DE69333502T2 - Up-converting Reporter-Molekül für biologische und andere Testverfahren unter Verwendung von Laseranregungstechniken - Google Patents

Up-converting Reporter-Molekül für biologische und andere Testverfahren unter Verwendung von Laseranregungstechniken Download PDF

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Description

  • Die Erfindung betrifft allgemein Assaymethoden und eine Vorrichtung zur Feststellung löslicher, suspendierter oder teilchenförmiger Substanzen oder von Analyten, wie Proteinen, Kohlenhydraten, Nukleinsäuren, Bakterien, Viren und eukariotischen Zellen, unter Verwendung feststellbarer Markierungen, und spezieller betrifft sie Vorrichtungen und Verfahren, die Lumineszenz(Phosphoreszenz oder Fluoreszenz)-Markierungen einschließen.
  • Verfahren zur Ermittlung spezieller makromolekularer Arten, wie von Proteinen, Arzneimitteln und Polynukleotiden, erwiesen sich als sehr wertvolle analytische Techniken in der Biologie und Medizin, insbesondere zur Charakterisierung der molekularen Zusammensetzung normaler und anomaler Gewebeproben und genetischen Materials. Viele unterschiedliche Typen solcher Ermittlungsverfahren werden verbreitet in der biomedizinischen Forschung und der klinischen Laboratoriumsmedizin verwendet. Beispiele solcher Feststellungsmethoden sind. Immunoassays, immunochemischen Anfärben für die Mikroskopie, Fluoreszenz-aktivierte Zelltrennung (FACS), Nukleinsäurehybridisierung, Wasserprobenentnahme, Luftprobenentnahme und anderes.
  • Typischerweise verendet eine Feststellungsmethode wenigstens ein analytisches Reagenz, das an eine spezielle makromolekulare Zielverbindung bindet und ein feststellbares Signal erzeugt. Diese analytischen Reagenzien haben typischerweise zwei Komponenten: (1) ein Sondenmakromolekül, wie beispielsweise einen Antikörper oder ein Oligonukleotid, die an ein Zielmakromolekül mit einem hohen Grad an Spezifität und Affinität binden können, und (2) eine feststellbare Markierung, wie ein Radioisotop oder kovalent vernetzte fluoreszierende Farbstoffmoleküle. Im allgemeinen definieren die Bindungseigenschaften des Sondenmakromoleküls die Spezifität der Feststellungsmethode, und die Feststellbarkeit der verbundenen Markierung bestimmt die Empfindlichkeit der Feststellungsmethode. Die Empfindlichkeit der Feststellung ist ihrerseits abhängig sowohl von der verwendeten Markierungsart als auch der Qualität und Type der verfügbaren Ausrüstung, um sie zu ermitteln.
  • Beispielsweise erwiesen sich Radioimmunoassays (RIA) als die empfindlichsten und spezifischsten analytischen Methoden bei der Verwendung für die Feststellung und Quantifizierung biologischer Makromoleküle. Radioimmunoassay-Techniken wurden verwendet, um winzige Menge an speziellen Analyten festzustellen und zu messen, wie Polypeptide, Arzneimittel, Steroidhormone, Polynukleotide, Stoffwechselprodukte und Tumormarker, in biologischen Proben. Radioimmunoassaymethoden verwenden Immunoglobuline, die mit einer oder mehreren Radioisotopen als das analytische Reagenz markiert sind. Bestrahlung (α, β oder γ), erzeugt durch Zersetzung der beigefügten Radioisotopmarkierung dient als das Signal, das nach verschiedenen radiometrischen Methoden ermittelt und quantifiziert werden kann.
  • Radioisotopmarkierungen besitzen einige Vorteile, wie sehr hohe Empfindlichkeit bezüglich der Feststellung, sehr niedriges Hintergrundsignal und genaue Messung mit radiometrischen Präzisionsinstrumenten (Szintillation und Gammazähler) oder mit billigen und empfindlichen autoradiographischen Techniken. Radioisotopmarkierungen haben aber auch mehrere Nachteile, wie mögliche Gesundheitsschäden, Schwierigkeit bei der Entsorgung, spezielle Erfordernisse bei der Lizenzvergabe und Instabilität (radioaktiver Zerfall und Radiolyse). Weiterhin macht die Tatsache, daß Radioisotopmarkierungen typischerweise kein starkes (d. h. nicht-Cerenkov) Signal im Ultraviolett-, Infrarot- oder sichtbaren Bereich des elektromagnetischen Spektrums erzeugen macht Radiosotopen allgemein ungeeignet als Markierungen für Anwendungen wie Mikroskopie, Bildspektroskopie und Strömungszytometrie, die optische Methoden für die Feststellung verwenden.
  • Aus diesen und anderen Grünen braucht man auf den Gebieten der klinischen Chemie, der Wasser- und Luftüberwachung und der biomedizinischen Forschung alternativ feststellbare nicht-radioaktive Markierungen, wie: (1) Enzyme, welche die Umwandlung eines chromogenen Substrats in ein unlösliches, gefärbtes Produkt (zum Beispiel alkalische Phosphatase, β-Galactosidase, Meerrettichperoxidase) oder eine Reaktion katalysieren, die ein fluoreszierendes oder lumineszierendes Produkt ergeben (zum Beispiel Luciferase) (Beck und Koster (1990), Anal. Chem. 62, 2258; Durrant, I. (1990) Nature 346: 297; Analytical Applications of Bioluminescence and Chemiluminescence (1984), Kricke et al. (Herausgeber), Academic Press, London) und (2) fluoreszierende Markierungen (zum Beispiel Fluorescein, Isothiocyanat, Rhodamin, Cascade Blau), die elektromagnetische Energie in einem speziellen Absorptions-Wellenlängenspektrum absorbieren und anschließend sichtbares Licht auf eine längere (d. h. weniger energiehaltige) Transformation eines chromogenen Substrates in feststellbares Produkt ergibt.
  • Die Verwendung von Enzymen und phosphoreszierenden/fluoreszierenden oder kolometrisch feststellbaren Markierungen bieten den signifikanten Vorteil einer Signalverstärkung, da ein einzelnes Enzymmolekül typischerweise eine beharrliche Kapazität, die Umwandlung eines chromogenen Substrats in feststellbares Produkt zu katalysieren, hat. Mit geeigneten Reaktionsbedingungen und geeigneter Inkubationszeit kann ein einzelnes Enzymmolekül eine große Produkt erzeugen und ergibt daher eine beachtliche Signalverstärkung. Ermittlungsmethoden, die Enzyme als Markierungen verwenden, erfordern jedoch nachteiligerweise zusätzliche Verfahren und Reagenzien, um eine geeignete Substratkonzentration unter Bedingungen zu liefern, die für die Produktion und Feststellung des gefärbten Produktes geeignet sind. Weiterhin benötigen Feststellungsmethoden, die auf Enzymmarkierungen beruhen, typischerweise engere Zeitintervalle zur Erzeugung feststellbarer Produktmengen und erzeugen auch ein unlösliches Produkt, das nicht an das Sondenmolekül bindet.
  • Ein weiterer Nachteil von Enzymmarkierungen ist die Schwierigkeit einer Feststellung mehrerer Zielarten. Es ist problematisch, die Reaktionsbedingungen und Entwicklungszeit(en) für zwei oder mehr diskrete Enzymmarkierungen zu optimieren und außerdem bestehen oft bemerkenswerte Spektralüberlappungen in den chromophoren Produkten, was die Unterscheidung der Reaktionsprodukte schwierig macht.
  • Fluoreszierende Markierungen bieten nicht den Vorteil der Signalverstärkung von Enzymmarkierungen, dessen ungeachtet besitzen fluoreszierende Markierungen signifikante Vorteile, welche zu ihrer weitverbreiteten Akzeptanz in der Immunozytochemie führten.
  • Fluoreszierende Markierungen sind typischerweise kleine organische Farbstoffmoleküle, wie Fluorescein, Texasrot oder Rhodami, die leicht mit Sondenmolekülen, wie Immunoglobulinen oder Staph. aureus Protein A konjugiert werden können. Die fluoreszierenden Moleküle (Fluorophore) können durch Beleuchtung mit Licht einer geeigneten Erregungsfrequenz ermittelt werden, und die resultierenden Spektralemissionen können durch elektro-optische Sensoren oder Lichtmikroskopie festgestellt werden.
  • Eine große Vielzahl von fluoreszierenden Farbstoffen ist verfügbar und bietet eine Auswahl von Erregungs- und Emissionsspektren. Es ist möglich, Fluorophore mit Emissionsspektren, die ausreichend verschieden sind, um eine Mehrfachzielermittlung und -unterscheidung mit mehrfachen Sonden zu erlauben, worin jede Sondenart mit einem unterschiedlichen Fluorophor vernetzt ist. Da die Spektren von Fluorophoren auf der Basis sowohl enger Bandenerregung und selektiv zweier Emissionsspektren festgestellt und aufgelöst werden können (Titus et al. (1982) J. Immunol. Methods 50: 193; Nederlof et al (1989) Cytometry 10: 20; Ploem, J. S. (1971) Ann. NY Acad. Scie. 177: 414).
  • Leider haben die Feststellungsmethoden, die fluoreszierende Markierungen verwenden, aus verschiedenen Gründen eine beschränkte Empfindlichkeit. Erstens ist es mit herkömmlichen Fluorophoren schwierig, spezielle fluoreszierende Signale von unspezifischen Hintergrundsignalen zu unterscheiden. Die üblichsten Fluorophore sind aromatische organische Moleküle, die breite Absorptions- und Emissionsspektren haben, wobei das Emissionsmaximum 50 bis 100 nm bis zu einer längeren Wellenlänge als die Erregungswellenlänge (d. h. Absorption) hat. Typischerweise sind beide, die Absorptionsbande und die Emissionsbande in dem UV/sichtbaren Anteil des Spektrums. Außerdem ist die Lebensdauer der Emission gewöhnlich kurz, in der Größenordnung von 1 bis 100 ns. Leider sind diese allgemeinen Charakteristiken organischer Farbstofffluoreszenz auf Hintergrundsignale anwendbar, bei anderen Reagenzien (zum Beispiel Fixativ oder Serum) oder Autofluoreszenz oder die Probe selbst mitgeteilt bekamen (Jongkind et al. (1982) Exp. Cell Res. 138: 409; Aubin, J. E. (1979) J. Histochem. 'Cytochem. 27: 36). Autofluoreszenz optischer Linsen und reflektiertes Erregungslicht sind zusätzliche Quellen für das Hintergrundrauschen im sichtbaren Spektrum (Beverloo et a. (1991) Cytometry 11: 784; Beverloo et al. (1992) Cytometry 13: 561). Daher ist die Grenze von speziellem fluoreszierendem Signal bei typischen Fluorophoren durch signifikantes Hintergrundrauschen beschränkt, das unspezifischer Fluoreszenz und reflektiertem Erregungslicht zuzuschreiben ist.
  • Ein zweites Problem organischer Farbstoff-Fluorophore, das die Empfindlichkeit beschränkt, ist photolytische Zersetzung des Farbstoffmoleküls (d. h. Lichtausbleichen). So ist es oftmals, selbst in Situation, wo Hintergrundrauschen relativ gering ist, nicht möglich, ein schwach fluoreszierendes Signal über eine lange Ermittlungszeit zu integrieren, da die Farbstoffmoleküle sich als eine Funktion der einfallenden Strahlung im UV und nahen UV-Bereich zersetzen.
  • Da jedoch fluoreszierende Markierungen attraktiv für verschiedene Anwendungen sind, wurden bereits mehrere Alternativfluorophore mit vorteilhaften Eigenschaften für empfindliche Feststellung vorgeschlagen. Ein Weg war der, organische Farbstoffe zu verwenden, die einen Phycobiliprotein-Akzeptormolekülfarbstoff umfassen, der im fernen Rot oder nahe dem Infrarot-Bereich des Spektrum emittieren, wo das unspezifische Fluoreszenzrauschen vermindert wird. Phycobiliproteine werden in Verbindung mit beiläufigen Molekülen, die einen großen Stoke-Shift über Energietransfermechanismen (US-Patent 4,666,862, Oi et al. (1982) J. Cell. Biol. 93: 891) bewirken. Phycobiliprotein-Markierungen vermindern den Grad an Spektralüberlappung zwischen Erregungsfrequenzen und Emissionsfrequenzen. Ein Alternativweg war der, Cyaninfarbstoffe zu verwenden, im gelben oder roten Bereich absorbieren und im roten oder fernen roten emittieren, wo Autofluoreszenz vermindert ist (Mujumbar et al. (1989) Cytometry 10: 11).
  • Mit beiden, den Phycopbiliproteinen und den Cyaninfarbstoffen würden jedoch die Emissionsfrequenzen nach rot gewechselt (d. h. die Frequenz wird abwärts gewechselt) und die Emissionslebensdauer ist kurz, und deshalb wird die Hintergrund-Autofluoreszenz nicht vollständig als eine Rauschquelle ausgeschaltet. Wichtiger vielleicht ist, daß Phycobiliproteine und Cyaninfarbstoffe mehrere bestimmte Nachteile besitzen: (1) Emission im roten, fernen roten und nahen infraroten Bereich ist nicht gut geeignet für Ermittlung durch das menschliche Auge, was die Verwendung von Phycobiliprotein- und Cyanin-Markierungen im optischen Fluoreszenzmikroskop behindert, (2) Cyanine, Phycobiliproteine und die gekoppelten beiläufigen Moleküle zum Beispiel Azur A sind organische Moleküle, die einem Photoausbleichen zugänglich sind und unerwünschte chemische Wechselwirkungen mit anderen Reagenzien unterzogen werden, und (3) emittierte Strahlung wird abwärts umgewandelt, d. h. von längerer Wellenlänge oder längeren Wellenlängen aus, als die absorbierte Erregungsstrahlung. Beispielsweise absorbiert Azure A bei 632 nm und emittiert bei 645 nm, und Allohpycocyanin absorbiert bei 645 nm und emittiert bei 655 nm, und daher wird Autofluoreszenz und Hintergrundrauschen von gestreutem Erregungslicht nicht ausgeschaltet.
  • Eine andere Fluorophorklasse, die bereits vorgeschlagen wurde, sind die abwärts sich wandelnden lumineszenten Lanthaniden-Chelate (Soini und Lovgren (1987) CRC. Crit. Rev. Anal. Chem. 18: 105; Leif et al. (1977) Clin. Chem. 23: 1492; Soini und Hemmila (1979) Clin: Chem. 28: 353; Seveus et al. (1992) Cytometry 13: 329). Abwärts umwandelnde Lanthaniden-Chelate sind anorganische Phosphore, die einen starken Stokes-Abwärtsshift haben (d. h., das Emissionsmaximum liegt typischerweise bei wenigstens 100 nm größer als das Absorptionsmaximum), was bei der Unterscheidung eines Signals gegenüber gestreutem Erregungslicht hilft. Lanthaniden-Phosphore besitzen eine Emissionslebensdauer, die ausreichend lang (d. h. größer als 1 μs) ist, um ihre Verwendung in zeitbegrenzten Feststellungsmethoden zu erlauben, was kurzlebige Autofluoreszenz und gestreutes Erregungslicht verursachtes Rauschen vermindern, aber nicht vollständig ausschalten kann. Weiterhin besitzen Lanthanid-Phorphore Emission mit schmaler Bande, was das Unterscheiden von Wellenlängen gegenüber dem Hintergrundrauschen und gestreutem Erregungslicht erleichtert, besonders wenn eine Lasererregungsquelle benutzt wird (Reichstein et al. (1988) Anal. Chem. 60: 1069). In jüngerer Zeit wurde enzymverstärkte Lanthaniden-Lumineszenz unter Verwendung abwärts sich wandelnder Lanthanid-Chelate als eine fluoreszenzmarkierende Technik vorgeschlagen (Evangelista et al. (1991) Anal. Biochem. 197: 213; Gudgin-Templeton et al. (1991) Clin. Chem 37: 1506).
  • Bis vor kurzem hatten abwärts sich wandelnde Lanthaniden-Phosphore den signifikanten Nachteil, daß ihre Quantenausbeute in wäßrigen (oxygenierten) Lösungen so gering ist, daß sie für cytochemische Färbung ungeeignet gemacht sind. Beverloo et al. (siehe oben) haben einen teilchenförmigen abwärts sich wandelnden Lanthaniden-Phosphor (Yttriumoxysulfit, aktiviert mit Europium) beschrieben, der ein Signal in wäßrigen Lösungen erzeugt, welches mit Zeit-aufgelösten Methoden ermittelt werden kann. Seveus et al. (siehe oben) verwendeten abwärts sich wandelnde Europiumchelate in Verbindung mit Zeit-aufgelöster Fluoreszenzmikroskopie, um das Signal an sofortiger Fluoreszenz und dadurch reduzierter Autofluoreszenz zu hindern. Take et al. (US-Patent 5,043,265) berichten über abwärts sich wandelnde Phosphorteilchen als Markierungen für Immunoglobuline und Polynukleotide.
  • Die Abwärtsumwandlung von Lanthaniden-Phosphor nach Beverloo et al. das Europiumchelat nach Seveus et al. erfordern jedoch maximale Erregungswellenlängen, die im Ultraviolettbereich liegen und somit signifikante Probenautofluoreszenz und Hintergrundrauschen produzieren (zum Beispiel Serum und/oder Fixativfluoreszenz, Erregungslichtstreuung und zeitbegrenzte Signalabweisung). Weiterhin zerstört Erregung mit Ultraviolettstrahlung Nukleinsäuren und andere biologische Makromoleküle, was ernsthafte Probleme immunozytische Anwendungen mit sich bringt, wo es erwünscht ist, die Lebensfähigkeit lebender Zellen zu erhalten und Zellstrukturen (zum Beispiel FACS, Cyto-Architekturmikroskopie) zurückzuhalten.
  • Laser-Rasterfluoreszenzmikroskopie wurde für Erregung zweier Photonen eines UV-erregbaren organischen Farbstoffs mit Fluoreszenz, Hoechst 33258, unter Verwendung eines Stromes stark fokussierter Laserpulse (Denk et al. (1990) Science 248: 73). Der organische Fluorphore, wie er von Denk et al. verwendet wird, wurde stark mit Licht ausgebleicht durch das intensive stark fokussierte Laserlicht während des Verlaufs der Belichtung.
  • Somit gibt es einen signifikanten Bedarf im Stand der Technik an Markierungen und Ermittlungsmethoden, die empfindliche optische und/oder spektroskopische Ermittlung spezieller Markierungssignale mit im wesentlichen gesamter Abweisung von unspezifischem Hintergrundrauschen und erträglich mit intakten lebensfähigen Zellen und in wäßriger oder lufthaltiger Umgebung.
  • EP-A-0 476 556 beschreibt ein Assay-Ermittlungssystem, in welchem rotes Licht Energie einer lichtempfindlichen Substanz zuführt, die katalytisch mit molekularem Sauerstoff reagiert, um ein Oxidationsmittel zu erzeugen.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Im allgemeinen liefert die vorliegende Erfindung Feststellungsmethoden und Feststellungsvorrichtungen, die eine ultraempfindliche Ermittlung von Zellen, biologischen Makromolekülen und anderen Analyten gestatten, die für Mehrfachzielermittlung und Zielunterscheidung verwendet werden können. Die Phosphor-Up-Converting-Reporter-Moleküle, die nach der Erfindung verwendet werden, erlauben im wesentlichen eine Gesamtabweisung von nicht spezifischer Hintergrund-Autofluoreszenz und sind durch Erregung und emittierte Wellenlängen gekennzeichnet, die typischerweise in dem Infrarot- oder sichtbaren Teil des Spektrums angeordnet sind und somit eine potentielle Zerstörung von Wirkungen der Ultraviolettstrahlung vermeiden. Die bei der Erfindung verwendeten Phosphor-Up-Converting-Markierungen wandeln Erregungsstrahlung mit langer Wellenlänge (zum Beispiel nahe IR) in emittierte Strahlung bei etwa der Hälfte bis zu einem Drittel der Wellenlänge der Erregungswellenlänge um. Da Hintergrundfluoreszenz in dem sichtbaren Bereich vernachlässigbar ist, wenn Erregungswellenlängen nahe IR verwendet werden, ergibt die Verwendung von Phosphor-Up-Converting-Markierungen im wesentlichen eine hintergrundfreie Signalermittlung.
  • So bekommt man nach einem Aspekt der vorliegenden Erfindung eine Vorrichtung zum Analysieren einer Probe, die möglicherweise einen lumineszierenden Phosphor-Up-Converting-Reporter enthält, der durch eine Erregungsbande in einem ersten Wellenlängenbereich und eine Emissionsbande in einem zweiten Wellenlängenbereich gekennzeichnet ist, welche letztere kürzere Wellenlänge als die im ersten Bereich hat und die Vorrichtung folgendes umfaßt:
    eine Quelle, die Licht in einem Wellenlängenbereich emittieren kann, der wenigstens einen Teil der Erregungsbande des lumineszierenden Phosphor-Up-Converting-Reporter-Moleküls überlappt, worin die Erregungsbande eine Wellenlänge von 950 bis 1000 nm hat,
    eine Einrichtung zur Versorgung dieser Quelle mit Energie,
    einen Detektor, der Licht im Wellenlängenbereich feststellen kann, der wenigstens einen Teil der Emissionsbande des lumineszierenden Phosphor-Up-Converting-Reporter-Moleküls überlappt und worin die Emissionsbande im sichtbaren Bereich des Spektrums liegt,
    eine erste Einrichtung, die wenigstens einen Teil des von der besagten Quelle emittierten Lichts unter Einschluß von Licht in dem ersten Wellenlängenbereich und unter Ausschluß von Licht in dem zweiten Wellenlängenbereich zu einer Stelle auf der Probe richtet,
    eine zweite Einrichtung, die wenigstens einen Teil des von der besagten Stelle an der Probe abgestrahlten Lichts unter Einschluß von Licht in dem zweiten Wellenlängenbereich zu dem Detektor lenkt und
    eine mit dem Detektor gekoppelten Einrichtung zur Erzeugung eines elektrischen Signals, das repräsentativ für die Intensität des Lichteinfalls an dem Detektor in einem Wellenlängenbereich ist, welcher Wellenlängen in dem zweiten Bereich einschließt und Wellenlängen in dem ersten Bereich ausschließt.
  • Nach einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung bekommt man eine Vorrichtung zum Analysieren einer Probe, die möglicherweise erste und zweite lumineszierende Phosphor-Up-Converting-Reporter-Moleküle enthält, worin das erste Reporter-Molekül durch eine Erregungsbande in einem ersten Wellenlängenbereich und eine Emissionsbande in einem zweiten Wellenlängenbereich, die kürzer als die Wellenlängen in dem ersten Bereich sind, gekennzeichnet ist, wobei das zweite Reporter-Molekül durch eine Erregungsbande in einem dritten Wellenlängenbereich und eine Emissionsbande in einem vierten Wellenlängenbereich gekennzeichnet sind und worin der erste und dritte Bereich einander nicht überlappen und die zweiten und vierten Bereich einander überlappen, wobei die Vorrichtung folgendes umfaßt:
    eine erste Quelle, die Licht in einem Wellenlängenbereich emittieren kann, der wenigstens einen Teil der Erregungsbande des ersten Reporter-Moleküls überlappt, worin die Erregungsbande eine Wellenlänge von 950 bis 1000 nm hat,
    eine zweite Quelle, die Licht in einem Wellenlängenbereich emittieren kann, der wenigstens einen Teil der Erregungsbande des zweiten Reporter-Moleküls überlappt,
    eine Einrichtung zur Versorgung der ersten und zweiten Quelle mit Energie einschließlich einer Einrichtung, die der ersterwähnten und der zweiten Quelle unterschiedliche Intensitätsmuster erteilt,
    einen Detektor, der Licht in einem Wellenlängenbereich feststellen kann, der wenigstens einen Teil der Emissionsbande des Reporter-Moleküls überlappt, wobei die Emissionsbande im sichtbaren Bereich des Spektrums liegt,
    eine Einrichtung, die wenigstens einen Teil des von der ersten und zweiten Quelle emittierten Lichts unter Einschluß von Licht in dem ersten und dritten Wellenlängenbereich und unter Ausschluß von Licht in dem zweiten und vierten Wellenlängenbereich zu einer Stelle an der Probe lenkt und
    eine mit dem Detektor gekoppelte Einrichtung zur Erzeugung erster und zweiter elektrischer Signale, die für die betreffenden Intensitäten von auf dem Detektor einfallendem Licht bei Wellenlängen im zweiten und vierten Bereich und außerhalb des ersten und dritten Bereichs repräsentativ sind, einschließlich einer Einrichtung zur Unterscheidung der unterschiedlichen Intensitätsmuster.
  • Nach noch einem anderen Aspekt der Erfindung bekommt man ein Verfahren zum Analysieren einer Probe, die ein lumineszierendes Phosphor-Up-Converting-Reporter-Molekül enthält, gekennzeichnet durch eine Erregungsbande in einem ersten Wellenlängenbereich und eine Emissionsbande in einem zweiten Wellenlängenbereich und eine Emissionsbande in einem zweiten Wellenlängenbereich, wobei letztere Wellenlängen kürzer als die Wellenlängen in dem ersten Bereich sind und wobei das Verfahren folgende Maßnahmen umfaßt:
    Vorsehen einer Probe, die ein lumineszierendes Phosphor-Up-Converting-Reporter-Molekül enthält, welches durch eine Erregungsbande in einem ersten Wellenlängenbereich und eine Emissionsbande in einem zweiten Wellenlängenbereich gekennzeichnet ist, wobei letztere Wellenlängen kürzer als die Wellenlängen in dem ersten Bereich sind,
    Vorsehen einer Quelle, die Licht in einem Wellenlängenbereich emittieren kann, der in der Erregungsbande des Reporter-Moleküls liegt, wobei die Erregungsbande eine Wellenlänge von 950 bis 1000 nm hat,
    Vorsehen eines Detektors, der Licht in einem Wellenlängenbereich feststellen kann, der in dem Erregungsbereich des Reporter-Moleküls liegt,
    Vorsehen eines Detektors, der Licht in einem Wellenlängenbereich feststellen kann, der in der Emissionsbande des Reporter-Moleküls liegt, wobei die Emissionsbande in dem sichtbaren Bereich des Spektrums liegt,
    von der Quelle emittiertes Licht zu einer Stelle an der Probe lenkt,
    von der Stelle an der Probe ausgestrahltes Licht zu dem Detektor lenkt und
    ein elektrisches Signal erzeugt, das für die Intensität von Licht in einem Wellenlängenbereich repräsentativ ist, welcher Wellenlängen in dem zweiten Bereich einschließt und Wellenlängen in dem ersten Bereich ausschließt.
  • Kurz gesagt verwendet die Erfindung lumineszierende Materialien, die um eine Mehrphotonenerregung in der Lage sind und nach oben verschobene Emissionsspektren haben. Up-Converting-Phosphore (d. h. die mehrere Photonen in einer Bande niedriger Frequenz absorbieren und in einer Bande höherer Frequenz emittieren) werden als Markierungen verwendet, die mit einer oder mehreren Sonden, wie einem Immunoglobulin, Polynukleotid, Streptavidin, Protein A, Rezeptorligand oder einem anderen Sondenmolekül vernetzt werden können. Nach einer anderen Ausführungsform dient das Up-Converting organischer Farbstoffe als die Markierung. Markierungen von organischem Farbstoff und Phosphormarkierungen nach der Erfindung sind sehr verträglich mit automatisiertem diagnostischem Testen, mit mikroskopischen Abbildungsanwendungen und codierter Teilchenermittlung unter vielen anderen Anwendungen.
