KR101213971B1

KR101213971B1 - 세포소기관 원격 이동방법, 장치 및 이를 위한 자성입자 복합체

Info

Publication number: KR101213971B1
Application number: KR1020100089829A
Authority: KR
Inventors: 이정훈; 차미선; 홍주희; 최정인
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2010-09-14
Filing date: 2010-09-14
Publication date: 2012-12-20
Also published as: KR20120027950A

Abstract

세포소기관 원격 이동방법, 장치 및 이를 위한 자성입자 복합체가 제공된다.
본 발명에 따른 세포소기관 원격 이동방법은 세포소기관과 특이적으로 결합할 수 있는 생물학적 활성 물질이 결합된 박테리아 자성입자 복합체를 세포 내로 주입시키는 단계; 상기 생물학적 활성 물질과 세포소기관의 특이적 결합에 따라 상기 자성 입자 복합체가 상기 세포소기관에 결합하는 단계; 및 외부 자기장 인가를 인가하여 상기 자성 입자 복합체가 결합된 세포소기관을 이동시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하며, 세포의 이동 없이 크로모솜과 같은 세포소기관과 자성 복합체를 특이적으로 결합시킨 후, 세포를 고정화시킴으로써 외부에 인가되는 자기장에 의하여 세포내 기관만을 선택적으로 조작할 수 있다

Description

세포소기관 원격 이동방법, 장치 및 이를 위한 자성입자 복합체{method and device for remote moving of organelle, and magnetic particle complex for the same}

본 발명은 세포소기관 원격 이동방법, 장치 및 이를 위한 자성입자 복합체에 관한 것으로, 보다 상세하게는 세포의 이동 없이 크로모솜과 같은 세포소기관과 자성 복합체를 특이적으로 결합시킨 후, 세포를 고정화시킴으로써 외부에 인가되는 자기장에 의하여 세포소기관만을 선택적으로 조작할 수 있는 세포소기관 원격 이동방법, 장치 및 이를 위한 자성입자 복합체에 관한 것이다.

유전공학 및 재생의학에 대한 상당한 기대로인해 세포 내의 세포소기관(organelle)을 조작하고자 하는 연구가 최근 활발히 진행되고 있다.

이중 가장 우수한 종래기술은 마이크로니들을 사용하여 전중기(prometaphase) 및 중기(metaphase)에서 인간 및 쥐 세포 내의 세포소기관인 크로모솜을 분리하는 것이다. 비록, 상기 종래기술들은 살아있는 세포에서의 직접적인 세포소기관 조작을 할 수 있다는 점에서 장점을 가지나, 세포 내로 직접 외부 도구를 침투시켜야 하는 점에서 많은 한계가 있다.

한편, 광학 집게(optical tweezer)는 초점화된 레이저 빔으로부터의 복사압을 이용, 광학 세포 전체, 세포소기관, 생체 내 거대분자 등을 조작할 수 있는 기술이다. 예를 들면, Walter 등은 레이저-유도 광학력 트랩(laser-induced optical force trap)dl 사용되어, 유사분열방추(mitotic spindle)에 연결된 크로모솜의 거동을 제어하는 방식을 개시하였다. 하지만, 트랩(포획)된 세포소기관 및 거대분자에 초점을 맞추기 위하여 필요한 레이저 전력은 세포의 사멸을 초래할 수 있다. 또한 상기 기술의 범위는 단일 세포로 제한되는 문제가 있다. 따라서, 아직까지 효과적인 방식으로 크로모솜과 같은 세포소기관을 원격 제어, 조작하는 기술은 개시되지 못하는 상황이다.

따라서, 본 발명이 해결하려는 과제는 자기장에 따라 효과적인 세포소기관의 원격 이동이 가능한 세포소기관 원격 이동방법을 제공하는 것이다.

본 발명이 해결하려는 또 다른 과제는 자기장에 따라 효과적인 세포소기관의 원격제어가 가능한 장치를 제공하는 것이다.

본 발명이 해결하려는 또 다른 과제는 세포소기관과 특이적으로 결합하여, 외부에 인가되는 자기력에 따라 세포 소기관을 이동시킬 수 있는 자성입자 복합체를 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 세포 내 세포소기관의 원격 이동방법으로, 상기 방법은 세포소기관과 특이적으로 결합할 수 있는 생물학적 활성 물질이 결합된 박테리아 자성입자 복합체를 세포 내로 주입시키는 단계; 상기 생물학적 활성 물질과 세포소기관의 특이적 결합에 따라 상기 자성 입자 복합체가 상기 세포소기관에 결합하는 단계; 및 외부 자기장 인가를 인가하여 상기 자성 입자 복합체가 결합된 세포소기관을 이동시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포소기관의 원격 이동방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에서 상기 박테리아 자성 나노입자는 코어의 자성입자; 및 상기 자성입자 표면을 덮는 리피드 막으로 이루어지며, 상기 세포소기관은 크로모솜 또는 미토콘드리아일 수 있다.

