JPH08501390A

JPH08501390A - 特殊細胞集団もしくは混合細胞集団および混合細胞集団を含有する溶液中の特異標的細胞の検出方法

Info

Publication number: JPH08501390A
Application number: JP6507991A
Authority: JP
Inventors: フーツタ，オイスタイン; クヴァールハイム，グンナル
Original assignee: フーツタ，オイスタイン; クヴァールハイム，グンナル
Priority date: 1992-09-14
Filing date: 1993-09-10
Publication date: 1996-02-13
Anticipated expiration: 2018-06-16
Also published as: AU686569B2; EP0660930B1; US6893881B1; CZ65995A3; WO1994007139A1; HU9500723D0; SK281566B6; PL308109A1; SK32995A3; CA2144328C; JP3417563B2; ES2141170T3; AU2593192A; HU221234B1; GR3032547T3; USRE43979E1; US6184043B1; DE69326956D1; PL177136B1; FI951161L

Abstract

(57)【要約】本発明は、常磁性の粒子と、抗体に関連する標的細胞及び標的細胞の膜で特異的な抗原決定体に応じた抗体に関係する標的細胞のFc部分を認識する抗体とを用いて、簡単で時間を節約した手法にて特異標的細胞を検出する方法。細胞懸濁液を、緩和な界面活性剤および／または目視可能にする蛍光剤類、金属コロイド類、放射性同位元素類、ビオチン複合体類もしくはある種の酵素類で予め標識をつけてあるかつけてない抗体類もしくは抗体フラグメント類の第二セットとともにインキュベートすると、この方法の特異性が劇的に増大する。この方法は更に磁界印加により標的細胞の分離に用いられ、本発明によるこの方法を実施するためのキットが述べられている。

Description

【発明の詳細な説明】特殊細胞集団もしくは混合細胞集団および混合細胞集団を含有する溶液中の特異標的細胞の検出方法本発明は細胞集団および細胞集団の溶液中の特異標的細胞の免疫磁気的検出方法（immunomagnetic method for detection）に関する。また本発明は、異なる細胞集団に上記方法を実施するのに適したキットに関する。生物学、生化学さらにその隣接科学分野には、化学物質が相互に関連した方法に対する需要が多い。このような方法は、正常なおよび異常な細胞集団の両者について研究する場合により重要となる。特に固体の支持体を用いると、細胞は固定され、検出され、分離されて精製することができる。さらに、細胞含有物は一連の高性能の方法を用いて試験することができる。また細胞を生育可能な形態で分離できることも重要である。アフィニティー結合法は化学物質／生化学物質を連結する高性能の方法である。この方法では、一対の結合パートナーは（例えば連結される物質に結合される）接触させると互いに結合する。このような結合において結合パートナーの一方は細胞表面の一分子によって表される。このような結合パートナー系の多くは公知であり、例えば細胞における抗原−抗体、酵素−受容体、リガンド−受容体の相互作用およびビオチン−アビジンの結合があるが、これらのなかで抗原−抗体の結合が最も頻繁に使用される。ハプテン／抗ハプテン結合対法も最近提案されている（PCT/EP90/01171）。上記のような方法が特異的な細胞（その後の各種の試験に用いる被検体）を分離するのに利用される場合、結合しているパートナーに対して破壊作用を起こさずに結合を切断する必要があり、理想的には、結合パートナーは元の状態に戻ったときにその機能を回復しなければならない。抗原／抗抗原およびハプテン／抗ハプテンの結合を適正に切断する方法が提案されているが（PCT/EP91/00671, PCT/EP90/01171）、上記のことは必ずしも実現されていない。結合パートナーの一方が不溶性の支持体例えば常磁性粒子に結合されている方法は公知であり、この方法によって混合細胞集団中の標的細胞の分離が消極的分離もしくは積極的分離として実施される。消極的分離法では、不要な細胞は、不要細胞に対して特異的な抗体でコートされた粒子とともに細胞とインキュベートすることによって細胞試料から除くことができる。インキュベートを行ってから、細胞／抗体／粒子複合体は粒子を用いて除去し、必要な標的細胞を残すことができる。この結果は不満足な場合が多い。というのは、必要な細胞は多少は精製されているが細胞集団中に残り、またこの分離法の目的は特異標的細胞について試験しおよび／またはさらに研究することだからである。積極的分離を行うために粒子を使用する試みがなされている。この場合、必要な標的細胞が混合細胞集団から取り出される。しかしこれらの方法はある種の標的細胞に用いられているがすべての標的細胞系に対して適しているわけではない。ハプテン／抗ハプテン結合系に関する積極的分離法が最近提案されており（PCT/EP90/01171）、また骨髄から造血前駆細胞を分離する方法も提案されている（PCT/EP90/02327）。後者の方法は、特異細胞すなわち造血前駆細胞を分離し骨髄中で増殖させるため、積極的なおよび消極的な選択を組合わせて用い、粒子の取り出しによって行われる。 PCT/EP90/01171には、ハプテン、抗ハプテン抗体類および抗細胞抗体類が互いに結合する性能を利用して、不溶性支持体すなわち粒子と標的細胞との結合、すなわち少なくともハプテンと抗ハプテン抗体またはハプテンと抗ハプテン抗体および抗抗ハプテン抗体もしくは第二の抗細胞抗体との組合わせからなる結合を形成させることによって、標的細胞を不溶性支持体に連結する方法が記載されている。この複合体のその後の切断は、その複合体をハプテンもしくはハプテン類似体に再び暴露することによって行われる。したがって形成された結合には一つ以上の成分に加えて常にハプテンを含有している。この方法は、非特異的な標的細胞に関しおよび標的細胞の分離と不溶性支持体の放出に関する。非特異的なハプテン群の化合物を含有せず、また非特異的細胞との会合を最小限にして特異標的細胞の検出を行って、不溶性支持体と特異標的細胞間の結合を後で切断する必要をなくするような、標的細胞と不溶性支持体とを連結する簡単な結合が要求されている。したがって本発明の目的は、特異的標細胞を血液中および骨髄中で用いた場合、正常細胞に非特異的に結合する問題を起こすことなく特異標的細胞を、診断のために検出することである。換言すれば、多数の細胞を顕微鏡で容易に選別することができかつ操作が迅速で簡単な、各種細胞型の高感度検出法である。さらに本発明の方法は、細胞−粒子複合体を分解する必要なしに、細胞を培養後、生化学、生物学および免疫学の試験を行うためおよびヌクレオチドまたはタンパク質のレベルで特異的な遺伝子を試験するため細胞を分離するのに用いることができる。本発明の他の目的は本願の特許請求の範囲に特定されている方法を実施するのに用いるキットを提供することである。本発明の目的は、本願の特許請求の範囲に特定されている方法とキットとによって達成される。混合細胞集団および細胞集団含有生理学的溶液中の標的細胞の免疫磁気検出を行う本発明の方法は、特定のタイプの正常細胞と病原細胞との両者を検出するのに適しているだけでなく、両者の積極的分離を行うのにも用いることができる。本発明の方法によれば、特異的な標的細胞と常磁性粒子（一つもしくは二つの成分で構成されている）のような不溶性支持体との結合が形成される。この粒子は、必要な標的細胞の膜中の特異的抗原決定基に対するマウスもしくはヒト起源の抗細胞抗体でコートされるか、またはこの粒子は標的細胞の膜の抗原決定基に対する特異的抗細胞抗体のFc部分に結合できるポリクローナルの抗マウス抗体もしくは抗ヒト抗体でコートされる。この粒子をコートするためにポリクローナルの抗マウス抗体／抗ヒト抗体を使用する代わりに、モノクローナルのラット抗マウス／抗ヒト抗体を使用することができる。この最後の抗体は、部分的にモノクローナル起源であるため、抗細胞抗体と一層特異的に結合するので、血液のような溶液中で他の細胞と交差反応を起こす危険性が減少する。さらに、細胞懸濁液を、緩和な界面活性剤および／または目視可能にする蛍光剤類、金属コロイド類（metallocolloids）、放射性同位元素類、ビオチン複合体類もしくはある種の酵素類で予め標識をつけてあるかつけてない抗体類もしくは抗体フラグメント類の第二のセットとともにインキュベートするとこの方法の特異性が劇的に増大する。以下に、検出および分離を行う標的細胞として癌細胞を用いて本発明を詳しく説明する。しかし本発明の方法は癌細胞に限定されず、かつその開示事項はこの特定の使用分野に本発明の方法を限定するものではない。本発明の方法は広く細胞学の研究に適しているからである。癌患者を管理する場合、癌が局在しているかどうか、または転移拡散が他の組織に起こっているかどうかについて疾患の病期分類を行うことが、個々の患者に対して治療法を選ぶ場合に最も重要である。悪性細胞は、リンパ管を経由して周囲の組織中に直接侵入するかまたは血液中の腫瘍細胞が骨髄および中枢神経系および脳脊髄液を含む遠隔臓器に分散することによって広がる。転移腫瘍細胞の検出は、最近まで、生検用に採取した腫瘍試料、骨髄および末梢血液の塗抹標本および各種の体液をサイトセントリヒューゲーション（cytose ntrifugation）に付した後作製したスライドガラス上の試料に対して光学顕微鏡と電子顕微鏡を用いて行う形態学的方法によって行われてきた。抗原を認識するモノクローナル抗体は主として、異なるタイプの悪性細胞の表面に出現するので、転移細胞の同定には、免疫細胞化学と免疫蛍光との使用が増大している。したがって、生検用に採取した腫瘍またはサイトセントリヒューゲート（cytosentri fugate）から作製したスライドガラス上の試料をモノクローナル抗体で処理して、これら抗体と腫瘍細胞との結合を着色もしくは蛍光によって目視可能にする。後者の蛍光による方法の場合、蛍光顕微鏡を使用する必要があり、あるいは細胞懸濁液を作製して流動細胞測定器を使用する。従来の方法は感度および／または特異性か限定され、通常面倒でかつ時間がかかりまた高度の熟練が必要である。また流動細胞測定法には高価な装置が付随している。血液および骨髄中の腫瘍細胞を検出する形態学方法は、免疫細胞化学法および免疫蛍光法を用いる方法より感度がはるかに低い（Be-iskeら，Am．J．Patholog y，141巻３号，1992年９月）。