST.I. ZPŮSOBU PODLE'.VYNÁLEZU.

· Detekce. mikrome.t.astatické neoplastické choroby krve a

Včasná a spolehlivá diagnóza rozšíření rakovinných buněk, do krve a/nebo do mízy je stále důležitější pro volbu optimální léčby, možná'uzdravující u mnoha typů rakoviny, včetně karcinomů, jak popsáno v aplikaci Příkladu čís. 1. Podobné postupy -byly. ověřeny;nebo- jsou- ve vývoji pro zhoubnou melanomu, sarkomu, neuroblastomu a několik dalších druhů rakoviny.

. Detekce zhoubných buněk v pl euráních..nebo. asci tesnich efuzícn a v moči

Charakter těchto efuzí může představovat důležitý diagnostický problém obzvláště v případech, kdy je přítomen nízký počet rakovinných buněk spolu s normálními reaktivními nebo epiteliálními buňkami, v několika případech byla učiněna 'rychlá definitivní diagnóza pomocí způsobu podle vynálezu v případech, kdy normální cytologická 2kouška byla negativní nebo neurčitá, K podobné výhodě dochází v případech rakoviny ledvin nebo močového traktu a měchýře.

Spolu s tím jak se zlepšovala systematická léčba mnoha druhů rakoviny se zvýšil i podstatně počet případů ukazujících na symptom mozkové metastázy a paralelně.s tím i potřeba včasné detekce takového rozšíření.

. Použitím způsobu podle vynálezu lze identifikovat i nízký počet zhoubných buněk, což umožňuje zákrok léčebnými alternativami v ranném stádiu projevu nitrolebečního novotvaru.

V případě podezřeni na r.ako.v.inu— a—z-ís-k-á-n-í—tkáně~pro drobnohledné vyšetření chirurgickými postupy nebo např. punkční biopsijní jehlou, lze způsobem podle vynálezu učinit daleko jednodušší a rychlejší diagnózu aplikovanou na připravenou suspenzi buněk, oproti obvyklému morfologickému nebo imunohistochemickému nebo cytochemičkému postupu. Rozlišení mezi několika alternativními rakovinami lze učinit pomocí příslušných protilátek.5. Identifikace prognostických ukazatelů

Jelikož výraz některých membránových molekul se ukázal být ve vztahu k postupu zhoubné choroby několika druhů rakoviny, lze použít způsobu podle vynálezu pro identifikaci prognostických ukazatelů, např. jak popsáno v aplikaci Příkladu čís. 2.

. Identifikace buněk př í značných pro...sp.eoif.hcké-chotQby nebo pro postup nebo prn stav choroby

U různých druhů revmatických chorob, (jako např. u revmatické artritidy), jakož i u alergických, autoimunitních.a kardiovaskulárních, .chorob, je ,p.ro .diagnózu _a určitá stádia choroby důležitá identifikace systematické nebo místní přítomnosti specifických subpopulací buněk. Rychlá detekce, takových populací buněk pomocí způsobu' podle vynálezu.má proto značný diagnoistický a léčebný význam.

. Detekce subpopulací no.rmálriiEhL-bunek.

Pro několik účelů je- důležité detekovat frakci určité subpopulace normálních buněk v populaci. To se týká např. jaterní biopsie, kde může identifikace buněk, vyjadřuj ících'žlučový epiteliální antigen,. hrát důležitou roli. Podobně může být opodstatněna identifikace a možná · izolace specifických endoteliálních buněk .ze suspenze buněk připravené z různých normálních tkání. Některé z membránových buněk zmíněných v bodech čís. 1-6 mohou být použity jako cíle v imunoterapii spolu s několika druhy aktivovaných ničivých buněk nebo např. s imunotoxiny. Identifikace výrazu takových molekul způsobem podle vynálezu je proto též důležitá pro stanovení, ve kterých případech by se měly použít takové typy léčby.

PŘÍKLADY PRAKTICKÉ APLIKACE ZPŮSOBŮ PODLE VYNÁLEZU:

Pro diagnózu šíření rakovinných buněk v krvi nebo kostní dřeni v ranném stádiu jsme pomocí způsobu podle vynálezu použili protirakovinné protilátky MOC-31, NrLulO, BM2,

BM7, 12H12 a MLuCl pro určení zda lze nebo'nelze citlivě identifikovat mikrometáštatickou chorobu rakoviny prsu, plic, konečníkového traktu a předstojné žlázy z tělesných tekutin. Úspěšné výsledky s těmito protilátkami mají důležité klinické důsledky.

