HU221234B1

HU221234B1 - Method for defecting specific target cells in specialized or mixed cell population and solutions containing mixed cell populations

Info

Publication number: HU221234B1
Application number: HU9500723A
Authority: HU
Inventors: Oystein Fodstad
Original assignee: Oystein Fodstad; Kvalheim Gunnar
Priority date: 1992-09-14
Filing date: 1993-09-10
Publication date: 2002-08-28
Also published as: USRE43979E1; FI951161A; FI951161A0; CA2144328A1; CZ65995A3; WO1994007139A1; ATE186402T1; ES2141170T3; SK281566B6; AU2593192A; AU4836393A; US6893881B1; PL177136B1; EP0660930A1; SK32995A3; HUT73741A; WO1994007138A1; HU9500723D0; JP3417563B2; DK0660930T3

Abstract

A találmány specifikus célsejtek kimutatására szolgáló eljárásravonatkozik egyszerű és időt kímélő módon, paramág- neses részecskéket,a célsejttel társult antitestek Fc részeit felismerő antitesteket, ésa célsejt membránokon lévő specifikus antigén determinánsokra irányulócélsejttel társuló antitesteket alkalmazva. A sejtszuszpenzióinkubálása valamely enyhe detergenssel és/vagy antitestek vagyantitest fragmensek második sorozatával, amely adott esetben elő vanjelezve a láthatóságot elősegítő fluoreszcens szerekkel,fémkolloidokkal vagy kiotin komplexekkel, drámai módon növeli azeljárás fajlagosságát. Ez az eljárás alkalmazható továbbá a célsejtekizolálására mágneses mező alkalmazásával. A találmány tárgya továbbákészlet az itt leírt eljárás végrehajtására. ŕ

Description

A találmány immunomágneses eljárásra vonatkozik, amellyel specifikus célsejteket lehet kimutatni sejtpopulációkban és sejtpopulációkat tartalmazó oldatokban. A találmány tárgyát képezi továbbá egy készlet (kit), amellyel a kimutatási eljárás különféle sejtpopulációkban végrehajtható.

A biológiában, a biokémiában és az ezekkel rokon szakterületeken nagy szükség van olyan módszerekre, amelyekben kémiai anyagokat kapcsolnak össze egymással. Az ilyen módszereknek növekvő jelentőségük van mind a normális, mind az abnormális sejtpopulációk kutatásában. Különösen akkor, ha szilárd hordozók alkalmazásával valósítják meg őket, amikor is a sejtek megköthetők, kimutathatók, elkülöníthetők és tisztíthatok. Ugyanakkor a sejttartalom egy sor kifinomult módszer alkalmazásával megvizsgálható. Fontos az is, hogy a sejteket életképes állapotban el lehessen különíteni.

Az affinitás kötés a kémiai és biokémiai anyagok egymáshoz való kapcsolásának egy kifinomult módja. Az ilyen eljárás során egy kötőpartner pár, amely például összekapcsolandó szubsztanciákhoz kapcsolódik, egymáshoz kötődik, amikor érintkezésbe kerül egymással. Az ilyen kötésekben az egyik kötőpartner egy sejt felületén lévő molekula lehet. Számos ilyen kötőpartner rendszer ismeretes, így például az antigén-antitest, az enzimreceptor vagy a ligand-receptor kölcsönhatás a sejteken, valamint a biotin-avidin kötés, amelyek közül az antigén-antitest kötést használják a leggyakrabban. Újabb szakirodalmi források szerint javasolták a haptén-antihaptén kötőpár módszer alkalmazását is (WO 91/01368).

Amikor ezeket az eljárásokat olyan specifikus sejtek elkülönítésére alkalmazzák, amelyeket aztán további különféle vizsgálatoknak vetnek alá, akkor szükség van a kötések visszafordítására (megszüntetésére), mégpedig a kötőpartnerek károsítása nélkül, hogy azok ideális esetben visszanyerjék eredeti tulajdonságaikat, amikor ismét az eredeti körülmények közé kerülnek. Ez azonban nem mindig sikerül, noha javasoltak eljárást antigén/anti-antigén és haptén/anti-haptén kötések adekvát hasítására (WO 91/15766 és WO 91/01368).

Ismeretesek eljárások, amelyekben az egyik kötőpartner egy oldhatatlan hordozóra, így például paramágneses részecskékre van kapcsolva, és amelyek során a vegyes sejtpopulációban lévő célsejteket negatív izolációval vagy pozitív izolációval különítik el. A negatív izolációs eljárás során a nemkívánatos sejteket lehet eltávolítani a sejtpreparátumból oly módon, hogy a sejteket a nemkívánt sejtekre specifikus antitestekkel bevont részecskékkel inkubálják. Az inkubálás után a sejt/antitest/részecske komplex a részecskék alkalmazása révén eltávolítható, amikor is a kívánt célsejt visszamarad. Ez az eredmény azonban gyakran nem kielégítő, minthogy a kívánt sejtek többé-kevésbé tisztított állapotban a sejtpopulációban maradnak, és mert az elkülönítési eljárást éppen a specifikus célsejtek vizsgálatáért és/vagy a célsejteken végzendő további tanulmányokért hajtják végre. Ezért megkísérelték részecskék használatát pozitív izolációban, amikor is a kívánt célsejteket választják ki a vegyes sejtpopulációból. Ezek az eljárások azonban csak kitüntetett célsejtekre irányultak, és nem alkalmazhatók minden célsejtrendszerre. Nemrég javasoltak egy pozitív izolációs eljárást, amelyben haptén/anti-haptén kötést alkalmaznak (WO 91/01368), valamint egy eljárást vérképző őssejtek csontvelőből való elkülönítésére (WO 91/09938). Az utóbbi a pozitív és a negatív szelekció kombinációjának használatára irányul a specifikus sejtek, nevezetesen a csontvelőben levő vérképző őssejtek elkülönítésére és lehetőség szerint tenyésztésére, ami a részecskék eltávolításának függvénye.

A WO 91/01368 számú publikáció olyan eljárásra vonatkozik, amelyben célsejteket egy oldhatatlan hordozóanyaggal kapcsolnak össze, kihasználva a haptén, anti-haptén antitestek és az antisejt antitestek egymáshoz kapcsolódási képességét. Ily módon kötést hoznak létre az oldhatatlan hordozó, azaz a részecske és a célsejt között, amely legalább haptén és anti-haptén antitestek közötti kötést vagy haptén és anti-haptén antitestek és anti-anti-haptén antitestek vagy másodlagos antisejt antitestek kombinációit foglalja magában. A komplexet később úgy hasítják fel, hogy ismét hapténnak vagy haptén analógnak teszik ki. így a kialakított kötés egy vagy több más elem mellett mindig tartalmaz haptént. Az eljárás aspecifikus célsejtekre irányul, és célja az, hogy a célsejteket elkülönítsék, és az oldhatatlan hordozót felszabadítsák.

Továbbra is szükség van olyan eljárásra, amellyel egyszerű kötést lehet létesíteni a célsejt és az oldhatatlan hordozó között egy nagymértékben nem specifikus haptén csoport alkalmazása nélkül, és amellyel specifikus célsejtek kimutathatók a lehető legkevesebb nem specifikus sejt kapcsolódással, és amely fölöslegessé teszi az oldhatatlan hordozó és a specifikus célsejt későbbi szétválasztását.

A WO 92/04961 számú közleményben olyan eljárásról és bonyolult berendezésről olvashatunk, amellyel sejteket vagy különböző molekulákat lehet elválasztani nem mágneses tesztközegből kolloid méretű mágneses részecskék segítségével. Ebben az eljárásban kicsiny, szubmikronos méretű részecskéket használnak, hogy elejét vegyék a részecskék oldatból való kiválásának. Az eljárás lefolytatásához egy bonyolult elválasztási rendszerre van szükség, amelyben mágneses erősítő eszközt merítenek a tesztfolyadékba. Ez káros hatást fejthet ki a sejtekre.

A találmány célja, hogy diagnosztikai célra a vérben és a csontvelőben alkalmazva lehetővé tegye specifikus célsejtek kimutatását a normális sejtekhez való nem specifikus kötés problémája nélkül. A találmány célja sokféle sejttípusra alkalmazható érzékeny kimutatási eljárás, amellyel nagyszámú sejt könnyen kiszűrhető mikroszkóppal, és amely gyorsan és egyszerűen végrehajtható. Az eljárás emellett használható sejtek elkülönítésére biokémiai, biológiai és immunológiai vizsgálat céljára, valamint specifikus gének tanulmányozására nukleotid és protein szinten, továbbá a sejtek tenyésztésére anélkül, hogy a sejtrészecske komplexeket szét kellene választani. A találmány célja továbbá, hogy egy készletet (kitet) biztosítson az eljáráshoz.

HU 221 234 Β1

A kitűzött célt a találmány szerint olyan, vegyes sejtpopulációk sejtszuszpenzióiban, vegyes sejtpopulációkat tartalmazó folyékony rendszerekben vagy szilárd szövetekből készített egynemű sejtszuszpenziókban lévő specifikus - a vér és a csontvelő normális és rosszindulatú vérképző sejtjeitől eltérő - célsejtek kimutatására irányuló eljárással éljük el, amelynek az a lényege, hogy

1.1. paramágneses részecskéket vagy gyöngyöket ismert módon bevonunk

a) a sejtkeverékben lévő célsejteken fajlagosan expresszálódó és nem célsejteken nem expresszálódó membrán szerkezetek ellen irányuló antitestekkel vagy antitest fragmentumokkal; vagy

b) az említett, a membrán szerkezetek ellen irányuló antitestek vagy antitest fragmentumok Fc-részére kötődni képes antitestekkel vagy antitest fragmentumokkal, előnyösen poliklonális anti-egér antitestekkel vagy monoklonális patkány anti-egér antitestekkel vagy anti-humán antitestekkel; és

1.2.1. a célsejtekkel asszociálódó (egér- vagy humán) antitesteket, amelyek

- az említett részecskékre vagy gyöngyökre vannak rögzítve, vagy

- a célsejtekkel asszociálódó antitestek Fc-részeit felismerő antiegér vagy anti-humán antitestekkel előzetesen bevont gyöngyökre vannak rögzítve, összekeverjük a célsejteket tartalmazó sejtszuszpenzióval; vagy

