JP2003177096A - レーザー励起技術を用いる生物学的および他の分析のためのアップコンバート性レポータ - Google Patents

レーザー励起技術を用いる生物学的および他の分析のためのアップコンバート性レポータ

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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 優れた信号／ノイズ比で、しかも本質的にバ
ックグランド試料自己蛍光の発生なく、生物学的巨大分
子などのアナライトを鋭敏に検出する装置を提供する。 【解決手段】 第１範囲の波長における励起バンドと第
１範囲における波長よりも短い第２範囲の波長における
発光バンドとを特徴とするアップコンバート性ルミネセ
ントレポータを有しうる試料の診断装置において：レポ
ータを励起する発光光源と；前記発生源を付勢する手段
と；レポータの発光を検出しうる検出器と；前記発生源
により発光された光の少なくとも１部を試料のに指向さ
せる第１手段と；試料から発散する第２範囲の波長にお
ける光の少なくとも１部を前記検出器に指向させる第２
手段と；第２範囲の波長を含むと共に第１範囲の波長を
排除する範囲の波長にて前記検出器に入射する光の強度
を示す電気信号を発生する前記検出器に連結させた手段
とを備える、試料における診断の実施装置。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の背景 本発明は一般に、たとえば蛋白質、炭水化物、核酸、細
菌、ウィルスおよび真核性細胞のような可溶性、懸濁も
しくは微粒子物質またはアナライトを検出するための分
析法に有用な検出可能なラベルおよび組成物に関し、よ
り詳細にはルミネセント（燐光性もしくは蛍光性）ラベ
ルを含む組成物および方法に関するものである。
【０００２】たとえば蛋白質、薬物およびポリヌクレオ
チドのような特定の巨大分子物質を検出する方法は、特
に正常および異常な組織試料および遺伝子物質の分子組
成を特性化するため生物学および医学において極めて価
値ある分析技術であると証明されている。種々異なる多
くの種類のこの種の検出法は、生物医学研究および臨床
実験医学にて広く使用されている。この種の検出法の例
は次のものを包含する：免疫分析、顕微鏡検査のための
免疫化学染色、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、核酸
ハイブリッド化、水試料採取、空気試料採取など。典型
的には、検出法は特定の標的巨大分子物質に結合して検
出可能な信号を発生する少なくとも１種の分析試薬を用
いる。これら分析試薬は典型的には次の２種の成分を有
する：（１）プローブ巨大分子、たとえば高度の特異性
および親和性にて標的巨大分子に結合しうる抗体もしく
はオリゴヌクレオチド、並びに（２）たとえば放射性同
位元素または共有結合した蛍光染料分子のような検出可
能なラベル。一般にプローブ巨大分子の結合性がこの検
出法の特異性を規定し、関連するラベルの検出性がこの
検出法の感度を決定する。検出の感度は用いるラベルの
種類、並びにこれを検出すべく入手しうる装置の品質お
よび種類の両者に関係する。
【０００３】たとえば放射性免疫分析（ＲＩＡ）は、生
物学的巨大分子の検出および定量するため用いられる最
も鋭敏かつ特異的な分析法である。放射性免疫分析技術
は、たとえばポリペプチド、薬物、ステロイドホルモ
ン、ポリヌクレオチド、代謝物および腫瘍マーカーのよ
うな生物学的試料における微量の特定アナライトの検出
および測定に使用されている。放射性免疫分析法は、分
析試薬としての１種もしくはそれ以上の放射性同位元素
で標識された免疫グロブリンを用いる。付着した放射性
同位元素ラベルの減衰により発生する放射線（α，βも
しくはγ）は、各種の放射能分析法により検出および定
量しうる信号として作用する。放射性同位元素ラベルは
たとえば次のような数種の利点を有する：極めて高い検
出感度、極めて低いバックグランド信号、および精密な
放射能分析装置（シンチレーションおよびγカウンタ）
または安価かつ鋭敏な自動放射能写真技術による正確な
測定。しかしながら、放射性同位元素ラベルは次のよう
な幾つかの欠点をも有する：潜在的な健康被害、処分の
困難性、特殊な認可要件、および不安定性（放射能減衰
および放射能分解）。さらに放射性同位元素ラベルが典
型的には電磁スペクトルの紫外、赤外もしくは可視部分
にて強力（すなわち非−セレンコフ）信号を発生しない
と言う事実は、放射性同位元素を一般にたとえば顕微鏡
検査、画像分光分析および流動血球測定のような光学的
検出法を用いる用途のラベルとして不適当にする。
【０００４】これらおよび他の理由で臨床化学、水およ
び空気の監視、並びに生物医学研究の分野は、放射性同
位元素を必要としない代案の検出可能なラベルを求めて
いる。この種の非放射性ラベルの例は次のものを包含す
る：（１）発色性基質から不溶性着色物質への変換を触
媒する酵素（たとえばアルカリホスファターゼ、β−ガ
ラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ）または
蛍光性もしくはルミネセント物質を生成する反応を触媒
する酵素（たとえばルシフェラーゼ）［ベックおよびコ
スター（１９９０）、アナリチカル・ケミストリー、第
６２巻、第２２５８頁；Ｉ．デュラント（１９９０）、
ネイチャー、第３４６巻、第２９７頁；「生物ルミネセ
ントおよび化学ルミネセントの分析用途」（１９８
４）、クリッカ等（編）、アカデミック・プレス社、ロ
ンドン］、並びに（２）特定の吸収波長スペクトルにて
電磁エネルギーを吸収し、次いで１つもしくはそれ以上
の長い（すなわちエネルギーの低い）波長にて可視光を
発する直接的蛍光性ラベル（たとえばフルオレスセイン
イソチオシアネート、ローダミン、カスケードブル
ー）。
【０００５】酵素と燐光性／蛍光性もしくは比色検出可
能なラベルメとの使用は信号増幅の顕著な利点を与え
る。何故なら、単一の酵素分子は典型的には発色性基質
から検出可能な物質への変換を触媒する持続性の能力を
有するからである。適する反応条件および培養時間によ
り単一の酵素分子は多量の生成物を生産し、したがって
相当な信号増幅を与えることができる。しかしながら、
ラベルとして酵素を用いる検出法は、着色物質の生成お
よび検出に適する条件下で、適切な基質濃度を与えるに
は追加工程および試薬を必要とする点で不利である。さ
らに、酵素ラベルに基づく検出法は典型的には、検出可
能量の生成物を生ぜしめるには長時間を必要とすると共
にプローブ分子に付着しない不溶性物質を発生する。酵
素ラベルの他の欠点は、酵素標識されたプローブにより
複数の標的物質を検出するのが困難なことである。２種
もしくはそれ以上の個々の酵素ラベル物質につき反応条
件および展開時間を最適化するには問題があり、さらに
発色性最終生成物には顕著なスペクトル重複がしばしば
存在して反応生成物の識別を困難にする。
【０００６】蛍光性ラベルは酵素ラベルにおける信号増
幅の利点を与えないが、蛍光性ラベルは免疫細胞化学に
て広く承認されうるような顕著な利点を有する。蛍光性
ラベルは典型的には小さい有機染料分子、たとえばフル
オレスセイン、テキサスレッドもしくはローダミンであ
って、たとえば免疫グロブリンまたはスタフィロコッカ
ス・アウレウス蛋白Ａのようなプローブ分子に容易に結
合することができる。蛍光性分子（発蛍団）は適する励
起周波数の光で照明して検出することができ、得られる
スペクトル放出は電気光学センサまたは光学顕微鏡によ
り検出することができる。広範な種類の蛍光染料を入手
することができ、励起および発光スペクトルの選択を与
える。複数標的の検出および識別を複数プローブ（各プ
ローブ物質は異なる発蛍団に結合する）にて可能にする
よう充分異なる発光スペクトルを持った発蛍団を選択す
ることができる。発蛍団のスペクトルは狭いバンド励起
および発光スペクトルの選択的検出の両者に基づいて識
別しうるので、２種もしくはそれ以上の異なる標的物質
を検出すると共に決定することができる［チツス等（１
９８２）、ジャーナル・イミュノロジカル・メソッズ、
第５０巻、第１９３頁；ニーダーロフ等（１９８９）、
サイトメトリー、第１０巻、第２０頁；Ｊ．Ｓ．プロエ
ム、アナリチカル・ＮＹアカデミー・サイエンス、第１
７７巻、第４１４頁］。
【０００７】残念ながら、蛍光性ラベルを用いる検出法
は各種の理由で限られた感度を有する。第１に、通常の
発蛍団では非特異的バックグランド信号から特異的蛍光
信号を識別するのが困難である。最も一般的な発蛍団は
幅広な吸収および発光スペクトルを有する芳香族有機分
子であって、励起（すなわち吸収）波長よりも長い波長
まで最大発光スペクトルが５０〜１００ｎｍだけ赤色に
移動する。典型的には、吸収バンドと発光バンドとの両
者はスペクトルのＵＶ／可視部分に存在する。さらに、
蛍光発光の寿命は一般に１〜１００ｎｓの程度に短い。
残念ながら、有機染料蛍光のこれら一般的特徴は、他の
試薬（たとえば固定剤もしくは血清）または自己蛍光性
もしくは試料自身により与えられるバックグランド信号
にも適用しうる［ジョングキンド等（１９８２）、エキ
スペリメンタル・セル・リサーチ、第１３８巻、第４０
９頁；Ｊ．Ｅ．オービン（１９７９）、ジャーナル・ヒ
ストケミカル・サイトケミストリー、第２７巻、第３６
頁］。光学レンズおよび反射励起光の自己蛍光性は可視
スペクトルにおけるバックグランドノイズの付加的発生
源である［ベベルロー等（１９９１）、サイトメトリ
ー、第１１巻、第７８４頁；ベベルロー等（１９９
２）、サイトメトリー、第１３巻、第５６１頁］。した
がって、典型的な発蛍団からの特異的蛍光信号の検出限
界は、非特異的な蛍光および反射励起光により与えられ
る顕著なバックグランドノイズによって制限される。
【０００８】感度を制限する有機染料発蛍団の第２の問
題は染料分子の光分解（すなわち光漂白）である。すな
わちバックグランドノイズが比較的低い状況において
も、弱い蛍光信号を長い検出時間にわたり積算すること
がしばしば不可能である。何故なら、染料分子が紫外お
よび近紫外バンドにおける入射光の関数として分解する
からである。しかしながら、蛍光ラベルは各種の用途に
魅力的であるため、鋭敏な検出につき有利な性質を有す
る幾つかの代案発蛍団が提案されている。１つの手段
は、非特異的蛍光性ノイズが減少するスペクトルの遠赤
外もしくは近赤外領域にて発光するフィコビリ蛋白アク
セプタ分子染料からなる有機染料を用いることである。
フィコビリ蛋白は、エネルギー移動メカニズムを介して
大きいストークシフトの作用を示す付属分子と組合せて
使用される［米国特許第４，６６６，８６２号；オイ等
（１９８２）、ジャーナル・セル・バイオロジー、第９
３巻、第８９１頁］。フィコビリ蛋白ラベルは、は励起
周波数と発光周波数との間のスペクトル重なり程度を減
少させる。他の代案手法は、黄色もしくは赤色領域にて
吸収すると共に自己蛍光が減少する赤色もしくは遠赤外
にて発光するシアニン染料を使用することである［ムジ
ャンバール等（１９８９）、サイトメトリー、第１０
巻、第１１頁］。
【０００９】しかしながら、フィコビリ蛋白およびシア
ニン染料の両者では発光周波数は赤色移動（すなわち周
波数低下移動）すると共に発光寿命が短く、したがって
バックグランド自己蛍光が完全にはノイズ発生源として
除去されない。より重要なことに、フィコビリ蛋白およ
びシアニン染料は幾つかの明確な欠点を有する：（１）
赤色、遠赤外および近赤外領域における発光は肉眼によ
る検出につき大して適さず、フィコビリ蛋白およびシア
ニンラベルを光学蛍光顕微鏡で使用することを妨げ；
（２）シアニン、フィコビリ蛋白および結合付属分子
（たとえばアズレＡ）は光漂白を受け易くかつ他の試薬
との望ましくない化学相互作用をもたらす有機分子であ
り；さらに（３）発光される照射線はダウンコンバート
（down-convert）され、すなわち吸収励起光よりも長い
波長を有する。たとえばアズレＡは６３２ｎｍにて吸収
すると共に６４５ｎｍにて発光する一方、アロフィコシ
アニンは６４５ｎｍにて吸収すると共に６５５ｎｍにて
発光し、したがって分散励起光からの自己蛍光およびバ
ックグランドノイズは除去されない。
【００１０】提案されている他の代案種類の発蛍団はダ
ウンコンバート性ルミネセントランタニドキレートであ
る［ソイニおよびロブグレン（１９８７）、ＣＲＣ Ｃ
ｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、第１８巻、第
１０５頁；ライフ等（１９７７）、クリニカル・ケミス
トリー、第２３巻、第１４９２頁；ソイニおよびヘミラ
（１９７９）、クリニカル・ケミストリー、第２５巻、
