KR20120026959A - 자기 영동을 이용한 미세 입자 분리 장치 및 이를 이용하여 미세 입자를 분리하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 자기 영동을 이용한 미세 입자 분리 장치 및 이를 이용하여 미세 입자를 분리하는 방법에 관한 것으로서, 미세 입자에 결합된 입자의 자성이 미약할 경우에도 우수한 효율로 신속하게 분리가 가능한 패턴화된 자성체 미세 구조물을 포함하는 자기 영동을 이용한 미세 입자 분리 장치 및 이를 이용하여 미세 입자를 분리하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
Description
본 발명은 자기 영동을 이용한 미세 입자 분리 장치 및 이를 이용하여 미세 입자를 분리하는 방법에 관한 것이다.
의약 분야에서의 진단 및 치료, 및 연구 분야에서 최종 목적 또는 다른 분석을 하기 위한 준비적인 도구로서 세포 타입 또는 세포 내 성분의 분리가 요구된다. 현재 연구실 및 임상 실험실에서 사용되는 많은 종류의 세포 타입 또는 세포 내 성분의 분류 방법이 있다. 다른 종류의 입자, 예를 들어 바이러스, 박테리아, 세포 및 다세포 개체를 빠르게 분리하는 것은 의약 연구, 임상적 진단 및 환경 분석 영역의 다양한 응용분야에서 중심적 단계이다. 신약개발 및 단백질 연구에서 빠르게 성장하는 지식들은 연구자들로 하여금 단백질-단백질 상호작용, 세포 신호 경로, 및 대사 과정의 마커에 대한 더 많은 이해를 신속하게 얻도록 하고 있다. 이러한 정보는 단일 단백질 탐지 방법, 예를 들어 ELISA 또는 웨스턴블로팅과 같은 전통적방법을 이용해서는 획득하기 어렵거나 불가능하다. 따라서 세포타입 또는 세포 내 성분의 분리가 더더욱 요구되고 있다.
혈장과 같은 생물학적 샘플로부터 특정의 표적 생체분자를 분리하는 방법으로서, 실리카, 유리섬유, 음이온교환 수지 또는 자성 비드를 이용하는 방법이 알려져 있다. 이들 중에서 자성 비드를 이용하는 방법에 따르면, 표면에 표적 생체분자와 결합될 수 있는 프로브를 갖는 자성 비드를 샘플 용액에 투입하여 표적 생체분자를 포획하게 하고, 샘플 용액으로부터 다시 자성 비드를 분리함으로써 표적 생체분자를 추출한다. 이렇게 자성 비드를 이용하여 표적 생체분자를 분리하는 방법 (bead based separation) 방법은 이미 상용화 되어서, 세포, 단백질, 핵산 또는 기타의 생체분자 등을 분리하는데 널리 사용되고 있다. 예를 들면, 미국특허 US 6,893,881에서는 항체가 코팅된 상자성(paramagnetic) 비드를 사용하여 특정 표적 세포를 분리하는 방법을 제시하고 있다.
이러한 자성 비드를 분리하기 위한 고구배 자장(HGMS: high gradient magnetic separation)을 이용하는 자기영동(magnetophoresis) 분리 기술은 간단한 구조와 함께 효율이 높고, 사용이 간편하며, 유전영동(dielectrophoresis)에 비해 가수분해 특성이 없는 장점이 있어 오랫동안 꾸준히 연구되고 있는 분야이다. 이러한 자기영동의 또 다른 장점은 자성입자와 바이오 분석물 간의 생친화적 결합에 의하여 생물적 특이성이 유지되고, 자기영동 힘은 미디어에 의하여 영향받지 않는다는 것이다.
종래 자기영동 방법은 분리하고자 하는 자성을 가진 시료의 자기 영동 분리를 위해 자기장을 인가하는 자기 에너지원과 상기 외부 자기 에너지원에 의해 인가된 자기장 구배를 증폭하기 위한 자성체 마이크로 구조물 영역을 두고, 분리하고자 하는 자성을 가진 시료에 대해 자기 에너지원에서 자기장을 인가하여 자기 밀도 구배에 따라 분리하는 방식을 사용하고 있다. 일 예로서 도 1에 나타낸 한국등록특허 10-0791036 에서는 미세 유체 채널(30)의 옆에 강자성체 구조물(40)을 배치하고, 탄소나노튜브 시료의 흐름에 수직방향으로 외부 자기장을 인가하여 순수한 탄소나노튜브를 분리하는 방법에 대해 개시하고 있다.
그러나, 상기 종래 자기 영동 방법에 사용되는 장치에서 발생하는 구배 자장으로는 자성 입자에 충분한 자기력을 유도하기 어렵고, 그에 따라 자성 입자를 분리하는 효율이 낮으며 시간이 오래 걸리므로, 자성 입자와 결합된 분리하고자 하는 미세 입자를 시료로부터 분리하여 추출하는 데 사용하는 것은 어렵다는 문제점이 있었다.