しかし後者の方法は、腫瘍細胞が有核細胞の合計数の１％より少ない場合には不充分である。流動細胞測定法は、顕微鏡を使用する方法より感度が優れているが多数の細胞を入手できることが必要であり、またいくつかの技術的に難しい点がある。すなわち、細胞が凝集して問題を起こすことがあり、そしてこの方法は標識をつけた腫瘍細胞と非特異的に蛍光を発する正常細胞とを識別することができない。本発明の方法は、多数の細胞を顕微鏡で容易に選別することができかつ結合された磁気ビーズは容易に認識できるので、例えば転移腫瘍細胞を非常な高感度で検出することができる。使用されるモノクローナル抗体は、例えば腫瘍細胞と充分な特異性で結合するが、血液、骨髄のような混合細胞懸濁液中に存在し他の腫瘍徴候を示す、標的細胞以外の細胞には結合せず、結合したビーズを有する細胞はすべて標的細胞である。その上、その手順は迅速かつ簡単に行うことができしかも従来の顕微鏡を使っていずれの研究者でも実行できる。本発明の新規な方法では、腫瘍細胞に存在するが、問題の正常細胞もしくは他の目的のための正常細胞の特定の分集団には存在しない抗原を特異的に認識する例えばマウスもしくはヒト起源のモノクローナル抗体を、常磁性粒子に直接結合させるか、または腫瘍細胞に結合するそれぞれの抗体もしくはIgG抗体のFc部分を特異的に認識する抗体で予め覆ったビーズに結合させる。細胞に結合する抗体はIgG型もしくはIgM型でありまたはablgGもしくはIgMである。使用される抗標的細胞抗体の例としては、抗パン・ヒト抗体（Brulandら、未刊行；動物細胞中のヒト細胞を検出するのに適している）に加えて、抗原決定基の群、例えばCD56/N CAM抗原（MOC−１）、クラスター２上皮抗原（MOC−31）、クラスター２（MW＝約40KD）抗原（NrLu10）（Myklebustら，Br． J． Cancer Suppl.，63巻、49〜5 3頁、1991年）、HMW黒色腫関連抗原（9.2，27）（Morganら，Hybridoma，１巻、 27〜36頁、1981年）、80KDの肉腫関連抗原（TP1およびTP3）（Can-cer Res.，48 巻、5302〜5309頁、1988年）、ムチン抗原類（Diel ら，Breast Cancer Res.Tre atm.，1991年）またはEGF受容体抗原（425.3）（Merck社）に対する抗体がある。上記の425.3抗体は正常および悪性の細胞の両者の抗原に対する抗体である。抗体類としてはさらに、成長因子受容体、例えば EGF受容体、PDGF（ＡとＢ）受容体、インシュリン受容体、インシュリン様受容体、トランスフェリン受容体、NGFおよびFGFの受容体、インテグリン類の群、他の接着膜分子類および正常細胞と異常細胞の両者のMDRタンパク質、ならびに正常細胞と悪性細胞および悪性細胞の膜および悪性細胞にのみ発現される癌産生物例えばNeu/erb B2/HER2に加えて正常細胞の分集団に存在する抗原に対する抗体がある。悪性細胞としては、乳癌、卵巣癌および肺癌の細胞、黒色腫、肉腫、グリア芽細胞腫、胃腸器官および網内系の癌細胞があり、または標的細胞は、非新生物性疾患例えば心臓血管、神経、肺、自己免疫、胃腸、尿生殖器、網内系などの疾患に関連する細胞と関連している。さらに悪性細胞集団は、骨髄、末梢血液中に存在している場合があり、胸水および腹腔液および他の体液区分例えば尿、脳脊髄液、精液、リンパ液由来のものがあり、または正常な組織もしくは臓器例えば肝臓、リンパ節、脾臓、肺臓、膵臓、骨組織、中枢神経系、前立腺、皮膚および粘膜の充実性腫瘍由来のものがある。本発明の方法に用いる抗原決定基および対応する抗体または抗体フラグメントのより完全な一覧表を表１に示す。本発明の方法では抗体を常磁性粒子に直接結合させることからなり、またはその結合は例えばポリクローナル抗マウス抗体類、モノクローナルラット抗マウス抗体またはモノクローナル抗ヒト抗体のような、前記の個々の抗体のFc部分を特異的に認識する表面結合抗体（surface-bound antibody）に結合させることによって行うことができる。抗体で被覆された常磁性ビーズを次に被検細胞の懸濁液と混合し、次いでゆるやかに回転させながら、０〜25℃好ましくは４℃で５〜10 分間乃至２時間好ましくは30分間インキュベートする。また本発明の方法は、遊離の標的細胞の抗体を細胞懸濁液に添加し、ゆるやかに回転しながら０〜20℃好ましくは４℃で５〜10分間乃至２時間好ましくは30分間インキュベートし、ステップの順序を変更して実施してもよい。次に抗マウス抗体または抗ヒト抗体で予めコートした常磁性粒子を先に述べたのと同様にして上記のインキュベートした細胞懸濁液に添加し、得られた懸濁液をさらに、ゆるやかに撹拌しながら０〜25℃好ましくは４℃で５〜10分間乃至２時間好ましくは30 分間インキュベートする。次に細胞懸濁液の試料を細胞計数装置に移し、結合ビーズを有する細胞の細胞全数に対する割合を光学顕微鏡で測定した。細胞懸濁液に添加される、抗体でコートされたビーズの数は標的細胞の数の0.5〜10倍でなければならない。標的細胞の数が不明の場合、添加される被覆ビーズの量は細胞全数の１〜10％でなければならない。特定の場合、および標的細胞の密度が低い場合例えば悪性細胞もしくは標的細胞の細胞全数に対する割合が非常に低い場合（≦１％）標的細胞は、磁場内で非標的細胞から積極的に分離することができる。次にこの分離された標的細胞は顕微鏡で数えることができ、次いで最初の細胞懸濁液中の細胞合計数に対する標的細胞の割合を計算することができる。さらにその標的細胞は特異的な化学上および生物学上の特徴について特性を決定することができる。特に重要なことは、分子生物学の研究に上記の細胞を使うことである。本発明の方法は、従来技術の上記の方法とは著しく異なり、常磁性粒子−標的細胞の結合を切断することなく、標的細胞を研究し増殖させることができる。いくつもの目的のために、腫瘍生検試料中、ならびに血液、骨髄および他の体液例えば尿、脳脊髄液、精液、リンパ液中に存在する腫瘍細胞中、または他の正常な組織と臓器例えは肝臓、リンパ節、脾臓、肺臓、膵臓、骨組織、中枢神経系、前立腺、皮膚および粘膜由来のおよび細胞学上の研究活動の他の分野での標的細胞の純集団の特異的遺伝子をDNA、mRNAおよびタンパク質のレベルで試験することが重要である。従来技術の方法では、サザーンブロット、ノーザンブロットおよびウエスタンブロット法で得られるシグナルは、その生検試料中の正常細胞と腫瘍細胞を示す。単個細胞懸濁液を腫瘍物質から最初に調製し、次いでその腫瘍細胞を免疫磁気的に積極的に検出して分離すれば、この物質について行われる遺伝子の試験結果は標的細胞だけを示す。またこの方法は例えば哺乳類の組織中に存在する悪性細胞、例えば骨髄、末梢血液、胸水、腹腔水および他の体液例えば尿、脳脊髄液、精液およびリンパ液中の悪性細胞にも適応している。ポリメラーゼ連鎖反応（PC R）法による試験も、本発明の新しい方法で得た純粋の腫瘍細胞集団について実施すると特異性と信頼性とが向上する。本発明の新しい方法のステップの適用法は被検組織の種類によって異なっている。 a)充実性腫瘍の生検もしくは腫瘍の針生検由来の組織を機械的に処理するか、またはゆるやかに酵素で処理して単個細胞懸濁液を調製し、その懸濁液に、一次の特異的抗体もしくは抗体フラグメントを、直接添加するか、またはリン酸、緩衝食塩水もしくは例えばウシ胎児血清、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギもしくはヒトの血清のごとき血清を含有もしくは含有しない培地で細胞懸濁液を洗浄した後に添加する。 b)材料が胸水もしくは腹水、脳脊髄液、尿、リンパ液または各種の形態の関節炎にかかっている患者の関節の滲出液のような体液の試料の場合、特異的な抗体または抗体フラグメントを試料に、直接添加するか、または試料中の細胞を遠心分離し次いで再び懸濁させる前または後に、洗浄もしくは洗浄せずに遠心分離した後に添加する。 c)材料が血液または骨髄吸引液で構成されている場合、単核細胞の画分は、例えばLymphoprepで勾配遠心分離し次いで洗浄し再懸濁し、適切な抗体または抗体フラグメントを添加することによって分離される。 a)とb)の手順の条件は確立されており、以下に述べる成功した実験で得られた結果で例証されている。 c)の方法については、試験結果は、詳細に試験された多数の因子によって影響を受けることが見出された。これらの因子としては、抗体の濃度、常磁性粒子数：細胞の数の比率、インキュベーションの時間と容積、インキュベーション培地の種類およびpHのレベルがある。全試験における粒子：単核細胞の比率は、一次の特異的抗体もしくはフラグメントの結合アフィニティーによって0.5/1〜2/1の範囲内でなければならない。主な問題点は、ヤギもしくはラットの抗マウス抗体だけで、またはさらに特異的抗体でコートされた粒子が、正常な血液または骨髄の細胞に非特異的に結合することであった。試験の結果は、非特異的結合は特異的抗体が存在しない場合に等しく高いことを示した。このことは、上記問題が起こるのはターゲティング抗体の正常細胞に対する交差反応性が原因ではないことを示している。最適の場合より低い特異性がイオン結合で起こる可能性は除かれた。他の可能性は、Ｂ系統の正常細胞の分集団が粒子−抗体複合体に粘着するかもしれないという可能性である。しかし、特異的抗体／抗体−粒子複合体を添加する前に細胞懸濁液からＢ細胞を免疫磁気的に除去しても、特異的抗体／抗体−粒子複合体の特異性は改善されなかった。骨髄および末梢血液の分離された単核画分に用いた手順に付随する問題点すなわちいくらかの非標的細胞も常磁性粒子を捕捉するかもしれないという問題点は回避されるかまたは克服された。すなわち、ヒツジ抗マウス抗体でコートした粒子のみまたは特異的抗体によって、低画分の血液もしくは骨髄の単核細胞に非特異的に結合した粒子の数は平均して10から約１まで減少し、そして粒子を有する正常細胞の画分は平行して１〜２％から0.5〜１％以下まで減少した。上記問題点が常磁性粒子に結合した抗体に関連する疎水力（hydro-phobic for ce）によって起こる証拠が得られた。したがって本願ではこの疎水性を減少させる方法の特許を請求するものである。この方法の一つは、抗体でコートされた粒子と細胞懸濁液を適切な濃度の緩和な界面活性剤、例えば0.1％より低い濃度のT ween 20とともに40℃にて30分間プレインキュベートする方法である。標的細胞の選択が保証できるならば、細胞懸濁液が含有する界面活性剤の濃度は例えば0. 01％のTween 20のような低い濃度でなければならない。