JP5865838B2 - 線維芽細胞増殖因子−23の測定方法及び測定試薬 - Google Patents
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Description
(1)試料中のFGF−23を、水性媒体中で、磁性粒子、FGF−23に結合する第1抗体若しくはそのフラグメント、及び、FGF−23に結合する第2抗体若しくはそのフラグメントと反応させ、磁性粒子上に、FGF−23に結合する第1抗体若しくはそのフラグメント、FGF−23、及び、FGF−23に結合する第2抗体若しくはそのフラグメントからなる免疫複合体を生成させる工程;
(2)工程(1)後の反応混合物中の磁性粒子を磁力により集めて、磁力により集められた磁性粒子とそれ以外の成分とを分離する工程;及び、
(3)工程(2)で分離された磁性粒子上の免疫複合体を測定する工程。
[2] 第2抗体が、標識化された抗体である[1]記載の測定方法。
[3] 標識化された抗体が、アルカリホスファターゼ標識抗体である[2]記載の測定方法。
[4] 工程(3)の磁性粒子上の免疫複合体の測定が、化学発光の測定により行われる、[1]〜[3]のいずれかに記載の測定方法。
[5] 試料が、血清又は血漿である[1]〜[4]のいずれかに記載の測定方法。
[7] 第2抗体が、標識化された抗体である[6]記載の測定試薬。
[8] 標識化された抗体が、アルカリホスファターゼ標識抗体である[7]記載の測定試薬。
[9] さらに、化学発光測定試薬を含む[6]〜[8]のいずれかに記載の測定試薬。
[10] 試料が、血清又は血漿である[6]〜[9]のいずれかに記載の測定試薬。
本発明の試料中のFGF−23の測定方法は、磁性粒子を担体として用いる、サンドイッチ法による試料中のFGF−23の免疫測定法であり、以下の工程を含む測定方法である。
(1)試料中のFGF−23を、水性媒体中で、磁性粒子、FGF−23に結合する第1抗体若しくはそのフラグメント、及び、FGF−23に結合する第2抗体若しくはそのフラグメントと反応させ、磁性粒子上に、FGF−23に結合する第1抗体若しくはそのフラグメント、FGF−23、及び、FGF−23に結合する第2抗体若しくはそのフラグメントからなる免疫複合体を生成させる工程;
(2)工程(1)後の反応混合物中の磁性粒子を磁力により集めて、磁力により集められた磁性粒子とそれ以外の成分とを分離する工程;及び、
(3)工程(2)で分離された磁性粒子上の免疫複合体を測定する工程。
工程(1)において、試料中のFGF−23は、水性媒体中で、磁性粒子、FGF−23に結合する第1抗体若しくはそのフラグメント、及び、FGF−23に結合する第2抗体若しくはそのフラグメントと反応し、磁性粒子上に、FGF−23に結合する第1抗体若しくはそのフラグメント、FGF−23、及び、FGF−23に結合する第2抗体若しくはそのフラグメントからなる免疫複合体が生成する。
工程(2)において、工程(1)後の磁性粒子、すなわち、FGF−23に結合する第1抗体若しくはそのフラグメント、FGF−23、及び、FGF−23に結合する第2抗体若しくはそのフラグメントからなる免疫複合体が結合した磁性粒子は磁力によって集められ、磁力により集められた磁性粒子は、それ以外の成分と分離される。磁性粒子を集めるための磁力は、本発明のFGF−23の測定を可能とする磁力であれば特に制限はない。磁力により集められた磁性粒子と、それ以外の成分との分離は、本発明のFGF−23の測定を可能とする分離であれば特に制限はない。
次いで、工程(3)において、工程(2)により分離された磁性粒子上の免疫複合体を測定することにより、試料中のFGF−23を測定することができる。免疫複合体の測定方法としては、例えば、以下の方法等が挙げられる。
