KR101882533B1 - 섬유아세포 증식 인자-２３ 의 측정 방법 및 측정 시약 - Google Patents

섬유아세포 증식 인자-２３ 의 측정 방법 및 측정 시약 Download PDF

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Abstract

본 발명은 하기 단계를 포함하는, 시료 중의 섬유아세포 증식 인자-23 (FGF-23) 의 검정 방법에 관한 것이다:
(1) 시료 중의 FGF-23 을, 수성 배지 중에서, 자성 입자, FGF-23 에 결합하는 제 1 항체 또는 이의 단편, 및 FGF-23 에 결합하는 제 2 항체 또는 이의 단편과 반응시켜, 자성 입자 상에 FGF-23 에 결합하는 제 1 항체 또는 이의 단편, FGF-23, 및 FGF-23 에 결합하는 제 2 항체 또는 이의 단편을 포함하는 면역복합체를 생성시키는 단계;
(2) 단계 (1) 후 반응 혼합물 중의 자성 입자를 자력에 의해 수집하고, 자력에 의해 수집된 자성 입자와 그 이외의 성분을 분리하는 단계; 및
(3) 단계 (2) 에서 분리된 자성 입자 상의 면역복합체를 검정하는 단계.
이에 의해, 고감도이며 측정 범위가 넓은, 시료 중의 FGF-23 의 검정 방법이 개시된다.

Description

섬유아세포 증식 인자-２３ 의 측정 방법 및 측정 시약 {METHOD FOR MEASURING FIBROBLAST GROWTH FACTOR-23 AND REAGENT THEREFOR}
본 발명은, 시료 중의 섬유아세포 증식 인자-23 (이하, FGF-23 으로 표시함)의 측정 방법, 및 FGF-23 의 측정 시약에 관한 것이다.
FGF-23 은, 섬유아세포 증식 인자 (FGF) 패밀리의 일원이며, 주로 골 조직에서 생성되는 251 개 아미노산을 함유하는 폴리펩티드이고, 신장에 작용하여 신장 세뇨관에서의 인의 재흡수를 저해한다. 최근, FGF-23 이 저인산혈증성 구루병, 종양-유도 골연화증 및 신부전과 같은 질환에 있어서 관여하는 것이 제시되고 있다 (비특허 문헌 1 참조).
FGF-23 은, N-말단의 24 개 아미노산이 분리되어 227 개 아미노산을 함유하는 폴리펩티드가 제공됨으로써 형성되고, 당 사슬이 부가되도록 개질되며, 약 32.5-kDa 의 성숙 단백질로서 세포 외부에 방출된다. 또한, FGF-23 의 N-말단으로부터 위치 197 과 위치 198 사이의 결합이 트롬빈에 의해 절단되고, 위치 198 ~ 위치 251 의 단편이 C-말단 단편로서 혈액 중에 존재한다.
지금까지, FGF-23 에 대한 항체가 취득된 바 있고 (특허 문헌 1 및 2; 및 비특허 문헌 2 참조), 이들 항체를 사용하는, 혈청 또는 혈장 중의 FGF-23 에 대한 면역검정법이 보고되어 있고 (특허 문헌 1 및 비특허 문헌 2 참조), 이들 측정법에 근거하는 측정 키트 또한 시판되고 있다 [Human Intact FGF-23 ELISA 키트 (Immutopics), Human FGF-23 (C-Term) ELISA 키트 (Immutopics) 및 FGF-23 측정 시약 (Kainos)].
그러나 지금까지의 면역검정법은, 플레이트를 사용하는 측정 방법이며, 이들 방법은 측정 감도가 낮고 측정 범위가 좁다는 문제점을 갖는다. 특히 만성 신장병 (CKD) 환자 및 투석 환자에 있어서는 표본이 수 pg/mL ~ 수만 pg/mL 의 농도 범위 내에 있고, 저농도 시료에 있어서는 불량한 정밀도로 인해 올바른 측정치를 수득할 수 없으며 고농도 표본에 있어서는 측정 범위를 넘어서는 것과 같은 문제점이 존재하였다.
WO 2003/057733 팜플렛 일본 공표 특허 공보 (JP-A) 2004-504063 호 (비-일본 국제 출원에 상응하는 미심사, 일본 국제 단계 공보)
Jin to Kotsu Taisha (Kidney and Metabolic Bone Diseases), vol.15, No. 4, p.351-356 (2002) N ENGL J MED, vol.348, No.17, p.1656-1663 (2003)
본 발명의 목적은, 고감도이며 측정 범위가 넓은, 시료 중의 FGF-23 의 측정 방법 및 측정 시약을 제공하는 것이다.
본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위하여 예의 검토한 결과, 자성 입자를 담체로서 사용하는 면역검정법에 의해 고감도 및 넓은 측정 범위로 FGF-23 을 측정할 수 있다는 것을 발견하였으며, 본 발명을 완성하였다. 보다 구체적으로, 본 발명은 하기의 [1] 내지 [10] 에 관한 것이다.
[1] 하기 단계를 포함하는, 시료 중의 FGF-23 의 측정 방법:
(1) 시료 중의 FGF-23 을, 수성 배지 중에서, 자성 입자, FGF-23 에 결합하는 제 1 항체 또는 이의 단편, 및 FGF-23 에 결합하는 제 2 항체 또는 이의 단편과 반응시켜, 자성 입자 상에 FGF-23 에 결합하는 제 1 항체 또는 이의 단편, FGF-23, 및 FGF-23 에 결합하는 제 2 항체 또는 이의 단편을 포함하는 면역복합체를 형성시키는 단계;
(2) 단계 (1) 후 반응 혼합물 중의 자성 입자를 자력에 의해 수집하고, 자력에 의해 수집된 자성 입자와 그 이외의 성분을 분리하는 단계; 및
(3) 단계 (2) 에서 분리된 자성 입자 상의 면역복합체를 측정하는 단계;
[2] [1] 에 있어서, 제 2 항체가 표지 항체인 방법;
[3] [2] 에 있어서, 표지 항체가 알칼리 포스파타아제-표지 항체인 방법;
[4] [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 있어서, 단계 (3) 에서의 자성 입자 상 면역복합체의 측정이 화학발광의 측정에 의해 실행되는 방법;
[5] [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 있어서, 시료가 혈청 또는 혈장인 방법;
[6] 자성 입자, FGF-23 에 결합하는 제 1 항체 또는 이의 단편, 및 FGF-23 에 결합하는 제 2 항체 또는 이의 단편을 포함하는, 시료 중의 FGF-23 측정 시약;
[7] [6] 에 있어서, 제 2 항체가 표지 항체인 시약;
[8] [7] 에 있어서, 표지 항체가 알칼리 포스파타아제-표지 항체인 시약;
[9] [6] 내지 [8] 중 어느 하나에 있어서, 화학발광 측정 시약을 추가로 포함하는 시약; 및
[10] [6] 내지 [9] 중 어느 하나에 있어서, 시료가 혈청 또는 혈장인 시약.
본 발명에 의해, 고감도이며 측정 범위가 넓은, 시료 중의 FGF-23 의 측정 방법 및 측정 시약이 제공된다.
도 1 은 실시예 1 의 FGF-23 의 측정 방법을 사용하여 최소 측정가능 농도를 나타내는 그래프를 보여주며, 시료 중의 FGF-23 농도와 발광 수준 간의 관계를 보여준다. 가로축은 FGF-23 농도 (pg/mL) 를 나타내며, 세로축은 발광 수준 (RLU) 을 나타낸다. "I" 표시는 평균치 ± 2 SD 의 범위를 나타낸다. 또한, 점선은 블랭크 (blank) + 2 SD 의 발광 수준을 나타낸다.
도 2 는 실시예 2 의 FGF-23 의 측정 방법의 측정 범위를 나타내는 그래프를 보여주며, 시료 중의 FGF-23 농도와 발광 수준 간의 관계를 보여준다. 가로축은 FGF-23 농도 (pg/mL) 를 나타내며, 세로축은 발광 수준 (RLU) 을 나타낸다.