いくつもの試験において、この手順で行った場合、血液もしくは骨髄由来の単核細胞画分にみられる非特異的結合の問題はほとんど消失するかまたは劇的に減少した。他の改良法は、改良が保証されることが分かったならば、下記のように界面活性剤のステップとともに利用できる。一次の抗体もしくは抗体フラグメントおよび抗体でコートされた常磁性粒子とともに細胞懸濁液のインキュベーションを先に述べたように行ってから、その細胞懸濁液を、標的細胞の他の細胞外決定因子もしくは細胞内決定因子に対する抗体もしくは抗体フラグメントの第二のセットとともに、ホルムアルデヒドまたはアルコール類のような細胞固定液によって前処理するかまたはせずにインキュベートする。これらの抗体もしくはそのフラグメントは、蛍光剤類、金属コロイド類、放射性同位元素類、ビオチン複合体類、またはペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼのような酵素類で予め標識を付けて、それ自体公知の方法で、顕微鏡および／または適切な計数装置で目視可能にしなければならない。標的細胞は後者の方法で目視可能になるとともにその表面に粒子を捕捉するので、数えることができる。非標的細胞と標的細胞との区別を簡単にするため、細胞懸濁液を、第二の目視化ステップを行う前に、細胞スピン遠心分離にかけるか、または懸濁液の一部を、粒子に捕捉された細胞が薄層で広げられている被覆スライドガラスに付着させて、二重に“ステインされた（stained）”細胞を認識し易くすることができる。本発明の新しい手順で使用するため、キットには、例えば各モノクローナル抗体について調製した、予めコートされた常磁性粒子が入っている。他の実施態様では、キットに、その一部分として、IgGイソタイプ特異的の抗マウス抗体もしくは抗ヒト抗体で予めコートされた常磁性粒子が入っており、および他の部分として異なる標的細胞例えば腫瘍細胞関連の抗体が入っている。第三の実施態様では、特異的抗標的細胞抗体に捕捉された標的細胞関連抗体のFc部分に結合できるポリクローナル抗マウス抗体、またはモノクローナルのラット抗マウス抗体、または抗マウス抗体もしくは抗ヒト抗体のような特異的抗Fc抗体で予めコートされた常磁性粒子がキットに入っている。さらに別の実施態様では、所望の標的細胞内もしくは該細胞上の抗原／受容体に対する他の特異的抗体または抗体フラグメントがキットに入っており、前記の抗体または抗体フラグメントは、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなどの酵素に対しこれら酵素の関連基質とともに接合されているか、または前記抗体または抗体フラグメントは、特定の色を有するかまたはペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼのような結合した酵素を有する非常磁性粒子に結合されている。本発明の方法を、モデル実験、本発明の新しい方法の有用性を示す実施例および実験の用途の実施例によって以下に説明する。これらの実施例はいかなる場合でも本発明を限定しない。モデル実験： 1. 本発明の新しい手順による、抗体−ビーズ複合体の腫瘍細胞系との結合抗体−常磁性粒子複合体を腫瘍細胞に結合させる場合の抗体濃度と最適条件を決定するため、大パネルの癌細胞系を用いた。常磁性ビーズは、ヒツジ抗マウス抗体(SAM)でコートした常磁性粒子に特異的抗体をコートするか、またはまず細胞を特異的抗体とともにインキュベートし、洗浄し続いてSAMでコートされた粒子とともに第二のインキュベーションを行うことによって、細胞に結合される。これらの試験の結果を表2aと2bに示す。これらの表において＋印はいくつものヒーズがすべての細胞に結合していることを示し、（＋）印は少数のビーズが各細胞に結合しているかまたはすべての腫瘍細胞ではないがその表面にビーズが結合していることを示し、−印は全く結合がないことを示し、および（−）印は非常に弱い結合を示す。 2. 骨髄または末梢血液の単核画分中の腫瘍細胞を検出するため、次のようなモデル実験を行った。すなわち特異的抗体とＳＡＭでコートした常磁性粒子を、前記単核細胞または細胞懸濁液に加えた。なおその場合生体外で培養した細胞系由来の各種の数の癌細胞を前記単核細胞に添加した。いくつかの実験では、単核細胞または悪性細胞は、２種の細胞を区別できるように蛍光染料で予めステインした。すべての実験で非結合一次抗体および／またはヒツジ抗マウス抗体でコートしたビーズを別個に対照として使用した。いくつもの試験で、単核細胞に対するいくつかの非特異的結合が観察された。この現象は特異的抗体の種類には無関係であることが分かり、SAMでコートされた粒子の場合にのみ等しく顕著であった。この非特異的結合の程度はほとんどゼロから0.5〜２％のレベルまで変動した。この非特異的結合は、疎水性細胞の相互作用の問題を減らすために実施した界面活性剤（Tween 20）によるゆるやかな処理によってほとんど消失した。本発明の新しい手順の有用性を示す実施例１．血液および骨髄の微小転移新生物疾患の検出血液および／または骨髄への癌細胞の拡散の信頼の高い早期診断を行うことは、応用例の実施例１に記載されているように、癌腫を含む多くのタイプの癌を治療できる最適の治療法を選択するのにますます重要になっている。悪性黒色腫、肉腫、神経芽腫およびその他のいくつかの癌に対する類似の方法が確立されたかまたは開発中である。２．胸水もしくは腹腔水中および尿中の悪性細胞の検出上記の滲出液の性質は、特に、少数の癌細胞が正常な反応性細胞または上皮細胞とともに存在しているときに重大な診断上の問題を示す。従来の細胞学的試験法では陰性であるか結論を出せなかった症例中、いくつかの症例で、本発明の新しい方法を用いて的確な診断が迅速に行われた。腎臓または尿路と膀胱の癌の症例でも類似の利点が見られた。３．脳脊髄液中の新生物細胞の検出多くのタイプの癌の全身治療法が改善されたので、症状を示す(symptom-givin g)脳転移を有する症例の頻度が著しく増大し、これに平行してこのような拡散を早期に検出することが必要になった。本発明の新しい方法を使用すれば、少数の悪性細胞でも容易に同定できるので、頭蓋内腫瘍の徴候の早期段階で治療法を選択して治療できる。４．生検用に採取した組織中の癌の診断癌の疑いがあり、外科的方法または例えは針生検によって組織の生検試料が得られる場合、調製された細胞懸濁液に対して本発明の新しい方法を用いれば、従来の免疫学的方法もしくは免疫組織学的方法もしくは細胞化学的方法に比べてはるかに簡単でかつ迅速な診断を行うことができる。いくつかの種類の癌の区別は適切な抗体を用いることによって行うことができる。５．予後の指標の同定いくつもの膜分子の発現は、いくつもの癌の悪性疾患の進行と相関関係があることが分かったので、本発明の方法は、例えば応用例の実施例２に記載されているように予後の指標を同定するのに使用できる。６．特定の疾患または疾患の進行もしくは状態を示す細胞の同定各種のリユーマチ性疾患（例えばリユーマチ性関節炎）ならびにアレルギー性、自己免疫性および心臓血管の疾患において、細胞の特異的分集団がが全身に存在しているか局在しているかの同定は、診断および病期の決定を行うのに重要である。したがって上記の細胞集団を本発明の方法で迅速に検出することは診断と治療との面で極めて重要である。７．正常細胞の分集団の検出いくつかの目的のため、集団中の正常細胞の特定の分集団の画分を検出することが重要である。このことは例えば胆管上皮抗原を発現する細胞の同定が大切である肝臓の生検に当てはまる。同様に、種々の正常な組織から調製した細胞懸濁液由来の特異的上皮細胞の同定と分離とが保証される。上記１〜６章に挙げた細胞膜分子のいくつかは、いく種類もの活性化されたキラー細胞または例えば免疫毒素に対する免疫療法に用いる標的としても用いることができる。それ故に、上記の分子の発現を本発明の新しい方法で同定することも、上記の種類の治療を用いなければならない症例を決定するのに価値がある。本発明の実用例の実施例実施例１血液および／または骨髄への癌細胞の拡散を早い段階で診断するために、本発明の新しい方法に、MOC-31、NrLu10、BM2、BM7、12H12およびMLuC1の抗癌腫抗体を用いて、乳癌、肺癌、結腸直腸癌および前立腺癌由来の微小転移疾患が上記体液中で高感度に同定できるか否かを決定した。これらの抗体を用いた結果成功したがこれは臨床上重要な意味がある。実施例２いくつもの細胞膜分子の発現は幾種類もの癌の悪性疾患の進行と相関関係があることが分かった。したがって、かような抗体のそれぞれの抗体との結合を検出することは高い予後価(high prognosticvalue)の情報を得るために使用できる。このような抗原の中には、以下に列挙する多数の接着性分子、炭水化物抗原、糖脂質、成長因子受容体、および癌腫マーカーがある。本発明の新しい方法によって、粒子−抗体複合体と次のものすなわちCD44変異体、Ｅ-カドヘリン、LeY、CE A、EGF-r、トランスフェリン受容体、MUC-1エピトープ、LUBCRU-G7 エピトープ、前立腺癌抗原、UJ13A エピトープ、β₂−ミクログロブリン、HLA-抗原および細胞消滅受容体との結合を同定した。実施例３悪性黒色腫にかかっていると考えられる患者から２ｌの胸水拡散液を得た。遠心分離を行った後、10％のウシ胎児血清を含有するRPMI２ｍｌの容積中に細胞を懸濁させ、9.2.27抗黒色腫抗体(10μｇ/ｍｌ)とともに４℃で30分間インキュベートし、洗浄し、Dynabeads SAMM450/IgG2Aとともに４℃で30分間再びインキュベートした。次にその細胞懸濁液を顕微鏡で試験してその表面に常磁性細胞が結合している細胞の画分を測定した。約10％の細胞が有意な数の粒子ロゼットをもっていたとき、悪性黒色腫の診断を確認した。実施例４小細胞肺癌もしくは悪性黒色腫の臨床指標を有する症例の皮下腫瘍から生検組織を得た。その生検試料から単個細胞懸濁液を調製し、二つの画分に分割し、一方を9.2.27抗黒色腫抗体とともにインキュベートし、他方をMOC-31抗癌腫抗体とともにインキュベートした(両方ともに10μｇ/ｍｌ）。このインキュベーションは上記実施例で利用したのと類似している。黒色腫抗体とともにインキュベートした細胞はビーズを全く捕捉しなかったが、MOC-31とともにインキュベートしたすべての腫瘍細胞は陽性であった。実施例５悪性黒色腫をもっている疑いがある患者から得た生検組織を、単個細胞懸濁液を調製し、9.2.27抗黒色腫抗体とともにインキュベートし次いで上記手順にしたがって試験した。その細胞の大部分は陽性であり、多数の粒子−ロゼットが細胞の膜に結合していた。実施例６乳癌患者由来の胸水を、その液体中に腫瘍細胞を検出できるか否かを試験するために研究した。