  • Die Natur der Erfindung ergibt erhebliche Flexibilität in der Apparatur zur Durchführung der Verfahren. Als allgemeine Faustregel kann die Erregungsquelle irgendeine bequeme Lichtquelle sein einschließlich billiger Laserdioden nahe Infrarot oder lichtemittierender Dioden (LEDs), und der Detektor kann irgendein üblicher Detektor, wie eine Photodiode sein. Im Falle eines einzelnen Reporter-Moleküls schließt die Apparatur eine Laserdiode, die Licht mit einer oder mit mehreren Wellenlängen in der Erregungsbande des Reporter-Moleküls emittieren kann, und einen Detektor, der für wenigstens einige Wellenlängen in der Emissionsbande des Reporter-Moleküls empfindlich ist, ein. Das Laserlicht wird vorzugsweise auf einen kleinen Bereich in der Probe fokussiert, und aus jenem Bereich ausströmendes Licht wird gesammelt und zu dem Detektor gerichtet. Ein elektrisches Signal, das die Intensität von Licht in der Emissionsbande repräsentiert, liefert ein Maß für die Menge an vorhandenem Reporter-Molekül. Abhängig von der Spektralreaktion des Detektors kann es erforderlich sein, ein Filter vorzusehen, um das Erregungslicht zu blockieren.
  • Gleichzeitige Feststellung von Mehrfach-Reporter-Molekülen ist möglich, wenigstens, wo die Reporter-Moleküle unterschiedliche Erregungsbanden oder unterschiedliche Emissionsbanden besitzen. Wo die Erregungsbanden unterschiedlich sind, werden Mehrfach-Laserdioden, die bei den betreffenden geeigneten Wellenlängen emittieren, unter Verwendung eines Wellenlängenteiler-Multiplexers oder anderer geeigneter Techniken, wie Frequenzmarkierung, Frequenzmodulation und Synchrondetektoreinrichtung, vereinigt. Wenn Emissionsbanden unterschiedlich sind (ob nun die Erregungsbanden unterschiedlich sind oder nicht), wird Licht in den unterschiedlichen Emissionsbanden abgetrennt und zu Mehrfachdetektoren geschickt. Wenn die Emissionsbanden einander überlappen, kann ein einzelner Detektor verwendet werden, doch werden andere Ermittlungstechniken verwendet. Ein Beispiel ist die Verwendung von Zeit-synchronisierenden Techniken, so daß nur ein Reporter-Molekül zu einem bestimmten Zeitpunkt emittiert wird. Alternativ können unterschiedli che Laserdioden bei unterschiedlichen charakteristischen Frequenzen moduliert werden und Synchronfeststellung durchgeführt werden.
  • Die Feststellungsmethoden und Feststellungsvorrichtung der vorliegenden Erfindung ermöglichen die ultraempfindliche Feststellung von Up-Converting-Phosphoren durch Ausnutzung dessen, was im wesentlichen das vollständige Fehlen von Hintergrundrauschen ist (zum Beispiel Autofluoreszenz, Serum/Fixativ-Fluoreszenz, Erregungslichtstreuung), was vorteilhafte Eigenschaften von Up-Converting-Markierungen sind. Einige Ausführungsformen der Erfindung benutzen zeitbeschränkte Feststellung und/oder wellenlängenbeschränkte Feststellung zur Optimierung der Feststellungsempfindlichkeit, Unterscheidung von Mehrfachproben und/oder der Feststellung von Mehrfachsonden bei einer einzelnen Probe. Phasenempfindliche Feststellung kann auch benutzt werden, um eine Unterscheidung zwischen Signalen, die einem Up-Converting-Phosphor zuzuschreiben sind, und Hintergrundrauschen (zum Beispiel Autofluoreszenz), welches eine andere Phasen-Verschiebung hat, zu bekommen.
  • Bei einigen Ausführungsformen benutzt die vorliegende Erfindung eine oder mehrere optische Laserquellen zur Erzeugung von Erregungsbeleuchtung einer oder mehrerer einzelner Frequenzen. In bestimmten Abwandlungen der Erfindung kann Laserbestrahlung einer Up-Converting-Markierung die unmittelbare molekulare Umgebung durch laserinduzierte photochemische Verfahren modifizieren, was entweder direkte Absorption oder Energieübertragung einschließt. Solche räumlich gesteuerte Energieabscheidung kann benutzt werden, um lokalisierten Schaden zu erzeugen und/oder die chemische Umgebung einer definierten Örtlichkeit zu sondieren. Bei solchen Ausführungsformen kann die Up-Converting-Markierung vorzugsweise als ein photophysikalischer Katalysator wirken.
  • Die Erfindung liefert Verfahren zur Erzeugung gezielter Beschädigung (zum Beispiel Katalyse) in chemischen oder biologischen Materialien, worin eine Sonde verwendet wird, um eine vernetzte Up-Converting-Markierung an einer Position nahe einer gezielten biologischen Struktur zu lokalisieren, die durch die Sonde gebunden ist. Die lokalisierte Up-Converting-Markierung wird durch eine oder mehrere Erregungswellenlängen erregt und bei einer kürzeren Wellenlänge emittiert, die direkt zytotoxisch oder genotoxisch sein kann (zum Beispiel durch Erzeugung freier Radikale, wie von Superoxid und/oder durch Erzeugung von Thymin-Thymin-Dimeren) oder eine lokale photolytische chemische Reaktion unter Bildung reaktiver chemischer Verbindungen in der unmittelbaren Nachbarschaft der Markierung, damit in der Nachbarschaft zu dem gezielten biologischen Material induzieren kann. So können mit einer oder mit mehreren Up-Converting-Markierungen (d. h. einem anorganischen Up-Converting-Phosphor) markierte Zielsonden verwendet werden, um gezielt eine Schädigung biologischer Strukturen, wie Zellen, Geweben, Neoplasma, Gefäßen oder anderer anatomischer oder histologischer Strukturen zu erzeugen.
  • Die vorliegende Erfindung verwendet Up-Converting-Phosphore, die auch von einem Elektronenstrahl oder einem anderen Strahl energetischer Strahlung ausreichender Energie erregt werden können und Kathodo-Lumineszenz haben. Solche Elektron-stimulierten Markierungen bieten neue Vorteile bei der Beseitigung von Hintergrund in ultraempfindlichen Biomolekülermittlungsme thoden. Typischerweise wird die Stimulierung des Up-Converting-Phosphors mit wenigstens zwei Elektronen verwendet, um ein sichtbares Licht oder eine UV-Bandenemission zu erzeugen.
  • Die Erfindung liefert auch die gleichzeitige Feststellung von Mehrfachzielarten durch Ausnutzung der Mehrfachphotonenerregung und anschließenden hintergrundfreien Fluoreszenzfeststellung mehrerer Up-Converting-Phosphore.
  • Bei einer Ausführungsform werden mehrere Phosphore ausgewählt, die überlappende Absorptionsbanden haben, die eine gleichzeitige Erregung bei einer Wellenlänge (oder in einer engen Bandbreite) erlauben, die aber in Emissionscharakteristiken derart variieren, daß jede Sonden-Markierungsart mit einem unterscheidbaren fluoreszierenden „Fingerabdruck" ausgezeichnet ist. Durch Verwendung verschiedener Methoden und Einrichtung kann das Vorhandensein und die Konzentration eines jeden der Phosphore bestimmt werden.
  • Die Erfindung liefert auch biochemische Assaymethoden zur Bestimmung des Vorhandenseins und der Konzentration eines oder mehrerer Analyten, typischerweise in Lösung. Die Assaymethoden verwenden Zusammensetzungen von Sonden, die mit Up-Converting-Phosphoren markiert sind, und Vorrichtungen zum Einfangen von magnetischen und/oder optischen Teilchen, die den Analyten und die markierte Sonde umfassen. In einer Ausführungsform wird ein Sandwich-Assay durchgeführt, bei dem eine immobilisierte Sonde, immobilisiert auf einem Teilchen, an einen vorbestimmten Analyten bindet, eine Immobilisierung des gebundenen Analyten an dem Teilchen erzeugt. Eine zweite Sonde, mit einer Up-Converting-Markierung versehen kann dann an den gebundenen Analyten binden, um einen gebundenen Sandwich-Komplex zu erzeugen, der eine an ein Teilchen gebundene Up-Converting-Markierung enthält. Durch Kombinieren unterschiedlicher Sonden-Markierungskombinationen, Teilchen unterschiedlicher Größen, Farbe und/oder Form mit bestimmten immobilisierten Sonden und/oder verschiedenen Erregungswellenlängen ist es möglich, Mehrfach-Assays im wesentlichen gleichzeitig oder synchron durchzuführen. Dieser Multiplex-Vorteil ergibt eine Ermittlung und Quantifizierung mehrerer Analytarten in einer einzigen Probe. Die Assaymethoden sind auch brauchbar für das Überwachen des Fortschritts einer Reaktion, wie einer physikalischen, chemischen, biochemischen oder immunologischen Reaktion einschließlich Bindungsreaktionen. Beispielsweise kann die Erfindung verwendet werden, um das Voranschreiten von Liganden-Bindungsreaktionen, Polynukleotid-Hybridisierungsreaktionen einschließlich Hybridisierungskinetik und thermodynamische Stabilität hybridisierter Polynukleotide zu überwachen.
  • Die Erfindung liefert auch Methoden und Up-Converting-Markierungen und Zusammensetzungen markierter Bindungsreagenzien, die zur Durchführung Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) durch Fließzytometrie unter Verwendung von Erregungsstrahlung, die im Infrarotbereich des Spektrums liegt und Zellen nicht signifikant schädigt. Dies liefert einen signifikanten Vorteil gegenüber derzeitigen FACS-Methoden, was auf Erregungsbeleuchtung im Ultraviolettbereich des Spektrums beruht, einschließlich Wellenlängen, die bekanntermaßen DNA-Verletzungen produzieren und Zellen schädigen.
  • Die Erfindung kann auch Zusammensetzungen verwenden, die wenigstens ein fluoreszierendes organisches Farbstoffmolekül umfassen, welches an einen anorganischen Up-Converting- Phosphor gebunden ist. Das fluoreszierende Farbstoffmolekül wird unter den folgenden Klassen ausgewählt: Rhodamine, Cyanine, Xanthene, Acridine, Oxazine, Porphyrine und Phthalocyanine, und die Farbstoffmoleküle können gegebenenfalls auch mit einem Schwermetall komplexiert werden. Der fluoreszierende organische Farbstoff kann an den anorganischen Up-Converting-Phosphor-Kristall absorbiert und/oder kovalent an einen beschichteten anorganischen Up-Converting-Phosphor, einen derivatisierten vitrokeramischen Up-Converting-Phosphor oder einen mikroeingekapselten anorganischen Up-Converting-Phosphor kovalent gebunden werden.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 ist ein optisches und elektronisches Blockdiagramm, welches die Vorrichtung zur Durchführung von Diagnostik auf einer Probe nach der vorliegenden Erfindung durchführt.
  • 2A zeigt eine Vorrichtung zur Durchführung der phasenempfindlichen Feststellung im Kontext eines einzelnen Kanals.
  • 2B zeigt eine Vorrichtung, wo erste und zweite Laserdioden durch Signale von wellenförmigen Generatoren moduliert werden.
  • 3 zeigt eine Vorrichtung zur Durchführung begrenzter Ermittlung.
  • 4 zeigt eine Vorrichtung zur Durchführung von Diagnostik auf einer Probe unter Verwendung erster und zweiter Reporter-Molekül-Erregungsbanden, zentriert bei λ1 bzw. λ2 und mit überlappenden Emissionsbanden bei λ3.
  • 5A, 5B, 5C zeigen schematisch Energiezustandsübergänge bei Mehrfachphotonenerregungsschemata.
  • 6 zeigt ein miniaturisiertes Instrument unter Verwendung einer mit der Hand gehaltenen Sonde.
  • 7A zeigt die Verwendung einer ladungsgekoppelten Vorrichtungsanordnung (CCD), die zur Ermittlung von Emissionen von einer großen Vielzahl von Bindungsstellen verwendet wird.
  • 7B zeigt die CCED-Anordnung bei Verwendung in Verbindung mit einer Linsenanordnung.
  • 8 zeigt eine Ausführungsform unter Verwendung von optischem Einschluß.
  • 9 zeigt schematisch eine Farbstoffbeschichtung und Einkapselung eines Up-Converting-Phosphorteilchens.
  • 10 zeigt schematisch eine Vorrichtung zur Bestimmung der Teilchengeschwindigkeit und Hydrodynamik- oder Aerodynamikeigenschaften eines Ziels.
  • 11 ist ein Phosphor-Emissionsspektrum von Natrium-Yttriumfluorid-Ytterbium/Erbium-Up-Converting-Phosphor mit einer Erregungslaserquelle bei einem Wellenlängenmaximum von 977,2 nm, Emissionsmaximum ist etwa 541,0 nm.
  • 12 ist ein Erregungsraster des Natrium-Yttrium-Fluorid-Ytterbium/Erbium-Phosphor Erregungsspektrums mit Emission-Sammelfenstersatz bei 541,0 nm.
  • 13 ist eine Zeitabnahmemessung der Phosphorlumineszenz bei 541 nm nach Beendigung der Erregungsbeleuchtung für Natrium-Yttrium-Fluorid-Ytterbium/Erbium-Phosphor.
  • 14 zeigt die Phosphor-Emissionsintensität als eine Funktion der Erregungslichtintensität für Natrium-Yttrium-Fluorid-Ytterbium/Erbium-Phosphor.
  • 15 zeigt den wirksamen Querschnitt bei Phosphoreszenz mit einzelnem Photon für Teilchen von Na(Y0,8Yb0,12E0,08)F4 mit 0,3 μm nach Erregung mit 200 W/cm2 bei 970 nm.
  • 16 zeigt die Größenabhängigkeit von Phosphoreszenz-Querschnitt für Na(Y0,8Yb0,12Er0,08)F4-Teilchen.
  • 17A zeigt ein Fluoreszenzraster eines Up-Converting-Phosphor-Reporter-Moleküls in Hepes-gepufferter Kochsalzlösung, induziert durch Erregung mit einer 970-nm-Laserquelle.
  • 17B zeigt ein Raster eines Fluoreszenzspektrums eines Up-Converting-Phosphor-Reporter-Moleküls, beschichtete mit Streptavidin in Hepes-gepufferter Kochsalzlösung, induziert durch Erregung mit einer 970-nm-Laserquelle.
  • 18A zeigt ein Erregungsspektrumraster eines Up-Converting-Phosphor-Reporter-Moleküls in Hepes-gepufferter Kochsalzlösung mit monochromatischer Feststellung von Emission bei 541 nm.
  • 18B zeigt ein Erregungsspektrumraster eines Up-Converting-Phosphor-Reporter-Moleküls, beschichtet mit Streptavidin in Hepes-gepufferter Kochsalzlösung mit monochromatischer Feststellung der Emission bei 541 nm.
  • 19 zeigt das integrierte Signal, das man von Proben von (Y0,86Yb0,08Er0,06)2O2S erhält, was die Beziehung zwischen Phosphorkonzentration und Up-Converted-Signal zeigt.
  • 20 zeigt schematisch eine Ausführungsform eines Sandwich-Immunoassays zur Feststellung eines Analyten in einer Lösung durch Bindung des Analyten (zum Beispiel eines Antigenziels) an einen biotinylierten Antikörper und an einen immobilisierten Antikörper, wobei der Analyt einen Sandwich-Komplex bildet, der auf einem festen Substrat von superparamagnetischen Mikroperlen immobilisiert ist, und
  • 21 zeigt schematisch Feststellung und Unterscheidung zweier Antigen-Zelloberflächen mit spezifischen Antikörpern, die mit zwei Phosphoren mit bestimmten Phosphoreszenzeigenschaften markiert sind.
  • 22 zeigt ein Schema einer Apparatur für phasenempfindliche Feststellung.
  • 23 zeigt ein Schema eines kompetitiven homogenen Assays unter Verwendung von Phosphoren als Markierung und Faseroptikbeleuchtung bei einer einfachen Oberfläche.
  • 24 zeigt ein Schema eines kompetitiven homogenen Antigeneinfangens unter Verwendung von Phosphoren als Markierungen und eines konvergierenden Beleuchtungsstrahls, fokussiert auf die Einfangoberfläche.
  • 25 zeigt ein Schema eines homogenen immunopräzitativen Assays unter Verwendung von Phosphoren als Markierungen und eines konvergierenden Beleuchtungsstrahls, fokussiert auf die Einfangoberfläche, in der die Einsammeloberfläche Immunopräzitate sammelt.
  • Beschreibung spezieller Ausführungsformen
  • Definitionen
  • Wenn nichts anderes angegeben ist, haben hier alle verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe gleiche Bedeutung, wie sie üblicherweise von einem Fachmann auf diesem Gebiet, zu dem die Erfindung gehört, verstanden werden. Obwohl irgendwelche Methoden und Materialien ähnlich oder äquivalent zu jenen sein können, die hier beschrieben sind, in der Praxis oder am Testen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind doch die bevorzugten Methoden und Materialien beschrieben. Für Zwecke der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Begriffe nachfolgend definiert.
  • Wenn hier verwendet, bezeichnet „Markierung" einen chemischen Substituenten, der unter geeigneten Erregungsbedingungen ein feststellbares optisches Signal erzeugt. Das optische Signal, produziert durch eine erregte Markierung ist typischerweise elektromagnetische Strahlung in dem Gebiet nahe Infrarot, dem sichtbaren oder ultraviolettanteiligen des Spektrum. Die Markierungen nach der Erfindung sind Up-Converting, was bedeutet, daß der chemische Substituent wenigstens zwei Photonen bei einer Erregungsbestimmung absorbiert und anschließend elektromagnetische Energie bei einer Emissionsfrequenz emittiert, die höher als die Erregungsfrequenz ist. Somit besteht generell ein signifikanter Stokes-Shift zwischen der ursprünglichen Erregungsfrequenz und der endgültigen Emissionsfrequenz. Die Markierung ist allgemein an eine Sonde gebunden, um als ein Reporter-Molekül zu dienen, welches das Vorhandensein und/oder die Örtlichkeit der Probe anzeigt. Die Erfindung schließt anorganische Up-Converting-Phosphor-Markierungen ein, doch verwendet sich vorzugsweise organische Up-Converting-Lanthaniden-Phosphore als Markierungen. So ist eine typische Markierung der Erfindung ein Up-Converting-Lanthaniden-Phosphorteilchen in Submikrongröße.
  • Wenn hier verwendet, bedeutet eine „Sonde" eine Bindungskomponente, die bevorzugt an ein oder mehrere Zielgruppen bindet (zum Beispiel an Antigene, Epitope, Polynukleotidsequenzen, makromolekulare Rezeptoren) mit einer Affinität, die ausreicht, eine Unterscheidung zwischen einer an das Ziel gebundenen markierten Sonde von unspezifisch gebundener markierter Sonde zu treffen (d. h. Hintergrund). Allgemein ist die Sonden-Zielbindung eine nicht-kovalente Wechselwirkung mit einer Bindungsaffinität (KD) von wenigstens etwa 1 × 106 M–1, vorzugsweise mit wenigstens 1 × 107 M–1 und stärker bevorzugt mit einer Affinität von wenigstens 1 × 108 M–1 oder mehr. Antikörper haben typischerweise eine Bindungsaffinität für verwandte Antigene von etwa 1 × 1010 M–1 oder mehr. Beispielsweise, aber nicht beschränkend, beinhalten die Sonden nach der Erfindung: Antikörper, Polypeptidhormone, Polynukleotide, Streptavidin, Staphylococcus aureus Protein A, Rezeptorliganden zum Beispiel Steroid- oder Polypeptidhormone), Leucin-Zipper-Polypeptide, Lectine, Antigene (Polypeptide, Kohlenhydrate, Nukleinsäure und Haptenepitope) und andere.
  • Wenn hier verwendet, bedeuten ein „Sonden-Markierungskonjugat" und „markierte Sonde" eine Kombination, die eine an eine Sonde gebundene Markierung umfaßt. Bei bestimmten Ausführungsformen kann mehr als ein Markierungssubstituent an einer Sonde haften. Alternativ kann in einigen Ausführungsformen mehr als eine Sonde an einer Markierung (zum Beispiel Mehrfach-Antikörpermoleküle können an eine anorganische Up-Converting-Phosphorperle von Submikrongröße angeheftet werden). Verschiedene chemische Arten von Anheftung können verwendet werden, um eine Markierung an einer Sonde zu befestigen, einschließlich, doch nicht darauf beschränkt, die Bildung von kovalenten Bindungen, Wasserstoffbindungen, ionische Bindungen, elektrostatische Wechselwirkungen und Oberflächenspannungs-(Phasengrenzen)Wechselwirkungen. Bindung von Markierung können auch die Einarbeitung der Markierung in oder auf Mikrokugeln, Mikroteilchen, Immunoperlen und superparamagnetischen magnetischen Perlen (Polysciences, Inc., Warrington, Pennsylvania; Bangs Laboratories, Inc. 979 Keystone Way, Carmel, IN 46032). Beispielsweise können anorganische Up-Converting-Phosphorteilchen in Mikrokugeln eingekapselt werden, die aus Polymermaterial bestehen, welches im wesentlichen transparent oder durchscheinend in den Wellenlängenbereichen der Erregung ist und elektromagnetische Strahlung emittiert (US-PS-5,132,242).
  • Solche Mikrokugeln können durch Oberflächenderivatisierung mit einer oder mehreren reaktiven Gruppen (zum Beispiel Carboxylat, Amino, Hyroxylat oder Polyacrolein) für kovalente Bindung an eine Sonde funktionieren, wie ein Protein. Sonden-Markierungskonjugate können auch ein Phosphorchelat umfassen.
  • Wenn hier verwendet, bedeuten die Begriffe „Ziel" und „Zielanalyt" die Aufgabe(n), daß nach den Methoden dieser Erfindung getestet wird. Beispielsweise, aber nicht ausschließlich können Targets Polypeptide (zum Beispiel hGH, Insulin, Albumin), Glycoproteine (zum Beispiel Immunoglobuline, Thrombomodulin, γ-Glutamyltranspeptidase; Goodspeed et al. (1989), Gene 76: 1), Lipoproteine, Viren, Mikroorganismen (zum Beispiel pathogene Bakterien, Hefen), Polynukleotide (zum Beispiel zelluläre Genome DNA, RNA in einer fixierten histologischen Probe für Hybridisierung in situ, DNA oder RNA, auf einer Nylon- oder Nitrozellulosemembran immobilisiert, virale DNA oder RNA in einem Gewebe oder biologischem Fluid) Pharmazeutika (d. h. vorgeschrieben oder Arzneimittel über den Ladentisch, die in Physicians Drug Refernce und/oder Merck Manuel aufgelistet sind, oder illegale Substanzen, wie rauscherzeugende Stoffe oder anabolische Steroide).
  • Wenn hier verwendet, bezeichnet der Begriff „Antikörper" ein Protein, das aus einem oder mehreren Polypeptiden besteht, die im wesentlichen durch Immunoglobulingene codiert sind. Die bekannte Immunoglobulingene schließen Kappa, Lambda, Alpha, Gamma (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), Delta, Epsilon und My Gene mit konstantem Bereich sowie die Myriade von Immunoglobulingenen mit variablem Bereich ein. Immunoglobulin voller Länge, „leichte Ketten" (etwa 25 Kd oder 214 Aminosäuren) sind durch ein Gen mit variablem Bereich am NH2-Terminus (etwa 110 Aminosäuren) und ein Kappa- oder Lambda-Gen konstanten Bereichs bei dem COOH-Terminus codiert. Immunoglobulin „schwere Ketten" (etwa 50 kD oder 464 Aminosäuren) mit voller Länge sind ähnlich durch ein Gen mit variablem Bereich (etwa 116 Aminosäuren) und einem der anderen oben erwähnten Gene mit konstantem Bereich, zum Beispiel Gamma (codierend mit etwa 330 Aminosäuren) codiert. Eine Form von Immunoglobulin stellt die Grundstruktureinheit eines Antikörpers dar. Diese Form ist ein Tetramer und besteht aus zwei identischen Paaren von Immunoglobulinketten, wobei jedes Paar eine leichte und eine schwere Kette besitzt. In jedem Paar sind die leichte und schwere Kette varia ble Bereiche zusammen verantwortlich für die Bindung an ein Antigen, und die konstanten Bereiche sind verantwortlich für die Antikörper-Effektorfunktionen. Außer Antikörpern können Immunoglobuline in verschiedenen anderen Formen vorkommen, einschließlich beispielsweise als Fv, FaB und F(ab')2 sowie als bifunktionale Hybrid-Antikörper (zum Beispiel Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987)) und in Einzelketten (zum Beispiel Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85, 5879–5888 (1988) und Bird et al., Science, 242, 423–426 (1988)). (Siehe allgemein Hood et al., „Immunology", Benjamin, N.Y., 2te Auflage (1984) und Hunkapiller und Hood, Nature, 323, 15–16 (1986)) – So sind nicht alle Immunoglobuline Antikörper (siehe U.S.S.N. 07/634,278 (1991) Proc. Ntl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88: 2869).
  • Wenn hier verwendet, bedeutet „Sonden-Polynukleotid" ein Polynukleotid, das spezifisch zu einem vorbestimmten Ziel Polynukleotid hybridisiert. Beispielsweise, aber nicht ausschließlich kann ein Sonden-Polynukleotid ein Abschnitt einer cDNA, die zu einer bestimmten mRNA-Sequenz gehört, eines Genomklons, eines synthetischen Oligonukleotids mit ausreichender Sequenzhomologie zu einer bekannten Zielsequenz (zum Beispiel einer Telomersequenz TTAGGG oder einer Alu-Wiederholungssequenz) für spezifische Hybridisierung, eine transkribierte RNA (zum Beispiel aus einem SP6-Klonungsvektoreinsatz) oder einer Polyamidnukleinsäure (Nielsen et al. (1991) Science 254: 1497) sein. Verschiedene Ziel-Polynukleotide können durch Hybridisierung eines markierten Sonden-Polynukleotids zu der oder den Zielsequenzen) ermittelt werden. Beispielsweise, doch nicht beschränkend, können Zielsequenzen sein: Genomsequenzen (zum Beispiel strukturelle Gene, wiederholte Chromosomensequenzen, reguläre Sequenzen usw.), RNA (zum Beispiel mRNA, hnRNA, rRNA, usw.), pathogene Sequenzen (zum Beispiel Virus- oder Mycoplasma-DNA- oder -RNA-Sequenzen) oder Transgensequenzen.