Přiklad čís, 2

Výraz několika membránových molekul buněk se ukázal být ve vzájemném, vztahu s postupem zhoubné choroby několika typů rakoviny. Detekci _vazby_t.ě.ch.to-p-r-o-ti-l-á-tek—napříslušné protilátky lze proto použít pro získání informace o vysoké prognostické hodnotě. Mezi takovými antigeny je vysoký počet adhezních molekul, sacharidových antigenů, glykolipidů, receptorú růstového faktoru a indikátorů rakoviny, uvedených níže. Pomocí způsobu podle vynálezu jsme identifikovali vazbu komplexů pozůstávajících z částice a protilátky na varianty CD44,

E kadherin, LeY, CEA, EGF-r, receptor transferinu, epitop MUC-1, epitop LUBCRU-G7, antigenů rakoviny předstojné žlázy, epitop UJ13A, mikroglobulin D₂' antigeny HLA a receptor apoptosy.

X

Příklad čís. 3

Od pacienta s předpokládaným onemocnění zhoubnou melanomou byly získány. 2 litry pleurální difúze. Po odstředění byly buňky suspendovány v objemu 2 ml RPMI s 10 % telecího plodového séxa inkubovaného s 9.2.27 antimelanomou protilátkou (10 7g/ml) při teplotě 4° C podobu 30 minut, umyty a opět inkubovány pomocí dynabeads (dynakuliček) (TM) SAM M450/IgG2A při teplotě 4° C po ' dobu 3 0“minutl^Sůspehze^buněk^býTápak' -zkoumána^pod mikroskopem pro určení frakce buněk s paramagnetickými částicemi připojenými k jejich povrchu. Diagnóza zhoubné melanomy byla potvrzena, jelikož asi 10 % buněk mělo podstatný počet rozetových částic.

Biopsijní tkáň byla získána z podkožního nádoru případu s klinickou indikací' buď malé buněční plicní rakoviny nebo zhoubného melanomu. Z biopsie byla připravena jednobuněčná suspenze a ta· byla rozdělena na 2 frakce, z nichž jedna' byla .inkubována' antimelanomou .protilátkou. . .. 9.2.27 a druhá antik.ar cinomou protilátkou MOC*.31 (obojí při 10 7g/ml). Inkubace byla podobná té, která byla použita ve shora uvedeném příkladu. Žádná z buněk inkubovanýčh melanomou protilátku nevázala kuličky, zatímco všechny novotvarové buňky inkubované s MOC-31 byly pozitivní.

Přiklad čís. 5_____________________ ............ ................... Biopsijní tkáň odebraná pacientu s podezřením na zhoubný melanom byla zkoumána přípravou jednobuněčné suspenze, inkubací antimelanomou protilátkou 9.2.27 a dále podle shora uvedeného postupu. Většina buněk byla pozitivní s vysokým počtem částicových rozet připojených k jejich membr ánám.

Byla studována pleurální efúze pacienta s rakovinou prsu pro zjištění zda lze'v tekutině zjistit novotvarové buňky. Litr kapaliny byl odstředěn, buňky znovu suspendovány a inkubovány v oddělených lahvičkách, každá Obsahující jeden ze 3 odlišných protirakovinných protilátek (MOC-31, 2E11, '12H12). Po ukončení postupu stejným způsobem jako shora bylo zjištěno, že většina buněk se ve všech 3 případech navázala na částice obalené protilátkou·.

Kostní -dřeň pacienta s rakovinou prsu byla^- zkoumána pro zjištění přítomnost mikrometastatických novotvarových buněk. Po přípravě jednozárodkových buněk byly tyto inkubovány stejnými 3 antikarcinomými protilátkami použitými ve shora uvedeném příkladu, ale v tomto případě protilátky byly nejprve připojeny na paramagnetické částice-dynakuličky (TM) SAM IgG, Po i inkubaci těmito přímo obalenými částicemi byla suspenze buněk zkoumána mikroskopicky, přičemž bylo zjištěno, že vysoký počet buněk je pozitivní a má na své membráně připojenu řadu částicových rozet. Podobné pokusy, byly .. pověděny s řadou pleurálních nebo asciteských efúzí a kostních dření pacientů s rakovinou prsu.