본 발명은 종래 자기 영동 장치의 문제점을 해결하기 위하여, 패턴화된 자성체 미세 구조물을 포함하여 분리하고자 하는 미세 입자의 자성이 미약할 경우에도 우수한 효율로 신속하게 분리가 가능한 자기 영동을 이용한 미세 입자 분리 장치 및 이를 이용하여 미세 입자를 분리하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 상기 과제를 해결하기 위하여 상부 유리 기판; 패턴화된 자성체 미세 구조물을 포함하는 하부 유리 기판; 상기 상부 유리 기판과 상기 하부 유리 기판 사이에 형성되며 자성 입자가 결합된 미세 입자를 포함하는 시료가 위치하는 미세 유체 채널; 및 상기 패턴화된 자성체 미세 구조물에 자기장을 인가하는 외부 자기장원을 포함하는 자기 영동을 이용한 미세 입자 분리 장치를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 미세 유체 채널은 자성 입자가 결합된 미세 입자를 포함하는 시료와 버퍼를 각각 주입하는 시료 주입관을 포함하는 시료 주입용 미세 유체 채널 영역; 상기 주입된 시료에 포함된 자성 입자가 결합된 미세 입자가 자기 영동에 의해 분리되면서 통과하는 분리용 미세 유체 채널 영역; 및 상기 분리용 미세 유체 채널 영역을 통과하면서 분리된 상기 자성 입자가 결합된 미세 입자 및 나머지 시료가 각각 분리 배출되는 복수개의 배출관을 포함하는 배출용 미세 유체 채널 영역으로 구분되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 하부 유리 기판의 자성체 미세 구조물은 i)seed layer 증착 공정, ii)자성체 미세 구조물을 형성하기 위한 포토리지스트에 의한 패턴 형성 공정, iii)상기 형성된 패턴에 따라 자성체 미세 구조물을 증착하는 공정, 및 iv)자성체 미세 구조물을 포함하는 하부 유리 기판 전체에 걸쳐 에폭시 수지를 균일하게 도포하여 코팅층을 형성하는 공정에 의하여 하부 유리 기판에 포함되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 하부 유리 기판의 자성체 미세 구조물은 상기 분리용 미세 유체 채널 영역에서 시료의 흐름 방향에 대한 소정의 경사각을 갖도록 상기 하부 유리 기판에 포함되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 자성체 미세 구조물은 시료의 흐름 방향에 대한 경사각이 상기 분리용 미세 유체 채널 영역에서 변화하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 복수개의 배출관을 포함하는 배출용 미세 유체 채널 영역은 자성 입자가 결합된 미세 입자가 수집되는 챔버와 나머지 시료들이 수집되는 챔버로 연결되는 배출관을 포함하며, 상기 자성 입자가 결합된 미세 입자가 수집되는 챔버로 연결되는 배출관과 상기 나머지 시료들이 수집되는 챔버로 연결되는 배출관은 상호 일정 각도로 분리되어 있는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 자기 영동을 이용한 미세 입자 분리 장치는 분리하고자 하는 자성 입자가 결합된 미세 입자에 따라 상기 자성체 미세 구조물의 시료의 흐름 방향에 대한 경사각, 상기 자성체 미세 구조물의 두께, 복수개로 형성되는 자성체 미세 구조물간의 간격, 설치 갯수를 변화시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 자기 영동을 이용한 미세 입자 분리 장치는 외부 자기장원의 크기와 미세 유체 채널 내의 유체 흐름 속도를 조절하여 미세 입자의 이동을 조절하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 하부 유리 기판의 자성체 미세 구조물은 와이어 형상으로 패턴 형성되는 강자성 와이어인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 미세 입자는 RNA 또는 혈중종양세포인 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한, 본 발명에 의한 미세 입자 분리 장치를 이용하여 미세 입자를 분리하는 방법으로서, 자성 입자가 결합된 미세 입자를 포함하는 시료를 시료 주입용 미세 유체 채널 영역의 시료 주입부에 주입하는 제 1 단계; 버퍼를 제어 유체 주입부에 주입하는 제 2 단계; 외부 자기장을 인가하여 상기 자성 입자가 결합된 미세 입자를 포함하는 시료가 분리용 미세 유체 채널을 통과하면서 자성 입자가 결합된 미세 입자를 분리하는 제 3 단계; 및 상기 제 3 단계의 분리된 자성 입자가 결합된 미세 입자를 배출용 미세 유체 채널 영역에서 포획하는 제 4 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 미세 입자를 분리하는 방법을 제공한다.
이하, 도면을 참조하여 본 발명의 자기 영동을 이용한 미세 입자 분리 장치 및 이를 이용하여 미세 입자를 분리하는 방법에 대해 상세히 설명한다.
본 발명의 일실시 형태에 따른 자기 영동을 이용한 미세 입자 분리 장치의 단면도 및 평면도를 도 2 와 도 3에 나타내었다. 도 2에서 보는 바와 같이 상부 유리 기판(100); 패턴화된 자성체 미세 구조물(200)을 포함하는 하부 유리 기판(300); 및 상기 상부 유리 기판과 하부 유리 기판 사이에 형성되며 자성 입자가 결합된 미세 입자를 포함하는 시료가 위치하는 미세 유체 채널(400)로 구성된다. 또한, 상기 미세유체 채널(400) 은 도 3에서 보는 바와 같이 순차적으로 연결된 미세 입자를 포함하는 시료와 버퍼를 주입하는 시료 주입용 미세 유체 채널 영역(410), 상기 주입된 시료에 포함된 자성 입자가 결합된 미세 입자가 자기 영동에 의해 분리되면서 통과하는 분리용 미세 유체 채널 영역(420) 및 상기 분리된 자성 입자가 결합된 미세 입자가 배출되는 복수개의 배출용 미세 유체 채널 영역(430)으로 구성되며, 상기 시료 주입용 미세 유체 채널은 시료주입부(440)와 버퍼 주입부(450)으로 형성되며, 상기 배출용 미세 유체 채널 영역은 복수개의 배출부(460)으로 구성된다.