도 3 은 투석 환자-유래 혈청 (환자 혈청 D) 을 사용하는, 실시예 3 의 측정 방법에 있어서의 희석 직선성을 나타내는 그래프를 보여주며, 희석률과 FGF-23 농도 간의 관계를 보여준다. 가로축은 상기 혈청의 희석률을 나타내며, 세로축은 측정된 FGF-23 농도 (pg/mL) 를 나타낸다.
도 4 는 투석 환자-유래 혈청 (환자 혈청 E) 을 사용하는, 실시예 3 의 측정 방법에 있어서의 희석 직선성을 나타내는 그래프를 보여주며, 희석률과 FGF-23 농도 간의 관계를 보여준다. 가로축은 상기 혈청의 희석률을 나타내며, 세로축은 측정된 FGF-23 농도 (pg/mL) 를 나타낸다.
도 5 는 플레이트를 사용하는 비교예 1 의 FGF-23 측정 방법을 사용하여 최소 측정가능 농도를 나타내는 그래프를 보여주며, 시료 중의 FGF-23 농도와 흡광도 간의 관계를 보여준다. 가로축은 FGF-23 농도 (pg/mL) 를 나타내고, 세로축은 흡광도 (Abs) 를 나타낸다. "I" 표시는 평균치 ± 2 SD 의 범위를 나타낸다. 또한, 점선은 블랭크 + 2 SD 의 흡광도를 나타낸다.
도 6 은 플레이트를 사용하는 비교예 2 의 FGF-23 측정 방법의 측정 범위를 나타내는 그래프를 보여주며, 시료 중의 FGF-23 농도와 흡광도 간의 관계를 보여준다. 가로축은 FGF-23 농도 (pg/mL) 를 나타내며, 세로축은 흡광도 (Abs) 를 나타낸다.
발명을 실시하기 위한 형태
(측정 방법)
본 발명에 따른 시료 중 FGF-23 측정 방법은, 자성 입자를 담체로서 사용하는 샌드위치법 (Sandwich method) 을 기반으로 하는 시료 중 FGF-23 면역검정법이며, 하기의 단계를 포함한다:
(1) 시료 중의 FGF-23 을, 수성 배지 중에서, 자성 입자, FGF-23 에 결합하는 제 1 항체 또는 이의 단편, 및 FGF-23 에 결합하는 제 2 항체 또는 이의 단편과 반응시켜, 자성 입자 상에 FGF-23 에 결합하는 제 1 항체 또는 이의 단편, FGF-23, 및 FGF-23 에 결합하는 제 2 항체 또는 이의 단편을 포함하는 면역복합체를 형성시키는 단계;
(2) 단계 (1) 후 반응 혼합물 중의 자성 입자를 자력을 사용하여 수집하고, 자력에 의해 수집된 자성 입자와 그 이외의 성분을 분리하는 단계; 및
(3) 단계 (2) 에서 분리된 자성 입자 상의 면역복합체를 측정하는 단계.
<단계 (1)>
단계 (1) 에서, 시료 중의 FGF-23 은, 수성 배지 중에서, 자성 입자, FGF-23 에 결합하는 제 1 항체 또는 이의 단편, 및 FGF-23 에 결합하는 제 2 항체 또는 이의 단편과 반응하여, 자성 입자 상에 FGF-23 에 결합하는 제 1 항체 또는 이의 단편, FGF-23, 및 FGF-23 에 결합하는 제 2 항체 또는 이의 단편을 포함하는 면역복합체를 형성시킨다.
여기서, 시료 중의 FGF-23 과 자성 입자, FGF-23 에 결합하는 제 1 항체 또는 이의 단편, 및 FGF-23 에 결합하는 제 2 항체 또는 이의 단편과의 반응은, 자성 입자 상에 FGF-23 에 결합하는 제 1 항체 또는 이의 단편, FGF-23, 및 FGF-23 에 결합하는 제 2 항체 또는 이의 단편을 포함하는 면역복합체를 형성시키는 것이면 임의의 반응일 수 있다. 예를 들어 시료 중의 FGF-23 은 자성 입자, 및 FGF-23 에 결합하는 제 1 항체 또는 이의 단편과 반응하여, 자성 입자 상에 FGF-23 에 결합하는 제 1 항체 또는 이의 단편과 FGF-23 과의 면역복합체를 형성시킨 후, FGF-23 에 결합하는 제 2 항체 또는 이의 단편과 반응할 수 있거나; 대안적으로는, 시료 중의 FGF-23 은 자성 입자, FGF-23 에 결합하는 제 1 항체 또는 이의 단편, 및 FGF-23 에 결합하는 제 2 항체 또는 이의 단편과 동시에 반응할 수 있다. 자성 입자 상에 FGF-23 에 결합하는 제 1 항체 또는 이의 단편과 FGF-23 과의 면역복합체가 형성된 후, 상기 면역복합체가 FGF-23 에 결합하는 제 2 항체 또는 이의 단편과 반응하는 경우, 상기 면역복합체 형성 후에 세척 단계를 준비할 수 있다.
단계 (1) 에서는, FGF-23 에 결합하는 제 1 항체 또는 이의 단편과 자성 입자는 시료 중의 FGF-23 과의 반응 전에 미리 결합할 수 있다. FGF-23 에 결합하는 제 1 항체 또는 이의 단편의 자성 입자에 대한 결합의 예는, 물리적 흡착에 의한 결합, 링커를 통한 결합, 및 항체 Fc 영역/Fc 영역-결합 항체 및 아비딘류 (아비딘, 스트렙타비딘, 뉴트라비딘 (NeutrAvidin) 등)/비오틴과 같은 서로에 대해 친화성을 갖는 2 개 물질 간의 상호작용을 사용하는 결합을 포함한다. 항체 Fc 영역과 Fc 영역-결합 항체 간의 상호작용을 사용하는 경우, 예를 들어 자성 입자 상에 고정된 Fc 영역-결합 항체와 제 1 항체 또는 이의 단편 간의 상호작용을 통해, 제 1 항체 또는 이의 단편을 자성 입자 상에 결합시킬 수 있다. 아비딘류와 비오틴 간의 상호작용을 사용하는 경우, 예를 들어 자성 입자 상에 고정된 아비딘류와 비오틴화 제 1 항체 또는 이의 단편 내의 비오틴 간의 상호작용을 통해, 제 1 항체 또는 이의 단편을 자성 입자 상에 결합시킬 수 있다.
반응 용액 중의 자성 입자의 농도는 본 발명의 FGF-23 의 측정을 가능하게 하는 농도이면 특별히 제한되지 않으며, 통상 0.1 mg/mL 내지 10 mg/mL 이다. 반응 온도는 본 발명의 FGF-23 의 측정을 가능하게 하는 온도이면 특별히 제한되지 않으며, 통상 0℃ 내지 50℃ 이고, 바람직하게는 4℃ 내지 45℃ 이고, 특히 바람직하게는 20℃ 내지 40℃ 이다. 반응 시간은 본 발명의 FGF-23 의 측정을 가능하게 하는 시간이면 특별히 제한되지 않으며, 통상 5 분 내지 1 시간이고, 바람직하게는 5 분 내지 20 분이다.
FGF-23 에 결합하는 제 1 항체 또는 이의 단편이 미리 고정된 자성 입자를 사용하는 경우, FGF-23 에 결합하는 제 1 항체 또는 이의 단편이 결합한 자성 입자는, 본 발명의 FGF-23 의 측정 방법을 가능하게 하는 것이면 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 0.1 mg/mL 내지 10 mg/mL 의 자성 입자의 현탁액에 0.1 μg/mL 내지 10 μg/mL 의 제 1 항체 또는 이의 단편 용액을 첨가하고 37℃ 에서 5 분 내지 1 시간 동안 반응을 실행함으로써, 제 1 항체 또는 이의 단편이 결합하는 자성 입자를 제조할 수 있다.