세포소기관이 크로모솜인 경우, 상기 생물학적 활성물질은 H1 히스톤 항체이며, 여기에서 상기 H1 히스톤 항체는 상기 박테리아 자성 나노입자의 리피드막과 결합하여, 크로모솜의 H1 히스톤 단백질과 특이적으로 결합하며, 상기 세포소기관이 미토콘드리아인 경우, 상기 생물학적 활성물질은 압타머이며, 상기 압타머는 상기 박테리아 자성 나노입자의 리피드막과 결합하여, 미토콘드리아의 시토크롬 C와 특이적으로 결합한다.

본 발명의 일 실시예에서 상기 H1 히스톤 항체는 박테리아 자성입자 결합 전 표지물질로 표지화되며, 상기 이동방법은 상기 외부 자기장 인가 전 상기 세포를 고정화시키는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 또 다른 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 세포소기관의 원격 이동장치로서, 세포가 트랩되며, 하부에 홀이 구비된 챔버; 상기 챔버의 홀과 연결되며, 상기 챔버 내의 세포를 진공에 의하여 고정시키는 진공라인; 및 상기 고정된 세포에 대하여 자기장을 인가하는 자기인가수단을 포함하며, 여기에서 상기 세포는 박테리아 자성 입자 복합체가 크로모솜과 특이적으로 결합된 것을 특징으로 하는 세포소기관의 원격 이동장치를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에서 상기 홀은 20 내지 40 μm의 직경을 가지며, 상기 박테리아 자성 나노입자는 코어의 자성입자; 및 상기 자성입자 표면을 덮는 리피드 막으로 이루어진다.

본 발명의 일 실시예에서 상기 세포소기관은 크로모솜 또는 미토콘드리아인데, 상기 세포소기관이 크로모솜인 경우, 생물학적 활성물질은 H1 히스톤 항체이며, 상기 H1 히스톤 항체는 상기 박테리아 자성 나노입자의 리피드막과 결합하다. 반대로, 상기 세포소기관이 미토콘드리아인 경우, 생물학적 활성물질은 압타머이며, 상기 압타머는 상기 박테리아 자성 나노입자의 리피드막과 결합하여, 미토콘드리아의 시토크롬 C와 특이적으로 결합할 수 있다.

상기 또 다른 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 세포소기관 원격 이동을 위한 자성입자 복합체로서, 상기 복합체는 코어의 자성입자와 상기 자성입자 표면을 덮는 리피드 막으로 이루어진 박테리아 자성 입자; 및 상기 리피드 막에 결합되며, 상기 세포소기관과 특이적으로 결합하는 물질이 결합된 것을 특징으로 하는, 세포소기관 원격 이동을 위한 자성입자 복합체를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에서 상기 세포소기관은 크로모솜이며, 상기 박테리아 자성입자 복합체는 리프드 막에 결합된 H1 히스톤 항체를 포함한다. 본 발명의 또 다른 일 실시예에서 상기 세포소기관은 미토콘드리아이며, 상기 박테리아 자성입자 복합체는 리프드 막에 결합된 압타머를 포함한다. 또한, 상기 리피드 막과 H1 히스톤 항체는 글루타르알데히드를 통하여, 가교결합된다.

본 발명의 세포소기관 원격 이동방법, 장치 및 이를 위한 자성입자 복합체에 따르면, 세포의 이동 없이 크로모솜과 같은 세포소기관과 자성 복합체를 특이적으로 결합시킨 후, 세포를 고정화시킴으로써 외부에 인가되는 자기장에 의하여 세포내 기관만을 선택적으로 조작할 수 있다. 특히 종래 기술에 비하여 보다 강한 힘으로 세포소기관을 조작, 제어할 수 있을 뿐 아니라, 원격 제어 방법으로 세포에 어떠한 영향을 주지 않고 제어 할 수 있으므로, 본 발명은 세포기능 및 분자 신호 경로 추정에 새로운 전기를 마련해 줄 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포소기관 원격 이동방법의 단계도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 실험방법을 설명하는 모식도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리아 자성입자(BMP)에 대한 SEM 이미지이다.
도 4는 자석막대에 의하여 BMP 복합체가 농축되어, 순도가 증가함을 나타내는 이미지이다.
도 5 및 6은 1 μl의 BMP 용액 (2.042 μg / 1 μl 농도) 을 내부에 주입한 후 관찰된 쥐 난모세포의 공초점레이저스캐닝현미경(CLSM) 이미지이다.
도 7은 세포내의 미토콘드리아만을 특이적으로 염색하고, 공초점레이저스케이닝 현미경으로 미토콘드리아의 표적화를 확인한 이미지이다.
도 8 및 9는 외부 자기장 인가에 따른 크로모솜 이동을 설명하는 도면 및 사진이다.
도 10a, 10b는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 트랩 장치를 포함하는 크로모솜 원격 이동장치에 대한 모식도이다.
도 11은 실제 제조된 크로모솜 원격 이동장치의 세포 트랩 장치의 사진이다.
도 12는 본 발명에 따른 자성 인가에 의하여 크로모솜의 이동을 나타내는 이미지이다.