Příklad čís.,. B

Lidské prsní rakovinné buňky T47D byly inkubovány po různé doby fluorescenčním barvivém Hoechst a byla kontrolována životaschopnost označených buněk. Různé počty označených prsních rakovinných buněk byly pak přidány do 1 x 10^ buněk kostní dřeně získané ze zdravých dobrovolníků. Při různých pokusech byly přidány různé koncentrace paramagnetických monodispezních částic .ýdynakuličky (TM) P45.0) obalené .individuálními protirakovinnými protilátkami (NrLulO, MOC31, nebo 12H12) . Po inkubaci na ledě, trvající 30 minut,, byly vzorky z jednotlivých zkumavek zkoumány v počítací komoře světelnou a fluorescenční mikroskopií. Když byl poměr novotvarových buněk k celkovému počtu buněk s vytvořeným zárodkem nízký, suspenze buněk byla vystavena magnetickému poli a buňky s připojenými částicemi byl.y izolovány před jejich mikroskopickým zkoumáním. Bylo zjištěno, že optimální poměr byl 1-10 paramagnetických kuliček na novotvarou buňku, a že všechny novotvarové buňky mely 2-15 kuliček připevněných na svém povrchu. .Citlivost detekční .metody byla blízko, jedné, cílové buňky na 10- buněk s vytvořeným zárodkem. Při kontrolních. pokusech s označenými novotvarými buňkami se.použitím protilátek, o kterých se ví, že mají křížovou' reaktivitu s normálními buňkami, tato příčná reaktivita se potvrdila s paramagnetickými Částicemi obalenými protilátkou. Při pokusech s kuličkami.bez obalu protilátek přidružených k novotvarům, se nenavázaly žádné cílové buňky na žádné kuličky. Podobné pokusy byly provedeny jak s jinými druhy prsní rakoviny a řadou rakovinných buněk maíobuňkových plicních rakovin. Při těchto pokusech byla docílena podobná citlivost a specifičnost .

Pleurální a ascitesní tekutina, získaná od pacientů s prsní rakovinou a .rakovinou, vaječníku,-byla-odstředěna,· byly přidány stejné obalené paramagnetické částice jako v Příkladu čís.l, materiál byl pak inkubován a soustředěn v magnetickém poli před suspendováním a zkoumáním světelnou mikroskopií. Typicky měly buňky s jasně morfologickými vlastnostmi novotvarových buněk' na sobě navázány kuličky, kdežto žádné z mála normálních buněk na sebe nenavázaly kuličky obalené protilátkou. Ve dvou případech pleurální efúze nevykázalo individuální morfologické vyšetření přítomnost žádné novotvarové buňky, zatímco význačný počet zhoubných buněk byl detekován použitím protilátkou obalených kuliček, v některých případech byly novotvarové buňky odděleny v magnetickém poli a přeneseny do kultivačních baněk obsahující růstové médium, speciálně připravené pro růst -buněk-prsní—r^kovínyT^rpbkusu založit permanentní odrůdy buněk z těchto kultur. Paralelně s tím byly buňky ze zhoubných efúzí kultivovány přímo bez pozitivní selekce pomocí magnetických kuliček. V posledně uvedených případech nebylo možné založit žádné, odrůdy buněk, zatímco' ve více než 50 % případech, ve kterých byly použity pozitivně vybrané novotvarové buňky, byly odrůdy úspěšně založeny.

Příklad čís. 10.

V některých.případech byly kostní dřeň a periferijní krev, získané od pacientů s prsní rakovinou, zkoumány způsobem· podle vynálezu a to přidáním paramagnetických kuliček obalených protilátkou, inkubováním po dobu 30 minut při teplotě 4° C, koncentrací v magnetickém poli a zkoumáním suspenze pomocí světelné mikroskopie. V obou případech vazba paramagnetických kuliček na novotvarové buňky, představující 0,1-1 % buněk s vytvořeným zárodkem v kostní dřeni a v krvi, byla takto detekována; tyto buňky nebyly identifikovatelné žádným jiným způsobem.

Příklad čís, n

------Proti látky-.pr.o-t.i-ur-či-tý-m-r-ec-eptor-ům-r-ů-s-tové-ho-f-ak-toru— '-^^ríěbo—jdným-geňovýni^prOdukťům^vyj^ádřbhým^há^pbvichů’^^^™^ populace specifických buněk mohou být použity pro identifikaci a případně i pro výběr těchto buněk. U kuliček obalených antitransferinými receptorovými protilátkami a použitých ve způsobu podle vynálezu, bylo prokázáno, že představují rychlý, jednoduchý a citlivý způsob identifikace buněk vyjadřujících transferinový receptor.