1.2.2. a célsejtekkel asszociálódó szabad antitesteket összekeverjük a célsejteket tartalmazó szuszpenzióval és ezt a keveréket 5-10 perc és 2 óra közti időtartamon, előnyösen 30 percen át 0 °C és 20 °C közti, előnyösen 4 °C hőmérsékleten enyhe forgatás közben inkubáljuk; és

1.3. - a sejtszuszpenzió és a paramágneses részecskékhez vagy gyöngyökhöz rögzített, céllal asszociálódó antitestek vagy antitest fragmensek keverékét (1.2.1), vagy

- sejtszuszpenzió és az inkubált, céllal asszociálódó szabad antitestek keverékére kialakuló, céllal asszociálódó antitestek Fc-részeit felismerő anti-egér vagy anti-humán antitestekkel előzetesen bevont paramágneses részecskék keverékét (1-2.2) inkubáljuk 5-10 perc és 2 órán közti, előnyösen 30 perc időtartamon át 0 °C és 25 °C közti, előnyösen 4 °C hőmérsékleten enyhe forgatás közben; és

1.4. - kívánt esetben, amennyiben a célsejt populáció vérből vagy csontvelő mintából származik, az antitestekkel bevont részecskékhez társuló hidrofobicitást az antitestekkel bevont részecskék és a sejtszuszpenzió megfelelő koncentrációjú enyhe detergenssel, például 0,1%-nál kisebb koncentrációjú Tween 20 detergenssel előnyösen 30 percen át 4 °C hőmérsékleten végzett előinkubálásával csökkentjük; és a kimutatás érdekében

- a kezeletlen vagy formáimnál, alkohollal vagy más rögzítő anyaggal előkezelt sejtszuszpenziót a célsejtekben jelen lévő extracelluláris vagy intracelluláris molekulákhoz kötődő más antitestekkel vagy antitest fragmensekkel inkubáljuk, ahol a nevezett antitestek vagy antitest fragmensek előzetesen

- peroxidázzal, lúgos foszfatázzal vagy más olyan enzimekkel vannak megjelölve, amelyek láthatóvá teszik a kötést ide vonatkozó szubsztrátumok hozzáadása és inkubálás után; vagy

- biotinilezve vannak és a kötés akkor válik láthatóvá, amikor peroxidázzal, lúgos foszfatázzal vagy más enzimekkel komplexbe vitt avidint adunk hozzá és ezzel inkubálunk, majd ide vonatkozó szubsztrátumokat adunk hozzá és inkubálunk; és

1.5. - amennyiben a célsejtek sűrűsége kicsiny, vagy ha a célsejtek az összes sejthez viszonyított aránya a sejtkeverékben kicsiny (legfeljebb 1%), akkor az inkubált és jelzett paramágneses részecske-antitest vagy antitest fragmens-sejtkeveréket (1.4.) mágneses mezőnek vetjük alá, majd a sejtszuszpenzióban mikroszkóp és/vagy megfelelő sejtrészecske számláló alkalmazásával megszámláljuk az elszíneződött vagy el nem színeződött részecske-célsejt komplexumokat; vagy

- megvizsgáljuk és megszámoljuk a célsejteket a paramágneses részecskék, antitestek és sejtek ínkubált és jelzett keverékében (1.4.); vagy

- abban az esetben, amikor az antitesteket vagy antitest ffagmensek olyan nem paramágneses részecskékhez is vannak konjugálva, amelyeket közvetlenül láthatóvá lehet tenni színük vagy enzimaktivitásuk miatt, a vizsgálatot mikroszkóppal és/vagy megfelelő sejtrészecske számláló berendezés alkalmazásával hajtjuk végre, amennyiben a célsejt/teljes sejt arány a sejtszuszpenzióban ezt lehetővé teszi (> 1%).

Előnyösen úgy járunk el, hogy normális élő sejtekben, különösen májhepatocitákban,

Kupffer-sejtekben, 1. vagy 2. típusú endotellális sejtekben vagy a tüdő Clara sejtjeiben, specifikus szervek endotelállis sejtjeiben, a hasnyálmirigy belső elválasztású vagy külső elválasztású sejtjeiben, a vesetubulus sejtekben, a hólyag hámsejtjeiben, az agy gliasejtjeiben vagy ependimasejtjeiben, a hólyag vagy prosztata hámsejtjeiben, a légutak csillós sejtjeiben, a gasztrointesztinális traktus nyálkahártyasejtjeinek különféle alpopuiációiban, a hipofízis sejtekben vagy különféle hormontermelő szervek más belső elválasztású sejtjeiben lévő antigének elleni antitesteket vagy antitest fragmenseket alkalmazunk.

A találmány szerinti eljárásban célsejtfelismerő antitestként előnyösen normális sejtek alpopuiációiban lévő és a normális szövetek sejtmembránjain megjelenő onkogén termékekben lévő antigénekkel szemben reaktív antitesteket használunk.

Az említett pozitív szelekció antitestjeiként előnyösen normális sejtek membránjain lévő növekedési faktor receptorok, különösen EGF receptorok, PDGF (A és B) receptorok, inzulin receptorok, inzulinszerű receptorok, transzferrin receptorok vagy NGF és FGF receptorok ellen irányított antitesteket használunk.

HU 221 234 Bl

Előnyös továbbá, hogy ha normális sejtekben levő integrinek és más adhéziós membrán molekulák csoportja vagy MDR proteinek ellen irányított antitesteket használunk.

A találmány szerinti eljárást előnyösen úgy valósíthatjuk meg, hogy az antitesteket vagy azok fragmenseit rendellenes fejlődésű sejtekben, különösen primer és áttételes ráksejtekben lévő antigének vagy receptorok ellen irányítjuk.

Az említettek során célsejtfelismerő antitestként előnyösen IgG izotípusú antitesteket vagy F(ab’)₂ vagy F(ab) fragmenseket vagy IgM antitesteket használunk, de használhatjuk az IgM antitestek fragmenseit is.

Magát az eljárást célszerűen úgy hajtjuk végre, hogy a sejtszuszpenziót emlősök szöveteit, különösen humán csontvelő vagy perifériás vér, pleurális vagy peritoneális izzadmányok, más testnedvek, különösen vizelet, agy-gerincvelői folyadék, sperma vagy nyirok szöveteit tartalmazó vegyes sejtpopulációból vagy normális szövetekben vagy szervekben, különösen a májban, a nyirokmirigyekben, lépben, tüdőben, hasnyálmirigyben, csontszövetben, a központi idegrendszerben, a prosztatában, a bőrben vagy a nyálkahártyákban levő szilárd tumorokból készítjük. Az eljárás során előnyösen antigén determinánsok, előnyösen az 1. táblázatban felsorolt antigén determinánsok ellen irányított antitesteket vagy antitest fragmenseket alkalmazunk.

Előnyösen úgy járunk el, hogy célsejtfelismerő antitestként növekedési faktor receptorok vagy rosszindulatú sejtek membránjain megjelenő onkogén termékek, különösen inzulin receptorok, inzulinszerű receptorok vagy FGF receptorok, valamint az 1. táblázatban felsoroltak ellen irányított antitesteket vagy antitest fragmenseket használunk.

Előnyösen járhatunk el oly módon is, hogy integrinek csoportja, valamint rendellenes sejtekben lévő más, az 1. táblázatban felsorolt adhéziós molekulák vagy MDR proteinek ellen irányított antitesteket vagy antitest fragmenseket használunk.

Az eljárásban használt antitesteket, antitest fragmenseket vagy azok kombinációit célszerűen az 1. táblázatban felsorolt antigén determinánsok ellen irányítjuk.

Általában előnyös, ha a találmány szerinti eljáráshoz antitestként rendellenes sejteken, különösen mell-, petefészek- vagy tüdőráksejteken, melanóma, szarkóma, glioblasztóma sejteken vagy a gasztrointesztinális vagy genitourináris traktus vagy a retikuloendoteliális rendszer ráksejtjein lévő antigénekkel és/vagy nem daganatos betegségekkel, különösen kardiovaszkuláris, neurológiai, pulmonáris, autoimmun, gasztrointesztinális, genitourináris, retikuloendoteliális vagy más rendellenességekkel kapcsolatos célsejteken lévő antigénekkel szemben reaktív antitesteket használunk.

A találmány tárgyát képezi továbbá az előbbiekben ismertetett kimutatási eljárás alkalmazása célsejtek elkülönítésére, aminek során a sejtek és a paramágneses részecskék komplexét mágneses térbe helyezzük, azután a kapott, mágnesesen aggregált sejteket biológiai, biokémiai és/vagy immunológiai vizsgálatoknak vetjük alá, kívánt esetben meghatározva a specifikus géneket a DNS, mRNS és protein szinten, adott esetben polimeráz láncreakcióval (PCR) vagy reverz transzkriptáz PCR-rel.

Ugyancsak a találmány tárgyát képezi az előbbi eljárás alkalmazása specifikus célsejtek kimutatására, aminek során a szeparált paramágneses részecskéket és célsejteket tartalmazó komplexekből in vitro sejtkultúrákat készítünk.

Végül a találmány tárgyát képezi a fent ismertetett eljáráshoz használható készlet (kit), amely tartalmaz

1. a kívánt célsejteken lévő antigének vagy receptorok ellen irányított specifikus antitesteket vagy antitest fragmenseket, amelyek a készletben lévő paramágneses részecskékre vannak rögzítve antigénkötő képességük megtartásával, vagy

2. paramágneses részecskéket, amelyek előzetesen specifikus anti-Fc antitestekkel, előnyösen poliklonális anti-egér vagy monoklonális patkány anti-egér vagy anti-humán antitestekkel vannak bevonva, amelyek képesek rákapcsolódni a célsejtfelismerő antitestek Fcrészére, valamint specifikus szabad célsejtfelismerő antitesteket, vagy

3. paramágneses részecskéket, amelyek előzetesen specifikus anti-Fc antitestekkel, előnyösen poliklonális anti-egér vagy monoklonális patkány anti-egér antitestekkel vagy anti-humán antitestekkel vannak bevonva, amelyek képesek rákapcsolódni a célsejtfelismerő antitestek Fc-részeire, specifikus anti-célsejt antitestekhez kötve, és adott esetben: 4. más, a kívánt célsejtekben vagy célsejteken lévő antigének/receptorok ellen irányított specifikus antitesteket vagy antitest fragmenseket, amelyek biotinhoz, peroxidázhoz, lúgos foszfatázhoz vagy más enzimekhez vannak konjugálva vagy nem paramágneses részecskékre vannak kötve, amelyeknek speciális színük van, vagy amelyek rájuk kapcsolt enzimeket, előnyösen peroxidázt vagy lúgos foszfatázt hordoznak.