이하, 본 발명을 도면을 참조하여 상세하게 설명하고자 한다. 다음에 소개되는 실시 예들은 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 예로서 제공되는 것이다. 따라서 본 발명은 이하 설명된 실시예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 그리고 도면들에 있어서, 구성요소의 폭, 길이, 두께 등은 편의를 위하여 과장되어 표현될 수도 있다. 명세서 전체에 걸쳐서 동일한 참조번호들은 동일한 구성요소들을 나타낸다. 또한, 본 발명의 일 실시 예는 세포소기관으로 크로모솜 및 미토콘드리아를 사용하였으나, 본 발명의 범위는 이에 제한되지 않는다. 즉, 세포 내에 존재하는 다양한 소기관에 대해서도 본 발명에 따른 BMP 복합체의 특이적 결합이 가능하며, 세포를 고정시킨 후, 외부 자기장을 인가함에 따라 세포소기관만이 이동될 수 있다.

본 발명은 자성입자의 위치를 원격에서 제어할 수 있다는 가능성과 함께, 나노입자의 우수한 장점(표적 목적으로 분자 고정화 가능, 우수한 분산특성 및 강한 자성)을 세포소기관 조작에 활용한다.

본 발명에서, 크로모솜과 같은 세포소기관을 특이적으로 표적하고, 이를 이동시키기 위한 물질(본 발명의 일 실시예에서는 크로모솜의 히스톤과 결합하는 H1 히스톤 항체)을 자성입자에 결합시킨 자성입자 복합체를 이용, 크로모솜을 표적, 결합시킨다. 특히 본 발명은 형광물질로 표지화된 H1 히스톤 항체로 기능화된 박테리아 자성 나노입자(BMP)를 자성입자 복합체로 개시한다.

본 발명의 일 실시예는 생물학적 방식으로 생성되며, 내부의 자성입자 코어 및 상기 코어를 둘러싸는 리피드 막으로 구성된 BMP가 종래의 합성자성입자에 비하여 우수한 특성을 갖는다는 점에 주목하였다. 우선 BMP는 자성 박테리아에 의하여 생성됨에 따라, 우수한 생체적합성을 가지며, 또한 리피드 이중막이 경계벽을 이루므로 수용액에서 잘 분산된다는 장점이 있다. 더 나아가, 자성코어를 폐쇄시키는 리피드 이중막에 다양한 단백질을 결합시킬 수 있으므로 BMP의 다양한 기능화가 효과적으로 수행될 수 있다는 장점이 있고, BMP는 상업적인 자성입자에 비하여 높은 자성 모멘트를 가진다는 장점이 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 세포소기관인 크로모솜의 특이적 표적결합을 위하여, H1 히스톤 항체가 BMP에 컨쥬게이트되었다. 히스톤은 염색체의 팩킹(packing)에 필수적인 단백질로서, DNA 나선형 스트랜드 주위의 “스풀(spool)”과 많이 유사하다. 또한 세포 사이클 중 M 단계(phase)에서는 크로모솜이 응축하여, 위치 확인이 용이할뿐 아니라, 세포 내의 핵막이 제거되어 BMP 복합체와 염색체의 결합률을 증가시킬 수 있으므로, 본 발명에서 세포는 M 단계에 고정되었다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포소기관 원격 이동방법의 단계도이다.

도 1을 참조하면, 먼저, 크로모솜과 같은 세포소기관에 특이적으로 결합할 수 있는 생물학적 활성 물질이 결합된 박테리아 자성 입자 복합체를 세포 내로 주입시킨다. 상기 생물학적 활성물질은 세포소기관에 특이적으로 결합하는 물질로서, 본 발명의 일 실시예는 크로모솜의 H1 히스톤 단백질과 특이적으로 결합할 수 있는 H1 히스톤 항체로 박테리아 자성 나노입자(BMP)를 컨주게이션하여 결합시켰다. 또한 본 발명은 BMP의 세포 내 주입/이동이 가장 용이한 시점으로 세포주기의 M 단계를 선택하여, BMP 복합체와 세포소기관의 특이적 결합 효율을 향상시켰다.

본 발명의 또 다른 일 실시 예에서는 세포소기관인 미토콘드리아의 시토크롬 C와 표적 결합하는 압타머(5'-CCGTGTCTGGGGCCGACCGGCGCATTGGGTACGTTGTTGC-3')와 BMP 복합체를 이용하였다.