その液体１ｌを遠心分離し、得られた細胞を再懸濁させ、次に別々のバイアルびん中で、３種の異なる各抗癌腫抗体(MOC-31、2E11、12H12)とともにインキュベートした。前記実施例と同様に手順を完了した後、３例すべてでほとんどの細胞が抗体被覆粒子に結合することが見出された。実施例７乳癌患者から得た骨髄懸濁液を研究して、微小転移腫瘍細胞が存在しているか否かを試験した。単核細胞を調製した後、この細胞を、上記実施例に使用したのと同じ３種の抗癌腫抗体とともにインキュベートした。しかしこの場合、抗体はまずDynabeads SAM IgM常磁性粒子に結合した。これらの直接コートされた粒子と１回インキュベートした後、その細胞懸濁液を顕微鏡で検査し、多数の細胞が陽性であることが見出され、多数の粒子−ロゼットが細胞の膜に結合していた。同様の試験を、乳癌の患者由来の胸水もしくは腹腔水および骨髄のいくつかについて実施した。実施例８ T47Dヒト乳癌細胞を、時間を変えてヘキスト社の蛍光塗料とともにインキュベートし次いでその標識を付けた細胞の生存力を検査した。標識を付けた乳癌細胞の数を変えて、健康なボランティアから得た１×１０⁶個の骨髄細胞に添加した。異なる試験において、個々の抗癌腫抗体(NrLu10、MOC31または12H12)でコートした常磁性の単分散粒子（Dynabeads P450）を異なる濃度で添加した。氷上で30 分間インキュベートした後、異なる試験管の試料を、計数チャンバー内で光学顕微鏡と蛍光顕微鏡とを用いて試験した。腫瘍細胞／全有核細胞の比率が低かった場合は、その細胞懸濁液を磁場にかけ、結合した粒子を有する細胞を分離し次いで顕微鏡で検査した。細胞混合物中、１腫瘍細胞当たり１〜10の常磁性ビーズという最適の比率では、すべての腫瘍細胞はその表面に２〜15個のビーズが結合されていた。この検出法の感度は、１０⁴個の有核細胞当たり１個の標的細胞に近かった。正常細胞に対していくらか交差反応を有することが分かっている抗体を用いて、標識をつけた腫瘍細胞で対照試験を行い、この交差反応性が抗体でコートされた常磁性粒子にあることが確認された。腫瘍関連抗体のコーティングなしのビーズの試験ではとの標的細胞もビーズを全く捕捉しなかった。他の乳癌系と小細胞肺癌細胞系の両者について類似の試験を行った。これらの試験で類似の感度と特異性とが得られた。実施例９乳癌および卵巣癌の患者由来の胸水と腹腔水とをセントリフューズ(sentrifug ed)、実施例１で使用したのと同じ被覆常磁性粒子を添加し、インキュベートし、次いで磁場内で濃縮し、そしてその懸濁液を光学顕微鏡で試験した。一般に、腫瘍細胞の明らかな形態学的特徴を有する細胞にはビーズが結合しており、一方少数の正常細胞は、抗体でコートされたビーズを全く捕捉しなかった。胸水の二つの例では、独立して形態学的試験をしたが腫瘍細胞は全く存在しなかったが、一方抗体でコートしたビーズを用いることによってかなりの数の悪性細胞が検出された。いくつかの場合に、腫瘍細胞を磁場内で分離し、乳癌細胞を増殖させるために特別に調製した増殖培地が入っている組織培養フラスコに移して、これらの培養物から永久細胞系を樹立することを試みた。平行して悪性滲出液由来の細胞を、磁性ビーズによる積極的選択なしで直接培養した。後者の場合、細胞系は全く樹立できなかったが、積極的に選択された腫瘍細胞を用いた場合その50％以上が細胞系の樹立に成功した。実施例10 いくつかの症例について、乳癌の患者から得た骨髄および末梢血液を、抗体でコートされた常磁性ビーズを加え、４℃で30分間インキュベートし、次に磁界内で濃縮し、そして光学顕微鏡で懸濁液を試験することによって、本発明の方法で試験した。両方の場合、腫瘍細胞に対する常磁性ビーズの結合程度は、骨髄と血液中とで有核細胞の0.1〜１％であることが検出されたが、他のいかなる方法も細胞を検出できなかった。実施例11 特異的細胞集団の表面に発現された特定の成長因子受容体または他の遺伝子産物に対する抗体を用いて、これらの細胞を同定し次いで積極的に選択することができる。本発明の新規な方法で、抗トランスフェリン受容体抗体でコートしたビーズを用いたところ、本発明の方法は、トランスフェリン受容体を発現する細胞を同定する迅速で簡単な高感度の方法であることが分かった。実施例12 各種の目的のため、正常細胞の特異的集団を分離することを保証する。正常組織または腫瘍組織中の毛細血管もしくは小血管の内側を覆う内皮細胞は、関連組織から調製した細胞懸濁液から積極的に選択することができた。この方法では該内皮細胞上では発現されるが細胞混合物の他の正常細胞上では発現されない構造に対する抗体でコートしたビーズを用いた。実施例13 免疫不全のげっ歯動物に注射されたヒト細胞は、抗パンヒト抗体でコートした磁性粒子を用いることによって、腫瘍異種移植片および各種の宿主の臓器／組織から調製した細胞懸濁液中に存在していることが分かった。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９４年８月２６日【補正内容】請求の範囲 1. 混合細胞集団の細胞懸濁液および混合細胞集団を含有する流体系、ならびに充実性組織から調製した単個細胞懸濁液の中の特異標的細胞を検出する方法であって、以下のステップ： 1.1．ａ)細胞混合物中で標的細胞上に特異的に発現されるが非標的細胞上では発現されない膜構造物に対する抗体類もしくは抗体フラグメント類またはｂ) 膜構造物に対する前記抗体類のFc部分に結合し得る抗体類、好ましくはポリクローナル抗マウス抗体もしくはモノクローナルラット抗マウス抗体もしくは抗ヒト抗体で、それ自体公知の方法により、常磁性の粒子もしくはビーズをコートし、次いで 1.2.1. 前記粒子もしくはビーズに結合されているか、または標的関連抗体の FC部分を認識する抗マウス抗体もしくは抗ヒト抗体で予めコートしたビーズに結合されている標的細胞関連抗体（マウスまたはヒト）を、標的細胞を含有する細胞懸濁液と混合するか、または 1.2.2. 遊離した標的細胞関連抗体を、標的細胞を含有する細胞懸濁液と混合し、この混合物を５〜10分間乃至２時間好ましくは30分間、０℃〜20℃の温度好ましくは４℃でゆるやかに回転しながらインキュベートし、次に 1.3. 細胞懸濁液、および常磁性粒子もしくはビーズ(1.2.1.)または標的関連抗体のFc部分を認識する抗マウス抗体もしくは抗ヒト抗体で予めコートされた常磁性粒子もしくはビーズに結合されたかインキュベートされた遊離標的関連抗体と細胞懸濁液との混合物(1.2.2.)に結合された遊離標的関連抗体の混合物をインキュベートし、次いで０℃〜25℃好ましくは４℃の温度で５〜10分間乃至２時間好ましくは30分間ゆるやかに回転しながらインキュベートし、および 1.4.1. 標的細胞集団が血液もしくは骨髄の吸引液中に含有されている場合は、抗体でコートされた粒子と細胞懸濁液を、適切な濃度の緩和な界面活性剤例えば0.1％未満の濃度のTween20（登録商標）とともに４℃にて30分間予めインキュベートすることによって、抗体でコートされた粒子に関係する疎水力を低減し、および／または 1.4.2. ホルマリン、アルコールまたは他の固定液で処理しないかまたは前処理された細胞懸濁液を、標的細胞中に存在する細胞外もしくは細胞内の分子に結合する他の抗体もしくは抗体フラグメントとともにインキュベートすることによって、そして使用される抗体は、関連基質を添加しインキュベートすることにより、その結合を目視可能にできるペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたはその他の酵素で予め標識を付けるか、または 1.4.3. 抗体フラグメントはビオチニル化され、その結合は、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたは他の酵素と複合させたアビジンを添加しインキュベートし、関連基質を添加しインキュベートすることによって目視可能になり、または 1.5.1. 標的細胞の密度が低いかまたは細胞混合物中の標的細胞／全細胞の比率が低い（≦１％）場合は、インキュベートされた常磁性粒子−細胞混合物(1.3 .)に磁場をかけ、次いで顕微鏡および／または適切な細胞／粒子計数装置を用いて、細胞懸濁液中のステインされたかまたは未ステインの粒子−標的細胞複合体を検査して計数し、または 1.5.2. 常磁性粒子、抗体および細胞混合物のインキュベートされた混合物(1 .3.)中の標的細胞を試験して計数し、抗体もしくは抗体フラグメントが、色のために直接目視可能になるかもしくは酵素の活性化で目視可能になる非常時磁性粒子に接合されている場合、細胞懸濁液中の標的細胞／全細胞の比率が適切である（＞１％）とき、顕微鏡および／または適切な細胞／粒子計数装置を用いる、を有することを特徴とする改良方法。 2. 正常な生存細胞、例えば肝実質細胞、クッペル細胞、肺臓の内皮細胞タイプ１と２およびクララ細胞、特定の臓器の内皮細胞、膵臓の外分泌細胞と内分泌細胞、腎臓の細管細胞、膀胱の上皮細胞、脳のグリア細胞と上衣細胞、膀胱と前立腺の上皮細胞、気道の線毛細胞、胃腸管の粘膜細胞の異なる分集団、下垂体細胞、および各種のホルモン産生器官の他の内分泌細胞の中の抗原に対する抗体またはそのフラグメントを用いることを特徴とする請求項１記載の方法。 3. 正常細胞の分集団上に存在する抗原および正常組織細胞の膜上で発現される腫瘍遺伝子産物に対して反応性の抗体を、前記標的細胞抗体として使用することを特徴とする前述の請求項の何れか１つに記載の方法。 4. 正常細胞の膜上の成長因子受容体類、例えばEGF受容体、PDGF（ＡおよびＢ）受容体、インシュリン受容体、インシュリン様受容体、トランスファリン受容体、NGFとFGFの受容体に対する抗体を、前記の積極的に選択する抗体として使用することを特徴とする前述の請求項の何れか１つに記載の方法。 5. インテグリン類と、他の接着性膜分子の群、および正常細胞中のMDRタンパク質類に対する抗体を用いることを特徴とする前述の請求項の何れか１つに記載の方法。 6. 異常な発育パターンを有する細胞、好ましくは例えば原発および転移の癌細胞の中の抗原もしくは受容体に対する抗体もしくはそのフラグメントを用いることを特徴とする前述の請求項の何れか１つに記載の方法。 7. IgGのイソタイプ、またはＦ(ab′)₂もしくはＦ(ab)のフラグメント、またはIgMもしくはそのフラグメントの抗体を、前記標的細胞関連抗体として用いることを特徴とする前述の請求項の何れか１つに記載の方法。 8. 哺乳動物の組織例えばヒトの骨髄と末梢血液を含む混合細胞集団から、胸水と腹腔水および他の体液例えば尿、脳脊髄液、精液、リンパ液から、または正常な組織と臓器例えば肝臓、リンパ節、脾臓、肺臓、膵臓、骨組織、中枢神経系、前立腺、皮膚および粘膜から前記細胞懸濁液を調製することを特徴とする前述の請求項の何れか１つに記載の方法。 