第３５３頁；セベウス等（１９９２）、サイトメトリ
ー、第１３巻、第３２９頁］。ダウンコンバート性ラン
タニドキレートは大きい下方向のストークス移動（すな
わち発光最大は典型的には吸収最大よりも少なくとも１
００ｎｍ大である）を有する無機燐であって、分散励起
光からの信号の識別に役立つ。ランタニド燐は、タイム
ゲート検出法に使用しうるよう充分長い（すなわち１μ
ｓより大）発光寿命を有し、短寿命の自己蛍光および分
散励起光によりもたらされるノイズを減少させうるが、
完全には除去しえない。さらにランタニド燐は狭いバン
ド発光を有し、特にレーザー励起源を用いる場合はバッ
クグランドノイズおよび分散励起光に対し波長識別を容
易化する（ライヒシュタイン等（１９８８）、アナリチ
カル・ケミストリー、第６０巻、第１０６９頁］。最
近、ダウンコンバート性ランタニドキレートを用いる酵
素増幅のランタニドルミネセントが蛍光標識技術として
提案されている［エバンゲリスタ等（１９９１）、アナ
リチカル・バイオケミストリー、第１９７巻、第２１３
頁；グジン−テンプレトン等（１９９１）、クリニカル
・ケミストリー、第３７巻、第１５０６頁］。
【００１１】最近までダウンコンバート性ランタニド燐
は、その水性（酸素化）溶液における量子効率が細胞化
学染色には不適にするような低さを有するという顕著な
欠点を有した。ベベルロー等（上記）は、時間分解法に
より検出しうる信号を水溶液中で発生する特定のダウン
コンバート性ランタニド燐（ヨーロピウムで活性化され
たイットリウムオキシスルフィド）を記載している。セ
ベウス等（上記）は、時間分解の蛍光顕微鏡法と組合せ
たダウンコンバート性ヨーロピウムキレートを用いて即
発蛍光からの信号を排除することにより自己蛍光を減少
させている。タンケ等（米国特許第５，０４３，２６５
号）は、免疫グロブリンおよびポリヌクレオチドのため
のラベルとしてダウンコンバート性燐粒子を報告してい
る。しかしながら、ベベルロー等のダウンコンバート性
ランタニド燐およびセベウス等のヨーロピウムキレート
は、紫外範囲にある最大励起波長を必要とし、したがっ
て顕著な試料自己蛍光およびバックグランドノイズ（た
とえば血清および／または固定剤の蛍光、励起光分散、
および屈折など）を発生し、これらは排除せねばならな
い（たとえばフィルタまたは時間ゲートの信号排除によ
り）。さらに、紫外線照射による励起は核酸および他の
生物学的巨大分子を損傷し、生存細胞の生存力を保持す
ると共に細胞構造（たとえばＦＡＣＳ、サイト−アーキ
テクチュラル−マイクロスコピー）を保持することが望
ましい免疫細胞化学用途につき重大な問題を提起する。
【００１２】強力に集中するレーザーパルスの流れを用
いるＵＶ励起性蛍光有機染料（ヘキスト３３２５８）の
２−フォトン励起につき、レーザー走査蛍光顕微鏡法が
使用されている［デンク等（１９９０）、サイエンス、
第２４８巻、第７３頁］。デンク等により使用された有
機発蛍団は、画像形成の過程で強力な高集中レーザー光
により顕著に光漂白された。したがって、特定ラベル信
号の鋭敏な光学的および／または顕微鏡的検出を可能に
すると共に非特異的なバッククグランドノイズをほぼ完
全に排除し、しかも生存完全細胞および水性もしくは空
気性環境に対し適合しうるようなラベルおよび検出法に
つき相当なニーズが当業界に存在する。本明細書に挙げ
た引例は本出願の出願日前に開示されたものである。し
かしながら、これらは決して本発明の特許性を妨げるも
のでない。
【００１３】発明の要点 本発明は、多重標的検出および標的識別につき使用しう
る超鋭敏な細胞、生物学的巨大分子および他のアナライ
トの検出を可能にするラベル、検出法および検出装置を
提供する。本発明のアップコンバート性（up-convertin
g ）標識は、非特異性バックグランド自己蛍光をほぼ完
全に排除しうると共に典型的にはそれぞれスペクトルの
赤外もしくは可視部分に存在する励起波長および発光波
長を特徴とし、したがって紫外線の強力な損傷作用を防
止する。本発明のアップコンバート性ラベルは長波長の
励起照射線（たとえば近赤外）を励起波長の約１／２〜
１／３の波長の発光照射線まで変換する。可視範囲にお
けるバックグランド蛍光は近赤外の励起波長を用いれば
無視しうるので、アップコンバート性ラベルの使用は実
質的にバックグランドなしの信号検出を可能にする。要
するに、本発明はマルチフォトン励起を可能にすると共
にアップシフトした発光放出スペクトルを有するルミネ
セント物質の使用を与える。本発明の一具体例において
は、アップコンバート性燐（すなわち低周波数バンドに
て複数フォトンを吸収すると共に、高周波数バンドで発
光する）をたとえば免疫クロブリン、ポリヌクレオチ
ド、ストレプトアビジン、蛋白Ａ、リセプタリガンドま
たは他のプローブ分子のような１種もしくはそれ以上の
ブローブに結合しうるラベルとして使用する。他の具体
例においては、アップコンバート性有機染料がラベルと
して作用する。本発明の有機染料ラベルおよび燐ラベル
は自動診断試験、顕微鏡画像形成用途およびコード化粒
子検出などの多くの用途に極めて適している。
【００１４】本発明の特性は、これら方法を実施する装
置における相当な融通性を与える。一般的に、励起源は
任意便利な光原とすることができ、安価な近赤外レーザ
ーダイオードまたは発光ダイオード（ＬＥＤ）を包含
し、検出器は任意便利な検出器、たとえばフォトダイオ
ードとすることができる。単一レポータの場合、装置は
レポータの励起バンドにおける１つもしくはそれ以上の
波長にて発光しうるレーザーダイオード、およびレポー
タの発光バンドにおける少なくとも幾つかの波長に対し
敏感な検出器を包含する。レーザー光は好ましくは試料
における小さい領域に集中し、この領域から発する光を
集めて検出器に指向させる。発光バンドにて光の強度を
示す電気信号は、存在するレポータ量の尺度を示す。検
出器のスペクトル応答に応じ、フィルタを設けて励起光
を阻止する必要がある。複数レポータの同時検出は、少
なくともリポータが異なる励起バンドもしくは異なる発
光バンドを有する場合に可能である。励起バンドが異な
る場合、それぞれ適する波長で発光する多重レーザーダ
イオードを波長分割マルチプレクサまたは他の適する技
術、たとえば周波数標識、周波数変調およびロックイン
検出装置を用いて組合せる。発光バンドが異なる場合
（励起バンドは異なっても異ならなくてもよい）、異な
る発光バンドにおける光を分離して多重検出器に送信す
る。発光バンドが重なる場合は単一の検出器を使用しう
るが、他の検出技術も使用される。１例は、１個のみの
レポータが所定時間で発光するよう時間マルチプレキシ
ング技術を用いることである。或いは、異なるレーザー
ダイオードを異なる特性周波数で変調し、ロックイン検
出を行うことができる。
【００１５】本発明の検出法および検出装置は、アップ
コンバート性ラベルの有利な特徴であるバックグランド
ノイズ（たとえば自己蛍光性、血清／固定剤蛍光、励起
光散乱）のほぼ完全な不存在の技術を開発してアップコ
ンバート性燐およびアップコンバート性有機染料の超鋭
敏な検出を可能にする。本発明の幾つかの具体例は、検
出感度を最適化し、複数試料を識別し、かつ／または単
一試料における複数プローブを検出するためのタイムゲ
ート検出および／または波長ゲート検出を用いる。位相
敏感検波を用いて、アップコンバート性燐に起因する信
号と異なる位相シフトを有するバックグランドノイズ
（たとえば自己蛍光）との間の識別を与えることもでき
る。たとえば赤色吸収性染料のようなアップコンバート
性有機染料を、染料により吸収されたフォトンを測定し
うる一時的電圧まで電極および慣用の電子回路により変
換する代案具体例に用いることもできる。２−フォトン
吸収を受けた後、染料を光原（たとえばレーザー）から
の他のフォトンによりイオン化させて短寿命の分子イオ
ンをもたらし、その存在を励起照射の後の一時的光な伝
導性を測定して検出および定量することができる。この
具体例においては、共鳴マルチフォトンイオン化が試料
における染料分子の個数および／または濃度の定量測定
に用いられる。さらに、照射試料で形成された実質的に
全てのフォトイオンは信号に寄与するのに対し、フォト
ンは全方向に放出されて１部のみが光学系を用いて回収
される。一時的な光電流の測定はフォトンを比較的簡単
かつ安価なセンサ（たとえば電極）で容易に測定される
電子信号まで効果的に変換する。
【００１６】ある具体例において、本発明は１つもしく
はそれ以上の個々の周波数における励起照明を発生する
ための１個もしくはそれ以上の光学レーザー源を用い
る。本発明の或る種の具体例において、アップコンバー
ト性ラベルのレーザー照射は、直接的吸収もしくはエネ
ルギー移行を含むレーザー誘起の光化学的過程を介し直
接的分子環境を改変することができる。この種のエネル
ギーの空間制御沈着を用いて局部的損傷を発生させ、か
つ／または所定位置の化学環境を検査することができ
る。この種の具体例において、アップコンバート性ラベ
ルは好ましくは光物理的触媒として作用することができ
る。本発明は、化学的もしくは生物学的物質における標
的損傷（たとえば触媒作用）の発生方法を与え、ここで
はプローブを用いて結合アップコンバート性ラベルをプ
ローブにより結合された標的生物学構造の近くの位置に
局在させる。局在化したアップコンバート性ラベルは１
つもしくはそれ以上の励起波長により励起されると共
に、直接的な細胞毒性もしくは遺伝子毒性（たとえば過
酸化物のような遊離基の発生および／またはチミン−チ
ミン２量体の発生による）としうる或いは局部的な光分
解化学反応を誘発してラベルの近傍で反応性化学物質を
もたらしうる（したがって標的の生物学的物質の近傍で
化学物質を発生しうる）短波長にて発光する。すなわ
ち、１種もしくはそれ以上のアップコンバート性ラベル
（たとえばアップコンバート性無機燐）で標識された標
的プローブを用いて生物学的構造、たとえば細胞、組
織、ネオプラスム、血管構造または他の解剖学的もしく
は組織学的構造に標的損傷を与えることができる。
【００１７】さらに本発明の具体例は、電子ビームまた
は充分なエネルギーを有するエネルギー照射の他のビー
ムにより励起しうると共に陰性ルミネセントであるアッ
プコンバート性燐をも包含する。この種の電子刺激ラベ
ルは、超鋭敏な生物分子検出法におけるバックグランド
を除去するという新規な利点を与える。典型的には、少
なくとも２個の電子によるアップコンバート性燐の刺激
を用いて、可視光またはＵＶバンド発光を生ぜしめる。
さらに本発明は、数種のアップコンバート性燐もしくは
アップコンバート性染料のマルチフォトン励起とそれに
続くバックグランドフリーの蛍光検出とを活用すること
による複数標的物質の同時検出に関する。１具体例にお
いては、１波長（または狭いバンド幅）にて同時励起を
可能にするが各プローブ−ラベル種類に識別可能な蛍光
性「指紋」が付与されるよう発光特性が変化する重なっ
た吸収バンドを有する数種の燐／染料を選択する。種々
の方法および装置を用いることにより、各燐もしくは染
料の存在および濃度を測定することができる。
【００１８】さらに本発明は、典型的には溶液における
１種もしくはそれ以上のアナライトの存在および濃度を
測定するための生化学的分析法を提供する。この分析法
は、アップコンバート性燐および／またはアップコンバ
ート性染料で標識されたプローブの組成物を用いると共
に、アナライトと標識プローブとからなる粒子を磁気的
および／または光学的に捕獲するための装置を用いる。
１具体例においてはサンドイッチ分析を行い、粒子上に
固体化された固定化プローブが所定アナライトに結合し
て粒子に対する結合アナライトの固定化をもたらす。次
いでアップコンバート性ラベルで標識された第２プロー
ブが結合アナライトに結合して、粒子に結合したアップ
コンバート性ラベルを含有する結合サンドイッチ複合体
を生成することができる。種々異なるプローブ−ラベル
の組合せ物と種々の寸法、色および／または形状の粒子
とを異なる固定化プローブおよび／または種々の励起波
長とを組合せることにより、複数分析をほぼ同時的に行
うことができる。この多重性の利点は、単一試料におけ
る複数アナライト物質の検出および定量を可能にする。
さらにこれら分析法はたとえば物理的、化学的、生化学
的もしくは免疫学的反応のような結合反応を包含する反
応の過程を監視するにも有用である。たとえば本発明
は、ハイブリダイズ速度論およびハイブリダイズしたポ
リヌクレオチドの熱力学的安定性を含めリガンド結合反
応、ポリヌクレオチドのハイブリダイズ反応などの過程
を監視すべく使用することができる。
【００１９】さらに本発明は、スペクトルの赤外部分に
存在するが細胞を顕著には損傷しない励起照射線を用