또한, 단계 (1) 에서 시료 중의 FGF-23, FGF-23 에 결합하는 제 1 항체 또는 이의 단편, 및 자성 입자를 포함하는 면역복합체를 형성시킨 후 상기 면역복합체에 FGF-23 에 결합하는 제 2 항체 또는 이의 단편을 결합시키는 경우, 상기 제 2 항체를 결합시키기 전에 면역복합체-결합 자성 입자의 세척 단계를 준비할 수 있다. 자성 입자의 세척은, 자성 입자 상에 FGF-23 에 결합하는 제 1 항체 또는 이의 단편, FGF-23, 및 FGF-23 에 결합하는 제 2 항체 또는 이의 단편을 포함하는 면역복합체를 형성시킬 수 있는 것이면 임의의 세척일 수 있다. 그의 예는 자성 입자 상에 FGF-23, 및 FGF-23 에 결합하는 제 1 항체 또는 이의 단편의 면역복합체를 형성시키는 반응 후의 반응 혼합물로부터 자성 입자 이외의 성분을 제거하고, 잔존 자성 입자를 함유하는 반응 용기에 세척액을 첨가하여 자성 입자를 세척하는 방법; 및 반응 후의 반응 혼합물에 세척액을 첨가하고, 동시에 자성 입자 이외의 성분을 제거하여 자성 입자를 세척하는 방법을 포함한다. 자성 입자 이외의 성분의 제거는, 예를 들어 자력에 의해 자성 입자를 수집하고, 잔존 성분을 흡인함으로써 실행될 수 있다. 세척액은 본 발명의 FGF-23 의 측정을 가능하게 하는 세척액이면 특별히 제한되지 않으며, 그의 예는 후술한 수성 배지 및 후술한 수성 배지에 계면활성제가 첨가된 수성 배지를 포함한다. 계면활성제의 예는 Tween 20 과 같은 비 (non)-이온성 계면활성제를 포함한다.
추가로, 염이 또한 단계 (1) 에서 존재할 수 있다. 염은 본 발명의 FGF-23 의 측정 방법을 가능하게 하는 염이면 특별히 제한되지 않는다. 그의 예는 염화 리튬, 염화 나트륨, 염화 칼륨, 염화 칼슘, 염화 마그네슘, 염화 암모늄, 브롬화 리튬, 브롬화 나트륨, 브롬화 칼륨, 브롬화 칼슘, 브롬화 마그네슘 및 브롬화 암모늄을 포함하며; 염화 나트륨이 바람직하다. 반응 중 염의 농도는 본 발명의 측정 방법을 가능하게 하는 농도이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어 40 mmol/L 내지 400 mmol/L 이고, 바람직하게는 70 mmol/L 내지 250 mmol/L 이다.
또한 단계 (1) 에서, 금속 이온, 당, 방부제, 단백질, 계면활성제, 단백질 안정화제 등이 또한 존재할 수 있다. 금속 이온의 예는 마그네슘 이온, 망간 이온 및 아연 이온을 포함한다. 당의 예는 만니톨 및 소르비톨을 포함한다. 방부제의 예는 나트륨 아자이드, 항생 물질 (스트렙토마이신, 페니실린, 겐타마이신 등), BioAce 및 ProClin 300 을 포함한다. 단백질의 예는 소 혈청 알부민 (BSA), 소 태아 혈청 (FBS), 카제인 및 BlockAce (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd. 사제) 를 포함한다. 계면활성제의 예는 양이온성 계면활성제, 음이온성 계면활성제, 양성 계면활성제 및 비이온성 계면활성제를 포함한다. 단백질 안정화제의 예는 퍼옥시다아제 안정화 완충액 및 알칼리 포스파타아제 안정화 완충액을 포함한다.
<단계 (2)>
단계 (2) 에서, 단계 (1) 후의 자성 입자, 또는 구체적으로는 FGF-23 에 결합하는 제 1 항체 또는 이의 단편, FGF-23, 및 FGF-23 에 결합하는 제 2 항체 또는 이의 단편을 포함하는 면역복합체가 결합하는 자성 입자는 자력에 의해 수집되고, 자력에 의해 수집된 상기 자성 입자는 그 이외의 성분과 분리된다. 자성 입자를 수집하기 위한 자력은 본 발명의 FGF-23 의 측정을 가능하게 하는 자력이면 특별히 제한되지 않는다. 자력에 의해 수집된 자성 입자와 그 이외의 성분과의 분리는 본 발명의 FGF-23 의 측정을 가능하게 하는 분리이면 특별히 제한되지 않는다.
단계 (2) 후, 또는 단계 (2) 와 동시에, FGF-23 에 결합하는 제 1 항체 또는 이의 단편, FGF-23, 및 FGF-23 에 결합하는 제 2 항체 또는 이의 단편을 포함하는 면역복합체가 결합하는 자성 입자를 세척하는 단계가 포함될 수 있다. 자성 입자는, 예를 들어 전술한 방법에 의해 세척될 수 있다.
<단계 (3)>
그 다음으로, 단계 (3) 에서, 단계 (2) 에서 분리된 자성 입자 상의 면역복합체를 측정함으로써 시료 중의 FGF-23 을 측정할 수 있다. 면역복합체의 측정 방법의 예는 하기의 방법을 포함한다:
(1) FGF-23 에 결합하는 제 2 항체 또는 이의 단편이 표지되지 않은 경우
제 2 항체 또는 이의 단편에 결합하는 제 3 항체 또는 이의 단편에 표지가 결합하는, 표지된 제 3 항체 또는 이의 단편을, 제 1 항체 또는 이의 단편, FGF-23, 및 제 2 항체 또는 이의 단편을 포함하는 면역복합체가 결합하는 자성 입자와 반응시켜, 자성 입자 상에 제 1 항체 또는 이의 단편, FGF-23, 제 2 항체 또는 이의 단편, 및 제 3 항체 또는 이의 단편을 포함하는 면역복합체를 형성시킨 후, 이들 면역복합체 중의 표지를 측정함으로써, 분리된 자성 입자 상의 면역복합체를 측정할 수 있다. 제 2 항체 또는 이의 단편에 결합하는 제 3 항체 또는 이의 단편의 예는 제 2 항체의 Fc 영역에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 포함한다. 표지의 측정은, 분리된 자성 입자 상의 면역복합체의 측정을 가능하게 하는 방법이면 특별히 제한되지 않는다. 그의 예는 화학발광의 측정, 형광의 측정 및 흡광도의 측정을 포함하며; 화학발광의 측정이 바람직하다.
(2) FGF-23 에 결합하는 제 2 항체 또는 이의 단편이 표지되는 경우
자성 입자 상에 형성되는, 제 1 항체 또는 이의 단편, FGF-23, 및 FGF-23 에 결합하는 표지된 제 2 항체 또는 이의 단편을 포함하는 면역복합체 중의 표지를 측정함으로써, 분리된 자성 입자 상의 면역복합체를 측정할 수 있다. 표지의 측정은, 분리된 자성 입자 상의 면역복합체의 측정을 가능하게 하는 방법이면 특별히 제한되지 않는다. 그의 예는 화학발광의 측정, 형광의 측정 및 흡광도의 측정을 포함하며; 화학발광의 측정이 바람직하다.
(A) 화학발광의 측정
화학발광의 측정은, 하기와 같은 방법에 의해 실행될 수 있다.
(A-1) 표지가 효소인 경우
표지가 효소인 경우, 예를 들어 그 효소와 반응시 광을 생성하는 기질을 표지 항체 또는 이의 단편에 작용시키고, 생성된 광 (hν) 의 강도를 발광 강도계 등을 사용하여 측정함으로써 측정을 실행할 수 있다. 효소는 그 효소의 기질과 반응하고 광을 생성할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않으며, 그의 예는 알칼리 포스파타아제, 퍼옥시다아제, β-D-갈락토시다아제 및 루시페라아제를 포함한다.