본 발명에 있어서, 상기 하부 유리 기판의 자성체 미세 구조물은 i)seed layer 증착 공정, ii)자성체 미세 구조물을 형성하기 위한 포토리지스트에 의한 패턴 형성 공정, iii)상기 형성된 패턴에 따라 자성체 미세 구조물을 증착하는 공정, 및 iv)자성체 미세 구조물을 포함하는 하부 유리 기판 전체에 걸쳐 에폭시 수지를 균일하게 도포하여 코팅층을 형성하는 공정에 의하여 하부 유리 기판에 패턴 형성된다.
도 4에 상기 하부 유리 기판의 자성체 미세 구조물을 전기 도금(electroplate) 공정에 의하여 패턴 형성하는 과정을 나타내었다.
먼저, 바닥 유리 기판에 SEED LAYER 를 증착하고, 포토리지스트(photoresist)를 도포하여 자성체 미세 구조물로서 강자성 니켈 와이어를 증착하기 위한 패턴을 형성한다.
본 발명에 있어서 자성체 미세 구조물은 일정 두께로 형성되어 방향성과 연속성을 가진 강자성 와이어의 형태로 형성될 수 있으며, 특별히 한정되지는 않는다. 형성된 패턴에 따라 강자성 니켈 와이어를 증착한 후, 상기 포토리지스트를 제거한다(도 4의 A). 포토리지스트를 제거한 후 접착 수단으로서 에폭시 어드히시브(epoxy adhesive)를 표면에 도포하고 85℃ 에서 6시간 동안 경화시켜 자성체 미세 구조물을 포함하는 하부 유리 기판을 제조한다(도 4의 B).
이와 같이 제조되는 상기 자성체 미세 구조물은 분리용 미세 유체 채널 영역에서 시료의 흐름 방향에 대한 소정의 경사각(θ)으로 경사지게 형성되어, 상기 자성 입자가 결합된 미세 입자가 수집되는 챔버로 연결되는 배출관과 나머지 시료들이 수집되는 챔버로 연결되는 배출관이 상호 일정 각도로 분리되는 부분과 연결되도록 형성된다.
상기 시료의 흐름 방향에 대한 강자성 와이어가 이루는 경사각(θ) 는 0°보다 크고 90°보다 작은 범위에서 결정되는 것이 바람직하다. θ값이 지나치게 작거나 크면, 자성 입자가 결합된 미세 입자의 분리 효율이 떨어지기 때문이다.
또한, 인가되는 외부 자기장이 강할 경우 자성이 결합된 미세 입자가 상기 강자성 와이어 주변에 쌓이게 되는 경우가 있으므로, 자성이 결합된 미세 입자가 배출용 미세 유체 채널로 원활하게 배출될 수 있도록 상기 강자성 와이어의 경사각이 상기 분리용 미세 유체 채널에서 변화하도록 구성하는 것이 바람직하다.
이어서, 상부 유리 기판에 1000Å의 크롬층을 증착시켜 SU-8 2050 과 유리 기판과의 접착력을 증가시킨 후, SU-8 2050 포토리지스트를 스핀 코팅하여 미세 유체 채널의 패턴을 형성하고, 드릴을 이용하여 상부 유리 기판에 시료 주입부 및 배출부 부분을 제조하였다(도 4의 C). 이후 제조된 상부 유리 기판과 하부 유리 기판을 UV 경화용 접착제 1187-M을 도포하고, UV를 조사하여 상부 유리 기판과 하부 유리 기판을 접합시킨 후(도 4의 D), 상부 유리 기판에 O-링을 이용하여 시료 및 버퍼 주입구를 제조하였다.
포토리지스트를 이용하여 상기 상부 유리 기판에 패턴 형성되는 미세 유체 채널은 도 3에서 나타낸 바와 같이 분리 전 시료 주입용 미세 유체 채널 영역(410); 상기 주입된 자성 입자와 결합한 미세 입자가 자기 영동에 의해 분리되는 분리용 미세 유체 채널 영역(420); 및 상기 분리된 시료가 배출되는 복수개의 배출용 미세 유체 채널 영역(430)으로 구분된다.
본 발명에 있어서, 상기 시료 주입용 미세 유체 채널 영역(410)에서는 자성 입자와 결합한 미세 입자를 포함하는 시료와 버퍼가 각각 주입된다.
본 발명에 따른 자기 영동을 이용한 미세 입자 분리 장치로 분리가 가능한 미세 입자는 DNA, 항체, 펩티드, 스몰펩티드 등 자성 입자와 결합할 수 있는 미세 입자라면 어떠한 것이라도 가능하며, 바람직하게는 RNA 또는 혈중 종양 세포 ( CTC circulating tumor cell ) 를 포함한다.
본 발명에 따른 자기 영동을 이용한 미세 입자 분리 장치로 분리하기 위해 미세 입자와 자성 입자를 결합시키는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 각각의 미세 입자에 대해 당업계에 일반적으로 알려진 방법에 의하여 제조될 수 있다.