A vegyes sejtpopulációkban és sejtpopulációkat tartalmazó fiziológiai oldatokban lévő célsejtek immunomágneses kimutatási módja alkalmas e célsejtek detektálására, de használható mind normális, mind patogén sejtek specifikus típusainak pozitív elkülönítésére is. Az eljárás révén kötés jön létre a specifikus célsejt és egy oldhatatlan hordozó, például a paramágneses részecskék között, mely egy vagy több elemből állhat. A részecskék vagy egér vagy humán eredetű antisejt antitesttel vannak bevonva, amelyek a kívánt célsejtek membránjain lévő specifikus antigén determinánsok ellen irányulnak, vagy pedig a részecskék poliklonális anti-egér vagy anti-humán antitestekkel vannak bevonva, amelyek kötődni képesek a célsejtek membránjain lévő antigén determinánsokkal szembeni specifikus antisejt antitestek Fc-részehez. Poliklonális antiegér vagy anti-humán antitestek helyett használhatunk a részecskék bevonására monoklonális patkány antiegér vagy anti-humán antitesteket is. Az utóbbi antitestek, részben monoklonális eredetüknél fogva, még inkább specifikus kötést képesek létrehozni az antisejt antitesttel, csökkentve ezzel esetleges keresztreakciók

HU 221 234 Β1 kockázatát az oldatokban vagy a vérben lévő más sejtekkel. Ha még ezenkívül a sejtszuszpenziót egy enyhe detergenssel és/vagy egy második antitest vagy antitest fragmens csoporttal inkubáljuk, amelyet adott esetben előzetesen fluoreszcens anyagokkal, metallokolloidokkal, radioizotópokkal, biotin komplexekkel vagy megfelelő enzimekkel jelöltünk meg, melyek a mintát láthatóvá teszik, akkor igen nagy mértékben növekszik az eljárás specificitása.

Az alábbiakban részletesebben ismertetjük a találmány szerinti eljárást, bemutatva ráksejtek mint célsejtek kimutatását és esetleges elkülönítését. A találmány azonban nem korlátozódik ráksejtekre, és az eljárás alkalmazási területe sem korlátozódik a most következő ismertetésben közöltekre, minthogy az eljárás citológiai kutatási területek egész sorában alkalmazható.

A rákban szenvedő páciensek kezelésbe vételekor igen fontos megállapítani a betegség előrehaladásának fokát, vagyis azt, hogy a betegség lokalizálva van, vagy pedig áttételesen elterjedt más szövetekre is. Erre azért van szükség, hogy megfelelően válasszuk meg a beteg számára legcélszerűbb terápiát. A rosszindulatú sejtek közvetlen invázió útján hatolnak be a környező szövetekbe, de a nyirokedényeken keresztül vagy a daganatos sejtek vérrel való szétszóródása révén eljutnak távoli szervekbe, sőt a csontvelőbe, a központi idegrendszerbe vagy az agy-gerincvelői folyadékba is.

Az áttételes tumorsejtek kimutatása eddig morfológiai módszereken alapult. Ezekhez fénymikroszkópiai vagy elektronmikroszkópiái megfigyeléseket alkalmaztak kimetszett (biopsziás) daganatmintákon vagy csontvelő vagy perifériás vér keneteken, valamint különféle testfolyadékok citocentrifugálása után készített lemezeken. Minthogy a monoklonális antitestek megjelenését érzékelő antigének túlnyomórészt a rosszindulatú sejtek különféle típusainak felületén jelennek meg, az áttételes sejtek azonosításához egyre inkább alkalmaznak immnocitokémiai és immunofluoreszcenciás módszereket. Ezért a biopsziás daganatmintákból vagy a citocentrifugálással nyert mintákból készített lemezekes preparátumokat monoklonális antitestekkel kezelték, és azoknak a tumorsejtekhez való kötődését kolorimetriásan vagy fluoreszcencia segítségével tették láthatóvá. Az utóbbi módszer fluoreszcencia-mikroszkóp használatát igényli, vagy pedig sejtszuszpenziót kell készíteni, és áramlásos sejtszámlálót kell használni a vizsgálathoz.

Ezeknek az eljárásoknak az a hátrányuk, hogy kicsi az érzékenységük és/vagy a szelektivitásuk, amellett rendszerint sok munkát és időt, valamint magas fokon képzett személyzetei igényelnek. Az áramlásos sejtszámlálós vizsgálatokhoz még költséges berendezésre is szükség van.

A vérben és a csontvelőben lévő daganatos sejtek kimutatásának morfológiai módszerei sokkal kevésbé érzékenyek, mint azok a módszerek, amelyekben immunocitokémiai vagy immunofluoreszcenciás vizsgálatokat alkalmaznak [Beiske és munkatársai, Am. J. Pathology 141 (3), 1992 szeptember]. Még ez utóbbi módszerek sem adekvátok azonban akkor, ha a tumorsejtek a magokat tartalmazó sejteknek 1%-nál kisebb részét teszik ki. Az áramlásos sejtszámlálásos módszerrel nagyobb érzékenységet lehet elérni, mint a mikroszkópos módszerekkel, de ehhez nagyszámú sejtre van szükség, és alkalmazása során technikai nehézségeket is le kell küzdeni. így például a sejtek aggregálása problémát okozhat, és az eljárás nem teszi lehetővé, hogy megkülönböztessék egymástól a jelzett tumorsejteket és a nem specifikusan fluoreszkáló normális sejteket.

A találmány lehetővé teszi például áttételes tumorsejtek igen érzékeny kimutatását, minthogy nagyszámú sejtet lehet általa mikroszkóposán átszűrni, és a sejtekhez kapcsolt mágneses gyöngyök könnyen felismerhetők. Az eljáráshoz használt monoklonális antitestek megfelelő specificitással kötődnek például a tumorsejtekhez, és nem kötődnek más sejtekhez, mint a vegyes sejtszuszpenziókban, például vérben, csontvelőben és más tumor manifesztációkban lévő célsejtekhez, minthogy minden sejt, amely a gyöngyökhöz kapcsolódik, a célsejtek körébe tartozik. Az eljárás amellett gyors és egyszerű, és bárki elvégezheti, ha rendelkezik egy szokványos mikroszkóppal.

A találmány szerinti eljárásban monoklonális antitestekkel létesítünk kötéseket, például egér vagy humán eredetű antitestekkel, amelyek specifikusan felismerik a tumorsejteken lévő antigéneket, de nem ismerik fel a normális sejtek antigénjeit. Más célra normális sejtek specifikus alpopulációihoz köthetjük őket. Ezeket az antitesteket paramágneses részecskékhez kötjük, vagy közvetlenül, vagy úgy, hogy a gyöngyöket előbb bevonjuk olyan antitestekkel, amelyek specifikusan felismerik a megfelelő antitesteket vagy a tumorsejtekhez kötődő IgG antitestek Fc-részét. A sejtet megkötő antitestek lehetnek IgG vagy IgM típusúak vagy lehetnek egy IgG vagy IgM fragmensei. Az eljárásban használhatunk anti-célsejt antitestként olyanokat, amelyek az antigén determinánsok csoportjai, például CD56/NCAM antigén (MOC-1), Cluster 2 epiteliális antigén (MOC-31), Cluster 2 (MW 40 kD) antigén (NrLulO) (Myklebust és munkatársai, Br. J. Cancer Sup pl. 63, 49-53, 1991), HMW-melanómával kapcsolatos antigén (9.2.27) (Morgan és munkatársai, Hybridoma, 1, 27-36, 1981), 80 kD, szarkómával kapcsolatos antigén (TP1 és TP3) (Cancer Rés. 48, 5302-5309, 1988), mucin antigének (Diel és munkatársai, Breast Cancer Rés. Treatm., 1991) vagy EGF-receptor antigén (425.3) (Merck) ellen irányulnak, azonkívül anti-pánhumán antitestet (Bruland és munkatársai, publikáció alatt), amely alkalmas arra, hogy kimutassa a humán sejteket az állati eredetű sejtek között. A 425.3 antitest mind normális, mind rosszindulatú sejtek antigénjei ellen irányul. Ezenkívül irányíthatunk antitesteket növekedési faktor receptorok ellen, így például EGF-receptor, PDGF (A és B) receptor, inzulin receptor, inzulinszerű receptor, transzferrin receptor vagy NGF és FGF receptorok ellen, integrinek csoportja és más adhéziós membrán molekulák és MDR proteinek ellen, amelyek előfordulhatnak normális vagy abnormális sejtekben, továbbá normális sejtek alpopulációiban lévő antigének ellen, azonkívül normális és rosszindulatú sejtek memb5

HU 221 234 Β1 ránjain megjelenő vagy csak rosszindulatú sejteken megjelenő onkogén termékek, például Neu/erb B2/HER2 ellen. A rosszindulatú sejtek lehetnek mell-, petefészek- vagy tüdőráksejtek, melanóma, szarkóma vagy glioblasztóma sejtek, a gasztrointesztinális traktus vagy a retikuloendoteliális rendszer ráksejtjei, de lehetnek célsejtek nem daganatos betegségekre jellemző sejtek is, így például a kardiovaszkuláris, neurológiai, pulmonáris, autoimmun, gasztrointesztinális, genitourináris, retikuloendoteliális vagy más rendellenességekkel kapcsolatban megjelenő sejtek. A rosszindulatú sejtpopuláció elhelyezkedhet a csontvelőben, a perifériás vérben, de származhat pleurális vagy peritoneális izzadmányokból vagy más testfolyadékokból, mint például vizeletből, agy-gerincvelői folyadékból, spermából, nyirokból, vagy pedig normális szövetek vagy szervek, mint a máj, a nyirokcsomók, a lép, a tüdő, a hasnyálmirigy, a csontszövet, a központi idegrendszer, a prosztata, a bőr vagy a nyálkahártyák szilárd tumorjaiból. Az antigén determinánsok és a találmány szerinti eljárásban használt, ezeknek megfelelő antitestek és antitest fragmensek még teljesebb felsorolását az 1. táblázat tartalmazza.