효소로서 알칼리 포스파타아제를 사용하는 경우, 알칼리 포스파타아제와 반응하여 광을 생성하는 알칼리 포스파타아제의 기질의 예는, 3-(2'-스피로아다만탄)-4-메톡시-4-(3'-포스포릴옥시)페닐-1,2-디옥세탄 이나트륨 염 (AMPPD), 2-클로로-5-{4-메톡시스피로[1,2-디옥세탄-3,2'-(5'-클로로)트리시클로[3.3.1.13,7]데칸]-4-일}페닐포스페이트 이나트륨 염 (CDP-StarTM), 3-{4-메톡시스피로[1,2-디옥세탄-3,2'-(5'-클로로)트리시클로[3.3.1.13,7]데칸]-4-일}페닐포스페이트 이나트륨 염 (CSPDTM), [10-메틸-9(10H)-아크리디닐리덴]페녹시메틸포스페이트 이나트륨 염 (LumigenTM APS-5) 및 9-(4-클로로페닐티오포스포릴옥시메틸리덴)-10-메틸아크리돈 이나트륨 염을 포함한다.
효소로서 퍼옥시다아제를 사용하는 경우, 퍼옥시다아제와 반응하여 광을 생성하는 퍼옥시다아제의 기질의 예는 과산화수소 및 발광 화합물의 조합을 포함한다. 발광 화합물의 예는 루미놀 화합물 및 루시게닌 화합물을 포함한다.
효소로서 β-D-갈락토시다아제를 사용하는 경우, β-D-갈락토시다아제와 반응하여 광을 생성하는 β-D-갈락토시다아제의 기질의 예는 Galacton-Plus (Applied Biosystems 사제) 를 포함한다.
효소로서 루시페라아제를 사용하는 경우, 루시페라아제와 반응하여 광을 생성하는 루시페라아제의 기질의 예는 루시페린 및 코엘렌테라진을 포함한다.
(A-2) 표지가 발광 물질인 경우
표지가 발광 물질인 경우에는, 예를 들어, 형성된 면역복합체 중의 발광 물질에서 기인하는 광의 강도를, 발광 강도계 등을 사용하여 측정함으로써 측정을 실행할 수 있다. 발광 물질은 본 발명의 측정을 가능하게 하는 발광 물질이면 특별히 제한되지 않으며, 그의 예는 아크리디늄 및 이의 유도체, 루테늄 착물 화합물 및 로핀을 포함한다.
(B) 형광의 측정
형광은 하기와 같은 방법에 의해 측정될 수 있다.
(B-1) 표지가 효소인 경우
표지가 효소인 경우에는, 예를 들어, 그 효소와 반응시 형광을 생성하는 기질을 표지 항체 또는 이의 단편에 작용시키고, 생성된 형광의 강도를 형광 강도계 등에서 측정함으로써 측정을 실행할 수 있다. 효소는 그 효소의 기질과 반응하여 형광을 생성할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않으며, 그의 예는 퍼옥시다아제,β-D-갈락토시다아제 및 β-글루쿠로니다아제를 포함한다.
효소로서 퍼옥시다아제를 사용하는 경우, 퍼옥시다아제와 반응하여 형광을 생성하는 퍼옥시다아제의 기질의 예는 과산화수소 및 형광 화합물의 조합을 포함한다. 형광 화합물의 예는 4-히드록시페닐아세트산, 3-(4-히드록시페닐)프로피온산 및 쿠마린을 포함한다.
효소로서 β-D-갈락토시다아제를 사용하는 경우, β-D-갈락토시다아제와 반응하여 형광을 생성하는 β-D-갈락토시다아제의 기질의 예는 4-메틸움벨리페릴-β-D-갈락토피라노시드 또는 이의 유사체를 포함한다.
효소로서 β-글루쿠로니다아제를 사용하는 경우, β-글루쿠로니다아제와 반응하여 형광을 생성하는 β-글루쿠로니다아제의 기질의 예는 Tokyo GreenTM-βGluU (Sekisui Medical Co. Ltd. 사제) 를 포함한다.
(B-2) 표지가 형광 물질인 경우
표지가 형광 물질인 경우에는, 예를 들어, 형성된 면역복합체 중의 형광 물질에서 기인하는 형광의 강도를, 형광 강도계 등을 사용하여 측정함으로써 측정을 실행할 수 있다. 형광 물질은 본 발명의 측정을 가능하게 하는 형광 물질이면 특별히 제한되지 않으며, 그의 예는 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC) 및 로다민 B-이소티오시아네이트 (RITC), 양자점 (quantum dot) (Science, 281, 2016-2018, 1998), 피코에리트린과 같은 피코빌리단백질, 녹색 형광 단백질 (GFP), 적색 형광 단백질 (RFP), 황색 형광 단백질 (YFP) 및 청색 형광 단백질 (BFP) 을 포함한다.
(C) 흡광도의 측정
흡광도는 하기와 같은 방법에 의해 측정될 수 있다.
(C-1) 표지가 효소인 경우
표지가 효소인 경우에는, 예를 들어, 그 효소와 반응시 색소를 형성하는 기질을 표지 항체 또는 이의 단편에 작용시키고, 형성된 색소의 흡광도를 분광 광도 계, 멀티-웰 플레이트 리더 등을 사용하여 측정함으로써 측정을 실행할 수 있다. 효소는 그 효소의 기질과 반응하여 색소를 형성할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않으며, 그의 예는 퍼옥시다아제를 포함한다.
효소로서 퍼옥시다아제를 사용하는 경우, 퍼옥시다아제와 반응하여 색소를 형성하는 퍼옥시다아제의 기질의 예는 과산화수소 및 산화 발색형 색원체의 조합을 포함한다. 산화 발색형 색원체의 예는 류코-형 색원체 및 산화 커플링 발색 색원체를 포함한다.
류코-형 색원체는 과산화수소 및 퍼옥시다아제와 같은 과산화활성 물질의 존재 하에 단독으로 색소로 변환되는 물질이다. 구체적인 예는 테트라메틸벤지진, o-페닐렌디아민, 10-N-카르복시메틸카르바모일-3,7-비스(디메틸아미노)-10H-페노티아진 (CCAP), 10-N-메틸카르바모일-3,7-비스(디메틸아미노)-10H-페노티아진 (MCDP), N-(카르복시메틸아미노카르보닐)-4,4'-비스(디메틸아미노)디페닐아민 나트륨 염 (DA-64), 4,4'-비스(디메틸아미노)디페닐아민 및 비스[3-비스(4-클로로페닐)메틸-4-디메틸아미노페닐]아민 (BCMA) 을 포함한다.
산화 커플링 발색 색원체는 과산화수소 및 퍼옥시다아제와 같은 과산화활성 물질의 존재 하, 2 개 화합물의 산화적 커플링에 의해 색소를 형성하는 물질이다. 2 개 화합물의 조합의 예는 커플러 (coupler) 와 아닐린 화합물 (Trinder 시약) 의 조합, 및 커플러와 페놀 화합물의 조합을 포함한다. 커플러의 예는 4-아미노안티피린 (4-AA) 및 3-메틸-2-벤조티아졸리논히드라진을 포함한다. 아닐린 화합물의 예는 N-(3-술포프로필)아닐린, N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3-메틸아닐린 (TOOS), N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3,5-디메틸아닐린 (MAOS), N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린 (DAOS), N-에틸-N-(3-술포프로필)-3-메틸아닐린 (TOPS), N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린 (HDAOS), N,N-디메틸-3-메틸아닐린, N,N-비스(3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린, N-에틸-N-(3-술포프로필)-3-메톡시아닐린, N-에틸-N-(3-술포프로필)아닐린, N-에틸-N-(3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린, N-(3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린, N-에틸-N-(3-술포프로필)-3,5-디메틸아닐린, N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3-메톡시아닐린, N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)아닐린, N-에틸-N-(3-메틸페닐)-N'-숙시닐에틸렌디아민 (EMSE), N-에틸-N-(3-메틸페닐)-N'-아세틸에틸렌디아민 및 N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-4-플루오로-3,5-디메톡시아닐린 (F-DAOS) 를 포함한다. 페놀 화합물의 예는 페놀, 4-클로로페놀, 3-메틸페놀 및 3-히드록시-2,4,6-트리요오도벤조산 (HTIB) 을 포함한다.