い、流動血球測定により蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣ
Ｓ）を行うための方法、アップコンバート性ラベルおよ
び標識結合試薬の組成物を提供する。これは、ＤＮＡ傷
害をもたらしかつ細胞を損傷させることが知られた波長
を含めスペクトルの紫外部分における励起照明に依存し
た現在のＦＡＣＳ法よりも顕著な利点を与える。さらに
本発明は、無機アップコンバート性燐に付着した少なく
とも１個の蛍光性有機染料分子を含む組成物をも提供す
る。蛍光性有機染料分子はローダミン、シアニン、キサ
ンテン、アクリジン、オキサジン、ポルフィリンおよび
フタロシアニンよりなる群から選択され、必要に応じ重
金属と錯体化することもできる。蛍光性有機染料は無機
アップコンバート性燐結晶に吸着させることができ、或
いは被覆された無機アップコンバート性燐、誘導化され
たガラスセラミック・アップコンバート性燐またはマイ
クロカプセル化された無機アップコンバート性燐に共有
付着することもできる。
【００２０】特定具体例の説明 定義 特記しない限りここで用いる全ての技術的および化学的
用語は本発明が属する技術分野の当業者により一般的に
理解されると同じ意味を有する。個々に説明すると同様
または均等な任意の方法および材料を本発明の実施また
は試験に使用することもできるが、好適方法および材料
につき説明する。本発明の目的で次の用語を下記に規定
する。
【００２１】ここで用いる「ラベル」という用語は適す
る励起条件下で検出可能な光学信号を発生する化学置換
基を意味する。励起したラベルにより発生する光学信号
は典型的にはスペクトルの近赤外、可視もしくは紫外部
分における電磁照射線である。本発明のラベルはアップ
コンバート性ラベルであって化学置換基が励起周波数に
て少なくとも２個のフォトンを吸収すると共に次いで励
起周波数よりも高い放出周波数にて電磁エネルギーを放
出することを意味する。すなわち、一般に初期励起周波
数と最終発光周波数との間には顕著なストロークシフト
が存在する。ラベルは一般にプローブに付着して、プロ
ーブの存在および／または位置を示すレポータとして作
用する。本発明は有機および無機のアップコンバート性
ラベルを包含するが、好ましくはアップコンバート性無
機ランタニド燐をラベルとして使用する。たとえば本発
明の典型的なラベルはサブミクロン寸法のアップコンバ
ート性ランタニド燐粒子である。
【００２２】ここで用いる「プローブ」という用語は、
標的に結合した標識プローブを非特異的に結合した標識
プローブ（すなわちバックグランド）から識別するのに
充分な親和性で１種もしくはそれ以上の標的（たとえば
抗原エピトープ、ポリヌクレオチド配列、巨大分子リセ
プタ）に優先的に結合する結合成分を意味する。一般
に、プローブ−標的結合は少なくとも約１×１０
6 Ｍ-1、好ましくは少なくとも約１×１０7 Ｍ-1、より
好ましくは少なくとも約１×１０8 Ｍ-1もしくはそれ以
上の結合親和性（ＫD ）を有する非共有相互作用であ
る。抗体は典型的には同族抗原に対し約１×１０10Ｍ-1
もしくはそれ以上の結合親和性を有する。限定はしない
が、たとえば本発明のプローブは次のものを包含する：
抗体、ポリペプチドホルモン、ポリヌクレオチド、スト
レプトアビジン、スタフィロコッカス・アウレウス蛋白
Ａ、リセプタリガンド（たとえばステロイドもしくはポ
リペプチドホルモン）、ロイシンジッパーポリペプチ
ド、レクチン、抗原（ポリペプチド、炭水化物、核酸お
よびハプテンエピトープ）など。
【００２３】ここで用いる「プローブ−ラベル結合体」
および「標識プローブ」という用語は、プローブに付着
したラベルからなる組合せ物を意味する。或る種の具体
例においては、２個以上のラベル置換基がプローブに付
着することもできる。或いは、或る具体例においては２
個以上のプローブをラベルに付着させることもできる
（たとえば複数抗体分子をサブミクロン寸法の無機アッ
プコンバート性燐ビーズに結合させることができる）。
各種の付着化学技術を用いてラベルをプローブに結合さ
せることができ、限定はしないが次の形成を包含する：
共有結合、水素結合、イオン結合、静電気相互作用およ
び表面張力（相界）相互作用。さらにラベルの付着は微
小球、微小粒子、免疫ビーズおよび超常磁性ビーズ［ポ
リサイエンス・インコーポレーション社、ワーリント
ン、ペンシルバニア州；バングス・ラボラトリース・イ
ンコーポレーション社・９７９キーストン・ウェイ、カ
ルメル、ＩＮ４６０３２］に対するラベルの組込をも包
含する。たとえば無機アップコンバート性燐粒子は、励
起および放出電磁線の波長範囲にて実質的に透明もしく
は半透明のポリマー材料で構成された微小球に包封する
ことができる（米国特許第５，１３２，２４２号、参考
のためここに引用する）。この種の微小球は、たとえば
蛋白のようなプローブへの共有結合につき１個もしくは
それ以上の反応基（たとえばカルボキシル基、アミノ
基、ヒドロキシル基またはポリアクロレイン）で表面誘
導化して官能化させることができる。プローブ−ラベル
結合体はさらに燐キレートをも含むことができる。
【００２４】ここで用いる「標的」および「標的アナラ
イト」という用語は本発明の方法により分析される目的
物を意味する。たとえば限定はしないが、標的はポリペ
プチド（たとえばｈＧＨ、インシュリン、アルブミ
ン）、グリコ蛋白（たとえば免疫グロブリン、スロンボ
モジュリン、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ；グ
ッドスピード等（１９８９）、ジーン、第７６巻、第１
頁）、リポ蛋白、ウィルス、微生物（たとえば病原性細
菌、酵母）、ポリヌクレオチド（たとえば細胞ゲノムＤ
ＮＡ、現場でのハイブリッド化に関する固定組織学的試
料におけるＲＮＡ、ナイロンもしくはニトロセルロース
膜に固定化されたＤＮＡもしくはＲＮＡ、組織もしくは
生物液におけるウィルスＤＮＡもしくはＲＮＡ）並びに
医薬品（すなわちフィジシャンス・ドラグ・リフェレン
スおよび／またはメルク・マニュアルに記載された処方
され或いは市販薬剤、またはたとえば麻酔薬もしくはア
ナボリックステロイドのような不法物質）を包含する。
【００２５】ここで用いる「抗体」という用語は免疫グ
ロブリン遺伝子により実質的にコードされる１種もしく
はそれ以上のポリペプチドよりなる蛋白を意味する。認
められている免疫グロブリン遺伝子はκ、λ、α、γ
（ＩｇＧ1 、ＩｇＧ2 、ＩｇＧ 3 、ＩｇＧ4 ）、δ、ε
およびζ一定領域遺伝子、並びに無数の免疫グロブリン
可変領域遺伝子を包含する。全長免疫グロブリン「軽
鎖」（約２５Ｋｄもしくは２１４アミノ酸）はＮＨ2 −
末端（約１１０アミノ酸）にて可変領域遺伝子によりコ
ードされ、さらにＣＯＯＨ−末端にてκもしくはλ一定
領域遺伝子によりコードされる。全長免疫グロブリン
「重鎖」（約５０Ｋｄもしくは４４６アミノ酸）も同様
に可変領域遺伝子（約１１６アミノ酸）および他の上記
一定領域遺伝子の１種、たとえばγ（約３３０アミノ酸
をコードする）によりコードされる。免疫グロブリンの
１形態は抗体の基本的構造単位を構成する。この形態は
４量体であって、同一の２対の免疫グロブリン鎖で構成
され、各対は１個の軽鎖と１個の重鎖とを有する。各対
において、軽鎖および重鎖の可変領域は共に抗原に対す
る結合に関与し、さらに一定領域は抗体イフェクタ機能
に関与する。抗体の他に、免疫グロブリンはたとえばＦ
ｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ′）2 、並びに２官能性ハイ
ブリッド抗体［たとえばランザベチア等、ヨーロピアン
・ジャーナル・イミュノロジー、第１７巻、第１０５頁
（１９８７）］のような各種の他の形態、並びに一本鎖
［たとえばハストン等、プロシーディング・ナショナル
・アカデミー・サイエンスＵＳＡ、第８５巻、第５８７
９〜５８８３頁（１９８８）；およびバード等、サイエ
ンス、第２４２巻、第４２３〜４２６頁（１９８８）］
にて存在することもできる［一般にフード等、「イミュ
ノロジー」、Ｎ．Ｙ．ベンジャーミン、第２版（１９８
４）；並びにフンカピラーおよびフード、ネイチャー、
第３２３巻、第１５〜１６頁（１９８６）参照］。すな
わち必ずしも全ての免疫グロブリンが抗体ではない
［Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ． ０７／６３４，２７８号（参考の
ためここに引用する）およびコ等（１９９１）、プロシ
ーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンスＵＳ
Ａ、第８８巻、第２８６９頁（参考のためここに引用す
る）参照］。
【００２６】ここで用いる「プローブポリヌクレオチ
ド」という用語は、所定の標的ポリヌクレオチドに特異
的にハイブリダイズするポリヌクレオチドを意味する。
限定はしないが、たとえばプローブポリヌクレオチドは
特定ｍＲＮＡ配列に対応するｃＤＮＡの１部、ゲノムク
ローンの１部、特異的ハイブリッド化につき公知の標的
配列に対し充分な配列ホモロジーを有する合成オリゴヌ
クレオチド（たとえばテロマーリピートＴＴＡＧＧＧも
しくはＡｌｕ反復配列）、転写ＲＮＡ（たとえばＳＰ６
クローン化用ベクター挿入物から）またはポリアミド核
酸［ニールセン等（１９９１）、サイエンス、第２５４
巻、第１４９７頁］とすることができる。各種の標的ポ
リヌクレオチドは、標的配列に対する標識プローブポリ
ヌクレオチドのハイブリッド化によって検出することが
できる。限定はしないが、たとえば標的ポリヌクレオチ
ドは次のものとすることができる：ゲノム配列（たとえ
ば構造遺伝子、染色体反復配列、調整配列など）、ＲＮ
Ａ（たとえばｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｒＲＮＡなど）、
病原体配列（たとえばウィルスもしくはマイコプラスマ
ＤＮＡもしくはＲＮＡ配列）またはトランスジーン配
列。
【００２７】「特異的ハイブリッド化」という用語はプ
ローブポリヌクレオチドと標的ポリヌクレオチドとの間
のハイブリッドの形成として規定され、プローブポリヌ
クレオチドはたとえば少なくとも１個のバンドが標的ポ
リヌクレオチド配列を有する真核性細胞から作成された
ＤＮＡのサウザンブロットで同定されるよう標的ＤＮに
対し優先的にハイブリダイズし、かつ／または完全核に
おけるプローブポリヌクレオチドは独特もしくは反復配
列を特徴とする個々の染色体位置に局在する。或る種の
例においては、標的配列が２個以上の標的ポリヌクレオ
チド物質に存在することができる（たとえば特定標的配
列は遺伝子群の複数因子または既知の反復配列に存在す
ることができる）。最適ハイブリッド化条件は標的とす
るポリヌクレオチドおよび標的の配列組成および長さ、
並びに実施者により選択される実験法に応じて変化する
ことが明らかである。種々の指針を用いて、適するハイ
ブリッド化条件を選択することができる［マニアチス
等、モレキュラ・クローニング：ラボラトリー・マニュ
アル（１９８９）、第２版、コールド・スプリング・ハ
ーバー、Ｎ．Ｙ．、並びにベルガーおよびキンメル、メ
ソッズ・イン・エンチモロジー、第１５２巻、「分子ク
ローニング技術に対する指針」（１９８７）、アカデミ
ック・プレス・インコーポレーション社、サンジエゴ、
ＣＡ；デュン等（１９８９）、ジャーナル・バイオロジ
カル・ケミストリー、第２６４巻、第１３０５７頁；さ
らにグッドスピード等（１９８９）、ジーン、第７６
巻、第１頁参照］。
【００２８】ここで用いる「ラベル励起波長」という用
語は、アップコンバート性ラベルにより吸収された際に
アップコンバート性ラベルから検出可能な蛍光発光を発
する電磁線波長を意味し、蛍光発光はラベル励起波長よ
りも短い波長（すなわちより高い周波数の照射線）を意
味する。ここで用いる「ラベル発光波長」という用語
は、１つもしくはそれ以上の励起波長でアップコンバー
ト性ラベルを照明した後に或いはそれと同時にアップコ
ンバート性ラベルから発光する波長を意味する。アップ
コンバート性ラベルのラベル発光波長は対応の励起波長
よりも短い（すなわち、より高い周波数の照射線）。ラ
ベル励起波長とラベル発光波長との両者は個々のアップ
コンバート性ラベルに特性的であり、簡単な励起および
発光走査を行って容易に決定される。
【００２９】発明の要点 本発明は、励起波長により励起され、次いでアップシフ
ト周波数（すなわち励起照射線よりも高い周波数）にて
電磁線を発する蛍光ラベルを包含する。本発明によれ
ば、アップコンバート性無機燐および／またはアップコ
ンバート性有機染料からなるラベルが種々の用途に提供
される。本発明のアップコンバート性ラベルは１種もし