즉, 자성 입자는 코발트, 철, 망간, 아연, 니켈 및 구리로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 산화물인 것이 바람직하나, 자성을 나타내는 물질이라면 제한되지 않고 사용될 수 있다.
이러한 자성 입자의 표면을 개질한 후 분리를 원하는 미세 입자와 반응시켜 상기 자성 입자의 표면에 미세 입자를 고정하게 된다.
이하에서 이러한 자성 입자가 결합된 미세입자를 포함하는 본 발명의 자기 영동을 이용한 미세입자 분리 장치의 작용 원리를 설명한다.
자성 입자가 결합된 미세입자를 포함하는 본 발명의 자기 영동을 이용한 미세입자 분리 장치의 미세 유체 채널 내에 위치하는 자성 입자가 결합된 미세입자 에 가해지는 자기장의 방향 및 자기력을 도 5, 도 6 및 도 7에 나타내었다.
자기장이 인가된 하부 유리 기판에 포함된 강자성 와이어 주위에는 도 5 에 나타낸 바와 같이 고구배(high gradient) 자장이 형성되며, 따라서 와이어 주위에 놓여있는 자성 입자가 결합된 미세입자들은 고구배 자장의 영향으로 자기력을 받게 된다.
도 6 에서 자기장 내에 존재하는 자성 입자가 결합된 미세입자가 x 축 방향으로 받는 자기력 힘 Fmx 는 다음과 같이 나타내어진다.
(위 식에서 Vp = wolume of the magnetic bead,
Mps = saturation magnetization of the beads,
μB = permeability of the buffer solution
μW = permeability of the ferromagnetic wire
a = the effective radius of the ferromagnetic wire
B0 = applied external magnetic flux
x, z = axes of a Cartesian coordinate 임)
도 6 와 같이 본원 발명의 경우 강자성 와이어가 시료의 흐름에 대하여 θ 각도를 가지고 기판에 인쇄 회로 공정으로 포함되어 있어, 시료 투입부로 투입된 자성 입자와 결합된 미세 입자가 예각(θ<90°)으로 센자성 와이어 위를 통과하게 되며, 따라서, 자성 입자가 결합된 미세입자는 유체의 항력(drag force)과 자기력에 의해 유체 흐름 방향과 함께 측면방향으로 힘을 받아 이동하게 된다. 따라서, 자성 입자와 결합된 미세 입자가 받는 전체 힘은 다음과 같이 나타낼 수 있다.
( 위 식에서 Fd = hydrodynamic drag force on a magnetic bead 임)
위 식에서 자성 입자와 결합된 미세 입자의 측면 방향 속도(lateral velocity) 는 아래와 같이 나타낼 수 있다.
z 가 일정하다고 할 때 x 축 방향, y 축 방향으로의 거리는 다음과 같다.
자성 입자의 y' 축 방향으로의 이동거리는 다음과 같이 나타낼 수 있다.
위 식들로부터 자성 입자의 이동 거리 dx 와 측면으로의 이동 거리 Δy' 는 x 축 방향으로의 자기력 Fmx 가 커지거나 시료의 흐름과 자성 와이어가 이루는 경사각 Θ 가 증가하면 커지게 된다는 것을 알 수 있다.
상기 시료의 흐름 방향에 대한 강자성 와이어가 이루는 경사각(Θ) 는 0°보다 크고 90°보다 작은 범위에서 결정되는 것이 바람직하다. θ값이 지나치게 작거나 크면, 자성 입자가 결합된 미세 입자의 분리 효율이 떨어지기 때문이다. θ값이 90°이상이 되면 상기 식 (4)에서 
가 되고, 이 경우 자성 입자와 결합된 미세 입자는 하부 기판에 패턴 형성된 강자성 와이어를 지나치지 못하게 되므로 결과적으로 측면 방향의 이동 거리가 무한정 증가하게 된다.
결과적으로 자성 입자가 결합된 미세 입자와 상기 입자를 제외한 나머지 시료들은 자기장으로부터 받는 힘에 의한 x 축 및 y 축 방향으로의 이동 거리가 차이가 나기 때문에 채널을 통과한 후에는 분리되게 되며, 자성입자를 제외한 시료의 나머지 물질들과는 다른 배출용 미세 유체 채널 영역(430)으로 배출된다.
본 발명에 의한 자기 영동을 이용한 미세 입자 분리 장치는 분리하고자 하는 자성 입자가 결합된 미세 입자에 따라 상기 자성체 미세 구조물의 시료의 흐름 방향에 대한 경사각, 상기 자성체 미세 구조물의 두께, 복수개로 형성되는 자성체 미세 구조물간의 간격, 설치 갯수를 변화시킴으로써 분리하고자 하는 자성 입자가 결합된 미세 입자의 분리가 가능하게 된다. 즉, 시료의 흐름에 대한 강자성 와이어의 배치 각도를 조절함으로써 자성 입자가 자기장 내에서 받는 힘의 크기 및 이에 의한 자성 입자의 이동 방향을 조절할 수 있게 된다.
따라서, 본 발명에 있어서는 상기 강자성 와이어의 시료의 흐름 방향에 대한 경사각, 상기 하부 기판에 패턴 형성되는 강자성 와이어의 두께, 간격, 설치 갯수 등 자기력을 발생시키는 조건을 변화시킴으로써 그에 따라 미세 입자의 분리 효율을 최적화하는 것이 가능하게 된다.