자성 입자 상에 형성된 면역복합체의 측정으로부터의 측정치에 근거한, 시료 중의 FGF-23 농도의 측정은, 예를 들어 하기의 방법에 의해 실행될 수 있다.
알려져 있는 농도의 FGF-23 을 사용하여 전술한 단계 (1) ~ (3) 을 실행하여, FGF-23 농도와 측정치 (표지 유래의 정보량) 간의 관계를 나타내는 검량선을 제공한 후, 측정할 시료를 사용하여 측정을 실행하고, 수득한 측정치를 미리 작성한 검량선과 비교하여 측정할 시료 중의 FGF-23 농도를 측정한다.
(시료)
본 발명에서의 시료는 본 발명의 FGF-23 의 측정을 가능하게 하는 시료이면 특별히 제한되지 않는다. 그의 예는 전혈, 혈장, 혈청, 척수액, 타액, 양수, 소변, 땀 및 췌액을 포함하며; 혈장 및 혈청이 바람직하다.
(수성 배지)
본 발명에서 사용되는 수성 배지는 본 발명의 FGF-23 의 측정을 가능하게 하는 수성 배지이면 특별히 제한되지 않으며, 그의 예는 탈이온수, 증류수 및 완충액을 포함하고; 완충액이 바람직하다. 완충액 제조에 사용되는 완충제는 완충력을 갖는 것이면 특별히 제한되지 않는다. 완충액의 예는 pH 1 내지 11 의 완충액, 예컨대 락테이트 완충액, 시트레이트 완충액, 아세테이트 완충액, 숙시네이트 완충액, 프탈레이트 완충액, 포스페이트 완충액, 트리에탄올아민 완충액, 디에탄올아민 완충액, 리신 완충액, 바르비투레이트 완충액, 이미다졸 완충액, 말레이트 완충액, 옥살레이트 완충액, 글리신 완충액, 보레이트 완충액, 카르보네이트 완충액, 글리신 완충액 및 굳 (Good's) 완충액을 포함한다.
굳 완충액의 예는 2-모르폴리노에탄술폰산 (MES) 완충액, 비스(2-히드록시 에틸)이미노트리스(히드록시메틸)메탄 (Bis-Tris) 완충액, 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 (Tris) 완충액, N-(2-아세토아미도)이미노 이아세트산 (ADA) 완충액, 피페라진-N,N'-비스(2-에탄술폰산) (PIPES) 완충액, 2-[N-(2-아세트아미도)아미노]에탄술폰산 (ACES) 완충액, 3-모르폴리노-2-히드록시프로판술폰산 (MOPSO) 완충액, 2-[N,N-비스(2-히드록시에틸)아미노]에탄술폰산 (BES) 완충액, 3-모르폴리노프로판술폰산 (MOPS) 완충액, 2-{N-[트리스(히드록시메틸)메틸]아미노}에탄술폰산 (TES) 완충액, N-(2-히드록시에틸)-N'-(2-술포에틸)피페라진 (HEPES) 완충액, 3-[N,N-비스(2-히드록시에틸)아미노]-2-히드록시프로판술폰산 (DIPSO) 완충액, 2-히드록시-3-{[N-트리스(히드록시메틸)메틸]아미노}프로판술폰산 (TAPSO) 완충액, 피페라진-N,N'-비스(2-히드록시프로판-3-술폰산) (POPSO) 완충액, N-(2-히드록시에틸)-N'-(2-히드록시-3-술포프로필)피페라진 (HEPPSO) 완충액, N-(2-히드록시에틸)-N'-(3-술포프로필)피페라진 (EPPS) 완충액, [N-트리스(히드록시메틸)메틸글리신] (트리신) 완충액, [N,N-비스(2-히드록시에틸)글리신] (바이신) 완충액, 3-[N-트리스(히드록시메틸)메틸]아미노프로판술폰산 (TAPS) 완충액, 2-(N-시클로헥실아미노)에탄 술폰산 (CHES) 완충액, 3-(N-시클로헥실아미노)-2-히드록시프로판술폰산 (CAPSO) 완충액 및 3-(N-시클로헥실아미노)프로판술폰산 (CAPS) 완충액을 포함한다.
(자성 입자)
본 발명의 자성 입자는 본 발명의 FGF-23 의 측정을 가능하게 하는 자성 입자이면 특별히 제한되지 않으며, 그의 예는 페라이트-코팅 라텍스 및 페라이트-코팅 중합체 입자를 포함한다. 또한 항체 결합을 촉진하기 위해서, 비오틴과 결합하는 성질을 갖는 아비딘, 뉴트라비딘 또는 스트렙타비딘이 표면에 고정된 자성 입자를 또한 사용할 수 있다. 자성 입자의 입자 직경은 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어 1 μm ~ 6 μm 이고, 바람직하게는 1 μm ~ 3 μm 이다. 시판되는 자성 입자를 본 발명에서의 자성 입자에 대해 사용할 수 있다. 시판되는 자성 입자의 예는 Dynabeads M-280 Streptavidin (Dynal Co. 사제), Dynabeads M-280 Tosylactivated (Dynal Co. 사제), Dynabeads MyOne Streptavidin T1 (Dynal Co. 사제), Dynabeads MyOne Tosylactivated (Dynal Co. 사제), Estapor (Merck & Co. 사제), Sera-Mag Magnetic Streptavidin Particles (Thermo Scientific 사제) 및 MAGNOTEX-SA (JSR Co. 사제) 를 포함한다.
(항체)
본 발명의 FGF-23 에 결합하는 항체 (제 1 항체 및 제 2 항체) 는, 본 발명의 FGF-23 의 측정을 가능하게 하는 항체이면 특별히 제한되지 않으며, 다중클론 항체 및 단일클론 항체 모두를 사용할 수 있지만, 단일클론 항체가 바람직하다. 또한 본 발명에서, 전체 길이의 항체 뿐 아니라 항체 단편을 사용할 수 있다. 항체 단편의 예는 항체의 파파인 처리에 의해 수득된 Fab, 항체의 펩신 처리에 의해 수득된 F(ab')2, 및 항체의 펩신 처리 및 환원 처리에 의해 수득된 Fab' 와 같은, Fc 부분을 제거한 단편을 포함한다. 자성 입자로서 아비딘, 뉴트라비딘 또는 스트렙타비딘이 그 표면에 고정된 자성 입자를 사용하는 경우, 제 1 항체에 비오틴이 결합한 비오틴화 제 1 항체를 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 FGF-23 에 결합하는 제 1 항체 및 제 2 항체에 있어서, 제 1 항체가 결합하는 FGF-23 부위 및 제 2 항체가 결합하는 FGF-23 부위는 동일하거나 상이할 수 있고, 바람직하게는 상이하다.
본 발명에서 사용되는 항체는 FGF-23 그 자체 또는 FGF-23 중의 에피토프에 상응하는 펩티드를 항원으로서 사용하는 통상적인 항체 생성 방법에 의해 수득될 수 있고; 추가로, 항체는 시판 제품으로서 또한 수득될 수 있다. FGF-23 에 결합하는 항체의 예는 FERM BP-7838, FERM BP-7839, FERM BP-7840 및 FERM BP-8268 로서 기탁된 하이브리도마가 생성하는 단일클론 항체를 포함한다.
본 발명의 FGF-23 의 측정 방법 및 측정 시약에 있어서, FGF-23 에 결합하는 압타머 (aptamer) 와 같은 항체 외의 물질을 FGF-23 에 결합하는 항체 대신 또한 사용할 수 있다.
(측정 시약)
시료 중의 FGF-23 을 측정하기 위한 본 발명의 시약은 시료 중의 FGF-23 을 측정하기 위한 본 발명의 방법에서 사용할 수 있다. 본 발명의 측정 시약은 자성 입자, FGF-23 에 결합하는 제 1 항체 또는 이의 단편, 및 FGF-23 에 결합하는 제 2 항체 또는 이의 단편을 포함한다. 사용하는, FGF-23 에 결합하는 제 1 항체 또는 이의 단편은 자성 입자에 결합할 수 있다.
