SK281566B6

SK281566B6 - Spôsob detekcie špecifických cieľových buniek a prostriedky na jeho vykonávanie

Info

Publication number: SK281566B6
Application number: SK329-95A
Authority: SK
Inventors: Oystein Fodstad; Gunnar Kvalheim
Original assignee: Oystein Fodstad; Gunnar Kvalheim
Priority date: 1992-09-14
Filing date: 1993-09-10
Publication date: 2001-05-10
Also published as: DE69326956D1; SK32995A3; US6184043B1; WO1994007139A1; JP3417563B2; US6893881B1; DK0660930T3; CZ65995A3; JPH08501390A; AU2593192A; AU686569B2; DE69326956T2; HUT73741A; FI951161A; EP0660930B1; HU9500723D0; FI951161A0; WO1994007138A1; CA2144328A1; ES2141170T3

Abstract

Opísaný spôsob detekcie špecifických cieľových buniek v suspenzii buniek pozostávajúcich zo zmiešanej populácie buniek, v tekutinách obsahujúcich zmiešanú populáciu buniek a v jednobunkovej suspenzii pripravenej z tuhých tkanív s výnimkou normálnych a zhubných hemapoietických buniek v krvi a kostnej dreni, pozostáva z nasledujúcich krokov: obaľovanie buniek paramagnetickými časticami alebo guľôčkami buď protilátkami alebo fragmentmi protilátok, zmiešanie cieľových buniek pridružujúcich protilátky, inkubácia zmesi suspenzie buniek a cieľ pridružujúcich protilátok pripojených na paramagnetické častice alebo guľôčky, vystavenie inkubovanej zmesi paramagnetických častíc, protilátok a buniek magnetickému poľu a skúmanie a spočítavanie cieľových buniek v inkubovanej zmesi paramagnetických častíc.ŕ

Description

Vynález sa týka spôsobu imunologickej detekcie špecifických cieľových buniek v populácii buniek a v roztokoch obsahujúcich populácie buniek. Vynález sa taktiež týka súpravy nástrojov na vykonanie spôsobu podľa vynálezu v rôznych populáciách buniek.

Doterajší stav techniky

V biológii, v biochémii a v príbuzných odvetviach je značná potreba spôsobov, ktorými sú chemické jednotky spoločne viazané. Tieto spôsoby majú vzrastajúcu dôležitosť vo výskume týkajúceho sa normálnych a abnormálnych populácií buniek. Najmä s použitím tuhých podkladov je možné bunky imobilizovať, zisťovať a izolovať a umyť. Navyše je možné obsah buniek skúšať použitím celého radu veľmi náročných spôsobov. Je tiež dôležité mať možnosť izolovať bunky v životaschopných formách.

Vzájomná väzba tvorí veľmi náročný spôsob spojenia chemických alebo biologických jednotiek. Pri tejto metóde sa pár väzbových partnerov, ktorý je napríklad pripojený k látke, ktorá má byť viazaná, viaže vzájomne na seba pri uvedení do styku. Jeden z väzbových partnerov takéhoto spojenia môže byť zastúpený molekulou na povrchu bunky. Je známych niekoľko takýchto väzbovo partnerských systémov, ako napríklad antigén-protilátkové, enzým-receptorové, ligand-receptorové interakcie na bunkách a biotín-avidínová väzba, z ktorých antigén-protilátková väzba je najčastejšie používaná. Nedávno bol navrhnutý spôsob väzbového páru haptén/anti-haptén (WO 91/01368).

Použitím týchto spôsobov na izolovanie špecifických buniek, určených na rozličné ďalšie skúšky, je potrebné obrátiť spojenie bez tvorby deštruktívnych vplyvov na väzbových partnerov, ktorí by ideálne mali znova získať svoje funkcie po návrate do svojich pôvodných podmienok. K tomu však nie v každom prípade dochádza, hoci je navrhnutý spôsob na primerané štiepenie antigén/anti-antigénnej a haptén/antihapténovej väzby (WO 91/15766, WO 91/01368).

Sú známe aj spôsoby, pri ktorých je jeden z väzbových partnerov pripojený na nerozpustný podklad, ako napríklad paramagnetické častice, pomocou ktorého sa vykonáva izolácia cieľových buniek zo zmiešanej populácie buniek, buď ako negatívna alebo ako pozitívna izolácia. V postupe negatívnej izolácie je možné nežiaduce bunky odstrániť z bunkového preparátu inkubáciou buniek protilátkou obalenými časticami špecifickými pre tieto nežiaduce bunky. Po inkubácii je možné odstrániť komplex pozostávajúci z bunky, protilátky a častice, ponechávajúci za sebou žiadané cieľové bunky. Tento výsledok je často nedostatočný, pretože žiadané bunky zostávajú v populácii buniek, viac alebo menej vyčistené a tiež preto, lebo zámerom izolačného postupuje skúšať a/alebo vykonávať ďalšie štúdie špecifických cieľových buniek. Pokusy boli vykonané s použitím častíc na pozitívnu izoláciu, pri ktorej žiadané cieľové bunky boli odstránené zo zmiešanej populácie buniek. Tieto postupy boli zamerané na určité cieľové bunky a nie sú vhodné pre všetky cieľové bunkové systémy. Nedávno bol navrhnutý pozitívny postup izolácie využívajúci haptén/antihapténový väzbový systém (WO 91/01368) a tiež spôsob na izolovanie hemapoietických buniek z kostnej drene (WO 91/09938. Druhý z uvedených spôsobov je zameraný na využitie kombinácie pozitívnej a negatívnej selekcie na účely izolovania a pripadne aj kultivovania špecifických buniek, t. j. hemapoietických buniek, v kostnej dreni a je závislý od odstránenia častíc.

WO 91/01368 sa týka spôsobu pripojenia cieľových buniek na nerozpustný podklad využitím schopností hapténových, antihapténových protilátok a antibunkových protilátok na vzájomnú väzbu, čím sa vytvorí spojenie medzi nerozpustným podkladom, t. j. časticou a cieľovou bunkou, pozostávajúci najmenej z hapténovej a antihapténovej protilátky alebo z kombinácie hapténových a antihapténových protilátok alebo zo sekundárnych protibunkových protilátok. Neskoršie štiepenie komplexu sa vykonáva jeho opätovným vystavením hapténu alebo hapténovej analógii. Takto vytvorené spojenie pozostáva vždy z hapténu navyše k jednému alebo viacerým prvkom. Spôsob je zameraný na špecifické cieľové bunky a je zameraný na izoláciu cieľových buniek a uvoľnenie nerozpustného základu.

Existuje potreba jednoduchej väzby na spojenie cieľovej bunky s nerozpustným podkladom, ktorý nevyžaduje zmes nešpecifických hapténových skupín a ktorý je zameraný na detekciu špecifických cieľových buniek pri minimálnom pridružení nešpecifických buniek a ktorý robí nepotrebným neskoršie štiepenie nerozpustného základu od špecifickej cieľovej bunky.

WO 92/04961 sa týka spôsobu a zložitej súpravy nástrojov na oddeľovanie buniek alebo rôznych molekúl od nemagnetického skúšobného média pomocou koloidných magnetických častíc. Pri tomto spôsobe sa používajú malé (submikrónové) častice, pretože je nutné sa vyhnúť zrážaniu častíc v roztoku. Tento spôsob vyžaduje zložitý oddeľovací systém, pri ktorom sa do skúšobného média ponára magnetický zosilňovací prostriedok. To môže mať nepriaznivý vplyv na bunky.

Podstata vynálezu

Cieľom tohto vynálezu je nájsť na diagnostické účely špecifické cieľové bunky v krvi alebo v kostnej dreni bez problému väzby na normálne bunky. Vynález predkladá citlivý spôsob detekcie rôznych typov buniek, takže veľké množstvo buniek môže byť zobrazené v mikroskope, pričom postup je rýchly a jednoduchý. Tento spôsob je možné ďalej použiť na izoláciu buniek pri biochemickom, biologickom a imunologickom vyšetrovaní a na štúdium špecifických génov na zárodkovej (nukleovej) alebo proteínovej hladine a navyše na kultiváciu buniek bez potreby štiepenia komplexu pozostávajúceho z bunky a častice. Ďalším cieľom vynálezu je poskytnúť súpravu nástrojov na vykonávanie spôsobu opísanom v patentových nárokoch.

Zámery vynálezu sú docielené spôsobom a súpravou nástrojov uvedených v priloženej definícii vynálezu.