  • „Spezifische Hybridisierung" wird hier als die Bildung von Hybriden zwischen einem Sonden-Polynukleotid und einem Ziel-Polynukleotid definiert, worin das Sonden-Polynukleotid bevorzugt mit der Ziel-DNA hybridisiert, so daß beispielsweise wenigstens eine einzelne Bande auf einem Southern-Flecken von DNA, hergestellt aus eukariotischen Zellen, die die Ziel-Polynukleotidsequenz enthalten, identifiziert werden kann und/oder ein Sonden-Polynukleotid in einem intakten Kern eine einzelne Chromosomenörtlichkeit lokalisiert, die für eine einzige oder wiederholte Sequenz charakteristisch ist. In einigen Fällen kann eine Zielsequenz in mehr als einer Ziel-Polynukleotidart vorliegen (zum Beispiel eine spezielle Zielsequenz kann in mehreren Gliedern einer Genfamilie oder in einer bekannten Wiederholungssequenz auftreten). Es ist ersichtlich, daß optimale Hybridisierungsbedingungen in Abhängigkeit von der Sequenzzusammensetzung und Länge des Ziel-Polynukleotids oder der Ziel-Polynukleotide sowie des Ziels oder der Ziele und der von dem Bearbeiter ausgewählten experimentellen Methode variiert. Verschiedene Richtlinien können angewendet werden, um geeignete Hybridisierungsbedingungen zu wählen (siehe Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989), 2te Auflage, Cold Spring Harbor, N.Y. und Berger und Kimmel, Methods in Enzymology, Band 152, Guide to Molecular cloning Techniques (1987), Academic Press, Ind., San Diego, CA., Dunn et al. (1989) J. Biol. Chem. 264: 1305 und Goodspeed et al., (1989) Gene 76: 1).
  • Wenn hier verwendet, bedeutet der Begriff „Markierungs-Erregungswellenlänge" eine elektromagnetische Strahlungswellenlänge, die, wenn von einer Up-Converting-Markierung absorbiert, eine ermittelbare fluoreszierende Emission von der Up-Converting-Markierung erzeugt, wobei die Fluoreszierende Emission eine kürzere Wellenlänge (d. h. eine Bestrahlung mit höherer Frequenz) als die Markierungs-Erregungswellenlänge hat. Wenn hier verwendet, bedeutet der Begriff „Markierungs-Emissionswellenlänge" eine Wellenlänge, die von einer Up-Converting-Markierung anschließend an oder gleichzeitig mit Beleuchtung der Up-Converting-Markierung mit einer oder mehreren Erregungswellenlängen emittiert wird. Markierungs-Emissionswellenlängen von Up-Converting-Markierungen sind kürzer (d. h. Strahlung mit höherer Frequenz) als die entsprechenden Erregungs-Wellenlängen. Beide, die Markierungs-Erregungswellenlängen und die Markierungs-Emissionswellenlängen, sind charakteristisch für einzelne Up-Converting-Markierungsarten und werden leicht durch einfache Erregungs- und Emissionsabtastung bestimmt.
  • Erfindungsüberblick
  • Die vorliegende Erfindung befaßt sich mit fluoreszierenden Markierungen, die durch eine Erregungswellenlänge erregt werden und anschließend elektromagnetische Strahlung bei Frequenzen aufwärts bis zum Shiften (d. h. bei höheren Frequenzen als die Erregungsstrahlung) emittieren.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Markierungen, die anorganische Up-Converting-Phosphore für verschiedene Anwendungen bereitgestellt. Die Up-Converting-Markierungen nach der Erfindung können an eine oder an mehrere Sonden gebunden werden, um als ein Reporter-Molekül (d. h. ein feststellbarer Marker) der Örtlichkeit der Sonde(n) zu dienen. Die Up-Converting-Markierungen können auf verschiedenen Sonden befestigt werden, wie auf Antikörpern, Streptavidin, Protein A, Polypeptidliganden von zellulären Rezeptoren, Polynukleotidsonden, Arzneimitteln, Antigenen, Toxinen und anderen. Die Befestigung der Up-Converting-Markierung an der Sonde kann unter Verwendung verschiedener chemischer Vernetzungen erfolgen, je nach der Natur der speziellen Sonde. Beispielsweise, aber nicht ausschließlich, können mikrokristalline Up-Converting-Lanthanid-Phosphorteilchen mit einer Polycarbonsäure (zum Beispiel Addition XW 330, Hoechst, Frankfurt, Deutschland) während des Vermahlens beschichtet werden, und verschiedene Proteine (zum Beispiel Immunoglobulin, Streptavidin oder Protein A) können physikalisch auf der Oberfläche des Phosphorteilchens adsorbiert werden (Beverloo et al. (1991), siehe oben).
  • Alternativ können für verschiedene anorganische Phosphore Beschichtungstechniken angewendet werden, einschließlich, doch nicht unter Beschränkung hierauf, der folgenden: Sprühtrocknen, Plasmaabscheidung und Derivatisierung mit funktionellen Gruppen (zum Beispiel -COOH, -NH2, -CONH2), die mit einem Silankupplungsmittel an -SiOH-Reste gebunden werden, die auf dem Phosphorteilchen oder in ein vitrokeramisches Phosphorteilchen eingearbeitet werden, wobei letztere Siliziumoxid(e) und Up-Converting-Phosphorzusammensetzungen enthalten. Vitrokeramische Phosphorteilchen können beispielsweise mit Aminopropyltriethoxysilan zum Zwecke einer Bindung von Aminogruppen an die vitrokeramische Oberfläche auf Vernetzermolekülen laminiert werden, doch können auch andere Omega-funktionalisierte Silane substituiert werden, um alternative funk tionelle Gruppen daran zu binden. Sonden, wie Proteine oder Polynukleotide, können dann direkt an den vitrokeramischen Phosphor durch kovalente Bindung angesetzt werden, wie beispielsweise durch Siloxanbindungen oder durch Kunststoff-Kohlenstoffbindungen an Vernetzermoleküle (zum Beispiel organo-funktionelle Syllierungsmittel), die kovalent an die Oberfläche eines Phosphorteilchens gebunden oder dort absorbiert werden.
  • Mikrokristalline Up-Converting-Phosphorteilchen sind typischerweise kleiner als 3 Mikron im Durchmesser, vorzugsweise kleiner als etwa 1 Mikron im Durchmesser (d. h. unter Mikron), und stärker bevorzugt 0,1 bis 0,3 Mikron oder weniger im Durchmesser. Es ist allgemein am meisten bevorzugt, daß die Phosphorteilchen so klein wie möglich sind, während ausreichend Quantenumwandlungsausbeute beibehalten wird, um ein feststellbares Signal zu erzeugen. Für eine spezielle Anwendung jedoch sollte die Größe des oder der Phosphorteilchen, die zu verwenden sind, nach der Entscheidung des Anwenders ausgewählt werden. Beispielsweise können einige Anwendungen (zum Beispiel die Ermittlung eines nicht reichlichen Zelloberflächen-Antigens) eine äußerst empfindliche Phosphormarkierung erfordern, die nicht klein zu sein braucht, aber hohe Umwandlungswirksamkeit und/oder Absorptionsquerschnitt haben muß, während andere Anwendungen (zum Beispiel Ermittlung eines reichlich vorhandenen Kern-Antigens in einer durchdrungenen Zelle) ein sehr kleines Phosphorteilchen erfordern können, welches leicht in unterzellulären Strukturen diffundieren und sie durchdringen kann, welches aber keine hohe Umwandlungseffizienz zu haben braucht. Daher ist die optimale Größe von anorganischen Phosphorteilchen anwendungsabhängig und wird von dem Verwerter auf der Basis der Quantenausbeutedaten für die verschiedenen Phosphore nach der Erfindung ausgewählt. Solche Umwandlungseffizienzdaten können von verfügbaren Quellen (zum Beispiel Handbüchern und Veröffentlichungen) erhalten werden oder können durch Erzeugung einer Standardisierungskurve für die Messung der Umwandlungsquantenausbeute als eine Funktion der Teilchengröße erhalten werden. In einigen Anwendungen, wie jenen, die eine äußerst empfindliche Ermittlung kleiner Phosphorteilchen erfordern, werden vorzugsweise Infrarot-Laserdioden als eine Erregungsquelle ausgewählt.
  • Obwohl die Eigenschaften der Up-Converting-Phosphore in Einzelheiten in einem späteren Abschnitt beschrieben werden, ist es brauchbar, die auftretenden Grundmechanismen aufzuzeigen. Up-Conversion erwies sich als in bestimmten Materialien auftretend, die Ionen Seltner Erden in bestimmten Kristallmaterialien enthalten. Beispielsweise wirken Ytterbium und Erbium als ein Aktivatorpaar in einem Phosphor-Wirtsmaterial, wie Barium-Yttriumfluorid. Die Ytterbiumionen wirken als der Absorber und überführen Energie nicht durch Strahlung, um Erbiumionen zu erregen. Die Emission ist somit charakteristisch für den Energieinhalt des Erbiumions.
  • Mikrokristalline Up-Converting-Phosphore
  • Obwohl die Erfindung mit verschiedenen anorganischen Up-Converting-Phosphoren durchgeführt werden kann, wird doch angenommen, daß die bevorzugte(n) Ausführungsform(en) einen oder mehrere Phosphore verwenden, die sich von einem mehrerer verschiedener Phosphorwirtsmaterialien herleiten, von denen jedes mit wenigstens einem Aktivatorpaar dotiert ist. Geeignete Phos phorwirtsmaterialien sind beispielsweise: Natrium-Yttriumfluorid (NaYF4), Lanthanfluorid (LaF3), Lanthanoxysulfid, Yttriumoxysulfid, Yttriumfluorid (YF3), Yttriumgallat, Yttriumaluminiumgranat, Gadoliniumfluorid (GdF3), Barium-Yttriumfluorid (BaYF5, BaY2F8) und Gadoliniumoxysulfid. Geeignete Aktivatorpaare werden aus Ytterbium/Erbium, Ytterbium/Tthulium und Ytterbium/Holmium ausgewählt. Andere geeignete Aktivatorpaare für Up-Conversion können auch verwendet werden. Durch Kombination dieser Wirtsmaterialien mit den Aktivatorpaaren werden wenigstens drei Phosphore mit wenigstens drei unterschiedlichen Emissionsspektren (rotes, grünes und blaues sichtbares Licht) vorgesehen. Allgemein ist der Absorber Ytterbium, und das emittierende Zentrum kann unter Erbium, Holmium, Terbium und Thulium ausgewählt werden. Andere Up-Converting-Phosphore nach der Erfindung können andere Absorber und/oder Emitter enthalten. Das Molverhältnis von Absorber zu emittierendem Zentrum ist typischerweise wenigstens etwa 1 : 1, häufiger wenigstens etwa 3 : 1 bis 5 : 1, bevorzugt wenigstens etwa 8 : 1 bis 10 : 1, stärker bevorzugt wenigstens etwa 11 : 1 bis 20 : 1 und typisch geringer als etwa 250 : 1, gewöhnlich weniger als etwa 100 : 1 und noch üblicher geringer als etwa 50 : 1 bis 25 : 1, obwohl verschiedene Verhältnisse von dem Anwender auf der Basis erwünschter Charakteristiken ausgewählt werden können (zum Beispiel chemische Eigenschaften, Herstellungseffizienz, Absorptionsquerschnitt, Erregungs- und Emissionswellenlängen, Quantenausbeute oder andere Betrachtungen). Das oder die ausgewählte(n) Verhältnis(se) hängen allgemein auch von den speziell ausgewählter Absorber-Emitter-Paaren ab und können aus Bezugswerten gemäß den gewünschten Eigenschaften berechnet werden.
  • Das optimale Verhältnis von Absorber (zum Beispiel Ytterbium) zu dem emittierenden Zentrum (zum Beispiel Erbium, Thulium oder Holmium) variiert je nach dem speziellen Absorber/Emitterpaar. Beispielsweise ist das Absorber : Emitter-Verhältnis für Yb : Er-Paare typischerweise im Bereich von etwa 20 : 1 bis etwa 100 : 1, während das Absorber : Emitter-Verhältnis für Yb : Tm und Yb : Ho-Paare typischerweise im Bereich von etwa 500 : 1 bis etwa 2000 : 1 beträgt. Diese verschiedenen Verhältnisse sind den unterschiedlichen passenden Energieinhalten von Er, Tm oder Ho in Bezug auf den Energieinhalt des Yb in dem Kristall zuzuschreiben. Für die meisten Anwendungen können Up-Converting-Phosphore bequemerweise etwa 10 bis 30% Yb und entweder etwa 1 bis 2% Er, etwa 0,1 bis 0,05% Ho oder etwa 0,1 bis 0,05% Tm umfassen, obwohl auch andere Formulierungen verwendet werden können.
  • Einige Ausführungsformen der Erfindung verwenden anorganische Phosphore, die optimal durch Infrarotstrahlung von etwa 950 bis 1000 nm, vorzugsweise etwa 960 bis 980 nm erregt werden. Beispielsweise, aber nicht einschränkend zeigt ein mikrokristalliner anorganischer Phosphor der Formel YF3:Yb0,10Er0,01 ein Lumineszenzintensitätsmaximum bei einer Erregungswellenlänge von etwa 980 nm. Anorganische Phosphore nach der Erfindung haben typischerweise Emissionsmaxima, die im sichtbaren Bereich liegen. Beispielsweise haben spezielle Aktivatorpaare charakteristische Emissionsspektren: Ytterbium-Erbium-Paare haben Emissionsmaxima im roten oder grünen Bereich des sichtbaren Spektrums, je nach dem Phosphorwirt, Ytterbium-Holmium-Paare emittieren allgemein maximal im grünen Bereich, Ytterbium-Thulium haben typischerweise ein Emissionsma ximum im blauen Bereich und Ytterbium-Terbium emittieren gewöhnlich maximal im grünen Bereich. Beispielsweise emittiert Y0,08Yb0,19Er0,01F2 maximal im grünen Bereich des Spektrums.
  • Obwohl anorganische Up-Converting-Phosphorkristalle verschiedener Formeln geeignet für die Verwendung bei der Erfindung sind, sind die folgenden Formeln, die beispielsweise und nicht als Beschränkung der Erfindung angegeben sind, allgemein geeignet:
    Na(YxYbyErz)F4: x ist 0,7 bis 0,9, y ist 0,09 bis 0,29 und z ist 0,05 bis 0,01;
    Na(YxYbyHoz)F4: x ist 0,7 bis 0,9, y ist 0,09995 bis 0,2995 und z ist 0,0005 bis 0,001 und
    Na(YxYbyTmz)F4: x ist 0,7 bis 0,9, y ist 0,0995 bis 0,2995 und z ist 0,0005 bis 0,001.
    (YxYbyErz)O2S: x ist 0,7 bis 0,9, y ist 0,05 bis 0,12, z ist 0,05 bis 0,12.
    (Y0,86Yb0,08Er0,06)2O3 ist ein relativ effizientes Up-Converting-Phosphormaterial.
  • Beispielhaft, aber nicht zur Beschränkung der Erfindung lumineszieren Ytterbium(Yb)-Erbium(Er)-dotierte Yttriumoxysulfide im grünen Bereich nach Erregung bei 950 nm. Diese sind nicht-lineare Phosphore, indem Ytterbium als eine „Antenne" (Absorber) für zwei 950 nm-Photonen wirkt und seine Energie auf Erbium überträgt, welches als ein Emitter (Aktivator) wirkt. Die kritische Korngröße des Phosphors ist durch die Quantenausbeute für grüne Emission und den Dotiergehalt für Yb und Er, der allgemein im Bereich von etwa 1 bis 10%, gewöhnlicher im Bereich von etwa 2 bis 5% liegt, gegeben. Ein typischer Yb : Er-Phosphorkristall umfaßt etwa 10 bis 30% Yb und etwa 1 bis 2% Er. Somit gewährleistet ein Phosphorkorn, das mehrere tausend Formeleinheiten enthält, die Emission wenigstens eines oder mehrerer Photonen während einer typischen Laserbestrahlungszeit. Die nicht-lineare Beziehung zwischen Absorption und Emission zeigt jedoch, daß intensive Beleuchtung an der oder den Erregungswellenlänge(n) erforderlich sein kann, um ein zufriedenstellendes Signal in Ausführungsformen zu erhalten, die sehr kleine Phosphorteilchen (d. h. geringer als etwa 0,3 μm) verwenden. Außerdem ist es gewöhnlich erwünscht, die Dotiergehalte von Aktivator/Emitter-Paaren zu steuern, um sehr kleine Phosphorteilchen zu produzieren und so die Umwandlungsquantenausbeute zu maximieren.
  • Anorganische mikrokristalline Phosphore mit Seltenen Erden als Aktivatoren haben allgemein schmale Absorptions- und Linienemissionsspektren. Die Linienemissionsspektren beruhen auf f-f-Übergängen in dem Ion der Seltenen Erde. Diese sind abgeschirmte innere Übergänge, die zu einer Emission schmaler Linien führen.
  • Bei bestimmten Anwendungen, wie wenn sehr empfindliche Ermittlung erforderlich ist, kann intensive Beleuchtung durch gewerblich verfügbare Quellen, wie Infrarotlaserquellen (zum Beispiel Halbleiterlaserdioden mit kontinuierlicher Welle (CW) oder gepulst) vorgesehen werden. Beispielsweise bei Anwendungen, bei denen das mikrokristalline Phosphorteilchen sehr klein sein muß und die Umwandlungsquantenausbeute gering ist, kann intensive Laserbeleuchtung das Signal steigern und die Ermittlungszeiten verringern. Alternativ können einige Anwendungen der Erfindung Phosphorzusammensetzungen erfordern, die inhärent niedrige Umwandlungsquantenausbeuten (zum Beispiel niedrige Dotierkonzentrationen an Aktivator gekoppelt) haben, die aber andere erwünschte Charakteristiken besitzen (zum Beispiel Herstellungseffizienz, Leichtigkeit der Derivatisierung usw.). Solche Up-Converting-Phosphore niedriger Effizienz werden vorzugsweise mit Laserbeleuchtung bei einer Frequenz bei oder nahe (d. h. innerhalb etwa 25 bis 75 nm) einem Absorptionsmaximum des Materials erregt. Die Tatsache, daß kein anderes Licht in dem System erzeugt wird, als jenes von dem Up-Converting-Phosphor, erlaubt extrem empfindliche Signalermittlung, besonders wenn intensive Laserbeleuchtung als die Quelle der Erregungsstrahlung verwendet wird. So macht die einzigartige Eigenschaft der Up-Conversion von Photonenergie durch Up-Converting-Phosphore die Feststellung sehr kleiner Teilchen von mikrokristallinen anorganischen Phosphoren möglich. Für die praktische Anwendung von Phosphoren als ultraempfindliche Reporter-Moleküle, besonders als interzelluläre Reporter-Moleküle ist es wesentlich, daß die Korngröße des Phosphors so klein wie praktikabel (typischerweise kleiner als etwa 0,3 bis 0,1 μm) ist, wofür Laser-erregte Up-Converting-Phosphore gut geeignet sind.
  • Beispielsweise sind verschiedene Phosphormaterialzusammensetzungen, die für Up-Conversion für die Verwendung bei der Erfindung geeignet sind, in Tabellel aufgeführt.
  • Tabelle I: Phosphormaterialzusammensetzungen
    Figure 00200001
  • Zusätzlich zu den in Tabelle I gezeigten Materialien und Variationen hiervon können Aluminate, Phosphate und Vanadate geeignete Phosphorwirtsmaterialien sein. Im allgemeinen ist, wenn Silikate als ein Wirtsmaterial verwendet werden, die Umwandlungseffizienz relativ niedrig. Bei bestimmten Verwendungen können Hybrid-Up-Converting-Phosphorkristalle gewonnen werden (zum Beispiel durch Vereinigung eines oder mehrerer Wirtsmaterialien und/oder eines oder mehrerer Absorber-Ionen und/oder eines oder mehrerer Emitter-Ionen).
  • Herstellung anorganischer Phosphormarkierungen
  • Techniken und Methoden für die Herstellung anorganischer Phosphore sind in der Literatur beschrieben. UpConverting-Phosphorkristalle können nach Methoden hergestellt werden, die dem Fachmann aufgrund verschiedener publizierter Verfahren bekannt sind, wie beispielsweise, aber nicht ausschließlich durch die folgenden Literaturstellen: Yocom et al. (1971) Metallurgical Transactions 2: 763; Kano et al. (1972) J. Electrochem. Soc., Seite 1561; Wittke et al. (1972) J. Appl. Physics 43: 595; Van Uitert et al. (1969) Mat. Res. Bull. 4: 381. Andere Literaturstellen, die genannt werden können, sind: Jouart JP und Man G (1990) J. Luminescence 46: 39; McPherson GL und Meyerson SL (1991) Chem. Phys. Lett. (April) = Seite 325; Oomen et al. (1990) J. Luminescence 46: 353; NI H und Rand SC (1991) Optics Lett. 16 (September); McFarlane RA (1991) Optics Lett. 16 (September); Koch et al. (1990) Appl. Phys. Lett. 51: 1977: Lenth W und McFarlane RM (1990) J. Luminescence 45: 346; Hirao et al. (1991) J. Non-crystalline Solids 135: 90; McFarlane et al. (1988) Appl. Phys. Lett. 52: 1300.
  • Im allgemeinen werden anorganische Phosphorteilchen zu einer erwünschten Durchschnittsteilchengröße und Teilchengrößenverteilung mit herkömmlichen, im Stand der Technik bekannten Verkleinerungsmethoden vermahlen, einschließlich eines Vermahlens in einer herkömmlichen Kugelmühle mit Zirkonoxid- und/Aluminiumoxidkugeln während einer Zeitdauer von bis zu etwa 48 Stunden oder länger. Phosphorteilchen, die in Bindungsassays verwendet werden, haben typischerweise einen Durchmesser von 3,0 bis 0,01 μm (oder entlang der langen Achse, wenn nicht kugelförmig) gewöhnlich eine Größe von 2,0 bis 0,1 μm und bequemer eine Größe von etwa 1,0 bis 0,3 μm, obwohl größere oder kleinere Phosphorteilchen als diese Abmessungen bevorzugt für bestimmte Ausführungsformen sein können. Die Phosphorteilchengröße wird von dem Anwender auf der Basis der erwünschten Eigenschaften und gemäß den Richtlinien, die hier gegeben werden, ausgewählt. Fraktionen mit einem speziellen Teilchengrößenbereich können durch Sedimentation hergestellt werden, allgemein über eine längere Periode (d. h. einen Tag oder mehr) unter Entfernung der Fraktion mit dem erwünschten Teilchengrößenbereich nach der geeigneten Sedimentationszeit. Das Sedimentationsverfahren kann beispielsweise mit einem Horiba-Teilchenanalysator überwacht werden.
  • Phosphorteilchen können oberflächenaktiven Mitteln (zum Beispiel anionischen oberflächenaktiven Mitteln, wie Aerosol OT) während des Vermahlens oder nach dem Vermahlen beschichtet oder behandelt werden. Beispielsweise können Teilchen mit einer Polycarbonsäure (zum Beispiel Additon XW330, Hoechst, Frankfurt, Deutschland, oder Tamol, siehe Beverloo et al. (1992) siehe oben) während des Vermahlens beschichtet werden, um eine stabile wäßrige Suspension von Phosphorteilchen, typischerweise bei etwa pH 6 bis 8, zu erzeugen. Der pH-Wert einer wäßrigen Lösung von Phosphorteilchen kann durch Zugabe eines geeigneten Puffers und Titration mit Säure oder Base auf den erwünschten pH-Bereich eingestellt werden. Je nach der chemischen Natur der Beschichtung kann etwas Verlust an Umwandlungseffizienz des Phosphors als ein Ergebnis des Beschichtens auftreten, doch kann die in einer Lasererregungsquelle verfügbare Energie eine solche Verminderung der Umwandlungseffizienz kompensieren und geeignete Phosphoremission gewährleisten.
  • Im allgemeinen wird die Herstellung anorganischer Phosphorteilchen und die Bindung an Bindungsreagenzien im wesentlichen wie in Beverloo et al. (1992), siehe oben, und Hanks in der US-Patentschrift 5,043,2654 beschrieben, durchgeführt.
  • Häufig werden, wie bei Phosphoren mit einem Oxysulfidwirtsmaterial, die Phosphorteilchen vorzugsweise in einem polaren Lösungsmittel, wie Aceton oder DMSO und dergleichen, dispergiert, um eine im wesentlichen monodisperse Emulsion (zum Beispiel für eine Lagerlösung) zu erzeugen. Anteile der monodispersen Lagerlösung können weiter zu einer wäßrigen Lösung verdünnt werden (zum Beispiel einer Lösung von Avidin in gepuffertem Wasser oder gepufferter Salzlösung).
  • Bindungsassays
  • Up-Converting-Phosphore werden als Reporter-Moleküle (d. h. ermittelbare Marker) verwendet, um bindende Reagenzien entweder direkt oder indirekt für die Verwendung in Eindungs-Assays zu markieren, um das Vorhandensein von Analyt(en) in einer Probe zu ermitteln und zu quantifizieren. Bindungsreagenzien werden direkt durch Anbindung an Up-Converting-Reporter-Moleküle (zum Beispiel Oberflächenadsorption, kovalente Bindung) markiert. Bindungsreagenzien, die direkt markiert werden können, schließen die folgenden ein, sind aber hierauf nicht beschränkt: primäre Antikörper (d. h. die an einen Zielanalyten binden), sekundäre Antikörper (d. h. solche, die an einen primären Antikörper oder an eine Prothesegruppe binden, wie Biotin oder Digoxygenin), Staphylococcus aureus Protein A, Polynukleotide, Streptavidin und Rezeptorliganden. Bindungsreagenzien können auch indirekt markiert werden. So kann ein primärer Antikörper (zum Beispiel ein Kaninchen-Anti-Erb-B-Antikörper) indirekt durch nicht-kovalente Bindung an einen direkt markierten zweiten Antikörper indirekt markiert werden (zum Beispiel ein Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörper, zu einem anorganischen Up-Converting-Phosphor vernetzt). Quantitative Feststellung des Analyt-Sondenkomplexes kann in Verbindung mit geeigneter Kalibrierung des Assays für jede verwendete Sonde durchgeführt werden. Eine Sonde wird bequemerweise unter sättigenden Erregungsbedingungen, beispielsweise unter Verwendung einer Laserquelle oder fokussierter Diodenquelle für Erregungsbeleuchtung.
  • Spezielle Assays werden üblicherweise in homogene und heterogene Assays unterteilt. In einem homogenen Assay ist das durch die gebundene markierte Sonde emittierte Signal verschieden von dem durch die ungebundene markierte Sonde emittierten Signal, da beide ohne Notwendigkeit einer physikalischen Trennstufe unterschieden werden können. In heterogenen Assays ist das von den gebundenen und ungebundenen markierten Sonden emittierte Signal identisch, so daß die beiden physikalisch getrennt werden müssen, um zwischen ihnen zu unterscheiden. Der klassische heterogene spezifische Bindungsassay ist der Radioimmunoassay (RIA) (Yalow et al. (1978), Science 200: 1245, welche hier unter Bezugnahme eingearbeitet wird). Andere heterogene Bindungsassays sind beispielsweise der Radiorezeptorassay (Cuatrecases et al. (1974) Ann. Rev. Biochem. 43: 109), der Sandwich-Radioimmunoassay (US-Patent 4,376,110) und der Antikörper/Lectin-Sandwichassay ( EP 0 166 623 ).
  • Heterogene Assays sind gewöhnlich bevorzugt und sind allgemein empfindlicher und zuverlässiger als homogene Assays.
