JPH08501390A - 特殊細胞集団もしくは混合細胞集団および混合細胞集団を含有する溶液中の特異標的細胞の検出方法 - Google Patents
特殊細胞集団もしくは混合細胞集団および混合細胞集団を含有する溶液中の特異標的細胞の検出方法Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、常磁性の粒子と、抗体に関連する標的細胞及び標的細胞の膜で特異的な抗原決定体に応じた抗体に関係する標的細胞のFc部分を認識する抗体とを用いて、簡単で時間を節約した手法にて特異標的細胞を検出する方法。細胞懸濁液を、緩和な界面活性剤および／または目視可能にする蛍光剤類、金属コロイド類、放射性同位元素類、ビオチン複合体類もしくはある種の酵素類で予め標識をつけてあるかつけてない抗体類もしくは抗体フラグメント類の第二セットとともにインキュベートすると、この方法の特異性が劇的に増大する。この方法は更に磁界印加により標的細胞の分離に用いられ、本発明によるこの方法を実施するためのキットが述べられている。
Description
【発明の詳細な説明】
特殊細胞集団もしくは混合細胞集団および混合細胞集団を含有する溶液中の特異
標的細胞の検出方法
本発明は細胞集団および細胞集団の溶液中の特異標的細胞の免疫磁気的検出方
法（immunomagnetic method for detection）に関する。また本発明は、異なる
細胞集団に上記方法を実施するのに適したキットに関する。
生物学、生化学さらにその隣接科学分野には、化学物質が相互に関連した方法
に対する需要が多い。このような方法は、正常なおよび異常な細胞集団の両者に
ついて研究する場合により重要となる。特に固体の支持体を用いると、細胞は固
定され、検出され、分離されて精製することができる。さらに、細胞含有物は一
連の高性能の方法を用いて試験することができる。また細胞を生育可能な形態で
分離できることも重要である。
アフィニティー結合法は化学物質／生化学物質を連結する高性能の方法である
。この方法では、一対の結合パートナーは（例えば連結される物質に結合される
）接触させると互いに結合する。このような結合において結合パートナーの一方
は細胞表面の一分子によって表される。このような結合パートナー系の多くは公
知であり、例えば細胞における抗原−抗体、酵素−受容体、リガンド−受容体の
相互作用およびビオチン−アビジンの結合があるが、これらのなかで抗原−抗体
の結合が最も頻繁に使用される。ハプテン／抗ハプテン結合対法も最近提案され
ている（PCT/EP90/01171）。
上記のような方法が特異的な細胞（その後の各種の試験に用いる被検体）を分
離するのに利用される場合、結合しているパートナー
に対して破壊作用を起こさずに結合を切断する必要があり、理想的には、結合パ
ートナーは元の状態に戻ったときにその機能を回復しなければならない。抗原／
抗抗原およびハプテン／抗ハプテンの結合を適正に切断する方法が提案されてい
るが（PCT/EP91/00671, PCT/EP90/01171）、上記のことは必ずしも実現されてい
ない。
結合パートナーの一方が不溶性の支持体例えば常磁性粒子に結合されている方
法は公知であり、この方法によって混合細胞集団中の標的細胞の分離が消極的分
離もしくは積極的分離として実施される。消極的分離法では、不要な細胞は、不
要細胞に対して特異的な抗体でコートされた粒子とともに細胞とインキュベート
することによって細胞試料から除くことができる。インキュベートを行ってから
、細胞／抗体／粒子複合体は粒子を用いて除去し、必要な標的細胞を残すことが
できる。この結果は不満足な場合が多い。というのは、必要な細胞は多少は精製
されているが細胞集団中に残り、またこの分離法の目的は特異標的細胞について
試験しおよび／またはさらに研究することだからである。積極的分離を行うため
に粒子を使用する試みがなされている。この場合、必要な標的細胞が混合細胞集
団から取り出される。しかしこれらの方法はある種の標的細胞に用いられている
がすべての標的細胞系に対して適しているわけではない。ハプテン／抗ハプテン
結合系に関する積極的分離法が最近提案されており（PCT/EP90/01171）、また骨
髄から造血前駆細胞を分離する方法も提案されている（PCT/EP90/02327）。後者
の方法は、特異細胞すなわち造血前駆細胞を分離し骨髄中で増殖させるため、積
極的なおよび消極的な選択を組合わせて用い、粒子の取り出しによって行われる
。
PCT/EP90/01171には、ハプテン、抗ハプテン抗体類および抗細胞抗体類が互い
に結合する性能を利用して、不溶性支持体すなわち粒
子と標的細胞との結合、すなわち少なくともハプテンと抗ハプテン抗体またはハ
プテンと抗ハプテン抗体および抗抗ハプテン抗体もしくは第二の抗細胞抗体との
組合わせからなる結合を形成させることによって、標的細胞を不溶性支持体に連
結する方法が記載されている。この複合体のその後の切断は、その複合体をハプ
テンもしくはハプテン類似体に再び暴露することによって行われる。したがって
形成された結合には一つ以上の成分に加えて常にハプテンを含有している。この
方法は、非特異的な標的細胞に関しおよび標的細胞の分離と不溶性支持体の放出
に関する。
非特異的なハプテン群の化合物を含有せず、また非特異的細胞との会合を最小
限にして特異標的細胞の検出を行って、不溶性支持体と特異標的細胞間の結合を
後で切断する必要をなくするような、標的細胞と不溶性支持体とを連結する簡単
な結合が要求されている。
したがって本発明の目的は、特異的標細胞を血液中および骨髄中で用いた場合
、正常細胞に非特異的に結合する問題を起こすことなく特異標的細胞を、診断の
ために検出することである。換言すれば、多数の細胞を顕微鏡で容易に選別する
ことができかつ操作が迅速で簡単な、各種細胞型の高感度検出法である。さらに
本発明の方法は、細胞−粒子複合体を分解する必要なしに、細胞を培養後、生化
学、生物学および免疫学の試験を行うためおよびヌクレオチドまたはタンパク質
のレベルで特異的な遺伝子を試験するため細胞を分離するのに用いることができ
る。本発明の他の目的は本願の特許請求の範囲に特定されている方法を実施する
のに用いるキットを提供することである。
本発明の目的は、本願の特許請求の範囲に特定されている方法とキットとによ
って達成される。
混合細胞集団および細胞集団含有生理学的溶液中の標的細胞の免
疫磁気検出を行う本発明の方法は、特定のタイプの正常細胞と病原細胞との両者
を検出するのに適しているだけでなく、両者の積極的分離を行うのにも用いるこ
とができる。本発明の方法によれば、特異的な標的細胞と常磁性粒子（一つもし
くは二つの成分で構成されている）のような不溶性支持体との結合が形成される
。この粒子は、必要な標的細胞の膜中の特異的抗原決定基に対するマウスもしく
はヒト起源の抗細胞抗体でコートされるか、またはこの粒子は標的細胞の膜の抗
原決定基に対する特異的抗細胞抗体のFc部分に結合できるポリクローナルの抗マ
ウス抗体もしくは抗ヒト抗体でコートされる。この粒子をコートするためにポリ
クローナルの抗マウス抗体／抗ヒト抗体を使用する代わりに、モノクローナルの
ラット抗マウス／抗ヒト抗体を使用することができる。この最後の抗体は、部分
的にモノクローナル起源であるため、抗細胞抗体と一層特異的に結合するので、
血液のような溶液中で他の細胞と交差反応を起こす危険性が減少する。さらに、
細胞懸濁液を、緩和な界面活性剤および／または目視可能にする蛍光剤類、金属
コロイド類（metallocolloids）、放射性同位元素類、ビオチン複合体類もしく
はある種の酵素類で予め標識をつけてあるかつけてない抗体類もしくは抗体フラ
グメント類の第二のセットとともにインキュベートするとこの方法の特異性が劇
的に増大する。
以下に、検出および分離を行う標的細胞として癌細胞を用いて本発明を詳しく
説明する。しかし本発明の方法は癌細胞に限定されず、かつその開示事項はこの
特定の使用分野に本発明の方法を限定するものではない。本発明の方法は広く細
胞学の研究に適しているからである。
癌患者を管理する場合、癌が局在しているかどうか、または転移拡散が他の組
織に起こっているかどうかについて疾患の病期分類を
行うことが、個々の患者に対して治療法を選ぶ場合に最も重要である。悪性細胞
は、リンパ管を経由して周囲の組織中に直接侵入するかまたは血液中の腫瘍細胞
が骨髄および中枢神経系および脳脊髄液を含む遠隔臓器に分散することによって
広がる。
転移腫瘍細胞の検出は、最近まで、生検用に採取した腫瘍試料、骨髄および末
梢血液の塗抹標本および各種の体液をサイトセントリヒューゲーション（cytose
ntrifugation）に付した後作製したスライドガラス上の試料に対して光学顕微鏡
と電子顕微鏡を用いて行う形態学的方法によって行われてきた。抗原を認識する
モノクローナル抗体は主として、異なるタイプの悪性細胞の表面に出現するので
、転移細胞の同定には、免疫細胞化学と免疫蛍光との使用が増大している。した
がって、生検用に採取した腫瘍またはサイトセントリヒューゲート（cytosentri
fugate）から作製したスライドガラス上の試料をモノクローナル抗体で処理して
、これら抗体と腫瘍細胞との結合を着色もしくは蛍光によって目視可能にする。
後者の蛍光による方法の場合、蛍光顕微鏡を使用する必要があり、あるいは細胞
懸濁液を作製して流動細胞測定器を使用する。
従来の方法は感度および／または特異性か限定され、通常面倒でかつ時間がか
かりまた高度の熟練が必要である。また流動細胞測定法には高価な装置が付随し
ている。
血液および骨髄中の腫瘍細胞を検出する形態学方法は、免疫細胞化学法および
免疫蛍光法を用いる方法より感度がはるかに低い（Be-iskeら，Am．J．Patholog
y，141巻３号，1992年９月）。しかし後者の方法は、腫瘍細胞が有核細胞の合計
数の１％より少ない場合には不充分である。流動細胞測定法は、顕微鏡を使用す
る方法より感度が優れているが多数の細胞を入手できることが必要であり、また
いくつかの技術的に難しい点がある。すなわち、細胞が凝集して問
題を起こすことがあり、そしてこの方法は標識をつけた腫瘍細胞と非特異的に蛍
光を発する正常細胞とを識別することができない。