Spôsob imunomagnetickej detekcie cieľových buniek v zmiešanej populácii buniek a vo fyziologických roztokoch obsahujúcich populácie buniek je vhodný na detekciu, ale je možné ho tiež použiť na pozitívnu izoláciu špecifických typov tak normálnych, ako aj patogénnych buniek. Tento spôsob vytvára väzbu medzi cieľovou bunkou a nerozpustným podkladom, ako napríklad paramagnetickými časticami, ktorý pozostáva z jedného alebo dvoch prvkov. Častica je buď obalená protibunkovou protilátkou myšacieho alebo ľudského pôvodu, zameraného na špecifické antigénne rozhodujúce činitele na membránach požadovaných cieľových buniek alebo sú častice obalené polyklonálnou protimyšacou alebo protiľudskou protilátkou schopnou väzby na Fc častice špecifickej protibunkovej protilátky zameranej na antigénne rozhodujúce činitele na membránach cieľových buniek. Namiesto použitia polyklonálnej protimyšacej/protiľudskej protilátky na obalenie častíc je možné použiť monoklonálne potkanie protimyšacie/protiľudské protilátky.

SK 281566 Β6

Táto na konci uvedená protilátka môže, vďaka svojmu monoklonálnemu pôvodu, čiastočne poskytnúť špecifickejšiu väzbu na protibunkovú protilátku a znížiť riziko možnej priečnej reakcie s inými bunkami v roztokoch, ako napríklad krvou. Ďalej, inkubácia bunky v suspenzii s miernym detergentom a/alebo druhou súpravou protilátok alebo fragmentov protilátok, vopred označená alebo neoznačená fluorescenčnými látkami, kovovými koloidmi, rádioizotopmi, biotínovými komplexmi alebo určitými enzýmami umožňujúcimi zviditeľnenie, zvýši špecifickosť tohto spôsobu.

Ďalej je predložený detailnejší opis spôsobu podľa vynálezu, uvádzajúci rakovinové bunky ako cieľové bunky na detekciu a možnú izoláciu. Tento spôsob nie je však obmedzený len na rakovinové bunky a opis nemá za cieľ obmedziť spôsob podľa vynálezu na túto zvláštnu oblasť, pretože tento spôsob je vhodný na celý rad oblastí cytologického výskumu.

Pri práci s rakovinovými pacientmi je určenie štádia choroby, z hľadiska či je rakovina lokalizovaná alebo či metastatické rozšírenie postihlo aj iné tkanivá, veľmi dôležité na voľbu terapeutických alternatív pre individuálnych pacientov. Zhubné bunky sa rozširujú priamym napadnutím okolitého tkaniva, lymfatickým systémom alebo rozdelením novotvarových buniek obsiahnutých v krvi do vzdialených orgánov vrátane kostnej drene a centrálneho nervového systému a mozgovomiechového moku.

Až donedávna detekcia metastatických novotvarových buniek závisela od morfologických spôsobov používajúcich svetlá a elektrónovú mikroskópiu na biopsne vzorky novotvarov alebo náter kostnej drene a prerifémej krvi, všetky pripravené na podložnom skle po cytocentrifugácii rôznych telových tekutín. Od objavenia monoklonálnych protilátok poznávajúcich antigény vytlačené najmä na povrch rôznych druhov zhubných buniek, identifikácia metastatických buniek v zvyšujúcej sa miere zahrnuje tiež imunocytochémiu a imunofluorescenciu. Podložné sklá, pripravené z biopsnych novotvarov alebo cytocentrifiigátov, boli teda upravené monoklonálnymi protilátkami a väzba týchto novotvarových buniek bola potom zviditeľnená kolorimetricky alebo fluorescenčné. Posledný spôsob vyžaduje použitie fluorescenčného mikroskopu, alebo alternatívne prípravu suspenzie buniek a použitie cytometrického prietokomeru.

Predchádzajúce spôsoby majú obmedzenú citlivosť a/alebo špecifickosť a sú zvyčajne prácne a časovo náročné a tiež vyžadujú vysoký stupeň odbornosti. Vyšetrenie prietokovou cytometriou taktiež vyžaduje nákladné zariadenie.

Morfologické spôsoby detekcie novotvarových buniek v krvi a v kostnej dreni sú oveľa menej citlivé než spôsoby používajúce imunocytochémiu a imunofluorescenciu (Beiske a ďalší, Am. J. Pathology 141 (3), september 1992). Aj posledné spôsoby sú však nedostatočné v prípadoch, keď novotvarové bunky predstavujú menej než 1 % z celkového počtu zárodkových buniek. Prietoková cytometria môže poskytnúť lepšiu citlivosť než spôsoby používajúce mikroskop, ale vyžaduje dostupnosť vysokého počtu buniek a tiež nesie zo sebou niektoré technické ťažkosti. Populácia buniek teda môže spôsobiť problémy a tento spôsob neposkytuje možnosť rozlišovania medzi značkovanými novotvarovými bunkami a nešpecifický fluoreskujúcimi normálnymi bunkami.

Vynález umožňuje veľmi citlivú detekciu napríklad metastatických novotvarových buniek, pretože vysoký počet buniek je možné ľahko zviditeľniť v mikroskope a pripojené magnetické guľôčky sú ľahko rozpoznateľné. Použité monoklonálne protilátky sa viažu dostatočne špecificky napríklad na novotvarové bunky a nie na iné bunky než sú cieľové bunky v zmiešanej bunkovej suspenzii, ako sú napríklad krv, kostná dreň a iné novotvarové úkazy, takže všetky bunky s pripojenými guľôčkami predstavujú cieľové bunky. Tento spôsob je navyše rýchly a jednoduchý a môže byť vykonávaný každým pracovníkom s prístupom k normálnemu mikroskopu.

Spôsob podľa vynálezu vyžaduje väzbu monoklonálnych protilátok, napríklad myšacieho alebo ľudského pôvodu, ktoré špecificky poznajú antigény prítomné na novotvarových bunkách a nie na normálnych bunkách, pri vyšetrovaní alebo na iné účely, na špecifické subpopulácie normálnych buniek a na paramagnetické častice, a to buď priamo alebo na guľôčky vopred pokryté protilátkami špecificky poznávajúcimi príslušné protilátky alebo Fc časti IgG protilátok, ktoré sa viažu na novotvarové bunky. Bunky viažuce protilátky môžu byť typu IgG alebo IgM alebo ab fragment IgG alebo IgM. Príklady používaných proticieľových bunkových protilátok môžu byť tie, ktoré sú namierené proti skupinám antigénnych rozhodujúcich činiteľov, ako sú napríklad CD56/NCAM antigén (MOC-1), populácia 2 epiteliálnych (výstelkových) antigénov (MOC-31), populácia 2 (MW 40 kD) antigénov (NrLulO) (Myklebust a ďalší, Br. J. Cancer Suppl. 63, 49 až 53, 1991), HMWmelanómu pridružený antigén (9.2, 27) (Morgan a ďalší, Hybridoma, 1, 27 až 36,1981), 80 kD, sarkómu pridružený antigén (TP1 a TP3) (Cancer a ďalší, Breast Cancer Res. Trestm., 1991) alebo EGF receptorový antigén (425.3) (Merck), navyše k antipanľudským protilátkam (Bruland a ďalší, nepublikované), ktoré sú vhodné na detekciu ľudských buniek medzi zvieracími bunkami. Protilátka 425.3 je zameraná na antigény tak v normálnych, ako aj v zhubných bunkách. Protilátky môžu byť ďalej zamerané proti receptorom rastového faktora, ako je napríklad receptor EGF, receptor PDGF (A a B), receptor inzulínu, receptor inzulínu podobných látok, receptor transferínu, receptory NGF a FGF, skupiny integrínov, iné molekuly s adhéznymi membránami a MDR proteíny, tak v normálnych bunkách, ako aj v abnormálnych bunkách a antigény prítomné na subpopuláciách normálnych buniek, navyše k onkogénnym produktom, expresovaným na membránach normálnych a zhubných buniek a len na zhubných bunkách, ako napríklad Neu/erb B2/HER2. Čo sa týka zhubných buniek, tieto môžu byť prsné, vaječníkové a prsné rakovinové bunky, melanóm, sarkóm, glioblastóm, rakovinové bunky tráviaceho systému a retikuloendoteliálneho systému alebo cieľové bunky môžu byť spojené s nie-neoplastickými chorobami, ako sú kardiovaskulárne, neurologické, pľúcne, autoimúnne, tráviace, močovopohlavné, retikoluendoteliálne a iné poruchy. Ďalej sa môžu zhubné populácie buniek nachádzať v kostnej dreni, periférnej krvi, môžu mať pôvod v pleurálnych a pobrušnicových efuziách a iných telesných tekutinách, ako napríklad moč, mozkovomiechový mok, semeno, lymfatické cievy, alebo z tuhých novotvarov v normálnych tkanivách a orgánoch, ako napríklad pečeň, lymfatické uzliny, slezina, pľúca, slinivka brušná, kostná dreň, centrálny nervový systém, predstojná žľaza, koža a hlienové membrány. Ucelenejší zoznam antigénnych rozhodujúcich činiteľov a zodpovedajúcich protilátok alebo protilátkových fragmentov protilátok používaných v spojitosti s týmto zlepšeným spôsobom podľa vynálezu je predložený v tabuľke č. 1. Spôsob podľa vynálezu pozostáva z pripojení protilátok priamo na paramagnetické častice alebo sa pripojenie môže uskutočniť pripojením na povrchovo viazané protilátky, ako napríklad polyklonálne protimyšacie protilátky, monoklonálne potkanie protimyšacie protilátky alebo monoklonálne protiľudské protilátky, špecificky rozoznávajúce Fc časť jednotlivých uvedených protilátok.