  • Ob nun ein Gewebeextrakt gemacht wird oder eine biologische Flüssigkeitsprobe verwendet wird, ist es oftmals erwünscht, die Probe in einem oder mehreren Verdünnungsmitteln zu verdünnen, die nicht wesentlich die anschließenden Assay-Prozeduren stören. Allgemein geeignete Verdünnungsmittel sind wäßrige Lösungen, die ein Puffersystem enthalten (zum Beispiel 50 mM NaH2PO4 oder 5–100 mM Tris, pH4 bis pH10), nicht störende ionische Stoffe (5–500 mM KCl oder NaCl oder Rohrzucker), und gegebenenfalls ein nicht-ionisches Detergens, wie Tween. Wenn die zu analysierende Probe an einem festen Träger fixiert wird, ist es gewöhnlich erwünscht, die Probe und den festen Träger vor dem Behandeln mit Sonde mit Verdünnungsmittel zu waschen. Die Probe, entweder direkt oder verdünnt, wird dann hinsichtlich des diagnostischen Analyten analysiert.
  • In der allgemeinen Methode der Erfindung wird ein Analyt in einer Probe ermittelt und quantifiziert, indem man die Probe mit einem Sonden-Markierungskonjugat in Berührung bringt, das spezifisch oder bevorzugt an einen Analyten unter Bildung eines gebundenen Komplexes bindet und dann die Bildung von gebundenem Komplex ermittelt, typischerweise durch Messung der Gegenwart von in den gebundenen Komplexen vorhandener Markierung. Ein Sonden-Markierungskonjugat kann ein direkt markiertes Analyt-Bindungsreagenz einschließen (zum Beispiel einen primären Antikörper, an einen Up-Converting-Phosphor gebunden) und/oder ein indirekt markiertes Analyt-Bindungsreagenz (zum Beispiel einen primär Antikörper, der von einem markierten zweiten Antikörper ermittelt wird, oder ein biotinyliertes Polynukleotid, das durch markiertes Streptavidin ermittelt wird). Der oder die gebundenen Komplex(e) werden typischerweise aus ungebundenen Sonden-Markierungskonjugaten vor der Ermittlung von Markierung isoliert, gewöhnlich durch Einarbeitung wenigstens einer Waschstufe, um so Hintergrundsignal zu entfernen, welches Markierung zuzuschreiben ist, die in ungebundenen Sonden-Markierungskonjugaten vorliegt. Es ist somit gewöhnlich erwünscht, Sonden-Markierungskonjugate mit der Analytprobe unter Bindungsbedingungen während einer geeigneten Bindungsdauer zu inkubieren.
  • Bindungsbedingungen variieren, je nach der Natur des Sonden-Markierungskonjugats, dem Zielanalyten und der speziellen Assaymethode. So werden Bindungsbedingungen gewöhnlich sich unterscheiden, wenn die Sonde ein Polynukleotid ist, das in einer Hybridisierung in situ in einem Northern- oder Southern-Blöcken oder Lösungshybridisier-Assay verwendet wird. Bindungsbedinungen werden auch sich unterscheiden, wenn die Sonde ein Antikörper ist, der in einer histologisch chemischen Anfärbemethode oder einer Western-Fleckenmethode in situ verwendet wird (Towbin et al. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 76: 4350).
  • Im allgemeinen werden die Bindungsbedingungen gemäß den allgemeinen Bindungsmethoden ausgewählt, die in der Technik bekannt sind. Beispielsweise, aber nicht als Beschränkung, werden die folgenden Bindungsbedingungen als allgemeine Richtschnur angegeben:
  • Für Antikörpersonden
    • 10–200 mM Tris, pH 6–8, gewöhnlich 100 mM Tris pH 7,5
    • 15–250 mM NaCl; gewöhnlich 150 mM NaCl
    • 0,01–0,5 Volumenprozent Tween 20
    • 1 Prozent Rinderserumalbumin
    • 4–37°C, gewöhnlich 4° bis 15°C.
  • Für Polynukleotidsonden
    • 3–10 × SSC, pH 6–8, gewöhnlich 5 × SSC, pH 7,5
    • 0–50 Prozent entionisiertes Formamid
    • 1–10 × Denharts Lösung
    • 0–1 Prozent Nariumdodecylsulfat
    • 10–200 μg/ml durch Scherkräfte denaturierte Lachssperma-DNA
    • 20–65°C, gewöhnlch 37–45°C für Polynukleotidsonden länger als 50 bp, gewöhnlich 55–65°C für kürzer Oligunukleotidsonden.
  • Weitere Beispiele für Bindungsbedingungen für Antikörper und Polynukleotide werden in verschiedenen Quellen angeboten, wie Maniatis et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual (1989), 2te Auflage, Cold Spring Harbor, N.Y. und Berger und Kimmel, Methods in Enzymology, Band 152, Führer für molekulare Klontechniken (1987), Academic Press, Inc., Sand Diego, CA; Young und Davis (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 80: '1194. Wenn die Sonde ein Rezeptorligand ist, wie IL-2, β-Interferon oder andere Polypeptidhormone, Cytokine oder Lymphokine, sind geeignete Bindungsbedingungen allgemein jene, die in der Technik zur Durchführung des betreffenden Rezeptor-Liganden Bindungsassays beschrieben sind.
  • Verschiedene Beispiele geeigneter Bindungsbedingungen, die in Immunoassays und Immunohistochemie brauchbar sind, sind beispielsweise in Harlow und Lane, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, New York (1988) diskutiert. Im allgemeinen schließen geeignete Bindungsbedingungen für immunologische Reaktionen einen wäßrigen Bindungspuffer ein, der ein Salz (zum Beispiel 5–500 mM NaCl oder KCl), einen Puffer (zum Beispiel Tris- oder Phosphatpuffer bei pH 4–10) und gegebenenfalls ein nicht-ionisches Detergens (zum Beispiel Tween) beinhaltet. Bei einigen Ausführungsformen können Proteinase-Inhibitoren oder Stabilisatoren enthalten sein. Die Bindungsreaktionen werden während einer geeigneten Bindungsdauer durchgeführt, welche für Antikörperreaktionen typischerweise wenigstens etwa 1 bis 5 Minuten, vorzugsweise wenigstens etwa 30 Minuten bis zu einigen Stunden brauchen, obwohl typischerweise weniger als etwa 24 Stunden, stärker bevorzugt weniger als etwa einige Stunden oder weniger ausreichen. Bindungsreaktionen (einschließlich Waschen) werden typischerweise in einem Temperaturbereich von etwa 0°C bis etwa 45°C, vorzugsweise von etwa 4°C bis etwa 20–25°C durchgeführt.
  • Bindungsassays, die Hybridisierung in situ, Bindungsassays in situ und immunohistochemische Anfärbung einschließen, werden gewöhnlich durchgeführt, indem man zunächst die Probe mit einer blockierenden oder vorhybridisierenden Lösung inkubiert, danach die Probe mit Sonde unter Bindungsbedingungen während einer geeigneten Bindungsperiode inkubiert, danach wäscht oder ungebundene Sonde anderweitig entfernt und schließlich das Vorhandensein, die Menge und/oder die Örtlichkeit von gebundener Sonde ermittelt. Die Stufe einer Ermittlung von gebundener Sonde kann ausgeführt werden, indem man die Markierung ermittelt, wenn die Sonde direkt markiert ist, oder die gebundenen Komplexe mit einem zweiten Bindungsreagenz (zum Beispiel Streptavidin) inkubiert, d. h. markiert und es an die Sonde bindet und so eine indirekte Markierung der Sonde bekommt.
  • Up-Converting-Markierungen werden an einer Sonde oder an Sonden oder an zweite Bindungsreagenzien, die spezifisch oder überwiegend an die Sonde(n) nach irgendeiner der verschiedenen hier diskutierten grundsätzlichen Methoden gebunden. Außerdem können Up-Converting-Phosphorteilchen in Mikrokugeln eingekapselt und mit einer Sonde (zum Beispiel einem speziellen Antigen oder Antikörper) für die Verwendung als eine markierte Sonde in einem immuno-diagnostischen Assay oder Nukleinsäure Hybridisierungs-Assay, um einen Analyten in einer Probe zu ermitteln, wie das Vorhandensein eines Antikörpers, Virus oder Antigens in einer Blutserumprobe, gemäß der Methode von Hari et al. (1990) Biotechniques 9: 342, beschichtet werden. Mirkoeinkapselung von Phosphor kann auf verschiedenen Wegen erfolgen, die in der Technik bekannt sind, einschließlich Beschichtung des Phosphors mit einer Monomerlösung und Polymerisieren des Monomers, um eine Polymerhülle zu erzeugen, die das Phosphorteilchen einhüllt. Phosphorteilchen, die in einer Polymerbeschichtung eingebettet sind, wie als ein Gelüberzug, können für kovalente Bindung an eine Bindungskomponente funktionalisiert werden (zum Beispiel mit Aminogruppen).
  • Ähnlich können Up-Converting-Phosphorteilchen mit Sonde direkt beschichtet werden entweder durch Oberflächenadsorption, durch mehrfache Wasserstoffbindung, durch elektrostatische Wechselwirkung durch Van der Walsche Bindung oder durch kovalente Bindung an eine funktionelle Gruppe auf einem funktionalisierten anorganischen Phosphorteilchen (zum Beispiel vitrokeramischer Phosphor), beispielsweise durch Binden an Aminosäureseitenkettenamin- oder -carboxylatgruppe auf einem Sondenprotein an eine Carboxylat- bzw. Amingruppe auf einem funktionalisierten Phosphorteilchen.
  • In bestimmten Ausführungsformen, wie dann, wenn sterische und/oder Ladungsstörung eines kompakten Up-Converting-Phosphorteilchens eine Bindung des angebundenen Bindungsreagenz an ein Ziel hemmt, ist es erwünscht, einen molekularen Abstandshalter zwischen dem Phosphorteilchen und dem Bindungsreagenz einzuarbeiten. Beispielsweise kann ein derivatisierter mikroeingekapselter Phosphor oder Vitrokeramikphosphor mit einem hetero-bifunktionellen Reagenz mit einem -(CH2)n-Abstandshalter, worin n gewöhnlich eine ganze Zahl von etwa 2 bis etwa 50 ist, zwischen funktionellen Endgruppen konjugiert werden, wenn n gewöhnlich eine ganze Zahl von etwa 2 bis etwa 50 zwischen funktionellen Endgruppen ist. Ähnlich können Phosphore direkt mit derivatisierenden Mitteln (zum Beispiel mit Omega-funktionalisierten Silanen) mit langen intramolekularen Abstandshalterketten, worin eine mit einem erwünschten Bindungsreagenz reaktive funktionelle Gruppe von der Oberfläche des Phosphors durch einen Abstandhalter von üblicherweise wenigstens etwa 15 Å (d. h. dem Äquivalent von etwa 10 geradkettigen-CH2-Gruppen). Bei einigen Ausführungsformen werden Etiketten durch Abstandshalterarme verschiedener Längen befestigt, um die potentielle sterische Hinderung zu reduzieren. Mehrfachschichten von Abstandshalterarmen können auch verwendet werden (zum Beispiel Mehrfachschichten von Streptavidin-Biotin-Verbund).
  • Mehrfach-Analyt-Ermittlung
  • Da Up-Converting-Phosphore auf der Basis der Erregungs- und/oder Emissionswellenlängenspektra unterschieden werden können, können Up-Converting-Phosphore verwendet werden, um mehrere Analytziele, wie beispielsweise Zelloberflächenantigene oder lösliche Makromoleküle, zu ermitteln.
  • Beispielsweise werden Streptavidin, Avidin oder ein anderes Bindungsmakromolekül (zum Beispiel Antidigoxigenin-Antikörper) jeweils an jedes der beiden verschiedenen Phosphore gebunden (erläuterungshalber sind diese hier als Phosphor #1 und Phosphor #2 bezeichnet), die sich in ihren Absorptions- und/oder Emissionsspektren unterscheiden, um so die Unterscheidung der beiden Phosphore auf der Basis der Absorptions- und/oder Emissionswellenlängen zu erleichtern. Beispielsweise kann ein Phosphor nach blau emittieren und der andere kann nach grün emittieren. Zum Beispiel und nicht als Beschränkung emittiert Na(Y0,80Yb0,18Er0,02)F4 vorherrschend im grünen Bereich und Na(Y0,73Yb0,27Tm0,001)F4 vorherrschend im blauen Bereich, und somit können diese beiden Phosphore auf der Basis ihrer phosphoreszierenden Emissionen auseinandergehalten werden. Statt dessen können zwei Phosphore im wesentlichen ähnliche Emissionsspektren erzeugen, können aber dabei unterschiedliche Erregungswellenlängen haben, die eine Basis für ihre Unterscheidung in Mehrfachanalyt Ermittlung erzeugen. Eine erste Bindungskomponente (zum Beispiel ein Antikörper), der spezifisch an einer ersten Analytart (zum Beispiel ein Lymphozyt-CD4-Antigen) bindet und Biotinylreste einführt, die durch Streptavidin-Phophor #1-Konjugate verwendet werden können, um quantitativ das Vorhandensein eines ersten Analyten in einer Probe (zum Beispiel einer Serumprobe) zu bestimmen, indem man die Phosphoreszenz von Phosphor #1 in Analyt bindende Komponentenkomplexe mißt. Eine zweite Bindungskomponente (zum Beispiel ein Sonden-Polynukleotid), die spezifisch an eine zweite Analytart (zum HIV-1-Folge) bindet und die Digoxygeninreste (zum Beispiel 11-UTP-Digoxygenin) einführt, die durch Antidigoxygenin-Phosphor 2 in Konjugation gebunden werden kann, kann zur quantitativen Bestimmung des Vorhandenseins eines zweiten Analyten in der Probe verwendet werden, indem man die Phosphoreszenz von Phosphor #2 in Analyt bindenden Komponentenkomplexen mißt. So können durch gleichzeitiges oder aufeinanderfol gendes Ermitteln der Gegenwart von Mehrfach-Phosphor-Reporter-Molekülen mit differenzierbaren Signalcharakteristiken mehrere Analyte quantitativ in einer einzigen Probe bestimmt werden.
  • Sandwich-Bindungsassay
  • Up-Converting-Phosphor-Markierungen können als Reporter-Moleküle für Sandwich-Bindungsassays verwendet werden (US-patent 4,376,110). Beispielsweise kann eine magnetische Perle, wie eine superparamagnetische Immunoperle oder ein funktionalisiertes magnetisierbares Polymerteilchen (Polysciences, Ind., Warrington, Pennsylvania) als das Festsubstrat dienen, welches eine immobilisierte erste Bindungskomponente (zum Beispiel einen Antikörper, ein Polynukleotid oder ein Lectin) besitzt, die an ein erstes Epitop (d. h. einen Bindungsort: eine antigene Determinante, ein Zuckerrest, ein chemischer Substituent oder eine Nukleotid-Sequenz) eines Analyten bindet. Der Analyt bindet an die erste Bindungskomponente und auch an eine zweite Bindungskomponente (zum Beispiel ein Antikörper, ein Lectin oder ein Polynukleotid), welche an e in zweites Epitop des Analyten bindet. So überbrückt der Analyt die beiden Bindungskomponenten unter Bildung eines Sandwich-Komplexes, der gegenüber dem festen Substrat immobilisiert wird. Die zweite Bindungskomponente hat typischerweise eine daran gebundene oder darin eingearbeitete Markierung, wie eine Biotinylgruppe, die an einen Streptavidin-beschichteten Up-Converting-Phosphor gebunden werden kann. Alternativ kann die zweite Bindungskomponente direkt an einen Up-Converting-Phosphor, wie über eine kovalente Bindung mit einem funktionalisierten vitrokeramischen Up-Converting-Phosphor, gebunden werden.
  • Der Sandwich-Komplex umfaßt die erste Bindungskomponente, einen Analyten, und die zweite Bindungskomponente, die entweder direkt oder indirekt mit einem Up-Converting-Reporter-Molekül markiert ist. Der Sandwich-Komplex ist somit auf dem festen Substrat immobilisiert, obwohl das feste Substrat selbst mobil sein kann (zum Beispiel ein superparamagnetisches Kügelchen, das in einem Probenschlamm zirkuliert). Das Vorhandensein und die Menge von Analyt(en) kann quantitativ durch Feststellung der Gegenwart von Up-Converting-Reporter-Molekül in Sandwich-Komplexen gemessen werden.
  • Beispielsweise kann ein festes Substrat mehrere bestimmte Arten von erster Verbindungskomponente haben (zum Beispiel eine Anordnung verschiedner Oligopeptide, die an einen festen Träger gebunden sind). Eine oder mehrere der Arten von erster Bindungskomponente können an einen speziellen Analyten (zum Beispiel einen Muskarin-Rezeptor) in einer Analytlösung binden, die in Berührung mit dem festen Träger steht. Bindung des Analyten an eine oder mehrere der ersten Bindungskomponentenarten können dann mit einer zweiten Bindungskomponente ermittelt werden (zum Beispiel einem Antimuskarin-Rezeptor-Antikörper), die mit einem Up-Converting-Phosphor (entweder direkt oder über einen biotinylierten sekundären Antikörper) markiert werden.
  • Feste Substrate können an eine erste Bindungskomponente gebunden werden, die mehr als einen bestimmten Analyten binden kann (zum Beispiel immunocross-reaktiv oder polyspezifisch sein kann) und/oder an mehrere bestimmte Analyten binden kann. Ähnlich können mehrere zweite Bindungskomponentarten verwendet werden, die an Spezifitäten für besondere Analyten verwendet werden. Wenn mehrere zweite Bindungskomponentarten verwendet werden, ist es typischerweise erwünscht, jede zweite Bindungskomponentenart mit einer einzigartigen Up-Conveting-Markierung zu markieren, die auf der Basis ihrer Absorptions- und/oder Emissionseigenschaften unterschieden werden kann.
  • Es ist möglich, unterschiedliche Absorber in Kombination mit verschiedenen Emittern zu verwenden, um eine Kollektion von Phosphoren mit mehreren unterscheidbaren Kombinationen von Erregungs- und Emissionsspektren zu produzieren. Beispielsweise, aber nicht beschränkend, können sechs unterscheidbare Phosphore aus zwei Absorbern und drei Emittern erzeugt werden. Ein erster Absorber, A1 hat eine Erregungswellenlänge von λA1, ein zweiter Absorber, A2, hat eine Erregungswellenlängen von λA2, ein erster Emitter, E1, hat eine Emissionslinie bei λE1, ein zweiter Emitter, E2, hat eine Emissionslinie bei λE2 und ein dritter Emitter, E3, hat eine Emissionslinie bei λE3. Die sechs Phosphore können differenziert werden, und das Signal aus jedem kann einzeln quantifiziert werden durch Beleuchtung der Probe mit einer Erregungswellenlänge λA1 und getrennte Feststellung der emittierten Strahlung bei λE1, λE2 und λE3 und durch getrenntes Beleuchten der Probe mit λA2 und getrennte Feststellung der emittierten Strahlung bei λE1, λE2 und λE3. Die Tabelle II zeigt die verschiedenen Absorber : Emitter-Kombinationen und ihre Erregungs- und Emissionswellenlängen.
  • Tabelle II
    Figure 00280001
  • Natürlich sind weitere Absorber : Emitter-Kombinationen möglich, um mehr als sechs unterscheidbare Phosphor-Markierungen zu bekommen.
  • Es ist auch möglich, feste Substrate unterschiedlicher Typen zu benutzen, die unterschieden werden können (zum Beispiel durch Größe, Farbe, Dichte, magnetische Eigenschaften, Form und Ladung), so daß eine spezielle Type von festem Substrat mit einer speziellen Art der ersten Bindungskomponente kombiniert wird.
  • Beispielsweise, aber nicht beschränkend, sind die folgenden kurzen drei Beispiele vorgesehen, um weitere mögliche Anwendungen der Mehrfachanalyt-Sandwich-Assay-Methode zu erklären.
  • Substratunterscheidung
  • Das folgende Beispiel beschreibt die Verwendung von unterscheidbaren Substrattypen, um das Vorhandensein spezieller Immunoglobulin Idiotypen in einer Probe (zum Beispiel einer Blutserumprobe, die von einem Patienten abgenommen wurde) zu ermitteln, die diagnostische Informatio nen über den Immunstatus eines Patienten (zum Beispiel ist ein Patient mit einem speziellen Antigen sero-reaktiv). Große supermagnetische Perlen werden zu einem immunogenen Herpesvirustyp II-Hüllenglycoprotein konjugiert, mittelgroße superparamagnetische Perlen werden zu HIV-gp120-Glycoprotein und kleine superparamagnetische Perlen zu einem immunogenen Cytomegalovirus-Hüllenglycoprotein konjugiert. Eine Serumprobe wird von einem Patienten abgenommen und mit einem Gemisch der superparamagnetischen Perlen unter Bindungsbedingungen inkubiert, um spezifische Bindung von Immunoglobulinen in der Probe mit den drei immobilisierten viralen Glycoproteinarten zu erlauben. Die superparamagnetischen Perlen werden von der Probe abgetrennt, um nicht-spezifisch gebundenes Immunoglobulin zu entfernen, und mit Up-Converting-Phosphorteilchen, beschichtet mit Staphylococcus aureus Protein A, welches an IgG unter Bindungsbedingungen bindet, inkubiert. Superparamagnetische Perlen mit spezifisch gebundener IgG werden so mit dem Phosphor-Protein A-Konjugat markiert. Große, mittlere und kleine superparamagnetische Perlen werden dann separat mit Phosphor-erregter elektromagnetischer Strahlung beleuchtet, und zeitbegrenzte emittierte Phosphoreszenz wird festgestellt. Eine nicht-spezifischen Bindung zuzuschreibender Hintergrund, wenn überhaupt, wird bestimmt und unter Verwendung innerer Standardperlen (Rinderserumalbumin, beschichtet mit superparamagnetischen Perlen) und positiver und negativer Kontrollserumproben subtrahiert. Die Intensität von Phosphoreszenz, verbunden mit den großen, mittleren und kleinen Perlen ergibt ein Maß für die Antikörpermenge in der Probe, welche mit dem Herpesvirus Typ II-Hüpllenglycoprotein, dem HIV gp120-Glycoprotein und dem Cytomegalovirus-Hüllenglycoprotein bzw. Cytomegalovirus-Hüllenglycoprotein. Diese Information kann verwendet werden, um zu bestimmen, ob ein einzelner Patient mit dem HIV-I1, menschlichem CMV und/oder Herpex Simplex Typ II-Vciren infiziert wurde.
  • Phosphor-Unterscheidung
  • Das folgende Bespiel beschreibt die Verwendung differenzierbarer Up-Converting-Phosphore zur Feststellung des Vorhandenseins und der relativen Häufigkeit von speziellen Isoformen von menschlichem APP (Amyloid-Vorläufer-Protein) in einer Serum oder Hirn-Biopsie-Probe. Verschiedene Isoformen von APP treten im Gehirn als Folge alternativer Exon-Verwendung und/oder alternativer proteolytischer Verfahrenswege auf. So können zwar alle APP-Isoformen anteilig an einem gemeinsamen hypothetischen Epitop (X) teilhaben, doch kann eine spezielle APP-Isoform ein einzigartiges Epitop (Y) haben, während eine andere APP-Isoform ein einzigartiges Epitop (Z) hat. Es ist möglich, daß die relative Häufigkeit einer speziellen APP-Isoform in einer Probe von voraussagbarem Wert sein kann oder für Alzheimer-Erkrankung pathogonomisch sein kann.
  • Superparamagnetische Perlen werden zu einem Antikörper konjugiert, der spezifisch an ein gemeinsames APP-Epitop (X) bindet, welches von allen Isoformen anteilig gebildet ist. Ein spezifischer Antikörper, der mit dem einzigartigen Y-Epitop reagieren kann, wird mit Phosphor #1 markiert, welcher durch Wellenlänge λ1 erregt und in einem Wellenlängenspektrum, das in blau zentriert ist, emittiert. Ein spezieller Antikörper, der mit dem einzigartigen Z-Epitop mit Phosphor #2 markiert wird, was durch eine Wellenlänge λ2 erregt wird und in einem Wellenlängenspektrum emittiert, das im Grünen zentriert ist. Eine Probe, die APP-Isoformen enthält, wird mit den superparamagnetischen Perlen inkubiert und mit speziellen Antikörpern unter Bindungsbedingungen markiert. Die superparamagnetischen Perlen werden aus der Probe entweder einzeln oder als Masse entnommen. Die Perlen werden mit der Wellenlänge λ1 beleuchtet und Blaulichtemission wird festgestellt und gemessen und mit λ2 beleuchtet und Grünlichtemission wird festgestellt und gemessen. Die Intensität von λ1-induzierter Blau-Emission ist ein Maß der APP-Isoform(en) mit der Y-Epitope, während die Intensität der λ2-induzierten Grün-Emission ein Maß der APP-Isoform(en) mit dem Z-Epitop ist. Wenn die Emissionen aus zwei Phosphoren leicht unterscheidbar sind, können λ1 und λ2 identisch sein. Die standardisierten relativen Intensitäten der zwei Phosphore ergeben ein Maß für die relative Häufigkeit der APP-Isoform(en), die die Y- oder Z-Epitope enthalten.
  • Phosphor- und Substrat-Differenzierung
  • Das folgende Beispiel beschreibt die Verwendung unterscheidbarer Up-Converting-Phosphore in Verbindung mit unterscheidbaren Substrattypen zur Ermittlung des Vorhandenseins und der relativen Häufigkeit spezieller Lymphozyt-T-Unterpopulationen in einer Blutprobe, die von einem Patienten abgenommen wurde. Obwohl hier unter Bezug auf die Ermittlung von T-Zellen-Unterpopulationen beschrieben, wird angenommen, daß Analyt-Multiplexing (d. h. Feststellen und/oder Charakterisieren mehrerer Analyte in einer Probe durch Verwendung verschiedener fester Substrattypen und/oder Up-Converting-Phosphor-Markierungen) eine allgemein anwendbare Methode ist.
  • Große superparamagnetische Perlen werden zu einem Anti-CD4-Antikörper, superparamagnetische Perlen mittlerer Größe werden zu einem Anti-CD8-Antikörper konjugiert, und kleine superparamagnetische Perlen werden an Anti-CD28-Antikörper angelagert. Ein Antikörper, der speziell an das CD2-Antigen bindet, ist mit einem Up-Converting-Phosphor markiert, der eine Erregungswellenlänge λ1 hat und im roten Bereich emittiert. Ein Antikörper, der speziell an das CD45R-Antigen bindet, wird mit einem Up-Converting-Phosphor markiert, der eine Erregungswellenlänge λ2 hat und in den grünen Bereich emittiert. Ein Antikörper, der speziell an das Dew60-Antigen bindet, wird mit einem Up-Converting-Phosphor markiert, der eine Erregungswellenlänge λ3 hat und in das Blaue emittiert.
  • Eine Blutprobe (oder Serum, Speichel, Urin, Fäkalien, Biopsiegewebe usw.) wird von einem Patienten abgenommen und mit einem Gemisch der superparamagnetischen Perlen und Phosphor-markierten Antikörper unter Bindungsbedingungen inkubiert, um eine spezifische Bindung von Zellen in der Blutprobe mit den drei immobilisierten Antikörperarten und den drei Phosphor-markierten Antikörperarten zu erlauben. Nachdem die Antigen-Antikörperbindung erfolgt ist, läßt man sich die superparamagnetischen Perlen absetzen und prüft entweder nacheinander oder gleichzeitig, durch Beleuchtung mit λ1, λ2 und λ3 sowie quantitative Bestimmung roter, grüner bzw. blauer Emissionen. Beispielsweise ist die Intensität von λ1-induzierter Rotlichtemission, verbunden mit den großen Perlen, ein rohes Maß für die Menge von Zellen sowohl mit CD4- als auch mit CD2-Oberflächen-Antigenen und/oder der relativen Häufigkeit dieser Oberflächen-Antigene (zum Beispiel können einige wenige CD4+-Zellen vorhanden sein, die eine große Menge von CD2-Antigen aufweisen und somit ein großes CD2-Phosphoreszenzsignal). Ähnlich ist die Intensität von λ2-induziertem grünem Licht, verbunden mit den großen Perlen ein rohes Maß der Zellmenge mit CD4 und D C45R-Oberflächenantigenen und/oder der relativen Häufigkeit jener Oberflächen-Antigene in einer Probe.