FGF-23 에 결합하는 제 1 항체 또는 이의 단편이 자성 입자에 결합하는 경우, 본 발명의 측정 시약은 FGF-23 에 결합하는 제 1 항체 또는 이의 단편이 결합한 자성 입자, 및 FGF-23 에 결합하는 제 2 항체 또는 이의 단편을 포함한다.
FGF-23 에 결합하는 제 1 항체 또는 이의 단편이 자성 입자에 결합하지 않는 경우, 본 발명의 측정 시약은 서로에 대한 친화성을 갖는 2 개의 물질 중 하나가 고정된 자성 입자, 서로에 대한 친화성을 갖는 2 개의 물질 중 다른 하나가 결합한 제 1 항체 또는 이의 단편, 및 FGF-23 에 결합하는 제 2 항체 또는 이의 단편을 포함한다. 서로에 대한 친화성을 갖는 2 개의 물질의 조합의 예는 아비딘, 스트렙타비딘 및 뉴트라비딘과 같은 아비딘류와 비오틴과의 조합을 포함한다. 본 발명의 측정 시약의 한 양태의 예는, 아비딘이 고정된 자성 입자, FGF-23 에 결합하는 제 1 항체 또는 이의 단편에 비오틴이 결합한 비오틴화 제 1 항체 또는 이의 단편, 및 FGF-23 에 결합하는 제 2 항체 또는 이의 단편을 포함하는 측정 시약을 포함한다.
제 2 항체 또는 이의 단편이 표지되는 경우, 본 발명의 측정 시약은 제 1 항체 또는 이의 단편, FGF-23, 및 표지된 제 2 항체 또는 이의 단편을 포함하는 면역복합체 중의 표지된 제 2 항체 또는 이의 단편의 측정을 가능하게 하는 표지 측정 시약을 추가로 포함한다. 표지 측정 시약은 형성된 면역복합체 중의 표지된 제 2 항체 또는 이의 단편을 측정할 수 있는 시약이면 특별히 제한되지 않는다. 그의 예는 화학발광 측정 시약 및 형광 측정 시약을 포함하며; 화학발광 측정 시약이 바람직하다.
FGF-23 에 결합하는 제 2 항체 또는 이의 단편이 표지되지 않은 경우, 본 발명의 측정 시약은 제 2 항체 또는 이의 단편에 결합하는 제 3 항체 또는 이의 단편에 표지가 결합한 표지된 제 3 항체 또는 이의 단편, 및 제 1 항체 또는 이의 단편, FGF-23, 제 2 항체 또는 이의 단편, 및 표지된 제 3 항체 또는 이의 단편을 포함하는 면역복합체 중의 표지된 제 3 항체 또는 이의 단편의 측정을 가능하게 하는 표지 측정 시약을 추가로 포함한다. 제 2 항체 또는 이의 단편에 결합하는 제 3 항체 또는 이의 단편의 예는 제 2 항체의 Fc 영역에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 포함한다. 면역복합체 중의 표지된 제 3 항체 또는 이의 단편의 측정을 가능하게 하는 표지 측정 시약은, 형성된 면역복합체 중의 표지된 제 3 항체 또는 이의 단편의 측정을 가능하게 하는 시약이면 특별히 제한되지 않는다. 그의 예는 화학발광 측정 시약, 형광 측정 시약 및 흡광도 측정 시약을 포함하며; 화학발광 측정 시약이 바람직하다.
특히, 화학발광 측정 시약은 표지가 효소인 경우에 사용되는 시약이며, 그의 예는 그 효소와 반응시 광을 생성하는 효소의 기질을 포함하는 시약을 포함한다. 효소와, 그 효소와 반응시 광을 형성하는 효소의 기질과의 조합의 예는 전술한 조합을 포함한다.
특히, 형광 측정 시약은 표지가 효소인 경우에 사용되는 시약이며, 그의 예는 그 효소와 반응시 형광을 생성하는 효소의 기질을 포함하는 시약을 포함한다. 효소와, 그 효소와 반응시 형광을 생성하는 효소의 기질과의 조합의 예는 전술한 조합을 포함한다.
특히, 흡광도 측정 시약은 표지가 효소인 경우에 사용되는 시약이며, 그의 예는 그 효소와 반응시 색소를 생성하는 효소의 기질을 포함하는 시약을 포함한다. 효소와, 그 효소와 반응시 색소를 생성하는 효소의 기질과의 조합의 예는 전술한 조합을 포함한다.
본 발명의 측정 시약에서 사용되는 자성 입자, FGF-23 에 결합하는 제 1 항체 또는 이의 단편, 및 FGF-23 에 결합하는 제 2 항체 또는 이의 단편의 예는 각각 전술한 자성 입자, FGF-23 에 결합하는 제 1 항체 또는 이의 단편, 및 FGF-23 에 결합하는 제 2 항체 또는 이의 단편을 포함한다. 또한, 본 발명의 측정 시약은 필요에 따라, 전술한 수성 배지, 표지 효소의 기질, 금속 이온, 당, 방부제, 단백질, 계면활성제, 단백질 안정화제 등을 포함할 수 있다.
하기에서 실시예를 참조로 하여 본 발명을 상세하게 설명하지만, 이러한 설명이 본 발명의 범주를 제한하는 것은 아니다.
[실시예 1]
(1) 재료 및 측정 방법
<측정용 시료>
건강한 개인에서 수득한 혈청 (FGF-23 농도가 10 pg/mL 인 혈청; Aries Diagnostika GmbH 사에서 구입) 을, 0.2% BSA (Bovogen Biologicals Co. 사제) 를 함유하는 인산 완충 식염수 용액 (0.15 mol/L 염화 나트륨을 함유하는 10 mmol/L 인산 완충액, pH 7.2) 으로 FGF-23 농도가 9 pg/mL, 8 pg/mL, 7 pg/mL, 6 pg/mL, 5 pg/mL, 4 pg/mL, 3 pg/mL, 2 pg/mL 및 1 pg/mL 이 되도록 희석하여 제조한 용액; 및 0.2% BSA 를 함유하는 인산 완충 식염수 용액 (FGF-23 농도 0 pg/mL) 을 측정용 시료로서 사용하였다.
<자성 입자 현탁액>
시판되는 스트렙타비딘-결합 자성 입자 (Dynabeads MyOne Streptavidin T1; Dynal Co. 사제) 를 자성 입자로서 사용하여, 하기의 조성을 갖는 자성 입자 현탁액을 제조하였다:
MES (pH 6.5) 50 mmol/L
스트렙타비딘-결합 자성 입자 0.75 mg/mL
BSA 0.1%
염화 나트륨 0.1 mol/L
<비오틴화 항-FGF-23 항체 및 비오틴화 항-FGF-23 항체 용액>
FERM BP-7838 로서 기탁된 하이브리도마가 생성하는 항-FGF-23 단일클론 항체 2C3B 를 제 1 항체로서 사용하였다. 상기 항체와 NHS-비오틴을 혼합하고, 37℃ 에서 1 시간 동안 반응을 실행하고, 반응된 혼합물을 Sephadex G-25 컬럼 (GE Health Science Japan Co. 사제) 을 거치게 하여 미반응 NHS-비오틴을 제거하고, 비오틴화 항-FGF-23 단일클론 항체를 제조하였다.
수득한 비오틴화 항-FGF-23 단일클론 항체를 사용하여, 하기의 조성을 갖는 비오틴화 항-FGF-23 항체 용액을 제조하였다:
MES (pH 6.5) 50 mmol/L
항-FGF-23 단일클론 항체 2C3B 5 μg/mL
BSA 0.1%
염화 나트륨 0.1 mol/L
<알칼리 포스파타아제-표지 항-FGF-23 항체 단편 및 알칼리 포스파타아제-표지 항-FGF-23 항체 단편 용액>
제 2 항체 단편에 대해, FERM BP-7839 로서 기탁된 하이브리도마가 생성하는 항-FGF-23 단일클론 항체 3C1E 를 펩신으로 소화시킨 후, G3000SW 컬럼 (Tosoh Co. 사제; 직경: 21.5 mm; 길이: 60 cm) 을 사용하여 HPLC 시스템 (Hitachi Ltd. 사제) 으로 F(ab')2 를 분리하였다. 수득한 F(ab')2 를 2-메르캅토에틸아민 염산염 (Nacalai Tesque 사제) 을 사용하여 환원한 후, G3000SW 컬럼 (Tosoh Co. 사제; 직경: 21.5 mm; 길이: 60 cm) 을 사용하여 HPLC 시스템 (Hitachi Ltd. 사제) 으로 Fab' 를 분리하였다. 수득한 Fab' 및 알칼리 포스파타아제를 하기의 절차에 따라 말레이미드 법에 의해 결합시켰다.