이후, 상기 생물학적 활성 물질과 세포소기관의 특이적 결합에 따라 자성 입자 복합체는 세포소기관과 결합된다. 본 발명의 일 실시 예에 따른 BMP 복합체와 크로모솜의 효과적인 특이 결합 결과는 아래에서 보다 상세히 설명한다.

이후, 외부 자기장 인가를 통하여 상기 자성 입자 복합체가 결합된 세포소기관을 이동시킨다. 특히, 본 발명의 일 실시예는 세포를 진공 등에 의하여 고정시킨 후, 외부 자기장을 인가하여 세포 내의 세포소기관만을 선택적으로 이동시키는, 원격 세포소기관 이동방법을 제공한다.

이하 본 발명의 일 실시예에 따른 원격 세포이동 방법을 보다 상세히 설명하며, 아래에서 세포소기관의 예로 크로모솜이 사용된다. 하지만, 본 발명의 범위는 이에 제한되지 않는다.

도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 실험방법을 설명하는 모식도이다.

도 2를 참조하면, 컨쥬게이션 방식을 통하여 제조된 항체-결합 박테리아 자성 입자(BMP) 복합체를 난자세포 내로 삽입하여, 세포소기관인 크로모솜 내의 H1 히스톤에 표적결합시켰다. 복합체와 히스톤 단백질 간의 특이적 결합 결과, 외부 자기장으로부터의 힘이 원격으로 크로모솜에 작용하여, 사이토졸에서의 크로모솜 움직임을 이끌었다.

본 발명의 일 실시예에서 BMP는 “마그네토솜”라 불리는 호기성 자성 박테리아(magnetospirillum magne-toticum AMB-1)로부터 추출되며, 그 형태, 크기는 도 3에 도시된 바와 같이 50 내지 100nm의 균일한 직경을 갖는다. 이하 BMP 추출방법을 보다 상세히 설명한다.

실시예 1

BMP 추출

먼저, 박테리아 자성 나노입자(BMP)를 자성 스피릴룸 성장 배지(MSGM)에서 4-5일간 27℃에서 혐기환경에서 배양된 마그네토스피릴룸(Magnetospirillum) sp. AMB-1으로부터 얻었다. 이후 배양된 ABM-1을 25분간 11300xg으로 원심분리하고, 30분간 초음파처리하여 용해시켰다. 다시 자성 나노입자는 네오디뮴철 붕소(NdFeB) 자석을 사용하여 수집하고, PBS로 5회 세척하고, 마지막으로 PBS에 분산시켰다. 도 4는 자석막대에 의하여 BMP 복합체가 농축되어, 순도가 증가함을 나타내는 이미지이다. 도 4를 참조하면, 아래의 자성 인가에 따라 BMP 복합체가 농축되는 것을 알 수 있다(아래 이미지).

수직된 자성 나노입자는 오토클레이브(121℃, 15분)에서 살균하였다. 이와 같이 박테리아로부터 추출된 BMP는 안정한 리피드막으로 둘러쌓인 자성코어로 이루어진다. 이러한 특징으로 인하여, 비록 중심은 자성의 성질을 가짐에도 불구하고, BMP는 수용액에서의 안정한 분산특성을 나타내게 된다. 또한 막의 몇몇 단백질은 다른 바이오 분자, 예를 들면 항체, 효소 및 폴리펩티드와 같은 분자와 컨쥬게이션 결합을 형성할 수 있다.

실시예 2

BMP 복합체 제조

BMP 복합체는 표지화 및 컨쥬게이션 과정을 통하여 제조된다.

먼저, 아민으로 기능화된 BMP와 H1 히스톤 항체의 공유 결합을 위하여, BMP에 대하여 글루타르알데히드(glutaraldehyde, Sigma Aldrich, 미국)를 이중기능기 함유 가교결합제(homobifunctional crosslinker)로 사용하였다. 상온에서 1 내지 2 시간 반응시킨 후, BMP를 1ml MES 버퍼액으로 세척하였다. 다시 BMP 를 블록킹/스토리지 버퍼액에서 재현탁시켜, 비특이적 결합을 방지하였다. 이때 BMP에 고정시키기 전, H1 히스톤 항체는 플루오레세인-이소티오시아네이트(FITC, 표지물질인 염료)로 표지화되었는데, 이를 위하여 H1 히스톤 항체는 Ez-표지 FITC 단백질 표지화 키트(Pierce, 미국)를 사용, FITC와 결합되는데, 여기에서 플루오레세인기의 이소티오시아네이트기는 항체의 아민기와 가교결합된다. 이후, FITC가 결합된 H1-항체(H1-antibody)를 함유하는 반응튜브에 BMP 용액을 혼입하고, 혼합 용액을 2-4 시간 반응시켜, 컨쥬게이트된 BMP-항체 복합체를 얻었다. 다시 과량의 항체를 제거하기 위하여, 자석막대를 사용하여 BMP-항체 복합체를 농축하였다(도 4 참조). 본 발명의 일 실시예에서 항체의 형광 표지화는 상술한 바와 같이 BMP-항체 컨쥬게이션에 앞서 진행된다.