本発明の方法は、多数の細胞を顕微鏡で容易に選別することができかつ結合さ
れた磁気ビーズは容易に認識できるので、例えば転移腫瘍細胞を非常な高感度で
検出することができる。使用されるモノクローナル抗体は、例えば腫瘍細胞と充
分な特異性で結合するが、血液、骨髄のような混合細胞懸濁液中に存在し他の腫
瘍徴候を示す、標的細胞以外の細胞には結合せず、結合したビーズを有する細胞
はすべて標的細胞である。その上、その手順は迅速かつ簡単に行うことができし
かも従来の顕微鏡を使っていずれの研究者でも実行できる。
本発明の新規な方法では、腫瘍細胞に存在するが、問題の正常細胞もしくは他
の目的のための正常細胞の特定の分集団には存在しない抗原を特異的に認識する
例えばマウスもしくはヒト起源のモノクローナル抗体を、常磁性粒子に直接結合
させるか、または腫瘍細胞に結合するそれぞれの抗体もしくはIgG抗体のFc部分
を特異的に認識する抗体で予め覆ったビーズに結合させる。細胞に結合する抗体
はIgG型もしくはIgM型でありまたはablgGもしくはIgMである。使用される抗標的
細胞抗体の例としては、抗パン・ヒト抗体（Brulandら、未刊行；動物細胞中の
ヒト細胞を検出するのに適している）に加えて、抗原決定基の群、例えばCD56/N
CAM抗原（MOC−１）、クラスター２上皮抗原（MOC−31）、クラスター２（MW＝
約40KD）抗原（NrLu10）（Myklebustら，Br． J． Cancer Suppl.，63巻、49〜5
3頁、1991年）、HMW黒色腫関連抗原（9.2，27）（Morganら，Hybridoma，１巻、
27〜36頁、1981年）、80KDの肉腫関連抗原（TP1およびTP3）（Can-cer Res.，48
巻、5302〜5309頁、1988年）、ムチン抗原類（Diel ら，Breast Cancer Res.Tre
atm.，1991年）またはEGF受容体抗原（425.3）
（Merck社）に対する抗体がある。上記の425.3抗体は正常および悪性の細胞の両
者の抗原に対する抗体である。抗体類としてはさらに、成長因子受容体、例えば
EGF受容体、PDGF（ＡとＢ）受容体、インシュリン受容体、インシュリン様受容
体、トランスフェリン受容体、NGFおよびFGFの受容体、インテグリン類の群、他
の接着膜分子類および正常細胞と異常細胞の両者のMDRタンパク質、ならびに正
常細胞と悪性細胞および悪性細胞の膜および悪性細胞にのみ発現される癌産生物
例えばNeu/erb B2/HER2に加えて正常細胞の分集団に存在する抗原に対する抗体
がある。悪性細胞としては、乳癌、卵巣癌および肺癌の細胞、黒色腫、肉腫、グ
リア芽細胞腫、胃腸器官および網内系の癌細胞があり、または標的細胞は、非新
生物性疾患例えば心臓血管、神経、肺、自己免疫、胃腸、尿生殖器、網内系など
の疾患に関連する細胞と関連している。さらに悪性細胞集団は、骨髄、末梢血液
中に存在している場合があり、胸水および腹腔液および他の体液区分例えば尿、
脳脊髄液、精液、リンパ液由来のものがあり、または正常な組織もしくは臓器例
えば肝臓、リンパ節、脾臓、肺臓、膵臓、骨組織、中枢神経系、前立腺、皮膚お
よび粘膜の充実性腫瘍由来のものがある。本発明の方法に用いる抗原決定基およ
び対応する抗体または抗体フラグメントのより完全な一覧表を表１に示す。
本発明の方法では抗体を常磁性粒子に直接結合させることからなり、またはそ
の結合は例えばポリクローナル抗マウス抗体類、モノクローナルラット抗マウス
抗体またはモノクローナル抗ヒト抗体のような、前記の個々の抗体のFc部分を特
異的に認識する表面結合抗体（surface-bound antibody）に結合させることによ
って行うことができる。抗体で被覆された常磁性ビーズを次に被検細胞の懸濁液
と混合し、次いでゆるやかに回転させながら、０〜25℃好ましくは４℃で５〜10
分間乃至２時間好ましくは30分間インキュベートする。
また本発明の方法は、遊離の標的細胞の抗体を細胞懸濁液に添加し、ゆるやかに
回転しながら０〜20℃好ましくは４℃で５〜10分間乃至２時間好ましくは30分間
インキュベートし、ステップの順序を変更して実施してもよい。次に抗マウス抗
体または抗ヒト抗体で予めコートした常磁性粒子を先に述べたのと同様にして上
記のインキュベートした細胞懸濁液に添加し、得られた懸濁液をさらに、ゆるや
かに撹拌しながら０〜25℃好ましくは４℃で５〜10分間乃至２時間好ましくは30
分間インキュベートする。
次に細胞懸濁液の試料を細胞計数装置に移し、結合ビーズを有する細胞の細胞
全数に対する割合を光学顕微鏡で測定した。細胞懸濁液に添加される、抗体でコ
ートされたビーズの数は標的細胞の数の0.5〜10倍でなければならない。標的細
胞の数が不明の場合、添加される被覆ビーズの量は細胞全数の１〜10％でなけれ
ばならない。
特定の場合、および標的細胞の密度が低い場合例えば悪性細胞もしくは標的細
胞の細胞全数に対する割合が非常に低い場合（≦１％）標的細胞は、磁場内で非
標的細胞から積極的に分離することができる。次にこの分離された標的細胞は顕
微鏡で数えることができ、次いで最初の細胞懸濁液中の細胞合計数に対する標的
細胞の割合を計算することができる。さらにその標的細胞は特異的な化学上およ
び生物学上の特徴について特性を決定することができる。特に重要なことは、分
子生物学の研究に上記の細胞を使うことである。本発明の方法は、従来技術の上
記の方法とは著しく異なり、常磁性粒子−標的細胞の結合を切断することなく、
標的細胞を研究し増殖させることができる。いくつもの目的のために、腫瘍生検
試料中、ならびに血液、骨髄および他の体液例えば尿、脳脊髄液、精液、リンパ
液中に存在する腫瘍細胞中、または他の正常な組織と臓器例えは肝臓、リンパ節
、脾臓、肺臓、膵臓、骨組織、中枢神経系、前立腺、皮膚
および粘膜由来のおよび細胞学上の研究活動の他の分野での標的細胞の純集団の
特異的遺伝子をDNA、mRNAおよびタンパク質のレベルで試験することが重要であ
る。
従来技術の方法では、サザーンブロット、ノーザンブロットおよびウエスタン
ブロット法で得られるシグナルは、その生検試料中の正常細胞と腫瘍細胞を示す
。単個細胞懸濁液を腫瘍物質から最初に調製し、次いでその腫瘍細胞を免疫磁気
的に積極的に検出して分離すれば、この物質について行われる遺伝子の試験結果
は標的細胞だけを示す。またこの方法は例えば哺乳類の組織中に存在する悪性細
胞、例えば骨髄、末梢血液、胸水、腹腔水および他の体液例えば尿、脳脊髄液、
精液およびリンパ液中の悪性細胞にも適応している。ポリメラーゼ連鎖反応（PC
R）法による試験も、本発明の新しい方法で得た純粋の腫瘍細胞集団について実
施すると特異性と信頼性とが向上する。
本発明の新しい方法のステップの適用法は被検組織の種類によって異なってい
る。
a)充実性腫瘍の生検もしくは腫瘍の針生検由来の組織を機械的に処理するか、
またはゆるやかに酵素で処理して単個細胞懸濁液を調製し、その懸濁液に、一次
の特異的抗体もしくは抗体フラグメントを、直接添加するか、またはリン酸、緩
衝食塩水もしくは例えばウシ胎児血清、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギもしくはヒトの
血清のごとき血清を含有もしくは含有しない培地で細胞懸濁液を洗浄した後に添
加する。
b)材料が胸水もしくは腹水、脳脊髄液、尿、リンパ液または各種の形態の関節
炎にかかっている患者の関節の滲出液のような体液の試料の場合、特異的な抗体
または抗体フラグメントを試料に、直接添加するか、または試料中の細胞を遠心
分離し次いで再び懸濁させ
る前または後に、洗浄もしくは洗浄せずに遠心分離した後に添加する。
c)材料が血液または骨髄吸引液で構成されている場合、単核細胞の画分は、例
えばLymphoprepで勾配遠心分離し次いで洗浄し再懸濁し、適切な抗体または抗体
フラグメントを添加することによって分離される。
a)とb)の手順の条件は確立されており、以下に述べる成功した実験で得られた
結果で例証されている。
c)の方法については、試験結果は、詳細に試験された多数の因子によって影響
を受けることが見出された。これらの因子としては、抗体の濃度、常磁性粒子数
：細胞の数の比率、インキュベーションの時間と容積、インキュベーション培地
の種類およびpHのレベルがある。全試験における粒子：単核細胞の比率は、一次
の特異的抗体もしくはフラグメントの結合アフィニティーによって0.5/1〜2/1の
範囲内でなければならない。
主な問題点は、ヤギもしくはラットの抗マウス抗体だけで、またはさらに特異
的抗体でコートされた粒子が、正常な血液または骨髄の細胞に非特異的に結合す
ることであった。試験の結果は、非特異的結合は特異的抗体が存在しない場合に
等しく高いことを示した。このことは、上記問題が起こるのはターゲティング抗
体の正常細胞に対する交差反応性が原因ではないことを示している。最適の場合
より低い特異性がイオン結合で起こる可能性は除かれた。他の可能性は、Ｂ系統
の正常細胞の分集団が粒子−抗体複合体に粘着するかもしれないという可能性で
ある。しかし、特異的抗体／抗体−粒子複合体を添加する前に細胞懸濁液からＢ
細胞を免疫磁気的に除去しても、特異的抗体／抗体−粒子複合体の特異性は改善
されなかった。
骨髄および末梢血液の分離された単核画分に用いた手順に付随す
る問題点すなわちいくらかの非標的細胞も常磁性粒子を捕捉するかもしれないと
いう問題点は回避されるかまたは克服された。すなわち、ヒツジ抗マウス抗体で
コートした粒子のみまたは特異的抗体によって、低画分の血液もしくは骨髄の単
核細胞に非特異的に結合した粒子の数は平均して10から約１まで減少し、そして
粒子を有する正常細胞の画分は平行して１〜２％から0.5〜１％以下まで減少し
た。
上記問題点が常磁性粒子に結合した抗体に関連する疎水力（hydro-phobic for
ce）によって起こる証拠が得られた。したがって本願ではこの疎水性を減少させ
る方法の特許を請求するものである。この方法の一つは、抗体でコートされた粒
子と細胞懸濁液を適切な濃度の緩和な界面活性剤、例えば0.1％より低い濃度のT
ween 20とともに40℃にて30分間プレインキュベートする方法である。標的細胞
の選択が保証できるならば、細胞懸濁液が含有する界面活性剤の濃度は例えば0.