SK 281566 Β6

Protilátkami obalené paramagnetické guľôčky sú potom zmiešané so suspenziou vyšetrovaných buniek a inkubované počas od 5 až 10 minút do 2 hodín, prednostne 30 minút, pri teplote 0 až 25 °C, prednostne pri 4 °C, za mierneho otáčania. Spôsob podľa vynálezu môže byť prevádzkovaný s pozmeneným poradím krokov, pri ktorom sa voľné protilátkové cieľové bunky pridajú do suspenzie buniek, inkubujú sa počas od 5 až 10 minút do 2 hodín, výhodne 30 minút, pri teplote 0 °C až 20 °C, výhodne 4 °C, za mierneho otáčania. Potom sa do buniek, inkubovaných ako je uvedené, pridajú paramagnetické častice, vopred obalené protimyšacími alebo protiľudskými protilátkami a výsledná suspenzia sa podrobí ďalšej inkubácii počas od 5 až 10 minút do 2 hodin, výhodne 30 minút, pri teplote 0 až 20 °C, výhodne 4 °C, za mierneho miešania. Vzorky bunkovej suspenzie sa potom prenesú do zariadenia na počítanie buniek a frakcie buniek s pripojenými guľôčkami, v pomere k celkovému počtu buniek sa určia pomocou svetelnej mikroskopie. Počet protilátkou obalených guľôčok pridávaných do bunkovej suspenzie by sa mal rovnať 0,5 až 10-násobku počtu cieľových buniek. Ak toto číslo nie je známe, potom počet pridávaných a protilátkou obalených guľôčok by sa mal rovnať 1 až 10 % celkového počtu buniek.

Na špecifické účely a v prípadoch s nízkou hustotu cieľových buniek, ako napríklad zhubných buniek, alebo keď cieľové bunky predstavujú veľmi nízku časť celkového počtu buniek (á 1 %), je možné cieľové bunky pozitívne oddeliť v magnetickom poli od necieľových. Izolované cieľové bunky potom môžu byť mikroskopicky sčítané a frakcie cieľových buniek v pomere k celkovému počtu buniek v pôvodnej suspenzii buniek môžu byť potom vypočítané. Okrem toho je možné cieľové bunky charakterizovať podľa prítomnosti špecifických biochemických a biologických vlastností. Zvlášť dôležité bude použitie takýchto buniek pri štúdiách v oblasti molekulárnej biológie. Na rozdiel od uvedených spôsobov, citovaných v rámci známej techniky, spôsob podľa vynálezu umožňuje štúdium a rast cieľových buniek bez vykonania štiepenia väzby paramagnetickou časticou a cieľovou bunkou. Na niekoľko účelov je zaujímavé skúmať špecifické gény v čistej populácii cieľových buniek na DNA, mRNA a proteínovej hladine, tak pri biopsii novotvarov, ako aj v novotvarových bunkách prítomných v krvi, kostnej dreni a iných telesných tekutinách, ako je napríklad moč, mozgovomiechový mok, semeno, lymfatický systém alebo z inak normálnych tkanív a orgánov, ako je napríklad pečeň, lymfatické uzliny, slezina, pľúca, slinivka brušná, kostná dreň, centrálny nervový systém, predstojná žľaza, koža a hlienové membrány a v iných oblastiach činnosti v rámci cytologického výskumu.

V známom spôsobe techniky predstavujú v biopsii signály z južných, severných a západných škvŕn normálne bunky, ako aj zhubné bunky. Ak sa pripraví najskôr jednobunková suspenzia zo zhubného materiálu a zhubné bunky sú potom imunomagneticky pozitívne zistené a oddelené, akékoľvek štúdie génov uskutočnené na tomto materiáli by preto predstavovali len cieľové bunky. To sa takisto vzťahuje napríklad na zhubné bunky prítomné v prsných tkanivách, napríklad v kostnej dreni, periférnej krvi, pleurálnej a pobrušnicovej efúzii a na iné telové tekutiny, napríklad moč, mozgovomiechový mok, semeno a lymfatický systém. Štúdie týkajúce sa postupu polymerizačnej reťazovej reakcie (PCR) tiež získajú na špecifickosti a spoľahlivosti, ak sú vykonávané na populáciách čisto zhubných buniek, získaných spôsobom podľa vynálezu.

Použitie krokov spôsobu podľa vynálezu sa môže líšiť v závislosti od typu vyšetrovaného tkaniva.

a) Tkanivo z tuhej alebo ihlovej biopsie novotvaru sa pripraví mechanicky alebo pomocou enzýmového ošetrenia na jednobunkovej suspenzii, do ktorej sa potom pridajú primáme špecifické protilátky alebo fragmenty protilátok, buď priamo alebo po umytí suspenzie buniek fosfátom tlmeným soľným alebo kultúrnym médiom so alebo bez séra, ako napríklad teľacím plodovým sérom, hovädzím, konským, prasačím, kozím alebo ľudským sérom.

b) Ak je materiál vzorka pleurálnej alebo ascitickej efúzie, mozgovomiechový mok, moč, lymfatická alebo telová tekutina, ako napríklad efiizia z pacientových kĺbov s rôznymi formami zápalov kĺbov, špecifické protilátky alebo fragmenty protilátok sa buď pridajú do vzoriek priamo alebo po odstredení s umývaním alebo bez umývania pred odstredením alebo po odstredení ku dnu a navráteniu do suspenzie.

c) Ak materiál pozostáva z odsatej krvi alebo kostnej drene, frakcia jednozárodkovej bunky sa izoluje spádovým odstredením na napríklad lymfatický preparát pred umytím, opätovnou suspenziou a pridaním príslušných protilátok alebo fragmentov protilátky.

Podmienky postupu pre a) a b) sú potvrdené, ako je doložené výsledkami, docielenými úspešnými pokusmi opísanými.

Pre c) sa ukázalo, že výsledky boli ovplyvnené vysokým počtom faktorov, ktoré boli detailne preskúmané. Medzi nich patrí koncentrácia protilátok, pomer počtu paramagnetických častíc k počtu buniek, inkubačná doba a objem, typ inkubačného média a hladina pH. Pomer častíc k jednozárodkovej bunke pri všetkých pokusoch by mal byť v rozsahu 0,5/1 až 2/1, v závislosti od väzbovej príťažlivosti primárnych špecifických protilátok alebo fragmentov.

Veľkým problémom bolo nešpecifické pripojenie častíc, obalených ovčími alebo potkaními protimyšacimi protilátkami samostatne alebo navyše špecifickými protilátkami, na bunky normálnej krvi ďebo kostnej drene. Pokusy ukázali, že nešpecifická väzba je rovnako vysoká bez prítomnosti špecifických protilátok, čo naznačuje, že problém nie je spôsobený priečnou reaktivitou cieľových protilátok na normálne bunky. Možnosť, že menšia než optimálna špecifickosť by mohla byť spôsobená iónovou väzbou, bola vylúčená. Iná možnosť bola, že subpopulácie normálnych buniek B-rodu by mohli priľnúť ku komplexom pozostávajúcim z častice a protilátky. Ale imunomagnetické odstránenie B-buniek zo suspenzie buniek pred pridaním špecifických protilátok alebo komplexov pozostávajúcich z protilátky a častice, nezlepšilo špecifickosť naposledy uvedeného.

Problém pri postupe použitom na izoláciu jednozárodkových frakcii kostnej drene a periférnej krvi, spočívajúci v tom, že niektoré necieľové bunky by tiež mohli viazať paramagnetické častice bol obídený alebo prekonaný. Tak pri časticiach obalených ovčou protimyšacou protilátkou samostatne alebo so špecifickými protilátkami bol počet častíc nešpecifický pripojených na malú frakciu jednozárodkových krvných buniek alebo buniek kostnej drene znížený z priemeru asi 10 na 1 a paralelne s tým sa frakcia normálnych buniek s časticami znížila z 1 až 2 % na 0,5 až 1 % alebo menej.