  • Auf diese Weise kann eine Analytprobe, wie eine Blutprobe, als „Fingerabdruck" für das Vorhandensein und die relative Verteilung verantwortlich sein (zum Beispiel gemeinsame Abscheidung und/oder Korrelation) verschiedener Analytarten. Ein solcher Analyt-Fingerabdruck kann dazu verwendet werden, beispielsweise diagnostische oder therapeutische Information zu erhalten, beispielhalber, um den Immunstatus des Patienten zu messen oder zur Messung der Antwort auf eine Chemotherapie, die auf bestimmte Blutzellen-Unterguppen gerichtet war.
  • Beispielhalber kann ein einheitlicher Detektor gleichzeitig oder nacheinander die superparamagnetischen Perlen aus einer Suspension einfangen, die Perlentype (Größe, Form und/oder Farbe) bestimmen und das durch (Beleuchtung mit Erregungswellenlänge(n) und Feststellung emittierter Wellenlängen) rastern.
  • Bei Durchführung von Bindungsassays unter verdünnten Bedingungen, bei denen im Mittel ein Analyt oder weniger (zum Beispiel Lymphozyt) je Mikroperle gebunden wird, ist es möglich, individuell (zum Beispiel die Häufigkeit von CD45R je einzelne CD4+-Zelle zu bestimmen) Zellen einzeln zu typisieren und so präzisere Lymphozyt-Subpopulations-Definitionen zu erzeugen.
  • Mit Biotin behandelte magnetische Perlen können auch verwendet werden, um die Kinetik des Bindens von Streptavidin an Phosphorteilchen und/oder Streptavidin-beschichtete Up-Converting-Phosphorteilchen aus einer Reaktion abzuscheiden oder zu reinigen. So werden Streptavidin- und Up-Converting-Phosphorteilchen in einem Reaktionsbehälter unter Bindungsbedingungen zur Bildung von Streptavidin-beschichteten Phosphorteilchen vermischt. Nach einer geeigneten Bindungsperiode kann ungebundenes Streptavidin entfernt werden (zum Beispiel durch Zentrifugieren, wobei Phosphorteilchen als das Pellet gesammelt werden, ungebundenes Streptavidin in der oben schwimmenden Schicht dekantiert wird und das Pellet erneut suspendiert wird), mit Biotin behandelte Magnetperlen zu der verbleibenden Phosphorsuspension bei Bindungsbedingungen zugegeben werden und mit Streptavidin-beschichtete Phosphorteilchen an die biotinylierten magnetischen Perlen gebunden gewonnen werden.
  • Photophysikalische Katalyse durch Up-Converting-Phosphore
  • Andere Anwendungen der Erfindung verwenden Phosphore als einen photophysikalischen Katalysator, der an eine Sonde gebunden ist, wo die von dem Phosphor emittierte Strahlung verwendet wird, typischerweise in Verbindung mit einem Farbstoffmolekül, um lokalisierte intensive elektromagnetische Strahlung in einer Fläche zu produzieren, die in Nachbarschaft zu der Sonde für verschiedene andere Zwecke als Ermittlung (zum Beispiel zur Cytotoxizität, Ionisierung von chemischen Verbindungen, Mutagenese usw.). Beispielsweise kann ein Antikörper, der spezifisch an ein Zellenoberflächenantigen, wie CD8-Antigen auf einem CD8+-Lymphozyten als eine Sonde verwendet werden, die an einen Up-Converting-Phosphor zur Lokalisierung des Phosphors auf CD8+-Lymphozyten verwendet werden. Eine CD8+-Lymphozyten enthaltende Probe kann mit der Anti- CD8+-Sonden-Phosphor-Konjugat inkubiert und mit einer Erregungswellenlänge (zum Beispiel von einer Infrarot-Laserdiode) bestrahlt werden, was zur Emission von Up-Shifted-Photonen (d. h. höherer Frequenz elektromagnetischer Strahlung) in der Nachbarschaft von CD8+-Lymphozyten führt, an welche das Anti-CD8+-Sonden-Phosphorkonjugat gebunden hat. Die emittierte Strahlung kann eine Wellenlänge haben, die direkt mutagen und/oder cytotoxisch ist (zum Beispiel Ultraviolettstrahlung, die zur Bildung von Thymindimeren führen kann, 760–765 nm Licht dürfte auch Chromosomenzersetzung erzeugen können) oder kann eine Wellenlänge haben, die eine photolytische Zersetzung einer Chemikalie bewirken, die in der Umgebung, die zur lokaler Bildung reaktiver Verbindungen führt, vorliegt und die eine Zerstörung benachbarter Zellen verursachen kann (zum Beispiel Photozersetzung von Buckminsterfullarenen, C60 zu C58 und C2, kann freie Radikale erzeugen, die LIpidperoxidation von Zellmembranen verursachen kann).
  • Da Phosphor-emittierte Strahlung isotrop ist, ist es allgemein erwünscht, physikalisch Ziele (zum Beispiel CD8+-Lymphozyten) von Nichtzielen (zum Beispiel CD8–-Lymphozyten) vor einer Erregungsbestrahlung zu trennen, so daß unerwünschte Zerstörung der Nichtziele durch isotrope Emissionen) (d. h. „sekundäre Zerstörung") vermieden wird. Physikalische Trennung kann mit verschiedenen Mitteln erzielt werden, einschließlich der folgenden, jedoch nicht ausschließlich mit diesen: (1) Durchführung einer Erregungsbestrahlung auf einer verdünnten Suspension von Zielzellen und Nichtzielzellen, worin der mittlere Abstand, welcher die einzelnen Zellen voneinander trennt, ausreicht, sekundäre Zerstörung von Nichtzielen zu reduzieren, und (2) Verwendung hydrodynamischer Fokussierung, wobei Zellen (sowohl Zielzellen als auch Nichtzielzellen) einfach durch eine Beleuchtungszone geführt werden (zum Beispiel in einem Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierer oder dergleichen). So kann eine an eine Anti-CD8+-Antikörper gebundener Up-Converting-Phosphor benutzt werden, selektiv Zerstörungs-CD9+-Lymphozyten in eine Lymphozytprobe zu überführen, wo (1) der Phosphor bei einer Wellenlänge emittiert, die entweder direkt cytotoxisch und/oder (2) die Phosphor bei einer Wellenlänge emittiert, die reaktive Chemikalien bei einer Wellenlänge emittiert, die reaktive Chemikalien durch Photokatalyse einer in der Probe vorhandenen Verbindung produziert (zum Beispiel kann eine Probe mit Buckminsterfullaren dotiert werden).
  • Anstelle einer Verwendung der emittierten Strahlung direkt für photokatalytische Wirkung auf Gewebe oder Tumore kann eine erregte Form von Sauerstoff sogenannter Singlet-erregter Sauerstoff (O2'Δg) durch Energietransfer von einem Farbstoffsensibilisator zu gelöstem molekularem Sauerstoff erzeugt werden. Dieses Schema macht Gebrauch von der Gewebe durchdringenden Stärke von Nahe-Infrarotstrahlung (rot und ultrarot Region Licht, einschließlich 970 nm), welche den anorganischen Up-Converting-Phosphor hat. Zwei der Infrarotphotonen werden entweder in ein rotes, grünes oder blaues Photon umgewandelt, je nach dem Absorptionsspektrum des Sensibilisator-Farbstoffs. Der Farbstoff wird durch die Up-Converted Bestrahlung in einen Triplet-Zustand angeregt, welcher seine Energie auf ein gelöstes molekulares Sauerstoffmolekül überführt, um eine erregtes (Singlet) Sauerstoffmolekül zu bekommen. Die cytotoxische Aktivität von Singlet-Sauerstoff ist in der photodynamischen Therapie und bei anderen biomedizinischen Anwendungen gut dokumentiert (siehe Wagnieres et al. (19.–21. Januar 1990) Future Directions and Applications of Photo dynamic Therapy, Seiten 249, SPIE-Institutes for Advanced Optical Technologies, Society of Photo-Optical Instrumentation Engineers, Box 10, Bellingham, Washington 98277; Pelegrin et al. (1991) Cancer 67: 2529; Wagnieres et al. (24.–25. Mai 1991) Future Directions and Applications of Photodynamic Therapy, Seite 219; Folli et al. (17. Dezember 1991) Fluoresceine Clinique 4; Braichotte et al. (Mai 1991) ENT-Clinic, Lausanne, Schweiz).
  • Bei dieser Anwendung wird der Up-Converting-Phosphor mit einem sensibilisierenden Farbstoff, wie Methylenblau, Rosabengal oder Phthalocyanin-Derivaten, wie Zn-Phthalocyanin, vermischt oder vereinigt. In dem ersten und dritten Fall wird ein rot emittierender Phosphor verwendet, während für Rosabengal ein grün emittierender Phosphor am besten geeignet ist. Die Phthalocyanin-Derivate sind ideal geeignet für diesen Zweck wegen ihrer Gesamtunlöslichkeit in wäßrigen oder biologischen Lösungen. Diese Farbstoffe halten daher in enger Nähe zu den Emittern an, so daß die Spezifiziertheit der Zelloberflächenreporter/Probe/Farbstoff-Komplexe der begrenzende Faktor wird. In diesem Fall müssen spezialisierte Kombinationen von Reporter/Sonde/Farbstoffformulierungen vorzugsweise in dem Größenbereich von 0,1 bis 0,3 Mikron synthetisiert werden, um ausreichend Energietransfer zu ermöglichen: zunächst wird Up-Converted-Strahlung von dem Farbstoff so vollständig wie möglich absorbiert, und zweitens wird die Farbstoff-Erregungsenergie (Triplet-Zustand) auf gelösten molekularen Sauerstoff übertragen. Beide Verfahren sind sehr effizient, wenn das Absorptionsspektrum des Sensibilisator-Farbstoffes zu der Up-Converted-Strahlung paßt.
  • Dieses Schema präsentiert eine Stufe über die traditionellen photodynamischen Therapieverfahren hinweg, indem das rote Licht sowohl für Vorsorgeuntersuchungen und Diagnose als auch für therapeutische Zwecke nach Up-Converting verwendet werden kann und so lediglich eine (Infrarot)-Lichtquelle bei etwa 1000 nm erforderlich macht. Ein weiterer Vorteil ist der größere Bereich innerhalb biologischer Proben der Infrarotbestrahlung im Vergleich mit anderen bekannten photodynamischen Therapie-Erregungsschemata (750–850 nm).
  • Für Ausführungsformen, die Up-Converting-Phosphore als photophysikalische Katalysatoren verwenden, ist es allgemein erwünscht, daß (1) die Wellenlänge(n) der Erregungsbestrahlung nicht signifikante Photokatalyse der Substratverbindung produzieren (2) die Wellenlänge(n) der Erregungsbestrahlung nicht direkt cytotoxisch oder mutagen sind und (3) die emittierte Strahlung direkt cytotoxisch und/oder von ausreichender Wellenlänge ist, um eine biologisch wirksame Menge von Photozersetzung einer Substratverbindung zu erzeugen (zum Beispiel Buckminsterfullaren, Psoralen, Verbindungen mit Azid-Substituenten oder anderen photoaktivierten Gruppen). Alternativ können Histidin-Seitenketten von Polypeptiden durch Licht in Gegenwart von Farbstoff-Sensibilisatoren, wie Methylenblau oder Rosabengal (Proteine, Strukturen und molekulare Prinzipien, (1984) Creighton (Herausgeber), W. N. Freeman and Company, New York; Introduction to Protein Structure. (1991), C. Brandan und J. Tooze, Garland Publishing, New York, NY, auf die hier Bezug genommen wird). So können beispielsweise Up-Converting-Phosphore; die an Anti-CD8-Antikörper gebunden sind, als photophysikalische Katalysatoren zur Produktion selektiver, örtlich geschädigter Lymphozyten an CD8+ verwendet werden. Gemäß der Erfindung kann im wesentlichen jeder Antikörper an einen geeigneten Up-Converting-Phosphor, entweder direkt oder durch Konjugation an Protein A, welches das Immunoglobulin binden kann, gebunden werden. So können die Up-Converting photophysikalischen Katalysatoren der Erfindung verwendet werden, um im wesentlichen jedes erwünschte Antigen zum Ziel zu bringen, oder es kann jede gewünschte Zelltype durch das Vorhandensein eines identifizierten Antigens unterschieden werden.
  • Ermittlungsvorrichtung
  • Ermittlung und Quantifizierung anorganischer Up-Converting-Phosphor(e) werden allgemein folgendermaßen durchgeführt: (1) Beleuchten einer Probe, von welcher man vermutet, daß sie Up-Converting-Phosphore enthält, mit elektromagnetischer Strahlung bei einer Erregungswellenlänge und (2) Feststellung phosphoreszierender Strahlung bei einer oder mehreren Banden der Emissionswellenlänge.
  • Beleuchtung der Probe erfolgt durch Belichten der Probe mit elektromagnetischer Strahlung, die von wenigstens einer Erregungsquelle erzeugt wird. Verschiedene Erregungsquellen können verwendet werden, einschließlich Infrarot-Laserdioden und weißglühender Fäden sowie anderer geeigneter Quellen. Optische Filter, die hohe Durchlässigkeit in den Erregungswellenlängenbereichen und geringe Durchlässigkeit in einer oder mehreren unerwünschten Wellenlängenbanden haben, können verwendet werden, um unerwünschte Wellenlängen aus der Beleuchtungsquelle herauszufiltern. Unerwünschte Wellenlängenbereiche schließen allgemein jene Wellenlängen ein, die feststellbare Proben-Autofluoreszenz erzeugen und/oder innerhalb etwa 25–100 nm von Erregungsmaximumwellenlängen liegen und so mögliche Quellen für Hintergrundrauschen aufgrund gestreuter Erregungsbeleuchtung sind. Erregungsbeleuchtung kann auch vervielfacht und/oder parallel gerichtet werden. Beispielsweise können Strahlen verschiedener Einzelfrequenzen von zusammenhängenden Mehrfachquellen zum Beispiel Lasern) parallel gerichtet und dem Multiplexverfahren unterzogen werden, indem man eine Anordnung von dikroitischen Spiegeln verwendet. Auf diesem Weg können Proben, die mehrere Phosphorarten mit unterschiedlichen Erregungswellenlängenbanden enthalten, gleichzeitig auf ihre Erregungsfrequenzen beleuchtet werden. Die Beleuchtung kann kontinuierlich oder gepulst vorgenommen werden oder kann kontinuierliche Welle (CW) und gepulste Beleuchtung kombinieren, wo Mehrfachbeleuchtungsstrahlen dem Multiplexverfahren unterzogen werden (zum Beispiel ein gepulster Strahl wird mit einem CW-Strahl dem Multiplexverfahren unterzogen), eine Signalunterscheidung zwischen der von der CW-Quelle induzierten Phosphoreszenz und der von der gepulsten Quelle induzierten Phosphoreszenz, so daß die Unterscheidung mehrere Phosphorarten mit ähnlichen Emissionsspektren, aber unterschiedlichen Erregungsspektren möglich ist. Beispielsweise, aber nicht ausschließlich, können gewerblich verfügbar Galliumarsenid-Laserdioden als eine Beleuchtungsquelle verwendet werden, um Licht nahe Infrarot zu bekommen.
  • Die Fähigkeit, Infrarot-Erregung zur Stimulierung von Up-Converting-Phosphoren zu nutzen, ergibt mehrere Vorteile. Erstens können billige IR-Diodenlaser und Diodenlaser nahe IR für gestützte Hochintensitäts-Beleuchtung, insbesondere mit Banden in IR-Wellenlänge, die nicht von Wasser absorbiert werden, verwendet werden. Diese Höhe von Hochintensitäts-Beleuchtung wäre nicht ge eignet für die Verwendung mit herkömmlichen Markierungen, wie üblich fluoreszierenden Farbstoffen (zum Beispiel FITC), da sehr intensive UV- oder sichtbare Strahlung intensive Lichtausbleichung der Markierung und potentielle Schädigung der Probe ergibt. Die Fähigkeit, höhere Intensitäten der Beleuchtung ohne Lichtausbleichung oder Probenschädigung verwenden zu können, spricht für Signale mit größerem Potential und somit empfindlicheren Assays.
  • Die Verträglichkeit von Up-Converting-Markierungen mit der Verwendung von Diodenlasern als Beleuchtungsquellen ergibt andere bestimmte Vorteile gegenüber Lampenquellen und am meisten gegenüber Laserquellen. Erstens kann die Diodenlaser-Intensität direkt durch Modulation des Antriebstroms moduliert werden. Dies gestattet eine Modulierung des Lichts für beschränkte Zeit oder phasenempfindliche Ermittlungstechniken, die eine Empfindlichkeitsverbesserung ohne Verwendung von zusätzlichem Modulator ergeben. Modulatoren erfordern hohe Spannung und teure Kristalle, was beides Kosten und erhöhte Vorrichtungsgröße zufügt. Die Laserdiode oder lichtemittierende Diode kann durch direkte Strommodulation gepulst werden. Zweitens liefern Laser-Beleuchtungsquellen eine Beleuchtung, die exzeptionell monochromatisch ist und auf sehr kleinen Flecken sitzen kann, die Vorteile im Verhältnis von Signal-zu-Rauschen und Empfindlichkeit infolge reduzierten Hintergrundlichts außerhalb des erwünschten Erregungs-Spektralbereichs und beleuchteten Volumens ist. Ein Diodenlaser ergibt diese signifikanten Vorteile ohne zusätzliche Kosten und Größe anderer herkömmlicher oder Laserquellen.
  • Ermittlung und Quantifizierung von phosphoreszierender Strahlung von erregten Up-Converting-Phosphoren kann mit einer Vielzahl von Mitteln erreicht werden. Verschiedene Mittel zur Feststellung phosphoreszierender Emissionen) können angewendet werden, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt: Photovervielfältigungseinrichtungen, Lawinen-Photodiode, ladungsgekoppelte Einrichtungen (CCD), CID-Einrichtungen, photographische Filmemulsion, photochemische Reaktionen, nachgebende feststellbare Produkte und visuelle Beobachtung (zum Beispiel fluoreszierende Lichtmikroskopie). Wenn die Reporter-Moleküle organische Farbstoffe sind, kann die Resonanz-Multiphotonen-Ionisierung unter Verwendung elektrostatischer stellungsempfindlicher Detektoren abgefühlt werden. Die Ermittlung kann zeitgesteuerte und/oder frequenzgesteuerte Lichtsammlung für Zurückweisung von Rest-Hintergrundrauschen verwenden. Zeitgesteuerte Ermittlung ist allgemein erwünscht, da sie ein Verfahren zur Aufzeichnung langlebiger Emissionen) nach Beendigung des Beleuchtens ergibt. Somit werden Signale, die Phosphoreszenz oder verzögerte Fluoreszenz von Up-Converting-Phosphor zugerechnet, während kurzlebige Autofluoreszenz und gestreutes Beleuchtungslicht, wenn überhaupt, abgewiesen werden. Zeitgesteuerte Ermittlung kann entweder durch spezielle periodische, mechanische Blockierung durch ein rotierendes Blatt (d. h. mechanische Zerkleinerung) oder durch elektronische Mittel, worin prompte Signale (d. h. das Auftreten innerhalb etwa 0,1 bis 0,3 μs nach Beendigung des Beleuchtens) abgewiesen werden (zum Beispiel eine elektronisch gesteuerte feste optische Blende wie eine Pockell- oder Kerr-Zelle). Up-Converting-Phosphore und Up-Converting-verzögerte Fluoreszenz-Farbstoffe haben typischerweise Emissionslebenszeiten von etwa einigen Millisekunden (vielleicht so viel wie 10 ms, typischerweise aber in der Größenordnung von 1 ms), während Hintergrundrauschen gewöhnlich innerhalb von etwa 100 ns zerfällt. Daher ist es, wenn man eine gepulste Erregungsquelle verwendet, allgemein erwünscht, zeitgesteuerte Ermittlung zu verwenden, um prompte Signale abzuweisen.
  • Da Up-Converting-Phosphore nicht Gegenstand des Photobleichens sind, können sehr schwach emittierte Phosphorsignale gesammelt und über sehr lange Feststellungszeiten (kontinuierliche Beleuchtung oder mehrfach gepulste Beleuchtung) vorliegen, um die Empfindlichkeit der Ermittlung zu erhöhen. Eine solche Zeitintegrierung kann elektronisch oder chemisch (zum Beispiel photographischer Film) er folgen. Wenn ein photographischer Nicht-Infrator-Film als ein Mittel zur Auffindung schwach emittierter Signale verwendet wird, liefern Up-Converting-Reporter-Moleküle den Vorteil im Vergleich mit Down-Converting-Phosphoren, daß die Erregungsquelle(n) typischerweise Beleuchtung in einem Wellenlängenbereich (zum Beispiel Infrarot und nahe-nfrarot) auftritt, der keine signifikante Belichtung des Films erzeugt (d. h. ähnlich einem Sicherheitslicht in einem Dunkelraum). So können Up-Converting-Phosphore als bequeme ultraempfindliche Markierungen für Immunohistochemische Anfärbung und/oder Hybridisierung in situ in Verbindung mit Fluoreszenz-Mikroskopie unter Benutzung einer Infrarotquelle (zum Beispiel einer Infrarot-Laserdiode) und eines photographischen Films zum Beispiel Kodak Ektachrome) für Signal- und Bildermittlung von Lumineszenz im sichtbaren Bereich (mit oder ohne Infrarotblockierfilter) verwendet werden.
  • Instrumentenüberblick
  • 1 ist ein optisches und elektronisches Blockdiagramm und erläutert eine repräsentative Apparatur 10 zur Durchführung diagnostischer Maßnahmen an einer Probe 15 gemäß der vorliegenden Erfindung. Die Erfindung kann mit einem oder einer Mehrzahl von Reporter-Molekülen durchgeführt werden. Zu Erläuterungszwecken zeigt die Apparatur ein System, worin zwei diagnostische Bestimmungen an einer einzelnen Probe durchgeführt werden, in welcher zwei Phosphor Reporter-Moleküle verwendet werden. Das erste Reporter-Molekül hat eine Erregungsbande, die bei λ1 zentriert ist und eine Emissionsbande, die bei λ1' zentriert ist, während das zweite Reporter-Molekül entsprechende Erregungs- und Emissionsbanden hat, die bei λ2 und λ2' zentriert sind. Da die Reporter-Moleküle der vorliegenden Erfindung auf Multiphoton-Erregung basieren, sind die Wellenlängen λ1 und λ2 länger als die Wellenlängen λ1' und λ2'. Die ersteren sind typischerweise im nahen-infrarot Gebiet und die letzteren im Gebiet des sichtbaren Lichts.
  • Ein Paar Lichtquellen 20(1) und 20(2), die Laserdioden oder lichtemittierende Dioden (LEDs) sein können, liefern Licht mit den erwünschten Erregungswellenlängen, während entsprechende Detektoren 22(1) und 22(2), die Photodioden sein können, Licht mit den erwünschten Emissionswellenlängen ermitteln. Die emittierte Strahlung steht in Beziehung zu dem einfallenden Fluß nach einem Energiegesetz, so daß die Effizienz maximiert werden kann, indem man den einfallenden Strahl schart auf der Probe fokussiert. Hierzu wird Licht aus den beiden Quellen auf einem einzigen Weg durch ein geeignetes Kombinationselement 25 vereinigt, in einem kleinen Bereich durch einen Linsen- oder anderen Fokussiermechanismus 27 fokussiert und trifft auf die Probe. Von den Phosphor Reporter-Molekülen emittiertes Licht wird von einer Linse 30 gesammelt, und die Komponenten in den zwei Emissionsbanden werden durch ein geeignetes Trennelement 32 getrennt und zu den betreffenden Detektoren geschickt.
  • Es gibt eine Reihe möglicher Betriebsbedingungen für den Antrieb der Laserdioden und die Ermittlung des emittierten Lichts in den unterschiedlichen Wellenlängenbanden. Dies ist allgemein als ein Kontroll-Elektronikblock 35 gezeigt, der mit den Laserdioden und Detektoren Verbindung haben muß. Das spezielle Timing und andere Charakteristika der Kontrollelektronik werden nachfolgend in Verbindung mit speziellen Ausführungsformen beschrieben.
  • Es kann mehrere Reporter-Moleküle mit bestimmten Emissionsbanden, aber einer gemeinsamen Erregungsbande, geben. In solch einem Fall würde das System Mehrfachdetektoren für eine einzelne Laserdiode einschließen. Ähnlich kann es mehrere Reporter-Moleküle mit bestimmten Erregungsbanden, aber einer gemeinsamen Emissionsbande geben. In solch einem Fall würde das System Mehrfach-Laserdioden für einen einzelnen Detektor einschließen und würde Zeit nach den Multiplex-Techniken oder dergleichen zur Trennung der Wellenlängen verwenden.
  • Licht von den beiden Quellen ist als kombiniert gezeigt, um es an einem einzigen Ort durch einen gemeinsamen Fokussiermechanismus zu fokussieren. Dies ist nicht erforderlich, selbst wenn es erwünscht ist, den gleichen Bereich der Probe zu beleuchten. Ähnlich braucht das Sammeln nicht über einen einzigen Sammelmechanismus zu verlaufen. Wenn es erforderlich ist, das gesamte Licht zu bewahren, kann die Kombination und die Trennung von Elementen eine Multiplex-Vorrichtung für Wellenlängenteilung und eine Demultiplex-Vorrichtung für die Verwendung dichroitischer Filter enthalten. Wenn Verlust toleriert werden kann, können 50% Strahlspalter und Filter verwendet werden.
  • Die schematische Darstellung zeigt das Licht durch die Probe gehend und in Linie festgestellt. Nach einer Faustregel ist die Emission von den Phosphor-Reporter-Molekülen allgemein isotrop, und es kann bevorzugt sein, Licht in einem Winkel von der Richtung des einfallenden Lichts zu sammeln, um Hintergrund wegen der Erregungsquelle zu vermeiden. Da jedoch die Erregungs- und Emissionsbanden weitgehend getrennt sind, ist in den meisten Fällen ein solcher Hintergrund unwahrscheinlich. Viel eher können andere Betrachtungen andere Geometrien vorschreiben. Beispielsweise kann es erwünscht sein, zurück entlang dem Weg der einfallenden Strahlung wanderndes Licht festzustellen, so daß bestimmte Elemente in den optischen Weg zwischen den Erregungs- und Feststellungswegen aufgeteilt werden.