01％のTween 20のような低い濃度でなければならない。いくつもの試験において
、この手順で行った場合、血液もしくは骨髄由来の単核細胞画分にみられる非特
異的結合の問題はほとんど消失するかまたは劇的に減少した。
他の改良法は、改良が保証されることが分かったならば、下記のように界面活
性剤のステップとともに利用できる。
一次の抗体もしくは抗体フラグメントおよび抗体でコートされた常磁性粒子と
ともに細胞懸濁液のインキュベーションを先に述べたように行ってから、その細
胞懸濁液を、標的細胞の他の細胞外決定因子もしくは細胞内決定因子に対する抗
体もしくは抗体フラグメントの第二のセットとともに、ホルムアルデヒドまたは
アルコール類のような細胞固定液によって前処理するかまたはせずにインキュベ
ートする。これらの抗体もしくはそのフラグメントは、蛍光剤類、
金属コロイド類、放射性同位元素類、ビオチン複合体類、またはペルオキシダー
ゼおよびアルカリホスファターゼのような酵素類で予め標識を付けて、それ自体
公知の方法で、顕微鏡および／または適切な計数装置で目視可能にしなければな
らない。
標的細胞は後者の方法で目視可能になるとともにその表面に粒子を捕捉するの
で、数えることができる。
非標的細胞と標的細胞との区別を簡単にするため、細胞懸濁液を、第二の目視
化ステップを行う前に、細胞スピン遠心分離にかけるか、または懸濁液の一部を
、粒子に捕捉された細胞が薄層で広げられている被覆スライドガラスに付着させ
て、二重に“ステインされた（stained）”細胞を認識し易くすることができる
。
本発明の新しい手順で使用するため、キットには、例えば各モノクローナル抗
体について調製した、予めコートされた常磁性粒子が入っている。他の実施態様
では、キットに、その一部分として、IgGイソタイプ特異的の抗マウス抗体もし
くは抗ヒト抗体で予めコートされた常磁性粒子が入っており、および他の部分と
して異なる標的細胞例えば腫瘍細胞関連の抗体が入っている。第三の実施態様で
は、特異的抗標的細胞抗体に捕捉された標的細胞関連抗体のFc部分に結合できる
ポリクローナル抗マウス抗体、またはモノクローナルのラット抗マウス抗体、ま
たは抗マウス抗体もしくは抗ヒト抗体のような特異的抗Fc抗体で予めコートされ
た常磁性粒子がキットに入っている。さらに別の実施態様では、所望の標的細胞
内もしくは該細胞上の抗原／受容体に対する他の特異的抗体または抗体フラグメ
ントがキットに入っており、前記の抗体または抗体フラグメントは、ペルオキシ
ダーゼ、アルカリホスファターゼなどの酵素に対しこれら酵素の関連基質ととも
に接合されているか、または前記抗体または抗体フラグメントは、特定の色を有
するかまたはペルオキシダーゼ
およびアルカリホスファターゼのような結合した酵素を有する非常磁性粒子に結
合されている。
本発明の方法を、モデル実験、本発明の新しい方法の有用性を示す実施例およ
び実験の用途の実施例によって以下に説明する。これらの実施例はいかなる場合
でも本発明を限定しない。
モデル実験：
1. 本発明の新しい手順による、抗体−ビーズ複合体の腫瘍細胞系との結合
抗体−常磁性粒子複合体を腫瘍細胞に結合させる場合の抗体濃度と最適条件を
決定するため、大パネルの癌細胞系を用いた。常磁性ビーズは、ヒツジ抗マウス
抗体(SAM)でコートした常磁性粒子に特異的抗体をコートするか、またはまず細
胞を特異的抗体とともにインキュベートし、洗浄し続いてSAMでコートされた粒
子とともに第二のインキュベーションを行うことによって、細胞に結合される。
これらの試験の結果を表2aと2bに示す。これらの表において＋印はいくつものヒ
ーズがすべての細胞に結合していることを示し、（＋）印は少数のビーズが各細
胞に結合しているかまたはすべての腫瘍細胞ではないがその表面にビーズが結合
していることを示し、−印は全く結合がないことを示し、および（−）印は非常
に弱い結合を示す。
2. 骨髄または末梢血液の単核画分中の腫瘍細胞を検出するため、次のようなモ
デル実験を行った。すなわち特異的抗体とＳＡＭでコートした常磁性粒子を、前
記単核細胞または細胞懸濁液に加えた。なおその場合生体外で培養した細胞系由
来の各種の数の癌細胞を前記単核細胞に添加した。いくつかの実験では、単核細
胞または悪性細胞は、２種の細胞を区別できるように蛍光染料で予めステインし
た。すべての実験で非結合一次抗体および／またはヒツジ抗マウス抗体
でコートしたビーズを別個に対照として使用した。
いくつもの試験で、単核細胞に対するいくつかの非特異的結合が観察された。
この現象は特異的抗体の種類には無関係であることが分かり、SAMでコートされ
た粒子の場合にのみ等しく顕著であった。この非特異的結合の程度はほとんどゼ
ロから0.5〜２％のレベルまで変動した。この非特異的結合は、疎水性細胞の相
互作用の問題を減らすために実施した界面活性剤（Tween 20）によるゆるやかな
処理によってほとんど消失した。
本発明の新しい手順の有用性を示す実施例
１．血液および骨髄の微小転移新生物疾患の検出
血液および／または骨髄への癌細胞の拡散の信頼の高い早期診断を行うことは
、応用例の実施例１に記載されているように、癌腫を含む多くのタイプの癌を治
療できる最適の治療法を選択するのにますます重要になっている。悪性黒色腫、
肉腫、神経芽腫およびその他のいくつかの癌に対する類似の方法が確立されたか
または開発中である。
２．胸水もしくは腹腔水中および尿中の悪性細胞の検出
上記の滲出液の性質は、特に、少数の癌細胞が正常な反応性細胞または上皮細
胞とともに存在しているときに重大な診断上の問題を示す。従来の細胞学的試験
法では陰性であるか結論を出せなかった症例中、いくつかの症例で、本発明の新
しい方法を用いて的確な診断が迅速に行われた。腎臓または尿路と膀胱の癌の症
例でも類似の利点が見られた。
３．脳脊髄液中の新生物細胞の検出
多くのタイプの癌の全身治療法が改善されたので、症状を示す(symptom-givin
g)脳転移を有する症例の頻度が著しく増大し、これに平行してこのような拡散を
早期に検出することが必要になった。本発明の新しい方法を使用すれば、少数の
悪性細胞でも容易に同定
できるので、頭蓋内腫瘍の徴候の早期段階で治療法を選択して治療できる。
４．生検用に採取した組織中の癌の診断
癌の疑いがあり、外科的方法または例えは針生検によって組織の生検試料が得
られる場合、調製された細胞懸濁液に対して本発明の新しい方法を用いれば、従
来の免疫学的方法もしくは免疫組織学的方法もしくは細胞化学的方法に比べては
るかに簡単でかつ迅速な診断を行うことができる。
いくつかの種類の癌の区別は適切な抗体を用いることによって行うことができ
る。
５．予後の指標の同定
いくつもの膜分子の発現は、いくつもの癌の悪性疾患の進行と相関関係がある
ことが分かったので、本発明の方法は、例えば応用例の実施例２に記載されてい
るように予後の指標を同定するのに使用できる。
６．特定の疾患または疾患の進行もしくは状態を示す細胞の同定
各種のリユーマチ性疾患（例えばリユーマチ性関節炎）ならびにアレルギー性
、自己免疫性および心臓血管の疾患において、細胞の特異的分集団がが全身に存
在しているか局在しているかの同定は、診断および病期の決定を行うのに重要で
ある。したがって上記の細胞集団を本発明の方法で迅速に検出することは診断と
治療との面で極めて重要である。
７．正常細胞の分集団の検出
いくつかの目的のため、集団中の正常細胞の特定の分集団の画分を検出するこ
とが重要である。このことは例えば胆管上皮抗原を発現する細胞の同定が大切で
ある肝臓の生検に当てはまる。同様に、種々の正常な組織から調製した細胞懸濁
液由来の特異的上皮細胞の
同定と分離とが保証される。
上記１〜６章に挙げた細胞膜分子のいくつかは、いく種類もの活性化されたキ
ラー細胞または例えば免疫毒素に対する免疫療法に用いる標的としても用いるこ
とができる。それ故に、上記の分子の発現を本発明の新しい方法で同定すること
も、上記の種類の治療を用いなければならない症例を決定するのに価値がある。本発明の実用例の実施例 実施例１
血液および／または骨髄への癌細胞の拡散を早い段階で診断するために、本発
明の新しい方法に、MOC-31、NrLu10、BM2、BM7、12H12およびMLuC1の抗癌腫抗体
を用いて、乳癌、肺癌、結腸直腸癌および前立腺癌由来の微小転移疾患が上記体
液中で高感度に同定できるか否かを決定した。これらの抗体を用いた結果成功し
たがこれは臨床上重要な意味がある。実施例２
いくつもの細胞膜分子の発現は幾種類もの癌の悪性疾患の進行と相関関係があ
ることが分かった。したがって、かような抗体のそれぞれの抗体との結合を検出
することは高い予後価(high prognosticvalue)の情報を得るために使用できる。
このような抗原の中には、以下に列挙する多数の接着性分子、炭水化物抗原、糖
脂質、成長因子受容体、および癌腫マーカーがある。本発明の新しい方法によっ
て、粒子−抗体複合体と次のものすなわちCD44変異体、Ｅ-カドヘリン、LeY、CE
A、EGF-r、トランスフェリン受容体、MUC-1エピトープ、LUBCRU-G7 エピトープ
、前立腺癌抗原、UJ13A エピトープ、β2−ミクログロブリン、HLA-抗原および
細胞消滅受容体との結合を同定した。実施例３
悪性黒色腫にかかっていると考えられる患者から２ｌの胸水拡散液を得た。遠
心分離を行った後、10％のウシ胎児血清を含有するRPMI２ｍｌの容積中に細胞を
懸濁させ、9.2.27抗黒色腫抗体(10μｇ/ｍｌ)とともに４℃で30分間インキュベ
ートし、洗浄し、Dynabeads SAMM450/IgG2Aとともに４℃で30分間再びインキュ
ベートした。次にその細胞懸濁液を顕微鏡で試験してその表面に常磁性細胞が結
合している細胞の画分を測定した。約10％の細胞が有意な数の粒子ロゼットをも
っていたとき、悪性黒色腫の診断を確認した。実施例４
小細胞肺癌もしくは悪性黒色腫の臨床指標を有する症例の皮下腫瘍から生検組
織を得た。その生検試料から単個細胞懸濁液を調製し、二つの画分に分割し、一
方を9.2.27抗黒色腫抗体とともにインキュベートし、他方をMOC-31抗癌腫抗体と
ともにインキュベートした(両方ともに10μｇ/ｍｌ）。このインキュベーション
は上記実施例で利用したのと類似している。黒色腫抗体とともにインキュベート
した細胞はビーズを全く捕捉しなかったが、MOC-31とともにインキュベートした
すべての腫瘍細胞は陽性であった。実施例５
悪性黒色腫をもっている疑いがある患者から得た生検組織を、単個細胞懸濁液
を調製し、9.2.27抗黒色腫抗体とともにインキュベートし次いで上記手順にした
がって試験した。その細胞の大部分は陽性であり、多数の粒子−ロゼットが細胞
の膜に結合していた。実施例６
乳癌患者由来の胸水を、その液体中に腫瘍細胞を検出できるか否かを試験する
ために研究した。その液体１ｌを遠心分離し、得られた細胞を再懸濁させ、次に
別々のバイアルびん中で、３種の異なる各抗癌腫抗体(MOC-31、2E11、12H12)と