Dôkaz bol získaný o tom, že problém mohol byť spôsobený hydrofóbnymi silami spojenými s protilátkami viazanými na paramagnetické častice. Spôsob zníženia tejto hydrofóbnosti je teda nárokovaný. Jeden takýto spôsob spočíva v predinkubácii protilátkami obalených častíc a suspenzii buniek pomocou slabých detergentov s vhodnou koncentráciou, napríklad Tween 20 (TM) v koncentráciách nižších než 0,1 % počas 30 minút pri teplote 4 °C. Ak je o

SK 281566 Β6 podstatnená možná selekcia cieľových buniek, suspenzia buniek by mala obsahovať nízku koncentráciu detergenta, napríklad 0,01 % Tween 20 (TM). V niekoľkých pokusoch tento postup skoro vylúčil alebo dramaticky znížil problém nešpecifickej väzby známej pri jednozárodkových bunkových frakciách z krvi alebo z kostnej drene.

Nasledujúce ďalšie zlepšenia, pokiaľ budú opodstatnené, použiteľné v spojení s detergentným krokom sú tieto:

Po inkubácii bunkovej suspenzie primárnymi protilátkami alebo fragmentmi protilátky a paramagnetickými časticami obalenými protilátkami, ako je opísané, sa suspenzia buniek inkubuje druhou súpravou protilátok alebo fragmenty protilátky zamerané proti iným mimobunkovým alebo vnútrobunkovým rozhodujúcim činiteľom cieľových buniek s alebo bez predchádzajúceho ošetrenia bunkovými fixatívami, ako sú napríklad formaldehyd alebo alkoholy. Tieto protilátky alebo ich fragmenty by sa mali vopred označiť fluoreskujúcimi látkami, kovovými koloidnú, rádioizotopmi, komplexmi biotínov alebo enzýmov, ako sú peroxidáza a alkanická fosfatáza, umožňujúca zviditeľnenie samotné známymi spôsobmi v mikroskope a/alebo vhodným počítacím zariadením.

Cieľové bunky budú nielen zviditeľnené pomocou naposledy uvedeného spôsobu, pričom budú mať na svojom povrchu pripojené častice, ale aj spočítané.

Na zjednodušenie rozlíšenia medzi necieľovými a cieľovými bunkami je možné suspenziu buniek pred druhými zviditeľňujúcim krokom buď podrobiť cytospinovému odstredenú] alebo pripojiť časti suspenzie na obalené podložné sklá, na ktorých sa bunky pripojené na častice rozptýlia v tenkej vrstve, čo uľahčí zisťovanie dvojnásobne „sfarbenej“ bunky.

Na použitie nového spôsobu bude súprava nástrojov obsahovať napríklad vopred obalené paramagnetické častice, pripravené na každú monoklonálnu protilátku. V inom uskutočnení bude súprava nástrojov na jednej strane obsahovať paramagnetické častice vopred obalené IgG izotypom špecifickej protimyšacej alebo protiľudskej protilátky a na druhej strane iné cieľové bunky, napríklad novotvarové bunky, pridružujúce protilátky. V treťom uskutočnení, súprava nástrojov bude obsahovať paramagnetické častice vopred obalené špecifickými proti-Fc protilátkami, ako napríklad polyklonálne protimyšacie alebo monoklonálne potkanie protimyšacie alebo protimyšacie alebo protiľudské protilátky schopné väzby na Fc časť cieľových buniek, pridružujúcich protilátky, viazané na špecifické protilátky proticieľových buniek. V ďalšom uskutočnení súprava nástrojov bude obsahovať iné špecifické protilátky alebo fragmenty protilátok zameraných proti antigénom/receptorom vnútri alebo na žiadaných cieľových bunkách, kde tieto protilátky alebo fragmenty protilátok sú konjugované s peroxidázou, alkalickou fosfatázou alebo s inými enzýmami spoločne s príslušnými substrátmi k takýmto enzýmom alebo kde uvedené protilátky alebo fragmenty protilátok sú viazané na neparamagnetické častice so špecifickými farbami alebo s viazanými enzýmami, ako je napríklad peroxidáza alebo alkalická fosfatáza.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Spôsob podľa vynálezu bude v ďalšom ilustrovaný modelovými pokusmi, príkladmi úžitkovosti nového spôsobu podľa vynálezu a príkladmi praktického použitia. Tieto príklady nebudú považované za akýmkoľvek spôsobom obmedzujúce vynález.

1. Viazanie komplexov pozostávajúcich z protilátky a guľôčky na odrody novotvarových buniek podľa nového postupu:

Na zistenie koncentrácie protilátok a optimálnych podmienok na viazanie komplexov pozostávajúcich z protilátky a paramagnetickej častice na novotvarové bunky bola použitá široká škála novotvarových buniek Tieto paramagnetické guľôčky boli naviazané na bunky buď obalením ovčou protimyšacou (sheep-anti-mouse = SAM) protilátkou paramagnetickej častice vopred obalenej špecifickou protilátkou alebo predtým inkubovanim buniek špecifickými protilátkami a umývaním nasledovaným druhou inkubáciou SAM obalených častíc. Výsledky týchto postupov sú uvedené v tabuľkách 2a a 2b, v ktorých + znamená väzbu niekoľkých guľôčok na všetky bunky, (+) znamená buď nižší počet guľôčok viazaných na každú bunku, alebo že nie všetky novotvarové bunky mali guľôčky pripojené na svojom povrchu, zatiaľ čo - znamená, že k žiadnej väzbe nedošlo a (-) znamená veľmi slabú väzbu.

2. Na detekciu novotvarových buniek v jednozárodkovej frakcii kostnej drene alebo periférnej krvi boli vykonané pokusy, pri ktorých špecifické protilátky a SAM-om obalené paramagnetické častice boli pridané buď k takýmto jednozárodkovým bunkám alebo k suspenzii buniek, kde rôzne počty v skúmavke pestovaných typov novotvarových buniek boli pridané k uvedeným jednozárodkovým bunkámi V niektorých z týchto pokusov boli jednozárodkové bunky alebo zhubné bunky vopred sfarbené pomocou fluorescentného farbiva na umožnenie rozlíšenia medzi dvoma typmi buniek. Vo všetkých pokusoch boli neväzbové primáme látky a/alebo guľôčky obalené ovčou protimyšacou protilátkou na kontrolu použité oddelene.

Tabuľka 2a

Protilátky	Bunková líni·
	MCP-7	SlCMÍ	T47D	HDA231	MDälJJ

KrUlO I\|C2b		¥	♦	(0	ω
ffiéJT ϊίΤ	♦	♦	♦	lO	10	*
čfocl I\|C1			M
TO—ítcl—		♦	♦
¢3	+	♦	*			+
3Ä5 ΪΪΠ		tú	*
IÍH			(J
ΤΞ φ5Γ	-	-	-				-
CCl Σ1Μ			-				í*>
CU18 ItCl		-
aS5 Mi^-	(*)	-	-
-gll I*C1 ,	-	-
D? I«C3			£ii
ItCl?		*	4			(-)
425 3			*
9.2.27							+	*
Mučia		-				-	-	-
2al2 ItCl							₊
4b7 IjGl							4
ÉM2 (-2F11)
BM7 {-7HJ)
TP-3

CEA
GIľTES ItG
3C9 1<M
Ίδ3
5Γ* IjM
3F1 IgCl

Tabuľka 2b

Protilátky	Bunkové línie
		PH1	MA-11	CRL1435	CRL1740	H-U6	)olo205	766-0	•’IDR

NrLulô		4.	+	4		4	4
MocJl	ItGl	4.	₊	4	♦	+-	4	4	4
Noci	učí					4	-
Τ5ηϊ2	ItGl	4	+			-	-	-
2E11	ltŽ3—	Trt—	4-	-	4	-	-	-
ôAb	Itäi		4·
5F2	IgM
XX3	ijux.					-		-
čči	IgM					(4)		-
ΠΠ3—	IgGl							-
ura—								-
7ΗΓ	IgGl	(+i	+	-			-		-
IĎ'	I$G3								-
ΈΠΡ—			4	4	4		-		-
425-3
9.2.27
rt-Cid
2412						-		-
ib)	Isčl					-		-
	+	4
es» (-ľFm—	+
TP-3
Im
CEA
ČINT»	τπ—					4
3C9	ItM								-
HH3
	ItH
3F1	ItGl		1		-

V niekoľkých pokusoch bola spozorovaná určitá nešpecifická väzba na jednozárodkové bunky, pri ktorej bolo zistené, že nemá žiadny vzťah k charakteru špecifickej protilátky a ktorá bola rovnako výrazná pri samotných SAM-obalených protilátok. Veľkosť tejto nešpecifickej väzby kolísala takmer od nuly do hladiny medzi 0,5 až 2 %. Táto nešpecifická väzba bola takmer odstránená miernym ošetrením detergentom (Tween 20), vykonaným na zníženie problému hydrofóbnej bunkovej interakcie.