9. 抗体もしくは抗体フラグメントが、抗原決定基の群、例えば明細書の表１に列挙されたものに対する抗体もしくは抗体フラグメントであることを特徴とする前述の請求項の何れか１つに記載の方法。 10．悪性細胞の膜上に発現される成長因子受容体と腫瘍遺伝子産物、例えば明細書の表１に列挙されているものに加えてインシュリン受容体、インシュリン様受容体およびFGF受容体に対する抗体もしくは抗体フラグメントを、前記標的細胞の抗体として用いることを特徴とする前述の請求項の何れか１つに記載の方法。 11．インテグリン類と他の接着性膜分子の群および表１に列挙されている異常細胞中のMDRタンパク質に対する抗体もしくは抗体フラグメントを用いることを特徴とする前述の請求項の何れか１つに記載の方法。 12．用いられる抗体、抗体フラグメントまたはそれらの混合物が、明細書の表１に列挙されている抗原決定基に該当することを特徴とする前述の請求項の何れか１つに記載の方法。 13．異常細胞、例えば乳癌、卵巣癌および肺癌の細胞、黒色腫、肉腫、グリア芽細胞腫、胃腸管と尿生殖器官および網内系の癌細胞、および／または非新生物疾患、例えば心臓血管障害、神経障害、肺障害、自己免疫障害、胃腸障害、尿生殖器障害、網内系障害などの障害に関連する標的細胞上に存在する抗原と反応性の抗体を、前記抗体として用いることを特徴とする前述の請求項の何れか１つに記載の方法。 14．標的細胞を分離するのに用いる、前述の請求項の何れか１つに記載の検出方法の用途であって、細胞と常磁性粒子との複合体を磁場に暴露し、磁気で凝集させて得た細胞をさらに、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)と逆転写酵素PCRとを含めて特定の遺伝子のDNA、mRNAおよびタンパク質のレベルでの特性決定を含む生物学的、生化学的および免疫学的試験に付す用途。 15．前述の請求項の何れか１つに記載の、特定の標的細胞の検出方法の用途であって、分離された常磁性粒子−標的細胞複合体から生体外細胞培養物を樹立するのに用いおよび／または好ましくは免疫不全動物に接種して前記動物内にヒトの腫瘍異種移植片を樹立する用途。 16．1.所望の標的細胞上の抗原受容体に対する特異的抗体もしくは抗体フラグメントであって、その抗原結合性能を除かずに、含有されている常磁性粒子に結合されるかもしくは結合されうる抗体もしくは抗体フラグメント、および／または 2.標的細胞関連抗体および特異的遊離標的細胞抗体のFc部分に結合できる、特異的な抗Fc抗体類、好ましくはポリクローナル抗マウス抗体またはモノクローナルラット抗マウス抗体または抗ヒト抗体で予めコートされた常磁性粒子、および／または 3.特異的抗標的細胞抗体に結合された標的細胞関連抗体のFc部分に結合できる、特異的抗Fc抗体類、好ましくはポリクローナル抗マウス抗体もしくはモノクローナルラット抗マウス抗体もしくは抗ヒト抗体で予めコートされた常磁性粒子、および／または 4. 所望の標的細胞内もしくは該細胞上の抗原／受容体に対する他の特異的抗体または抗体フラグメントであって、ビオチン、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたは他の酵素に接合されているかまたは特定の色を有しているかまたはペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼのような酵素が結合している非常磁性粒子に結合されている抗体または抗体フラグメント、を有することを特徴とする前述の請求項の何れか１つに記載の方法を実施するためのキット。【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９４年８月２６日【補正内容】明細書特殊細胞集団もしくは混合細胞集団および混合細胞集団を含有する溶液中の特異標的細胞の検出方法本発明は細胞集団および細胞集団の溶液中の特異標的細胞の免疫磁気的検出方法(immunomagnetic method for detection)に関する。また本発明は、異なる細胞集団に上記方法を実施するのに適したキットに関する。生物学、生化学さらにその隣接科学分野には、化学物質が相互に関連した方法に対する需要が多い。このような方法は、正常なおよび異常な細胞集団の両者について研究する場合により重要となる。特に固体の支持体を用いると、細胞は固定され、検出され、分離されて精製することができる。さらに、細胞含有物は一連の高性能の方法を用いて試験することができる。また細胞を生育可能な形態で分離できることも重要である。アフィニティー結合法は化学物質／生化学物質を連結する高性能の方法である。この方法では、一対の結合パートナーは（例えば連結される物質に結合される）接触させると互いに結合する。このような結合において結合パートナーの一方は細胞表面の一分子によって表される。このような結合パートナー系の多くは公知であり、例えば細胞における抗原−抗体、酵素−受容体、リガンド−受容体の相互作用およびビオチン−アビジンの結合があるが、これらのなかで抗原−抗体の結合が最も頻繁に使用される。ハプテン／抗ハプテン結合対法も最近提案されている(WO 91/01368)。上記のような方法が特異的な細胞（その後の各種の試験に用いる被検体）を分離するのに利用される場合、結合しているパートナーに対して破壊作用を起こさずに結合を切断する必要があり、理想的には、結合パートナーは元の状態に戻ったときにその機能を回復しなければならない。抗原／抗抗原およびハプテン／抗ハプテンの結合を適正に切断する方法が提案されているが(WO 91/15766，WO 91/01368)、上記のことは必ずしも実現されていない。結合パートナーの一方が不溶性の支持体例えば常磁性粒子に結合されている方法は公知であり、この方法によって混合細胞集団中の標的細胞の分離が消極的分離もしくは積極的分離として実施される。消極的分離法では、不要な細胞は、不要細胞に対して特異的な抗体でコートされた粒子とともに細胞とインキュベートすることによって細胞試料から除くことができる。インキュベートを行ってから、細胞／抗体／粒子複合体は粒子を用いて除去し、必要な標的細胞を残すことができる。この結果は不満足な場合が多い。というのは、必要な細胞は多少は精製されているが細胞集団中に残り、またこの分離法の目的は特異標的細胞について試験しおよび／またはさらに研究することだからである。積極的分離を行うために粒子を使用する試みがなされている。この場合、必要な標的細胞が混合細胞集団から取り出される。しかしこれらの方法はある種の標的細胞に用いられているがすべての標的細胞系に対して適しているわけではない。ハプテン／抗ハプテン結合系に関する積極的分離法が最近提案されており(WO 91/01368)、また骨髄から造血前駆細胞を分離する方法も提案されている(WO 91/09938)。後者の方法は、特異細胞すなわち造血前駆細胞を分離し骨髄中で増殖させるため、積極的なおよび消極的な選択を組合わせて用い、粒子の取り出しによって行われる。 WO 91/01368には、ハプテン、抗ハプテン抗体類および抗細胞抗体類が互いに結合する性能を利用して、不溶性支持体すなわち粒子と標的細胞との結合、すなわち少なくともハプテンと抗ハプテン抗体またはハプテンと抗ハプテン抗体および抗抗ハプテン抗体もしくは第二の抗細胞抗体との組合わせからなる結合を形成させることによって、標的細胞を不溶性支持体に連結する方法が記載されている。この複合体のその後の切断は、その複合体をハプテンもしくはハプテン類似体に再び暴露することによって行われる。したがって形成された結合にはーつ以上の成分に加えて常にハプテンを含有している。この方法は、非特異的な標的細胞に関しおよび標的細胞の分離と不溶性支持体の放出に関する。非特異的なハプテン群の化合物を含有せず、また非特異的細胞との会合を最小限にして特異標的細胞の検出を行って、不溶性支持体と特異標的細胞間の結合を後で切断する必要をなくするような、標的細胞と不溶性支持体とを連結する簡単な結合が要求されている。 WO 92/04961は、コロイド状の磁性粒子を用いて非磁性試験媒体から細胞又は異なる分子を分離するための方法および複合化した装置を含んでいる。この方法では、溶液内での粒子の沈殿を避けるためにまたその方法は複雑な分離過程を必要とするので、小さな（サブミクロン）粒子が使用され、その分離過程で、磁界を強める手段が試験媒体に作用する。これは細胞に反対の影響を及ぼす。したがって本発明の目的は、特異的標細胞を血液中および骨髄中で用いた場合、正常細胞に非特異的に結合する問題を起こすことなく特異標的細胞を、診断のために検出することである。換言すれば、多数の細胞を顕微鏡で容易に選別することができかつ操作が迅速で簡単な、各種細胞型の高感度検出法である。さらに本発明の方法は、細胞−粒子複合体を分解する必要なしに、細胞を培養後、生化学、生物学および免疫学の試験を行うためおよびヌクレオチドまたはタンパク質のレベルで特異的な遺伝子を試験するため細胞を分離するのに用いることができる。本発明の他の目的は本願の特許請求の範囲に特定されている方法を実施するのに用いるキットを提供することである。本発明の目的は、本願の特許請求の範囲に特定されている方法とキットとによって達成される。混合細胞集団および細胞集団含有生理学的溶液中の標的細胞の免疫磁気検出を行う本発明の方法は、特定のタイプの正常細胞と病原細胞との両者を検出するのに適しているだけでなく、両者の積極的分離を行うのにも用いることができる。本発明の方法によれば、特異的な標的細胞と常磁性粒子（一つもしくは二つの成分で構成されている）のような不溶性支持体との結合が形成される。この粒子は、必要な標的細胞の膜中の特異的抗原決定基に対するマウスもしくはヒト起源の抗細胞抗体でコートされるか、またはこの粒子は標的細胞の膜の抗原決定基に対する特異的抗細胞抗体のFc部分に結合できるポリクローナルの抗マウス抗体もしくは抗ヒト抗体でコートされる。この粒子をコートするためにポリクローナルの抗マウス抗体／抗ヒト抗体を使用する代わりに、モノクローナルのラット抗マウス／抗ヒト抗体を使用することができる。この最後の抗体は、部分的にモノクローナル起源であるため、抗細胞抗体と一層特異的に結合するので、血液のような溶液中で他の細胞と交差反応を起こす危険性が減少する。さらに、細胞懸濁液を、緩和な界面活性剤および／または目視可能にする蛍光剤類、金属コロイド類(m etallocolloids)、放射性同位元素類、ビオチン複合体類もしくはある種の酵素類で予め標識をつけてあるかつけてない抗体類もしくは抗体フラグメント類の第二のセットとともにインキュベートするとこの方法の特異性か劇的に増大する。