본 발명에 의한 자기 영동을 이용한 미세 입자 분리 장치는 상기 자성체 미세 구조물의 시료의 흐름 방향에 대한 경사각이 상기 분리용 미세 유체 채널 영역에서 변화하는 것을 특징으로 한다. 도 7에 본 발명의 일 실시예에 따라서 제조된 자성체 미세 구조물이 시료의 흐름 방향에 대한 경사각이 분리용 미세 유체 채널 영역에서 변화하는 경우의 모식도를 나타내었다.
또한, 이와 같이 제작된 자기 영동을 이용한 미세 입자 분리 장치를 이용하여 미세 입자를 분리하는 방법은 자성 입자가 결합된 미세 입자를 포함하는 시료를 시료 주입용 미세 유체 채널 영역의 시료 주입부에 주입하는 제 1 단계; 버퍼를 제어 유체 주입부에 주입하는 제 2 단계; 외부 자기장을 인가하여 상기 자성 입자가 결합된 미세 입자를 포함하는 시료가 분리용 미세 유체 채널을 통과하면서 상기 자성 입자가 결합된 미세 입자가 나머지 물질들로부터 분리하는 제 3 단계; 및 상기 제 3 단계의 분리된 자성 입자가 결합된 미세 입자를 배출용 미세 유체 채널 영역에서 포획하는 제 4 단계로 구성된다.
본 발명의 미세 입자를 분리하는 방법의 상기 제 3 단계에서는 상기 자성체 미세 구조물에 연결되어 자기장을 형성하는 외부 자기장원의 크기와 미세 유체 채널 내의 유체 흐름 속도를 조절하여 미세 입자의 이동을 조절함으로써, 미세 입자를 분리하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 자기영동에 의한 미세 입자의 분리 장치는 하부 유리 기판에 자성체 미세 구조물을 포함하여 자성 입자에 가해지는 자기력을 증강시키는 한편, 상기 자성체 미세 구조물이 시료의 흐름 방향에 대하여 패턴 형성되어 자성 입자의 이동 방향을 조절하여, 자성 입자가 결합된 미세 입자의 분리 효율을 높이고, 분리 시간을 단축시키는 효과를 나타낸다.
도 1은 종래 자기 영동 장치의 개략도이다.
도 2와 도 3은 본 발명의 일실시 형태에 따른 자기 영동을 이용한 미세 입자 분리 장치의 단면도 및 평면도이다.
도 4는 하부 유리 기판에 상감 기법에 의하여 강자성 와이어를 포함하도록 하는 제조 과정을 나타낸다.
도 5 내지 도 7은 본 발명의 자기 영동을 이용한 미세 입자 분리 장치에 외부 자기장이 가해질 경우 자성 입자가 결합된 미세 입자에 가해지는 자기장의 방향 및 자기력을 나타낸다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 자기 영동을 이용한 미세 입자 분리 장치를 나타낸다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 자기 영동을 이용한 자성 입자와 결합된 미세 입자를 분리하는 장치를 사용하여 백혈구를 분리하는 경우 외부 자기장을 가한 경우와 가하지 않은 경우의 백혈구가 용해된 혈액 및 자성 입자가 채널을 따라 흐르는 모습을 나타낸다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 자기 영동을 이용한 자성 입자와 결합된 미세 입자를 분리하는 장치를 사용하여 자성 입자와 결합된 RNA 를 분리하는 경우 시료의 유량을 변화시킴에 따라 자성 입자와 결합된 RNA의 분리 효율 및 RNA 순도를 측정한 결과를 나타낸다.
도 11은 본 발명의 실시예에 따른 RNA 추출물로 human ß actin(219 bp)검출을 위한 RT-PCR를 수행한 결과를 나타낸다.
도 12에 자성 입자가 결합된 혈중 종양 세포가 본 발명의 일 실시예에 의하여 제조된 미세 입자 분리기의 채널을 따라 흐르는 모습을 나타내었다.
도 13에 시료의 유량을 변화시킬 경우 자성 입자와 결합한 혈중종양 세포의 분리 효율을 측정한 결과를 나타내었다.
도 14에 샘플 내에 스파이크 되는 혈중 종양 세포의 갯수를 변화시키면서 본 발명의 실시예에 의한 미세입자분리기로 분리되는 혈중 종양 세포의 갯수를 측정한 결과를 나타내었다.
도 15에 분리된 혈중 종양 세포에 대한 RT-PCR를 수행한 결과를 나타내었다.
도 16은 유방암과 폐암 환자로부터 혈중 종양 세포를 분리한 결과를 나타낸다.
도 2와 도 3은 본 발명의 일실시 형태에 따른 자기 영동을 이용한 미세 입자 분리 장치의 단면도 및 평면도이다.
도 4는 하부 유리 기판에 상감 기법에 의하여 강자성 와이어를 포함하도록 하는 제조 과정을 나타낸다.