第2抗体若しくはそのフラグメントに結合する第3抗体若しくはそのフラグメントに標識が結合した標識化第3抗体若しくはそのフラグメントを、第1抗体若しくはそのフラグメント、FGF−23、及び、第2抗体若しくはそのフラグメントからなる免疫複合体が結合している磁性粒子と反応させて、磁性粒子上に、第1抗体若しくはそのフラグメント、FGF−23、第2抗体若しくはそのフラグメント、及び、第3抗体若しくはそのフラグメントからなる免疫複合体を形成させ、該免疫複合体中の標識を測定することにより、分離された磁性粒子上の免疫複合体を測定することができる。第2抗体若しくはそのフラグメントに結合する第3抗体若しくはそのフラグメントとしては、例えば第2抗体のFc領域に結合する抗体若しくはそのフラグメント等が挙げられる。標識の測定は、分離された磁性粒子上の免疫複合体の測定を可能とする方法であれば、特に制限はなく、例えば化学発光の測定、蛍光の測定、吸光度の測定等が挙げられるが、化学発光の測定が好ましい。
磁性粒子上に形成された、第1抗体若しくはそのフラグメント、FGF−23、及び、標識化されたFGF−23に結合する第2抗体若しくはそのフラグメントからなる免疫複合体中の標識を測定することにより、分離された磁性粒子上の免疫複合体を測定することができる。標識の測定は、分離された磁性粒子上の免疫複合体の測定を可能とする方法であれば、特に制限はなく、例えば化学発光の測定、蛍光の測定、吸光度の測定等が挙げられるが、化学発光の測定が好ましい。
化学発光の測定は、以下の方法等によって行うことができる。
(A-1)標識が酵素である場合
標識が酵素である場合には、例えばその酵素と反応して光を生成する基質を標識化抗体若しくはフラグメントに作用させ、生成した光(hν)の強度を発光強度計等で測定することにより行うことができる。酵素としては、その酵素の基質と反応し、光を生成し得るものであれば特に制限はなく、例えばアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−D−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ等が挙げられる。
標識が発光物質である場合には、例えば生成した免疫複合体中の発光物質に起因する光の強度を、発光強度計等で測定することにより行うことができる。発光物質としては、本発明の測定を可能とする発光物質であれば特に制限はなく、例えばアクリジニウムおよびその誘導体、ルテニウム錯体化合物、ロフィン等が挙げられる。
蛍光の測定は、以下の方法等によって行うことができる。
(B-1)標識が酵素である場合
標識が酵素である場合には、例えばその酵素と反応して蛍光を生成する基質を標識化抗体若しくはフラグメントに作用させ、生成した蛍光の強度を蛍光強度計等で測定することにより行うことができる。酵素としては、その酵素の基質と反応し、蛍光を生成し得るものであれば特に制限はなく、例えばペルオキシダーゼ、β−D−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ等が挙げられる。
標識が蛍光物質である場合には、例えば生成した免疫複合体中の蛍光物質に起因する蛍光の強度を、蛍光強度計等で測定することにより行うことができる。蛍光物質としては、本発明の測定を可能とする蛍光物質であれば特に制限はなく、例えばFITC(フルオレッセイン イソチオシアナート)、RITC(ローダミンB−イソチオシアナート)、quantum dot(Science, 281, 2016-2018, 1998)、フィコエリスリン等のフィコビリ蛋白質、GFP(Green fluorescent Protein)、RFP(Red fluorescent Protein)、YFP(Yellow fluorescent Protein)、BFP(Blue fluorescent Protein)等が挙げられる。
吸光度の測定は、以下の方法等によって行うことができる。
(C-1)標識が酵素である場合
標識が酵素である場合には、例えばその酵素と反応して色素を生成する基質を標識化抗体若しくはフラグメントに作用させ、生成した色素の吸光度を分光光度計やマルチウェルプレートリーダー等で測定することにより行うことができる。酵素としては、その酵素の基質と反応し、色素を生成し得るものであれば特に制限はなく、例えばペルオキシダーゼ等が挙げられる。