以下に、検出および分離を行う標的細胞として癌細胞を用いて本発明を詳しく説明する。しかし本発明の方法は癌細胞に限定されず、かつその開示事項はこの特定の使用分野に本発明の方法を限定するものではない。本発明の方法は広く細胞学の研究に適しているからである。癌患者を管理する場合、癌が局在しているかどうか、または転移拡散が他の組織に起こっているかどうかについて疾患の病期分類を行うことが、個々の患者に対して治療法を選ぶ場合に最も重要である。悪性細胞は、リンパ管を経由して周囲の組織中に直接侵入するかまたは血液中の腫瘍細胞が骨髄および中枢神経系および脳脊髄液を含む遠隔臓器に分散することによって広がる。転移腫瘍細胞の検出は、最近まで、生検用に採取した腫瘍試料、骨髄および末梢血液の塗抹標本および各種の体液をサイトセントリヒューゲーション(cytosen trifugation)に付した後作製したスライドガラス上の試料に対して光学顕微鏡と電子顕微鏡を用いて行う形態学的方法によって行われてきた。抗原を認識するモノクローナル抗体は主として、異なるタイプの悪性細胞の表面に出現するので、転移細胞の同定には、免疫細胞化学と免疫蛍光との使用が増大している。したがって、生検用に採取した腫瘍またはサイトセントリヒューゲート(cytosentrifug ate)から作製したスライドガラス上の試料をモノクローナル抗体で処理して、これら抗体と腫瘍細胞との結合を着色もしくは蛍光によって目視可能にする。後者の蛍光による方法の場合、蛍光顕微鏡を使用する必要があり、あるいは細胞懸濁液を作製して流動細胞測定器を使用する。従来の方法は感度および／または特異性が限定され、通常面倒でかつ時間がかかりまた高度の熟練が必要である。また流動細胞測定法には高価な装置が付随している。血液および骨髄中の腫瘍細胞を検出する形態学方法は、免疫細胞化学法および免疫蛍光法を用いる方法より感度がはるかに低い（Be iskeら，Am．J．Pathology，141巻３号，1992年９月）。しかし後者の方法は、腫瘍細胞が有核細胞の合計数の１％より少ない場合には不充分である。流動細胞測定法は、顕微鏡を使用する方法より感度が優れているが多数の細胞を入手できることが必要であり、またいくつかの技術的に難しい点がある。すなわち、細胞が凝集して問題を起こすことがあり、そしてこの方法は標識をつけた腫瘍細胞と非特異的に蛍光を発する正常細胞とを識別することができない。本発明の方法は、多数の細胞を顕微鏡で容易に選別することができかつ結合された磁気ビーズは容易に認識できるので、例えば転移腫瘍細胞を非常な高感度で検出することができる。使用されるモノクローナル抗体は、例えば腫瘍細胞と充分な特異性で結合するが、血液、骨髄のような混合細胞懸濁液中に存在し他の腫瘍徴候を示す、標的細胞以外の細胞には結合せず、結合したビーズを有する細胞はすべて標的細胞である。その上、その手順は迅速かつ簡単に行うことができしかも従来の顕微鏡を使っていずれの研究者でも実行できる。本発明の新規な方法では、腫瘍細胞に存在するが、問題の正常細胞もしくは他の目的のための正常細胞の特定の分集団には存在しない抗原を特異的に認識する例えばマウスもしくはヒト起源のモノクローナル抗体を、常磁性粒子に直接結合させるか、または腫瘍細胞に結合するそれぞれの抗体もしくはIgG抗体のFc部分を特異的に認識する抗体で予め覆ったビーズに結合させる。細胞に結合する抗体はIgG型もしくはIgM型でありまたはabIgGもしくはIgMである。使用される抗標的細胞抗体の例としては、抗パン・ヒト抗体（Brulandら、未刊行；動物細胞中のヒト細胞を検出するのに適している）に加えて、抗原決定基の群、例えばCD56/N CAM 抗原(MOC-1)、クラスター２上皮抗原(MOC−31)、クラスター２(MW＝約40KD) 抗原 (NrLu10) (Myklebustら，Br．J．Cancer Suppl., 63巻、49〜53頁、1991年) 、 HMW黒色腫関連抗原（9.2，27）（Morganら，Hybridoma，1巻、27〜36頁、19 81年)、80KDの肉腫関連抗原(TP1およびTP3)(Cancer Res., 48巻、5302〜5309頁、1988年)、ムチン抗原類(Diel ら，Breast Cancer Res．Treatm., 1991年)またはEGF受容体抗原(425.3)(Merck社)に対する抗体がある。上記の425.3抗体は正常および悪性の細胞の両者の抗原に対する抗体である。抗体類としてはさらに、成長因子受容体、例えばEGF受容体、PDGF（ＡとＢ）受容体、インシュリン受容体、インシュリン様受容体、トランスフェリン受容体、NGFおよびFGFの受容体、インテグリン類の群、他の接着膜分子類および正常細胞と異常細胞の両者のMDR タンパク質、ならびに正常細胞と悪性細胞および悪性細胞の膜および悪性細胞にのみ発現される癌産生物例えばNeu/erb B2/HER2に加えて正常細胞の分集団に存在する抗原に対する抗体がある。悪性細胞としては、乳癌、卵巣癌および肺癌の細胞、黒色腫、肉腫、グリア芽細胞腫、胃腸器官および網内系の癌細胞があり、または標的細胞は、非新生物性疾患例えば心臓血管、神経、肺、自己免疫、胃腸、尿生殖器、網内系などの疾患に関連する細胞と関連している。さらに悪性細胞集団は、骨髄、末梢血液中に存在している場合があり、胸水および腹腔液および他の体液区分例えば尿、脳脊髄液、精液、リンパ液由来のものがあり、または正常な組織もしくは臓器例えば肝臓、リンパ節、脾臓、肺臓、膵臓、骨組織、中枢神経系、前立腺、皮膚および粘膜の充実性腫瘍由来のものがある。本発明の方法に用いる抗原決定基および対応する抗体または抗体フラグメントのより完全な一覧表を表１に示す。本発明の方法では抗体を常磁性粒子に直接結合させることからなり、またはその結合は例えばポリクローナル抗マウス抗体類、モノクローナルラット抗マウス抗体またはモノクローナル抗ヒト抗体のような、前記の個々の抗体のFc部分を特異的に認識する表面結合抗体(surface-b ound antibody)に結合させることによって行うことができる。抗体で被覆された常磁性ビーズを次に被検細胞の懸濁液と混合し、次いでゆるやかに回転させながら、０〜25℃好ましくは４℃で５〜10分間乃至２時間好ましくは30分間インキュベートする。また本発明の方法は、遊離の標的細胞の抗体を細胞懸濁液に添加し、ゆるやかに回転しながら０〜２０℃好ましくは４℃で５〜10分間乃至２時間好ましくは30分間インキュベートし、ステップの順序を変更して実施してもよい。次に抗マウス抗体または抗ヒト抗体で予めコートした常磁性粒子を先に述べたのと同様にして上記のインキュベートした細胞懸濁液に添加し、得られた懸濁液をさらに、ゆるやかに撹拌しながら０〜25℃好ましくは４℃で５〜10分間乃至２時間好ましくは30分間インキュベートする。次に細胞懸濁液の試料を細胞計数装置に移し、結合ビーズを有する細胞の細胞全数に対する割合を光学顕微鏡で測定した。細胞懸濁液に添加される、抗体でコートされたビーズの数は標的細胞の数の0.5〜10倍でなければならない。標的細胞の数が不明の場合、添加される被覆ビーズの量は細胞全数の１〜10％でなければならない。特定の場合、および標的細胞の密度が低い場合例えば悪性細胞もしくは標的細胞の細胞全数に対する割合が非常に低い場合（≦１％）標的細胞は、磁場内で非標的細胞から積極的に分離することができる。次にこの分離された標的細胞は顕微鏡で数えることができ、次いで最初の細胞懸濁液中の細胞合計数に対する標的細胞の割合を計算することができる。さらにその標的細胞は特異的な化学上および生物学上の特徴について特性を決定することができる。特に重要なことは、分子生物学の研究に上記の細胞を使うことである。本発明の方法は、従来技術の上記の方法とは著しく異なり、常磁性粒子− 標的細胞の結合を切断することなく、標的細胞を研究し増殖させることができる。いくつもの目的のために、腫瘍生検試料中、ならびに血液、骨髄および他の体液例えば尿、脳脊髄液、精液、リンパ液中に存在する腫瘍細胞中、または他の正常な組織と臓器例えば肝臓、リンパ節、脾臓、肺臓、膵臓、骨組織、中枢神経系、前立腺、皮膚および粘膜由来のおよび細胞学上の研究活動の他の分野での標的細胞の純集団の特異的遺伝子をDNA、mRNAおよびタンパク質のレベルで試験することが重要である。従来技術の方法では、サザーンブロット、ノーザンブロットおよびウエスタンブロット法で得られるシグナルは、その生検試料中の正常細胞と腫瘍細胞を示す。単個細胞懸濁液を腫瘍物質から最初に調製し、次いでその腫瘍細胞を免疫磁気的に積極的に検出して分離すれば、この物質について行われる遺伝子の試験結果は標的細胞だけを示す。またこの方法は例えば哺乳類の組織中に存在する悪性細胞、例えば骨髄、末梢血液、胸水、腹腔水および他の体液例えば尿、脳脊髄液、精液およびリンパ液中の悪性細胞にも適応している。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR )法による試験も、本発明の新しい方法で得た純粋の腫瘍細胞集団について実施すると特異性と信頼性とが向上する。本発明の新しい方法のステップの適用法は被検組織の種類によって異なっている。ａ)充実性腫瘍の生検もしくは腫瘍の針生検由来の組織を機械的に処理するか、またはゆるやかに酵素で処理して単個細胞懸濁液を調製し、その懸濁液に、一次の特異的抗体もしくは抗体フラグメントを、直接添加するか、またはリン酸、緩衝食塩水もしくは例えばウシ胎児血清、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギもしくはヒトの血清のごとき血清を含有もしくは含有しない培地で細胞懸濁液を洗浄した後に添加する。ｂ)材料が胸水もしくは腹水、脳脊髄液、尿、リンパ液または各種の形態の関節炎にかかっている患者の関節の滲出液のような体液の試料の場合、特異的な抗体または抗体フラグメントを試料に、直接添加するか、または試料中の細胞を遠心分離し次いで再び懸濁させる前または後に、洗浄もしくは洗浄せずに遠心分離した後に添加する。ｃ)材料が血液または骨髄吸引液で構成されている場合、単核細胞の画分は、例えばLymphoprepで勾配遠心分離し次いで洗浄し再懸濁し、適切な抗体または抗体フラグメントを添加することによって分離される。ａ)とｂ)の手順の条件は確立されており、以下に述べる成功した実験で得られた結果で例証されている。ｃ)の方法については、試験結果は、詳細に試験された多数の因子によって影響を受けることが見出された。これらの因子としては、抗体の濃度、常磁性粒子数：細胞の数の比率、インキュベーションの時間と容積、インキュベーション培地の種類およびpHのレベルがある。