실시예 3

세포소기관과의 결합

실시예 3-1

크로모솜과의 특이적 결합

크로모솜의 H1 히스톤 단백질 또는 로 접근하기 위하여 BMP 복합체는 세포와 핵막을 지날 수 있어야 한다. 세포 흡수 메커니즘 중 엔도시토시스가 일반적으로 알려져 있는데, 본 발명은 이를 이용하였다. 또한 내부로 침투된 BMP복합체와 크로모솜의 H1 히스톤 사이의 표적결합 효율은 M-단계에서 증가할 것으로 예상하였는데, 그 이유는 M-단계에서는 핵막이 없기 때문에 BMP가 크로모솜을 자유롭게 지날 수 있으며, 또한 응축된 크로모솜은 대부분 이 단계에서 관찰할 수 있기 때문이다. BMP 복합체가 크로모솜에 특이적으로 표적결합 되었는지를 판단하기 위하여, 본 발명은 두 종류의 BMP를 사용하였는데, 그 중 하나는 항체가 결합된 것이었고, 나머지 하나는 항체가 결합되지 않은 것이었다. 항체가 없는 BMP를 추적하기 위하여, FITC가 BMP 표면에 직접 결합, 표지화시켰다.

도 5 및 6은 1 μl의 BMP 용액 (2.042 μg / 1 μl 농도) 을 내부에 주입한 후 관찰된 쥐 난모세포의 공초점레이저스캐닝현미경(CLSM) 이미지이다. CLSM의 주요 특징은 특정 깊이로부터 초점거리 내의 이미지를 얻을 수 있다는 것으로, 이것은 광학 분할(optical sectioning)로 알려진 공정이다. 따라서, 본 발명에서는 Z-축으로 1μm까지의 간격으로 이미지가 스캔되어, 캡쳐되었고, 크로모솜과 BMP 복합체의 상대 위치를 비교하기 위하여, 크로모솜을 훽스트(Hoechst)로 대비염색시켰다.

도 5는 항체가 결합된 케이스 1에 대한 캡쳐된 이미지이다.

도 5를 참조하면, BMP 복합체와 크로모솜의 위치가 정확히 오버랩되는 것을 알 수 있다. 이는 BMP 복합체가 명확히 크로모솜 내부로 이동되었음을 보여주며, 또한 수축된 크로모솜은 쥐 난자세포가 M 단계에 머물러 있음을 나타낸다. 이러한 결과는 비록 사이토솔과 세포하부 구조(예를 들면 세포골격 섬유)가 다수 존재함에도 불구하고, BMP 복합체가 이러한 사이토솔 등의 저항을 극복하고 엔도시토시스에 의하여 세포 내로 용이하게 이동되는 것을 나타낸다.

도 6은 항체가 없는 케이스 2에 대한 캡쳐 이미지이다.

도 6을 참조하면, 항체가 없는 케이스 2인 경우, FITC 형광 스폿은 난자세포 내에서 임의 방식으로 분산하는 형태로 나타났으며, 이것은 크로모솜 분포와는 아무런 상관관계가 없는 분포 형태이다.

이상의 도 5 및 도 6의 결과는 세포 내의 BMP 복합체와 세포소기관인 크로모솜의 특이적 결합을 실증한다.

실시예 3-1

미토콘드리아와의 결합

또 다른 세포소기관과 본 발명에 따라 제조된 BMP 복합체와의 특이 결합을 증명하기 위하여, 세포소시관으로 미토콘드리아를 선택하였다.

BMP의 추출은 실시예 1과 같은 방법으로 이루어 졌으며, 미토콘드리아 표적화를 위한 BMP의 복합체 제조는 다음과 같은 방법으로 이루어졌다.

먼저 미토콘드리아의 시토크롬 C를 표적화하는 것으로 알려진 압타머(5'-CCGTGTCTGGGGCCGACCGGCGCATTGGGTACGTTGTTGC-3')를 5'쪽에 아민기로 기능화하고, 3'쪽은 FITC로 표지화하여 합성하였다.

BMP와 시토크롬 C 압타머를 단백질 결합 완충제(protein conjugation buffer) 역할을 하는 20mM HEPES에 넣어 준비하였다. 여기에 아민-아민 결합을 중개하는 가교제인 BS3를 첨가하여 30분 동안 상온에서 반응시켰다. 이후 pH 7.5의 1M Tris-HCl 용액을 첨가하여 15분 동안 상온에서 반응시켜 BMP-압타머 복합체를 얻었다. 잔여 압타머를 제거하기 위해 네오디움 자석을 사용하여 BMP-압타머를 집합시켜 BMP-압타머 복합체를 농축하였다.