Př i klad čís, 12

Pro. různé.potřeby je opodstatněna izolace, populace normálních buněk. Enďoteliální buňky obalující kapiláry nebo malé cévy v normální nebo novotvarové tkáni by mohly být pozitivně vybrány ze suspenzí buněk připravených příslušných tkání. Tento postup vyžaduje použití kuliček obalených protilátkami zaměřenými proti strukturám vyjádřeným na endoteliálních buňkách, ale ne na ostatních normálních buňkách ve směsi buněk;

Příklad čís.._13 '

Přítomnost lidských buněk injikovaných do imunodeficitních hlodavců byla prokázána v suspenzích ύ ί buněk připravených různých'hostitelských orgánů nebo tkání použitím magnetických částic obalených protivšelidskou

Y, ,.-.-1- - Ί í ·z novotvarových xenoiinplantátů a z protilátkou.

2tí

Tabulka 1

SEZNAM PŘÍSLUŠNÝCH ANTIGENŮ VAZAJ í Cí CH PROTILÁTEK

A PŘÍKLADY

PŘIDRUĚNÝCH ANTIGEN

Λ SM “Γ x G E~ ÍM

M O IM O K IL. O DM ÍMI í .

!= R G Γ T L_. A li EU V

A d h e z ní ro o I g k u 1 y'

Keceptor tibronektinu (.5[3l integrin) Pierce 36114, BTC 21/22 Calbiochem 341649

Integrin .3 [31

Receptor Víctronectin (,τ[33 integrin Integrin .2 integrin_ .3 __ __ _ ______

Integrin .4 ’ ITTťe~ji řir?¹”? 5'”'· ™

Integrin .V

Integrin [32 ' .

Integrin [34

G f j 1113111 .

ICAM-1 ÍC054)

VCAM-1

ELAM-1

E—selectin

P - s e I e c i i n / G r IP --14 0

LFA-3.(CD58)

CD44

C D 4 4 - v a r ;i. a:ί t y

N-CAM (CD56)

N-CAM

L-CAM

N-CAM. ... * .'..

MACAM-1

E-cadherin

P-cadherin

Tenascin

Recep t ci r T arombos pon d i n ( CD36 ) l| Λ ·.

vLH“ ,.ř

R e c e p t c 1 - i a m i n i n u

HNK-1 epítop

Sachridové antigeny

Ϊ-antigen

Tn'-antigěn '........’

Bialyl Tn

Antigen přidružený k, rakovině? t r á v i c í b o t. r a k t u (M . 2 0 0 k. D Antigen přidružený k rakovině Lev di-Le^K, tri-Le”

M-Kiol 2

TP36.1, BTC 41/42 Calbiochem 407277 C ě I.b ioc h em _ ,407278________

Ca 1 bioc hem	407279
Caí bioc hem	407280
Calbiochem	407281
Ca 1biochem	407233
Calbiochem	407234
8221
C57-60, CLI	303.4 .

RF; 1/1¹

G Enzyme 2137—CEL GEnzyme 2138-01 DBA 8

BTC 71/72

TS 2/9

BM 1441 272, 25.32

11.. 24, 11.31, 11.10 MOC-1

BCA9

BM 1.441 892 .

TURŘ-27 -A .· - · NKI-119

BTC 111, HECD-Í, 6F9

NCC-CAD-299

EM 1452 .193.,

CalPlochém- 580664 BM 1441 264 Al. 43

HNK-1

ΗΗΘ, HT-8 1 1046, BaGs2 TKH-2

CA 19-9

C-50

MLuCl, BR96, I3R64

B3 .

T a b n 1 k a 1 (1. p o k r a č o v á η i )

Epitop Dimetric Le“ H-typ 2 Epitop CA15-3	NCC-ST-421 &1 CA15-3
CEA	í-7, 1-14, 1-27, I-46, Ca 1bi oc bem
Ga 1 b.l — 481 c Mac ínL.4,6,3)	1B2
H-II	BE2
A typ 3	HHS
Lacto-N--f ucopen tanóz a III (GDI. 5)	PII-81
G1 y k o I i p i d v	- «
GLU	ME 36.1, R24
ge>₃	ME 36.1. 3F3, 14
Gbn ’ . ’	38-13
Sil ₃	112570
Gtb	MIC 1-9, MKI-16 '

rLicGili 1D7, F12

R e c g P t- o r V r fi s t o v b h o f a k t o r u Receptor EGF c-erbE-2 (HElR2)

Receptor Receptor Receptor F<eceptor Ret: eptor

PDGF.