全試験における粒子：単核細胞の比率は、一次の特異的抗体もしくはフラグメントの結合アフィニティーによって0.5/1〜2/1 の範囲内でなければならない。主な問題点は、ヤギもしくはラットの抗マウス抗体だけで、またはさらに特異的抗体でコートされた粒子が、正常な血液または骨髄の細胞に非特異的に結合することであった。試験の結果は、非特異的結合は特異的抗体が存在しない場合に等しく高いことを示した。このことは、上記問題が起こるのはターゲティング抗体の正常細胞に対する交差反応性が原因ではないことを示している。最適の場合より低い特異性がイオン結合で起こる可能性は除かれた。他の可能性は、Ｂ系統の正常細胞の分集団が粒子−抗体複合体に粘着するかもしれないという可能性である。しかし、特異的抗体／抗体−粒子複合体を添加する前に細胞懸濁液からＢ細胞を免疫磁気的に除去しても、特異的抗体／抗体−粒子複合体の特異性は改善されなかった。骨髄および末梢血液の分離された単核画分に用いた手順に付随する問題点すなわちいくらかの非標的細胞も常磁性粒子を捕捉するかもしれないという問題点は回避されるかまたは克服された。すなわち、ヒツジ抗マウス抗体でコートした粒子のみまたは特異的抗体によって、低画分の血液もしくは骨髄の単核細胞に非特異的に結合した粒子の数は平均して10から約１まで減少し、そして粒子を有する正常細胞の画分は平行して１〜２％から0.5〜１％以下まで減少した。上記問題点が常磁性粒子に結合した抗体に関連する疎水力(hydroーphobic forc e)によって起こる証拠が得られた。したがって本願ではこの疎水性を減少させる方法の特許を請求するものである。この方法の一つは、抗体でコー卜された粒子と細胞懸濁液を適切な濃度の緩和な界面活性剤、例えば0.1％より低い濃度のTwe en 20（登録商標）とともに40℃にて30分間プレインキュベートする方法である。標的細胞の選択が保証できるならば、細胞懸濁液が含有する界面活性剤の濃度は例えば0.01％のTween 20（登録商標）のような低い濃度でなければならない。いくつもの試験において、この手順で行った場合、血液もしくは骨髄由来の単核細胞画分にみられる非特異的結合の問題はほとんど消失するかまたは劇的に減少した。他の改良法は、改良が保証されることが分かったならば、下記のように界面活性剤のステップとともに利用できる。一次の抗体もしくは抗体フラグメントおよび抗体でコートされた常磁性粒子とともに細胞懸濁液のインキュベーションを先に述べたように行ってから、その細胞懸濁液を、標的細胞の他の細胞外決定因子もしくは細胞内決定因子に対する抗体もしくは抗体フラグメントの第二のセットとともに、ホルムアルデヒドまたはアルコール類のような細胞固定液によって前処理するかまたはせずにインキュベートする。これらの抗体もしくはそのフラグメントは、蛍光剤類、金属コロイド類、放射性同位元素類、ビオチン複合体類、またはペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼのような酵素類で予め標識を付けて、それ自体公知の方法で、顕微鏡および／または適切な計数装置で目視可能にしなければならない。標的細胞は後者の方法で目視可能になるとともにその表面に粒子を捕捉するので、数えることができる。非標的細胞と標的細胞との区別を簡単にするため、細胞懸濁液を、第二の目視化ステップを行う前に、細胞スピン遠心分離にかけるか、または懸濁液の一部を、粒子に捕捉された細胞が薄層で広げられている被覆スライドガラスに付着させて、二重に“ステインされた(stained)”細胞を認識し易くすることができる。本発明の新しい手順で使用するため、キットには、例えば各モノクローナル抗体について調製した、予めコートされた常磁性粒子が入っている。他の実施態様では、キットに、その一部分として、IgGイソタイプ特異的の抗マウス抗体もしくは抗ヒト抗体で予めコートされた常磁性粒子が入っており、および他の部分として異なる標的細胞例えば腫瘍細胞関連の抗体が入っている。第三の実施態様では、特異的抗標的細胞抗体に捕捉された標的細胞関連抗体のFc部分に結合できるポリクローナル抗マウス抗体、またはモノクローナルのラット抗マウス抗体、または抗マウス抗体もしくは抗ヒト抗体のような特異的抗Fc抗体で予めコートされた常磁性粒子がキットに入っている。さらに別の実施態様では、所望の標的細胞内もしくは該細胞上の抗原／受容体に対する他の特異的抗体または抗体フラグメントがキットに入っており、前記の抗体または抗体フラグメントは、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなどの酵素に対しこれら酵素の関連基質とともに接合されているか、または前記抗体または抗体フラグメントは、特定の色を有するかまたはペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼのような結合した酵素を有する非常磁性粒子に結合されている。本発明の方法を、モデル実験、本発明の新しい方法の有用性を示す実施例および実験の用途の実施例によって以下に説明する。これらの実施例はいかなる場合でも本発明を限定しない。モデル実験： 1. 本発明の新しい手順による、抗体−ビーズ複合体の腫瘍細胞系との結合抗体−常磁性粒子複合体を腫瘍細胞に結合させる場合の抗体濃度と最適条件を決定するため、大パネルの癌細胞系を用いた。常磁性ビーズは、ヒツジ抗マウス抗体(SAM)でコートした常磁性粒子に特異的抗体をコートするか、またはまず細胞を特異的抗体とともにインキュベートし、洗浄し続いてSAMでコートされた粒子とともに第二のインキュベーションを行うことによって、細胞に結合される。これらの試験の結果を表2aと2bに示す。これらの表において＋印はいくつものヒーズがすべての細胞に結合していることを示し、（＋）印は少数のビーズが各細胞に結合しているかまたはすべての腫瘍細胞ではないがその表面にビーズが結合していることを示し、−印は全く結合がないことを示し、および（−）印は非常に弱い結合を示す。 2. 骨髄または末梢血液の単核画分中の腫瘍細胞を検出するため、次のようなモデル実験を行った。すなわち特異的抗体とSAMでコートした常磁性粒子を、前記単核細胞または細胞懸濁液に加えた。なおその場合生体外で培養した細胞系由来の各種の数の癌細胞を前記単核細胞に添加した。いくつかの実験では、単核細胞または悪性細胞は、２種の細胞を区別できるように蛍光染料で予めステインした。すべての実験で非結合一次抗体および／またはヒツジ抗マウス抗体でコートしたビーズを別個に対照として使用した。幾種類もの癌。したがって、かような抗体のそれぞれの抗体との結合を検出することは高い予後価(high prognostic value)の情報を得るために使用できる。このような抗原の中には、以下に列挙する多数の接着性分子、炭水化物抗原、糖脂質、成長因子受容体、および癌腫マーカーがある。本発明の新しい方法によって、粒子−抗体複合体と次のものすなわちCD44変異体、E-カドヘリン、LeY、CEA、 EGF-r、トランスフェリン受容体、MUC-1 エピトープ、LUBCRU-G７エピトープ、前立腺癌抗原、UJ13A エピトープ、β₂−ミクログロブリン、HLA-抗原および細胞消滅受容体との結合を同定した。実施例３悪性黒色腫にかかっていると考えられる患者から２ｌの胸水拡散液を得た。遠心分離を行った後、10％のウシ胎児血清を含有するRPMI２ｍｌの容積中に細胞を懸濁させ、9.2.27抗黒色腫抗体(10μg/ml)とともに４℃で30分間インキュベートし、洗浄し、Dynabeads SAMM450/IgG2Aとともに４℃で30分間再びインキュベートした。次にその細胞懸濁液を顕微鏡で試験してその表面に常磁性細胞が結合している細胞の画分を測定した。約10％の細胞が有意な数の粒子ロゼットをもっていたとき、悪性黒色腫の診断を確認した。実施例４小細胞肺癌もしくは悪性黒色腫の臨床指標を有する症例の皮下腫瘍から生検組織を得た。その生検試料から単個細胞懸濁液を調製し、二つの画分に分割し、一方を9.2.27抗黒色腫抗体とともにインキュベートし、他方をMOC-31抗癌腫抗体とともにインキュベートした（両方ともに10μg/ml）。このインキュベーションは上記実施例で利用したのと類似している。黒色腫抗体とともにインキュベートした細胞はビーズを全く捕捉しなかったが、MOC-31とともにインキュベートしたすべての腫瘍細胞は陽性であった。実施例５悪性黒色腫をもっている疑いがある患者から得た生検組織を、単個細胞懸濁液を調製し、9.2.27抗黒色腫抗体とともにインキュベートし次いで上記手順にしたがって試験した。その細胞の大部分は陽性であり、多数の粒子−ロゼットが細胞の膜に結合していた。実施例６乳癌患者由来の胸水を、その液体中に腫瘍細胞を検出できるか否かを試験するために研究した。その液体１ｌを遠心分離し、得られた細胞を再懸濁させ、次に別々のバイアルびん中で、３種の異なる各抗癌腫抗体(MOC-31、2E11、12H12)とともにインキュベートした。前記実施例と同様に手順を完了した後、３例すべてでほとんどの細胞が抗体被覆粒子に結合することが見出された。実施例７乳癌患者から得た骨髄懸濁液を研究して、微小転移腫瘍細胞が存在しているか否かを試験した。単核細胞を調製した後、この細胞を、上記実施例に使用したのと同じ３種の抗癌腫抗体とともにインキュベートした。しかしこの場合、抗体はまずDynabeads（登録商標）SAM IgM 常磁性粒子に結合した。これらの直接コートされた粒子と１回インキュベートした後、その細胞懸濁液を顕微鏡で検査し、多数の細胞が陽性であることが見出され、多数の粒子−ロゼットが細胞の膜に結合していた。同様の試験を、乳癌の患者由来の胸水もしくは腹腔水および骨髄のいくつかについて実施した。実施例８ T47D ヒト乳癌細胞を、時間を変えてヘキスト社の蛍光塗料とともにインキュベートし次いでその標識を付けた細胞の生存力を検査した。標識を付けた乳癌細胞の数を変えて、健康なボランティアから得た１×１０⁶個の骨髄細胞に添加した。異なる試験において、個々の抗癌腫抗体（NrLu10、MOC31または12H12）でコートした常磁性の単分散粒子（Dynabeads （登録商標）P450）を異なる濃度で添加した。氷上で30分間インキュベートした後、異なる試験管の試料を、計数チャンバー内で光学顕微鏡と蛍光顕微鏡とを用いて試験した。腫瘍細胞／全有核細胞の比率が低かった場合は、その細胞懸濁液を磁場にかけ、結合した粒子を有する細胞を分離し次いで顕微鏡で検査した。細胞混合物中、１腫瘍細胞当たり１〜10の常磁性ビーズという最適の比率では、すべての腫瘍細胞はその表面に２〜15個のビーズが結合されていた。この検出法の感度は、１０⁴個の有核細胞当たり１個の標的細胞に近かった。正常細胞に対していくらか交差反応を有することが分かっている抗体を用いて、標識をつけた腫瘍細胞で対照試験を行い、この交差反応性が抗体でコートされた常磁性粒子にあることが確認された。腫瘍関連抗体のコーティングなしのビーズの試験ではとの標的細胞もビーズを全く捕捉しなかった。他の乳癌系と小細胞肺癌細胞系の両者について類似の試験を行った。これらの試験で類似の感度と特異性とが得られた。実施例９乳癌および卵巣癌の患者由来の胸水と腹腔水とをセントリフューズ(sentrifug ed)、実施例１で使用したのと同じ被覆常磁性粒子を添加し、インキュベートし、次いで磁場内で濃縮し、そしてその懸濁液を光学顕微鏡で試験した。一般に、腫瘍細胞の明らかな形態学的特徴を有する細胞にはビーズが結合しており、一方少数の正常細胞は、抗体でコートされたビーズを全く捕捉しなかった。胸水の二つの例では、独立して形態学的試験をしたが腫瘍細胞は全く存在しなかったが、一方抗体でコートしたビーズを用いることによってかなりの数の悪性細胞が検出された。いくつかの場合に、