만들어진 BMP-압타머 복합체를 암세포인 HeLa cell에 주입한 후 24시간 동안 37℃에서 배양 하였다. 그 후 mitotracker를 이용하여 세포내의 미토콘드리아만을 특이적으로 염색하고 공초점레이저스케이닝 현미경으로 미토콘드리아의 표적화를 확인하였다. (도 7 참조)

도 7(a)는 mitotracker에 의해 염색된 미토콘드리아를 보여준다. 또한 도 7(b)는 HeLa cell 내로 전달된 BMP-압타머 복합체를 확인한 이미지이다. 이 두 이미지를 합치면 도 7(c)와 같이 미토콘드리아와 BMP-압타머 복합체가 정확히 일치하여 염색된 색깔이 변하는 것을 확인할 수 있다. 이상의 도 12 결과를 통해 BMP 복합체를 이용하여 크로모솜 이외의 세포내 소기관에 대해서도 특이적 결합을 유도할 수 있음을 실증한다.

아래에서는 크로모솜을 세포소기관의 일 예로 선택하여, 본 발명에 따른 세포기관의 이동 방법, 장치를 설명한다.

실시예 4

크로모솜 이동

도 8 및 9는 외부 자기장 인가에 따른 크로모솜 이동을 설명하는 도면 및 사진이다.

도 8 및 9를 참조하면, 크로모솜과 BMP 복합체의 특이적 결합이 형성되었음을 관찰한 후, 외부 자기장을 인가하여 세포 배향과 크로모솜 위치에 대한 조작을 진행하였다. 이때 1μl BMP 복합체는 상술한 바와 동일한 농도로 사용되었으며, 세포 생존력 또한 이 수준의 농도로 분석되었다.

세포 방향을 조작하기 위해서는, 세포의 BMP 복합체 흡수량이 상기 실험값보다 다소 커야 한다. 따라서, 난모난구세포(oocyte cumulus cell (OCC))를 제거하고, 세포를 투명대(zona pellucida) 처리하여, 투과도를 증가시켰다.

또한, 보다 용이한 관찰을 위하여 M Ⅱ 단계에 머물러 있는 세포를 선택하였으며, 세포 외부의 BMP 복합체로부터의 신호 효과를 감소시키기 위하여, BMP 복합체 의 세포 내 주입 후 세포를 매질로 수회 세정하였다. 또한, 세포 이동을 초래할 수도 있는 매질 유동 현상을 안정화시킨 후, 다시 네오디뮴 자석(45x30x10 mm )을 사용, 정지된 세포에 자기장을 서서히 인가하였다. 도 8에서 도시된 바와 같이, 자석막대가 이동함에 따라, 세포 배향은 자석막대의 이동경로에 따라 변화되었다. 자석막대의 역방향 이동은 동일한 방식으로 세포 배향의 변화를 발생시켰다(도 9 참조). 상술한 실험에서, 전체 세포의 회전은 세포 내의 크로모솜의 이동보다 선호된다. 이것은 크로모솜의 이동이 사이토졸(저항)에 의하여 블록되기 때문으로 판단된다.

실시예 5

크로모솜 이동장치

실시예 4의 결과로부터 세포 내의 세포소기관만을 선택적으로 이동, 조작하기 위해서는 사이토졸 등의 저항을 극복할 수 있는 보다 강한 자기장이 요구된다. 하지만, 세포소기관의 이동과 동시에 세포 자체가 이동하는 문제를 방지하기 위해서는 기판에 세포를 고정시켜, 세포 회전을 방지하는 것은 매우 중요하다. 이러한 세포의 고정을 위하여, 본 발명은 진공으로 동작하는 세포트랩 장치를 제조하였으며, 이러한 세포 트랩 장치를 포함하는 크로모솜 원격 이동장치에 대한 모식도가 도 10a, 10b 및 11에 도시된다.

도 10a를 참조하면, 본 발명에 따른 세포 내 크로모솜의 원격 이동장치(100)는 세포가 트랩되며, 하부에 홀이 구비된 챔버(110)를 포함한다. 상기 챔버에는 세포 배지가 채워진 웰 형태일 수 있으며, 하부에는 세포(C)보다 적은 크기의 홀(120)이 구비된다. 상기 홀(120)을 통하여 진공이 인가되는데, 이로써 세포(C)는 인가되는 진공에 의하여 홀(120)로 이동하여 고정된다. 즉, 진공에 의한 흡인력에 의하여 세포는 고정되며, 이로부터 세포는 외부자기장으로부터 안정화된다. 이를 위하여, 상기 홀(120)에는 상기 챔버(110)로 진공을 인가하기 위한 별도의 진공라인(130)이 구비될 수 있다. 여기에서 진공라인(130)은 물리적인 라인이라기 보다는 진공이 인가되는 통로로 해석되어야 한다.