ともにインキュベートした。
前記実施例と同様に手順を完了した後、３例すべてでほとんどの細胞が抗体被覆
粒子に結合することが見出された。実施例７
乳癌患者から得た骨髄懸濁液を研究して、微小転移腫瘍細胞が存在しているか
否かを試験した。単核細胞を調製した後、この細胞を、上記実施例に使用したの
と同じ３種の抗癌腫抗体とともにインキュベートした。しかしこの場合、抗体は
まずDynabeads SAM IgM常磁性粒子に結合した。これらの直接コートされた粒子
と１回インキュベートした後、その細胞懸濁液を顕微鏡で検査し、多数の細胞が
陽性であることが見出され、多数の粒子−ロゼットが細胞の膜に結合していた。
同様の試験を、乳癌の患者由来の胸水もしくは腹腔水および骨髄のいくつかに
ついて実施した。実施例８
T47Dヒト乳癌細胞を、時間を変えてヘキスト社の蛍光塗料とともにインキュベ
ートし次いでその標識を付けた細胞の生存力を検査した。標識を付けた乳癌細胞
の数を変えて、健康なボランティアから得た１×１０6個の骨髄細胞に添加した
。異なる試験において、個々の抗癌腫抗体(NrLu10、MOC31または12H12)でコート
した常磁性の単分散粒子（Dynabeads P450）を異なる濃度で添加した。氷上で30
分間インキュベートした後、異なる試験管の試料を、計数チャンバー内で光学顕
微鏡と蛍光顕微鏡とを用いて試験した。腫瘍細胞／全有核細胞の比率が低かった
場合は、その細胞懸濁液を磁場にかけ、結合した粒子を有する細胞を分離し次い
で顕微鏡で検査した。細胞混合物中、１腫瘍細胞当たり１〜10の常磁性ビーズと
いう最適の比率では、すべての腫瘍細胞はその表面に２〜15個のビーズが結合さ
れていた。この検出法の感度は、１０4個の有核細胞当たり１個の標
的細胞に近かった。正常細胞に対していくらか交差反応を有することが分かって
いる抗体を用いて、標識をつけた腫瘍細胞で対照試験を行い、この交差反応性が
抗体でコートされた常磁性粒子にあることが確認された。腫瘍関連抗体のコーテ
ィングなしのビーズの試験ではとの標的細胞もビーズを全く捕捉しなかった。
他の乳癌系と小細胞肺癌細胞系の両者について類似の試験を行った。これらの
試験で類似の感度と特異性とが得られた。実施例９
乳癌および卵巣癌の患者由来の胸水と腹腔水とをセントリフューズ(sentrifug
ed)、実施例１で使用したのと同じ被覆常磁性粒子を添加し、インキュベートし
、次いで磁場内で濃縮し、そしてその懸濁液を光学顕微鏡で試験した。一般に、
腫瘍細胞の明らかな形態学的特徴を有する細胞にはビーズが結合しており、一方
少数の正常細胞は、抗体でコートされたビーズを全く捕捉しなかった。胸水の二
つの例では、独立して形態学的試験をしたが腫瘍細胞は全く存在しなかったが、
一方抗体でコートしたビーズを用いることによってかなりの数の悪性細胞が検出
された。いくつかの場合に、腫瘍細胞を磁場内で分離し、乳癌細胞を増殖させる
ために特別に調製した増殖培地が入っている組織培養フラスコに移して、これら
の培養物から永久細胞系を樹立することを試みた。平行して悪性滲出液由来の細
胞を、磁性ビーズによる積極的選択なしで直接培養した。後者の場合、細胞系は
全く樹立できなかったが、積極的に選択された腫瘍細胞を用いた場合その50％以
上が細胞系の樹立に成功した。実施例10
いくつかの症例について、乳癌の患者から得た骨髄および末梢血液を、抗体で
コートされた常磁性ビーズを加え、４℃で30分間インキュベートし、次に磁界内
で濃縮し、そして光学顕微鏡で懸濁液を
試験することによって、本発明の方法で試験した。両方の場合、腫瘍細胞に対す
る常磁性ビーズの結合程度は、骨髄と血液中とで有核細胞の0.1〜１％であるこ
とが検出されたが、他のいかなる方法も細胞を検出できなかった。実施例11
特異的細胞集団の表面に発現された特定の成長因子受容体または他の遺伝子産
物に対する抗体を用いて、これらの細胞を同定し次いで積極的に選択することが
できる。本発明の新規な方法で、抗トランスフェリン受容体抗体でコートしたビ
ーズを用いたところ、本発明の方法は、トランスフェリン受容体を発現する細胞
を同定する迅速で簡単な高感度の方法であることが分かった。実施例12
各種の目的のため、正常細胞の特異的集団を分離することを保証する。正常組
織または腫瘍組織中の毛細血管もしくは小血管の内側を覆う内皮細胞は、関連組
織から調製した細胞懸濁液から積極的に選択することができた。この方法では該
内皮細胞上では発現されるが細胞混合物の他の正常細胞上では発現されない構造
に対する抗体でコートしたビーズを用いた。実施例13
免疫不全のげっ歯動物に注射されたヒト細胞は、抗パンヒト抗体でコートした
磁性粒子を用いることによって、腫瘍異種移植片および各種の宿主の臓器／組織
から調製した細胞懸濁液中に存在していることが分かった。
【手続補正書】特許法第１８４条の８
【提出日】１９９４年８月２６日
【補正内容】
請求の範囲
1. 混合細胞集団の細胞懸濁液および混合細胞集団を含有する流体系、ならび
に充実性組織から調製した単個細胞懸濁液の中の特異標的細胞を検出する方法で
あって、以下のステップ：
1.1． ａ)細胞混合物中で標的細胞上に特異的に発現されるが非標的細胞上で
は発現されない膜構造物に対する抗体類もしくは抗体フラグメント類またはｂ)
膜構造物に対する前記抗体類のFc部分に結合し得る抗体類、好ましくはポリクロ
ーナル抗マウス抗体もしくはモノクローナルラット抗マウス抗体もしくは抗ヒト
抗体で、それ自体公知の方法により、常磁性の粒子もしくはビーズをコートし、
次いで
1.2.1. 前記粒子もしくはビーズに結合されているか、または標的関連抗体の
FC部分を認識する抗マウス抗体もしくは抗ヒト抗体で予めコートしたビーズに結
合されている標的細胞関連抗体（マウスまたはヒト）を、標的細胞を含有する細
胞懸濁液と混合するか、または
1.2.2. 遊離した標的細胞関連抗体を、標的細胞を含有する細胞懸濁液と混
合し、この混合物を５〜10分間乃至２時間好ましくは30分間、０℃〜20℃の温度
好ましくは４℃でゆるやかに回転しながらインキュベートし、次に
1.3. 細胞懸濁液、および常磁性粒子もしくはビーズ(1.2.1.)または標的関
連抗体のFc部分を認識する抗マウス抗体もしくは抗ヒト抗体で予めコートされた
常磁性粒子もしくはビーズに結合されたかインキュベートされた遊離標的関連抗
体と細胞懸濁液との混合物(1.2.2.)に結合された遊離標的関連抗体の混合物をイ
ンキュベートし、次いで０℃〜25℃好ましくは４℃の温度で５〜10分間乃至２
時間好ましくは30分間ゆるやかに回転しながらインキュベートし、および
1.4.1. 標的細胞集団が血液もしくは骨髄の吸引液中に含有されている場合は
、抗体でコートされた粒子と細胞懸濁液を、適切な濃度の緩和な界面活性剤例え
ば0.1％未満の濃度のTween20（登録商標）とともに４℃にて30分間予めインキュ
ベートすることによって、抗体でコートされた粒子に関係する疎水力を低減し、
および／または
1.4.2. ホルマリン、アルコールまたは他の固定液で処理しないかまたは前処
理された細胞懸濁液を、標的細胞中に存在する細胞外もしくは細胞内の分子に結
合する他の抗体もしくは抗体フラグメントとともにインキュベートすることによ
って、そして使用される抗体は、関連基質を添加しインキュベートすることによ
り、その結合を目視可能にできるペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼま
たはその他の酵素で予め標識を付けるか、または
1.4.3. 抗体フラグメントはビオチニル化され、その結合は、ペルオキシダー
ゼ、アルカリホスファターゼまたは他の酵素と複合させたアビジンを添加しイン
キュベートし、関連基質を添加しインキュベートすることによって目視可能にな
り、または
1.5.1. 標的細胞の密度が低いかまたは細胞混合物中の標的細胞／全細胞の比
率が低い（≦１％）場合は、インキュベートされた常磁性粒子−細胞混合物(1.3
.)に磁場をかけ、次いで顕微鏡および／または適切な細胞／粒子計数装置を用い
て、細胞懸濁液中のステインされたかまたは未ステインの粒子−標的細胞複合体
を検査して計数し、または
1.5.2. 常磁性粒子、抗体および細胞混合物のインキュベートされた混合物(1
.3.)中の標的細胞を試験して計数し、抗体もしくは抗体フラグメントが、色のた
めに直接目視可能になるかもしくは酵素
の活性化で目視可能になる非常時磁性粒子に接合されている場合、細胞懸濁液中
の標的細胞／全細胞の比率が適切である（＞１％）とき、顕微鏡および／または
適切な細胞／粒子計数装置を用いる、
を有することを特徴とする改良方法。
2. 正常な生存細胞、例えば肝実質細胞、クッペル細胞、肺臓の内皮細胞タイ
プ１と２およびクララ細胞、特定の臓器の内皮細胞、膵臓の外分泌細胞と内分泌
細胞、腎臓の細管細胞、膀胱の上皮細胞、脳のグリア細胞と上衣細胞、膀胱と前
立腺の上皮細胞、気道の線毛細胞、胃腸管の粘膜細胞の異なる分集団、下垂体細
胞、および各種のホルモン産生器官の他の内分泌細胞の中の抗原に対する抗体ま
たはそのフラグメントを用いることを特徴とする請求項１記載の方法。
3. 正常細胞の分集団上に存在する抗原および正常組織細胞の膜上で発現され
る腫瘍遺伝子産物に対して反応性の抗体を、前記標的細胞抗体として使用するこ
とを特徴とする前述の請求項の何れか１つに記載の方法。
4. 正常細胞の膜上の成長因子受容体類、例えばEGF受容体、PDGF（Ａおよび
Ｂ）受容体、インシュリン受容体、インシュリン様受容体、トランスファリン受
容体、NGFとFGFの受容体に対する抗体を、前記の積極的に選択する抗体として使
用することを特徴とする前述の請求項の何れか１つに記載の方法。
5. インテグリン類と、他の接着性膜分子の群、および正常細胞中のMDRタン
パク質類に対する抗体を用いることを特徴とする前述の請求項の何れか１つに記
載の方法。
6. 異常な発育パターンを有する細胞、好ましくは例えば原発および転移の癌
細胞の中の抗原もしくは受容体に対する抗体もしくはそのフラグメントを用いる
ことを特徴とする前述の請求項の何れか１つに記載の方法。
7. IgGのイソタイプ、またはＦ(ab′)2もしくはＦ(ab)のフラグメント、また
はIgMもしくはそのフラグメントの抗体を、前記標的細胞関連抗体として用いる
ことを特徴とする前述の請求項の何れか１つに記載の方法。
8. 哺乳動物の組織例えばヒトの骨髄と末梢血液を含む混合細胞集団から、胸
水と腹腔水および他の体液例えば尿、脳脊髄液、精液、リンパ液から、または正
常な組織と臓器例えば肝臓、リンパ節、脾臓、肺臓、膵臓、骨組織、中枢神経系
、前立腺、皮膚および粘膜から前記細胞懸濁液を調製することを特徴とする前述
の請求項の何れか１つに記載の方法。
9. 抗体もしくは抗体フラグメントが、抗原決定基の群、例えば明細書の表１
に列挙されたものに対する抗体もしくは抗体フラグメントであることを特徴とす
る前述の請求項の何れか１つに記載の方法。
10．悪性細胞の膜上に発現される成長因子受容体と腫瘍遺伝子産物、例えば明