くはそれ以上のプローブに付着されて、プローブの位置
のレポータ（すなわち検出可能なマーカー）として作用
することができる。アップコンバート性ラベルはたとえ
ば抗体、ストレプトアビジン、蛋白Ａ、細胞リセプタの
ポリペプチドリガンド、ポリヌクレオチドプローブ、薬
物、抗原、毒素などの各種のプローブに付着することが
できる。プローブに対するアップコンバート性ラベルの
付着は、各種の結合化学技術を用いて特定プローブの性
質に応じ行うことができる。限定はしないが、たとえば
マイクロクリスタリン質アップコンバート性ランタニド
燐粒子を微粉砕に際しポリカルボン酸（たとえばアディ
ションＸＷ ３３０、ヘキスト社、フランクフルト、ド
イツ国）で被覆し、各種の蛋白（たとえば免疫グロブリ
ン、ストレプトアビジンもしくは蛋白Ａ）を燐粒子の表
面に物理的に吸着させることができる［ベベルロー等
（１９９１）、上記、参考のためここに引用する］。或
いは、限定はしないが次のものを包含する各種の無機燐
被覆技術を用いることができる：噴霧乾燥、プラズマ沈
着、並びに燐粒子に付着され或いは酸化珪素とアップコ
ンバート性燐組成物とからなるガラスセラミック燐粒子
に組込まれた−ＳｉＯＨ部分に対するシラン結合剤によ
り付着した官能基（たとえば−ＣＯＯＨ、−ＮＨ2 、−
ＣＯＮＨ2 ）での誘導化。ガラスセラミック燐粒子は、
たとえばアミノ基をリンカー分子におけるガラスセラミ
ック表面に結合させる目的でアミノプロピルトリエトキ
シシランによりアミノ化しうるが、他のω−官能化シラ
ンを用いて他の官能基を付着させることもできる。たと
えば蛋白もしくはポリヌクレオチドのようなプローブを
次いで直接に共有結合により、たとえばシロキサン結合
もしくは炭素−炭素結合を介し、燐粒子の表面に共有結
合もしくは吸着されたリンカー分子（たとえば有機官能
性シリル化剤）に共有結合させてガラスセラミック燐に
付着させることができる。
【００３０】マイクロクリスタリン質アップコンバート
性燐粒子は典型的には直径が約３μｍ以下、好ましくは
直径が約１μｍ以下（すなわちサブμｍ）、より好まし
くは直径が０．１〜０．３μｍもしくはそれ以下であ
る。一般に燐粒子をできるだけ小さくすると共に検出可
能な信号を発生するのに充分な量子変換効率を保持する
ことが最も好ましい。しかしながら、任意特定の用途に
つき、使用すべき燐粒子の寸法は実施者の判断で選択す
べきである。たとえば、或る種の用途（たとえば少量の
細胞表面抗原の検出）は、小さい必要はないが高い変換
効率および／または吸収断面を持たねばならない高感度
の燐ラベルを必要とするのに対し他の用途（たとえば浸
透化した細胞における多量の核抗原の検出）は、細胞下
構造に容易に拡散浸透しうるが高変換効率を持たなくて
もよい極めて小さい燐粒子を必要とする。したがって無
機燐粒子の最適寸法は用途に依存し、本発明の各種の燐
に関する量子効率データに基づいて実施者により選択さ
れる。この種の変換効率データは入手しうる刊行物（た
とえばハンドブックおよび公開された引例）から得るこ
とができ、或いは量子変換効率を粒子寸法の関数として
測定する標準曲線を作成して得ることもできる。たとえ
ば小燐粒子の高感度検出を必要とするような或る種の用
途では、赤外レーザーダイオードが励起源として好適に
選択される。
【００３１】アップコンバート性燐の性質については後
に詳細に説明するが、これは関与する基本メカニズムを
要約するのに有用である。アップコンバーション（up-c
onversion ）は、稀土類イオンを或る種の結晶物質中に
含有する或る種の材料で生ずることが判明した。たとえ
ばイッテルビウムおよびエルビウムは、たとえばバリウ
ム−イットリウム−フルオライドのような燐ホスト材料
において活性化剤カップルとして作用する。イッテルビ
ウムイオンは吸収剤として作用し、エネルギーを非放射
的に移行させてエルビウムイオンを励起させる。したが
って、発光はエルビウムイオンのエネルギーレベルの特
徴である。
【００３２】アップコンバート性マイクロクリスタリン
燐 本発明は各種のアップコンバート性無機燐を用いて実施
しうるが、好適具体例はそれぞれ少なくとも１種の活性
化剤カップルでドープされた数種の異なる燐ホスト材料
の１種から誘導された１個もしくはそれ以上の燐を用い
る。適する燐ホスト材料は次のものを包含する：ナトリ
ウムイットリウムフルオライド（ＮａＹＦ4 ）、ランタ
ンフルオライド（ＬａＦ3 ）、ランタンオキシスルフィ
ド、イットリウムオキシスルフィド、イットリウムフル
オライド（ＹＦ3 ）、イットリウムガレート、イットリ
ウムアルミニウムガーネット、ガドリニウムフルオライ
ド（ＧｄＦ3 ）、バリウムイットリウムフルオライド
（ＢａＹＦ5 、ＢａＹ2 Ｆ8）およびガドリニウムオキ
シスルフィド。適する活性化剤カップルは次のものから
選択される：イッテルビウム／エルビウム、イッテルビ
ウム／ツリウムおよびイッテルビウム／ホルニウム。ア
ップコンバーションに適する他の活性化剤カップルも使
用することができる。これらホスト物質と活性化剤カッ
プルとの組合せにより、少なくとも３種の異なる発光ス
ペクトル（赤色、緑色および青色可視光）を有する少な
くとも３種の燐が得られる。一般に、吸収剤はイッテル
ビウムであり、発光中心は次のものから選択することが
できる：エルビウム、ホルミウム、テルビウムおよびツ
リウム。しかしながら、本発明の他のアップコンバート
性燐は他の吸収剤および／または発光剤を含有すること
もできる。吸収剤と放出性中心とのモル比は典型的には
少なくとも約１：１、より一般的には少なくとも約３：
１〜５：１、好ましくは少なくとも約８：１〜１０：
１、より好ましくは少なくとも約１１：１〜２０：１、
典型的には約２５０未満：１、一般に約１００未満：
１、より一般的には約５０未満：１〜２５：１である
が、所望の特性（たとえば化学特性、製造効率、吸収断
面、励起波長および発光波長、量子効率または他の考
慮）に基づき実施者により種々の比を選択することがで
きる。選択する比は一般に、選択される特定の吸収剤−
発光剤カップルにも基づき、所望の特性に応じ基準値か
ら計算することができる。
【００３３】吸収剤（たとえばイッテルビウム）と発光
中心（たとえばエルビウム、ツリウムもしくはホリミウ
ム）との最適比は特定の吸収剤／発光剤カップルに応じ
て変化する。たとえばＹｂ：Ｅｒカップルにつき吸収
剤：発光剤の比は典型的には約２０：１〜約１００：１
の範囲であるのに対し、Ｙｂ：ＴｍおよびＹｂ：Ｈｏカ
ップルにつき吸収剤：発光剤の比は典型的には約５０
０：１〜約２０００：１の範囲である。これらの異なる
比は、結晶におけるＹｂレベルに対するＥｒ、Ｔｍもし
くはＨｏの異なる対応エネルギーレベルに起因する。大
抵の用途にて、アップコンバート性燐は便利には約１０
〜３０％のＹｂを含み、さらに約１〜２％のＥｒ、約
０．１〜０．０５％のＨｏもしくは約０．１〜０．０５
％のＴｍのいずれかを含むが、他の組成も用いることが
できる。本発明の幾つかの具体例は、約９５０〜１００
０ｎｍ、好ましくは約９６０〜９８０ｎｍの赤外線によ
り最適に励起される無機燐を用いる。限定はしないが、
たとえば式ＹＦ3 ：Ｙｂ0.10Ｅｒ0.01のマイクロクリス
タリン無機燐は約９８０ｎｍの励起波長にて最大ルミネ
セント強度を示す。本発明の無機燐は典型的には、可視
範囲にある発光最大を示す。たとえば特定の活性化剤カ
ップルは特徴的な発光スペクトルを有する。イッテルビ
ウム−エルビウムカップルは可視スペクトルの赤色もし
くは緑色部分に燐ホストに応じて発光最大を示す。イッ
テルビウム−ホルミウムカップルは一般に緑色部分で最
大発光し、イッテルビウム−ツリウムは典型的には青色
範囲に発光最大を有し、さらにイッテルビウム−テルビ
ウムは一般に緑色範囲で最大発光する。たとえばＹ0.80
Ｙｂ0.19Ｅｒ0.01Ｆ2 はスペクトルの緑色部分で最大発
光する。
【００３４】種々の組成のアップコンバート性無機燐結
晶が本発明での使用に適しているが、本発明を限定する
ものでなくたとえば次の組成が一般に適している： Ｎａ（Ｙx Ｙｂy Ｅｒz ）Ｆ4 ： ｘは０．７〜０．９
であり、ｙは０．０９〜０．２９であり、ｚは０．０５
〜０．０１であり； Ｎａ（Ｙx Ｙｂy Ｈｏz ）Ｆ4 ： ｘは０．７〜０．９
であり、ｙは０．０９９５〜０．２９９５であり、ｚは
０．０００５〜０．００１であり； Ｎａ（Ｙx Ｙｂy Ｔｍz ）Ｆ4 ： ｘは０．７〜０．９
であり、ｙは０．０９９５〜０．２９９５であり、ｚは
０．０００５〜０．００１であり； （Ｙx Ｙｂy Ｅｒz ）Ｏ2 Ｓ： ｘは０．７〜０．９で
あり、ｙは０．０５〜０．１２であり、ｚは０．０５〜
０．１２である。（Ｙ0.86Ｙｂ0.08Ｅｒ0.06）2 Ｏ3 が
比較的効率的なアップコンバート性燐材料である。
【００３５】限定はしないが例示の目的でイッテルビウ
ム（Ｙｂ）−エルビウム（Ｅｒ）ドープされたイットリ
ウムオキシスルフィドは９５０ｎｍでの励起の後に緑色
にて発光する。これらは非線状燐であって、イッテルビ
ウムは２個の９５０ｎｍフォトンにつき「アンテナ」
（吸収剤）として作用し、そのエネルギーを発光剤（活
性化剤）として作用するエルビウムに移行させる。燐の
臨界的な粒子寸法は緑色発光に関する量子収率および一
般に約１〜１０％、より好ましくは約２〜５％の範囲に
あるＹｂとＥｒとの両者のドープレベルにより与えられ
る。典型的なＹｂ：Ｅｒ燐結晶は約１０〜３０％のＹｂ
と約１〜２％のＥｒとを含む。すなわち、数千のフォー
ミュラ単位を有する燐粒子は、典型的なレーザー照射時
間に際し少なくとも１個もしくはそれ以上のフォトンの
放出を確保する。しかしながら、吸収と放出との間の非
直線的関係は、励起波長における強力な照明が極めて小
さい燐粒子（すなわち約０．３μｍ未満）を用いる具体
例にて満足な信号を得るのに必要であることを示す。さ
らに、極めて小さい燐粒子を生成させて量子変換効率を
最大化させるには、活性化剤／放出剤カップルのドーピ
ングレベルを増加させることが一般に望ましい。
【００３６】稀土類活性化剤を有する無機マイクロクリ
スタリン燐は一般に狭い吸収およびライン発光スペクト
ルを有する。ライン発光スペクトルは稀土類イオン内の
ｆ−ｆ転移に基づく。これらは遮蔽内部転移であって、
狭いライン発光をもたらす。たとえば高感度検出が必要
とされる或る種の用途において、たとえば赤外レーザー
源（たとえば連続波（ＣＷ）もしくはパルス半導体レー
ザーダイオード）のような市販の発生源により強力な照
明を得ることができる。たとえばマイクロクリスタリン
燐粒子を極めて小さくせねばならずかつ量子変換効率が
低いような用途において、強力なレーザー照明は信号を
増大させると共に検出時間を減少させることができる。
或いは、本発明の或る種の用途は固有の低い量子変換効
率を有する燐組成物（たとえば低ドープレベルの活性化
剤カップル）を必要とするが、他の所望の特徴（たとえ
ば製造効率、誘導化の容易さなど）を有する。この種の
低効率のアップコンバート性燐は好ましくは物質の吸収
最大における或いはそれに近い（約２５〜７５ｎｍ）の
周波数にてレーザー照明により励起される。アップコン
バート性燐以外からはもはや他の光が系で発生しないと
いう事実は、特に励起照射源として強力なレーザー照明
を使用する場合、極めて敏感な信号検出を可能にする。
たとえばアップコンバート性燐によるフォトンエネルギ
ーのアップコンバーションの独特な性質は、マイクロク
リスタリン無機燐の極めて小さい粒子の検出を可能にす
る。超感度レポータとしての特に細胞内レポータとして
の燐の実際的使用については、燐の粒子寸法をできるだ
け小さくすることが重要であり（典型的には約０．３未
満〜０．１μｍ）、これにはレーザー励起のアップコン
バート性燐が極めて適している。
【００３７】たとえばアップコンバートしうる各種の燐
材料組成物が、第Ｉ表に示すように本発明での使用に適
している。
【００３８】
【表１】 第Ｉ表：燐材料組成物 ホスト材料 吸収剤イオン 発光剤イオン 色 オキシスルフィド（Ｏ2 Ｓ） Ｙ2 Ｏ2 Ｓ イッテルビウム エルビウム 緑色 Ｇｄ2 Ｏ2 Ｓ イッテルビウム エルビウム 赤色 Ｌａ2 Ｏ2 Ｓ イッテルビウム ホルミウム 緑色 オキシハライド（ＯＸy ） ＹＯＦ イッテルビウム ツリウム 青色 Ｙ3 ＯＣｌ7 イッテルビウム テルビウム 緑色 フルオライド（Ｆx ） ＹＦ3 イッテルビウム エルビウム 赤色 ＧｄＦ3 イッテルビウム エルビウム 緑色 ＬａＦ3 イッテルビウム ホルミウム 緑色 ＮａＹＦ3 イッテルビウム ツリウム 青色 ＢａＹＦ5 イッテルビウム ツリウム 青色 ＢａＹ2 Ｆ8 イッテルビウム テルビウム 緑色 ガレート（Ｇａx Ｏy ） ＹＧａＯ3 イッテルビウム エルビウム 赤色 Ｙ3 Ｇａ5 Ｏ12 イッテルビウム エルビウム 緑色 シリケート（Ｓｉx Ｏy ） ＹＳｉ2 Ｏ5 イッテルビウム ホルミウム 緑色 ＹＳｉ3 Ｏ7 イッテルビウム ツリウム 青色