또한 상기 크로모솜 원격 이동장치(100)는 상기 세포에 자기장을 인가하기 위한 자기인가수단(140)이 더 구비된다. 바람직하게는 상기 자기인가수단(140)은 위치가 이동 가능한 자석 등이 사용될 수 있다.

도 10b는 본 발명의 일 실시예에 따른 크로모솜 원격 이동장치의 모식도이다.

도 10b를 참조하면, 배지챔버(210)에서의 세포(C)는 진공챔버(240)에 연결된 하부 챔버로(230)부터 홀(220)에 인가되는 진공에 의하여 고정되어, 외부 자기장 인가에도 불구하고 회전이 방지된다. 보다 효과적인 세포 고정을 위하여, 본 발명은 대상 세포의 외부 난구를 제거하였는데, 왜냐하면 이것은 일종의 윤활유와 같이 기능하여 세포 회전을 초래하기 때문이다.

외부 난구가 제거된 후 난모세포의 크기는 60~70 μm 수준이었고, 홀의 크기는 외부 난구가 제거된 세포를 포획하기 위하여 20~40 μm 으로 세포 크기보다 작게 설계되었다. 즉, 진공 챔버와 연결된 어레이의 홀을 통하여 세포는 고정되며, 챔버압력은 도립형 현미경에 연결된 미세 조작자에 의하여 제어된다. 제어압력이 인가되었을 때, 세포는 빨리 홀로 이끌리어, 고정된다. 홀에 고정된 세포는 자기장에서의 크로모솜 이동 중 외부 자기장 인가에 의한 영향을 받지 않는다. 도 11은 실제 제조된 크로모솜 원격 이동장치의 세포 트랩 장치의 사진이다.

실시예 6

크로모솜 이동효과

이하 본 발명에 따른 크로모솜의 원격 제어방법 및 장치의 우수한 특성을 보다 상세히 설명한다.

단일 입자에 대한 자성 모멘트(m)인 자력 F는 자성 플럭스 밀도(B)에 비례한다. 단일 BMP의 자성 모멘텀(m)는 ~ 6x0^-17A?m² 수준으로 나타났다. 따라서, ~ 90 T?m^-1 수준의 적당한 자기장 구배(∇B)가 형성될 때, BMP하나에 대한 견인력은 ~ 5.4 fN수준이었다. 다른 수단, 예를 들면 광학 집게를 사용하였을 때의 원격조작력은 수 피코뉴튼 수준이었음을 고려해볼 때, BMP 복합체의 흡입량이 증가 되어야 하는 것을 알 수 있다. 본 발명에서 표적결합의 효율을 증가시키고, 세포성장주기에서 유도되는 크로모솜의 이동을 방지하기 위하여, 세포를 M I 단계로 머물러있게 하는 노코다졸 처리법이 사용되었다. 또한 BMP 복합체의 세포 내 주입 후, 세포 외의 BMP 복합체를 신선한 배양액으로 수회 세정하여, 제거되었다.

용이한 관찰을 위하여 크로모솜을 획스트로 염색하고, 크로모솜 위치를 모니터링하기 위하여, 각 세포를 마이크로-트랩 장치로 고정화하였고, 10분 간격으로 80분간 도립형 형광 현미경으로 이미지를 캡쳐하였다. 자기장에 의하여 유도되었을 때, 크로모솜은 서서히 자기장 방향으로 이동하였다(도 12 참조). 하지만, ~5.6 μm 수준의 크로모솜 이동(translocation) 이후, 크로모솜의 이동은 정지되었다. 일반적으로 난모세포의 응축된 크로모솜은 1 내지 2 ㎛ 수준임을 고려하여 볼 때, 상기 결과는 BMP 복합체에 의하여 포획된 크로모솜 이동이 세포 내의 사이토졸 점도에 의하여 상당히 방해 받기 때문으로 판단된다. 특히, 세포내 단백질 섬유인 액틴 섬유(filament)가 밀도에 따라 100nm 내지 1㎛ 수준의 평균 메쉬 크기의 엉킨 네트워크를 구성하며, 이러한 엉킴 구조로 인하여 응축된 크로모솜 이동이 저해된다.