  • Ein typisches Instrument mit aufgeteilten Elementen ist ein Mikroskop, bei dem das Objektiv verwendet wird, die Erregungsstrahlung auf der Probe zu fokussieren und die ausgesandte Strahlung zu sammeln. Eine potentiell vorteilhafte Abwandlung einer solchen Gestaltung macht die Verwendung des Phänomens des optischen Einfangens. In einer Situation, wo das Reporter-Molekül an einen kleinen Tropfen gebunden ist, kann es möglich sein, den Tropfen in dem Bereich nahe dem Strahlfokus einzuschließen. Die gleiche Quelle oder eine unterschiedliche kann verwendet werden, um das Reporter-Molekül zu erregen. Die Verwendung eines Infrarot-Diodenlasers zum Einfangen kleiner Teilchen ist in Sato et al., „Optical Trapping of small particles usind a 1,3 μm compact InGaAsP laser", Optics letters, Band 16, Nr. 5 (1. März 1991) beschrieben.
  • Spezielle Ermittlungstechniken
  • Wie oben ausgeführt, verwendet Mehrkanal-Ermittlung optische Einrichtungen, wie Filter oder dichroitische Strahlspalter, bei denen die Emissionsbanden des Phosphor Reporter-Moleküls ausreichend getrennt sind. Ähnlich wurde darauf hingewiesen, daß Mehrfach-Reporter-Moleküle mit einer gemeinsamen Emissionsbande unter Verwendung elektronischer Techniken ermittelt werden könnte. Diese elektronischen Techniken werden nachfolgend in Verbindung mit Mehrfachquellen beschrieben. Die Techniken werden jedoch zunächst im Kontext eines einzelnen Kanals beschrieben. Die Techniken sind brauchbar in diesem Kontext, da es Quellen für Hintergrund gibt, die in dem gleichen Wellenlängenbereich wie das zu messende Signal sind.
  • 2A zeigt eine Apparatur für phasenempfindliche Ermittlung im Kontext eines einzelnen Kanals. Entsprechende Bezugszeichen werden für Elemente entsprechend jenen früheren beschreibenden Figuren verwendet. In dem vorliegenden Kontext umfaßt die Kontrollelektronik 35 einen Wellenformgenerator 37 und einen Frequenzmischer 40. Der Wellenformgenerator 37 treibt die Laserdiode 20 81) bei einer Frequenz f1 und liefert ein Signal bei f1 zu dem Frequenzmischer. Der Frequenzmischer empfängt auch das Signal von dem Detektor 22(1) und ein Phasenkontroll-Inputsignal. Diese Schaltung ergibt zusätzliche Hintergrundunterscheidung, da das Grundgerüst eine viel kürzere Lebensdauer als das zu messende Signal hat (Nanosekunden oder Mikrosekunden, verglichen mit Millisekunden). Dies bewirkt, daß das Signal und der Hintergrund unterschiedliche Phasen haben (obwohl sie beide bei der charakteristischen Frequenz des Wellenformgenerators moduliert sind). Für eine Diskussion des lebenszeitabhängigen Phasenshifts siehe Demtröder, Laser Spectroscopy, Springer-Verlag, New York, 1988, Seiten 557–559).
  • Das Phasen-Inputsignal wird so gesteuert, daß es das Signal maximiert und gegen den Hintergrund unterscheidet. Unterscheidung gegen unmodulierten Hintergrund ist hier auch von Vorteil und führt zu zwei Typen der Unterscheidung.
  • Da das Signal auf Zwei-Photonenerregung beruht, ist es möglich, zwei modulierte Laserdioden zu verwenden und das Signal bei der Summe oder Differenz der Modulationsfrequenzen zu ermitteln. 2B zeigt eine solche Anordnung, bei der erste und zweite Laserdioden 20(1) und 20(1)' (emittierend bei der gleichen Wellenlänge λ1 oder gegebenenfalls unterschiedlichen Wellenlängen) moduliert mit Signalen aus Wellenformgeneratoren 37a und 37b, die jeweiligen Frequenzen fa und fb arbeiten. Die Wellenform der Generator-Outputsignale werden zu einem ersten Frequenzmischer 42 überführt, und ein Signal bei fa ± fb wird zu einem zweiten Frequenzmischer 45 überführt. Das Signal von dem Detektor 22(1) und ein Phasen-Inputsignal werden auch zu dem Frequenzmischer 45 überführt.
  • 3 zeigt eine Apparatur zur Durchführung gesteuerter Ermittlung. Da der Hintergrund kürzer lebend ist als das Signal, erlaubt eine Verzögerung der Ermittlung verbesserter Unterscheidung. Hierzu wird die Laserdiode von einem Pulsgenerator 50 angetrieben, dessen verzögerter Output verwendet wird, um einen gesteuerten Integrator oder einen anderen gesteuerten Analysator 55 zu ermöglichen.
  • 4 zeigt eine Apparatur zur Durchführung diagnostischer Versuche mit einer Probe unter Verwendung erster und zweiter Reporter-Moleküle mit Erregungsbanden, die bei λ1 und λ2 zentriert sind und überlappende Emissionsbanden nahe λ3 haben. Die Probe wird mit Licht von Laserdioden 20(1) und 20(2) bestrahlt, wie oben in Verbindung mit 1 diskutiert ist. Erste und zweite Wellenformgeneratoren 37(1) und 37(2) treiben die Laserdioden bei entsprechenden Frequenzen f1 und f2 und liefern weiterhin Signale bei f1 und f2 an jeweilige Frequenzmischer 60(1) und 60(2). Das Signal von dem Detektor 22(3) wird zu beiden Frequenzmischern überführt, die auch jeweilige Phasen-Inputsignale bekommen. So liefert der Frequenzmischer 60(1) ein Outputsignal entsprechend der Menge an emittiertem Licht, moduliert bei Frequenz f1, was ein Maß für das Vorhandensein des ersten Reporter-Moleküls in der Probe darstellt. Ähnlich liefert der Frequenzmischer 60(2) ein Outputsignal entsprechend der Menge an emittiertem Licht, moduliert bei Frequenz f2, was ein Maß für die Anwesenheit des zweiten Reporter-Moleküls in der Probe ist.
  • Die Verwendung der beiden unterschiedlichen Wellenlängen wurde oben in dem Kontext der beiden Reporter-Moleküle mit unterschiedlichen Erregungsbanden diskutiert. Die Diskussion bezieht sich aber auch auf eine Situation mit nur einem einzigen Reporter-Molekül. Da die Erregung ein Zwei-Photonenverfahren ist, gibt es kein Erfordernis, daß die beiden Photonen die gleiche Energie haben. Vielmehr ist es nur erforderlich, daß die Gesamtenergie der zwei Photonen in die Erregungsbande fällt. Somit gibt es mehr mögliche Kombinationen, d. h. mehr mögliche Wahlen der Gesamterregungsenergie, da es relativ richtungsweisend und billig ist, unterschiedliche Wellenlängen mit Laserdioden vorzusehen. Dies gestattet eine größere Breite in der Wahl der Seltenen Erd-Ionen für Up-Converter, da die Erregungsstufen nicht auf einem Zusammenfallen von Energieüberführung einschließlich einer Ein-Photonenenergie beruhen. Außerdem kann es möglich sein, direkte stufenweise Erregung des emittierenden Ions zu erhalten (das Erbium-Ion in dem oben ausgeführten Beispiel), ohne Energietransfer von einem anderen absorbierenden Ion (dem Ytterbium-Ion in dem Beispiel), während man sich die Resonanzverbesserung von Zwischenstufen zu Nutze macht. Außerdem kann die Verwendung unterschiedlicher Wellenlängen für ein einziges Reporter-Molekül zusätzliche Optionen für erregungsabhängiges Multiplex-Verfahren und Hintergrund-Unterscheidungstechniken liefern.
  • Mehrfachwellenlängenerregung eines einzelnen Phosphors kann auf einer Reihe von Wegen auftreten, wie in den 5A bis 5C gezeigt ist. Zwei Laser können stufenweise die Erregung eines einzelnen Ions verursachen, wie in 5A gezeigt ist. Ein erster Laser stimuliert die Erregung von Level 1 auf Level 2, und ein zweiter Laser stimuliert die Erregung von Level 2 auf Level 3, auf welchem die Emission stattfindet. Eine Einzel-Ionenerregung kann auch unter Verwendung von Energietransfer auftreten, wie in 5B gezeigt. In diesem Fall stimuliert ein erster Laser eine Erregung von Level 1 auf Level 2, ein Energietransfer findet von Level 2 auf Level 32 statt, und ein zweiter Laser stimuliert die Erregung von Level 3 auf Level 4. In einer Abwandlung des letzteren Verfahrens können die Level 1 und 2 in einem ersten Ion (d. h. einem Sensibilisator-Ion) sein und in Level 3 und 4 in einem zweiten Ion (d. h. einem Aktivator-Ion), wie in 5C gezeigt ist.
  • In einem stufenweisen Erregungsschema, das in 5A gezeigt ist, ist Energietransfer nicht erforderlich, und somit kann Information über die Polarisierung der Erregungslaser bewahrt werden und eine Polarisation der emittierten Strahlung stattfinden. In diesem Fall kann eine Depolarisation des Lichtes eine Verbesserung erlauben.
  • Für das in 5C gezeigte Mehrionen-Mehrlaser-Erregungsschema können mehrere Phosphore Anteil an einer gemeinsamen Erregungswellenlänge haben. In diesem Fall kann eine Unterscheidung zwischen unterschiedlichen Phosphoren auf der Basis unterschiedlicher Emissionswellenlängen und/oder durch zeitgeregelte Frequenzmodulation und/oder phasenempfindliche Ermittlung unter Benutzung einer Modulation der Erregungswelle(n) erfolgen.
  • Ausführungsformen spezieller Instrumente
  • 6 ist eine schematische Darstellung, welche die optische Schiene einer speziellen Ausführungsform von Apparatur zur Durchführung der vorliegenden Erfindung an einer Probe unter Verwendung einer von Hand gehaltenen Sonde zeigt. Diese Ausführungsform bekommt die Form eines miniaturisierten Instruments mit einem Gehäuse 75 (gestrichelt gezeigt), einer von Hand gehaltenen Sonde 80 mit einer Faseroptik im Verbindungskabel 82. Die optischen und elektronischen Komponenten liegen in dem Gehäuse. Zum Zweck einer Erläuterung sind die optischen Bestandteile, ein Drei-Kanalsystem, gezeigt. Die Probe kann bis zu drei Reporter-Moleküle mit deutlichen Emissionsbanden, beispielsweise in blau, grün und rot Bereichen des sichtbaren Spektrums enthalten. Es wird auch unterstellt, daß die Reporter-Moleküle bestimmte Erregungsbanden im nahen Infrarot haben.
  • Die Output-Strahlen von drei Laserdioden 85a–c sind über Linsen 87a–c mit Abstufungsindex (GRIN), fokussiert auf die Enden jeweiliger Fasersegmente 88a–c und in eine Einzelfaser 90 durch eine Richtungskopplung 92 oder andere geeignete Einrichtungen gekoppelt. Das aus dem Ende der Faser 90 kommende Licht wird durch eine GRIN-Linse 95 genau eingestellt, geht durch eine dikroitische Strahlspalteinrichtung 97 und wird von einer GRIN-Linse 100 auf das Ende des Faseroptikkabels 82 erneut fokussiert. Der Strahlspalteinrichtung unterstellt man, daß sie die Infrarotstrahlung von den Laserdioden passiert, aber sichtbares Licht reflektiert.
  • Die von Hand gehaltene Sonde 80 enthält einen Handgriff 102, eine innere GRIN-Linse 105 und eine kegelstumpfförmige Ausrichtungsspitze 110. Das aus der Faser 82 kommende Licht wird durch die GRIN-Linse 105 an einem Brennpunkt 115 fokussiert, d. h. etwas jenseits der Ausrichtungsspitze 110. Die Ausrichtungsspitze wird in die Nähe der Teströhre gebracht, welche die Probe enthält, so daß der Brennpunkt 115 in der Probe liegt. Es wird angenommen, daß die Teströhre die Laserstrahlung durchläßt.
  • Ein Teil des aus dem Bereich des Brennpunkts 115 in der Probe kommenden Lichts wird von der GRIN-Linse 105 gesammelt, in die Faser 82 fokussiert, mit der GRIN-Linse 100 genau eingestellt und bei der dikroitischen Strahlspalteinrichtung 97 reflektiert. Dieses Licht kann Wellenlängen bis zu den drei Emissionsbanden enthalten. Optische Filter 120a–c richten die betreffenden Komponenten auf betreffende Photodetektoren 125a–c. Eine spezielle Filteranordnung ist gezeigt, wo jeweils ein Filter Licht in einer betreffenden Emissionsbande reflektiert, doch würden auch andere Anordnungen verwendet werden, wenn beispielsweise einer oder mehrere der Filter Bandpaßfilter für die Emissionsbanden wären.
  • Die Steuerelektronik ist nicht gezeigt, doch könnte sie die Multiplex-Vorrichtung für die Zeit oder interferenzerzeugende Technik, wie oben diskutiert, einarbeiten. Solche Techniken wären notwendig beispielsweise, wenn die Emissionsbanden nicht deutlich wären.
  • 7A ist eine schematische Darstellung einer Ausführungsform der Erfindung, in welcher eine ladungsgekoppelte Einrichtung (CCD), die einen Bereich 150 abbildet, als ein Detektor in Kombination mit einer zweidimensionalen Anordnung 152 von Peptiden oder anderen biologisch aktiven Verbindungen verwendet wird, die auf einem Glas- oder Kunststoffsubstrat abgelagert sind. Die CCD-Anordnung hat eine Anzahl einzeln adressierbarer lichtempfindlicher Detektorelemente 155 mit einer darüberliegenden Passivierungsschicht 157, während die Peptidanordnung eine Anzahl einzelner Bindungsstellung 160 hat. Die Sonde, die den Phosphor enthält, wäre reaktionsspezifisch für ein oder mehrere der Elemente in dieser Peptidanordnung und würde daher physikalisch an jene Elemente und nur jene Elemente gebunden. Die Peptidanordnung ist gezeigt, als habe sie eine 1 : 1-geometrische Beziehung zu der Abbildungsanordnung, in welcher ein Pixel jedem Element in der Peptidanordnung entspricht. Es ist auch möglich, größere Peptidelemente zu haben, die eine Gruppe von Detektorelementen bedecken sollten, wie erforderlich ist.
  • Verschiedene der oben beschriebenen Techniken können verwendet werden, um die Detektoranordnung in die Lage zu versetzen, die Emissionen des Phosphors von der Infrarotlaserstimulierung zu unterscheiden.
  • Erstens ist es möglich, einen Phosphor zu verwenden, der auf IR-Stimulierung jenseits des Empfindlichkeitsbereichs der Detektoranordnung reagiert. Ein Beispiel eines solchen Phosphors wäre Gadoliniumoxisulfid: 10% Erbium. Dieser Phosphor wird durch 1,5 Mikron Strahlung stimuliert und emittiert bei 960 nm und 520 nm. Die Detektoranordnung ist unempfindlich gegenüber 1,5-Mikronstrahlung, aber empfindlich gegenüber Up-Converted-Strahlung.
  • Weiterhin könnte, da die Phosphoremission relativ langsam bezüglich der Anstiegs- und Abfallzeit ist, Zeit von einer gepulsten Laserstimulierungsquelle durch die CCD-Detektoranordnung aufgelöst werden. Die Verweilzeit für das Up-Converting-Verfahren ist eine von der speziellen emittierenden Überführung und dem Phosphorwirt abhängige Variable. Sie liegt normalerweise jedoch im Bereich von 500 μs Sekunden je 10 ms. Dies ist sehr langsam im Vergleich mit dem Lasererregungsimpuls und der Fähigkeit der Detektoranordnung. Die Techniken zur Herstellung der CCD-Anordnung sind wohlbekannt, da CCD-Abbildungsanordnungen seit vielen Jahren handelsüblich sind. Verschiedene derartige Einrichtungen können vom David Sarnoff Research Center, Princeton, NY, erhalten werden.
  • Die Techniken zur Herstellung der Peptidanordnung sind in einem Papier von Fodor et al., „Light-Directed, Spatially addressable Parallel Chemical Syntheses", Science, Band 251, Seiten 767–773, 15. Februar 1991) beschrieben.
  • Die speziell beschriebene Anordnung enthält 1024 einzelne Elemente in einem Bereich von 1,28 cm × 1,28 cm.
  • Die Ausführungsform von 7A zeigt die Peptidanordnung in innigem Kontakt mit der CCD-Anordnung. In der Tat kann es möglich sein, die Peptide direkt auf der Passivierungsschicht ohne getrenntes Substrat abzuscheiden. Es kann jedoch Situationen geben, wo Anordnungen mit räumlicher Trennung bevorzugt sind. 7B zeigt eine Ausführungsform, bei der die Peptidanordnung und die CCD-Anordnung getrennt vorliegen. Eine Anordnung von Linsen 165 sammelt das Licht aus den betreffenden Bindungsstellen und fokussiert es auf entsprechende Detektorelemente. Diese Anordnung erleichtert die Verwendung von Filtern für den Extrakt insoweit, als andere Techniken für die Abweisung der Erregungsstrahlung nicht verwendet werden.
  • Optischer Einschluß kann verwendet werden, um ein Probenteilchen für eine Bestimmung des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins von Phosphor auf dem Teilchen ausgleichend zu immobilisieren. Bequemerweise kann der Wellenlängenbereich, der verwendet wird, die Probeteilchen einzufangen, im wesentlichen identisch mit einem Erregungswellenlängenbereich für den oder die Up-Converting-Phosphore, der oder die ausgewählt wurden, so daß optisches Einfangen und Erregungsbeleuchten mit der gleichen Quelle durchgeführt wird. 8 zeigt eine Blockdiagramm einer Apparatur, die für das Einfangen von kleinen Teilchen mit Einzelstrahlgradienten Kraft genutzt wird.
  • Fluoreszenz-.aktivierte Zellenauswahl
  • Die Up-Converting-Phosphore, die hier beschrieben sind, können als phosphoreszierende Etiketten als phosphorisierende Strömungs-Zytometrie verwendet werden. Ungleich herkömmlichen fluoreszierenden Farbstoffen besitzen Up-Converting-Phosphore den deutlichen Vorteil, keine Erregungsbeleuchtung in Wellenlängenbereichen (zum Beispiel UV), die genetisches Material und Zellen schädigen, zu erfordern. Typischerweise binden Up-Converting-Phosphormarkierungen an ein Bindungsreagenz, wie einen Antikörper, welches mit hoher Affinität und Spezifität an ein Zelloberflächenprotein bindet, das auf einem Unterbereich von Zellen in einer Population von Zellen in Suspension bindet. Die Phosphor-markierte Bindungskomponente wird mit der Zellsuspension unter Bindungsbedingungen in Berührung gebracht, so daß Zellen mit dem Zelloberflächenprotein an das markierte Bindungsreagenz binden, während Zellen, denen das Zelloberflächenprotein fehlt, nicht wesentlich an das markierte Bindungsreagenz binden. Die suspendierten Zellen gehen über einen Probendetektor unter Bedingungen, bei denen nur etwa eine einzelne Zelle in einer Probenermittlungszone gleichzeitig vorliegt. Eine Quelle, typischerweise ein IR-Laser, beleuchtet jede Zelle und einen Detektor, typischerweise einen Photomultiplier oder eine Photodiode, ermittelt emittierte Strahlung. Der Detektor kontrolliert die Steuerung der Zelle in der Ermittlungszone in einer von einer Mehrzahl gleicher Sammelbereiche auf der Basis des oder der ermittelten Signale. Eine allgemeine Beschreibung von FACS-Apparturen und Methoden findet sich in den US-Patentschriften 4,172,227, 4,347,935, 4,661,913, 4,667,830, 5,093,234, 5,094,940 und 5,1441,224.
  • Es ist bevorzugt, daß Up-Converting-Phosphore, die als Markierungen für FACS-Methoden verwendet werden, einen Erregungsbereich oder Erregungsbereiche haben (und vorzugsweise auch einen Emissionsbereich oder Emissionsbereiche), die nicht Zellen oder genetisches Material beschädigen. Allgemein sind Strahlungen im fernen Rotbereich und im Infrarotbereich bevorzugt für Erregung. Es wird angenommen, daß Strahlung im Bereich von 200 nm bis 400 nm vermieden werden sollte, wo möglich, und der Wellenlängenbereich von 760 nm bis 765 nm kann in Anwendungen, bei denen Aufrechterhaltung von lebensfähigen Zellen erwünscht ist, vermieden werden.
  • Weitere Abwandlungen
  • In Umgebungen, wo Absorption der Up-Converted-Phosphorstrahlung hoch ist, werden die Phosphormikroteilchen mit einem fluoreszierenden Farbstoff oder einer Farbstoffkombination in ausgewählten Mengenverhältnissen beschichtet, die bei der Up-Converting-Frequenz absorbiert und anschließend wieder bei anderen Wellenlängen bestrahlt. Da die Einzelphoton-Absorptionsquerschnitte für diese Fluore typischerweise sehr hoch sind, ist nur eine dünne Schicht für vollständige Absorption der Phosphoremission erforderlich. Diese Beschichtungsteilchen können dann eingekapselt und in einem geeigneten Antigen- oder Antikörperrezeptor (zum Beispiel Mikroteilchen) beschichtet werden. Ein Beispiel dieser Beschichtung ist schematisch in 9 dargestellt. Es existiert eine große Vielzahl von fluoreszierenden Farbstoffen mit starken Absorptionsübergängen im sichtbaren Bereich, und ihre Emission überdeckt den sichtbaren Bereich und erstreckt sich in das Infrator. Meist haben fluoreszierende Farbstoffe Wirksamkeiten von 10% oder mehr. Auf diese Weise können die Emissionswellenlängen auf den Kunden zugeschnitten werden, um die Umgebung der Teilchen zu durchdringen, und optische Störfilter können wiederum verwendet werden, um zwischen Erregungs- und Emissionswellenlängen zu unterscheiden. Wenn eine relativ große Wellenlänge „Fenster" in dem Testmedium existiert, dann ist die Variierbarkeit der Emissionswellenlängen, die eine einzelne Phosphortype bedecken können, beschränkt auf nur die Anzahl verfügbarer Farbstoffe und Farbstoffkombinationen. Unterscheidung zwischen verschiedenen Reporter-Molekülen erfolgt dann leicht unter Verwendung der spektroskopischen und Multiplex-Techniken, die hier beschrieben sind. So kann die Anzahl von Sonden/Reporter-„Fingerabdrücken", die erhalten werden kann und in einem heterogenen Gemisch von Mehrfachzielen verwendet wird, nahezu unbegrenzt.
  • Die oben beschriebenen Prinzipien können auch auf das Betreiben artspezifischer photokatalytischer und photochemischer Reaktionen angepaßt werden. Zusätzlich zu spektroskopischer Auswahl gestatten die langen Emissionsverweilzeiten der Phosphore, daß in der Emission nach dem Photobelichten relativ langsame Reaktionen oder Reaktionsreihen stattfinden. Es ist besonders brauchbar, wenn das Phosphor-[Katalysator oder Reaktionspartner]-Konjugat in eine Umgebung eintritt, welche die Erregungswellenlänge nicht durchdringen kann. Diese langsame Freisetzung steigert auch die Wahrscheinlichkeit, daß mehrere Ziele mit dem Teilchen in Wechselwirkung treten.
  • Die einzigartigen Zerfallsarten von Phosphorteilchen gestatten auch dynamische Untersuchungen. In einem System, wo kontinuierlich der Erregungsquelle ausgesetzt wird, ist es nicht möglich, oder angreifend und dadurch unerwünscht, daß gepulste Erregung, gefolgt von verzögerter Fluoreszenzermittlung erforderlich ist. Nachdem das Phosphor-Reporter-Molekül lichterregt wurde, dauert die anschließende Emission von dem Phosphor oder dem Phosphor/Farbstoff-Konjugatteilchen typischerweise etwa 1 Millisekunde. In einer dynamischen Umgebung, wie einem statischen oder fließendem System mit sich bewegenden Zielen, wird das Teilchen eine charakteristisch zerfallende Lichtintensität, während es gegenüber der Erregungs/Ermittlungsapparatur wandert. Vereinigt mit Abbildungsoptik, die geeignet für den Maßstab des Systems und die Geschwindigkeiten innerhalb des Systems ist, wird eine CCD-photoelektrische Sensoranordnung verwendet, um die Teilchen oder Teilchenbewegung über das Blickfeld der Anordnung festzustellen. Die verzögerte Emission des Phosphors, welche eine gut gekennzeichnete Zeitfunktion ist, macht die dynamische Spurverfolgung der Positionen einzelner Teilchen, der Richtungen und Geschwindigkeiten derselben und gegebenenfalls Berechnung der Teilchengröße, Dichte und hydrodynamischen Konformation möglich. Wenn sich ein Teilchen bewegt, setzt es sich mehr Elementen der Anordnung aus, jedoch mit jeweils abnehmender Intensität. Je mehr Elementen es sich über einen bestimmten Bruchteil seiner Verweilzeit aussetzt, desto schneller bewegt es sich. Daher ist das integrierte Intensitätsbild einer Teilchenemission „Bahn", gesammelt durch die Anordnung in direkter Relation zu der Geschwindigkeit des Teilchens. Die Teilchen können zu irgendeinem Zeitpunkt durch die gepulste oder zerschnittene CW-Erregungsquelle wieder aufgefrischt werden. 10 erläutert dieses Schema. Obwohl nur eine Beschreibung von „Zeit-on"-Erregung und Feststellung gezeigt sind, sind sowohl „Zeit-on"- als auch „end-on"-Feststellungs- und Erregungsanordnungen oder Kombinationen hiervon möglich. Reduzierung der CCD-Anordnungsintensitätsinformation durch Computeranalyse wird eine Spurverfolgung der Teilchen nahe der Realzeit in dynamisch sich entwickelnden oder lebenden Systemen gestatten. Datenanalyse und Reduzierung, die durch den Computer durchgeführt werden, würden eine Konvolution des eigenen Zerfalls der Phosphoremission, der Anzahl von beleuchteten Pixeln und ihres Signallevels, der Orientierung des Zerfallsignals auf der Anordnung und des Intensitätsbeitrags von einem unscharfen Kreis von Partikeln einschließen, die sich in der und außerhalb der Trennebene der Anordnung bewegen. In einer Flußfeststellungsanordnung würde die Größe des unscharfen Kreises direkt in Relation dazu stehen, wie schnell sich das Teilchen aus dem Brennpunkt bewegt und dabei die Geschwindigkeit der zu bestimmenden Teilchen erlaubt. Eine mögliche Anwendung wäre die Überwachung der Chemie und Kinetik in einer Reaktionssäule, alternativ kann die Anwendung dieser Methode auch die Flußzytometrie, die Auflösung von Zellen auf der Basis von Hydrodynamik-Eigenschaften (Größe, Form, Dichte) gestatten. Die Methode kann auch brauchbar für in vivo-diagnostische Anwendungen sein (zum Beispiel Blutperfusionsgeschwindigkeit).
  • Up-Converting-Phosphor-Markierungen können auch verwendet werden, um die Temperatur in dem Bereich abzufühlen, bei welcher die Up-Converting-Phosphor-Markierung gebunden wird. Up-Converting-Phosphor-Temperaturmessungsmethoden sind in H. Bertou und CK. Jorgensen (Oktober 1990), Optics lett. 15 (19): 1100 beschrieben.
  • Obwohl die vorliegende Erfindung in einigen Einzelheiten zur Erläuterung aus Gründen der Klarheit oder des Verständnisses beschrieben wird, liegt es auf der Hand, daß bestimmte Änderun gen und Modifikationen innerhalb des Schutzumfanges der Ansprüche vorgenommen werden können.