도 5 내지 도 7은 본 발명의 자기 영동을 이용한 미세 입자 분리 장치에 외부 자기장이 가해질 경우 자성 입자가 결합된 미세 입자에 가해지는 자기장의 방향 및 자기력을 나타낸다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 자기 영동을 이용한 미세 입자 분리 장치를 나타낸다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 자기 영동을 이용한 자성 입자와 결합된 미세 입자를 분리하는 장치를 사용하여 백혈구를 분리하는 경우 외부 자기장을 가한 경우와 가하지 않은 경우의 백혈구가 용해된 혈액 및 자성 입자가 채널을 따라 흐르는 모습을 나타낸다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 자기 영동을 이용한 자성 입자와 결합된 미세 입자를 분리하는 장치를 사용하여 자성 입자와 결합된 RNA 를 분리하는 경우 시료의 유량을 변화시킴에 따라 자성 입자와 결합된 RNA의 분리 효율 및 RNA 순도를 측정한 결과를 나타낸다.
도 11은 본 발명의 실시예에 따른 RNA 추출물로 human ß actin(219 bp)검출을 위한 RT-PCR를 수행한 결과를 나타낸다.
도 12에 자성 입자가 결합된 혈중 종양 세포가 본 발명의 일 실시예에 의하여 제조된 미세 입자 분리기의 채널을 따라 흐르는 모습을 나타내었다.
도 13에 시료의 유량을 변화시킬 경우 자성 입자와 결합한 혈중종양 세포의 분리 효율을 측정한 결과를 나타내었다.
도 14에 샘플 내에 스파이크 되는 혈중 종양 세포의 갯수를 변화시키면서 본 발명의 실시예에 의한 미세입자분리기로 분리되는 혈중 종양 세포의 갯수를 측정한 결과를 나타내었다.
도 15에 분리된 혈중 종양 세포에 대한 RT-PCR를 수행한 결과를 나타내었다.
도 16은 유방암과 폐암 환자로부터 혈중 종양 세포를 분리한 결과를 나타낸다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것이므로, 본 발명의 내용이 실시예에 의하여 한정되지는 않는다.
<
제조예
1> 자기 영동에 의한 자성 입자가
결합된
미세 입자 분리 장치의 제조
미소유체채널을 형성하기 위하여 0.7 mm 두께의 바닥 유리기판(BorofloatTM, Howard Glass Co.,Worchester, MA)에 Ti/Cu/Cr seed layer를 증착하고, 포토레지스트를 통해 패턴을 형성한 뒤, 도금과정을 통하여 30 ㎛ 두께의 강자성 니켈 와이어를 형성하였다.
본 실시예에서는 분리용 미세 유체 채널 부분의 하부 유리 기판에 2개의 강자성 니켈 와이어가 포함되도록 하였으며, 이중 하나의 와이어는 시료의 흐름 방향에 대하여 5.7°경사각으로 포함되고, 나머지 하나의 와이어는 7.1°로 진행되다가 분리용 미세 유체 채널의 말단부에서 11.3 °로 경사각을 변경시켜 패턴 형성하였다.
세포가 미세 유체 채널 표면에 붙는 현상을 줄이기 위하여 상기 강자성 니켈 와이어를 분리용 미소 유체 채널부의 채널 표면으로부터 100 ㎛ 이격되도록 구성하였다.
포토리지스트를 제거하고, 에폭시 접착제를 도포하고 표면을 평탄하게 함으로써 자성 구조체로서 강자성 니켈 와이어를 포함하는 하부 기판을 제조하였다.
이후, 상부 유리 기판에 SU-8 을 미세 유체 채널 패턴으로 형성하고, Nitril rubber O-rings(size 001-1/2, McMaster-Carr, IL, USA) 를 사용하여 시료 주입부를 만들어 상부 유리 기판을 제조하고, 상기 제조된 하부 유리 기판과 UV 접착제(1187-M, DYMAX Co., Torrington, CT)로 접합함으로써 자기 유동을 이용한 미세입자 분리기를 도 8 과 같이 최종 완성하였다.
<실시예 1> RNA 분리
<실시예 1-1> 혈액으로부터 RNA 분리 실험
자성 입자로서 2.8 ㎛ diameter magnetic beads (Dynabeads Oligo(dT)25)를사용하였다. 사람의 혈액을 손가락으로부터 50 μl 채취하고, RNA 용해제(lysis buffer) 175 μl 를 상기 자성 입자와 혼합하여 자성 입자가 결합된 RNA 를 포함하는 시료를 제조하였다. 이와 같이 분비된 시료를 상기 실시예 1에서 제조된 미세입자 분리기의 시료 주입구에 15 ml/h 의 속도로 주입하였다.
상기 하부 유리판에 패턴 형성된 강자성 니켈 와이어에 외부 자기장을 가한 경우와 가하지 않은 경우의 백혈구가 용해된 혈액 및 자성 입자가 채널을 따라 흐르는 모습을 각각 도 9A 와 도 9B 에 나타내었다. 외부 자기장이 인가된 경우 혈액 및 자성 입자가 명백하게 분리되어 수집되는 것을 확인할 수 있다.
<실시예 1-2> 시료의 유량에 따른 분리 효율 측정
상기 실시예 1-1와 동일하게 하고 시료의 유량을 10, 15, 20, 25 ml/h 로 각각 변화시킬 경우 자성 입자와 결합한 RNA 의 분리 효율 및 분리된 RNA의 순도를 측정하였으며, 그 결과를 도 10a 및 도 10b 로 나타내었다.
도 10a 및 도 10b 에서 보는 바와 같이 시료의 유량이 증가할수록 분리 효율이 낮아지며, 따라서 분리하고자 하는 미세 입자에 따라 시료의 유량을 변화시킴으로써 분리 효율을 조절할 수 있으며, 혈액의 경우 RNA를 분리하기 위해서는 분리 효율 및 분리 속도 관점에서 시료의 유량이 15 내지 20 ml/h 인 것이 바람직함을 알 수 있다.