既知濃度のFGF−23を用いて上記工程(1)から工程(3)を行い、FGF−23の濃度と測定値(標識由来の情報量)との関係を表す検量線を作成し、次いで、測定すべき試料を用いて測定を行い、得られた測定値を予め作成した検量線に照らし合わせて、測定すべき試料中のFGF−23濃度を決定する。
本発明における試料としては、本発明のFGF−23の測定を可能とする試料であれば特に制限はなく、例えば全血、血漿、血清、髄液、唾液、羊水、尿、汗、膵液等が挙げられるが、血漿、血清等が好ましい。
本発明において使用される水性媒体としては、本発明のFGF−23の測定を可能とする水性媒体であれば特に制限はなく、例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等があげられ、緩衝液が好ましい。緩衝液の調製に使用される緩衝剤としては、緩衝能を有するものならば特に限定されないが、pH1〜11の例えば乳酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、フタル酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、トリエタノールアミン緩衝剤、ジエタノールアミン緩衝剤、リジン緩衝剤、バルビツール緩衝剤、イミダゾール緩衝剤、リンゴ酸緩衝剤、シュウ酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、炭酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、グッド緩衝剤等があげられる。
本発明における磁性粒子としては、本発明のFGF−23の測定を可能とする磁性粒子であれば特に限定はなく、例えばフェライトで被覆したラテックス、フェライトで被覆したポリマー粒子等が挙げられる。また、抗体の結合を容易にするために、ビオチンと結合する性質を有するアビジン、ニュートラアビジン又はストレプトアビジンを表面に固定化した磁性粒子も使用することができる。磁性粒子の粒径は、特に限定されないが、例えば1μm〜6μmであり、好ましくは1μm〜3μmである。本発明における磁性粒子としては、市販の磁性粒子を用いることができる。市販の磁性粒子としては、例えばDynabeads M-280 Streptavidin(ダイナル社製)、Dynabeads M-280 Tosylactivated(ダイナル社製)、Dynabeads MyOne Streptavidin T1(ダイナル社製)、Dynabeads MyOne Tosylactivated(ダイナル社製)、Estapor(メルク社製)、Sera-Mag Magnetic Streptavidin Particles(サーモサイエンティフィック社製)、MAGNOTEX-SA(JSR社製)等が挙げられる。
本発明におけるFGF−23に結合する抗体(第1抗体及び第2抗体)は、本発明のFGF−23の測定を可能とする抗体であれば特に制限はなく、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれも使用できるが、モノクローナル抗体が好ましい。また、本発明においては、全長の抗体のみならず、抗体フラグメントを用いることもできる。抗体フラグメントとしては、例えば、抗体をパパイン処理により得られるFab、ペプシン処理により得られるF(ab')2、ペプシン処理−還元処理により得られるFab'等のFc部分を除去した抗体フラグメント等が挙げられる。磁性粒子として、アビジン、ニュートラアビジン又はストレプトアビジンがその表面に固定化された磁性粒子を用いる場合には、第1抗体にビオチンが結合したビオチン結合第1抗体を用いることができる。
本発明の試料中のFGF−23測定試薬は、本発明の試料中のFGF−23の測定方法に使用することができる。本発明の測定試薬は、磁性粒子、FGF−23に結合する第1抗体若しくはそのフラグメント、及び、FGF−23に結合する第2抗体若しくはそのフラグメントを含有する。FGF−23に結合する第1抗体若しくはそのフラグメントは、磁性粒子に結合されたものを用いてもよい。
<測定用試料>