【００３９】第Ｉ表に示した材料およびその変種の他に
アルミネート、ホスフェートおよびバナデートも適する
燐ホスト材料とすることができる。一般にホスト材料と
してシリケートを使用する場合、変換効率は比較的低
い。或る種の用途においては、ハイブリッドアップコン
バート性燐結晶を作成することもできる（たとえば１種
もしくはそれ以上のホスト材料および／または１種もし
くはそれ以上の吸収剤イオンおよび／または１種もしく
はそれ以上の発光剤イオンの組合せ）。
【００４０】無機燐ラベルの作成 無機燐を作成するための技術および方法は従来技術に記
載されている。アップコンバート性燐結晶は各種の公開
された方法で当業者により作成することができ、限定は
しないが次のものを包含する：ヨコム等（１９７１）、
メタルルジカル・トランスアクションズ、第２巻、第７
６３頁；カノ等（１９７２）、ジャーナル・エレクトロ
ケミカル・ソサエティー、第１５６１頁；ウィトケ等
（１９７２）、ジャーナル・アプライド・フィジーク
ス、第４３巻、第５９５頁；バン・ウイタート等（１９
６９）、マテリアル・リサーチ・ブレチン、第４巻、第
３８１頁（これらを参考のためここに引用する）。引用
しうる他の刊行物は次の通りである：Ｊ．Ｐ．ジョワル
トおよびＧ．メリー（１９９０）、ジャーナル・ルミネ
センス、第４６巻、第３９頁；Ｇ．Ｌ．マックファーソ
ンおよびＳ．Ｌ．マイエルソン（１９９１）、ケミカル
・フィジカル・レタース（４月）、第３２５頁；オーメ
ン等（１９９０）、ジャーナル・ルミネセンス、第４６
巻、第３５３頁；Ｈ．ニーおよびＳ．Ｃ．ランド（１９
９１）、オプチックス・レタース、第１６巻（９月）；
Ｒ．Ａ．マックファーレン（１９９１）、オプチックス
・レタース、第１６巻（９月）；コッホ等（１９９
０）、アプライド・フィジカル・レタース、第５６巻、
第１０８３頁；シルバースミス等（１９８９）、アプラ
イド・フィジカル・レタース、第５１巻、第１９７７
頁；Ｗ．レンスおよびＲ．Ｍ．マックファーレン（１９
９０）、ジャーナル・ルミネセンス、第４５巻、第３４
６頁；ヒラオ等（１９９１）、ジャーナル・ノンクリス
タリン・ソリッズ、第１３５巻、第９０頁；マックファ
ーレン等（１９８８）、アプライド・フィジカル・レタ
ース、第５２巻、第１３００頁（これらを参考のためこ
こに引用する）。
【００４１】一般に、無機燐粒子は慣用の当業界で知ら
れた微粉砕法により所望の平均粒子寸法および分布まで
微粉砕され、たとえば慣用のバレルミルにてジルコニア
および／またはアルミナ球を用いて約４８時間もしくは
それ以上の時間にわたり微粉砕する。結合分析に用いる
燐粒子は典型的には直径約３．０〜０．０１μｍ（また
は非球状であれば長手軸線に沿った寸法）、より一般的
には約２．０〜０．１μｍの寸法、より便利には約１．
０〜０．３μｍの寸法であるが、これら寸法よりも大き
い或いは小さい燐粒子も或る種の具体例には好適であ
る。燐粒子寸法は、所望の特性に基づきここに説明した
指針にしたがって実施者により選択される。特定の粒子
寸法範囲を有するフラクションは一般に長時間（すなわ
ち１日もしくはそれ以上）にわたる沈降により作成する
ことができ、適する沈降時間の後に所望寸法範囲のフラ
クションを取出す。沈降過程は、たとえばホリバ粒子ア
ナライザを用いて監視することができる。
【００４２】燐粒子は表面活性剤（たとえばエアロゾル
ＯＴのような陰イオン型表面活性剤）により微粉砕工程
の際または微粉砕が完結した後に被覆もしくは処理する
ことができる。たとえば、これら粒子は微粉砕に際しポ
リカルボン酸［たとえばアディションＸＷ ３３０、ヘ
キスト社、フランクフルト、ドイツ国またはタモール、
ビベルロー等（１９９２）、上記参照］で被覆して、典
型的には約ｐＨ６〜８にて燐粒子の安定な水性懸濁液を
作成することができる。燐粒子の水溶液のｐＨは、適す
る緩衝剤を添加すると共に所望のｐＨ範囲まで酸もしく
は塩基で滴定して調整することができる。コーチングの
化学的性質に応じ、燐の変換効率における若干の低下も
被覆の結果として生じうるが、レーザー励起源で用いう
る電力は変換効率におけるこの種の低下を補いうると共
に充分な燐発光を確保することができる。一般に、無機
燐粒子の作成および結合試薬への結合は実質的にベベル
ロー等（１９９２）（上記）およびタンケに係る米国特
許第５，０４３，２６５号に記載されたように行われ
る。しばしば、たとえばオキシスルフィドホスト材料を
有する燐により、燐粒子は好ましくはたとえばアセトン
もしくはＤＭＳＯなどの極性溶剤に分散されて、実質的
に単分散のエマルジョン（たとえば保存溶液につき）を
生成させる。単分散保存溶液の１部をさらに水溶液まで
希釈することができる（たとえば緩衝水または緩衝塩水
におけるアビジンの溶液）。
【００４３】結合分析 アップコンバート性燐およびアップコンバート性有機染
料を、試料におけるアナライトの存在を検出および定量
するための結合分析に使用すべく、レポータ（すなわち
検出可能なマーカー）として使用することにより直接ま
たは間接的に結合試薬を標識する。結合試薬は、アップ
コンバート性レポータへの付着（たとえば表面吸着、共
有結合）により直接に標識される。直接に標識しうる結
合試薬は限定はしないが次のものを包含する：一次抗体
（すなわち標的アナライトに結合するもの）、二次抗体
（すなわち一次抗体または補綴群、たとえばビオチンも
しくはジゴシキシゲニンに結合するもの）、スタヒィロ
コッカス・アウレウス蛋白Ａ、ポリヌクレオチド、スト
レプトアビジンおよびリセプタリガンド。さらに結合試
薬は間接的に標識することもできる。すなわち一次抗体
（たとえばウサギ抗−ｅｒｂ−Ｂ抗体）を、直接標識さ
れた二次抗体（たとえばアップコンバート性無機燐に結
合したヤギ抗−ウサギ抗体）への非共有結合により間接
的に標識することができる。アナライト−プローブ複合
体の定量検出は、用いる各プローブに関する分析の適切
な検量と組合せて行うことができる。プローブは便利に
は、たとえば励起照明のためのレーザー源または集中フ
ォトダイオード源を用いて飽和励起条件下で検出され
る。
【００４４】特定の結合分析は一般に均質分析および不
均質分析に分類される。均質分析においては、結合標識
プローブにより放出される信号は未結合標識プローブに
より放出される信号とは異なり、したがって、これら２
種を物理的分離工程の必要なしに識別することができ
る。不均質分析においては、結合および未結合の標識プ
ローブから放出される信号は同一であるため、これら２
種を識別するには物理的に分離せねばならない。古典的
な不均質特定結合分析は放射性免疫分析（ＲＩＡ）であ
る［ヤロウ等（１９７８）、サイエンス、第２００巻、
第１２４５頁、参考のためここに引用する］。他の不均
質結合分析は放射性リセプタ分析［クアトレカサス等
（１９７４）、アニュアル・レビュー・バイオケミスト
リー、第４３巻、第１０９頁］、サンドイッチ放射性免
疫分析［米国特許第４，３７６，１１０号、参考のため
ここに引用する］、および抗体／レクチンサンドイッチ
分析［ＥＰ ０ １６６ ６２３号、参考のためここに
引用する］を包含する。不均質分析が一般に好適であ
り、均質分析よりも一般に感度および信頼性が高い。組
織抽出物を作成する場合も生物液試料を使用する場合
も、試料をその後の分析過程を実質的に阻害しない１種
もしくはそれ以上の希釈剤で希釈することがしばしば望
ましい。一般に、適する希釈剤は緩衝系（たとえば５０
ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4 もしくは５〜１００ｍＭトリス、
ｐＨ４〜１０）、非干渉性イオン物質（５〜５００ｍＭ
ＫＣｌもしくはＮａＣｌまたは蔗糖）、および必要に応
じたとえばツイーンのような非イオン型洗剤を含有する
水溶液である。分析すべき試料を固体支持体に固定する
場合は、一般にプローブと接触させる前に試料および固
体支持体を希釈剤で洗浄することが望ましい。現物また
は希釈された試料を次いで診断アナライトにつき分析す
る。
【００４５】本発明の一般的方法において、試料中のア
ナライトは、試料をアナライトに特異的もしくは優先的
に結合して結合複合体を形成するプローブ−ラベル結合
体と接触させ、次いで結合複合体の形成を典型的には結
合複合体に存在するラベルの存在を測定して検出するこ
とにより、検出定量される。プローブ−ラベル結合体は
直接標識アナライト−結合試薬（たとえばアップコンバ
ート性燐に結合した一次抗体）および／または間接標識
アナライト−結合試薬（たとえば標識第２抗体により検
出される一次抗体、または標識ストレプトアビジンによ
り検出されるビオチニル化ポリヌクレオチド）を包含す
る。典型的には、結合複合体をラベルの検出前に一般に
少なくとも１回の洗浄工程を行うことにより未結合プロ
ーブ−ラベル結合体から分離して、未結合プローブ−ラ
ベル結合体に存在するラベルに起因するバックグランド
信号を除去する。したがって、一般にプローブ−ラベル
結合体をアナライト試料と共に結合条件下で適する結合
時間にわたり培養することが望ましい。
【００４６】結合条件はプローブ−ラベル結合体の種
類、標的アナライトおよび特定分析法に応じて変化す
る。たとえば結合条件は一般に、プローブが現場でのハ
イブリッド化、ノーザンもしくはサウザンブロットまた
は溶液ハイブリッド化分析で使用されるポリヌクレオチ
ドであるかどうかに応じて相違する。さらに結合条件
は、プローブが現場での組織化学的染色法またはウエス
タンブロットのいずれで用いられる抗体であるかに応じ
て相違する［トウビン等（１９７９）、プロシーディン
グ・ナショナル・アカデミー・サイエンスＵＳＡ、第７
６巻、第４３５０頁、参考のためここに引用する］。一
般に、結合条件は当業界で知られた一般的な結合法に応
じて選択される。限定はしないが、たとえば次の結合条
件が一般的指針として与えられる：
【００４７】抗体プローブにつき： １０〜２００ｍＭトリス、ｐＨ６〜８；一般に１００ｍ
Ｍトリス、ｐＨ７．５ １５〜２５０ｍＭ ＮａＣｌ；一般に１５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ ０．０１〜０．５、容量％ツイーン２０ １％ウシ血清アルブミン ４〜３７℃；一般に４〜１５℃。ポリヌクレオチドプローブにつき： ３〜１０×ＳＳＣ、ｐＨ６〜８；一般に５×ＳＳＣ、ｐ
Ｈ７．５ ０〜５０％脱イオン化ホルムアミド １〜１０×デンハルト溶液 ０〜１％ドデシル硫酸ナトリウム １０〜２００μｇ／ｍｌ 剪断された変性サケ精子ＤＮ
Ａ ２０〜６５℃、一般に５０ｂｐより長いポリヌクレオチ
ドプローブにつき３７〜４５℃、一般に短いオリゴヌク
レオチドプローブにつき５５〜６５℃。
【００４８】抗体およびポリヌクレオチドに関する結合
条件の他の例は次の文献に示されている：マニアチス
等、モレキュラ・クローニング：ラボラトリー・マニュ
アル（１９８９）、第２版、コールド・スプリング・ハ
ーバー、Ｎ．Ｙ．；並びにベルガーおよびキンメル、メ
ソッズ・イン・エンチモロジー、第１５２巻、モレキュ
ラ・クローニング技術の指針（１９８７）、アカデミッ
ク・プレス・インコーポレーション社、サンジエゴ、Ｃ
Ａ；ヤングおよびデービス（１９８３）、プロシーディ
ング・ナショナル・アカデミー・サイエンスＵＳＡ、第
８０巻、第１１９４頁（参考のためここに引用する）。
プローブがたとえばＩＬ−２、β−インタフェロンまた
は他のポリペプチドホルモン、サイトキンもしくはリン
ホキンのようなリセプタ−リガンドである場合、適する
結合条件は一般に各リセプタリガンド結合分析を行うべ
く従来技術に記載された条件である。免疫分析および免
疫組織化学に有用な適する結合条件の種々の例がたとえ
ばハロウおよびレイン、アンチボディース：ラボラトリ
ー・マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー、ニ
ューヨーク（１９８８）（参考のためここに引用する）
に検討されている。一般に、免疫学的反応の適する結合
条件は塩（たとえば５〜５００ｍＭＮａＣｌもしくはＫ
Ｃｌ）と緩衝剤（たとえばトリスもしくは燐酸塩緩衝
剤、ｐＨ４〜１０）と必要に応じイオン型洗剤（たとえ
ばツイーン）とを含有する水性結合緩衝剤を包含する。
或る種の具体例においては、プロテナーゼ抑制剤もしく
は安定剤も含ませることができる。結合反応は抗体反応
については典型的には少なくとも約１〜５分間、好まし
くは少なくとも約３０分間〜数時間である適する結合時
間にわたり行われるが、典型的には約２４時間未満、よ
り好ましくは約数時間以下である。結合反応（洗浄を含