게다가 피층으로의 크로모솜 이동은 액틴 섬유의 엉킴 구조에 따른 저항에 크게 영향 받는데, 그 이유는 액틴 섬유가 중앙보다는 세포 피층에 높은 밀도로 엉켜 있기 때문이다. 즉, 본 발명은 BMP 복합체(BMP-항체 복합체)를 세포 내의 소기관인 크로모솜에 재배치하여, 표적결합시키고, 표적결합된 크로모솜에 자기장을 인가함으로써 특정 세포소기관(본 발명의 일 실시예에서는 크로모솜)만을 선택적으로 세포 내에서 이동시킨다. 따라서, 본 발명에 따른 이러한 방법은 세포기능 및 분자 신호 경로 추정에 새로운 전기를 마련해 줄 것으로 기대된다.

Claims

세포 내 세포소기관의 원격 이동방법으로, 상기 방법은
크로모솜 또는 미토콘드리아인 세포소기관과 특이적으로 결합할 수 있는 생물학적 활성 물질이 결합된 박테리아 자성입자 복합체를 세포 내로 주입시키는 단계;
상기 생물학적 활성 물질과 세포소기관의 특이적 결합에 따라 상기 자성 입자 복합체가 상기 세포소기관에 결합하는 단계; 및
외부 자기장 인가를 인가하여 상기 자성 입자 복합체가 결합된 세포소기관을 이동시키는 단계를 포함하며, 상기 세포소기관이 크로모솜인 경우, 상기 생물학적 활성물질은 H1 히스톤 항체이며, 여기에서 상기 H1 히스톤 항체는 상기 박테리아 자성 나노입자의 리피드막과 결합하여, 크로모솜의 H1 히스톤 단백질과 특이적으로 결합하고,
상기 세포소기관이 미토콘드리아인 경우, 상기 생물학적 활성물질은 압타머이며, 상기 압타머는 상기 박테리아 자성 나노입자의 리피드막과 결합하여, 미토콘드리아의 시토크롬 C와 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 세포소기관의 원격 이동방법.
제 1항에 있어서,
상기 박테리아 자성 나노입자는 코어의 자성입자; 및
상기 자성입자 표면을 덮는 리피드 막으로 이루어진 것을 특징으로 하는 세포소기관의 원격 이동방법.
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제 2항에 있어서,
상기 H1 히스톤 항체는 박테리아 자성입자 결합 전 표지물질로 표지화되는 것을 특징으로 하는 세포소기관의 원격 이동방법.
제 1항에 있어서,
상기 외부 자기장 인가 전 상기 세포를 고정화시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포소기관의 원격 이동방법.
크로모솜 또는 미토콘드리아인 세포소기관의 원격 이동장치로서,
세포가 트랩되며, 하부에 홀이 구비된 챔버;
상기 챔버의 홀과 연결되며, 상기 챔버 내의 세포를 진공에 의하여 고정시키는 진공라인; 및
상기 고정된 세포에 대하여 자기장을 인가하는 자기인가수단을 포함하며, 여기에서 상기 크로모솜 또는 미토콘드리아에 특이적으로 결합할 수 있는 생물학적 활성 물질이 결합되며, 코어의 자성입자, 및 상기 자성입자 표면을 덮는 리피드 막으로 이루어진 박테리아 자성입자 복합체가 상기 크로모솜 또는 미토콘드리아에 결합되며,
상기 세포소기관이 크로모솜인 경우, 상기 생물학적 활성물질은 H1 히스톤 항체이며, 상기 H1 히스톤 항체는 상기 박테리아 자성 나노입자의 리피드막과 컨쥬게이션되며,
상기 세포소기관이 미토콘드리아인 경우, 상기 생물학적 활성물질은 압타머이며, 상기 압타머는 상기 박테리아 자성 나노입자의 리피드막과 결합하여, 상기 미토콘드리아의 시토크롬 C와 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 세세포소기관의 원격 이동장치.
제 8항에 있어서,
상기 홀은 20 내지 40 μm의 직경을 갖는 것을 특징으로 하는 세포소기관의 원격 이동장치.
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크로모솜 또는 미토콘드리아인 세포소기관 원격 이동을 위한 자성입자 복합체로서, 상기 복합체는
코어의 자성입자와 상기 자성입자 표면을 덮는 리피드 막으로 이루어진 박테리아 자성 입자; 및
상기 리피드 막에 결합되며, 상기 세포소기관과 특이적으로 결합하는 물질이 결합되며,상기 세포소기관이 크로모솜인 경우, 상기 박테리아 자성입자 복합체는 리프드 막에 결합된 H1 히스톤 항체를 포함하며, 상기 세포소기관이 미토콘드리아인 경우, 상기 박테리아 자성입자 복합체는 리프드 막에 결합되며, 상기 미토콘드리아의 시토크롬 C와 특이적으로 결합하는 압타머를 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포소기관 원격 이동을 위한 자성입자 복합체.
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제 14항에 있어서,
상기 리피드 막과 H1 히스톤 항체는 글루타르알데히드를 통하여, 가교결합된 것을 특징으로 하는, 세포소기관 원격 이동을 위한 자성입자 복합체.