健常人より得た血清(FGF−23濃度が10 pg/mLの血清;アリエス社より購入)を、0.2%BSA(Bovogen Biologicals社製)を含むリン酸緩衝化生理食塩水(0.15 mol/L 塩化ナトリウムを含有する10 mmol/L リン酸緩衝液、pH7.2)にてFGF−23濃度が9 pg/mL、8 pg/mL、7 pg/mL、6 pg/mL、5 pg/mL、4 pg/mL、3 pg/mL、2 pg/mL、1 pg/mL、になるように希釈したもの、及び0.2%BSAを含むリン酸緩衝化生理食塩水(FGF−23濃度 0 pg/mL)を測定用試料に用いた。
磁性粒子として、ストレプトアビジンが結合した市販の磁性粒子(Dynabeads MyOne Streptavidin T1;ダイナル社製)を用いて、以下の組成からなる磁性粒子懸濁液を調製した。
MES(pH6.5) 50mmol/L
ストレプトアビジン結合磁性粒子 0.75mg/mL
BSA 0.1%
塩化ナトリウム 0.1mol/L
第1抗体として、FERM BP-7838として寄託されたハイブリドーマが生産する抗FGF−23モノクローナル抗体2C3Bを用いて、当該抗体とNHS−ビオチンとを混合し、37℃で1時間反応させ、反応後の混合物をセファデックスG-25カラム(GEヘルスサイエンス・ジャパン社製)に供して未反応のNHS−ビオチンを除去し、ビオチン結合抗FGF−23モノクローナル抗体を調製した。得られたビオチン結合抗FGF−23モノクローナル抗体を用いて、以下の組成からなるビオチン結合抗FGF−23抗体溶液を調製した。
MES(pH6.5) 50mmol/L
抗FGF−23モノクローナル抗体2C3B 5μg/mL
BSA 0.1%
塩化ナトリウム 0.1mol/L
第2抗体フラグメントとして、FERM BP-7839として寄託されたハイブリドーマが生産する抗FGF−23モノクローナル抗体3C1Eをペプシンで消化した後、G3000SWカラム(東ソー社製;口径:21.5 mm;長さ:60 cm)を用いたHPLCシステム(日立製作所社製)でF(ab’)2を分離した。得られたF(ab’)2を2−メルカプトエチルアミン塩酸塩(ナカライテスク社製)で還元した後、G3000SWカラム(東ソー社製;口径:21.5 mm;長さ:60 cm)を用いたHPLCシステム(日立製作所社製)でFab’を分離した。得られたFab’とアルカリホスファターゼとを以下の手順により、マレイミド法によって結合させた。
MES(pH6.5) 50mmol/L
アルカリホスファターゼ標識抗FGF−23抗体フラグメント
5μg/mL
BSA 0.1%
塩化ナトリウム 0.1mol/L
上記(1)で調製した測定用試料10 μLに、(1)で調製した磁性粒子懸濁液、ビオチン結合抗FGF−23抗体溶液、及び、アルカリホスファターゼ標識抗FGF−23抗体フラグメント溶液を各30 μL加えて攪拌し、37℃で20分間反応させた。磁性粒子を磁力で集めて、磁性粒子以外の反応溶液を除去すると共に、洗浄液[0.1%ツイーン20を含有する50 mmol/L MOPS緩衝液(pH7.35)]で磁性粒子を5回洗浄した。その後、9−(4−クロロフェニルチオホスホリルオキシメチリデン)−10−メチルアクリダン・二ナトリウム塩を主成分とする発光基質液を100 μL加えて攪拌し、生じた発光量(RLU)を測定した。測定結果を図1に示す。
<測定用試料>
WO2003/057733に記載された方法によって製造したFGF−23を、0.2%BSA(Bovogen Biologicals社製)を含むリン酸緩衝化生理食塩水(0.15 mol/L 塩化ナトリウムを含有する10 mmol/L リン酸緩衝液、pH7.2)にてFGF−23濃度が10,000 pg/mL、3,000 pg/mL、1,000 pg/mL、300 pg/mL、100 pg/mL、50 pg/mL、10 pg/mL、5 pg/mL、になるように希釈したもの、及び0.2%BSAを含むリン酸緩衝化生理食塩水(FGF−23濃度 0 pg/mL)を測定用試料に用いた。
上記(1)の測定用試料を用いる以外は、実施例1と同様の方法により測定を行った。その結果を図2に示す。