말레이미드화 시약 Sulfo-HMCS (Dojindo Laboratories 사제) 를 사용하여, 알칼리 포스파타아제를 말레이미드화시키고, 반응 혼합물을 Sephadex G-25 컬럼 (GE Health Science Japan Co. 사제) 을 거치게 하여 미반응 Sulfo-HMCS 를 제거하고, 말레이미드화 알칼리 포스파타아제를 수득하였다.
제조된 말레이미드화 알칼리 포스파타아제와 Fab' 를 혼합하고, 알칼리 포스파타아제-표지 Fab' 항체를 수득하였다. 수득한 알칼리 포스파타아제-표지 Fab' 항체를 사용하여 하기의 조성을 갖는 알칼리 포스파타아제-표지 항-FGF-23 항체 단편 용액을 제조하였다:
MES (pH 6.5) 50 mmol/L
알칼리 포스파타아제-표지 항-FGF-23 항체 단편 5 μg/mL
BSA 0.1%
염화 나트륨 0.1 mol/L
(2) 시료 중의 FGF-23 의 측정
상기 기재한 (1) 에서 제조한 측정용 시료 10 μL 에, (1) 에서 제조한 자성 입자 현탁액, 비오틴화 항-FGF-23 항체 용액, 및 알칼리 포스파타아제-표지 항-FGF-23 항체 단편 용액의 각 30 μL 를 첨가하고, 혼합물을 교반하고, 반응을 37℃ 에서 20 분 동안 실행하였다. 자성 입자를 자력으로 수집하여 자성 입자 이외의 반응 용액을 제거하고, 세척액 [0.1% Tween 20 을 함유하는 50 mmol/L MOPS 완충액 (pH 7.35)] 을 사용하여 자성 입자를 5 회 세척하였다. 그 후, 9-(4-클로로페닐티오포스포릴옥시메틸리덴)-10-메틸아크리단 이나트륨 염을 주성분으로서 함유하는 발광 기질액 100 μL 를 첨가하고 혼합물을 교반하고, 생성된 발광 수준 (RLU) 을 측정하였다. 측정 결과를 도 1 에 나타낸다.
측정계에 대해 측정 가능한 최소 농도를 규정하는 방법은 평균치 및 표준 편차를 사용하는 통계적 평가 방법을 포함한다. 구체적으로는, 0 pg/mL 시료의 5 회 측정 평균치 + 2 배의 표준 편차 (+ 2SD) 보다, (1) 에서 제조한 시료의 5 회 측정 평균치 - 2 배의 표준 편차 (- 2SD) 가 더 높은 RLU 를 갖는다면, 그 시료를 검출가능한 농도를 갖는 것으로서 규정할 수 있다.
FGF-23 농도가 0 pg/mL 인 시료를 측정했을 때 평균 발광 수준 + 2SD 는 173 RLU (도 1 의 점선) 였다. 반면, FGF-23 농도가 1 pg/mL 인 시료를 측정했을 때 평균 발광 수준 - 2SD 는 186 RLU 였고, 이는 0 pg/mL 시료를 측정했을 때 수득한 평균 발광 수준 + 2SD 보다 높은 값이었다. 그리하여, 1 pg/mL 의 FGF-23 을 측정할 수 있는 것이 확인되었다. 따라서, 이 측정 방법에 있어서, 검출할 수 있는 FGF-23 의 최소 농도는 1 pg/mL 인 것으로 규정할 수 있다. 또한, 도 1 에 나타낸 바와 같이, 1 pg/mL 이상의 FGF-23 농도에서는 농도 의존적인 발광 수준의 증가가 관찰되었다.
[실시예 2]
(1) 재료 및 측정 방법
<측정용 시료>
WO2003/057733 에 기재된 방법에 따라 제조한 FGF-23 을, 0.2% BSA (Bovogen Biologicals Co. 사제) 를 함유하는 인산 완충 식염수 용액 (0.15 mol/L 염화 나트륨을 함유하는 10 mmol/L 인산 완충액, pH 7.2) 으로 FGF-23 농도가 10,000 pg/mL, 3,000 pg/mL, 1,000 pg/mL, 300 pg/mL, 100 pg/mL, 50 pg/mL, 10 pg/mL 및 5 pg/mL 이 되도록 희석하여 제조한 용액; 및 0.2% BSA 를 함유하는 인산 완충 식염수 용액 (FGF-23 농도 0 pg/mL) 을 측정용 시료로 사용하였다.
(2) 시료 중의 FGF-23 의 측정
상기 (1) 의 측정용 시료를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1 에서와 동일한 방법에 의해 측정을 실행하였다. 그 결과를 도 2 에 나타낸다.
도 2 로부터 명백한 바와 같이, 5 pg/mL 내지 10,000 pg/mL 의 농도 범위에서, FGF-23 농도에 의존적으로, 그리고 직선 방식으로 발광 수준이 증가하는 것이 발견되었다. 그러므로, 본 발명의 측정 방법을 사용하여 5 pg/mL 내지 10,000 pg/mL 의 범위에서 FGF-23 농도를 측정할 수 있는 것이 판명되었다.
[실시예 3]
인공투석이란, 외적인 수단으로 혈중의 노폐물을 제거하고, 전해질을 유지하고, 수분량을 유지하는 것을 지칭하며, 체외에서 순환하는 혈액의 응고를 방지하기 위해 항응고제 (헤파린) 를 사용한다. 그러므로, 투석 환자 표본에서, 혈청 분리 후에 피브린 석출이 자주 관찰된다. 혈청 중에 석출한 피브린이 존재하는 경우, FGF-23 측정계에 영향을 미칠 수 있으며 정확한 결과가 수득되지 않을 수 있다.
정확한 측정치를 수득할 수 있는지 여부를 판정하는 방법으로서 동시 재현성 시험, 첨가 회수 (spike-recovery) 시험 및 희석 직선성 시험이 자주 실행된다. 따라서, 투석 환자 유래의 혈청 (Discovery Life Sciences Inc. 에서 구입) 을 사용하여 실시예 1 의 측정 방법에 대해 하기의 동시 재현성 시험, 첨가 회수 시험 및 희석 직선성 시험을 실행하였다.
(1) 동시 재현성 시험
동시 재현성 시험이란, 동일 시료 (혈청, 혈장 등) 를 사용하여 복수회, 연속 측정을 실행하여 측정치의 편차를 평가함으로써 측정 방법의 정확성을 측정하는 방법이다.
투석 환자 유래의 3 종류 혈청을 사용하여, 실시예 1 에 기재된 방법에 따라 각각의 혈청 중의 FGF-23 농도를 10 회 측정하였다. 측정에 의해 수득한 FGF-23 농도, 그의 평균 및 변동 계수 (CV%) 를 하기 표 1 에 나타낸다. 각 혈청에 대한 변동 계수는 1.2% 내지 3.1% 였으며 양호하였다. 그러므로, 본 발명의 측정 방법을 사용하여 양호한 재현성으로 투석 환자 유래의 혈청 중의 FGF-23 을 측정할 수 있다는 것이 판명되었다.
[표 1]
Figure 112013026375012-pct00001
(2) 첨가 회수 시험
첨가 회수 시험이란, 알려져 있는 농도의 항원 (FGF-23) 을 첨가한 시료 (혈청, 혈장 등) 를 측정하고 측정치가 실제의 첨가량과 일치하는지 여부를 평가함으로써 측정 방법의 정확성을 측정하는 방법이다.