Príklady použitia spôsobu podľa vynálezu

1. Detekcia mikrometastatickej neoplastickej choroby krvi a lymfatického systému.

Včasná a spoľahlivá diagnóza rozšírenia rakovinových buniek do krvi a/alebo do lymfatického systému je stále dôležitejšia kvôli voľbe optimálnej liečby, možno uzdravujúcej pri mnohých typoch rakoviny vrátane karcinómov, ako bude opísané v aplikácii príkladu 1. Podobné postupy boli overené alebo sú vo vývoji na zhubný melanóm, sarkóm, neuroblastóm a niekoľko ďalších druhov rakoviny.

2. Detekcia zhubných buniek v pleurálnych alebo v ascitických efúziach a v moči

Charakter týchto efúzií môže predstavovať dôležitý diagnostický problém zvlášť v prípadoch, keď je prítomný nízky počet rakovinových buniek spolu s normálnymi reaktívnymi alebo epiteliálnymi bunkami. V niekoľkých prípadoch bola urobená rýchla definitívna diagnóza pomocou spôsobu podľa vynálezu v prípadoch, keď normálna cytologická skúška bola negatívna alebo neurčitá. K podobnej výhode dochádza v prípadoch rakoviny ľadvín alebo močového traktu a mechúra.

3. Detekcia neoplastických buniek v mozgovomiechovom moku

Spolu s tým, ako sa zlepšovala systematická liečba mnohých druhov rakoviny sa zvýšil podstatne aj počet prípadov ukazujúcich na symptóm mozgovej metastázy a paralelne s tým aj potreba včasnej detekcie takéhoto rozšírenia. Použitím spôsobu podľa vynálezu je možné identifikovať aj nízky počet zhubných buniek, čo umožňuje zákrok liečebnými alternatívami v rannom štádiu prejavu vnútrolebkového novotvaru.

4. Diagnóza rakoviny v biopsnom tkanive

V prípade podozrenia na rakovinu, získanie tkaniva na mikroskopické vyšetrenie chirurgickými postupmi alebo napríklad punkčnou biopsnou ihlou, je možné spôsobom podľa vynálezu urobiť oveľa jednoduchšiu a rýchlejšiu diagnózu aplikovanú na pripravenú suspenziu buniek, oproti zvyčajnému morfologickému alebo imunohistochemickému alebo cytochemickému postupu. Rozlíšenie medzi niekoľkými alternatívnymi rakovinami je možné urobiť pomocou príslušných protilátok.

5. Identifikácia prognostických ukazovateľov

Pretože expresia niektorých membránových molekúl sa ukázala byť vo vzťahu k postupu zhubnej choroby niekoľkých druhov rakoviny, je možné použiť spôsob podľa vynálezu na identifikáciu prognostických ukazovateľov, napríklad, ako je opísané v aplikácii príkladu 2.

6. Identifikácia buniek príznačných na špecifické choroby alebo na postup alebo na stav choroby

Pri rôznych druhoch reumatických chorôb (ako napríklad pri reumatickej artritídy), ako aj pri alergických, autoimunitných a kardiovaskulárnych chorobách je na diagnózu a určité štádiá choroby dôležitá identifikácia systematickej alebo miestnej prítomnosti špecifických subpopulácií buniek. Rýchla detekcia takýchto populácií buniek pomocou spôsobu podľa vynálezu má preto značný diagnostický a liečebný význam.

7. Detekcia subpopulácií normálnych buniek

Na niekoľko účelov je dôležité detegovať frakcie určitej subpopulácie normálnych buniek v populácii. To sa týka napríklad pečeňovej biopsie, kde môže identifikácia buniek vyjadrujúcich žlčový epiteliálny antigén, hrať dôležitú úlohu. Podobne môže byť opodstatnená identifikácia a možná izolácia špecifických endoteliálnych buniek zo suspenzie buniek pripravenej z rôznych normálnych tkanív. Niektoré z membránových buniek uvedených v bodoch 1 až 6 môžu byť použité ako ciele v imunoterapii spolu s niekoľkými druhmi aktivovaných ničivých buniek alebo napríklad s imunotoxínmi. Identifikácia expresie takýchto molekúl spôsobom podľa vynálezu je preto tiež dôležitá na stanovenia, v ktorých by sa mali použiť takéto typy liečby.

Príklady praktickej aplikácie spôsobu podľa vynálezu

Príklad 1

Na diagnózu šírenia rakovinových buniek v krvi alebo v kostnej dreni v rannom štádiu sme pomocou spôsobu podľa vynálezu použili protirakovinové protilátky MOC31, NrLulO, BM2, BM7, 12H12 a MLuCl na určenie, či je možné alebo nie je možné citlivo identifikovať mikrometastatickú chorobu rakoviny prsníkov, pľúc, konečníkového traktu a predstojnej žľazy z telesných tekutín. Úspešné výsledky s týmito protilátkami majú dôležité klinické dôsledky.

Príklad 2

Expresia niekoľkých membránových molekúl buniek sa ukázala byť vo vzájomnom vzťahu s postupom zhubnej choroby niekoľkých typov rakoviny. Detekciu väzby týchto protilátok na príslušné protilátky je možné preto použiť na získanie informácie o vysokej prognostickej hodnote. Medzi takýmito antigénmi je vysoký počet adhéznych molekúl, sacharidových antigénov, glykolipidov, receptorov rastového faktora a indikátorov rakoviny uvedených. Pomocou spôsobu podľa vynálezu sme identifikovali väzbu komplexov pozostávajúcich z častice a protilátky na varianty CD44, E kadherín, Le^Y, CEA, EGF-r, receptor transferínu, epitop MUC-1, epitop LUBCRU-G7, antigénu ra

SK 281566 Β6 koviny prcdstojncj žľazy, epitop UJ13A, mikroglobulin D₂, antigény HLA a receptor apoptózy.

Príklad 3

Od pacienta s predpokladaným ochorením zhubným melanómom boli získané 2 litre pleurálnej difúzie. Po odstredení boli bunky suspendované v objeme 2 ml RPMI s 10 % teľacieho plodového séra inkubovaného s 9.2.27 antimelanómovou protilátkou (10 pg/ml) pri teplote 4 °C počas 30 minút, umyté a opäť inkubované pomocou dynaguľôčok (TM) SÁM M450/IgG2A pri teplote 4 °C počas 30 minút. Suspenzia buniek bola potom skúmaná pod mikroskopom na určenie frakcie buniek s paramagnetickými časticami pripojenými k ich povrchu. Diagnóza zhubného melanómu bola potvrdená, pretože asi 10 % buniek malo podstatný počet rozetových častíc.

Príklad 4

Biopsné tkanivo bolo získané z podkožného nádoru prípadu s klinickou indikáciou buď malej pľúcnej rakoviny alebo zhubného melanómu. Z biopsie bola pripravená jednobunková suspenzia a táto bola rozdelená na 2 frakcie, z ktorých jedna bola inkubovaná antimelanómovou protilátkou 9.2.27 a druhá antikarcinogénnou protilátkou MOC-31 (obe pri 10 pg/ml). Inkubácia bola podobná tej, ktorá bola použitá v uvedenom príklade. Žiadna z buniek inkubovaných melanómovou protilátkou neviazala guľôčky, zatiaľ čo všetky novotvarové bunky inkubované s MOC-31 boli pozitívne.

Príklad 5

Biopsné tkanivo odobrané pacientovi s podozrením na zhubný melanóm, bolo skúmané prípravou jednobunkovej suspenzie, inkubáciou antimelanómovou protilátkou 9.2.27 a ďalej podľa uvedeného postupu. Väčšina buniek bola pozitívna s vysokým počtom časticových roziet pripojených k ich membránam.

Príklad 6

Bola študovaná pleurálna efuzia pacienta s rakovinou prsníka na zistenie, či je možné v tekutine zistiť novotvarové bunky. Liter kvapaliny bol odstredený, bunky znova suspendované a inkubované v oddelených fľaštičkách, každá obsahujúca jeden z 3 odlišných protirakovinových protilátok (MOC-31, 2E11, 12H12). Po skončení postupu rovnakým spôsobom, ako bolo opísané, bolo zistené, že väčšina buniek sa vo všetkých 3 prípadoch naviazala na častice obalené protilátkou.