図2から明らかな様に、5〜10,000 pg/mLの濃度範囲において、FGF−23濃度依存的、かつ、直線的に発光量が増加することが判明した。従って。本発明の測定方法により、5〜10,000 pg/mLの範囲でFGF−23濃度を測定できることが判明した。
同時再現性試験とは、同一試料(血清、血漿等)を用いて複数回、連続測定し、測定値のばらつきを評価することで、測定法の正確性を判断する方法である。
添加回収試験とは、試料(血清、血漿等)に既知濃度の抗原(FGF−23)を添加したものを測定し、実際の添加量と一致するか否かを評価することで、測定法の正確さを判断する方法である。
希釈直線性試験とは、試料(血清、血漿等)を適当な希釈液で段階的に希釈し、希釈倍率に応じて測定値が直線的に減少していくか否かを評価することで、測定法の正確さを判断する方法である。
(1)材料及び測定方法
<測定用試料>
健常人より得た血清(FGF−23濃度が20 pg/mLの血清;アリエス社より購入)を、0.2%BSA(Bovogen Biologicals社製)を含むリン酸緩衝化生理食塩水(0.15 mol/L 塩化ナトリウムを含有する10 mmol/L リン酸緩衝液、pH7.2)にてFGF−23濃度が16 pg/mL、14 pg/mL、12 pg/mL、10 pg/mL、8 pg/mL、6 pg/mL、4 pg/mL、2 pg/mLになるように希釈したもの、及び0.2%BSAを含むリン酸緩衝化生理食塩水(FGF−23濃度 0 pg/mL)を測定用試料に用いた。
測定キットとして、プレート法によるFGF−23測定試薬(カイノス社製)を用い、試料として、(1)で調製した測定用試料を用いて、実施例1と同様の方法により、5重測定した。その結果を図5に示す。
FGF−23測定試薬(カイノス社製;プレート法)を用いて、同試薬に付属した標準溶液(FGF−23濃度 0 pg/mL、10 pg/mL、50 pg/mL、100 pg/mL、250 pg/mL、500 pg/mL、800 pg/mL)を測定した時の吸光度を図6に示した。10〜800 pg/mLまで、FGF−23濃度依存的に吸光度が増加していた。FGF−23測定試薬の測定範囲上限は800 pg/mLと規定されており、これより高濃度のFGF−23を定量することは出来ない。
Claims (10)
- 以下の工程を含むことを特徴とする、試料中の線維芽細胞増殖因子−23(以下、FGF−23と記す)の測定方法。
(1)試料中のFGF−23を、水性媒体中で、磁性粒子、FGF−23に結合する第1抗体若しくはそのフラグメント、及び、FGF−23に結合する第2抗体若しくはそのフラグメントと反応させ、磁性粒子上に、FGF−23に結合する第1抗体若しくはそのフラグメント、FGF−23、及び、FGF−23に結合する第2抗体若しくはそのフラグメントからなる免疫複合体を生成させる工程;
(2)工程(1)後の反応混合物中の磁性粒子を磁力により集めて、磁力により集められた磁性粒子とそれ以外の成分とを分離する工程;及び、
(3)工程(2)で分離された磁性粒子上の免疫複合体を測定する工程。 - 第2抗体が、標識化された抗体である請求項1記載の測定方法。
- 標識化された抗体が、アルカリホスファターゼ標識抗体である請求項2記載の測定方法。
- 工程(3)の磁性粒子上の免疫複合体の測定が、化学発光の測定により行われる、請求項1〜3のいずれかに記載の測定方法。
- 試料が、血清又は血漿である請求項1〜4のいずれかに記載の測定方法。
- 請求項1に記載の測定方法に用いられる、磁性粒子、FGF−23に結合する第1抗体若しくはそのフラグメント、及び、FGF−23に結合する第2抗体若しくはそのフラグメントを含有することを特徴とする、試料中のFGF−23測定試薬。
- 第2抗体が、標識化された抗体である請求項6記載の測定試薬。
- 標識化された抗体が、アルカリホスファターゼ標識抗体である請求項7記載の測定試薬。
- さらに、化学発光測定試薬を含む請求項6〜8のいずれかに記載の測定試薬。
- 試料が、血清又は血漿である請求項6〜9のいずれかに記載の測定試薬。
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