1. táblázat

Releváns antigének és példák az azokhoz kapcsolódó antigénkötő antitestekre

Antigének_Monoklonális antitestek

Adhéziós molekulák
Fibronectin receptor	Pierce 36114, BTC
(αδβΐ integrin)	21/22 Calbiochem 341649
Integrin α3β1	M-Kiol 2
Vitronectin receptor
(αγβ3 integrin)	TP36.1, BTC 41/42
Integrin a2	Calbiochem 407277
Integrin a3	Calbiochem 407278
Integrin a4	Calbiochem 407279
Integrin a5	Calbiochem 407280
Integrin aV	Calbiochem 407281
Integrin β2	Calbiochem 407283
Integrin β4	Calbiochem 407284
€φΙΙβ3ΙΙΙα	8221
ICAMI (CD54)	C57-60, CL 203.4, RR l/l¹
VCAM-1	Genzyme 2137-01
ELAM-1	Genzyme 2138-01
E-selectin	BBA8
P-selectin/GMP-140	BTC 71/72
LFA-3 (CD58)	TS 2/9
CD 44	BM 1441 272, 25.32
CD 44 variánsok	11.24, 11.31, 11.10
N-CAM (CD56)	MOC-1
H-CAM	BCA9
L-CAM	BM 1441 892
N-CAM	TURA-27
MACAM-1	NK.I-M9
E-cadherin	BTC 111, HECD-1,6F9

Antigének	Monoklonális antitestek
P-cadherin	NCC-CAD-299
Tenascin	BM 1452 193 Calbiochem 580664
Thrombospondin receptor (CD36)	BM 1441 264
VLA-2	A 1.43
Laminin receptor
HNK-1 epitóp	HNK-1
Szénhidrát antigének
T-antigén	HH8, HT-8
Tn antigén	TKH6, BaGs2
Sialyl Tn Gasztrointesztinális rák-	TKH-2
kai kapcsolatos antigén (M 200kD)	CA 19-9
Karcinómával kapcsolatos antigén	C-50
Le	MLuCl, BR96, BR64
di-Le¹, tri-Le¹	B3
dimer Le¹ epitóp	NCC-ST-421
H-típus 2	B1
CA15-3 epitóp	CA 15-3
CEA	I- 9,1-14,1-27, II- 10,1-46 Calbiochem 250729
Galbl-4GlcNac- (nL4,6,8)	1B2
H-II	BE2
A-típus 3 Lakto - N - fukopenta-	HH8
nóz III (CD 15)	PM-81
Glikolipidek
gd₃	ME36.1, R24
gd₂	ME36.1,3F8, 14.18
Gb₃	38-13
gm₃	M2590
gm₂	MKI-8, MKI-16
FucGM,	1D7.F12
Növekedési faktor receptorok
EGF receptor	425.3, 2.E9.225
c-erbB-2 (HER2)	BM 1378 988,800 E6
PDGFa receptor	Genzyme 1264-00
ΡΟΟΡβ receptor	Sigma P 7679
Transzferrin receptor	OKT 9, D65.30
NGF receptor	BM 1198 637
IL-2 receptor (CD 25)	BM 1295 802, BM 1361 937
c-kit	BM 428 616, 14A3,1D9.3 D6
TNF receptor	GEnzyme 1995-01, PAL-M1
NGF receptor
Melanóma antigének
nagy móltömegű an-	9.2.27, NrML5,225.28,
tigén (HMW 250,000) Mw 105 melanómával	763.74, TP41.2, IND1
kapcsolatos glikoprotein	ME20

HU 221 234 Β1

Antigének	Monoklonális antitestek	Antigének	Monoklonális antitestek
100 kDa antigén (melanóma/karcinóma)	376.96		M 150-130kD tüdő adenokarcinóma antigén	AF-10
gP Π3 p95-100	MUC 18 PAL-M2	5	gpl60 tüdőrák antigén (Cancer Rés.
Sp75	15.75		48, 2768, 1988)	anti gp 160
gr 100-107 MAA	NKI-bereb K.9.2		M 92kD hólyagrák antigén	3G2-C6
M 125 kD (gp 125) Szarkóma antigének	Mab 436	10	M 600kD hólyagrák antigén	C3
TP-1 és TP-3 epitóp M 200 kD M 160 kD	TP-1, TP-3 29-13,29.2 35-16, 30-40		hólyagrák antigén (Cancer Rés. 49, 6720, 1989)	AN43, BB369
Karcinóma markerek MOC-31 epitóp		15	CAR-3epitóp M >400kD	AR-3
(cluster 2 epitél antigén)	MOC-31, NrLulO		MAM-6 epitóp (05.3)	115D8
MUC-1 antigének [mint DF3-epitóp	MUC-1, DF3, BCP-7-		nagymolekulájú petefészekrák antigén	OVX1,OVX2
(gp290kD)]	tői-10-ig	20	mucin epitóp Ia3	Ia3
MUC-2 és MUC-3 LUBCRU-G7 epitóp (gp230kD)	PMH1 LUBKJ-G7	hepatocelluláris karcinóma antigén M 900kD	K.M-2
prosztata specifikus antigén	BM 1276 972	25	hepemális epitóp (gp43) hepatocelluláris karcinó-
prosztata rák antigén	E4-SF	ma antigén	H epema-1
nagymolekulájú prosztata antigén M>400kD polimorf epitéliális nyál-	PD41 BM-2, BM-7,		N - glikolil -neuraminsavat tartalmazó Okötésű mucin	3E1.2
kák	12-H-12	30	M 48kD colorektális kar-
prosztata specifikus membrán antigén (Cyt-356)	7E11-C5	cinóma antigén M 71kD mellrák antigén	D612 BCA 227
humán tejzsír globulin	Imunotech HMFG-1, 27.1	35	16.88 epitóp (colorektális karcinóma antigén)	16.88
42kD mellrák epitóp	B/9189	CAK.1 (petefészekrák)	KI
M>10⁶ mucin petefészekrák 0025 epitóp	TAG-72, CC-49, CC-83	40	vastagbél specifikus antigén p tüdőrák antigén M 350-420kD	Mu-l,Mu-2 DF-L1, DF-L2
(m 750 kD)	0025		gp54 hólyagrák antigén	T16
hasnyálmirigy HMW glikoprotein	DU-PAN-2		gp85 hólyagrák antigén gp25 hólyagrák antigén	T43 T138
vastagbél antigén Col7-1A(M 37000)	17-1A	45	Neuroblasztóma antigének neuroblasztómával kap-
G9-epitóp (vastagbélrák)	G9		csolatos epitóp, mint UJ13A epitóp	UJ13A
humán vastagbél szulfomucin	91.9H		Glióma antigének Mel-14 epitóp	Mel-14
M 300kD hasnyálmi-		50	Fej és nyak rák antigének
rigy antigén	MUSE11		M 18-22kD antigén	E48
GA 733.2 TAG 72	GA733.KS1.4 B72.3, CC49, CC83		HLA antigének HLA Class 1	TP25.99
definiálatlan	Oatl, SM1		HLA-A	VF19LL67
hasnyálmirigy rákhoz		55	HLA-B	H2-149.1
kapcsolódó antigén	MUSE 11		HLA-A2	KS1
pán karcinóma antigén	CC49		HLA-ABC	W6.32
prosztata adenokarcinóma antigén	PD41		HLA-DR, DQ, DP Pi-mikroglobulin	Q 5/13, B 8.11.2 NAMB-1

HU 221 234 Β1

Antigének	Monoklonális antitestek
Apoptózis receptor
Apo-1 epitóp	Apó 1
Vegyes antigének
plazminogén aktivátor	nyúl poliklonális an-
antigének és receptorok	titestek
p-glikoprotein	C219, MRK16, JSB-1, 265/F4
katepszin D	CIS-Diagnostici, Olaszország
epe epitéliális antigén	HEA 125
neuroglanduláris an-	ME491,NKI-C3,
tigén (CD63)	LS62
CD9	TAPA-1,R2, SM23
pán-humán sejt antigén	pan-H

A fenti 1. táblázatban szereplő antigén-monoklonális antitestpárok a szakterületen megszokott, kutatóhelyek közötti cserék révén is beszerezhetők, vagy a szakterületen ismert eljárásokkal bármikor előállíthatok, de közülük több a kereskedelmi forgalomban vagy törzsgyűjteményből is beszerezhető. Ezek közül kiemeljük például a polimorf epitéliális nyálka - BM-7 párt, ahol az antitest a „MED 1 C GmbH (D-20312 Hamburg, Németország) terméke.

Az eljárás során az antitesteket vagy közvetlenül a paramágneses részecskékhez kötjük, vagy az azok felületén megkötött antitestekre, így például poliklonális anti-egér antitestekre, monoklonális patkány anti-egér antitestekre vagy monoklonális anti-humán antitestekre, amelyek specifikusan felismerik az adott individuális antitestek Fc-részeit. Az antitestekkel bevont paramágneses részecskéket azután összekeveijük a vizsgálandó sejtek szuszpenziójával, és 5-10 perctől 2 óráig terjedő időn át, előnyösen 30 percig inkubáljuk 0 °C és 25 °C közötti hőmérsékleten, előnyösen 4 °C-on, enyhe forgatás közben. Az eljárás lefolytatható más műveleti sorrendben is, oly módon, hogy a szabad célsejtfelismerő antitesteket adjuk a sejtszuszpenzióhoz, és 5-10 perc és 2 óra közötti ideig, előnyösen 30 percig inkubáljuk 0 °C és 20 °C közötti hőmérsékleten, előnyösen 4 °C-on, enyhe forgatás közben. Ezután adjuk hozzá az inkubált sejtszuszpenzióhoz az anti-egér vagy anti-humán antitestekkel előzetesen bevont paramágneses részecskéket, amint fent leírtuk, és a kapott szuszpenziót újabb inkubálásnak vetjük alá, melyet 5-10 perctől 2 óráig terjedő ideig, előnyösen 30 percig folytatunk 0 °C és 25 °C közötti hőmérsékleten, előnyösen 4 °C-on, enyhe mozgatás közben. A sejtszuszpenzió mintákat azután átvisszük egy sejtszámláló készülékbe, és a gyöngyökhöz tapadt sejtfrakciót a sejtek összszámához viszonyítva fénymikroszkóposan határozzuk meg. A sejtszuszpenzióhoz mintegy 5,0-10-szer annyi antitesttel bevont gyöngyöt kell adni, mint amennyi a célsejtek száma. Ha ez a szám ismeretlen, akkor a bevont gyöngyökből a sejtek össz-számához viszonyítva 1-10% mennyiséget kell a sejtszuszpenzióhoz adni.