Príklad 7

Kostná dreň pacienta s rakovinou prsníka bola skúmaná na zistenie prítomnosti mikrometastatických novotvarových buniek. Po príprave jednozárodkových buniek boli tieto inkubované rovnakými tromi antikarcinogénnymi protilátkami použitými v uvedenom príklade, ale v tomto prípade protilátky boli najskôr pripojené na paramagnetické častice-dynaguľôčky (TM) SAM IgG. Po prvej inkubácii týmito priamo obalenými časticami bola suspenzia buniek skúmaná mikroskopicky, pričom bolo zistené, že vysoký počet buniek je pozitívny a má na svojej membráne pripojený celý rad časticových roziet.

Podobné pokusy boli vykonaná s radom pleurálnych alebo ascitických efúzií a kostných drení pacientov s rakovinou prsníka.

Príklade

Ľudské prsné rakovinové bunky T47D boli inkubované po rôzne doby fluorescenčným farbivom Hoechst a bola kontrolovaná životaschopnosť označených buniek. Rôzne počty označených prsných rakovinových buniek boli potom pridané do 1 x 10® buniek kostnej drene získanej zo zdravých dobrovoľníkov. Pri rôznych pokusoch boli pridané rôzne koncentrácie paramagnetických monodisperzných častíc (dynaguľôčky (TM) P450) obalené individuálnymi protirakovinovými protilátkami (NrLulO, MOC31 alebo 12H12). Po inkubácii na ľade, trvajúcej 30 minút, boli vzorky z jednotlivých skúmaviek skúmané v počítacej komore svetelnou a fluorescenčnou mikroskópiou. Keď bol pomer novotvarových buniek k celkovému počtu buniek s vytvoreným zárodkom nízky, suspenzia buniek bola vystavená magnetickému poľu a bunky s pripojenými časticami boli izolované pred ich mikroskopickým skúmaním. Bolo zistené, že optimálny pomer bol 1 až 10 paramagnetických guľôčok na novotvarovú bunku a že všetky novotvarové bunky mali 2 až 15 guľôčok pripevnených na svojom povrchu. Citlivosť detekčnej metódy bola blízko jednej cieľovej bunky na 10⁴ buniek s vytvoreným zárodkom.

Pri kontrolných pokusoch s označenými novotvarovými bunkami sa použitím protilátok, o ktorých sa vie, že majú krížovú reaktivitu s normálnymi bunkami, táto priečna reaktivita sa potvrdila s paramagnetickými časticami obalenými protilátkou. Pri pokusoch s guľôčkou bez obalu protilátok pridružených k novotvarom, sa nenaviazali žiadne cieľové bunky na žiadne guľôčky.

Podobné pokusy boli vykonané tak s inými druhmi prsnej rakoviny a radom rakovinových buniek malobunkových pľúcnych rakovín. Pri týchto pokusoch bola docielená podobná citlivosť a špecifickosť.

Príklad 9 rPleurálna a ascitická tekutina získaná od pacientov ,;s prsnou rakovinou vaječníkov bola odstredená, boli pridané rovnaké obalené paramagnetické častice ako v príklade 1, materiál bol potom inkubovaný a sústredený v magnetickom poli pred suspendovaním a skúmaním svetelnou mikroskópiou. Typicky mali bunky s jasne morfologickými vlastnosťami novotvarových buniek na sebe naviazané guľôčky, zatiaľ čo žiadne z malého počtu normálnych buniek na seba nenaviazali guľôčky obalené protilátkou. V dvoch prípadoch pleurálnej eíuzie nemalo individuálne morfologické vyšetrenie prítomnosť žiadnej novotvarovej bunky, zatiaľ čo význačný počet zhubných buniek bol detegovaný použitím protilátkou obalených guľôčok. V niektorých prípadoch boli novotvarové bunky oddelené v magnetickom poli a prenesené do kultivačných baniek, obsahujúcich rastové médium, špeciálne pripravené na rast buniek prsnej rakoviny, pokusne založiť permanentné odrody buniek z týchto kultúr. Paralelne s tým boli bunky zo zhubných efuzií kultivované priamo bez pozitívnej selekcie pomocou magnetických guľôčok. V príkladoch, naposledy uvedených, nebolo možné založiť žiadne odrody buniek, zatiaľ čo vo viac než 50 % prípadoch, v ktorých boli použité pozitívne vybrané novotvarové bunky, boli odrody úspešne založené.

Príklad 10

V niektorých prípadoch bola kostná dreň a periférna krv, získané od pacientov s rakovinou prsníka, skúmané spôsobom podľa vynálezu, a to pridaním paramagnetických guľôčok obalených protilátkou, inkubovaním počas 30 minút pri teplote 4 °C, koncentráciou v magnetickom poli a skúmaním suspenzie pomocou svetelnej mikroskopie. V o7 boch prípadoch väzba paramagnetických guľôčok na novotvarové bunky, predstavujúce 0,1 až 1 % buniek s vytvoreným zárodkom v kostnej dreni a v krvi, bola takto detegovaná; tieto bunky neboli identifikované žiadnym iným spôsobom.

Príklad 11

Protilátky proti určitým receptorom rastového faktora alebo iným génovým produktom expresovaným na povrchu populácie špecifických buniek môžu byť použité na identifikáciu a prípadne aj na výber týchto buniek. Pri guľôčkách obalených antitransferínovými receptorovými protilátkami a použitých v spôsobe podľa vynálezu, bolo dokázané, že predstavujú rýchly, jednoduchý a citlivý spôsob identifikácie buniek vyjadrujúcich tranferínový receptor.

Receptor Taronbospondín (CD36) VLA-2

Receptor laminínu

NHK-1 epitop

Sacharidové antigény

T-antigén

Tn-antigén

Sialyl Tn

Antigén pridružený k rakovine tráviaceho traktu (M.200kD) Antigén pridružený k rakovine Le^Yíi-U^x. trl-Le*

Bpitop Dineric Le^x

H-typ 2

Epitop CA15-3

CEA

Calbiochem 580664

BH 1441 264

A1.43

HNK-1

Príklad 12

Na rôzne účely je opodstatnená izolácia populácie normálnych buniek. Endoteliálne bunky obaľujúce kapiláry alebo malé cievy v normálnom alebo novotvarom tkanive by mohli byť pozitívne vybrané zo suspenzie buniek pripravených príslušných tkanív. Tento postup vyžaduje použitie guľôčok obalených protilátkami zameranými proti štruktúram expresovaným na endoteliálnych bunkách, ale nie na ostatných normálnych bunkách v zmesi buniek.

Príklad 13

Prítomnosť ľudských buniek injikovaných do imunodeficitných hlodavcov bola dokázaná v suspenziách buniek pripravených z novotvarových xenoimplantátov a z rôznych hostiteľských orgánov alebo tkanív použitím magnetických častíc obalených protiľudskou protilátkou.

Tabuľka 1

Zoznam príslušných antigénov a príklady pridružených protilátok viažucich antigén

ANTIGÉNY MONOKLONÁLNE

PROTILÁTKY

Galbl-4Gl_ĽNac (nL4,6,8)

H-II

A typ 3

Lacto-N-fucopentanózu III (CD15)

Glvkolipidv

GDj gd₂

Ob₃ gm₃ gm₂

FucGM₁

Receotorv rastového faktora

Receptor EGF c-erbB-2 (HER2)

Receptor PDCF.

Receptor PDGFP

Receptor transferinu

Receptor NGF

Receptor IL-2 (CD2S)

Sada c (c-kit)

Receptor TNF

Receptor NGF

HH8, HT-8

TKH6. BaGs2

TKH-2

CA 19-9

C-50

MLuCl, BR96, BR64

B3

NCC-ST-421

Bl

CA15-3

1-9, 1-14, 1-27, 11-10,

1-46, Calbiochem 250729

IB2

BE2

HH8

PM-81

ME 36.1, R2A

ME 36.1. 3F8, 14.18

3B-13

M2590

MKI-B, MKI-16

107. F12

425.3, 2.E9. 225

BM 1378 988. 800 E6

Genzýw 1264-00

Sigma P 7679

OKT 9. D 65,30

BM 1198 637

BM 1295 802,

BM 1361 937

BM 428 616, 14 A3

109.3D6

Genzým 1995-01, PAL-M1

Adhézne Molekuly

Receptor

Integrin .3β1 Receptor Victronectin(.τβ3 Integrin .2

Integrin .3

Integrin .4

Integrin .5 Integrin .V Integrin . β2 Integrin . β4 ΟρΙΙβΙΙΙ.