細書の表１に列挙されているものに加えてインシュリン受容体、インシュリン様
受容体およびFGF受容体に対する抗体もしくは抗体フラグメントを、前記標的細
胞の抗体として用いることを特徴とする前述の請求項の何れか１つに記載の方法
。
11．インテグリン類と他の接着性膜分子の群および表１に列挙されている異常
細胞中のMDRタンパク質に対する抗体もしくは抗体フラグメントを用いることを
特徴とする前述の請求項の何れか１つに記載の方法。
12．用いられる抗体、抗体フラグメントまたはそれらの混合物が、明細書の表
１に列挙されている抗原決定基に該当することを特徴とする前述の請求項の何れ
か１つに記載の方法。
13．異常細胞、例えば乳癌、卵巣癌および肺癌の細胞、黒色腫、
肉腫、グリア芽細胞腫、胃腸管と尿生殖器官および網内系の癌細胞、および／ま
たは非新生物疾患、例えば心臓血管障害、神経障害、肺障害、自己免疫障害、胃
腸障害、尿生殖器障害、網内系障害などの障害に関連する標的細胞上に存在する
抗原と反応性の抗体を、前記抗体として用いることを特徴とする前述の請求項の
何れか１つに記載の方法。
14．標的細胞を分離するのに用いる、前述の請求項の何れか１つに記載の検出
方法の用途であって、細胞と常磁性粒子との複合体を磁場に暴露し、磁気で凝集
させて得た細胞をさらに、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)と逆転写酵素PCRとを含め
て特定の遺伝子のDNA、mRNAおよびタンパク質のレベルでの特性決定を含む生物
学的、生化学的および免疫学的試験に付す用途。
15．前述の請求項の何れか１つに記載の、特定の標的細胞の検出方法の用途で
あって、分離された常磁性粒子−標的細胞複合体から生体外細胞培養物を樹立す
るのに用いおよび／または好ましくは免疫不全動物に接種して前記動物内にヒト
の腫瘍異種移植片を樹立する用途。
16．1.所望の標的細胞上の抗原受容体に対する特異的抗体もしくは抗体フラグ
メントであって、その抗原結合性能を除かずに、含有されている常磁性粒子に結
合されるかもしくは結合されうる抗体もしくは抗体フラグメント、および／また
は
2.標的細胞関連抗体および特異的遊離標的細胞抗体のFc部分に結合できる、特
異的な抗Fc抗体類、好ましくはポリクローナル抗マウス抗体またはモノクローナ
ルラット抗マウス抗体または抗ヒト抗体で予めコートされた常磁性粒子、および
／または
3.特異的抗標的細胞抗体に結合された標的細胞関連抗体のFc部分に結合できる
、特異的抗Fc抗体類、好ましくはポリクローナル抗マ
ウス抗体もしくはモノクローナルラット抗マウス抗体もしくは抗ヒト抗体で予め
コートされた常磁性粒子、および／または
4. 所望の標的細胞内もしくは該細胞上の抗原／受容体に対する他の特異的抗
体または抗体フラグメントであって、ビオチン、ペルオキシダーゼ、アルカリホ
スファターゼまたは他の酵素に接合されているかまたは特定の色を有しているか
またはペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼのような酵素が結合して
いる非常磁性粒子に結合されている抗体または抗体フラグメント、
を有することを特徴とする前述の請求項の何れか１つに記載の方法を実施する
ためのキット。
【手続補正書】特許法第１８４条の８
【提出日】１９９４年８月２６日
【補正内容】
明細書
特殊細胞集団もしくは混合細胞集団および混合細胞集団を含有する溶液中の特異
標的細胞の検出方法
本発明は細胞集団および細胞集団の溶液中の特異標的細胞の免疫磁気的検出方
法(immunomagnetic method for detection)に関する。また本発明は、異なる細
胞集団に上記方法を実施するのに適したキットに関する。
生物学、生化学さらにその隣接科学分野には、化学物質が相互に関連した方法
に対する需要が多い。このような方法は、正常なおよび異常な細胞集団の両者に
ついて研究する場合により重要となる。特に固体の支持体を用いると、細胞は固
定され、検出され、分離されて精製することができる。さらに、細胞含有物は一
連の高性能の方法を用いて試験することができる。また細胞を生育可能な形態で
分離できることも重要である。
アフィニティー結合法は化学物質／生化学物質を連結する高性能の方法である
。この方法では、一対の結合パートナーは（例えば連結される物質に結合される
）接触させると互いに結合する。このような結合において結合パートナーの一方
は細胞表面の一分子によって表される。このような結合パートナー系の多くは公
知であり、例えば細胞における抗原−抗体、酵素−受容体、リガンド−受容体の
相互作用およびビオチン−アビジンの結合があるが、これらのなかで抗原−抗体
の結合が最も頻繁に使用される。ハプテン／抗ハプテン結合対法も最近提案され
ている(WO 91/01368)。
上記のような方法が特異的な細胞（その後の各種の試験に用いる被検体）を分
離するのに利用される場合、結合しているパートナー
に対して破壊作用を起こさずに結合を切断する必要があり、理想的には、結合パ
ートナーは元の状態に戻ったときにその機能を回復しなければならない。抗原／
抗抗原およびハプテン／抗ハプテンの結合を適正に切断する方法が提案されてい
るが(WO 91/15766，WO 91/01368)、上記のことは必ずしも実現されていない。
結合パートナーの一方が不溶性の支持体例えば常磁性粒子に結合されている方
法は公知であり、この方法によって混合細胞集団中の標的細胞の分離が消極的分
離もしくは積極的分離として実施される。消極的分離法では、不要な細胞は、不
要細胞に対して特異的な抗体でコートされた粒子とともに細胞とインキュベート
することによって細胞試料から除くことができる。インキュベートを行ってから
、細胞／抗体／粒子複合体は粒子を用いて除去し、必要な標的細胞を残すことが
できる。この結果は不満足な場合が多い。というのは、必要な細胞は多少は精製
されているが細胞集団中に残り、またこの分離法の目的は特異標的細胞について
試験しおよび／またはさらに研究することだからである。積極的分離を行うため
に粒子を使用する試みがなされている。この場合、必要な標的細胞が混合細胞集
団から取り出される。しかしこれらの方法はある種の標的細胞に用いられている
がすべての標的細胞系に対して適しているわけではない。ハプテン／抗ハプテン
結合系に関する積極的分離法が最近提案されており(WO 91/01368)、また骨髄か
ら造血前駆細胞を分離する方法も提案されている(WO 91/09938)。後者の方法は
、特異細胞すなわち造血前駆細胞を分離し骨髄中で増殖させるため、積極的なお
よび消極的な選択を組合わせて用い、粒子の取り出しによって行われる。
WO 91/01368には、ハプテン、抗ハプテン抗体類および抗細胞抗体類が互いに
結合する性能を利用して、不溶性支持体すなわち粒子と標的細胞との結合、すな
わち少なくともハプテンと抗ハプテン抗
体またはハプテンと抗ハプテン抗体および抗抗ハプテン抗体もしくは第二の抗細
胞抗体との組合わせからなる結合を形成させることによって、標的細胞を不溶性
支持体に連結する方法が記載されている。この複合体のその後の切断は、その複
合体をハプテンもしくはハプテン類似体に再び暴露することによって行われる。
したがって形成された結合にはーつ以上の成分に加えて常にハプテンを含有して
いる。この方法は、非特異的な標的細胞に関しおよび標的細胞の分離と不溶性支
持体の放出に関する。
非特異的なハプテン群の化合物を含有せず、また非特異的細胞との会合を最小
限にして特異標的細胞の検出を行って、不溶性支持体と特異標的細胞間の結合を
後で切断する必要をなくするような、標的細胞と不溶性支持体とを連結する簡単
な結合が要求されている。
WO 92/04961は、コロイド状の磁性粒子を用いて非磁性試験媒体から細胞又は
異なる分子を分離するための方法および複合化した装置を含んでいる。この方法
では、溶液内での粒子の沈殿を避けるためにまたその方法は複雑な分離過程を必
要とするので、小さな（サブミクロン）粒子が使用され、その分離過程で、磁界
を強める手段が試験媒体に作用する。これは細胞に反対の影響を及ぼす。
したがって本発明の目的は、特異的標細胞を血液中および骨髄中で用いた場合
、正常細胞に非特異的に結合する問題を起こすことなく特異標的細胞を、診断の
ために検出することである。換言すれば、多数の細胞を顕微鏡で容易に選別する
ことができかつ操作が迅速で簡単な、各種細胞型の高感度検出法である。さらに
本発明の方法は、細胞−粒子複合体を分解する必要なしに、細胞を培養後、生化
学、生物学および免疫学の試験を行うためおよびヌクレオチドまたはタンパク質
のレベルで特異的な遺伝子を試験するため細胞を分離するのに用いることができ
る。本発明の他の目的は本願の特許請求の範
囲に特定されている方法を実施するのに用いるキットを提供することである。
本発明の目的は、本願の特許請求の範囲に特定されている方法とキットとによ
って達成される。
混合細胞集団および細胞集団含有生理学的溶液中の標的細胞の免疫磁気検出を
行う本発明の方法は、特定のタイプの正常細胞と病原細胞との両者を検出するの
に適しているだけでなく、両者の積極的分離を行うのにも用いることができる。
本発明の方法によれば、特異的な標的細胞と常磁性粒子（一つもしくは二つの成
分で構成されている）のような不溶性支持体との結合が形成される。この粒子は
、必要な標的細胞の膜中の特異的抗原決定基に対するマウスもしくはヒト起源の
抗細胞抗体でコートされるか、またはこの粒子は標的細胞の膜の抗原決定基に対
する特異的抗細胞抗体のFc部分に結合できるポリクローナルの抗マウス抗体もし
くは抗ヒト抗体でコートされる。この粒子をコートするためにポリクローナルの
抗マウス抗体／抗ヒト抗体を使用する代わりに、モノクローナルのラット抗マウ
ス／抗ヒト抗体を使用することができる。この最後の抗体は、部分的にモノクロ
ーナル起源であるため、抗細胞抗体と一層特異的に結合するので、血液のような
溶液中で他の細胞と交差反応を起こす危険性が減少する。さらに、細胞懸濁液を
、緩和な界面活性剤および／または目視可能にする蛍光剤類、金属コロイド類(m
etallocolloids)、放射性同位元素類、ビオチン複合体類もしくはある種の酵素
類で予め標識をつけてあるかつけてない抗体類もしくは抗体フラグメント類の第
二のセットとともにインキュベートするとこの方法の特異性か劇的に増大する。
以下に、検出および分離を行う標的細胞として癌細胞を用いて本発明を詳しく
説明する。しかし本発明の方法は癌細胞に限定されず、
かつその開示事項はこの特定の使用分野に本発明の方法を限定するものではない
。本発明の方法は広く細胞学の研究に適しているからである。
癌患者を管理する場合、癌が局在しているかどうか、または転移拡散が他の組
織に起こっているかどうかについて疾患の病期分類を行うことが、個々の患者に
対して治療法を選ぶ場合に最も重要である。悪性細胞は、リンパ管を経由して周