FuGI-p transferinu NGF

ÍL-2 (CD25)

Sada c (c-kit)

Receptor TNF Recept or NGi425.3, 2.E7, 225 BII 1378 838, 800 EG G enzym 1264—00 tíigma P 7677 OKT 7, D 65.30 BM 1.173 637 BM 1275 802, '

ΒΪ1 1361 737

BII 423 616, 14 A3, ID7.3DÓ

GEnzym 17 7 5 ~01, PAL-Μ1

M e 1 a n o iravé _an t i nervy

Antigen on vysoké molekulární váze íI4MW 250.000)

1*1 w 1 o 5 g 1 y k o p r o t e i n p r i d r u z e n ý k mel anomu

Ant lpěn 100 kila ( me 1 anom/ k a r c i n o rn) gp i 13 p'75-100 p 7 5 f gr 100-107

MAA

II. 12 5 k D (g p 12 5)

A n 11q e n v s a r k □ m u

Epitopy TP-l a TP-3

M„200kD

J1„ióOkD

7.2.27, NrMU5, 225.28, 763.74, TF-4Í .2, - INDI

ME20 / 6.7 6

UC 13

PAL--112

15.75

Nl< I-bereb

K7.2

Mab436

TP-l, TP-3.

O O ~ 1 T '“l· Q j!· / J- 5 £ 7 i r_

35-16, 30-40

I abu 1 k a .1 (2 pokrabování )

Značko v ač kar c i n omu

Epitop MOC-31 (shluk 2 epiteliálních antigenů)

Antigeny MUC-1 ínapř. epitop DF3 (gp 290kD))

MUC-2 a MUC-3

Epitop LUBCRU-G7 (gp 230kD)

Antigen specifické prostaty A n t i g e n r a k o v i π π £ ρ ros t a t y -

MOC-31, NrLuiO MUC-1, DF3, BCP-7 do —Í.0 PMH1

LUBCPU-G7 BM 1270'972

E4—tíE

PD41

Polyniorfní epiteliální irmciny Specifický membránový antigen prostaty (Eyt-356)

BM2, BM-7, 12-H-l

7E11-C5 .-G-l.o.bul-in—l-idsk-ého-’fflTéčriého'tcvkP. ' '1 mmímotech HMFG-l

B/91Q9

Mucin MmŽIO*’

Epitop karcinomu vajseníků 0C125 (m„ 750 kD)

P a n k r e a 5 n í g 1 y k o ρ r o t e i η H JI W Antigen tračníku CO17-1A (M„37000) Epitop G9 (karcinom tračníku)

Lidský suliomucin tračníku A nt ig en si i n i v ky břišní M300kD GA 733.2

TAG 72

N e d e f i n o v a t & 1 n £

Přidružená rakovina slinivky břišní Rankareinom

A n t i g e n a cíeno k a r c i noniu prost a t y Adenokarcinom plic M_xl150-130kD Antigen rakoviny plic gp '160.í Cancer' Res . '48, 2768,19138)

Antigen karcinomu měchýře M„92kD Ant igen k. arc inomu měc hγře M „600kD Antigen karcinomu měchýře (Cancer Res. 49, 6720,- 1989)

Ε ρ i t o p' C A R - 3 M14 0 0 k. D

Epitop MAM-6 (Elu. 3) y s o k o mi ole I; u 1 á r n i a n t i g e n r a k o v i n y v a j e č n í k u

Ε ρ i i o ρ M u c i n u I a 3

A r 11 i g e n h e pa toče .1 u .1 á r n í h o

k. are inomu M „900k D

Epitop _i-iepemeilu._ig.p43)., —Antigen-- hepa t oc e 1 u 1 á r n í ho k are i n omu D-vazaný mucin, obsahující kyselinu N-g '1 y ko 1 ylneuraminickou Antigen kolorektálního karcinomu M„4SkD

Antigen karcinomu prsu M„,71kD

TAG-72, CE-49, CC

0C125

DU-PAN-2.

17-1A

B9

91.9H

PUSE. 11

BA’733, KS 1,4 072.3, CC49, LESÍ Oatl, SMI MUSEU

CC49

PD 41

AF-10- ' anti gpj.60 3S2-C6C3

A N 43, ΒB369 AF:-3

115D8

09X1, 09X2 I a 3

KM-2

Hepema-l

3E1.2

D612

BEA227

Ji

Tabulka i (3. pokračování)

Epitop 16.83 (antigen kolorektální

rakoviny)	16.88
CA K1 (rak o v i π y vaječní k u)	Ki
S ρ eci f ický ant i geη ρ trač ηí k u	Mu-1, Mu-2
Antigen karcinomu plic M„350-420kD	df-li, df-l:
Antigen karcinomu měchýře gp54	T16
Antigen karcinomu rnechýře gp85 - -	T43
Antigen karcinomu měchýře gp25	TI 38
A n t i q e? n y neu ro blas tomv
Epitopy přidružené neuroblastomy.
jako např. UJ13A	LU13A
Antigeny qiiomu
E ρ i t o ρ M e 1 — 14	Mel-14
A n t i q e n v r a k o v i n y h 1 a. v y a k r k u
A n t i g e η M >, 1.8—2 2 k u	E48
HLA antigeny
HLA třídai 1	TF'2'5.9?
H L. A — A	VF19LL67
HLA “Et	142-149.1
HLA-A2	KEÍl
HL A--A6C	Wó. 32
HLA-Dlí, DO, DE	Q 5/13, B 8
íía-mi krop lobul in	—NA tiR~i-
Receptor apoptosv
Lpitop· Apo-1	A po 1