む）は典型的には約０〜約４５℃、好ましくは約４〜約
２０〜２５℃の温度範囲で行われる。
【００４９】その場でのハイブリッド化、その場での結
合分析、および免疫組織学的染色を包含する結合分析は
一般に、先ず最初に試料を封鎖用または予備ハイブリッ
ド化用の溶液と共に培養し、次いで試料を結合条件でプ
ローブと共に適する結合時間にわたり培養し、次いで未
結合のプローブを洗浄または他の方法で除去し、最後に
結合プローブの存在、量および／または位置を検出する
ことにより行われる。結合プローブを検出する工程は、
プローブが直接標識される場合はラベルを検出すること
により、或いは結合複合体を標識されてプローブに結合
する二次結合試薬（たとえばストレプトアビジン）と共
に培養してプローブを間接的に標識することにより行う
ことができる。アップコンバート性ラベルはプローブま
たはプローブに特異的もしくは優先的に結合する第２結
合試薬に、ここで説明する各種の方法により付着され
る。さらに、アップコンバート性燐粒子は微小球に包封
してプローブ（たとえば特異性抗原もしくは抗体）で免
疫診断分析または核酸ハイブリッド化分析における標識
プローブとして使用すべく被覆し、試料におけるアナラ
イト、たとえば血清試料における抗体、ウィルスもしく
は抗原の存在をハリー等（１９９０）、バイオテクニー
クス、第９巻、第３４２頁参考のためここに引用する）
の方法により検出する。燐のマイクロカプセル化は当業
界で知られた数種の方法で行うことができ、たとえばモ
ノマー溶液による燐の被覆および燐粒子を包封するポリ
マーシェルを生成させるためのモノマーの重合を包含す
る。ポリマー被覆（たとえばゲル被覆）に埋込まれた燐
粒子を官能化して（たとえばアミノ基により）、結合成
分に共有付着させることができる。
【００５０】同様に、アップコンバート性燐粒子は表面
吸着、多重水素結合、静電気相互作用、ファンデルワー
ルス結合または官能化無機燐粒子（たとえばガラスセラ
ミック燐）上への官能基の共有結合により、たとえばプ
ローブ蛋白のアミノ酸側鎖アミンもしくはカルボキシレ
ート基をそれぞれ官能化燐粒子におけるカルボキシレー
ト基もしくはアミン基に結合させることにより直接にプ
ローブで被覆することができる。たとえば嵩高アップコ
ンバート性燐粒子の立体的および／または帯電干渉が標
的に対する結合試薬の結合を阻止するような或る種の具
体例においては、分子スペーサを燐粒子と結合試薬との
間に組込むことが望ましい。たとえば誘導化されたマイ
クロカプセル化燐またはガラスセラミック燐を、−（Ｃ
Ｈ2 ）n −スペーサ（ここでｎは一般に約２〜約５０の
整数である）を有するヘテロ二官能性試薬に末端官能基
間で結合させることができる。同様に、燐は長い分子内
スペーサ連鎖を有する誘導化用試薬（たとえばω−官能
化シラン）で直接に誘導化することができ、所望の結合
試薬に対し反応性の官能基は一般に少なくとも約１５オ
ングストロームのスペーサ（すなわち約１０個の−ＣＨ
2 −直鎖基に等しい）により燐の表面から分離される。
或る種の具体例において、ラベルを種々の長さのスペー
サアームにより付着させて有力な立体障害を減少させ
る。スペーサアームの複数層も用いることができる（た
とえば複数層のストレプトアビジン−ビオチン結合）。
【００５１】多重アナライト検出 アップコンバート性燐は励起および／または発光波長ス
ペクトルに基づいて区別しうるので、たとえば細胞表面
抗原もしくは可溶性巨大分子のような複数アナライト標
的を検出および識別するためアップコンバート性燐を使
用することができる。たとえばストレプトアビジン、ア
ビジンまたは他のリンカー巨大分子（たとえば抗ジゴキ
シゲニン抗体）をそれぞれ吸収およびまたは発光スペク
トルにて相違する２種の異なる燐（例示のため、ここで
は燐Ｎｏ．１および燐Ｎｏ．２と称する）のそれぞれに
付着させて、吸収および／または発光波長に基づく２種
の燐の識別を容易化させる。たとえば一方の燐は青色で
発光しうるのに対し、他方は緑色にて発光することがで
きる。限定はしないが、たとえばＮａ（Ｙ0.80Ｙｂ0.18
Ｅｒ0.02）Ｆ4 は主として緑色で発光するのに対し、Ｎ
ａ（Ｙ0.73Ｙｂ0.27Ｔｍ 0.001 ）Ｆ4 は主として青色に
て発光し、したがってこれら２種の燐はその燐光性発光
に基づき識別することができる。或いは２種の燐は実質
的に同様な発光スペクトルを発生しうるが、異なる励起
波長を有して多重アナライト検出における識別の基礎を
与えることができる。第１アナライト物質（たとえばリ
ンパ球ＣＤ４抗原）に特異的に結合すると共にストレプ
トアビジン−燐Ｎｏ．１結合体により結合しうるビオチ
ニル部分を有する第１結合成分（たとえば抗体）を使用
して、試料（たとえば血清試料）における第１アナライ
トの存在をアナライト−結合成分複合体における燐Ｎ
ｏ．１の燐光の測定により定量検出することができる。
第２アナライト物質（たとえばＨＩＶ−１配列）に特異
的に結合すると共に抗ジゴキシゲニン−燐Ｎｏ．２結合
体により結合しうるジゴキシゲイン部分（たとえば１１
−ＵＴＰ−ジゴキシゲニン）を有する第２結合成分（た
とえばプローブポリヌクレオチド）を用いて、試料にお
ける第２アナライトの存在をアナライト−結合成分複合
体における燐Ｎｏ．２の燐光の測定により定量検出する
ことができる。かくして、分化しうる信号特性を有する
複数燐レポータの存在を同時的に検出することにより、
複数アナライトを単一試料で定量検出することができ
る。
【００５２】サンドイッチ結合分析 アップコンバート性燐ラベルをサンドイッチ結合分析用
のレポータとして使用することができる［米国特許第
４，３７６，１１０号（参考のためここに引用す
る）］。たとえば超常磁性の免疫ビーズまたは官能化磁
気化しうるポリマー粒子（ポリサイエンシス・インコー
ポレーション社、ワーリントン、ペンシルバニア州）の
ような磁性ビーズを固体基質として使用することがで
き、これはアナライトの第１エピトープ（すなわち結合
部位：抗原決定子、糖部分、化学置換基もしくはヌクレ
オチド配列）に結合する固定化された第１結合成分（た
とえば抗体、ポリヌクレオチドもしくはレクチン）を有
する。アナライトは第１結合成分に結合し、さらにアナ
ライトの第２エピトープに結合する第２結合成分（たと
えば抗体、レクチンもしくはポリヌクレオチド）にも結
合する。したがって、アナライトはこれら２種の結合成
分を架橋してサンドイッチ複合体を形成し、これを固体
基質に対し固定化させる。第２結合成分は典型的には付
着した或いは組込まれたラベル（たとえばビオチニル基
のようなラベル）を有し、このラベルはストレプトアビ
ジン被覆されたアップコンバート性燐に結合することが
できる。或いは、第２結合成分はたとえば官能化された
ガラスラセミック質アップコンバート性燐との共有結合
を介しアップコンバート性燐に直接結合することもでき
る。
【００５３】サンドイッチ複合体は第１結合成分とアナ
ライトと第２結合成分とからなり、直接に或いは間接的
にアップコンバート性レポータで標識される。かくして
サンドイッチ複合体は固体基質に固定化されるが、固体
基質自身は移動性である（たとえば超常磁性ビーズは試
料スラリーにて循環する）。アナライト存在および量
は、サンドイッチ複合体におけるアップコンバート性レ
ポータの存在を検出して定量測定することができる。た
とえば固定基質は複数の異なる種類の第１結合成分（た
とえば固定支持体に固定された複数の異なるオリゴペプ
チド）を有することができる。１種もしくはそれ以上の
第１結合成分は、固定支持体と接触するアナライト溶液
における特定アナライト（たとえばムスカリンリセプ
タ）に結合することができる。１種もしくはそれ以上の
第１結合成分に対するアナライトの結合は、アップコン
バート性燐により標識された（直接的に或いはビオチニ
ル化された二次抗体を介し）第２結合成分（たとえば抗
ムスカリンリセプタ抗体）で検出することができる。
【００５４】固定基質は第１結合成分に付着して２種以
上の異なるアナライト（たとえば免疫交差反応性もしく
はポリ特異性とすることができる）に結合することがで
き或いは複数の第１結合成分に付着して複数の異なるア
ナライトに結合することができる。同様に、特定のアナ
ライトに対する結合特異性を有する複数の第２結合成分
を用いることもできる。複数の第２結合成分を用いる場
合、典型的には吸収および／または発光特性に基づいて
識別しうる独特なアップコンバート性ラベルにより各第
２結合成分を標識することが望ましい。種々異なる吸収
剤を各種の放出剤と組合せて用いることにより励起およ
び発光スペクトルの数種の区別可能な組合せを有する燐
のコレクションを得ることができる。たとえば限定はし
ないが、６種の区別しうる燐を２種の吸収剤および３種
の発光剤から発生させることができる。第１の吸収剤Ａ
1 はλA1の励起波長を有し、第２の吸収剤Ａ2 はλA2の
励起波長を有し、第１の発光剤Ｅ1 はλE1における発光
ラインを有し、第２の発光剤Ｅ2 はλE2に発光ラインを
有し、第３の発光剤Ｅ3 はλE3に発光ラインを有する。
６種の燐を区別して、それぞれからの信号を個々に試料
を励起波長λA1で照明すると共に別々にλE1、λE2およ
びλE3における発光照射線を検出し、さらに試料をλA2
で照明すると共に別々にλE1、λE2およびλE3ににおけ
る発光照射線を検出して定量することができる。第ＩＩ
表は種々の吸収剤：発光剤の組合せ物、並びにその励起
および発光波長を示す。
【００５５】
【表２】 第ＩＩ表 吸収剤：発光剤の組合せ 励起λ 発光λ Ａ１：Ｅ１ λＡ１ λＥ１ Ａ１：Ｅ２ λＡ１ λＥ２ Ａ１：Ｅ３ λＡ１ λＥ３ Ａ２：Ｅ１ λＡ２ λＥ１ Ａ２：Ｅ２ λＡ２ λＥ２ Ａ２：Ｅ３ λＡ２ λＥ３
【００５６】勿論、６種より多い区別しうる燐ラベルを
得るには、追加の吸収剤：発光剤組合せを用いることも
できる。さらに識別しうる（たとえば寸法、色、密度、
磁気特性、形状、電荷により）異なる種類の固体基質を
用いて、特定種類の固体基質を特定種類の第１結合成分
と関連させることもできる。限定はしないが、たとえば
次の３種の簡単な実施例を示して多重アナライトサンド
イッチ分析法の可能な用途につき説明する。
【００５７】基質分別化 次の実施例は、識別可能な基質種類を用いて患者の免疫
状態（たとえば特定抗原に対する患者の血清反応）に関
する診断情報を与えうる試料（たとえば患者から採取さ
れた血清試料）における特定の免疫グロブリン遺伝子型
の存在を検出する例につき説明する。大きい超常磁性ビ
ーズを免疫原性ヘルペスウィルス型ＩＩエンベロプグリ
コ蛋白に結合させ、中庸寸法の超常磁性ビーズをＨＩＶ
ｇｐ１２０グリコ蛋白に結合させ、小さい超常磁性ビ
ーズを免疫原性サイトメガロウィルスエンベロプグリコ
蛋白に結合させる。血清試料を患者から採取し、試料に
おける免疫グロブリンと３種の固定化されたウィルスグ
リコ蛋白とを特異的に結合させうる結合条件下で超常磁
性ビーズの混合物と共に培養する。これら超常磁性ビー
ズを試料から分離して非特異的に結合した免疫グロブリ
ンを除去すると共に、結合条件下でＩｇＧに結合するス
タフィロコッカス・アウレス蛋白Ａで被覆されたアップ
コンバート性燐と共に培養する。次いで、特異的に結合
したＩｇＧを有する超常磁性ビーズを燐−蛋白Ａ結合体
で標識する。大型、中形および小型の超常磁性ビーズを
次いで別々に燐励起電磁線で照射し、時間ゲートの発光
した燐光を検出する。必要に応じ非特異的結合に基づく
バックグランドを内部標準ビーズ（超常磁性ビーズで被
覆された牛血清アルブミン）並びに陽性および陰性比較
血清試料を用いて決定する。大型、中形および小型ビー
ズに関連する燐光の強度は、ヘルペスウィルスＩＩ型エ
ンベロプグリコ蛋白、ＨＩＶ ｇｐ１２０グリコ蛋白お
よびサイトメガロウィルスエンベロプグリコ蛋白に対し
それぞれ反応性である試料における抗体の量の尺度を与
える。この情報を用いて、個々の患者がＨＩＶ−１、ヒ
トＣＭＶおよび／または単純疱疹ＩＩ型ウィルスで感染
されているかどうかを決定することができる。
【００５８】燐分別化 次の実施例は、分別化しうるアップコンバート性燐を用
いて血清もしくは脳生検試料における特定種類のヒトＡ
ＰＰ（アミロイド先駆体蛋白）の存在および相対的量を
検出する例につき説明する。各種のＡＰＰが、異なるエ
キソン使用および／または異なる蛋白分解処理過程の結
果として脳で生ずる。たとえば全ゆる種類のＡＰＰは共
通の仮定のエピトープ（Ｘ）を有しうるが、特定種類の
ＡＰＰは独特のエピトープ（Ｙ）を有すると共に、他の
種類のＡＰＰは独特のエピトープ（Ｚ）を有することが
できる。試料における特定のＡＰＰ種類の相対量は予測
値とすることができ、或いはアルツハイマー氏病の発病
源とすることもできる。超常磁性ビーズを、全種類が有