  • Der breite Gedanke dieser Erfindung ist am besten unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele zu verstehen, die nicht beabsichtigen, die Erfindung in irgendeiner Weise einzuschränken.
  • Experimentelle Beispiele
  • Bestätigung der anorganischen Up-Converting-Phosphore als Reporter-Moleküle
  • Up-Converting-Phosphorteilchen, die Natrium-Yttriumfluorid, dotiert mit Ytterbium-Erbium, wurde auf Untermikrongröße vermahlen, nach der Teilchengröße aufgeteilt und mit Polycarbonsäure beschichtet. Na(Y0,80Yb0,18Er0,02)F4 wurde wegen seiner hohen Effizienz bei Erregung im Bereich 940 bis 960 nm ausgewählt. Ein Nd:Yag-gepumpter Farbstofflaser/IR-Farbstoffkombination wurde verwendet, um 8-ns bis 10-ns Dauerpulse in dem obigen Frequenzbereich zu erzeugen.
  • Die Laserpulse wurden verwendet, um eine Suspension von vermahlenen Phosphorteilchen in Flüssigkeit und am Glasplättchen in situ befestigt zu beleuchten. Die Suspensions-Lumineszenz, die in rechten Winkeln beobachtet wurde, wurde unter Verwendung einer Sammellinse, eines Raumfilters zum Ausfiltrieren von gestreutem Erregungslicht bis zum maximal möglichen Umfang und eines Photomultipliers, einer Vakuum-Photodiode oder einer einfachen Photodiode im festen Zustand (abhängig von dem beobachteten Licht-Level) betrachtet.
  • Der lumineszente Signallevel wurde als eine Funktion des pH-Wertes der Lösung (Bereich: 6–8), der Korngröße, der Teilchenbeladung (μg/cm3) und der Natur der stabilisierenden anionischen oberflächenaktiven Mittel bestimmt. Signale wurde sowohl als ein Zeitintegral von einem Kastenwagen-Integrator und von einer langen RC-Zeitkonstante oder als ein kurzlebiges Signal unter Verwendung eines kurzlebigen Digitizers aufgezeichnet, um die Lumineszenz-Lebenszeit unter speziellen experimentellen Bedingungen zu zeichnen. In situ Signale wurden auch durch Laser-Rastermikroskopie gemessen. 11 ist ein Fluoreszenzraster des einfallenden Phosphor-Emissionsspektrums zur Erregung mit einer Laserquelle bei einem Wellenlängenmaximum von 977,2 nm. Das Emissionsmaximum ist etwa 541,0 nm. 12 ist ein Erregungsraster des Phosphor-Erregungsspektrums mit Emissionssammlungsfenster, eingestellt bei 541,0 nm. Das Erregungsmaximum für den Phosphor bei 541,0 nm, Emissionswellenlänge ist etwa 977 nm. 13 ist eine Zeit-Abbaumessung der Phosphor-Lumineszenz bei 541,0 nm nach Beendigung der Erregungsbeleuchtung. Maximal Phosphoreszenz erscheint bei etwa 400 μs mit einem allmählichen Abbau zu einem niedrigeren stabilen Level von Phosphoreszenz bei etwa 1000 μs. 14 zeigt die Phosphor-Emissionsintensität als eine Funktion der Erregungsbeleuchtungsintensität. Phosphoreszenzintensität wächst mit Erregungsintensität bis zu fast 2000 W/cm3.
  • Phosphoreszenzwirksamkeiten von Untermikronteilchen von Na(Y0,8Yb0,12Er0,08)F4 wurden gemessen ein Ti-Saphirlaser wurde als eine Erregungsschwelle verwendet und ein Spektrophotometer und Photomultiplier wurden verwendet als Ermittlungssystem. Zwei Typen von Messungen wurden durchgeführt. Die erste war eine direkte Messung, in welcher die absolute Emission per Teilchen für Phosphorsuspensionen in Emissionsbanden bei 540 nm und 660 nm gemessen wurde. Die kalibrierten Querschnitte sind in 15 gezeigt, und die Größenabhängigkeit ist in 16 graphisch dargestellt. Dies korrespondiert mit einem Phosphoreszenzquerschnitt von etwa 1 × 1016 cm3 für 0,3 μm-Teilchen mit Erregungslicht bei 975 nm und einer Intensität von etwa 20 W/cm2. Die Emissionseffizienz von trockenem Phosphorpulver von etwa 25 μm wurde auch gemessen. Auf der Basis bekannter Werte für den Absorptionsquerschnitt von Yb+3 in kristallinen Wirten (Lacovara et al. (1991), Op. Lett. 16: 1089) und der gemessenen Abhängigkeit der Phosphoreszenzemission von der Teilchengröße wurde ein Phosphoreszenzquerschnitt von etwa 1 × 10–15 cm2 gefunden. Der Unterschied zwischen diesen beiden Messungen kann auf einer Differenz bei der Phosphoreszenzwirksamkeit zwischen trockenem Phosphor und wäßrigen Suspensionen oder auf der Absorption mehrfach gestreuter Photonen in dem trockenen Phosphor beruhen. Auf der Basis jedes dieser Querschnittsschätzungen ist der Querschnitt ausreichend groß, um eine Ermittlung einzelner Submikronphosphorteilchen der moderaten Laserintensitäten zu erlauben. Bei Laserintensitäten von groß besagt 10 W/cm2 wächst die Phosphoreszenz wie die Laserintensität auf 1,5 Stärke.
  • Phosphorteilchenverhalten: Empfindlichkeit der Ermittlung
  • Eine Reihe von Terasaki-Platten, die Reihenverdünnungen von monodispersen Up-Converting-Phosphorteilchen mit 0,3 μm aus (Y0,86Yb0,08Er0,06)2O2S wurden hinsichtlich der Up-Convertion-Fluoreszenz unter IR-Diodenlaserbeleuchtung in einem Prototyp-Instrument getestet.
  • Die Phosphorteilchen wurden durch Stabilisieren in DMSo hergestellt und in Reihe in eine 0,1%-ige wäßrige Gummiarabikumlösung eingeführt. Dies schien die Wasserdispersionsprobleme vollständig zu beseitigen. Die verwendeten Reihenverdünnungen sind in Tabelle III aufgelistet.
  • TABELLE III
    Figure 00470001
  • Die Vorrats-DMSO-Dispersion hatte eine Phosphordichte von 1,70 ± 0,09 mg/ml (bei 95% Fehlergrenzen), bestimmt gravimetrisch durch Verdampfung von 4–1 ml Proben. Dies ergibt 23,6 × 109 Teilchen/ml (angenommen eine mittlere Teilchengröße von 0,3 μm und Teilchendichte von 5,3 g/ml). Der Rest nach Verdampfen der Proben über das Wochenende bei 110 bis 120°C war merklich gelb, phosphoreszierte aber beim Test mit einem IR-Diodenlaser.
  • Visuelles grünes Licht trat bei allen Reihenverdünnungen abwärts bis 10–3 (d. h. 1,7 μg/ml oder 23,6 × 106 Teilchen/ml) in einem 1 ml-Polypropylen-Mikroteströhrchen unter Verwendung eines in der Hand gehaltenen Diodenlasers in einem dunklen Raum. Die Verdünnungen 10–1 und 10–2 waren sichtbar trübe. Jeder μl jeder Reihenverdünnung oder 0,1 μl der nächst höheren Verdünnung wurden in eine Vertiefung auf der Terasaki-Platte pipettiert. Es wurde gefunden, daß 1 μl den Boden der Vertiefung füllt und 0,1 μl sich entlang der Kante der Vertiefung ausbreitet, aber nicht die gesamte Oberfläche bedeckt. Wegen der statistischen und Pipettierprobleme, die mit kleinen Volumina mit niedriger Teilchenkonzentration verbunden sind, wurden 2 bis 4 Replikate für jede Verdünnung hergestellt.
  • Die Vertiefung einer Terasaki-Platte nimmt eine Probe mit einem Volumen von 10 μl auf. Angenommen, daß alle Phosphorteilchen, die in diesem Volumen enthalten sind, am Boden der Probenvertiefung anhaften, können wir eine äquivalente Ermittlungsempfindlichkeit schätzen (Tabelle III). Es sollte bemerkt werden, daß 10–15 bis 10–18 M der Normalbereich von enzymgebundenen Oberflächenassays ist.
  • Kontrollproben-Ergebnisse
  • Die Kontrollproben wurden unter Verwendung einer Up-Conversion-Fluorimetereinrichtung (David Sarnmodd Research Center) abgetastet. Die Proben wurden durch Bewegung der Platte in 50 μm-Schritten unter Verwendung einer motorisierten Y-Y-Positionierstufe gegenüber dem Brennpunkt eines Infrarot-Diodenlasers bewegt.
  • Der IR-Diodenlaser wurde bei 63 mW (100 mA) betrieben. Der Strahl wurde auf 2,4 × 10–3 cm2 auf den Brennpunkt fokussiert. Da der Boden der Probenvertiefung etwa 1,4 × 10–2 cm2 (1366 μm Durchmesser) hat, bedeckt der Strahl weniger als 17% der Vertiefungsbodenoberfläche in irgendeiner individuellen Position. Die Vertiefung hat auch geneigte Seitenwände, die sich vom Boden zur Spitze der Probevertiefung aufweiten und auch befragt werden. Wenn man Verluste in der Optik außer Acht läßt, war die IR-Lichtintensität am Brennpunkt (Boden der Probenvertiefung) etwa 26 bis 27 W/cm2 bei 980 nm Wellenlänge. Ein Photomultiplierrohr (PMT) wurde zur Feststellung des von der Probe emittierten sichtbaren (Up-converted) Licht verwendet. Da die Laserstrahlbreite kleiner als die Oberfläche am Boden der Probenvertiefung war, wurde die Platte durch visuelle Inspektion gegen den Brennpunkt des Diodenlasers so ausgerichtet, daß der Laser in der Mittelvertiefung (C6 bei Ablesung der Vertiefungen C5, C6 und C7 und D6 bei Ablesen der Vertiefungen D5, D6 und D7).
  • Das PMT-Signal (Ampere) wurde bei jeder Plattenposition aufgezeichnet und numerisch über die Breite der groben Vertiefung (etwa 4000 μm) integriert. Mehrere Abtastungen wurden bei verschiedenen Positionen in der 10–2 bis 100-Verdünnungs-Probenvertiefungen gemacht, um die Gleichmäßigkeit der Teilchenverteilung zu bestimmen. Das Hintergrundsignal wurde durch Integrieren des durchschnittlichen Dunkelfeldstrom der PMT über einen Abstand von 4000 μm bestimmt, was ein integriertes Hintergrundsignal von 1 × 10–9 μa-m ergibt. Die Integrationsprodukte der Probenvertiefungen wurden zu diesem Hintergrundsignal hin maßstäblich geändert und sind in 19 gezeigt.
  • Immunodiagnostische Probenermittlung
  • Eine Reihe von IgG/Anti-IgG-Proben zum Demonstrieren der Fähigkeiten der Up-Converting-Phosphor-Reporter-Moleküle in einem Immuno-Sorbens-Assay wurde hergestellt. Diese Proben bestanden aus sechs einzelnen Vertiefungen (positive Proben), beschichtet mit Antigen (Mäuse-iGG) und Rinderserumalbumin (BSA) sowie sechs Vertiefungen, die mit BSA allein (negative Kontrolrlen) beschichtet waren. Nominal 0,3 μm große Phosphorteilchen (Y0,86Yb0,08Er0,06)2O2S mit Ziegen-Antimäuse IGG-Antikörper (Anti-IGG) beschichtet waren, wurden dann als das Reporter-Antikörper-Konjugat verwendet.
  • Sechs Vertiefungen (C5, C6, C7, D5, D6 und D7) einer klaren Polystyrol-Terasaki-Platte, wurden mit Mäuse-iGG durch Inkubieren bei 37°C gegen 5 μl einer 100 μg/μl Mäuse-iGG-Lösung in Phosphatpuffersalzlösung beschichtet. Nach einer Stunde wurde diese Lösung abgesaugt, und jede Probenvertiefung wurde mit 10 μl 3%-iger BSA in PBS gewaschen. Dies wurde unmittelbar abgesaugt und durch 20 μl 3&-iger BSA in PBS ersetzt. Jede Probenvertiefung wurde mit BSA durch Inkubieren gegen die 20 μl-BSA/PBS-Lösung während einer Stunde bei 37°C nachbeschichtet. Die Nachbeschichtungslösung wurde abgesaugt, und die Platten wurden bei 4°C über Nacht gelagert. Diese Vertiefungen wurden als positive Proben angesehen. Die gleichen sechs Vertiefungen in einer zweiten Terasaki-Platte wurden in identischer Weise hergestellt, jedoch mit der Ausnahme, daß nicht mit Mäuse-igG beschichtet wurde. Dieser zweite Satz von Probenvertiefungen wurde als negative Kontrolle angesehen.
  • Phosphor-Antikörper-Konjugat
  • Eine Lösung von (Y0,86Yb0,08Er0,06)2O2S-Phosphorteilchen wurde durch Suspendieren der drei Phosphore in DMSO hergestellt. Die Anfangsteilchendichte war etwa 107-Teilchen/ml, bestimmt durch Auszählung der Teilchenzahl, die in dem Feld eines optischen Mikroskops enthalten war. Es sei bemerkt, daß die 0,3 μm fundamentale Teilchengröße unter den Auflösungsgrenzen des Mikroskops lagen. Diese Lösung ließ man ungestört drei Tage absitzen. Das oben Schwimmende, das trüb war und wahrscheinlich hauptsächlich monodisperse kleinere Teilchen enthielt, wurde für anschließende Konjugation verwendet.
  • Ziegen-Mäuse-iGG-Antikörper (Ab) wurde (durch Adsorption) mit DMSO-fraktionierten Phosphorteilchen konjugiert. Dieses erfolgte durch Vermischen von 200 μl der Ab-Lösung (in 0,1 m Tris-HCl, pH 7,2) mit 100 μl der Phosphorsuspension in DMSO. Mehrere verschiedene Ab-Konzentrationen wurden im Bereich von 0,025 bis 1 μg/μl versucht. Eine Konzentration von 0,25 μg/μl schien in der wirksamsten Beschichtung (d. h. maximal Ab-Ausnutzng mit einem Minimum an Klumpen der Phosphorteilchen) zu sein. Die Phosphore wurden über Nacht bei Raumtemperatur mit dem Ab in dieser DMSo/Tris-Lösung mit mäßigem Rühren äquilibriert. Die resultierenden Phosphor-Ab-Konjugate wurden aus dieser Lösung zentrifugiert und in einer 3 μg/ml-BSA-Lösung in PBS für Nachbeschichtung neu suspendiert. Die resultierende BSA-PSA-Wiedersuspension wurde direkt für den Assay verwendet.
  • Der Grad der Ab-Absorption zu den Phosphoren und die Rest-Ab-Aktivität wurden durch Titrieren des phosphorgebundenen Ab mit einem Fluoreszein Isothiocyanat(FITC)-konjugierten Mäuse-igG bestimmt. Die resultierenden FITC-markierten Phosphore wurden durch ein Fließcytometer Cyteron absolute geführt, welches auch die relative Größe der Teilchen messen konnte. Zwei Unterpopulationen mit deutlicher Größe wurden mit etwa 65% der gezählten Teilchen beobachtet, die kleine, wahrscheinlich monodisperse Teilchen zu schein schienen, und 35% waren signifikant größer, wahrscheinlich Aggregate. Nur 60% der kleineren Unterpopulation schienen signifikante Mengen an aktivem Ab (bestimmt durch FITC-Fluoreszenz) zu haben. Von den besagten Aggregaten schienen etwa 90% aktives Ab zu enthalten (durch FITC-Fluoreszenez). Dies legt es nahe, daß weniger als 40% der Phosphor-Ab-Konjugate von geeigneter Größe (nominal 0,3 μm) waren und Anti-Mäuse-IgG-Aktivität zeigten. Eine ähnliche Fraktion von Phosphor-Ab-Konjugaten (31%) war aktiv, trug ber einen signifikant größeren Phosphorreporter.
  • Das PMT-Signal (Ampere) wurde bei jeder Plattenposition aufgezeichnet und numerisch über der Breite der groben Vertiefung (etwa 4000 μm) integriert. Die mittleren Signale (mit 96% Genauigkeitsgrenze) sind folgende:
    Durchschnitt positiver Proben = 1,30 × 10–4 ± 1,25 × 10–4 μa-m.
    Durchschnitt negativer Kontrollproben = 4,20 × 10–6 ± 6,82 × 10–6 μa-m. Die positiven Proben und negativen Kontrollwerte sind statistisch verschieden an der 99,9%-Vertrauensgrenze. Die positi ven Proben emittieren im Durchschnitt 30,0 ± 29,7-fach mehr Licht als die negativen Kontrollproben.
  • Bindung von Phosphoren an biologische Makromoleküle
  • Um die Parameter für Up-Converting-Phosphore als biochemische Reporter-Moleküle aufzuzeigen, wurden biologische Vernetzer an Phosphorteilchen angefügt. Natrium-Yttrium-Fluorid-Ytterbium/Erbium-Phosphorteilchen wurden mit Streptavidin beschichtet. Die Erregungs- und Emissionsspektraleigenschaften des Phosphors allein und des mit Streptavidin beschichteten Phosphors wurden gemessen (17A, 17B, 18A und 18B), und beide, die unbeschichteten und die mit Streptavidin beschichteten Phosphore waren fast identisch in ihren Absorptions- und Emissionseigenschaften, was zeigt, daß die Anbindung makromolekularer Vernetzer (zum Beispiel Proteine) nur geringe, wenn überhaupt Wirkung auf die phosphoreszierenden Eigenschaften des Up-Converting-Phosphors haben. Die mit Streptavidin beschichteten Phosphore wurden dann speziell an biotinylierte magnetische Perlen gebunden, was die Anwendbarkeit von Vernetzer-konjugierten anorganischen Phosphoren als Reporter-Moleküle in biochemischen Assays, wie Immunoassays, Immunohistochemie, Nukleinsäurehybridiserungen und anderen Assays demonstriert. Magnetperlentechnologie erlaubt die leichte Trennung von Biotin-gebundenen Streptavidin-beschichteten Phosphoren aus einer Lösung und ist besonders gut geeignet für Sandwich-Assays, worin die magnetische Perle das feste Substrat ist.
  • Vorteilhafterweise wird Streptavidin-Biotinchemie weitverbreitet in einer Vielzahl biologischer Assays verwendet, für welche Up-Converting-Phosphor-Reporter-Moleküle geeignet sind, 20 zeigt schematisch beispielsweise und nicht als Beschränkung eine Ausführungsform eines Immunoassays zur Ermittlung eines Analyten in einer Lösung durch Bindung des Analyten (zum Beispiel eines Zielantigens) an einen biotinylierten Antikörper, worin der Analyt einen Sandwich-Komplex bildet, der auf einem festen Substrat (zum Beispiel einer magnetischen Perle) durch Bindung einer ersten Bindungskomponente direkt an das feste Substrat und eine zweite Bindungskomponente (zum Beispiel den biotinylierten Antikörper) immobilisiert. Ein Streptavidin-beschichteter Up-Converting-Phosphor bindet dann speziell an den biotinylierten Antikörper in dem Sandwich und dient dazu, über die Bildung des Sandwich-Komplexes auf dem festen Substrat (was ein Maß für die Analytkonzentration ist) zu berichten. Wenn das feste Substrat eine magnetische Perle ist, wird sie leicht von der Probenlösung durch magnetische Trennung entfernt, und die Menge an Phosphor, die an die Perle(n) in Sandwich-Komplex(en) gebunden sind, werden durch Messung spezifischer Up-Converting-Phosphoreszenz bestimmt. So ergibt die Sandwich-Komplex-Phosphoreszenz ein quantitatives Maß der Analytkonzentration.
  • Biotinylierte Polynukleotide werden auch bequem als Hybridisierungssonden verwendet, die durch Streptavidin-beschichtete Up-Converting-Phosphore gebunden werden können, um über Hybridbildung zu berichten.
  • Hintergrund Phosphoreszenz in biologischen Proben
  • Hintergrundsignale wurden in zwei biologischen Proben für Bestimmung von potentiellem Hintergrund in Immunoassays bestimmt. Speichel und Urin wurden als Proben in der gleichen Apparatur verwendet, wie sie für die Phosphoreszenzempfindlichkeitsmessungen (oben verwendet werden. Es wurden keine Hintergrundwerte über den Geräuschpegeln des Systems, die durch den Photomultiplierdunkelstrom eingestellt wurden, gefunden. Dieser Rauschwert erlaubt eine Ermittlung von Signalen in der Größenordnung von einigen hundert Teilchen/cm3. Dies ist nahe an einem Einzelteilchen in dem Ermittlungsvolumen des Systems.
  • Ein Photomultiplier ist eine bevorzugte Wahl für einen Detektor für höchstempfindliche Messungen von Up-Converting-Phosphoren, da Photomultiplier so gewählt werden können, daß sie eine hohe Quantenausbeute bei den Up-Converted (d. h. emittierten) Wellenlängen und fast keine Reaktion im Bereich der längeren Erregungswellenlängen zeigen.
  • Ermittlung von Zell-Antigenen mit Phosphor-markierten Antikörpern
  • Streptavidin wird an die Up-Converting-Phosphorteilchen, wie oben beschrieben, gebunden. Das Mäuselymphom Zellinie E-4 wird mit einem Hamster-Anti-CD3-Antikörper, der spezifisch an die 30 dK-Zelloberfläche EL-4 CD3 T Lymphozyt-Differenzierungs-Antigen bindet. Der primäre Hamster-Antikörper wird dann spezifisch von einem biotinylierten Ziegen-Antihamster-Sekundär-Antikörper gebunden. Der biotinylierte sekundäre Antikörper wird dann mit dem Streptavidin-Phosphor-Konjugat ermittelt. Diese Art von Mehrfach-Antikörperbindung und -markierung wird als Antikörperschichtung bezeichnet.
  • Zugabe von Mehrfachschichtungen (zum Beispiel Bindung des primären Hamster-Ab mit dem Ziegen-Antihamster Ab, gefolgt von einer Bindung mit einem biotinylierten Kaninchen-Antiziegen-Ab) wird verwendet, um den Abstand zu erhöhen, der den Phosphor von dem Ziel trennt. Die Schichtungswirkung auf die Signalintensität und die Spezifität der Zielermittlung wird kalibriert und optimiert für die Einzelanwendung durch Durchführung der Schichtenantikörperschichtung aus einer Schicht (primärer Antikörper ist biotinyliert) zu wenigstens fünf Schichten und Sicherstellung der optimalern Zahl von Schichten für die Ermittlung von CD3 auf EL-4-Zellen.
  • 21 zeigt schematisch gleichzeitige Ermittlung von z wie EL-4-Zellen-Oberflächen-Antigenen unter Verwendung von Phosphoren, die auf der Basis von Erregungs- und/oder Emissionsspektren unterschieden werden können. Ermittlung beider Antigene in dem in 21 gezeigten Schema verwendet einen biotinylierten Terminal-Antikörper, der mit Streptavidin-beschichtetem Phosphor (#1 oder #2) vor der Inkubation mit Ab-geschichteten Probe konjugiert ist. Somit wird die Phosphor-Antikörper-Spezifität über die ungewöhnlich starke Kd' etwa 1 × 1015 M–1) nicht kovalente Bindung zwischen Streptavidin und Biotin beibehalten, die vor der Inkubation mit der primären Antikörper-gebundenen Probe vorgeformt wurde. Quantifizierung eines jeden Antigens erfolgt durch Ermittlung der deutlichen Signale, die jeder einzelnen Phosphorart zuzuschreiben sind. Phosphoreszenzsignale können auf der Basis von Erregungsspektrum, Emissionsspektrum, Fluoreszenzabbauzeit oder einer Kombination dieser oder anderer Eigenschaften unterschieden werden.
  • 22 zeigt ein Schema einer Apparatur für phasenempfindliche Ermittlung, die zusätzliche Hintergrundunterscheidung ergibt. Der Puls- oder Frequenzmischer wird so eingestellt, daß das Signal passiert und gegen den Hintergrund nach Frequenzkalibrierung für maximale Hintergrundabweisung unterschieden wird.
  • Kovalente Konjugation von Up-Converting-Phosphor-Markierung an Avidin
  • Ein Up-Converting-Yttrium-Ytterbium-Erbium(Y0,86Yb0,08Er0,06)-Oxisulfit(O2S)-Phosphor wurde nach dem folgenden Verfahren an Avidin gebunden:
  • Monodisperse Up-Converting-Phosphorteilchen wurden mit Silan, nämlich mit Thiopropyltriethosysilan (Huls) behandelt, nachdem das detaillierte Verfahren nach Arklles (in: Silicone Compounds: Register and Review., Hills, America, Seite 59–75, 1991) erfolgte. Diese bestand aus der Zugabe von Thiopropyltriethoxysilan (2 g) und 95%-igem wäßrigem Ethanol (100 ml) in einem 500 ml-Erlenmeyerkolben und wurde zwei Minuten gerührt. Etwa 8 ml der 65 mg/ml-Phosphorsuspension in DMSO wurden dann dem Gemisch zugesetzt. Diese Suspension wurde weitere zwei Minuten gerührt, dann in Zentrifugenröhrchen überführt und zentrifugiert, um die Phosphorteilchen abzutrennen. Die Pellets wurden zweimal mit 85%igem wäßrigem Ethanol gewaschen, wobei jeweils zentrifugiert wurde. Die resultierenden Teilchen wurden gesammelt und über Nacht unter Vakuum bei etwa 30°C getrocknet. Eine Menge (127 mg) von trockenem, mit Silan behandelten Phosphoren wurde wieder in 1,5 ml DMSO (Phosphorlagermaterial) suspendiert.
  • Eine 1,10 mg Avidin (Pierce) in 1,0 ml Boratpuffer enthaltende Lösung (954 mg Natriumboratdecahydrat und 17,7 ml 0,1 N NaCl in 50 ml entionisiertem Wasser, pH 8,3) wurde hergestellt (Avidinlagerlösung). Eine andere Lösung enthielt 1,7 mg N-Succinimidyl(4-jodacetyl)-aminobenzoat (Pierce Chjemical) in 1,2 ml DMSO wurde hergestellt (SIAB-Stock). Eine Menge (10 μl) des SIAB-Stock wurde zu den 1,0 ml Avidinspeichermaterial zugegeben und bei Raumtemperatur 30 Minuten gerührt, um zu erlauben, daß der N-Hydroxysuccimidester des STAB mit primären Aminen auf dem Avidin (Avidin-SIAB-Lagermaterial) zu reagieren.
  • Eine 20-ml-Szintillationsphiole wurde vorbereitet, so daß sie 10 ml Boratpuffer (pH 8,3) enthielt. Die folgenden Zusätze erfolgten dann zu dieser Phiole: 21,6 μl des Avidin-SIAB-Lagermaterials als Lösung, gefolgt von 1,5 ml des Phosphormaterials. Dieses Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur im Dunklen über Nacht gerührt, um das mit SIAB-aktivierte Avidin mit den Thiolgruppen auf der mit Silan behandelten Phosphoroberfläche reagieren zu lassen und in der kovalenten Bindung von Avidin zu den Phosphorteilchen zu kommen.