<시험예 1> 분리된 RNA 를 이용한 RT-PCR 수행
상기 실시예 1에서 분리된 RNA 를 이용하여 human ß actin(219 bp)검출을 위한 RT-PCR를 수행함으로써 본 발명에 따른 RNA 추출물이 RT-PCR 수행에 사용될 수 있는지 여부를 알아보았다.
RT-PCR 결과 도 11 에서 보는 바와 같은 젤 전기 영동 결과를 얻었으며, 이에 따라 본 발명의 RNA 추출 방법에 따라 분리된 RNA를 RT-PCR에 사용할 수 있음을 알 수 있다.
<제조예 2> 자기 영동에 의한 자성 입자가 결합된 미세 입자 분리 장치의 제조
본 실시예에서는 분리용 미세 유체 채널 부분의 하부 유리 기판에 2개의 강자성 와이어가 포함되도록 하였으며, 와이어의 폭은 50 ㎛이고, 2개의 와이어가 모두 시료의 흐름 방향에 대하여 5.7°경사각으로 포함되도록 패턴 형성하는 것을 제외하고는 상기 제조예 1과 동일하게 하여 자기 영동에 의한 자성 입자가 결합된 미세 입자 분리 장치를 제조 하였으며, 제조된 분리 장치를 도 12에 나타내었다.
<실시예 2> 혈중 종양 세포(CTC circulating tumor cell) 의 분리
<실시예 2-1>
유방암 환자와 폐암환자로부터 혈액 샘플을 채취하였으며, 상피 세포 부착 분자에 대한 항체 anti-EpCAM 으로 표지화된 자성 나노 입자와 혼합하여 혈액 샘플 내의 혈중 종양 세포를 자성 나노 입자와 결합시켰다. 자성 입자로서 지름이 수십 nm인 anti-EpCAM 항체가 코팅된 magnetic nanobeads(STEMCELL Technologies)를 사용하였다.
이와 같이 준비된 자성 입자가 결합된 혈중 종양 세포를 포함하는 혈액 샘플을 상기 제조예 2에서 제조된 미세 입자 분리기에 주입하고, 상기 강자성 니켈 와이어에 외부 자기장을 가한 경우와 가하지 않은 경우 자성 입자가 결합된 혈중 종양 세포가 상기 제조예 2에서 제조된 미세 입자 분리기의 채널을 따라 흐르는 모습을 도 12 에 나타내었다. 도 12에서 외부 자기장이 인가될 경우 자성 입자와 결합된 혈중 종양 세포가 측면방향으로 이동하면서 분리되는 것을 확인할 수 있다.
<실시예 2-2> 시료의 유량에 따른 분리 효율 측정
상기 실시예 1-1와 동일하게 하고 시료의 유량을 2, 3, 4, 5 ml/h 로 각각 변화시킬 경우 자성 입자와 결합한 혈중종양 세포의 분리 효율 및 분리된 혈중종양세포의 순도를 측정하였으며, 그 결과를 도 13에 나타내었다.
도 13에서 보는 바와 같이 자성 입자와 결합한 혈중종양 세포의 분리 효율은 78.7% 로 나타났으며, 혈중 종양 세포에 있어서는 유속이 2 내지 5 ml/h 범위에서는 유속에 의하여 분리 효율이 변화하지 않는 것을 알 수 있다.
<실시예 2-3> 시료 내에 혈중 종양 세포의 삽입 양에 따른 분리 효율 측정
상기 실시예 2-1와 동일하게 하고 샘플 내에 스파이크 되는 혈중 종양 세포에 갯수를 10, 102, 103, 104 로 변화시키면서 상기 제조예 2에서 제조된 미세입자분리기로 분리되는 혈중 종양 세포의 갯수를 측정하고, 그 결과를 도 14에 나타내었다. 도 14에서 보는 바와 같이 스파이크 된 혈중 종양 세포의 갯수와 분리되는 혈중 종양 세포의 갯수가 상호 비례하는 것을 알 수 있다.
<실시예 2-4> 시료 내에 혈중 종양 세포의 스파이크 양에 따른 RT-PCR 수행
스파이크 되는 혈중 종양 세포 갯수가 10, 102, 103 인 각각의 샘플에 대해서, 상기 실시예 2-3에서 분리된 혈중 종양 세포 검출을 위한 RT-PCR를 수행하였으며, 그 결과를 도 15에 나타내었다.
RT-PCR 결과 도 15에서 보는 바와 같이 스파이크 되는 혈중 종양 세포가 10 인 경우에도 PCR로 분리 결과를 확인할 수 있었다.
<실시예 2-5> 암환자로부터 CTC 세포 분리
3명의 유방암 환자와 1명의 폐암 환자 샘플을 사용하여 상기 제조예 2에서 제조된 미세입자 분리 장치로 혈중 종양 세포를 분리하였으며, 그 결과를 도 16에 나타내었다. 도 16에서 혈중 종양 세포가 완전히 분리됨을 확인할 수 있다.