Különleges célok esetén, vagy akkor, ha a célsejtek sűrűsége csekély, mint például rosszindulatú sejtek esetében, vagy ha a célsejtek a sejtek összmennyiségének csak egy igen kis frakcióját (legfeljebb 1%-át) alkotják, a célsejteket pozitív szeparálássál különíthetjük el az egyéb sejtektől mágneses mezőben. Az elkülönített célsejteket azután mikroszkóposán megszámlálhatjuk, és kiszámíthatjuk a célsejtfrakció arányát a kezdeti sejtszuszpenzióban lévő teljes sejtmennyiséghez képest. A célsejteket azonkívül jellemezhetjük esetleges specifikus biokémiai vagy biológiai sajátságaikkal is. Az ilyen sejtek különösen előnyösen használhatók a molekuláris biológiai vizsgálatokban. A technika állásából ismert, fent leírt megoldásokkal szemben a találmány szerinti eljárás lehetővé teszi a célsejtek tanulmányozását és tenyésztését a paramágneses részecske és a célsejt közötti kötés felhasítása nélkül. Adott esetben, különböző célból előnyös lehet megvizsgálni specifikus géneket a célsejtek tiszta populációjában DNS, mRNS és protein szinten, mind a tumor biopsziás mintákban, valamint olyan tumorsejtekben, amelyek a vérben, a csontvelőben vagy más testfolyadékban, például a vizeletben, az agy-gerincvelői folyadékban, a spermában vagy a nyirokban találhatók, vagy egyébként normális szövetekből vagy szervekből, például májból, nyirokmirigyekből, lépből, tüdőből, hasnyálmirigyből, csontszövetekből, a központi idegrendszerből, a prosztatából, a bőrből vagy a nyálkahártyákból vett mintákból származnak, mind pedig a citológiai vizsgálatok más területein.

A technika állása szerinti eljárásokban a Southern, a Northern és Western blotból kapott jelek egyaránt képviselik a normális sejteket és a tumorsejteket a biopsziás mintában. Ha azonban előbb egyetlen sejtszuszpenziót készítünk a daganatos mintából, és a tumorsejteket azután pozitív immunomágneses detektálásnak és szeparálásnak vetjük alá, az így előkészített anyagon bármely génvizsgálat csak a célsejtekről ad felvilágosítást. Ez vonatkozik például az emlősök szöveteinek rosszindulatú sejtjeire is, amelyek például a csontvelőben, a perifériás vérben, a pleurális vagy peritoneális izzadmányokban és más testnedvekben, például a vizeletben, az agygerincvelői folyadékban, a spermában és a nyirokban lelhetők fel. A polimeráz láncreakció (PCR) metodológiájának alkalmazásával végzett vizsgálatoknak is növelhetjük a specificitását és megbízhatóságát, ha azokat a találmány szerinti eljárással előállított tiszta tumorsejt populációkkal végezzük.

A találmány szerinti eljárás egyes lépései különbözők lehetnek aszerint, hogy milyen szöveteket kell megvizsgálni.

a) A szilárd tumorból vagy a tűbiopsziás mintából származó szövetet mechanikusan vagy enyhe enzimes kezeléssel dolgozzuk fel egyetlen sejtszuszpenzióvá, amelyhez vagy közvetlenül hozzáadjuk a specifikus antitesteket vagy antitest fragmenseket, vagy a sejtszuszpenzió mosása után, amit foszfátpufferos sóoldattal vagy adott esetben szérumot, például magzati borjúszérumot, szarvasmarha, ló, sertés, kecske vagy humán szérumot tartalmazó tápközeggel végzünk.

b) Ha a vizsgálandó anyag egy pleurális vagy ascitises izzadmányból vagy agy-gerincvelői folyadékból, vizeletből, nyirokból vagy testfolyadékokból, mint az artritis különböző formáiban szenvedő betegek ízületeinek izzadmányából származó minta, akkor a specifi8

HU 221 234 Β1 kus antitesteket vagy antitest fragmenseket vagy közvetlenül adjuk a mintához, vagy centrifugálás után, melynek során adott esetben a mintákban lévő sejteket a kicentrifugálás előtt vagy után mossuk, azután a mintát ismét szuszpendáljuk.

c) Ha a vizsgálandó anyag vér vagy csontvelő minta, akkor a mononukleáris sejtfrakciót gradiens centrifugálással, például Lymphoprep segítségével elkülönítjük a mosás, újra szuszpendálás és a megfelelő antitestek vagy antitest fragmensek hozzáadása előtt.

Az a) és b) eljárás változatok körülményeit kísérleti tapasztalatok határozzák meg, amelyeket a később ismertetendő sikeres kísérletekben kaptunk.

A c) eljárásváltozat eredményeit tapasztalataink szerint számos körülmény befolyásolja, amelyeket részletesen megvizsgáltunk. Ilyenek az antitest-koncentráció, a paramágneses részecskék számának aránya a sejtek számához viszonyítva, az inkubálási idő, valamint az inkubált anyag térfogata, az inkubáláshoz használt közeg, valamint annak pH-ja. A részecskék mononukleáris sejtekhez viszonyított számarányának minden kísérletben a 0,5/1 és 2/1 közötti tartományba kell esnie, ezen belül a primer specifikus antitestek vagy antitest fragmensek kötési affinitásának a függvénye.

Komoly gondot okozott a juh vagy patkány anti-egér antitestekkel bevont részecskéknek a normális vérhez vagy csontvelőhöz való aspecifikus kötődése önmagában vagy a specifikus antitestekkel együtt. Kísérleteink azt mutatták, hogy az aspecifikus kötés akkor is ugyanolyan nagy, ha specifikus antitestek nincsenek jelen, ami azt jelenti, hogy a problémát nem a célsejtfelismerő antitesteknek a normális sejtekkel való keresztreakciója okozza. Azt a lehetőséget, hogy az optimálisnál gyengébb specificitást ionos kötés okozhatja, kizártuk. Egy másik lehetőség volt arra gondolni, hogy a B-vonal normális sejtjeinek alpopulációi a részecske-antitest komplexekhez tapadhatnak. Amikor azonban a B-sejteket immunomágneses úton eltávolítottuk a sejtszuszpenzióból, mielőtt hozzáadtuk a specifikus antitesteket tartalmazó antitest-részecske komplexeket, ez utóbbiak specificitása nem javult.

Végül megkerültük vagy megoldottuk azt a problémát, amely abból adódott, hogy egyes nem célsejtek is megköthetnek paramágneses részecskéket, ha az eljárást csontvelő vagy perifériás vér elkülönített mononukleáris frakciójára alkalmazzuk. Juh-anti-egér antitesttel bevont részecskéket önmagukban vagy specifikus antitestekkel együtt használva a mononukleáris vér vagy csontvelő sejtek alacsony frakciójához kötött részecskék száma átlagosan 10-ről mintegy 1-re csökkent, és ezzel együtt a részecskékhez kötött normális sejtek frakciója 1-2%-ról 0,5-1%-ra vagy annál kisebbre esett vissza.

Bebizonyosodott, hogy a problémát a paramágneses részecskékhez kötött antitestekkel kapcsolatos hidrofób erők okozhatják. Ennek a hidrofobitásnak a csökkentése szintén a találmány részét képezi. Ennek egyik módja az, hogy az antitestekkel bevont részecskéket és a sejtszuszpenziót előinkubáljuk egy megfelelő koncentrációban alkalmazott enyhe detergenssel, például

0,1%-nál kisebb koncentrációban vett Tween 20 márkanevű detergenssel, az inkubációt 30 percig folytatva 4 °C hőmérsékleten. Ha biztosítva van a célsejtek lehetséges szelekciója, akkor a sejtszuszpenziónak egy csekély mennyiségű detergenst, például 0,01% Tween 20 detergenst kell tartalmaznia. Ha így járunk el, akkor számos kísérlet tapasztalata szerint csaknem teljesen megszűnik vagy igen nagy mértékben csökken a vér vagy a csontvelő mononukleáris sejtfrakciójának aspecifikus kötéséből eredő probléma.

Az alábbiakban a találmány szerinti eljárásnak egy másik tökéletesítési lehetőségét ismertetjük, amelyet, ha célszerűnek látjuk, a detergens alkalmazásával együtt igénybe vehetünk.

Miután a sejtszuszpenziót a primer antitestekkel vagy antitest fragmensekkel és az antitestekkel bevont paramágneses részecskékkel a fentiek szerint inkubáltuk, a sejtszuszpenziót újra inkubáljuk antitestek vagy antitest fragmensek egy újabb csoportjával, amelyek a célsejtek más extracelluláris determinánsai vagy intracelluláris determinánsai ellen irányulnak, adott esetben sejtrögzítőkkel, mint formaldehiddel vagy alkoholokkal való előkezelés után. Ezeket az antitesteket vagy azok fragmenseit fluoreszcens anyagokkal, metallokolloidokkal, radioizotópokkal, biotin komplexekkel vagy enzimekkel, mint peroxidázzal vagy lúgos foszfatázzal előzetesen jelzetten kell alkalmazni, hogy lehetővé tegyük az ismert módon való vizualizálást a mikroszkópos és/vagy más megfelelő számlálókészülékkel való kiértékelés során.

A célsejtek az utóbbi művelet révén láthatóvá válnak, egyúttal kötött részecskéket hordoznak a felületükön, és így meg lehet őket számlálni.

Annak érdekében, hogy a célsejteket könnyebben meg lehessen különböztetni a nem-célsejtektől, a sejtszuszpenziót a második vizualizálás előtt citospin centrifugálásnak vethetjük alá, vagy a sejtszuszpenzióból kivett részeket bevont üveglemezekre vihetjük fel, amelyeken a részecskékhez kötött sejtek vékony rétegben szétterjednek, megkönnyítve a kétszer „festett sejtek felismerését.