する共通のＡＰＰエピトープ（Ｘ）に特異的に結合する
抗体に結合させる。独特のＹエピトープに対し反応性の
特異的抗体を、波長λ1 により励起されて青色に集中す
る波長スペクトルで発光する燐Ｎｏ．１で標識する。独
特のＺエピトープに対し反応性の特異的抗体を、波長λ
2 により励起されて緑色に集中する波長スペクトルで発
光する燐Ｎｏ．２で標識する。これらＡＰＰ種類を含有
する試料を超常磁性ビーズおよび標識された特異的抗体
と共に結合条件下で培養する。超常磁性ビーズを試料か
ら個々に或いはバルクで取出す。これらビーズの波長λ
1 で照明して青色発光を検出すると共に測定し、さらに
λ2 で照明して緑色発光を検出すると共に測定する。λ
1 誘起の青色発光の強度はＹエピトープを有するＡＰＰ
種類の尺度である一方、λ2 誘起の緑色発光の強度はＺ
エピトープを有するＡＰＰ種類の尺度である。２種の燐
からの発光が容易に識別できれば、λ1 およびλ2 は同
一とすることができる。２種の燐の基準化した相対強度
はＹエピトープもしくはＺエピトープを含有するＡＰＰ
種類の相対量の尺度を与える。
【００５９】燐および基質の分別化 次の実施例は、個人から採取した血液試料における特定
Ｔリンパ球サブ群の存在および相対量を検出するための
識別可能な基質種類と組合せた区別しうるアップコンバ
ート性燐の使用につき説明する。Ｔ細胞サブ群の検出に
関しここに説明するが、アナライト多重化（すなわち各
種の固体基質および／またはアップコンバート性燐ラベ
ルを用いる試料における複数アナライトの検出および／
または特性化）も一般的に用いるうる方法であると思わ
れる。大きい超常磁性ビーズを抗−ＣＤ４抗体に結合さ
せ、中庸寸法の超常磁性ビーズを抗−ＣＤ８抗体に結合
させ、小さい超常磁性ビーズを抗−ＣＤ２８抗体に結合
させる。ＣＤ２抗原に特異的に結合する抗体を、励起波
長λ1 を有すると共に赤色で発光するアップコンバート
性燐で標識する。ＣＤ４５Ｒ抗原に特異的に結合する抗
体を、励起波長λ2 を有すると共に緑色で発光するアッ
プコンバート性燐で標識する。ＣＤＷ６０抗原に特異的
に結合する抗体を、励起波長λ3 を有する共に青色で発
光するアップコンバート性燐で標識する。
【００６０】血液（または血清、唾液、尿、糞、生検組
織など）試料を患者から採取し、超常磁性ビーズと燐標
識抗体との混合物と共に、３種のビーズ固定化された抗
体および３種の燐標識された抗体との血液試料における
細胞の特異的結合を可能にする結合条件下で培養する。
抗原−抗体結合が生じた後、超常磁性ビーズを分離して
順次に或いは同時にλ1 、λ2 およびλ3 での照明およ
び赤色、緑色および青色の発光の定量検出によりそれぞ
れ検査する。たとえば大型ビーズに関連するλ 1 誘起の
赤色発光の強度は、ＣＤ４およびＣＤ２表面抗原を有す
る細胞の量および／またはこれら表面抗原の相対量の大
凡の尺度である（たとえばＣＤ２を有する極めて少ない
ＣＤ４+ 細胞も存在するが、これら僅かな細胞は多量の
ＣＤ２抗原を有し、したがって大きいＣＤ２燐光信号を
有する）。同様に、大型ビーズに関連するλ2 誘起の緑
色光の強度は、ＣＤ４およびＣＤ４５Ｒ表面抗原の両者
を有する細胞の量および／または試料におけるこれら表
面抗原の相対量の大凡の尺度である。
【００６１】このようにして、たとえば血液試料のよう
なアナライト試料を、各種のアナライト物質の存在およ
び相対的分布（たとえば同時分離および／または相関関
係）につき「特性化（fingerprint ）」することができ
る。この種のアナライト指紋を用いて診断もしくは治療
情報を与えることができ、たとえば患者の免疫状態を測
定し或いは特定の血球に向けられた化学療法の反応を測
定することができる。同様なアナライト指紋を用いて、
病原生物およびウィルスを分類すると共にポリヌクレオ
チド配列を遺伝子地図化および／または配列決定のため
用いることができる。寸法、形状、色または密度に基づ
き区別しうる超常磁性ビーズを個々に磁気的に捕えて、
適する励起照明で走査すると共に特定アナライトに特徴
的な燐放光を検出することができる。たとえば単一検出
器は同時的に超常磁性ビーズを懸濁物から捕らえると共
にビーズ種類（寸法、形状および／または色）を決定
し、特定燐の存在および量につき走査することができる
（励起波長での照明および発光波長での検出による）。
【００６２】平均して１個もしくはそれ以下のアナライ
ト（たとえばリンパ球）がマイクロビーズ１個当りに結
合する希釈条件下での結合分析を行うことにより、個々
に細胞を分類し（たとえば個々の各ＣＤ４+ 細胞におけ
るＣＤ４５Ｒの量を決定し）、かくして一層正確なリン
パ球サブ群を規定することができる。さらに、ビオチニ
ル化された磁性ビーズを用いて燐粒子に対するストレプ
トアビジンの結合速度を監視し、或いはストレプトアビ
ジン被覆されたアップコンバート性燐粒子を反応から分
離または精製することもできる。すなわち、ストレプト
アビジンとアップコンバート性燐粒子とを、反応容器内
でストレプトアビジン被覆燐粒子を形成する結合条件下
で混合する。適する結合時間の後、未結合のストレプト
アビジンを除去し（たとえば燐粒子をペレットとして集
め、上澄液における未結合のストレプトアビジンをデカ
ントし、ペレットを再懸濁させる遠心分離による）、ビ
オチニル化された磁性ビーズを残余の燐懸濁物に結合条
件下で添加し、ストレプトアビジン被覆燐粒子をビオチ
ニル化磁性ビーズに結合させて回収する。
【００６３】アップコンバート性燐による光物理的触媒
作用 本発明の他の用途はプローブに結合した光物理的触媒と
して燐を用い、燐により発光された照射線を典型的には
染料分子と共に用いて検出以外の種々の目的（たとえば
細胞毒性、化学物質のイオン化、突然変異など）につき
プローブに隣接した領域に強力な局在電磁線を発生させ
る。たとえばＣＤ８+ リンパ球におけるＣＤ８抗原のよ
うな細胞表面抗原に特異的に結合する抗体をアップコン
バート性燐に結合したプローブとして使用し、ＣＤ８+
リンパ球に対し燐を局在させることができる。ＣＤ８+
リンパ球を含有する試料を抗−ＣＤ８+ プローブ−燐結
合体と共に培養し、励起波長（たとえば赤外レーザーダ
イオードから）を照射して抗−ＣＤ８+ プローブ−燐結
合体が結合したＣＤ８+ リンパ球の近傍にアップシフト
フォトン（すなわち、より高い周波数の電磁線）を放出
させる。放出された照射線は直接的な突然変異性および
／または細胞毒性である波長（たとえばチミン二量体の
形成をもたらす紫外線、７６０〜７６５ｎｍの光は染色
体損傷をもたらすと思われる）とすることができ、或い
は環境中に存在する化学物質の光分解をもたらして隣接
する細胞を損傷しうる反応性物質の局部的形成をもたら
しうる波長とすることができる（たとえば、ブックミン
ステルフレレン（buckminsterfullerene）の光分解（Ｃ
60からＣ58およびＣ2 への分解）は細胞膜のリピド過酸
化をもたらしうる遊離基を発生しうる）。
【００６４】燐−発光照射線は等方性であるため、一般
に標的（たとえばＣＤ８+ リンパ球）を非標的（たとえ
ばＣＤ８- リンパ球）から励起照射の前に物理的に分離
して等方性発光による非標的に対する望ましくない損傷
（すなわち「二次的損傷」）を回避することが望まし
い。物理的分離は限定はしないが次のことを包含する各
種の手段により行うことができる：（１）標的および非
標的細胞の希釈懸濁物に対し励起照射を行い、個々の細
胞を分離する平均間隔を充分にして、非標的に対する二
次的損傷を減少させる手段、および（２）流体力学的集
中を用いて細胞（標的および非標的の両者）を照明帯域
に（たとえば蛍光活性化細胞ソータなど）に１回通過さ
せる手段。たとえば抗−ＣＤ８+ 抗体に結合したアップ
コンバート性燐を用いて、リンパ球試料におけるＣＤ８
+ リンパ球を選択的に損傷させることができ、ここで
（１）燐は直接的に細胞毒性である波長にて発光し、か
つ／または（２）燐は試料中に存在する化合物の光触媒
作用により反応性化学物質を生成する波長で発光する
（たとえば、試料をバックミンステルフレレンでドープ
することができる）。
【００６５】発光照射線を組織もしくは腫瘍に対する光
触媒作用につき直接使用する代りに、励起型の酸素（い
わゆるシングレット励起酸素（Ｏ2 ′Δｇ））を染料感
作剤から溶解分子酸素へのエネルギー移行によって発生
させることができる。この方式は、無機アップコンバー
ト性燐に達する近赤外線（赤色光および紫外光、９７０
ｎｍを含む）の組織浸透力を利用する。赤外フォトンの
２個が赤色、緑色もしくは青色フォトンのいずれかに、
感作剤染料の吸収スペクトルに応じて変化する。この染
料をアップコンバート性照射線によりトリプレット状態
まで励起させて、そのエネルギーを溶解酸素分子に移行
させることにより励起（シングレット）酸素分子を生ぜ
しめる。シングレット酸素の細胞毒性活性については光
力学療法および他の生物医療用途に充分説明されている
［ワグニエレス等、１９９０年１月１９〜２１日、「光
力学療法の将来の指針および用途、第２４９頁；光学的
装置工学の高度光学技術協会のＳＰＩＥインスチチュー
ト、私書箱１０、ベリンガム、ワシントン９８２７７；
ペレグリン等（１９９１）、キャンサー、第６７巻、第
２５２９頁；ワグニエレス等、１９９１年５月２４〜２
５日、「光力学療法の将来の指針および用途」、第２１
９頁；ホリー等（１９９１年１２月１７日）、フルオレ
スセイン・クリニーク、第４頁；ブライコッテ等（１９
９１年５月）、ＥＮＴ−クリニーク、ローザンヌ、スイ
ス国、参照］。
【００６６】この用途においては、アップコンバート性
燐をたとえばメチレンブルー、ローズベンガルもしくは
フタロシアニン誘導体（たとえばＺｎ−フタロシアニ
ン）のような感作性染料と混合し或いは組合せる。第１
および第３の場合は赤色発光性燐を用いるのに対し、ロ
ーズベンガルについては緑色発光性燐が特に適してい
る。フタロシアニン誘導体がこの目的に理想的である。
何故なら、水溶液もしくは生物学的溶液に全く不溶性で
あるからである。したがって、これら染料は発光剤の直
ぐ近傍に留まって、細胞表面−レポータ／プローブ／染
料複合体の特異性が制限因子になる。この場合、好まし
くは０．１〜０．３μｍの寸法範囲におけるレポータ／
プローブ／染料組成物の特定組合せ物を合成して、効率
的なエネルギー移行を可能にせねばならない：先ず最初
に、アップコンバート照射線をできるだけ完全に染料に
より吸収させる。第２に、染料励起エネルギー（トリプ
レット状態）を溶解分子酸素に移行させる。これら両過
程は、感作剤染料の吸収スペクトルがアップコンバート
照射線に適合すれば極めて効率的である。この方式は、
赤色光を追跡および診断の両者に使用しうると共にアッ
プコンバートの後に治療目的にも使用しうる点で従来の
光力学療法よりも優れた手段を与え、したがって約１０
００ｎｍにおける１個のみの（赤外）光源しか必要とし
ない。他の利点は、他の公知の光力学療法の励起方式
（７５０〜８５０ｎｍ）と対比し、生物学的試料におけ
る赤外照射線の大きい範囲である。
【００６７】光物理的触媒としてアップコンバート性燐
を用いる具体例につき、一般に次のことが望ましい：
（１）励起照射線の波長は基質化合物の顕著な光触媒作
用を与えないこと、（２）励起照射線の波長は直接的に
細胞毒性もしくは突然変異性でないこと並びに（３）発
光照射線は直接的に細胞毒性でなく或いは生物学上有効
量の基質化合物（たとえばバックミンステルフレレン、
プソラレン、アジド置換基もしくは他の光活性基を有す
る化合物）を発生するのに適する波長を有すること。或
いは、ポリペプチドのヒスチジン側鎖を染料感作剤（た
とえばメチレンブルーもしくはローズベンガル）の存在
下に光により酸化させることもできる［蛋白、構造およ
び分子原則（１９８４）、クレイトン（編）、Ｗ．Ｈ．
フリーマン・アンド・カンパニー社、ニューヨーク；
「蛋白構造の序論」（１９９１）、Ｃ．ブランデンおよ
びＪ．ツーゼ、ガーランド・パブリッシング社、ニュー
ヨーク、ＮＹ、参考のためここに引用する］。たとえ
ば、抗−ＣＤ８抗体に結合したアップコンバート性燐を
光物理的触媒として使用することにより、ＣＤ８型+ リ
ンパ球に対し選択的かつ局在した損傷を生ぜしることが
できる。本発明によれば、実質的に任意の抗体を適する
アップコンバート性燐に直接的に或いは蛋白Ａに対する
結合により結合させ、次いで免疫グロブリンに結合させ
ることができる。たとえば本発明によるアップコンバー
ト性の光物理的触媒を用いて実質的に任意所望の抗原ま
たは細胞種類を標的とし、同定された抗原の存在により
識別することができる。
【００６８】アップコンバート性有機染料 アップコンバート性無機燐レポータと同様に、蛍光が光
電子手段により検出されるような「分子」ラベルを使用