ICAM-l (CD54)

VCAM-1

ELAM-1

E-selektín

P-selektin/GMP-140

CD44

CD44-varianty N-CAM (CD56) H-C AM

I.-CAM

N-CAM

MACAM-L

E-cadherín

P-cadherín

Tenascín fíbroncktinu(.501 integrin) integrin)

Pierce 36114, BTC 21/22 Calbiochem 341649 M-Kiol 2

TP36.1, BTC 41/42 Calbiochem 407277 Calbiochem 407278 Calbiochem 407279 Calbiochem 407280 Calbiochem 407281 Calbiochem 407283 Calbioche· 407284 8221 C57-60, RR 1/1' GEnzyme GEnzyme BBA 8 BTC 71/72 BM 1441 272, 25.32 11.24, 11.31. 11.10 HOC-1 BCA9

BM 1441 892 TURA-27

NK1-M9 BTC 111, HECD-1. 6F9 NCC-CAD-299 BN 1452 193,

CĽ203.4.

2137- 01

2138- 01

Melanómové antigény

Antigén vysoko molekulárny váze (KMV 250.00Q)

Mwl05 glykoproteín pridružený k aelanómu

Abtigén 100 kDa (melanóm/karcinóm) 8P 113

P95-100

Sp75 gr 100-107

MAA

M.125kD (gpl25)

Antigény sarkómu

Epitópy TP-1 a TP-3

M_x200kD

M_x160kD

Značkovač karcinómu

Epitop NOC-31 (zhluk 2 epiteliálnych antigénov)

Antigény MĽC-1 (napr. epitop DF3 (_8P 290k0))

9.2.27 NrML5, 22S.28,

763.74, TP41.2, JND1

NE20

376.96

NOC 18

PAL-N2

15.75

NKl-bereb

K9.2

MAb436

TP-1, TP-3

29-13, 29.2

35-16, 30-40

MOC-31, NrLulO

MUC-l, DF3,

BCP-7 do -10

MUC-2 a MUC-3

Epitop LUBCRU-G7 (gp 230kD) Antigén špecifickej prostaty Antigén rakovinovej prostaty Vysokomolekulárny antigén prostaty M_M2400kD

Polynorfne epiteliálne niucíny špecifický aeabránový antigén prostaty (Cyt-356)

Globulín ľudského mliečneho tuku 422kD epitop prsného karcinómu Mucln H„210⁶

Epitop karcinÓBU vaječníkov OC125 (·_χ 750 kD)

Pankreésový glykoprotein HNV Antigén časti hrubého čreva CO17-1A (Μ_χ37000)

Epitop G9 (karcinó· časti hrubého čreva)

Ľudský sulfonucln časti hrubého čreva

Antigén slinivky brušnej N300kD GA 733.2

TAQ 72

Nedefinovateľné

Pridružené rakovina slinivky brušnej

Pankarcinón

Antigén adenokarcinómu prostaty Adenokarcínón pľúc M_xlS0-130kD Antigén rakoviny pľúc gp 160 (Cancer Res. 48, 2768, 1988)

Antigén karcinómu mechúra M_x600kD Antigén karcinómu mechúra (Cancer Res. 49, 6720. 1989)

PMH1

LUBCRU-G7

BM 1276 972

E4-SF

PD41

BM2. BM-7. 12-H-12

7E11-C5

Iauaunotech HMFG-1, 27.1

B/9189

TAG-72, CC-49, CC-83

OC125

DU-PAN-2

17-1A

G9

91.9H

MUSE 11

GA733, KS1.4

B72.3, CC49, CC83

Oatl, SMI

MUSE11

OC49

PD 41

AF-10 anti gpl60

C3

AN43, BB369

Epitop CAR-3 M_x2400kD AR-3

Epitop HAM-6 (C15.3)115D8

Vysokomolekulárny antigén rakoviny vaječníka 0VX1.0VX2

Epitop Hucínu Ia3Ia3

Antigén hepatocelulárneho karcinómu N_x900kDKM-2

Epitóp hepenalu (gp43), Antigén hepatocelulárneho karcinóau Hepena-1

0-viazaný aucín, obsahujúci kyselinu

N-glykolylneuraminickú

Antigén kolorektálneho karcinómu

N_x48kD

Antigén karcinóau prsníka M_x71kD Epitop 16.88 (antigén kolorektálnej rakoviny)

CAK1 (rakoviny vaječníkov) špecifický antigén p časti hrubého čreva

Antigén karcinóau pľúc M_x350-420kD

Antigén karcinóau mechúra gp54

Antigén karcinóau mechúra gp85

Antigén karcinómu mechúra gp25

3E1.2

D612

BCA227

16.88

KÍ

Mu-1, Hu-2

DF-L1. DF-L2

TI 6

T43

T138

AnUgérw ncvroblastvuY

Epitop pridruženej neuroblastomy, ako napríklad UJ13A UJ13A

Antigény gliômu

Epitop Mel-14

Antigény rakoviny hlavv a krku

Antigén N_x18-22kD

Mel-14

E48

HLA antigény

HLA trieda 1

HLA-A

HLA-B

HLA-A2

HLA-ABC

HLA-DR, DQ, DP 02~ikťoglobulín

Receptor apoptózv

Epitop Apo-1

Rôzne

Plazminogenný aktivátor antigénov a receptorov

F-glykoproteín C219, MRK16, JSB-1, Katepsin D

Žlčový epoteliálny antigén Neuroglandulárny antigén (CD63) CD9

TP25.99

VF19LL67

H2-149.1

KS1

V6.32

Q 5/13, B 8.11.2

NAMB-1

Apo 1 zajačí polyklón

265/F4 CIS-Diagnostici, Taliansko

HEA 125

ME491, NKI-C3, LS62

TAPA-1, R2, SM23 pan-H

Ľudský celulárny antigén

Claims

1. Spôsob detekcie špecifických cieľových buniek v suspenzii buniek pozostávajúcich zo zmiešanej populácie buniek a v tekutinách obsahujúcich zmiešanú populáciu buniek a v jednobunkovej suspenzii pripravenej z tuhých tkanív s výnimkou normálnych a zhubných hemapoietických buniek v krvi a kostnej dreni, vyznačujúci sa t ý m , že pozostáva z nasledujúcich krokov:

1.1 obalenie buniek paramagnetickými časticami alebo guľôčkami buď

a) protilátkami alebo fragmentmi protilátok zameraných na membránové štruktúry špeciálne expresované na cieľových bunkách a nie na necieľových bunkách v zmesi buniek; alebo

b) protilátkami, prednostne polyklonálnymi protimyšacími alebo monoklonálnymi potkaními protimyšacími protilátkami alebo ľudskými protilátkami schopnými väzby na Fc časti uvedených protilátok, zameraných proti membránovej štruktúre; a

1.2.1 zmiešanie cieľových buniek pridružujúcich protilátky (myšacie alebo ľudské), ktoré sú pripojené na uvedené častice alebo guľôčky, alebo pripojené na guľôčky vopred obalené protimyšacími alebo protiľudskými protilátkami poznávajúcimi Fc časti cieľ poznávajúcich protilátok, so suspenziou buniek, obsahujúcou cieľové bunky; alebo

1.2.2 zmiešanie voľných cieľových buniek pridružujúcich protilátky so suspenziou buniek obsahujúcich cieľové bunky a inkubovaním tejto zmesi počas 5 až 10 minút až 2 hodiny, prednostne 30 minút, pri teplote medzi 0 °C až 20 °C, prednostne 4 °C za mierneho otáčania; a

1.3 inkubácia zmesi suspenzie buniek a cieľ pridružujúcich protilátok pripojených na paramagnetické častice alebo guľôčky (1.2.1), alebo na paramagnetické častice alebo guľôčky vopred obalené protimyšacími alebo protiľudskými protilátkami poznávajúcimi Fc časť pridružujúcich protilátok, k zmesi inkubovaných voľných cieľ pridružujúcich protilátok a k suspenzii buniek (1.2.2) a inkubovaním počas 5 až 10 minút až 2 hodiny, výhodne 30 minút pri teplote medzi 0 °C až 25 °C, výhodne 4 °C pri miernom otáčaní; a

1.4.1 predinkubovanie protilátkou obalených častíc a suspenzií buniek pomocou miernych detergentov s vhodnou koncentráciou ako napríklad Tween 20 (TM) s koncentráciou menšou než 0,1 % počas 30 minút pri teplote 4 °C po znížení hydrofóbnej sily spojenej s protilátkou obalenými

SK 281566 Β6 časticami, ak populácia cieľových buniek je obsiahnutá v odsatej krvi alebo v kostnej dreni; a/alebo