A találmány szerinti eljáráshoz használható készlet (kit) például minden egyes monoklonális antitesthez készített, előre bevont paramágneses részecskéket tartalmaz. Egy másik lehetőség szerint a készlet egyik részét IgG izotípusú specifikus anti-egér vagy anti-humán antitestekkel előzetesen bevont paramágneses részecskék, másik részét egy más célsejtet, például tumorsejtet felismerő antitestek képezik. Egy harmadik megvalósítási lehetőség szerint a készlet olyan specifikus anti-Fc-antitestekkel előzetesen bevont paramágneses részecskéket tartalmaz, amelyek a célsejtfelismerő antitestek Főrészéhez képesek kötődni, így például poliklonális antiegér vagy monoklonális patkány anti-egér, anti-egér vagy anti-humán antitesteket, specifikus anti-célsejt antitestekhez kötve. Egy további lehetőség szerint a készlet más specifikus antitesteket vagy antitest fragmenseket tartalmaz, amelyek a kívánt célsejtekben vagy célsejteken lévő antigének/receptorok ellen irányulnak, és amely antitestek vagy antitest fragmensek peroxidázzal, lúgos

HU 221 234 Bl foszfatázzal vagy más enzimekkel vannak konjugálva, az illető enzimek releváns szubsztrátumaival együtt, vagy amely antitestek vagy antitest fragmensek olyan nemparamágneses részecskékhez vannak kötve, amelyeknek sajátos színük van, vagy amelyekre enzimek, mint peroxi- 5 dáz vagy lúgos foszfatáz vannak kapcsolva.

A találmány szerinti eljárást az alábbiakban modellkísérletekkel, az eljárás hasznosságát bemutató példákkal, valamint gyakorlati példákkal szemléltetjük. Ezekkel a példákkal azonban semmiképpen sem kívánjuk a találmány oltalmi körét korlátozni.

A találmány szerinti eljárással az alábbi modellkísérleteket végeztük el.

1. Antitest-gyöngy komplex kötése tumorsejtvonalakhoz a találmány szerinti eljárással.

Ráksejtvonalak széles skáláját használtuk annak meghatározására, hogy melyek az antitest-paramágneses részecske komplexek tumorsejtekhez kötéséhez szükséges antitest koncentrációk, és melyek a kötés optimális körülményei. A paramágneses gyöngyöket úgy kötöttük a sejtekhez, hogy a specifikus antitesteket juhanti-egér antitesttel (SAM) bevont paramágneses részecskékre vittük fel bevonatként, vagy pedig a sejteket előbb a specifikus antitestekkel inkubáltuk, azután mos10 tuk, majd egy újabb inkubálás közben hoztuk össze a SAM-bevonatos részecskékkel. Ezeknek a kísérleteknek az eredményeit a 2a és 2b táblázatban foglaljuk össze, ahol a + jel azt jelenti, hogy minden sejtre több gyöngy kötődött, a (+) jel azt jelenti, hogy kisebb számú gyöngy kötődött minden sejtre, vagy nem minden tumorsejt felületére kötődött gyöngy, míg a - jel arra utal, hogy kötés nem jött létre, a (-) jel pedig arra, hogy kötés csak igen kis mértékben jött létre.

2. Modellkísérleteket végeztünk tumorsejteknek a csontvelő vagy a perifériás vér mononukleáris frakciójában való kimutatására, oly módon, hogy a specifikus antitesteket és a SAM-bevonatos paramágneses részecskéket vagy az ilyen mononukleáris sejtekhez adtuk, vagy olyan sejtszuszpenzióhoz, amely az említett mononukleáris sejtek mellett in vitro tenyésztett sejtvonalakból származó, és a szuszpenzióhoz hozzáadott különböző számú ráksejtet tartalmazott. Néhány kísérletben a mononukleáris sejteket vagy a rosszindulatú sejteket előzetesen megszíneztük egy fluoreszcens festékkel, hogy a kétféle sejtet meg lehessen különböztetni egymástól. Kontrollként minden kísérletben nem-kötő primer antitesteket és/vagy juh-anti-egér antitesttel bevont gyöngyöket használtunk külön-külön.

2a táblázat

Sejtvonalak

Antitestek	MCF-7	SKBR3	T47D	MDA231	MDA435	FMEX-1
DU145	LOX
NrLulO	lgG2b		+	+	( + )	( + )	+
Moc31	IgGl	+	4-	+	( + )	( + )	+
Mocl	IgGl			(+)	( + )	+
12H12	IgGl		+	+		+	+
2E11	IgG3	+	+	+		+	+
5A6	IgGl		(+)	+
5F2	IgM			(+)
CC3	IgG2a	-	-	-				-
CC1	IgM			-				(+)
CU18	IgGl	-	-	-
CU46	IgGl	(+)	-	-
7F11	IgGl	-	-	+			-	-	-
D7	IgG3			(+)
E4SF	IgGl		+	+			(-)	-	50% +
425-3				+				-	+
9.2.27								-1-	+
MUC18			-				-	-	-
2gl2	IgGl							-i-
4b7 BM2 (=2F11)	IgGl							+

HU 221 234 BI

2a táblázat (folytatás)

Antitestek MCF-7

Sejtvonalak

T47D MDA435

FMEX-1

SKBR3 MDA231 DU145

LOX

BM7
(=7F11) TP-3 TP-1 CEA GINTES	IgG
3C9	IgM
HH8	IgM
5F4	IgM
3F1	IgG

2b táblázat

Sejtvonalak

Antitestek PM1 CRL1435 H-146 786-0

MA-11 CRL 1740 Colo205 W1DR

NrLulO	IgG2b	+	+	+	+	+	+	-
Moc31	IgGl	+	+	+	+	+	+	+
Mocl	IgGl					+	-
12H12	IgGl	+	+	(+)		-	-	-
2E11	IgG3	(+)	+	-	+	-	-	-
5A6	IgGl	+	+
5F2	IgM
CC3	lgG2a					-		-
CC1	IgM					(+)		-
CU18	IgGl					-		-
CU46	IgGl					-		-
7F11	IgGl	(+)	+	-		-	-
ID7	IgG3					-
E4SF	IgGl?	+	+	+	+	-	-
425-3
9.2.27
MUCI 8		-
2gl2	IgGl				-		-
4b7	IgGl				-		-
BM2
(=2F11)
BM7 (=7F11) TP-3 TP-1	+

HU 221 234 Β1

2b. táblázat (folytatás)

Sejtvonalak

Antitestek

PM1

CRL1435 H-146

786-0

	MA-11	CRL1740	Colo205	WIDR
CEA
GINTES	IgG		+		-
3C9	IgM		-		-
HH8	IgM		-		-
5F4	IgM		-		-
3F1	IgGl		-		-

Néhány kísérletben a mononukleáris sejtekhez kapcsolódó aspecifikus kötést figyeltünk meg, ez azonban nem volt összefüggésben az adott specifikus antitest természetével, és ugyanúgy megnyilvánult akkor is, ha csupán SAM-bevonatos részecskékkel kísérleteztünk. Ennek az aspecifikus kötésnek a nagysága a közel 0%tól a 0,5-2%-ig teijedt. Ezt az aspecifikus kötést csaknem teljesen megszüntettük a hidrofób sejtkölcsönhatások problémájának csökkentésére irányuló enyhe kezeléssel, amelyet detergenssel (Tween 20 detergenssel) végeztünk.

A találmány szerinti eljárás hasznosságára az alábbi példákat soroljuk fel.

1. Mikroáttételes daganatos betegség kimutatása vérben és csontvelőben

A ráksejteknek a vérbe és/vagy a csontvelőbe való átterjedését korán és megbízhatóan diagnosztizálni egyre fontosabb lett az optimális terápia, adott esetben a kuratív beavatkozás megválasztásához a rák számos típusa esetében, amint azt az 1. példában részletezzük. Hasonló eljárásokat határoztunk meg vagy fejlesztünk ki jelenleg a rosszindulatú melanómára, a szarkómára, a neuroblasztómára és a rák számos más típusára.

2. Rosszindulatú sejtek kimutatása pleurális vagy asciteses izzadmányokban és a vizeletben

Az ilyen izzadmányok természete komoly diagnosztikai problémát okozhat, különösen akkor, ha kisszámú ráksejt van jelen normális reaktív sejtekkel vagy hámsejtekkel együtt. Több esetben rövid idő alatt határozott diagnózist készítettünk a találmány szerinti eljárással, olyankor is, amikor a szokásos citológiai vizsgálat negatív eredménnyel járt vagy eredménye nem volt meggyőző. Hasonló eredményeket értünk el a vese vagy az urináris traktus és a hólyag rákos eseteinek vizsgálatakor is.

3. Daganatos sejtek kimutatása az agy-gerincvelői folyadékban

Ahogy tökéletesedett sokféle ráktípus szisztemikus kezelése, jelentősen megnőtt a szimptómaadó agyi áttételekkel járó esetek gyakorisága, és ezzel párhuzamosan az ilyen áttételek korai felismerésének szükségessége. A találmány szerinti eljárással már csekély számú rosszindulatú sejt is könnyen azonosítható, lehetővé téve a terápiás alternatívákkal való beavatkozást a koponyában fellépő tumor korai szakaszában.

4. A rák diagnosztizálása biopsziás szövetekben

Ha a rák gyanúja felmerül, és szövetmintákat veszünk sebészeti módszerekkel vagy például tűbiopsziával, a találmány szerinti eljárással a preparált sejtszuszpenziók használatával sokkal egyszerűbben és gyorsabban lehet diagnózist készíteni, mint a szokásos morfológiai vagy immunohiszto- vagy citokémiai eljárásokkal.

A rák különféle változatait a megfelelő antitestek használatával lehet megkülönböztetni.

5. Prognosztikai indikátorok azonosítása

Figyelembe véve, hogy különféle membrán molekulák megjelenése összefüggésbe hozható a rosszindulatú betegség előrehaladásával a rák különféle típusaiban, a találmány szerinti eljárás használható a prognosztikai indikátorok azonosítására, például a 2. példában részletezett módon.

6. Specifikus betegségeket jelző sejtek vagy a betegség előrehaladását vagy állapotátjelző sejtek azonosítása

A reumatoid betegségek (így például a reumatoid artritisz), valamint az allergiás, az autoimmun és a kardiovaszkuláris betegségek különféle típusaiban fontos a diagnózishoz és a betegség fokának megállapításához, hogy azonosítsuk sejtek specifikus alpopulációinak szisztemikus vagy lokális jelenlétét. Az ilyen sejt alpopulációk gyors kimutatása a találmány szerinti eljárással ezért diagnosztikai és terápiás szempontból igen jelentős.

7. Normális sejtek alpopulációinak kimutatása

Különféle célokra fontos kimutatni sejtpopulációkban normális sejtek egy bizonyos alpopulációját. Ilyen eset áll fenn például májból vett biopsziás minták vizsgálata esetén, amikor is fontos lehet az epe felhámjához tartozó antigént megjelenítő sejtek azonosítása. Hasonló módon azonosíthatunk vagy adott esetben különíthetünk el különféle normális szövetekből készített sejtszuszpenziókból specifikus endoteliális sejteket a találmány szerinti eljárással.