囲の組織中に直接侵入するかまたは血液中の腫瘍細胞が骨髄および中枢神経系お
よび脳脊髄液を含む遠隔臓器に分散することによって広がる。
転移腫瘍細胞の検出は、最近まで、生検用に採取した腫瘍試料、骨髄および末
梢血液の塗抹標本および各種の体液をサイトセントリヒューゲーション(cytosen
trifugation)に付した後作製したスライドガラス上の試料に対して光学顕微鏡と
電子顕微鏡を用いて行う形態学的方法によって行われてきた。抗原を認識するモ
ノクローナル抗体は主として、異なるタイプの悪性細胞の表面に出現するので、
転移細胞の同定には、免疫細胞化学と免疫蛍光との使用が増大している。したが
って、生検用に採取した腫瘍またはサイトセントリヒューゲート(cytosentrifug
ate)から作製したスライドガラス上の試料をモノクローナル抗体で処理して、こ
れら抗体と腫瘍細胞との結合を着色もしくは蛍光によって目視可能にする。後者
の蛍光による方法の場合、蛍光顕微鏡を使用する必要があり、あるいは細胞懸濁
液を作製して流動細胞測定器を使用する。
従来の方法は感度および／または特異性が限定され、通常面倒でかつ時間がか
かりまた高度の熟練が必要である。また流動細胞測定法には高価な装置が付随し
ている。
血液および骨髄中の腫瘍細胞を検出する形態学方法は、免疫細胞化学法および
免疫蛍光法を用いる方法より感度がはるかに低い（Be
iskeら，Am．J．Pathology，141巻３号，1992年９月）。しかし後者の方法は、
腫瘍細胞が有核細胞の合計数の１％より少ない場合には不充分である。流動細胞
測定法は、顕微鏡を使用する方法より感度が優れているが多数の細胞を入手でき
ることが必要であり、またいくつかの技術的に難しい点がある。すなわち、細胞
が凝集して問題を起こすことがあり、そしてこの方法は標識をつけた腫瘍細胞と
非特異的に蛍光を発する正常細胞とを識別することができない。
本発明の方法は、多数の細胞を顕微鏡で容易に選別することができかつ結合さ
れた磁気ビーズは容易に認識できるので、例えば転移腫瘍細胞を非常な高感度で
検出することができる。使用されるモノクローナル抗体は、例えば腫瘍細胞と充
分な特異性で結合するが、血液、骨髄のような混合細胞懸濁液中に存在し他の腫
瘍徴候を示す、標的細胞以外の細胞には結合せず、結合したビーズを有する細胞
はすべて標的細胞である。その上、その手順は迅速かつ簡単に行うことができし
かも従来の顕微鏡を使っていずれの研究者でも実行できる。
本発明の新規な方法では、腫瘍細胞に存在するが、問題の正常細胞もしくは他
の目的のための正常細胞の特定の分集団には存在しない抗原を特異的に認識する
例えばマウスもしくはヒト起源のモノクローナル抗体を、常磁性粒子に直接結合
させるか、または腫瘍細胞に結合するそれぞれの抗体もしくはIgG抗体のFc部分
を特異的に認識する抗体で予め覆ったビーズに結合させる。細胞に結合する抗体
はIgG型もしくはIgM型でありまたはabIgGもしくはIgMである。使用される抗標的
細胞抗体の例としては、抗パン・ヒト抗体（Brulandら、未刊行；動物細胞中の
ヒト細胞を検出するのに適している）に加えて、抗原決定基の群、例えばCD56/N
CAM 抗原(MOC-1)、クラスター２上皮抗原(MOC−31)、クラスター２(MW＝約40KD)
抗原
(NrLu10) (Myklebustら，Br．J．Cancer Suppl., 63巻、49〜53頁、1991年)
、 HMW黒色腫関連抗原（9.2，27）（Morganら，Hybridoma，1巻、27〜36頁、19
81年)、80KDの肉腫関連抗原(TP1およびTP3)(Cancer Res., 48巻、5302〜5309頁
、1988年)、ムチン抗原類(Diel ら，Breast Cancer Res．Treatm., 1991年)ま
たはEGF受容体抗原(425.3)(Merck社)に対する抗体がある。上記の425.3抗体は正
常および悪性の細胞の両者の抗原に対する抗体である。抗体類としてはさらに、
成長因子受容体、例えばEGF受容体、PDGF（ＡとＢ）受容体、インシュリン受容
体、インシュリン様受容体、トランスフェリン受容体、NGFおよびFGFの受容体、
インテグリン類の群、他の接着膜分子類および正常細胞と異常細胞の両者のMDR
タンパク質、ならびに正常細胞と悪性細胞および悪性細胞の膜および悪性細胞に
のみ発現される癌産生物例えばNeu/erb B2/HER2に加えて正常細胞の分集団に存
在する抗原に対する抗体がある。悪性細胞としては、乳癌、卵巣癌および肺癌の
細胞、黒色腫、肉腫、グリア芽細胞腫、胃腸器官および網内系の癌細胞があり、
または標的細胞は、非新生物性疾患例えば心臓血管、神経、肺、自己免疫、胃腸
、尿生殖器、網内系などの疾患に関連する細胞と関連している。さらに悪性細胞
集団は、骨髄、末梢血液中に存在している場合があり、胸水および腹腔液および
他の体液区分例えば尿、脳脊髄液、精液、リンパ液由来のものがあり、または正
常な組織もしくは臓器例えば肝臓、リンパ節、脾臓、肺臓、膵臓、骨組織、中枢
神経系、前立腺、皮膚および粘膜の充実性腫瘍由来のものがある。本発明の方法
に用いる抗原決定基および対応する抗体または抗体フラグメントのより完全な一
覧表を表１に示す。
本発明の方法では抗体を常磁性粒子に直接結合させることからなり、またはそ
の結合は例えばポリクローナル抗マウス抗体類、モノクローナルラット抗マウス
抗体またはモノクローナル抗ヒト抗体の
ような、前記の個々の抗体のFc部分を特異的に認識する表面結合抗体(surface-b
ound antibody)に結合させることによって行うことができる。抗体で被覆された
常磁性ビーズを次に被検細胞の懸濁液と混合し、次いでゆるやかに回転させなが
ら、０〜25℃好ましくは４℃で５〜10分間乃至２時間好ましくは30分間インキュ
ベートする。また本発明の方法は、遊離の標的細胞の抗体を細胞懸濁液に添加し
、ゆるやかに回転しながら０〜２０℃好ましくは４℃で５〜10分間乃至２時間好
ましくは30分間インキュベートし、ステップの順序を変更して実施してもよい。
次に抗マウス抗体または抗ヒト抗体で予めコートした常磁性粒子を先に述べたの
と同様にして上記のインキュベートした細胞懸濁液に添加し、得られた懸濁液を
さらに、ゆるやかに撹拌しながら０〜25℃好ましくは４℃で５〜10分間乃至２時
間好ましくは30分間インキュベートする。
次に細胞懸濁液の試料を細胞計数装置に移し、結合ビーズを有する細胞の細胞
全数に対する割合を光学顕微鏡で測定した。細胞懸濁液に添加される、抗体でコ
ートされたビーズの数は標的細胞の数の0.5〜10倍でなければならない。標的細
胞の数が不明の場合、添加される被覆ビーズの量は細胞全数の１〜10％でなけれ
ばならない。
特定の場合、および標的細胞の密度が低い場合例えば悪性細胞もしくは標的細
胞の細胞全数に対する割合が非常に低い場合（≦１％）標的細胞は、磁場内で非
標的細胞から積極的に分離することができる。次にこの分離された標的細胞は顕
微鏡で数えることができ、次いで最初の細胞懸濁液中の細胞合計数に対する標的
細胞の割合を計算することができる。さらにその標的細胞は特異的な化学上およ
び生物学上の特徴について特性を決定することができる。特に重要なことは、分
子生物学の研究に上記の細胞を使うことである。本発明の方法は、従来技術の上
記の方法とは著しく異なり、常磁性粒子−
標的細胞の結合を切断することなく、標的細胞を研究し増殖させることができる
。いくつもの目的のために、腫瘍生検試料中、ならびに血液、骨髄および他の体
液例えば尿、脳脊髄液、精液、リンパ液中に存在する腫瘍細胞中、または他の正
常な組織と臓器例えば肝臓、リンパ節、脾臓、肺臓、膵臓、骨組織、中枢神経系
、前立腺、皮膚および粘膜由来のおよび細胞学上の研究活動の他の分野での標的
細胞の純集団の特異的遺伝子をDNA、mRNAおよびタンパク質のレベルで試験する
ことが重要である。
従来技術の方法では、サザーンブロット、ノーザンブロットおよびウエスタン
ブロット法で得られるシグナルは、その生検試料中の正常細胞と腫瘍細胞を示す
。単個細胞懸濁液を腫瘍物質から最初に調製し、次いでその腫瘍細胞を免疫磁気
的に積極的に検出して分離すれば、この物質について行われる遺伝子の試験結果
は標的細胞だけを示す。またこの方法は例えば哺乳類の組織中に存在する悪性細
胞、例えば骨髄、末梢血液、胸水、腹腔水および他の体液例えば尿、脳脊髄液、
精液およびリンパ液中の悪性細胞にも適応している。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR
)法による試験も、本発明の新しい方法で得た純粋の腫瘍細胞集団について実施
すると特異性と信頼性とが向上する。
本発明の新しい方法のステップの適用法は被検組織の種類によって異なってい
る。
ａ)充実性腫瘍の生検もしくは腫瘍の針生検由来の組織を機械的に処理するか
、またはゆるやかに酵素で処理して単個細胞懸濁液を調製し、その懸濁液に、一
次の特異的抗体もしくは抗体フラグメントを、直接添加するか、またはリン酸、
緩衝食塩水もしくは例えばウシ胎児血清、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギもしくはヒト
の血清のごとき血清を含有もしくは含有しない培地で細胞懸濁液を洗浄した後に
添
加する。
ｂ)材料が胸水もしくは腹水、脳脊髄液、尿、リンパ液または各種の形態の関
節炎にかかっている患者の関節の滲出液のような体液の試料の場合、特異的な抗
体または抗体フラグメントを試料に、直接添加するか、または試料中の細胞を遠
心分離し次いで再び懸濁させる前または後に、洗浄もしくは洗浄せずに遠心分離
した後に添加する。
ｃ)材料が血液または骨髄吸引液で構成されている場合、単核細胞の画分は、
例えばLymphoprepで勾配遠心分離し次いで洗浄し再懸濁し、適切な抗体または抗
体フラグメントを添加することによって分離される。
ａ)とｂ)の手順の条件は確立されており、以下に述べる成功した実験で得られ
た結果で例証されている。
ｃ)の方法については、試験結果は、詳細に試験された多数の因子によって影
響を受けることが見出された。これらの因子としては、抗体の濃度、常磁性粒子
数：細胞の数の比率、インキュベーションの時間と容積、インキュベーション培
地の種類およびpHのレベルがある。全試験における粒子：単核細胞の比率は、一
次の特異的抗体もしくはフラグメントの結合アフィニティーによって0.5/1〜2/1
の範囲内でなければならない。
主な問題点は、ヤギもしくはラットの抗マウス抗体だけで、またはさらに特異
的抗体でコートされた粒子が、正常な血液または骨髄の細胞に非特異的に結合す
ることであった。試験の結果は、非特異的結合は特異的抗体が存在しない場合に
等しく高いことを示した。このことは、上記問題が起こるのはターゲティング抗
体の正常細胞に対する交差反応性が原因ではないことを示している。最適の場合
より低い特異性がイオン結合で起こる可能性は除かれた。他の可能