1.4.2 inkubovanie suspenzie buniek ošetrených alebo neošetrených formalínom, alkoholom alebo inými fixatívami s inými protilátkami alebo fragmentmi protilátok viažucich sa na mimobunkové alebo vnútrobunkové molekuly prítomné v cieľových bunkách a použité protilátky sa označia vopred pomocou peroxidázy, alkalickej fosfatázy alebo inými enzýmami umožňujúcimi zviditeľnenie väzby pridaním a inkubovanlm s príslušnými substrátmi; alebo

1.4.3 biotinilácia fragmentov protilátok a zviditeľnenie väzby pridaním inkubácie s avidínom vytvárajúcim komplex s peroxidázou, alkalickou fosfatázou alebo s inými enzýmami a pridaním a inkubovaním s príslušnými substrátmi alebo

1.5.1 vystavenie inkubovanej zmesi paramagnetických častíc, protilátok a buniek (1.3) magnetickému poľu, ak je hustota cieľových buniek nízka alebo ak je pomer počtu cieľových buniek k celkovému počtu buniek v zmesi buniek nízky (< 1 %) s následným skúmaním a sčítaním sfarbených alebo nesfarbených komplexov, pozostávajúcich z častíc a cieľových buniek, v suspenzii buniek pomocou mikroskopu a/alebo vhodného počítačového zariadenia na bunky alebo častice; alebo

1.5.2 skúmanie a spočítanie cieľových buniek v inkubovanej zmesi paramagnetických Častíc, protilátok a zmesi buniek (1.3) alebo v prípade, keď protilátky alebo fragmenty protilátok sú konjugované s neparamagnetickými časticami, ktoré je možné zviditeľniť priamo z dôvodu farby alebo enzymatickou aktiváciou použitím mikroskopu a/alebo vhodného počítačového zariadenia buniek alebo častíc, ak je pomer cieľových buniek k celkovému počtu buniek v suspenzii buniek primeraný (z 1 %).

2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m , že smeruje protilátku alebo jej fragmenty proti antigénom v normálnych živých bunkách, ako napríklad v pečeňových hepatocytoch, v Kupfferových bunkách a v endoteliálnych bunkách typu 1 a 2 a v Čiarkových pľúcnych bunkách, v endoteliálnych bunkách špecifických orgánov, v pankreatických exokrinných a endokrinných bunkách, v ľadvinových kanálikových bunkách, v mechúrových epiteliálnych bunkách, v mozgových gliových bunkách, v mechúrových a prostatických epiteliálnych bunkách, v riasových bunkách dýchacích ciest, v rôznych subpopuláciách sliznicových buniek v tráviacom trakte, v hypofýznych bunkách a v iných endokrinných bunkách v rôznych orgánoch produkujúcich hormóny.

3. Spôsob podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúci sa t ý m , že využíva pre uvedenú protilátku cieľovej bunky protilátku, ktorá je reaktívna s antigénmi prítomnými na subpopuláciách normálnych buniek a na onkogenických produktoch expresovaných na membráne normálnych tkanivových buniek.

4. Spôsob podľa jedného z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že využíva ako uvedenú pozitívnu protilátku, ktorá je nasmerovaná proti receptorom rastového faktora na membráne normálnych buniek, ako napríklad receptor EGF, receptor PDGF (A aj B), receptory inzulínu, receptory látok podobných inzulínu, receptor transferínu a receptory NGF a FGF.

5. Spôsob podľa jedného z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že využíva protilátku nasmerovanú proti skupine integrínov a iných adhéznych membránových molekúl a proti proteínom MDR v normálnych bunkách.

6. Spôsob podľa jedného z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že smeruje protilátku alebo jej fragmenty proti antigénu alebo proti receptorom v bunkách s abnormálnymi vývojovými tvarmi, prednostne takými, ako sú primáme a metastatické rakovinové bunky.

7. Spôsob podľa jedného z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že používa ako uvedené protilátky pridružujúce cieľovú bunku protilátky IgG izotypu alebo fragmenty F(ab')₂ alebo F(ab) alebo IgM alebo fragmenty IgM.

8. Spôsob podľa jedného z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že pripravuje zmienenú suspenziu buniek zo zmesi populácií buniek pozostávajúcich z cicavčích tkanív, ako napríklad ľudskej kostnej drene a periférnej krvi, z pleurálnych a pobrušnicových efúzií, z iných telových tekutín, ako napríklad z moču, mozgovomiechového moku, zo semena, lymfatického systému alebo z tuhých novotvarov v normálnom tkanive a orgánoch, ako napríklad v pečeni, z lymfatických uzlín, z centrálneho nervového systému, z predstojnej žľazy, z kože a zo sliznicových membrán.

9. Spôsob podľa jedného z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že protilátka alebo fragmenty protilátky sú zamerané proti skupinám antigénnych rozhodujúcich činiteľov, ako sú tieto uvedené v tabuľke 1 opisu vynálezu.

10. Spôsob podľa jedného z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že používa ako uvedenú protilátku cieľovej bunky protilátku alebo fragment protilátky, ktorý je zameraný proti rastovému faktoru a onkogénnym produktom expresovaným na membráne zhubných buniek, ako napríklad receptory inzulínu, receptory inzulínu podobných látok a receptorov FGF okrem tých uvedených v tabuľke 1 opisu vynálezu.

11. Spôsob podľa jedného z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že používa protilátku alebo fragment protilátky zameraný proti skupine integrínov, iným adhéznym membránam molekúl a MDR proteínov v abnormálnych bunkách, ako je uvedené v tabuľke 1.

12. Spôsob podľa jedného z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že používa protilátku alebo fragmenty protilátky alebo ich kombinácie zamerané na rozhodujúce činitele antigénu, ako je uvedené v tabuľke 1 opisu vynálezu.

13. Spôsob podľa jedného z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že používa protilátku, ktorá je reaktívna s antigénmi prítomnými v normálnych bunkách, ako napríklad v prsných, vo vaječníkových a v pľúcnych rakovinových bunkách, v melanóme, v sarkóme, v glioblastome a v rakovinových bunkách tráviaceho a močovopohlavného traktu a retikuloendoteliálneho systému a/alebo cieľovými bunkami pridruženými k nie-neoplastickým chorobám, ako sú napríklad kardiovaskulárne, neurologické, pľúcne, autoimúnne, tráviace, močovopohlavné, retikoendoteliálne a iné poruchy.

14. Použitie detekčného spôsobu podľa jedného z predchádzajúcich nárokov na izoláciu cieľových buniek, vyznačujúce sa tým, že komplex buniek a paramagnetických častíc je vystavený magnetickému poľu a výsledné magneticky nahromadené bunky sú ďalej vystavené biologickému, biochemickému a imunologickému skúmaniu vrátane charakterizácie špecifických génov na DNA, mRNA a proteínovej hladine vrátane polymerizačnej reťazovej reakcie a spätnej transkripcie PCR.

15. Použitie spôsobu na detekciu špecifických cieľových buniek podľa jedného z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúce sa tým, že sa založia v skúmavke kultúry buniek zo separovaných paramagnetických komplexov pozostávajúcich z častíc a cieľových buniek

SK 281566 Β6 a/alebo na naočkovanie imunodeficitných zvierat, výhodne na založenie ľudských novotvarových xenoimplantátov v uvedených zvieratách.

16. Prostriedky na vykonávanie spôsobu podľa jedného z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúce sa t ý m , že pozostáva zo:

1. špecifických protilátok alebo fragmentov protilátok nasmerovaných na receptory antigénu na žiadaných cieľových bunkách, kde uvedená protilátka alebo fragment protilátky je viazaný alebo môže byť viazaný na zahrnuté paramagnetické častice bez odstránenia ich schopnosti viazať antigén; alebo

2. paramagnetické častice vopred obalené špecifickými proti-Fc protilátkami, výhodne polyklonálnymi protimyšacími alebo monoklonálnymi potkaními protimyšacími, alebo protiľudskými protilátkami, schopnými väzby na Fc časť protilátok pridružených k cieľovým bunkám a nešpecifické voľné protilátky cieľovej bunky; alebo

3. paramagnetické častice vopred obalené špecifickými proti-Fc protilátkami, výhodne polyklonálnymi protimyšacími alebo monoklonálnymi potkaními protimyšacími, alebo protiľudskými protilátkami schopnými väzby na Fc časť protilátok pridružených k špecifickým protilátkam proticieľových buniek; alebo

4. iné špecifické protilátky alebo fragmenty protilátok zamerané proti antigénom alebo receptorom vnútri alebo na žiadaných cieľových bunkách, kde uvedené protilátky alebo fragmenty protilátok sú konjugované s biotínom, peroxidázou, alkalickou fosfatázou alebo inými enzýmami, alebo kde uvedené protilátky alebo fragmenty protilátok sú viazané na enzýmy, ako napríklad peroxidáza a alkalická fosfatáza.