Számos olyan sejtmembrán molekula, amelyet az előbbi 1-6. pontokban említettünk, használható célként különféle típusú ölősejtekkel vagy például immunotoxinokkal folytatott immunoterápiás eljárásokban. Az ilyen molekulák megjelenésének a találmány szerinti eljárással való azonosítása értékes abból a szem12

HU 221 234 Β1 pontból is, hogy meghatározzuk, milyen esetekben kell az ilyen típusú terápiás eljárásokat alkalmazni.

A találmány gyakorlati alkalmazását a következő példákkal szemléltetjük.

1. példa

Annak érdekében, hogy korai szakaszban diagnosztizáljuk ráksejteknek a vérben és/vagy a csontvelőben való elterjedését, MOC-31, NrLuíO, BM2, BM7, 12H 12 és MLuCl anti-karcinóma antitesteket használtunk a találmány szerinti eljárásban, hogy eldöntsük, vajon érzékenyen azonosítható a mellből, tüdőből, a kolorektális szakaszból és a prosztatából eredő mikroáttételes betegség az említett testfolyadékokban. Ezekkel az antitestekkel olyan eredményekhez jutottunk, amelyek klinikai szempontból is jelentősek.

2. példa

Különféle sejtmembrán molekulák megjelenése tapasztalataink szerint összefüggésben van a rosszindulatú betegség előrehaladásával a rák különböző típusainál. Ha tehát kimutatjuk az ilyen antigéneknek a megfelelő antitestekhez való kötődését, ezzel nagy prognosztikai értékű információhoz jutunk. Az ilyen antigének közé tartozik számos adhéziós molekula, szénhidrát antigének, glikolipidek, növekedési fokator receptorok és karcinóma markerek, melyeket az alábbiakban felsorolunk. A találmány szerinti eljárással azonosítottuk részecskékhez kapcsolt antitest komplexek kötődését CD44-variánsokhoz, E-cadherinhez, Ley-hoz, CEAhoz, EGF-r-hez, transzferrin receptorhoz, MUC-1 epitóphoz, LUBCRU-G7 epitóphoz, prosztatarák antigénhez, UJ13A epitóphoz, P₂-mikroglobulinhoz, HLA-antigénhez és apoptózis receptorhoz.

3. példa

Egy betegtől, aki feltételezésünk szerint rosszindulatú melanómában szenvedett, 2 liter pleurális izzadmányt vettünk. Centrifugálás után a sejteket 2 ml RPMI-ben szuszpendáltuk 10% magzati borjúszérummal, és 9.2.27 antimelanóma antitesttel (10 μ/ml) inkubáltuk 4 °C hőmérsékleten 30 percig, azután mostuk és újra inkubáltuk Dynabeads (TM) SAM M450/IgG2A komplexszel 4 °C hőmérsékleten 30 percig. A sejtszuszpenziót azután mikroszkóposán megvizsgáltuk, hogy meghatározzuk azoknak a sejteknek a frakcióját, amelyek felületére paramágneses sejtek kötődtek. A rosszindulatú melanóma diagnózisát megerősítettük, mert a sejteknek mintegy 10%-a jelentős számú részecske rozettával rendelkezett.

4. példa

Biopsziás szövetmintát vettünk egy szubkután tumorból egy olyan esetben, amelyben a klinikai indikációk kissejtes tüdőrákra vagy rosszindulatú melanómára engedtek következtetni. A biopsziás mintából egyetlen sejtszuszpenziót készítettünk, amelyet két részre osztottunk. Az egyik részt 9.2.27 anti-melanóma antitesttel, a másikat MOC-31 anti-karcinóma antitesttel (mindkettőt 10 μ/ml koncentrációban alkalmazva) inkubáltuk. Az inkubálást az előző példában leírtakhoz hasonló módon végeztük. A melanóma antitesttel inkubált sejtek közül egy sem kötött meg gyöngyöket, ezzel szemben az összes MOC-31-gyei inkubált tumorsejt pozitív eredményt adott. A példában szereplő MOC-31 anti-karcinóma antitest a „Zymed Laboratories, Inc. (CA 94080 South San Francisco, Amerikai Egyesült Államok) kereskedelmi forgalomban lévő terméke, amelynek katalógusszáma 180270.

5. példa

Biopsziás szövetmintát vettünk egy betegtől, aki feltételezhetően rosszindulatú melanómában szenvedett. A mintából egyetlen sejtszuszpenziót készítettünk, 9.2.27 anti-melanóma antitesttel inkubáltuk, azután az előbbiekben leírt eljárást követtük. A legtöbb sejt pozitív volt, membránjához nagyszámú részecskerozetta tapadt.

6. példa

Egy mellrákos betegtől vett pleurális izzadmányt vizsgáltunk abból a szempontból, hogy kimutathatók-e tumorsejtek a folyadékban, 1 liter folyadékot centrifugáltunk, a sejteket újra szuszpendáltuk, és külön kémcsövekben inkubáltuk, mindegyiket 3 különböző antikarcinóma antitesttel (MOC-31, 2E11, 12H12). Miután az eljárást az előző példa szerint lefolytattuk, azt találtuk, hogy a sejtek legtöbbje antitesttel borított részecskékre kötődött mind a három esetben.

7. példa

Megvizsgáltunk egy mellrákos betegtől vett csontvelő szuszpenziót abból a szempontból, hogy találhatók-e benne mikroáttételes tumorsejtek. A mononukleáris sejtek kipreparálása után ezeket a sejteket az előző példában említett háromféle anti-karcinóma antitesttel inkubáltuk, ezúttal azonban az antitesteket előbb Dynabeads (TM) SAM IgG paramágneses részecskékhez kötöttük. E közvetlenül bevont részecskékkel folytatott 1 inkubálás után a sejtszuszpenziót mikroszkóposán megvizsgáltuk, és nagyszámú sejtet találtunk pozitívnak. Ezek membránjához nagyszámú részecskerozetta tapadt.

Hasonló kísérleteket végeztünk számos pleurális vagy asciteses izzadmány és csontvelő mintán, amelyet mellrákban szenvedő betegektől vettünk.

8. példa

T47D humán mellráksejteket inkubáltunk változó időtartammal Hoechst fluoreszcens festékkel, és ellenőriztük a megjelölt sejtek életképességét. Ezután változó számú megjelölt mellráksejtet adtunk 1 χ 10^{4 * 6} csontvelősejtet tartalmazó mintákhoz, amelyek önként felajánlkozó egészséges egyénektől származtak. A különböző kísérletekben a mintákhoz különféle koncentrációkban adtunk monodiszperz paramágneses részecskéket (Dynabeads (TM) P450), melyek individuális antikarcinóma antitestekkel (NrLulO, MOC-31 vagy 12H12) voltak bevonva. A mintákat 30 percig inkubáltuk jeges hűtéssel, azután az egyes kémcsöveket szám13

HU 221 234 Bl lálókamrában vizsgáltuk meg fénymikroszkóppal és fluoreszcens mikroszkópos módszerrel. Amikor a tumorsejteknek a magvas sejtek összmennyiségéhez viszonyított mennyisége csekély volt, akkor a sejtszuszpenziót mágneses térbe helyeztük, és a részecskékhez tapadt sejteket elkülönítettük, mielőtt a mikroszkópos vizsgálathoz fogtunk. Azt találtuk, hogy egy optimális arány esetében, amikor is a sejtkeverékben egy tumorsejtre 1-10 paramágneses részecske jutott, az összes tumorsejt felületén 2-15 odatapadt gyöngy volt megfigyelhető. A kimutatás érzékenysége közel volt ahhoz, hogy 10⁴ magvas sejt közül 1 célsejtet kimutassunk.

A kontrollkísérletekben, melyeket jelzett tumorsejtekkel folytattunk, olyan antitesteket használtunk, amelyekről tudtuk, hogy keresztreakcióra képesek normális sejtekkel. Ezt a keresztreaktivitást antitestekkel bevont paramágneses részecskékkel igazoltuk. Azokban a kísérletekben, amelyekben tumorfelismerő antitesttel be nem vont gyöngyöket használtunk, nem kötött meg gyöngyöt egyetlen célsejt sem.

Hasonló kísérleteket végeztünk más mellrák sejtvonalakkal és kissejtes tüdőrák sejtvonalakkal. Ezekben a kísérletekben hasonló szenzitivitást és specificitást figyeltünk meg.

9. példa

Mellrákban szenvedő, valamint petefészekrákban szenvedő betegektől származó pleurális és asciteses folyadékokat centrifugáltunk. A mintákhoz ugyanolyan bevonatos paramágneses részecskéket adtunk, mint amilyeneket az 1. példában használtunk. A mintákat inkubáltuk, és mágneses térben betöményítettük, mielőtt a szuszpenziót fénymikroszkóppal megvizsgáltuk. Azt találtuk, hogy azok a sejtek, amelyek a tumorsejtek tiszta morfológiai jellegzetességeit mutatták, jellemzően megkötötték az antitestekkel bevont gyöngyöket, míg a kevés normális sejt egyike sem kötött meg antitesttel bevont gyöngyöt. A pleurális izzadmány két esetében egy független morfológiai vizsgálat egyetlen tumorsejt jelenlétét sem tárta fel, ezzel szemben szignifikáns mennyiségű rosszindulatú sejtet mutattunk ki antitesttel bevont gyöngyök használatával. Néhány esetben a tumorsejteket mágneses térben elválasztottuk, és mellráksejt tenyésztéshez készített tápközeggel töltött szövettenyésztő edénybe vittük át, megkísérelve permanens sejtvonalak létesítését ezekből a kultúrákból. A párhuzamos kísérletekben a rosszindulatú izzadmányokból származó sejteket közvetlenül tenyésztettük, mágneses gyöngyökkel való pozitív elválasztás nélkül. Az utóbbi esetekben egyetlen sejtvonalat sem sikerült képezni, míg akkor, ha pozitív szelekcióval elválasztott tumorsejteket használtunk, az esetek több, mint 50%-ában eredménnyel járt a sejtvonalak létesítésére irányuló kísérlet.