性は、Ｂ系統の正常細胞の分集団が粒子−抗体複合体に粘着するかもしれないと
いう可能性である。しかし、特異的抗体／抗体−粒子複合体を添加する前に細胞
懸濁液からＢ細胞を免疫磁気的に除去しても、特異的抗体／抗体−粒子複合体の
特異性は改善されなかった。
骨髄および末梢血液の分離された単核画分に用いた手順に付随する問題点すな
わちいくらかの非標的細胞も常磁性粒子を捕捉するかもしれないという問題点は
回避されるかまたは克服された。すなわち、ヒツジ抗マウス抗体でコートした粒
子のみまたは特異的抗体によって、低画分の血液もしくは骨髄の単核細胞に非特
異的に結合した粒子の数は平均して10から約１まで減少し、そして粒子を有する
正常細胞の画分は平行して１〜２％から0.5〜１％以下まで減少した。
上記問題点が常磁性粒子に結合した抗体に関連する疎水力(hydroーphobic forc
e)によって起こる証拠が得られた。したがって本願ではこの疎水性を減少させる
方法の特許を請求するものである。この方法の一つは、抗体でコー卜された粒子
と細胞懸濁液を適切な濃度の緩和な界面活性剤、例えば0.1％より低い濃度のTwe
en 20（登録商標）とともに40℃にて30分間プレインキュベートする方法である
。標的細胞の選択が保証できるならば、細胞懸濁液が含有する界面活性剤の濃度
は例えば0.01％のTween 20（登録商標）のような低い濃度でなければならない。
いくつもの試験において、この手順で行った場合、血液もしくは骨髄由来の単核
細胞画分にみられる非特異的結合の問題はほとんど消失するかまたは劇的に減少
した。
他の改良法は、改良が保証されることが分かったならば、下記のように界面活
性剤のステップとともに利用できる。
一次の抗体もしくは抗体フラグメントおよび抗体でコートされた常磁性粒子と
ともに細胞懸濁液のインキュベーションを先に述べた
ように行ってから、その細胞懸濁液を、標的細胞の他の細胞外決定因子もしくは
細胞内決定因子に対する抗体もしくは抗体フラグメントの第二のセットとともに
、ホルムアルデヒドまたはアルコール類のような細胞固定液によって前処理する
かまたはせずにインキュベートする。これらの抗体もしくはそのフラグメントは
、蛍光剤類、金属コロイド類、放射性同位元素類、ビオチン複合体類、またはペ
ルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼのような酵素類で予め標識を付け
て、それ自体公知の方法で、顕微鏡および／または適切な計数装置で目視可能に
しなければならない。
標的細胞は後者の方法で目視可能になるとともにその表面に粒子を捕捉するの
で、数えることができる。
非標的細胞と標的細胞との区別を簡単にするため、細胞懸濁液を、第二の目視
化ステップを行う前に、細胞スピン遠心分離にかけるか、または懸濁液の一部を
、粒子に捕捉された細胞が薄層で広げられている被覆スライドガラスに付着させ
て、二重に“ステインされた(stained)”細胞を認識し易くすることができる。
本発明の新しい手順で使用するため、キットには、例えば各モノクローナル抗
体について調製した、予めコートされた常磁性粒子が入っている。他の実施態様
では、キットに、その一部分として、IgGイソタイプ特異的の抗マウス抗体もし
くは抗ヒト抗体で予めコートされた常磁性粒子が入っており、および他の部分と
して異なる標的細胞例えば腫瘍細胞関連の抗体が入っている。第三の実施態様で
は、特異的抗標的細胞抗体に捕捉された標的細胞関連抗体のFc部分に結合できる
ポリクローナル抗マウス抗体、またはモノクローナルのラット抗マウス抗体、ま
たは抗マウス抗体もしくは抗ヒト抗体のような特異的抗Fc抗体で予めコートされ
た常磁性粒子がキットに入っている。さらに別の実施態様では、所望の標的細胞
内もしくは該細胞
上の抗原／受容体に対する他の特異的抗体または抗体フラグメントがキットに入
っており、前記の抗体または抗体フラグメントは、ペルオキシダーゼ、アルカリ
ホスファターゼなどの酵素に対しこれら酵素の関連基質とともに接合されている
か、または前記抗体または抗体フラグメントは、特定の色を有するかまたはペル
オキシダーゼおよびアルカリホスファターゼのような結合した酵素を有する非常
磁性粒子に結合されている。
本発明の方法を、モデル実験、本発明の新しい方法の有用性を示す実施例およ
び実験の用途の実施例によって以下に説明する。これらの実施例はいかなる場合
でも本発明を限定しない。
モデル実験：
1. 本発明の新しい手順による、抗体−ビーズ複合体の腫瘍細胞系との結合
抗体−常磁性粒子複合体を腫瘍細胞に結合させる場合の抗体濃度と最適条件を
決定するため、大パネルの癌細胞系を用いた。常磁性ビーズは、ヒツジ抗マウス
抗体(SAM)でコートした常磁性粒子に特異的抗体をコートするか、またはまず細
胞を特異的抗体とともにインキュベートし、洗浄し続いてSAMでコートされた粒
子とともに第二のインキュベーションを行うことによって、細胞に結合される。
これらの試験の結果を表2aと2bに示す。これらの表において＋印はいくつものヒ
ーズがすべての細胞に結合していることを示し、（＋）印は少数のビーズが各細
胞に結合しているかまたはすべての腫瘍細胞ではないがその表面にビーズが結合
していることを示し、−印は全く結合がないことを示し、および（−）印は非常
に弱い結合を示す。
2. 骨髄または末梢血液の単核画分中の腫瘍細胞を検出するため、次のようなモ
デル実験を行った。すなわち特異的抗体とSAMでコー
トした常磁性粒子を、前記単核細胞または細胞懸濁液に加えた。なおその場合生
体外で培養した細胞系由来の各種の数の癌細胞を前記単核細胞に添加した。いく
つかの実験では、単核細胞または悪性細胞は、２種の細胞を区別できるように蛍
光染料で予めステインした。すべての実験で非結合一次抗体および／またはヒツ
ジ抗マウス抗体でコートしたビーズを別個に対照として使用した。
幾種類もの癌。したがって、かような抗体のそれぞれの抗体との結合を検出する
ことは高い予後価(high prognostic value)の情報を得るために使用できる。こ
のような抗原の中には、以下に列挙する多数の接着性分子、炭水化物抗原、糖脂
質、成長因子受容体、および癌腫マーカーがある。本発明の新しい方法によって
、粒子−抗体複合体と次のものすなわちCD44変異体、E-カドヘリン、LeY、CEA、
EGF-r、トランスフェリン受容体、MUC-1 エピトープ、LUBCRU-G７エピトープ、
前立腺癌抗原、UJ13A エピトープ、β2−ミクログロブリン、HLA-抗原および細
胞消滅受容体との結合を同定した。実施例３
悪性黒色腫にかかっていると考えられる患者から２ｌの胸水拡散液を得た。遠
心分離を行った後、10％のウシ胎児血清を含有するRPMI２ｍｌの容積中に細胞を
懸濁させ、9.2.27抗黒色腫抗体(10μg/ml)とともに４℃で30分間インキュベート
し、洗浄し、Dynabeads SAMM450/IgG2Aとともに４℃で30分間再びインキュベー
トした。次にその細胞懸濁液を顕微鏡で試験してその表面に常磁性細胞が結合し
ている細胞の画分を測定した。約10％の細胞が有意な数の粒子ロゼットをもって
いたとき、悪性黒色腫の診断を確認した。実施例４
小細胞肺癌もしくは悪性黒色腫の臨床指標を有する症例の皮下腫瘍から生検組
織を得た。その生検試料から単個細胞懸濁液を調製し、二つの画分に分割し、一
方を9.2.27抗黒色腫抗体とともにインキュベートし、他方をMOC-31抗癌腫抗体と
ともにインキュベートした（両方ともに10μg/ml）。このインキュベーションは
上記実施例で利用したのと類似している。黒色腫抗体とともにインキュベートし
た細胞はビーズを全く捕捉しなかったが、MOC-31とともにインキュベートしたす
べての腫瘍細胞は陽性であった。実施例５
悪性黒色腫をもっている疑いがある患者から得た生検組織を、単個細胞懸濁液
を調製し、9.2.27抗黒色腫抗体とともにインキュベートし次いで上記手順にした
がって試験した。その細胞の大部分は陽性であり、多数の粒子−ロゼットが細胞
の膜に結合していた。実施例６
乳癌患者由来の胸水を、その液体中に腫瘍細胞を検出できるか否かを試験する
ために研究した。その液体１ｌを遠心分離し、得られた細胞を再懸濁させ、次に
別々のバイアルびん中で、３種の異なる各抗癌腫抗体(MOC-31、2E11、12H12)と
ともにインキュベートした。前記実施例と同様に手順を完了した後、３例すべて
でほとんどの細胞が抗体被覆粒子に結合することが見出された。実施例７
乳癌患者から得た骨髄懸濁液を研究して、微小転移腫瘍細胞が存在しているか
否かを試験した。単核細胞を調製した後、この細胞を、上記実施例に使用したの
と同じ３種の抗癌腫抗体とともにインキュベートした。しかしこの場合、抗体は
まずDynabeads（登録商標）SAM IgM 常磁性粒子に結合した。これらの直接コー
トされた粒子と１回インキュベートした後、その細胞懸濁液を顕微鏡で検査し、
多数の細胞が陽性であることが見出され、多数の粒子−ロゼットが細胞の膜に結
合していた。
同様の試験を、乳癌の患者由来の胸水もしくは腹腔水および骨髄のいくつかに
ついて実施した。実施例８
T47D ヒト乳癌細胞を、時間を変えてヘキスト社の蛍光塗料とともにインキュ
ベートし次いでその標識を付けた細胞の生存力を検査した。標識を付けた乳癌細
胞の数を変えて、健康なボランティアから
得た１×１０6個の骨髄細胞に添加した。異なる試験において、個々の抗癌腫抗
体（NrLu10、MOC31または12H12）でコートした常磁性の単分散粒子（Dynabeads
（登録商標）P450）を異なる濃度で添加した。氷上で30分間インキュベートした
後、異なる試験管の試料を、計数チャンバー内で光学顕微鏡と蛍光顕微鏡とを用
いて試験した。腫瘍細胞／全有核細胞の比率が低かった場合は、その細胞懸濁液
を磁場にかけ、結合した粒子を有する細胞を分離し次いで顕微鏡で検査した。細
胞混合物中、１腫瘍細胞当たり１〜10の常磁性ビーズという最適の比率では、す
べての腫瘍細胞はその表面に２〜15個のビーズが結合されていた。この検出法の
感度は、１０4個の有核細胞当たり１個の標的細胞に近かった。正常細胞に対し
ていくらか交差反応を有することが分かっている抗体を用いて、標識をつけた腫
瘍細胞で対照試験を行い、この交差反応性が抗体でコートされた常磁性粒子にあ
ることが確認された。腫瘍関連抗体のコーティングなしのビーズの試験ではとの
標的細胞もビーズを全く捕捉しなかった。
他の乳癌系と小細胞肺癌細胞系の両者について類似の試験を行った。これらの
試験で類似の感度と特異性とが得られた。実施例９
乳癌および卵巣癌の患者由来の胸水と腹腔水とをセントリフューズ(sentrifug
ed)、実施例１で使用したのと同じ被覆常磁性粒子を添加し、インキュベートし
、次いで磁場内で濃縮し、そしてその懸濁液を光学顕微鏡で試験した。一般に、
腫瘍細胞の明らかな形態学的特徴を有する細胞にはビーズが結合しており、一方
少数の正常細胞は、抗体でコートされたビーズを全く捕捉しなかった。胸水の二