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】 1. 混合細胞集団の細胞懸濁液および混合細胞集団を含有する流体系、ならびに充実性組織から調製した単個細胞懸濁液の中の特異標的細胞を検出する方法であって、以下のステップ： 1.1. a)細胞混合物中で標的細胞上に特異的に発現されるが非標的細胞上では発現されない膜構造物に対する抗体類もしくは抗体フラグメント類またはb)膜構造物に対する前記抗体類のFc部分に結合し得る抗体類、好ましくはポリクローナル抗マウス抗体もしくはモノクローナルラット抗マウス抗体もしくは抗ヒト抗体で、それ自体公知の方法により、常磁性の粒子もしくはビーズをコートし、次いで 1.2.1. 前記粒子もしくはビーズに結合されているか、または標的関連抗体の FC部分を認識する抗マウス抗体もしくは抗ヒト抗体で予めコートしたビーズに結合されている標的細胞関連抗体（マウスまたはヒト）を、標的細胞を含有する細胞懸濁液と混合するか、または 1.2.2. 遊離した標的細胞関連抗体を、標的細胞を含有する細胞懸濁液と混合し、この混合物を５〜10分間乃至２時間好ましくは30分間、０℃〜20℃の温度好ましくは４℃でゆるやかに回転しながらインキュベートし、次に 1.3. 細胞懸濁液、および常磁性粒子もしくはビーズ(1.2.1.)または標的関連抗体のFc部分を認識する抗マウス抗体もしくは抗ヒト抗体で予めコートされた常磁性粒子もしくはビーズに結合されたかインキュベートされた遊離標的関連抗体と細胞懸濁液との混合物(1.2.2.)に結合された遊離標的関連抗体の混合物をインキュベートし、次いで０℃〜25℃好ましくは４℃の温度で５〜10分間乃至２時間好ましくは30分間ゆるやかに回転しながらインキュベートし、および 1.4.1. 標的細胞集団が血液もしくは骨髄の吸引液中に含有されている場合は、抗体でコートされた粒子と細胞懸濁液を、適切な濃度の緩和な界面活性剤例えば0.1％未満の濃度のTween20とともに４℃にて30分間予めインキュベートすることによって、抗体でコートされた粒子に関係する疎水力を低減し、および／または 1.4.2. ホルマリン、アルコールまたは他の固定液で処理しないかまたは前処理された細胞懸濁液を、標的細胞中に存在する細胞外もしくは細胞内の分子に結合する他の抗体もしくは抗体フラグメントとともにインキュベートすることによって、そして使用される抗体は、関連基質を添加しインキュベートすることにより、その結合を目視可能にできるペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたはその他の酵素で予め標識を付けるか、または 1.4.3. 抗体フラグメントはビオチニル化され、その結合は、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたは他の酵素と複合させたアビジンを添加しインキュベートし、関連基質を添加しインキュベートすることによって目視可能になり、または 1.5.1. 標的細胞の密度が低いかまたは細胞混合物中の標的細胞／全細胞の比率が低い（≦１％）場合は、インキュベートされた常磁性粒子−細胞混合物(1.3 .)に磁場をかけ、次いで顕微鏡および／または適切な細胞／粒子計数装置を用いて、細胞懸濁液中のステインされたかまたは未ステインの粒子−標的細胞複合体を検査して計数し、または 1.5.2. 常磁性粒子、抗体および細胞混合物のインキュベートされた混合物(1 .3.)中の標的細胞を試験して計数し、抗体もしくは抗体フラグメントが、色のために直接目視可能になるかもしくは酵素の活性化で目視可能になる非常時磁性粒子に接合されている場合、細胞懸濁液中の標的細胞／全細胞の比率が適切である（＞１％）とき、顕微鏡および／または適切な細胞／粒子計数装置を用いる、を有することを特徴とする改良方法。 2. 正常な生存細胞、例えば肝実質細胞、クッペル細胞、肺臓の内皮細胞タイプ１と２およびクララ細胞、特定の臓器の内皮細胞、膵臓の外分泌細胞と内分泌細胞、腎臓の細管細胞、膀胱の上皮細胞、脳のグリア細胞と上衣細胞、膀胱と前立腺の上皮細胞、気道の線毛細胞、胃腸管の粘膜細胞の異なる分集団、下垂体細胞、および各種のホルモン産生器官の他の内分泌細胞の中の抗原に対する抗体またはそのフラグメントを用いることを特徴とする請求項１記載の方法。 3. 正常細胞の分集団上に存在する抗原および正常組織細胞の膜上で発現される腫瘍遺伝子産物に対して反応性の抗体を、前記標的細胞抗体として使用することを特徴とする前述の請求項の何れか１つに記載の方法。 4. 正常細胞の膜上の成長因子受容体類、例えばEGF受容体、PDGF（ＡおよびＢ）受容体、インシュリン受容体、インシュリン様受容体、トランスファリン受容体、NGFとFGFの受容体に対する抗体を、前記の積極的に選択する抗体として使用することを特徴とする前述の請求項の何れか１つに記載の方法。 5. インテグリン類と、他の接着性膜分子の群、および正常細胞中のMDRタンパク質類に対する抗体を用いることを特徴とする前述の請求項の何れか１つに記載の方法。 6. 異常な発育パターンを有する細胞、好ましくは例えば原発および転移の癌細胞の中の抗原もしくは受容体に対する抗体もしくはそのフラグメントを用いることを特徴とする前述の請求項の何れか１つに記載の方法。 7. IgGのイソタイプ、またはＦ（ab′）₂もしくはＦ(ab)のフラグメント、またはIgMもしくはそのフラグメントの抗体を、前記標的細胞関連抗体として用いることを特徴とする前述の請求項の何れか１つに記載の方法。 8. 哺乳動物の組織例えばヒトの骨髄と末梢血液を含む混合細胞集団から、胸水と腹腔水および他の体液例えば尿、脳脊髄液、精液、リンパ液から、または正常な組織と臓器例えば肝臓、リンパ節、脾臓、肺臓、膵臓、骨組織、中枢神経系、前立腺、皮膚および粘膜から前記細胞懸濁液を調製することを特徴とする前述の請求項の何れか１つに記載の方法。 9. 抗体もしくは抗体フラグメントが、抗原決定基の群、例えば明細書の表１に列挙されたものに対する抗体もしくは抗体フラグメントであることを特徴とする前述の請求項の何れか１つに記載の方法。 10. 悪性細胞の膜上に発現される成長因子受容体と腫瘍遺伝子産物、例えば明細書の表１に列挙されているものに加えてインシュリン受容体、インシュリン様受容体およびFGF受容体に対する抗体もしくは抗体フラグメントを、前記標的細胞の抗体として用いることを特徴とする前述の請求項の何れか１つに記載の方法。 11. インテグリン類と他の接着性膜分子の群および表１に列挙されている異常細胞中のMDRタンパク質に対する抗体もしくは抗体フラグメントを用いることを特徴とする前述の請求項の何れか１つに記載の方法。 12. 用いられる抗体、抗体フラグメントまたはそれらの混合物が、明細書の表１に列挙されている抗原決定基に該当することを特徴とする前述の請求項の何れか１つに記載の方法。 13. 異常細胞、例えば乳癌、卵巣癌および肺癌の細胞、黒色腫、肉腫、グリア芽細胞腫、胃腸管と尿生殖器官および網内系の癌細胞、および／または非新生物疾患、例えば心臓血管障害、神経障害、肺障害、自己免疫障害、胃腸障害、尿生殖器障害、網内系障害などの障害に関連する標的細胞上に存在する抗原と反応性の抗体を、前記抗体として用いることを特徴とする前述の請求項の何れか１つに記載の方法。 14. 標的細胞を分離するのに用いる、前述の請求項の何れか１つに記載の検出方法の用途であって、細胞と常磁性粒子との複合体を磁場に暴露し、磁気で凝集させて得た細胞をさらに、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)と逆転写酵素PCRとを含めて特定の遺伝子のDNA、mRNAおよびタンパク質のレベルでの特性決定を含む生物学的、生化学的および免疫学的試験に付す用途。 15. 前述の請求項の何れか１つに記載の、特定の標的細胞の検出方法の用途であって、分離された常磁性粒子−標的細胞複合体から生体外細胞培養物を樹立するのに用いおよび／または好ましくは免疫不全動物に接種して前記動物内にヒトの腫瘍異種移植片を樹立する用途。 16. 1.所望の標的細胞上の抗原受容体に対する特異的抗体もしくは抗体フラグメントであって、その抗原結合性能を除かずに、含有されている常磁性粒子に結合されるかもしくは結合されうる抗体もしくは抗体フラグメント、および／または 2.標的細胞関連抗体および特異的遊離標的細胞抗体のFc部分に結合できる、特異的な抗Fc抗体類、好ましくはポリクローナル抗マウス抗体またはモノクローナルラット抗マウス抗体または抗ヒト抗体で予めコートされた常磁性粒子、および／または 3.特異的抗標的細胞抗体に結合された標的細胞関連抗体のFc部分に結合できる、特異的抗Fc抗体類、好ましくはポリクローナル抗マウス抗体もしくはモノクローナルラット抗マウス抗体もしくは抗ヒト抗体で予めコートされた常磁性粒子、および／または 4. 所望の標的細胞内もしくは該細胞上の抗原／受容体に対する他の特異的抗体または抗体フラグメントであって、ビオチン、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたは他の酵素に接合されているかまたは特定の色を有しているかまたはペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼのような酵素が結合している非常磁性粒子に結合されている抗体または抗体フラグメント、を有することを特徴とする前述の請求項の何れか１つに記載の方法を実施するためのキット。