10. példa

Végeztünk néhány további kísérletet a találmány szerinti eljárással olyan csontvelő és perifériás vér mintán, amelyet mellrákos betegektől vettünk. A mintákhoz antitesttel bevont paramágneses gyöngyöket adtunk, azután a mintákat 30 percig inkubáltuk 4 °C hőmérsékleten, mágneses térben betöményítettük, és a szuszpenziót fénymikroszkóppal vizsgáltuk meg. Mindkét esetben megállapítottuk a paramágneses gyöngyök kötődését a tumorsejtekhez, melyek a magvas sejteknek 0,1 — 1%-át tették ki a csontvelőben és a vérben, és amelyeket semmilyen más módszerrel nem lehetett azonosítani.

11. példa

Az olyan antitestek, amelyek bizonyos növekedési faktor receptorok vagy más, specifikus sejtpopulációk felületén megjelenő géntermékek ellen irányulnak, használhatók az ilyen sejtek azonosítására és pozitív elválasztására. A találmány szerinti eljárás, ha abban anti-transzferrin receptor antitestekkel bevont gyöngyöket használtunk, gyors, egyszerű és szenzitív módszernek bizonyult transzferrin receptort kifejező sejtek azonosítására.

12. példa

Adott esetben célszerű normális sejtek specifikus populációit különféle célokra elkülöníteni. A normális vagy daganatos szövetekben a kapillárisokat vagy a kis edényeket belülről borító endotél sejteket pozitív szelekcióval elkülöníthetjük az adott szövetekből készített szuszpenziókból. Az eljárás során olyan struktúrák ellen irányuló antitestekkel bevont gyöngyöket használtunk, amelyek az endotél sejteken megjelentek, a sejtkeverékben lévő más normális sejteken azonban nem.

13. példa

Anti-pán-humán antitestekkel bevont mágneses részecskék alkalmazásával kimutattuk immunhiányos rágcsálókba injektált humán sejtek jelenlétét olyan sejtszuszpenziókban, amelyeket idegen fajból átültetett tumorokból és különböző gazdaszervezetekből vagy gazdaszövetekből készítettünk.

Claims

1. Eljárás vegyes sejtpopulációk sejtszuszpenzióiban, vegyes sejtpopulációkat tartalmazó folyékony rendszerekben vagy szilárd szövetekből készített egyedi sejtszuszpenziókban lévő, a vér és csontvelő normális és rosszindulatú vérképző sejtjeitől eltérő célsejtek kimutatására, azzal jellemezve, hogy

1.1. paramágneses részecskéket vagy gyöngyöket ismert módon bevonunk

b) az említett, a membrán szerkezetek ellen irányuló antitestek vagy antitest fragmentumok Fc-részére kötődni képes antitestekkel vagy antitest fragmentumokkal, előnyösen poliklonális anti-egér antitestekkel vagy monoklonális patkány anti-egér antitestekkel vagy antihumán antitestekkel; és

HU 221 234 Bl

- az említett részecskékre vagy gyöngyökre vannak rögzítve, vagy

- sejtszuszpenzió és az inkubált, céllal asszociálódó szabad antitestek keverékére kialakuló, céllal asszociálódó antitestek Fc-részeit felismerő anti-egér vagy anti-humán antitestekkel előzetesen bevont paramágneses részecskék keverékét (l·²·²) inkubáljuk 5-10 perc és 2 óra közti, előnyösen 30 perc időtartamon át 0 °C és 25 °C közti, előnyösen 4 °C hőmérsékleten enyhe forgatás közben; és

- a kezeletlen vagy formaiinnal, alkohollal vagy más rögzítő anyaggal előkezelt sejtszuszpenziót a célsejtekben jelen lévő extracelluláris vagy intracelluláris molekulákhoz kötődő más antitestekkel vagy antitest fragmensekkel inkubáljuk, ahol a nevezett antitestek vagy antitest fragmensek előzetesen

1.5. - amennyiben a célsejtek sűrűsége kicsiny, vagy ha a célsejtek az összes sejthez viszonyított aránya a sejtkeverékben kicsiny (legfeljebb 1%), akkor az inkubált és jelzett paramágneses részecskeantitest vagy antitest fragmens sejtkeveréket (1.4.) mágneses mezőnek vetjük alá, majd a sejtszuszpenzióban mikroszkóp és/vagy megfelelő sejtrészecske számláló alkalmazásával megszámláljuk az elszíneződött vagy el nem színeződött részecske-célsejt komplexumokat; vagy

- megvizsgáljuk és megszámoljuk a célsejteket a paramágneses részecskék, antitestek és sejtek inkubált és jelzett keverékében (1.4.); vagy

- abban az esetben, amikor az antitesteket vagy antitest fragmensek olyan nem paramágneses részecskékhez is vannak konjugálva, amelyeket közvetlenül láthatóvá lehet tenni színük vagy enzimaktivitásuk miatt, a vizsgálatot mikroszkóppal és/vagy megfelelő sejtrészecske számláló berendezés alkalmazásával hajtjuk végre, amennyiben a célsejt/teljes sejt arány a sejtszuszpenzióban ezt lehetővé teszi (>1%).

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy normális élő sejtekben, különösen májhepatocitákban, Kupffer-sejtekben, 1. vagy 2. típusú endoteliális sejtekben vagy a tüdő Clara sejtjeiben, specifikus szervek endoteliális sejtjeiben, a hasnyálmirigy belső elválasztású vagy külső elválasztású sejtjeiben, a vesetubulus sejtekben, a hólyag hámsejtjeiben, az agy gliasejtjeiben vagy ependimasejtjeiben, a hólyag vagy prosztata hámsejtjeiben, a légutak csillós sejtjeiben, a gasztrointesztinális traktus nyálkahártyasejtjeinek különféle alpopulációiban, a hipofízis sejtekben vagy különféle hormontermelő szervek más belső elválasztású sejtjeiben lévő antigének elleni antitesteket vagy antitest fragmenseket alkalmazunk.

3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy célsejtfelismerő antitestként előnyösen normális sejtek alpopuiációiban lévő és a normális szövetek sejtmembránjain megjelenő onkogén termékekben lévő antigénekkel szemben reaktív antitesteket használunk.

4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a pozitív szelekcióhoz antitestként előnyösen normális sejtek membránjain lévő növekedési faktor receptorok, különösen EGF receptorok, PDGF (A és B) receptorok, inzulin receptorok, inzulinszerű receptorok, transzferrin receptorok vagy NGF és FGF receptorok ellen irányított antitesteket használunk.

5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy normális sejtekben lévő integrinek és más adhéziós membrán molekulák csoportja vagy MDR proteinek ellen irányított antitesteket használunk.

6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az antitesteket vagy azok fragmenseit rendellenes fejlődésű sejtekben, különösen primer és áttételes ráksejtekben lévő antigének vagy receptorok ellen irányítjuk.

7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy célsejtfelismerő antitestként IgG izotípusú antitesteket vagy F(ab’)₂ ^vagy F(ab) fragmenseket vagy IgM antitesteket vagy IgM antitest fragmenseket használunk.

8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejtszuszpenziót emlősök szö15

HU 221 234 Bl veteit, különösen humán csontvelő vagy perifériás vér, pleuráris vagy peritoneális izzadmányok, más testnedvek, különösen vizelet, agy-gerincvelői folyadék, sperma vagy nyirok szöveteit tartalmazó vegyes sejtpopulációból, vagy normális szövetekben vagy szervekben, különösen a májban, a nyirokmirigyekben, lépben, tüdőben, hasnyálmirigyben, csontszövetben, a központi idegrendszerben, a prosztatában, a bőrben vagy a nyálkahártyákban lévő szilárd tumorokból készítjük.

9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy antigén determinánsok, előnyösen az 1. táblázatban felsorolt antigén determinánsok ellen irányított antitesteket vagy antitest ffagmenseket alkalmazunk.

10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy célsejtfelismerő antitestként növekedési faktor receptorok vagy rosszindulatú sejtek membránjain megjelenő onkogén termékek, különösen inzulin receptorok, inzulinszerű receptorok vagy FGF receptorok, valamint az 1. táblázatban felsoroltak ellen irányított antitesteket vagy antitest ffagmenseket használunk.

11. Az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy integrinek csoportja, valamint rendellenes sejtekben lévő más, az 1. táblázatban felsorolt adhéziós molekulák vagy MDR proteinek ellen irányított antitesteket vagy antitest ffagmenseket használunk.

12. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az eljárásban antitesteket, antitest ffagmenseket vagy azoknak az 1. táblázatban felsorolt antigén determinánsok ellen irányított kombinációit alkalmazzuk.

13. Az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy antitestként rendellenes sejteken, különösen mell-, petefészek- vagy tüdőráksejteken, melanóma, szarkóma, glioblasztóma sejteken vagy a gasztrointesztinális vagy genitourináris traktus vagy a retikuloendoteliális rendszer ráksejtjein lévő antigénekkel és/vagy nem daganatos betegségekkel, különösen kardiovaszkuiáris, neurológiai, pulmonáris, autoimmun, gasztrointesztinális, genitourináris, retikuloendoteliális vagy más rendellenességekkel kapcsolatos célsejteken lévő antigénekkel szemben reaktív antitesteket használunk.

14. Az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti eljárás alkalmazása célsejtek elkülönítésére, aminek során a sejtek és a paramágneses részecskék komplexét mágneses térbe helyezzük, azután a kapott, mágnesesen aggregált sejteket biológiai, biokémiai és/vagy immunológiai vizsgálatoknak vetjük alá, kívánt esetben meghatározva a specifikus géneket a DNS, mRNS, protein szinten, adott esetben polimeráz láncreakcióval (PCR) vagy reverz transzkriptáz PCR-rel.

15. Az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti eljárás alkalmazása specifikus célsejtek kimutatására, aminek során a szeparált paramágneses részecskéket és célsejteket tartalmazó komplexekből in vitro sejtkultúrákat készítünk.

16. Készlet (kit) az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti eljárás megvalósításához, azzal jellemezve, hogy tartalmaz

1. a kívánt célsejteken lévő antigének vagy receptorok ellen irányított specifikus antitesteket vagy antitest ffagmenseket, amelyek a készletben lévő paramágneses részecskékre vannak rögzítve antigénkötő képességük megtartásával, vagy

2. paramágneses részecskéket, amelyek előzetesen specifikus anti-Fc antitestekkel, előnyösen poliklonális anti-egér vagy monoklonális patkány anti-egér vagy anti-humán antitestekkel vannak bevonva, amelyek képesek rákapcsolódni a célsejtfelismerő antitestek Főrészére, valamint specifikus szabad célsejtfelismerő antitesteket, vagy