  • Nach Inkubation über Nacht wurde 1,0 ml des Reaktionsgemisches zentrifugiert (1 Minute bei 10.000 g), und das oben Schwimmende wurde entfernt. Das Pellet wurde wieder in 1,0 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (pH 7,2, Pierce) suspendiert und wieder zentrifugiert, um unkonjugiertes Protein von den Phosphoren zu entfernen. Dieses Waschverfahren wurde wiederholt. Die gewaschenen Pellets wurden erneut in 1,0 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung suspendiert und direkt in diagnostischen Assays, wie nachfolgend beschrieben, verwendet.
  • Meßapparatur
  • Ein modifiziertes Fluorimeter SLM Aminco 48000 wurde verwendet, das Fluoreszenzspektrum von den Phosphorproben zu messen. Die Modifikationen an diesem Gerät bestanden in dem Zusatz einer Laserdiode (David Sarnoff CD-299R-FA #13), die durch Öffnung 3 in das Fluorimeter eingeführt wurde. Die Laserdiode emittiert bei λ = 985,1 nm. Die von der David Sarnoff Research Center bereitgestellten Spektraldaten zeigen auch einen kleinen Peak bei 980,2 nm. Dieser Peak hat ^5% der Intensität des Peaks bei 985 nm.
  • Eine Linse mit einem Brennpunkt bei 5,08 cm wurde verwendet, um den Diodenlaserstrahl parallel zu richten. Die Energie des IR-Laserlichtes wurde an der Küvettenstelle mit einem Treiberstrom von 75 mA als 6,1 mW gemessen. Der Strahl wurde nicht in der Mitte der Küvette fokussiert. Dies gilt auch für das sichtbare Standardlicht aus dem Fluorimeter-Erregungsmonochromator. Der Laserdiodenstrahl divergiert, wenn er in den Küvettenhalter eintritt, und ist etwa 4 mm(h) × 2 mm(V) und erreicht mit der Zeit die Mitte der Zelle unter Vernachlässigung der Änderungen im Brechungsindex der Zellwand und der Flüssigkeit.
  • Emittiertes Licht wird mit einem Monochromator abgetastet und eine Photomultiplierröhre (PMT) 90° von der Richtung des erregten Lichtes festgestellt. Die Feststellungsgrenzen für das modifizierte SLM Aminco 48000 wurden durch Reihenverdünnung bestimmt und waren 4 × 10–16 M (240.000 Phosphorteilchen je ml) in PBS. Phosphor Emissions-Peaks wurden bei Wellenlängen von 406 ± 2 nm, 434 ± 2 nm, 522 ± 2 nm und 548 ± 2 nm gefunden. Der größte Peak war bei 548 nm. Die Intensität des Peaks bei 548 nm wurde verwendet, um Proben zu unterscheiden.
  • Bindung von Avidin-Phosphorkonjugat an Zelloberflächenmarker
  • Eine lymphoplastoide Zellinie (Human Genetic Mutant Cell Repository #GM07092) wurde in RPMI 1640-Mediun mit einem Gehalt von 15% mit Wärme-inaktiviertem Kälberfötusserum kultiviert. Eine Suspension von Zellen (107 Zellen) wurde zentrifugiert und erneut in einem gleichen Volumen von Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei pH 7,4 suspendiert. Zellen wurden zweimal in PBS gewaschen und erneut bis zu einer Endkonzentration von 5 × 106 Zellen/ml suspendiert. Diese Zellen wurden dann mit einem monoklonalen Antikörper mit Mäuse-IgGI zu menschlichem β-Mikroglobulin, einem Histokompatibilitäts-Antigen Klase I in Polystyrol/Zentrifugenröhren inkubiert. Die Zellen wurden 30 Minuten bei 4°C mit einer Antikörperkonzentration von 10 μg/ml immuno ausgefällt. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren gesammelt, zweimal in PBS gewaschen, erneut in PBS suspendiert, und dann wurde ein Anteil (250 μl) in 6 frischen Zentrifugenröhren verteilt. Vier dieser Proben erhielten mit Biotin behandeltes Ziegen-Antimäuse-igG, während die restlichen beiden FITC-markiertes Ziegen-Antimäuse-IgG bekamen. Diese Immuno-Ausfällungen wurden bei 4°C während 30 Minuten in einem Volumen von 400 μl mit einer zweiten endgültigen Antikörperkonzentration von 20 μg/ml durchgeführt. Die Zellen wurden gesammelt und in PBS gewaschen, wie oben, doch wurden sie in 50 μl Blockierpuffer, (0,2% gereinigtes Casein in PBS, Tropix, Bedford, MA) wieder suspendiert. Die Zell-Antikörperkomplexe wurden in dieser Lösung 30 Minuten bei Raumtemperatur blockiert und dann in frische Röhren überführt.
  • Eine vorblockierte Suspension (40 μl) von jedem, dem Avidin-Phosphorkonjugat, dem Avidin-FITC, Avidin oder unkonjugiertem Phosphor, wurde zu vier der Zellproben, konjugiert mit dem mit Biotin behandelten Antimäuse-IgG (N & L), zugegeben. Außerdem wurde eine gleiche Menge an vorblockiertem Avidin-Phosphor oder unkonjugiertem Phosphor zu den restlichen beiden Zellproben, die monoausgefält mit dem nicht mit Biotin behandelten FITC-markierten Antimäuse-IgG (N & L) zugesetzt.
  • Die Avidin-Reporterkonjugate oder negativen Kontrollen wurden wie folgt vorgeblockt. Avidin-Phosphor und Phosphor allein wurden in Blockierpuffer durch Zusatz von 10 μl einer 6,7 mg/ml-Suspension auf eine Endvolumen von 100 μl verdünnt. Avidin-FITC und das Avidin allein kontrolliert auch in blockierendem Puffer verdünnt durch Zugabe von 27 μl einer 2,5 mg/ml-Lösung zu einem Endvolumen von 100 μl. Diese Reagenzien wurden bei Raumtemperatur 3 Stunden mit intermittierender Resuspensierung geblockt und dann zu 50 μl Zellen, die durch Biotinbehandlung oder Nicht-Biotinbehandlung markierte zweite Antikörper waren. Die Avidin-Biotinreaktionen wurden bei Raumtemperatur während 30 Minuten mit gelegentlicher Umsuspendierung durchgeführt. Die Reaktionen wurden durch Sammeln der Zellen durch Zentrifugieren und zweimaliges Waschen in blockierendem Puffer angehalten. Die Proben wurden erneut in 100 μl Blockierpuffer blockiert und erlaubt, sich vier bis 5 Minuten zu setzen. Objektträger für Abbildungen wurden durch Pipettieren von 5 μl sich absetzender Zellen vom Boden des Röhrchens vorbereitet. Zellen wurden durch konfokale Lasermikroskopie unter geeigneten Bedingungen abgebildet, um die Zelloberfläche FITC und Up-Converting-Phosphorsignale zu beobachten. Die Beobachtungen sind in Tabelle IV zusammengestellt.
  • Der Rest der Proben wurde verwendet, um paramagnetische Polystyrolperlen wieder zu suspendieren, die mit Schaf-Antimäuse-IggG gebunden waren. Für jede der sechs Proben wurden 3 × 107 Perlen mit Blockierpuffer während einer Stunde bei Raumtemperatur in Eppendorf-Röhrchen vorgewaschen. Der Puffer wurde durch Absaugen entfernt, während die Röhrchen in einem magnetischen Halter waren. Die magnetischen Perlen mit Antimäuse-IgG ließ man an die markierten Antikörperzelle während einer Stunde bei Raumtemperatur mit dazwischenliegender Wiedersuspension binden. Die magnetischen Perlen wurden dann auf einem magnetischen Halter gesammelt, viermal in Blockierpuffer gewaschen, in 100 μl Blockierpuffer wiedersuspendiert, zu einem frischen Röhrchen überführt, und Up-Converting-Phosphoreszenz wurde auf dem Fluorimeter gemessen.
  • Zum Abtasten wurde für Phosphoremission der Emissionsmonochromator bandbreit auf 8 nm eingestellt, und die Spektren wurden von 500 auf 700 nm mit einer Stufengröße von 2 nm abgetastet. Proben wurden auch hinsichtlich des FITC-Signals durch Erregen der Proben mit 37 μM bei λ = 490 nm mit einer Bandbreite von 2 nm. Da die Erregungswellenlänge (490 nm) und die Emissionswellenlänge (514 nm) sehr nahe bei FITC liegen, wurde eine höhere Auflösung verlangt, um trennbare Signale zu bekommen, im Vergleich mit Phosphormarkierung. Die Intensität des 490 nm-Signal war 240 μW/cm2 in der Mitte der Vertiefung. FITC-Emissionsspektren wurden bei 0,5 nm an Teilen von 450 nm bis 750 nm mit einer Bandbreite von 2 nm auf dem Emissionsmonochromator abgetastet. Probe 1 ist die positive Kontrolle und ergab klar das höchste Emissionssignale. Probe 2 zeigt, daß eine unspezifische Adsorption des Phosphors auf die Probe beschränkt ist und leicht von Signalen unterscheidbar ist, die Avidin-konjugiertem Phosphor zuzuschreiben sind und zeigt, daß an Phosphore gebundenes Avidin spezifisch nur binden kann, wenn sie mit der Sonde konjugiert sind, in diesem Beispiel durch die Biotin-Avidin-Bindung. Probe 3 ist die negative Kontrollprobe, die keine Phosphore, sondern nur Avidin enthält. Probe 4 zeigt FITC-konjugiertes Avidin. Obwohl FITC-Signale auf der Zelloberfläche durch Lasermikroskopie beobachtet wurden, waren die Signale unter dem Level der Ermittlung auf dem Fluorimeter für FITC-Messung, und da es keinen Phosphor in der Probe gab, wurde dort kein signifikantes Phosphorsignal erstellt. Proben 5 und 6 zeigen, daß FITC-konjugierte primäre Antikörper ermittelt werden können und daß die Gegenwart von Phosphor oder Avidin-Phosphor nicht signifikant die Bindung des primären Antikörpers an sein Ziel-Antigen unterbricht.
  • Tabelle IV
    Figure 00550001
  • Bindung von Avidin-Phosphorkonjugat an DNA
  • Plasmid-DNBA (25 μg) wurde herb übertragen in Gegenwart von 20 mM dGTP, 20 mM DCTP, 20 mM Bioton-14 dATP, 13 mM dTTP und 7 mM DTTP Digoxigenin-11 dUTP und durch Ethanol-Ausfällung gereinigt. Die mittlere Größe des mit Biotin behandelten Digoxigenin-markierten Fragments wurde auf zwischen 200 und 300 Nukleotiden geschätzt, wie es durch Gelelektroforese geschätzt wurde. Etwa 20 μg DNA wurde immuno-ausgefällt während einer Stunde bei 22°C mit monokonalem Mäuse-Antiddigoxigenin-IgG1-Lösung (PBS) in einem Volumen von 200 μl. Ein Äquivalent Reaktionsgemisch ohne DNA-Gehalt wurde auch hergestellt. Jede der zwei Proben wurde dann anteilweise (50 μl) in drei frische Eppendorfröhren überführt.
  • Die Avidin-Konjugate wurden eine Stunde bei Raumtemperatur durch Verdünnung mit 500 μg einer Avidin-Phosphor-Suspension, unkonjugierter Phosphor-Suspension oder Avidin-Lösung in 300 ml Blockierpuffer geblockt. Für jede der Proben (zusammengefaßt nachfolgend in Tabelle V) wurden 50 μl des Antidigoxigenin-Konjugats zu 150 μl der vorblockierten Avidin-Konjugate oder Avidin zugesetzt und wurden 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
  • Ungebundene Avidin-Konjugate wurden durch Wiedersuspendieren von 3 × 107 paramagnetischen Perlen, gebunden an Schaf-Antimäuse-IgG (vorblockiert in Blockierpuffer) entfernt. Nach Inkubation während 30 Minuten bei Raumtemperatur mit intermitterender Wiedersuspendierung wurden die Perlen auf einem magnetischen Gestell getrennt und vier- bis sechsmal mit PBS gewaschen. Die an Antikörper-DNA gebundenen Perlen wurden dann auf dem Fluorimeter gemessen.
  • Die Proben wurden von 500 bis 700 nm mit einer Bandbreite von 8 nm und einer Stufengröße von 2 nm abgetastet. Jeder berichtete PMT-Wert (Tabelle V) repräsentiert einen Mittelwert von 5 Abtastungen. Von Probe 1 erwartet man, daß sie das höchste PMT-Signal liefert, da mit Biotin behandelte DNA vorliegt und an die Avidin-gebundenen Phosphore binden kann. Probe 2 zeigt den Level von nicht-spezifischer Absorption der Phosphore an die Probe, für die man fand, daß sie unwichtig sind, da das PMT-Signal als das gleiche wie jenes der negativen Kontrollprobe (Probe 4), die keine Phosphore enthält, ermittelt wird. Probe 3 ist eine andere Kontrollprobe und zeigt, daß die Avidin-gebundenen Phosphore nicht an die paramagnetischen Perlen in Abwesenheit von DNA binden. Proben 5 und 6 zeigen Ergebnisse von FITC-markiertem Avidin, das für die Gültigkeit der zu überprüfenden Assays verwendet wurde.
  • Tabelle V Ergebnisse diagnostischer Assays mit Up-Converting-Phosphor-Nukleinsäure
    Figure 00560001
  • Phosphor-Down-Conversion-Bewertung
  • Eine Probe des Phosphors (Y0,86'Yb0,08Er0,06)2O2S wurde hinsichtlich des Vorhandenseins eines Down-Converted-Signals abgetastet. Dies erfolgte durch Erregen einer Probe des monodispersen Phosphors, der oben beschrieben wurde (4 × 10–12 M in DMSO) mit 1,3 mW monochromatischem Licht bei 350 nm mit einer Bandbreite von 16 nm für die Erregungsquelle. Ermittlung erfolgte durch Abtasten dieser Probe von 350 bis 800 nm mit einem Monochromator mit Bandbreite 8 nm. Das Abtasten erfolgte in Schritten von 2 nm. Es wurde keine Down-Conversion beobachtet. Außerdem wurde keine Down-Conversion bei den Erregungswellenlängen beobachtet, die von Tanke et al. (US-Patent 5,043,265) zitiert sind. So ist es unwahrscheinlich, daß die Up-Converting-Phosphore jene sind, die von Tanke et al. berichtet wurden.
  • Homogene Assays
  • Das für Up-Converting-Phosphore charakteristische Multiphotonen-Aktivierungsverfahren kann verwendet werden, um Assays zu produzieren, die keine Probenwaschstufen erfordern. Solche diagnostische Assays, die nicht der Entfernung von ungebundenen Phosphormarkierung aus der Probe erfordern, sind hier als homogene Assays bezeichnet und können auch pseudohomogene Assays genannt werden.
  • Homogenes Assay – Beispiel 1
  • Eine Ausführungsform eines homogenen Assays besteht aus der Verwendung einer Up-Converting-Phosphor-Markierung, gebunden an eine geeignete Sonde (zum Beispiel einen Antikörper oder DNA). Die Phosphor-markierte Sonde bindet speziell an ein Ziel (zum Beispiel Antigen oder Nukleinsäure), das an eine Einfangfläche gebunden ist. Eine geeignete Einfangfläche kann die Spitze einer lichttragenden optischen Faser (23) oder die Bodenfläche eines Probenbehälters (24) sein. Bei Inkubation der zielmarkierten Einfangfläche mit der Phosphor-markierten Sonde wird Phosphorteilchen an der Einfangfläche als eine Funktion der Zielmenge auf der Einfangfläche ansammeln. Das Ziel kann direkt an die Einfangfläche binden oder kann durch Wechselwirkung mit einem Bindemittel (zum Beispiel einem spezifischen Antikörper, der mit dem Ziel Polynukleotid reagieren kann, welches an das Ziel gebunden ist), das selbst an die Einfangfläche gebunden ist (wie beispielsweise in einem Sandwich-Immunoassay).
  • Feststellung des an die Einfangfläche gebundenen Phosphors wird unter Verwendung eines Erregungslichts bewirkt, das von einem Strahl niedriger Intensität und mit großem Querschnitt zu einem Strahl hoher Intensität und mit kleinem Querschnitt fokussiert wird, wobei der Brennpunkt des Strahlt bei oder sehr nahe der Einfangfläche ist. Fokussieren des Erregungslichts erfolgt durch Übertragung durch optische Elemente, die einen sehr kurzen Brennpunktabstand haben, so daß der Strahl divergiert, in einem kurzen Abstand von der Einfangfläche weniger intensiv wird.
  • Da die Intensität des von den Up-Converting-Phosphor-Markierungen emittierten Lichts proportional zu der Erregungslichtintensität ist, angehoben bis zu einer zweifachen oder größeren Energie, werden Phosphore nahe dem Brennpunkt der erregenden Quelle signifikant mehr Licht als jene emittieren, die in Suspension in der Probe von der Einfangfläche wegbleiben. Daher wird ein Binden von Up-Converting-Phosphor an die Einfangfläche gebundenen Sonden eine Zunahme der emittierten Lichtintensität, gemessen an der Probe als Ganzes oder gemessen an einer Kontrollprobe, in welcher Phosphore nicht an die Einfangfläche gebunden sind. Emittierte Lichtintensität kann als eine Funktion der Zielkonzentration unter Verwendung für Standardisierung (Kalibrierung) einer Reihe von Proben, die vorbestimmte Zielkonzentrationen enthalten, ausgedrückt werden. Die emit tierten Lichtintensität von einer Testprobe (unbekannte Zielkonzentration) kann mit der so erzeugten Standardkurve verglichen werden, um die Zielkonzentration zu bestimmen.
  • Beispiele von geeignetem homogenem Assayformat enthalten, jedoch nicht darauf beschränkt, immunodiagnostische Sandwich-Assays und Antigen- und/oder Antikörperoberflächenassays in kompetitiver Form.
  • Homogenes Assay Beispiel 2
  • Eine andere Ausführungsform gestattet für die Ansammlung von Sonden, die an Up-Converting-Phosphor an der Ermittlungsfläche durch die Anwendung von Zentrifugal- oder Gravitationskräfte ein Absitzen. Bei dieser Ausführungsform wird ein Up-Converting-Phosphor an Mehrfachsonden gebunden. Alle Sonden müssen an das gleiche Ziel binden, obwohl diese Bindung an unterschiedlichen Stellen (zum Beispiel als Antikörpersonden kann das Ziel aus verschiedenen Epitomen auf einem einzigen Antigen bestehen) angeordnet sein kann. Der Multisonden-Phosphor kann dann verwendet werden, um die Aggregation von Zielen in Lösung oder Suspension in der Probe zu bewirken. Diese Aggregation führt zur Bildung eines großen unlöslichen Phosphor-Sonden-Zielkomplex, der aus der Lösung oder Suspension ausfällt (25). Der Komplex im Aggregatzustand, der Phosphoransammlungen an einer Ermittlungsfläche enthält, während nicht der Aggregation unterworfenes Material in Lösung oder Suspension bleibt. Feststellung erfolgt, wie beschrieben in dem obigen Beispiel, unter Verwendung eines schart konvergierenden Erregungsstrahls.
  • Obwohl die vorliegende Erfindung in einigen Einzelheiten zur Erläuterung zum Zweck der Klarheit und des Verständnisses beschrieben wurde, liegt auf der Hand, daß bestimmte Veränderungen und Modifikationen innerhalb des Erfindungsgedankens erfolgen können.

Claims (5)

  1. Vorrichtung zum Analysieren einer Probe, die möglicherweise ein lumineszierendes Phosphor-Up-converting-Reporter-Molekül enthält, gekennzeichnet durch eine Erregungsbande in einem ersten Wellenlängenbereich und eine Emissionsbande in einem zweiten Wellenlängenbereich kürzerer Wellenlängen als jene in dem ersten Bereich mit: einer Quelle, die Licht in einem Wellenlängenbereich emittieren kann, der wenigstens einen teil der Erregungsbande des lumineszierenden Phosphor-Up-converting-Phosphor-Moleküls überlappt, worin die Erregungsbande eine Wellenlänge von 950 bis 1000 nm hat, einer Einrichtung zur Versorgung dieser Quelle mit Energie, einem Detektor, der Licht im Wellenlängenbereich feststellen kann, der wenigstens einen Teil der Emissionsbande des lumineszierenden Phosphor-Up-converting-Reporter-Moleküls überlappt und worin die Emissionsbande im sichtbaren Bereich des Spektrums liegt, einer ersten Einrichtung, die wenigstens einen Teil des von der besagten Quelle emittierten Lichts unter Einschluß von Licht in dem ersten Wellenlängenbereich und unter Ausschluß von Licht in dem zweiten Wellenlängenbereich zu einer Stelle auf der Probe richtet, einer zweiten Einrichtung, die wenigstens einen Teil des von der besagten Stelle an der Probe abgestrahlten Lichts unter Einschluß von Licht in dem zweiten Wellenlängenbereich zu dem Detektor lenkt und einer mit dem Detektor gekoppelten Einrichtung zur Erzeugung eines elektrischen Signals, das repräsentativ für die Intensität des Lichteinfalls an dem Detektor in einem Wellenlängenbereich ist, welcher Wellenlängen in dem zweiten Bereich einschließt und Wellenlängen in dem ersten Bereich ausschließt.
  2. Vorrichtung nach Anspruch 1, bei der der Detektor auf Licht in dem ersten und zweiten Bereich reagiert und die zweite Lenkungseinrichtung ein Wellenlängen-selektives Element enthält und nur Licht mit Wellenlängen in dem zweiten Bereich den Detektor erreicht.
  3. Vorrichtung nach einem der vorausgehenden Ansprüche, bei der die Probe möglicherweise zusätzlich ein zweites Reporter-Molekül enthält, gekennzeichnet durch eine Erregungsbande in einem dritten Wellenlängenbereich und eine Emissionsbande in einem vierten Wellenlängenbereich und worin der erste und dritte Bereich nicht überlappen und der zweite und vierte Bereich nicht überlappen, weiterhin mit einer zweiten Quelle, die Licht im Wellenlängenbereich emittieren kann, der wenigstens einen Teil der Erregungsbande des zweiten Reporter-Moleküls überlappt, einer Einrichtung, welche die zweite Quelle mit Energie versorgt, einem zweiten Detektor, der Licht in einem Wellenlängenbereich feststellen kann, der wenigstens einen Teil der Emissionsbande des zweiten Reporter-Moleküls überlappt, einer dritten Einrichtung, die wenigstens einen Teil des von der zweiten Quelle emittierten Lichts unter Einschluß von Licht in dem dritten Wellenlängenbereich und unter Ausschluß von Licht in dem vierten Wellenlängenbereich zu einer Stelle an der Probe emittiert, einer Einrichtung, die wenigstens einen Teil des von der besagten Stelle an der Probe abstrahlenden Lichts unter Einschluß von Licht in dem vierten Wellenlängenbereich zu dem Detektor lenkt und einer zusätzlichen Einrichtung, die mit dem zweiten Detektor gekoppelt ist zur Erzeugung eines elektrischen Signals, das für die Intensität des einfallenden Lichts an dem zweiten Detektor in einem Wellenlängenbereich repräsentativ ist, welcher Wellenlängen im vierten Bereich einschließt und Wellenlängen im ersten, zweiten und dritten Bereich ausschließt.
  4. Vorrichtung zum Analysieren einer Probe, die möglicherweise erste und zweite lumineszierende Phosphor-Up-converting-Reporter-Moleküle enthält, worin das erste Reporter-Molekül durch eine Erregungsbande in einem ersten Wellenlängenbereich und einer Emissionsbande in einem zweiten Wellenlängenbereich gekennzeichnet ist, welche letztere kürzer als die Wellenlängen im ersten Bereich sind, wobei das zweite Reporter-Molekül durch eine Erregungsbande in einem dritten Wellenlängenbereich und eine Emissionsbande in einem viertel Wellenlängenbereich gekennzeichnet ist und worin der erste und dritte Bereich nicht überlappen und der zweite und vierte Bereich nicht überlappen, mit einer ersten Quelle, die Licht in einem Wellenlängenbereich emittieren kann, der wenigstens einen Teil der Erregungsbande des ersten Reporter-Moleküls überlappt, worin die Erregungsbande eine Wellenlänge von 950 bis 1000 nm hat, einer zweiten Quelle, die Licht in einem Wellenlängenbereich emittieren kann, der wenigstens einen Teil der Erregungsbande des zweiten Reporter-Moleküls überlappt, einer Einrichtung zur Versorgung der ersten und zweiten Quelle mit Energie einschließlich einer Einrichtung, die der ersterwähnten und der zweiten Quelle unterschiedliche Intensitätsmuster erteilt, einem Detektor, der Licht in einem Wellenlängenbereich feststellen kann, der wenigstens einen Teil der Emissionsbande des Reporter-Moleküls überlappt, wobei die Emissionsbande im sichtbaren Bereich des Spektrums liegt, einer Einrichtung, die wenigstens einen Teil des von der ersten und zweiten Quelle emittierten Lichts unter Einschluß von Licht in dem ersten und dritten Wellenlängenbereich und unter Ausschluß von Licht in dem zweiten und vierten Wellenlängenbereich zu einer Stelle an der Probe lenkt und einer mit dem Detektor gekoppelten Einrichtung zur Erzeugung erster und zweiter elektrischer Signale, die für die betreffenden Intensitäten von auf dem Detektor einfallendem Licht bei Wel lenlängen im zweiten und vierten Bereich und außerhalb des ersten und dritten Bereichs repräsentativ sind, einschließlich einer Einrichtung zur Unterscheidung der unterschiedlichen Intensitätsmuster.
  5. Verfahren zum Analysieren einer Probe, die ein lumineszierendes Phosphor-Up-Converting-Reporter-Molekül enthält, gekennzeichnet durch eine Erregungsbande in einem ersten Wellenlängenbereich und eine Emissionsbande in einem zweiten Wellenlängenbereich, dessen Wellenlängen kürzer als die Wellenlängen in dem ersten Bereich sind, wobei man eine Probe vorsieht, die ein lumineszierendes Phospor-Up-Converting-Reporter-Molekül enthält, welches durch eine Erregungsbande in einem ersten Wellenlängenbereich und eine Emissionsbande in einem zweiten Wellenlängenbereich gekennzeichnet ist, wobei letztere Wellenlängen kürzer als die Wellenlängen in dem ersten Bereich sind, eine Quelle vorsieht, die Licht in einem Wellenlängenbereich emittieren kann, der in der Erregungsbande des Reporter-Moleküls liegt, wobei die Erregungsbande eine Wellenlänge von 950 bis 1000 nm hat, einen Detektor vorsieht, der Licht in einem Wellenlängenbereich feststellen kann, der in dem Erregungsbereich des Reporter-Moleküls liegt, einen Detektor vorsieht, der Licht in einem Wellenlängenbereich feststellen kann, der in der Emissionsbande des Reporter-Moleküls liegt, wobei die Emissionsbande in dem sichtbaren Bereich des Spektrums liegt, von der Quelle emittiertes Licht zu einer Stelle an der Probe lenkt, von der Stelle an der Probe ausgestrahltes Licht zu dem Detektor lenkt und ein elektrisches Signal erzeugt, das für die Intensität von Licht in einem Wellenlängenbereich repräsentativ ist, welcher Wellenlängen in dem zweiten Bereich einschließt und Wellenlängen in dem ersten Bereich ausschließt.
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