つの例では、独立して形態学的試験をしたが腫瘍細胞は全く存在しなかったが、
一方抗体でコートしたビーズを用いることによってかなりの数の悪性細胞が検出
された。いくつかの場合に、
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フロントページの続き
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ
Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ
，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，
ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，
ＣＡ，ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｈ
Ｕ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＭＧ，ＭＮ
，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，
ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＶＮ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1. 混合細胞集団の細胞懸濁液および混合細胞集団を含有する流体系、ならび に充実性組織から調製した単個細胞懸濁液の中の特異標的細胞を検出する方法で あって、以下のステップ： 1.1. a)細胞混合物中で標的細胞上に特異的に発現されるが非標的細胞上では 発現されない膜構造物に対する抗体類もしくは抗体フラグメント類またはb)膜構 造物に対する前記抗体類のFc部分に結合し得る抗体類、好ましくはポリクローナ ル抗マウス抗体もしくはモノクローナルラット抗マウス抗体もしくは抗ヒト抗体 で、それ自体公知の方法により、常磁性の粒子もしくはビーズをコートし、次い で 1.2.1. 前記粒子もしくはビーズに結合されているか、または標的関連抗体の FC部分を認識する抗マウス抗体もしくは抗ヒト抗体で予めコートしたビーズに結 合されている標的細胞関連抗体（マウスまたはヒト）を、標的細胞を含有する細 胞懸濁液と混合するか、または 1.2.2. 遊離した標的細胞関連抗体を、標的細胞を含有する細胞懸濁液と混合 し、この混合物を５〜10分間乃至２時間好ましくは30分間、０℃〜20℃の温度好 ましくは４℃でゆるやかに回転しながらインキュベートし、次に 1.3. 細胞懸濁液、および常磁性粒子もしくはビーズ(1.2.1.)または標的関連 抗体のFc部分を認識する抗マウス抗体もしくは抗ヒト抗体で予めコートされた常 磁性粒子もしくはビーズに結合されたかインキュベートされた遊離標的関連抗体 と細胞懸濁液との混合物(1.2.2.)に結合された遊離標的関連抗体の混合物をイン キュベートし、次いで０℃〜25℃好ましくは４℃の温度で５〜10分間乃至２ 時間好ましくは30分間ゆるやかに回転しながらインキュベートし、および 1.4.1. 標的細胞集団が血液もしくは骨髄の吸引液中に含有されている場合は 、抗体でコートされた粒子と細胞懸濁液を、適切な濃度の緩和な界面活性剤例え ば0.1％未満の濃度のTween20とともに４℃にて30分間予めインキュベートするこ とによって、抗体でコートされた粒子に関係する疎水力を低減し、および／また は 1.4.2. ホルマリン、アルコールまたは他の固定液で処理しないかまたは前処 理された細胞懸濁液を、標的細胞中に存在する細胞外もしくは細胞内の分子に結 合する他の抗体もしくは抗体フラグメントとともにインキュベートすることによ って、そして使用される抗体は、関連基質を添加しインキュベートすることによ り、その結合を目視可能にできるペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼま たはその他の酵素で予め標識を付けるか、または 1.4.3. 抗体フラグメントはビオチニル化され、その結合は、ペルオキシダー ゼ、アルカリホスファターゼまたは他の酵素と複合させたアビジンを添加しイン キュベートし、関連基質を添加しインキュベートすることによって目視可能にな り、または 1.5.1. 標的細胞の密度が低いかまたは細胞混合物中の標的細胞／全細胞の比 率が低い（≦１％）場合は、インキュベートされた常磁性粒子−細胞混合物(1.3 .)に磁場をかけ、次いで顕微鏡および／または適切な細胞／粒子計数装置を用い て、細胞懸濁液中のステインされたかまたは未ステインの粒子−標的細胞複合体 を検査して計数し、または 1.5.2. 常磁性粒子、抗体および細胞混合物のインキュベートされた混合物(1 .3.)中の標的細胞を試験して計数し、抗体もしくは抗体フラグメントが、色のた めに直接目視可能になるかもしくは酵素 の活性化で目視可能になる非常時磁性粒子に接合されている場合、細胞懸濁液中 の標的細胞／全細胞の比率が適切である（＞１％）とき、顕微鏡および／または 適切な細胞／粒子計数装置を用いる、 を有することを特徴とする改良方法。 2. 正常な生存細胞、例えば肝実質細胞、クッペル細胞、肺臓の内皮細胞タイ プ１と２およびクララ細胞、特定の臓器の内皮細胞、膵臓の外分泌細胞と内分泌 細胞、腎臓の細管細胞、膀胱の上皮細胞、脳のグリア細胞と上衣細胞、膀胱と前 立腺の上皮細胞、気道の線毛細胞、胃腸管の粘膜細胞の異なる分集団、下垂体細 胞、および各種のホルモン産生器官の他の内分泌細胞の中の抗原に対する抗体ま たはそのフラグメントを用いることを特徴とする請求項１記載の方法。 3. 正常細胞の分集団上に存在する抗原および正常組織細胞の膜上で発現され る腫瘍遺伝子産物に対して反応性の抗体を、前記標的細胞抗体として使用するこ とを特徴とする前述の請求項の何れか１つに記載の方法。 4. 正常細胞の膜上の成長因子受容体類、例えばEGF受容体、PDGF（Ａおよび Ｂ）受容体、インシュリン受容体、インシュリン様受容体、トランスファリン受 容体、NGFとFGFの受容体に対する抗体を、前記の積極的に選択する抗体として使 用することを特徴とする前述の請求項の何れか１つに記載の方法。 5. インテグリン類と、他の接着性膜分子の群、および正常細胞中のMDRタン パク質類に対する抗体を用いることを特徴とする前述の請求項の何れか１つに記 載の方法。 6. 異常な発育パターンを有する細胞、好ましくは例えば原発および転移の癌 細胞の中の抗原もしくは受容体に対する抗体もしくはそのフラグメントを用いる ことを特徴とする前述の請求項の何れか１つに記載の方法。 7. IgGのイソタイプ、またはＦ（ab′）2もしくはＦ(ab)のフラグメント、ま たはIgMもしくはそのフラグメントの抗体を、前記標的細胞関連抗体として用い ることを特徴とする前述の請求項の何れか１つに記載の方法。 8. 哺乳動物の組織例えばヒトの骨髄と末梢血液を含む混合細胞集団から、胸 水と腹腔水および他の体液例えば尿、脳脊髄液、精液、リンパ液から、または正 常な組織と臓器例えば肝臓、リンパ節、脾臓、肺臓、膵臓、骨組織、中枢神経系 、前立腺、皮膚および粘膜から前記細胞懸濁液を調製することを特徴とする前述 の請求項の何れか１つに記載の方法。 9. 抗体もしくは抗体フラグメントが、抗原決定基の群、例えば明細書の表１ に列挙されたものに対する抗体もしくは抗体フラグメントであることを特徴とす る前述の請求項の何れか１つに記載の方法。 10. 悪性細胞の膜上に発現される成長因子受容体と腫瘍遺伝子産物、例えば 明細書の表１に列挙されているものに加えてインシュリン受容体、インシュリン 様受容体およびFGF受容体に対する抗体もしくは抗体フラグメントを、前記標的 細胞の抗体として用いることを特徴とする前述の請求項の何れか１つに記載の方 法。 11. インテグリン類と他の接着性膜分子の群および表１に列挙されている異 常細胞中のMDRタンパク質に対する抗体もしくは抗体フラグメントを用いること を特徴とする前述の請求項の何れか１つに記載の方法。 12. 用いられる抗体、抗体フラグメントまたはそれらの混合物が、明細書の 表１に列挙されている抗原決定基に該当することを特徴とする前述の請求項の何 れか１つに記載の方法。 13. 異常細胞、例えば乳癌、卵巣癌および肺癌の細胞、黒色腫、 肉腫、グリア芽細胞腫、胃腸管と尿生殖器官および網内系の癌細胞、および／ま たは非新生物疾患、例えば心臓血管障害、神経障害、肺障害、自己免疫障害、胃 腸障害、尿生殖器障害、網内系障害などの障害に関連する標的細胞上に存在する 抗原と反応性の抗体を、前記抗体として用いることを特徴とする前述の請求項の 何れか１つに記載の方法。 14. 標的細胞を分離するのに用いる、前述の請求項の何れか１つに記載の検 出方法の用途であって、細胞と常磁性粒子との複合体を磁場に暴露し、磁気で凝 集させて得た細胞をさらに、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)と逆転写酵素PCRとを含 めて特定の遺伝子のDNA、mRNAおよびタンパク質のレベルでの特性決定を含む生 物学的、生化学的および免疫学的試験に付す用途。 15. 前述の請求項の何れか１つに記載の、特定の標的細胞の検出方法の用途 であって、分離された常磁性粒子−標的細胞複合体から生体外細胞培養物を樹立 するのに用いおよび／または好ましくは免疫不全動物に接種して前記動物内にヒ トの腫瘍異種移植片を樹立する用途。 16. 1.所望の標的細胞上の抗原受容体に対する特異的抗体もしくは抗体フラ グメントであって、その抗原結合性能を除かずに、含有されている常磁性粒子に 結合されるかもしくは結合されうる抗体もしくは抗体フラグメント、および／ま たは 2.標的細胞関連抗体および特異的遊離標的細胞抗体のFc部分に結合できる、特 異的な抗Fc抗体類、好ましくはポリクローナル抗マウス抗体またはモノクローナ ルラット抗マウス抗体または抗ヒト抗体で予めコートされた常磁性粒子、および ／または 3.特異的抗標的細胞抗体に結合された標的細胞関連抗体のFc部分に結合できる 、特異的抗Fc抗体類、好ましくはポリクローナル抗マ ウス抗体もしくはモノクローナルラット抗マウス抗体もしくは抗ヒト抗体で予め コートされた常磁性粒子、および／または 4. 所望の標的細胞内もしくは該細胞上の抗原／受容体に対する他の特異的抗 体または抗体フラグメントであって、ビオチン、ペルオキシダーゼ、アルカリホ スファターゼまたは他の酵素に接合されているかまたは特定の色を有しているか またはペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼのような酵素が結合して いる非常磁性粒子に結合されている抗体または抗体フラグメント、 を有することを特徴とする前述の請求項の何れか１つに記載の方法を実施する ためのキット。
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