Růcné

P1 a s í n i no geηη í ak tiv átor. a nt i genů a receptorfl P-glykoprotein Kátepsin D

Žlučový ěpoteliální antigen

J\l e u r o g 1 a n d u 1 á r n í a n t i g e n (C D 6 3)

CD 9

Všelidský celulární antigen

Zaječí pólyklon

C219,MRK16_f JSB-l 265/F4 CIS-Diagnostíci, Itálie HEA 12<

ΜΙΞ481, NKI-C3, I..S62 TAPA-1, R2, SM23 pan~'H fy

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob detekce specifických cílových buněk v suspenzích buněk pozůstávající ze smíšené populace buněk a v tekutinách obsahujících smíšenou populaci buněk a v jednobuněčné suspenzi připravené z pevných tkání, s * ·“—vý j -imkou^- no r mální ch~á~z'hou'b'ňý ch~ herna tdpoie tic ký ch ’ 'buněk' ΚΥνί'δΓkbstní^dřeni^ vyznačující se tím, že pozůstává z následujících kroků;

1.1 obalení samo o sobě známým způsobem paramagnetickými částicemi nebo kuličkami buď

a) protilátkami nebo fragmenty protilátek zaměřených na' membránové struktury speciálně vyjádřené na cílových buňkách ..a ne na necílových bukách ve směsi buněk; nebo

b) protilátkami, přednostně polyklonními protimyššími nebo monoklonními krysími protimyššími protilátkami nebo lidskými protilátkami schopnými'vazby na Fc'čásťi řečených protilátek, zaměřených proti membránové struktuře; a

1.2.1 smísení cílových buněk přidružujících protilátky (myšší nebo lidské), které jsou připojeny na řečené částice nebo kuličky nebo připojeny na kuličky předem obalené protimyššími nebo protilidskými protilátkami poznávajícími F.c části cíl poznávajících protilátek, se

- - -suspenzí buněk“obsa'hu'j'ících' cílové 'buňky';’'nebo

1.2.2 smísení volných cílových buněk přidužujících protilátky se suspenzí buněk obsahujících cílové buňky a inkubováním této směsi po dobu 5-10 minut až 2- hodiny, přednostně 30 minut, při teplotě mezi 0° C a 20° C, přednostně 4° C za mírného otáčení; a

1.3 inkubace směsi suspenze buněk a cíl' přidružujících protilátek připojených na paramagnetické částice nebo kuličky (1.2.1), nebo na paramagnetické částice nebo kuličky předem obalené protimyššími nebo protilidskými protilátkami poznávajícími .Fc část cíl přidružujících protilátek, ke směsi inkubovaných volných cíl přidružujících protilátek a suspenzi buněk (1.2.2) a inkubováním po dobu 5-10 minut až 2 hodiny, přednostně 30 minut, při teplotě mezi 0° c a 25° C, přednostně 4° C, při mírném otáčení; a

1.4.1 předinkubování protilátkou obalených částic a suspenzí buněk pomocí mírných detergentů’o vhodné koncentraci jako např. Tween 20 (TM) o koncentraci menší než 0.1 % po dobu 30 minut při teplotě 4° C po snížení hydrofobní síly spojené s protilátkou .obalenými_ čáwsticemi, jestliže populacecílových buněk je obsažena v odsáté krvi nebo kostní dřeni; a/nebo

1.4.2 inkubování suspenzí buněk ošetřených nebo neošetřených formalinem, alkoholem nebo jinými fixativy s jinými protilátkami nebo fragmenty protilátek vázajících se na mimobuněční nebo nitrobuněční molekuly přítomné v cílových buňkách a použité protilátky se označí předem pomocí peroxidáze, ‘alkalické fosfatáze nebo jinými enzymy umožňujícími zviditelnění vazby přidáním a inkubováním s příslušnými substráty; nebo

1.4..3 bioty.nilace fragmentů· protilátek jsou a zviditelnění vazby přidáním inkubace s avidinem vytvářejícím komplex s peroxidázou, alkalickou fosfatázou nebo s jinými enzymy a přidáním a inkubováním s příslušnými substráty nebo