Claims (12)
- 상부 유리 기판;
패턴화된 자성체 미세 구조물을 포함하는 하부 유리 기판;
상기 상부 유리 기판과 상기 하부 유리 기판 사이에 형성되며 자성 입자가 결합된 미세 입자를 포함하는 시료가 위치하는 미세 유체 채널; 및
상기 패턴화된 자성체 미세 구조물에 자기장을 인가하는 외부 자기장원을 포함하는 자기 영동을 이용한 미세 입자 분리 장치.
- 제 1 항에 있어서,
상기 미세 유체 채널은 자성 입자가 결합된 미세 입자를 포함하는 시료와 버퍼를 주입하는 시료 주입관을 포함하는 시료 주입용 미세 유체 채널 영역;
상기 주입된 시료에 포함된 자성 입자가 결합된 미세 입자가 자기 영동에 의해 분리되면서 통과하는 분리용 미세 유체 채널 영역; 및
상기 분리용 미세 유체 채널 영역을 통과하면서 분리된 자성 입자가 결합된 미세 입자 및 나머지 시료가 각각 분리 배출되는 복수개의 배출관을 포함하는 배출용 미세 유체 채널 영역으로 구분되는 것을 특징으로 하는 자기 영동을 이용한 미세 입자 분리 장치.
- 제 1 항에 있어서,
상기 하부 유리 기판의 자성체 미세 구조물은
i)seed layer 증착 공정,
ii)포토리지스트에 의한 자성체 미세 구조물을 형성하기 위한 패턴 형성 공정,
iii)상기 형성된 패턴에 따라 자성체 미세 구조물을 증착하는 공정, 및
iv)자성체 미세 구조물을 포함하는 하부 유리 기판 전체에 걸쳐 에폭시 수지를 균일하게 도포하여 코팅층을 형성하는 공정에 의하여 하부 유리 기판에 포함되는 것을 특징으로 하는 자기 영동을 이용한 미세 입자 분리 장치.
- 제 2 항에 있어서,
상기 자성체 미세 구조물은 상기 분리용 미세 유체 채널 영역에서 시료의 흐름 방향에 대한 소정의 경사각을 갖도록 상기 하부 유리 기판에 패턴 형성되어 포함되는 것을 특징으로 하는 자기 영동을 이용한 미세 입자 분리 장치.
- 제 4 항에 있어서,
상기 자성체 미세 구조물의 시료의 흐름 방향에 대한 경사각이 상기 분리용 미세 유체 채널 영역에서 변화하는 것을 특징으로 하는 자기 영동을 이용한 미세 입자 분리 장치.
- 제 4 항에 있어서,
상기 복수개의 배출관을 포함하는 배출용 미세 유체 채널 영역은 자성 입자가 결합된 미세 입자가 수집되는 챔버와 나머지 시료들이 수집되는 챔버로 연결되는 배출관을 포함하며, 상기 자성 입자가 결합된 미세 입자가 수집되는 챔버로 연결되는 배출관과 상기 나머지 시료들이 수집되는 챔버로 연결되는 배출관은 상호 일정 각도로 분리되어 있는 것을 특징으로 하는 자기 영동을 이용한 미세 입자 분리 장치.
- 제 4 항에 있어서,
상기 자기 영동을 이용한 미세 입자 분리 장치는 분리하고자 하는 자성 입자가 결합된 미세 입자에 따라 상기 자성체 미세 구조물의 시료의 흐름 방향에 대한 경사각, 상기 자성체 미세 구조물의 두께, 복수개로 형성되는 자성체 미세 구조물간의 간격, 설치 갯수를 변화시키는 것을 특징으로 하는 자기 영동을 이용한 미세 입자 분리 장치.
- 제 4 항에 있어서,
상기 자기 영동을 이용한 미세 입자 분리 장치는 외부 자기장원의 크기와 미세 유체 채널 내의 유체 흐름 속도를 조절하여 미세 입자의 이동을 조절하는 것을 특징으로 하는 자기 영동을 이용한 미세 입자 분리 장치.
- 제 1 항에 있어서,
상기 자성체 미세 구조물은 강자성 와이어인 것을 특징으로 하는 자기 영동을 이용한 미세 입자 분리 장치.
- 제 1 항에 있어서,
상기 미세 입자는 RNA 또는 혈중 종양 세포 인 것을 특징으로 하는 자기 영동을 이용한 미세 입자 분리 장치.
- 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 하나의 미세 입자 분리 장치를 이용하여 미세 입자를 분리하는 방법으로서,
자성 입자가 결합된 미세 입자를 포함하는 시료를 시료 주입용 미세 유체 채널 영역의 시료 주입부에 주입하는 제 1 단계;
버퍼를 제어 유체 주입부에 주입하는 제 2 단계;
외부 자기장원에 전압을 인가하여 상기 자성 입자가 결합된 미세 입자를 포함하는 시료가 분리용 미세 유체 채널을 통과하면서 자성 입자가 결합된 미세 입자를 분리하는 제 3 단계; 및
상기 제 3 단계의 분리된 자성 입자가 결합된 미세 입자를 배출용 미세 유체 채널 영역에서 포획하는 제 4 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 미세 입자를 분리하는 방법.
- 제 11 항에 있어서,
상기 제 3 단계에서는 상기 자성체 미세 구조물에 연결되어 자기장을 형성하는 외부 자기장원의 크기와 미세 유체 채널 내의 유체 흐름 속도를 조절하여 미세 입자의 이동을 조절하는 것을 특징으로 하는 미세 입자를 분리하는 방법.
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