WO2003/057733 에 기재된 방법에 의해 제조한 FGF-23 을 다양한 농도로 첨가한 투석 환자 유래의 3 종류 혈청을 측정용 시료로서 사용하고, 실시예 1 에서 기재된 방법에 의해 측정하여 첨가 회수 시험을 실행하였다. 첨가 회수율을 하기 표 2 에 나타낸다. 각 혈청에 대한 첨가 회수율은 96.7% 내지 101.6% 였으며 양호하였다. 그러므로, 본 발명의 측정 방법을 사용하여 투석 환자 유래의 혈청 중의 FGF-23 을 정확하게 측정할 수 있다는 것이 판명되었다.
[표 2]
Figure 112013026375012-pct00002
(3) 희석 직선성 시험
희석 직선성 시험이란, 적절한 희석제를 사용하여 시료 (혈청, 혈장 등) 를 단계적으로 희석하고 희석 정도에 따라 측정치가 직선적으로 감소하는지 여부를 평가함으로써 측정 방법의 정확성을 측정하는 방법이다.
0.2% BSA (Bovogen Biologicals Co. 사제) 를 함유하는 인산 완충 식염수 용액을 사용하여 10 단계 희석한 투석 환자 유래의 2 종류 혈청 (환자 혈청 D 및 환자 혈청 E), 및 0.2% BSA 를 함유하는 인산 완충 식염수 용액 (FGF-23 농도 0 pg/mL) 을 측정용 시료로서 사용하고, 실시예 1 에 기재된 방법에 의해 측정하여 희석 직선성 시험을 실행하였다.
희석률 (x-축) 및 측정에 의해 결정된 FGF-23 농도 (y-축) 를 플롯팅한 결과를 도 3 및 도 4 에 나타낸다. 투석 환자 유래의 혈청 둘 모두로부터 양호한 직선성이 수득되었으므로, 본 발명의 측정 방법을 사용하여 투석 환자 유래의 혈청 중의 FGF-23 을 정확하게 측정할 수 있다는 것이 판명되었다.
[비교예 1]
(1) 재료 및 측정 방법
<측정용 시료>
건강한 개인에서 수득한 혈청 (FGF-23 농도가 20 pg/mL 인 혈청; Aries 에서 구입) 을 0.2% BSA (Bovogen Biologicals Co. 사제) 를 함유하는 인산 완충 식염수 용액 (0.15 mol/L 염화 나트륨을 함유하는 10 mmol/L 인산 완충액, pH 7.2) 으로 FGF-23 농도가 16 pg/mL, 14 pg/mL, 12 pg/mL, 10 pg/mL, 8 pg/mL, 6 pg/mL, 4 pg/mL 및 2 pg/mL 가 되도록 희석하여 제조한 용액; 및 0.2% BSA 를 함유하는 인산 완충 식염수 용액 (FGF-23 농도 0 pg/mL) 을 측정용 시료에 사용하였다.
(2) 시료 중의 FGF-23 의 측정
플레이트법에 대한 FGF-23 측정 시약 (Kainos 사제) 을 측정 키트에 사용하고, (1) 에서 제조한 측정용 시료를 시료로서 사용하고, 실시예 1 에서와 유사한 방법에 의해 5 회 측정하였다. 그 결과를 도 5 에 나타낸다.
FGF-23 농도가 0 pg/mL 인 시료를 측정했을 때 평균 흡광도 + 2SD 는 0.111 (도 5 의 점선) 이었다. FGF-23 농도가 6 pg/mL 인 시료를 측정했을 때 평균 흡광도 - 2SD 는 0.104 였고, 이는 0 pg/mL 시료를 측정했을 때 수득한 평균 흡광도 + 2SD 보다 낮은 값이었다. 따라서, 6 pg/mL 의 FGF-23 농도는 측정할 수 없다는 것이 판명되었다. 반면, FGF-23 농도가 8 pg/mL 인 시료를 측정했을 때 평균 흡광도 - 2SD 는 0.115 였고, 이는 0 pg/mL 시료를 측정했을 때 수득한 평균 흡광도 + 2SD 보다 높은 값이었다. 그리하여, 8 pg/mL 의 FGF-23 을 측정할 수 있는 것이 확인되었다. 따라서, 이 측정 방법에 있어서, 검출할 수 있는 FGF-23 의 최소 농도는 8 pg/mL 인 것으로 규정할 수 있다.
[비교예 2]
FGF-23 측정 시약 (Kainos 사제; 플레이트법) 을 사용하여, 시약에 첨부된 표준 용액 (FGF-23 농도 0 pg/mL, 10 pg/mL, 50 pg/mL, 100 pg/mL, 250 pg/mL, 500 pg/mL 및 800 pg/mL) 을 측정하였고, 그의 흡광도를 도 6 에 나타낸다. 10 pg/mL 내지 800 pg/mL 의 FGF-23 농도에 의존적으로 흡광도가 증가하였다. FGF-23 측정 시약의 측정 범위 상한치는 800 pg/mL 인 것으로 규정되어, 더 높은 농도의 FGF-23 은 정량할 수 없다.
한편, 본 발명의 방법에 있어서, 실시예 2 에 나타낸 바와 같이, 5 pg/mL 내지 10,000 pg/mL 까지 측정이 가능하므로; 본 발명의 측정 방법은 플레이트법에 비해 고감도이며 측정 범위가 넓은 방법인 것이 판명되었다.
본 발명에 의해, 저인산혈증성 구루병, 종양-유도 골연화증 및 신부전과 같은 질환의 진단에 유효하고, 고감도이며 측정 범위가 넓은, 시료 중의 FGF-23 의 측정 방법 및 측정 시약이 제공된다.

Claims (12)

  1. 하기 단계를 포함하는, 시료 중의 섬유아세포 증식 인자-23 (이하, FGF-23 으로 표시함) 의 측정 방법:
    (1) 시료 중의 FGF-23 을, 수성 배지 중에서, 자성 입자, FGF-23 에 결합하는 제 1 항체 또는 이의 단편, 및 FGF-23 에 결합하는 제 2 항체 또는 이의 단편과 반응시켜, 자성 입자 상에 FGF-23 에 결합하는 제 1 항체 또는 이의 단편, FGF-23, 및 FGF-23 에 결합하는 제 2 항체 또는 이의 단편을 포함하는 면역복합체를 형성시키는 단계;
    (2) 단계 (1) 후 반응 혼합물 중의 자성 입자를 자력에 의해 수집하고, 자력에 의해 수집된 자성 입자와 그 이외의 성분을 분리하는 단계; 및
    (3) 단계 (2) 에서 분리된 자성 입자 상의 면역복합체를 측정하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 제 2 항체가 표지 항체인 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 표지 항체가 알칼리 포스파타아제-표지 항체인 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (3) 에서의 자성 입자 상 면역복합체의 측정이 화학발광의 측정에 의해 실행되는 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 시료가 혈청 또는 혈장인 방법.
  6. 제 4 항에 있어서, 시료가 혈청 또는 혈장인 방법.
  7. 제 1 항에 기재된 측정 방법에 사용되는, 시료 중의 섬유아세포 증식 인자-23 (이하, FGF-23 으로 표시함) 측정 시약으로서, 자성 입자, FGF-23 에 결합하고 또한 자성 입자에 결합하고 있지 않은 제 1 항체 또는 이의 단편, 및 FGF-23 에 결합하는 제 2 항체 또는 이의 단편을 포함하는, 시료 중의 FGF-23 측정 시약.
  8. 제 7 항에 있어서, 제 2 항체가 표지 항체인 시약.
  9. 제 8 항에 있어서, 표지 항체가 알칼리 포스파타아제-표지 항체인 시약.
  10. 제 7 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 화학발광 측정 시약을 추가로 포함하는 시약.
  11. 제 7 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 시료가 혈청 또는 혈장인 시약.
  12. 제 10 항에 있어서, 시료가 혈청 또는 혈장인 시약.
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