1.5.1 vystavení inkubované směsi paramagnetických částic, protilátek a buněk (1.3) magnetickému poli jestliže hustota cílových buněk nízká nebo jestliže poměr počtu cílových buněk k celkovému počtu buněk ve směsi buněk je nízký (Á 1 %) -s následným zkoumáním a sečtením obarvených nebo nebo neobarvených komplexů, pozůstávajících z částic a cílových buněk, v suspenzi buněk pomocí mikroskopu a/nebo vhodného počítacího zařízení na buňky- nebo

- -čás-t ice-;—nebo -----------——.................. 1.5.2 zkoumání a sečtení cílových buněk v inkubovanésměsi paramagnetických částic, protilátek a směsi buněk (1.3) nebo v případě, kdy protilátky nebo fragmenty protilátek jsou konjugovány s nepařamagnetickým částicemi, které lze zviditelnit přímo z důvodu barvy nebo enzymatickou aktivací použitím mikroskopu a/nebo vhodného počítacího zařízení buněk nebo částic je-li poměr cílových buněk k celkovému počtu buněk v suspenzi buněk přiměřený (ž 1 %).

2. Způsob podle bodu 1-, vyznačující se . t i- m, že zaměřuje protilátku nebo její fragmenty proti antigenúm v normálních živých buňkách, jako např. v játrových hepatocytech, v Kupfferových buňkách a v endoteliálních buňkách typu 1 a 2 a v Clarových plicních buňkách, v endoteliálních buňkách specifických orgánů, v pankreatických exokrinních a endokrinních buňkách,, v ledvinových kanálkových, buňkách,., v ..měchýřových...............epiteliálních buňkách, v mozkových gliových buňkách, v měchýřových a prostatických epiteliálních buňkách, v řasových buňkách dýchacích cest, v různých subpopulacích slizničních buněk v trávicím traktu, v hypofýzních buňkách a v jiných endokrinních buňkách v různých orgánech produkujících hormony.

3. Způsob podle bodu 1 nebo 2, vyznačující se 'tím, že využívá pro řečenou protilátku cílové buňky protilátku, která je reaktivní s antigeny přítomnými na subpopulacích normálních buněk a na onkogenických produktech vyjádřených na.membráně normálních tkáňových buněk.

4. Způsob podle jednoho z předchozích bodů, vyznačující se tím, že využívá jako řečenou pozitivní protilátku, která je zaměřena proti receptorúm růstového faktoru najnembráně— nořmďlňi^rr-buněk, jako např. receptor EGF, receptor PDGF (A i B), receptory inzulínu, receptory látek podobných inzulínu, receptor transferinu a receptory NGF a FGF.

5. Způsob podle jednoho z předchozích bodů, vyznačující se tím, Že využívá protilátku zaměřenou proti skupině integrinů a jiných adhezních membránových molekul, a proti proteinům MDR v normálních buňkách.

3b

6. Způsob podle jednoho z'předchozích bodů, vyznačující se tím, že.

zaměřuje protilátku nebo její fragmenty proti antigehu nebo proti receptorúm v buňkách s abnormálními vývojovými tvary, přednostně takovými, jako jsou primární a metastatické rakovinné buňky

7 .... Způsob.podle jednoho..z .předchozích bodů,.. ·... .

I,,.<“nrr.iu‘ «ι κ » ιι ji-j ι_ «·πι'·ι _ΙΜ|· ι ι.··.·.ι· «g;i·····!·!··^ e-'Ťy ·; rj· ττί^τ-·- ,.,,.7,. jj —ι'·-η-4 τ'· ·,τ.

vyznačující se tím, že používá jako řečené protilátky přidružující cílovou buňku protilátky IgG izotypu nebo fragmenty F(ab')2 nebo F(ab), nebo IgM, nebo fragmenty IgM.

8. Způsob podle jednoho z předchozích bodů, vyznačující· se tím, že připravuje zmíněnou suspenzi buněk ze směsi populací buněk pozůstávajících ze savčích tkání, jako např.lidské kostní dřeně a periferijní krve, z pléurálních a pobřišničních efúzí, z jiných'tělních'tekutin, jako např) z moči, pléurálních a peritoneálních efúzí, z tělních tekutin, jako např. z moči, mozkomíšního moku, ze- semene, z mízy, nebo z tuhých novotvarů v normální tkáni a orgánech, jako např. v játrech, z mízních uzlin, ze sleziny, z plic, ze slinivky břišní, z kostní tkáně, z centrálního nervového systému, z předstojné žlázy, z kůže a ze slizničních membrán.

9. Způsob podle jednoho z předchozích bodů, vyznačující se- tím, že protilátka nebo fragmenty protilátky jsou zaměřeny' proti skupinám antigenních rozhodujících činitelů, jako‘jsou ty uvedené v Tabulce čís. l popisu vynálezu.

10. Způsob podle jednoho z předchozích bodů, vyznačující se tím, že užívá jako řečenou protilátku cílové buňky protilátku nebo fragment protilátky, který je zaměřen proti růstovému faktoru a onkogenním produktům vyjádřeným na membráně zhoubných buněk, jako např. receptory inzulínu,, receptory inzulínu podobných látek a receptorů FGF, kromě těch uvedených v Tabulce čís. 1 popisu vynálezu.

11. Způsob podle jednoho z předchozích bodů, vyznačující se tím, že užívá protilátku nebo fragment protilátky zaměřený proti skupině integrinů, jiným adhezním membránám molekul a MDR proteinů v abnormálních buňkách,, jak uvedeno v Tabulce čís.' l.

12. Způsob podle jednoho z předchozích bodů, vyznačující se tím, že

-užívá protilátky nebo fragmenty protilátky' nebo jejich kombinace zaměřené na rozhodující činitele antigenu, jak uvedeno v Tabulce čís. 1 popisu vynálezu.

13. Způsob podle jednoho z předchozích bodů, vyznačující se tím, že užívá řečenou protilátku, která je reaktivní s antigeny přítomnými v normálních buňkách, jako např. v prsních, ve vaječníkových a v plicních rakovinných buňkách, v melanomu, v sarkomu, v glioblastomu a v rakovinných buňkách trávicího a močopohlavního traktu a retikuloendoteliálniho systému^/n^bo_cílo\ými_buňkami__ ^_:pžidi,uže.nýn)i^k_ř„-ne.^neop,lasx-i,c-kým^chorobám_>=ig.akoi_fg_isou^např-;kardiovaskulární, neurologické, plicní, autoimunní, trávicí, močopohlavní, retikoendoteliální a jiné poruchy.

14. Užití detekčního způsobu podle jednoho z předchozích bodů pro izolaci cílových buněk, v y z n a č 'u .j i c i se t i m, že komplex buněk a paramagnetických částic je vystaven magnetickému poli a výsledné magneticky nahromaděné buňky jsou dále vystaveny biologickému, biochemickému a imunologickému, zkoumání, včetně charakterizace specifických genů'-na DNA, mRNA a proteinové hladině, včetně polymeračni .řetězové reakce a zpětné trankripce PCR.

15. Užití způsobu pro detekci specifických cílových buněk podle jednoho z předchozích bodů, vyznačující se tím, že sé‘zálbži ve” zkumavce kultury buněk ze separovaných paramagnetických komplexů pozůstávajících z částic a cílových buněk a/nebo pro naočkování imunodeficitních zvířat, přednostně pro založeni lidských novotvarových xenoimplantátů v řečených zvířatech.

15, Sada nástrojů pro provozování způsobu podle jednoho z předchozích bodů, vyznačuj ícl- se' tím', že pozůstává ze:

1) specifických protilátek nebo fragmentů protilátek zaměřených na receprory antigenu na žádaných cílových buňkách, kde řečená protilátka nebo fragment protilátky je vázán nebo může být vázán na zahrnuté paramagnetické částice bez odstranění jejich antigen vázací schopnosti; a/nebo
2) paramagnetické částice předem obalené specifickými proti-Fc protilátkami, přednostně polyklonními pr-oti-my-š š-í-mi—nebo-monok-lonními^-“krysími” px otumy š’š imii nebo proti lidskými protilátkami, schopnými vazby na Fc část protilátek přidružených k cílovým buňkám, a nespecifické volné protilátky cílové buňky; a/nebo.
3) paramagnetické částice předem obalené specifickými proti-Fc protilátkami, přednostně polyklonními protimyššími nebo monoklonními krysími protimyššími, nebo protilidskýmiprotilátkami schopnými vazby na Fc část protilátek přidružených ke specifickým protilátkám proticílových buněk; a/nebó
4) jiné specifické protilátky nebo fragmenty protilátek zaměřenéproti ahtigenům nebo receptorům uvnitř nebo na žádaných cílových buňkách, kde řečené protilátky nebo fragmenty protilátek jsou konjugovány s biotinem, peroxidázou, alkalickou fosfatázou nebo jinými enzymy, su nebo kde řečené protilátky nebo fragmenty protilátek vázány na enzymy, jako např. peroxidáza a alkalická rosfataza.