することも提案される。赤外光もしくは赤色光は標的に
結合したプローブ−レポータ複合体を励起させ、その後
に光を照明源に比べ短い波長にて発光させる。このアッ
プコンバートした光は光源からの分散光を含まず、或い
はその高エネルギーにより自己蛍光を示さない。さら
に、自己蛍光は赤外もしくは赤色スペクトル範囲におけ
る励起により著しく減少する。光源はポンプパルスが短
いポンプレーザーであって、高出力および低エネルギー
を得ることにより染料における非直線的光学過程を可能
にする。その目的は、染料における第２励起シングレッ
ト状態（Ｓ2 ）を２個の赤色もしくは赤外フォトンによ
り調整可能な染料レーザからのｐｓパルスで励起させる
ことである。Ｓ2 状態をポンピングした後、染料は数ｐ
ｓ内で蛍光性状態（Ｓ1 ）まで弛緩して、光電子手段に
より検出することができる。２個のフォトンを用いてＳ
2 状態に到達する目標は、２−フォトン断面を増加させ
る利点を利用し埋める点にある。何故なら、２−フォト
ン吸収を用いてＳ2 状態に達するからである。非共鳴２
−フォトン吸収断面は１０-49 〜１０-50 ｃｍ4 ｓの程
度あるのに対し、Ｓ2 吸収に対応する断面はその２〜３
倍程度大である。幾つかの特定例を挙げれば次の通りで
ある：一般にシアニン、キサンテン、ローダミン、アク
リジンおよびオキサジンがこの目的に極めて適してい
る。さらに青色染料も使用しうるが、励起波長は赤色で
ある。ローダミンは２個のフォトンを用いて６５０〜７
００ｎｍにて励起させることができ、蛍光は約５５５ｎ
ｍであると予想される。たとえばＩＲ−１４０、ＩＲ−
１３２およびＩＲ−１２５のような多くのＩＲ染料はＮ
ｄ：ＹＡＧに基づく２個のフォトンを用いて１０６０ｎ
ｍで励起することができ、蛍光は８５０〜９５０ｎｍ範
囲にあると予想される。青色染料の例は４８０ｎｍで励
起されるＢＢＱであって２４０ｎｍでＳ2 状態に達し、
蛍光は３９０ｎｍにあると予想される。これら染料の多
くは水溶液に対し極く僅かに可溶性であって極性を有し
（シアニン）、或いは極性置換基を有する。プローブの
性質に応じ、全く或いは殆ど付着化学を行う必要がな
い。何故なら、染料発色団には官能基が多いからであ
る。数会社が全ゆる種類の染料を販売している：その例
はコダック社、エクサイトン社およびラムダ・フィジー
ク社である。有機染料分子における２−フォトンレーザ
励起の科学的基礎が幾つかの実験論文で処理されてい
る：Ａ．ペンズコファーおよびＷ．ロイパッハー、オプ
チカル・アンド・クウォンタム・エレクトロニクス、第
１９巻（１９８７）、第３２７〜３４９頁；Ｃ．Ｈ．チ
ェンおよびＭ．Ｐ．マックキャン、オプチックス・コミ
ュニケーション、第６３巻（１９８７）、第３３５頁；
Ｊ．Ｐ．ハーマンおよびＪ．ズクーイング、オプチック
ス・コミュニケーション、第６巻（１９７２）、第１０
１頁；Ｂ．フーコールトおよびＪ．Ｐ．ハーマン、オプ
チックス・コミュニケーション、第１５巻（１９７
５）、第４１２頁；リー・シチュンおよびＣ．Ｙ．シ
ー、オプチカ・アクタ、第２９巻（１９８２）、第２８
１〜２８７頁；Ｄ．Ｊ．ブラッドレー、Ｍ．Ｈ．Ｒ．ハ
ッチンソンおよびＨ．ケーツァー、Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓｏ
ｃ．Ｌｏｎｄ．Ａ、第３２９巻（１９７２）、第１０５
〜１１９頁。
【００６９】共鳴多重フォトンイオン化 極めて高いレーザ強度でアップコンバート性有機染料を
誘起させて、集中したレーザー照射線のフィールドにて
さらに励起フォトンを吸収させる。これら高いレーザー
強度にて、蛍光は追加フォトンの吸収に有利となるよう
抑制される。この過程は一般に有機染料分子を溶液にお
けるイオン化限界より高くし、電子を溶剤シェル中に放
出して安定化する。この３−フォトン相互作用の結果は
分子イオンおよび付着もしくは溶媒和電子となる。この
荷電分離が電場で生ずる際、電荷が移動すると共に電圧
を発生し、これを極めて鋭敏に検出することができる。
これは溶剤系における一時的導電率の測定値となり、一
般に光検出よりも鋭敏である。この方法の欠点は、移動
する電荷を検知する電極を必要とすることである。その
意味で光検出と同様な非浸蝕的方法でない。他方、これ
は極めて有利である光電気信号への光の変換を迂回す
る。全ての光学系は効率を低下させる制限された視野角
度を有するのに対し、光イオン化は発生した電荷の１０
０％近くを常に「検知」する。効果的に、レーザーフィ
ールドの非線状相互作用は全ての励起有機染料分子を充
分高いフィールド強度にて充分に電気パルスに変換し、
これら強度は市販レーザー源を用いて日常的に達成する
ことができる。その特定例は約６５０〜７００ｎｍのロ
ーダミンの励起、または約４８０ｎｍのＢＢＱ励起であ
る。赤色にて吸収する有機染料はＳ2 まで励起された後
に２個の追加フォトンを吸収し、したがって全過程を４
−フォトン励起過程にし、これは３−フォトン非線状工
程よりも遅い。しかしながら、この種の４−フォトン過
程が望ましい場合も存在する。
【００７０】検出装置 無機アップコンバート性燐の検出および定量は一般に次
の操作によって行われる：（１）アップコンバート性燐
を含有すると思われる試料に励起波長の電磁線を照射
し、さらに（２）燐光放射線を１つもしくはそれ以上の
発光波長バンドで検出する。試料の照明は、試料を少な
くとも１個の励起源により発生した電磁線に露出して行
われる。各種の励起源、たとえば赤外レーザーダイオー
ドおよび白熱フィラメント並びに他の適する発生源を用
いることができる。励起波長範囲にて高い透過性および
１つもしくはそれ以上の望ましくない波長バンドにて低
い透過性を有する光学フィルタを用いて、望ましくない
波長を光源照明から除去することができる。望ましくな
い波長範囲は一般に、検出可能な試料の自己蛍光を発生
するか或いは励起最大波長の約２５〜１００ｎｍ内にあ
って散乱励起照明からのバックグランドノイズの有力な
発生源となる波長を包含する。励起照明はさらに多重化
し或いは視準することもできる。たとえば複数コヒーレ
ント発生源（たとえばレーザー）からの種々の周波数を
有するビームを視準すると共に一連の２色ミラーを用い
て多重化することができる。このようにして、異なる励
起波長バンドを有する複数の燐物質を含有した試料をそ
の励起周波数にて同時に照明することができる。照明は
連続的またはパルスとすることができ、或いは連続波
（ＣＷ）およびバルス照明を組合せて複数照明ビームを
多重化し（たとえばパルスビームをＣＷビームと多重化
し）、ＣＷ源により誘起された燐光とパルス源により誘
起された燐光との間の信号識別を可能にし、同様な発光
スペクトルを有するが異なる励起スペクトルを有する複
数燐物質を識別することができる。限定はしないが、た
とえば市販入手しうる砒素化ガリウムレーザーダイオー
ドを近赤外光を与えるための照明源として使用すること
ができる。
【００７１】アップコンバート性燐を刺激するため赤外
励起を使用しうる可能性は幾つかの利点を与える。第１
に、安価なＩＲおよび近ＩＲダイオードレーザーを、特
に水により吸収されないＩＲ波長バンドにて、維持され
た高強度励起照明につき使用することができる。高強度
照明のこのレベルは、たとえは通常の蛍光染料（たとえ
ばＦＩＴＣ）のような慣用のラベルと共に使用するには
適さない。何故なら、高強度ＵＶもしくは可視光線はラ
ベルの強力な光漂白をもたらし、試料を強力に損傷する
からである。光漂白または試料損傷なしに高照明強度を
用いうる可能性はより大きい有力な信号をもたらし、し
たがってより感度の高い分析を可能にする。照明源とし
てのダイオードレーザーの使用に対するアップコンバー
ト性ラベルの適合性は、ランプ発生源および他の大抵の
レーザー源よりも明確な他の利点を与える。第１に、ダ
イオードレーザー強度は駆動電流の変調により直接に変
調することができる。これは、時間ゲートもしくは位相
敏感検波の技術に関する光の変調を可能にして、追加変
調器を用いることなく感度向上を与える。変調器は高電
圧回路と高価な結晶とを必要とし、コストおよび装置寸
法の増大をもたらす。レーザーダイオードまたは発光ダ
イオードは直流変調により脈動にすることができる。第
２に、レーザー照明源は全く単色である照明を与えると
共に、極めて小さいスポット寸法に密に集中させること
ができ、信号とノイズとの比および感度における利点を
所望の励起スペクトル領域および照明量の範囲外におけ
る減少したバックグランド光に基づいて与える。ダイオ
ードレーザーは、他の慣用レーザー源の追加経費および
寸法を伴わずに顕著な利点を与える。
【００７２】励起アップコンバート性燐からの燐光照射
線の検出および定量は、各種の手段により行うことがで
きる。燐光発光を検出する種々の手段を用いることがで
き、限定はしないが次のものを包含する：光電子増倍管
デバイス、電子なだれフォトダイオード、電荷結合素子
（ＣＣＤ）、ＣＩＤデバイス、写真フィルム乳液、検出
可能な生成物をもたらす光化学反応、並びに肉眼観察
（たとえば蛍光顕微鏡）。レポータが有機染料であれ
ば、静電位置感受性検出器を用いて共鳴マルチフォトン
イオン化を検知することができる。検出は時間ゲートお
よび／または周波数ゲートの光収集を用いて残留バック
グランドノイズを排除することができる。時間ゲート検
出が一般に望ましい。何故なら、これは照明を終了した
後に長時間発光の記録方法を与えるからである。したが
って、アップコンバート性燐の燐光または遅延蛍光に起
因する信号を記録すると共に、存在する場合には短寿命
の自己蛍光および散乱照明光が排除される。時間ゲート
検出は、回転羽根（すなわち機械的チョッパ）での特定
の時間的機械封鎖により或いは電子手段により行うこと
ができ、即発信号（すなわち照明を終了してから約０．
１〜０．３μｓ以内で生ずる）が排除される（たとえば
電子制御の固相光学シャッタ、たとえばポッケルもしく
はケールセル）。アップコンバート性燐およびアップコ
ンバート性遅延蛍光染料は典型的には約数ミリ秒（恐ら
く１０ｍｓ程度であるが、典型的には１ｍｓの程度）の
発光寿命を有するのに対し、バックグランドノイズは一
般に約１００ｎｓ以内で減衰する。したがって、パルス
励起源を用いる場合、一般に時間ゲート検出を用いて即
発信号を排除することか望ましい。
【００７３】アップコンバート性燐は光漂白を受けない
ので、極めて弱い放出燐信号を集めると共に極めて長い
検出時間（連続照明または多重パルス照明）にわたり積
算して検出感度を増大させることができる。この種の時
間積算は電子的または化学的（たとえば写真フィルム）
とすることができる。非赤外写真フィルムを弱い放出信
号を検出するための手段として使用する場合、アップコ
ンバート性レポータはダエンコンバー性（down-convert
ing ）燐と比較して励起源が典型的にはフィルムの顕著
な露出を生ぜしめない（すなわち暗室の安全光と同様）
波長範囲（たとえば赤外および近赤外）における照明を
与える点で有利である。すなわち、アップコンバート性
燐を免疫組織化学的染色および／または現場でのハイブ
リッド化につき赤外発生源（たとえば赤外レーザーダイ
オード）を用い蛍光顕微鏡と組合せて便利な超感度ラベ
ルとして使用することができ、さらに可視範囲ルミネセ
ンスの信号および画像検出につき写真フィルム（たとえ
ばコダック・エクタクローム）として使用することがで
きる（赤外遮蔽フィルタと共にまたはそれなしに）。
【００７４】装備の要約 第１図は、本発明により試料１５に関する診断を実施す
るための代表的装置１０を示す光学および電子ブロック
図である。本発明は１個もしくは複数のレポータを用い
て行うことができる。例示の目的で、この装置は２個の
燐レポータを使用して単一試料につき２つの診断を行う
システムを示す。第１レポータはλ1 に集中する励起バ
ンドとλ1 ′に集中する発光バンドとを有する一方、第
２レポータはそれぞれλ2 およびλ2 ′に集中する励起
および発光バンドを有する。本発明のレポータはマルチ
フォトン励起に依存するので、波長λ1 およびλ2 はλ
1′およびλ2 ′よりも長い。前者は典型的には近赤外
であり、後者は可視範囲である。レーザーダイオードま
たは発光ダイオード（ＬＥＤ）としうる１対の光源２０
（１）および２０（２）は所望の励起波長にて光を発す
る一方、光ダイオードとしうる各検出器２２（１）およ
び２２（２）は所望の発光波長にて光を検出する。発光
線は指数法則による入射光束に関係し、したがって効率
は試料に対し明確に集中する入射束を有することにより
最大化される。この目的で、２つの光源からの光を適す
る組合せ素子２５により単一光路に合体させ、レンズま
たは他の集束メカニズム２７により小領域に集束させ、
試料に当てる。燐レポータにより放出された光をレンズ
３０によって集め、２つの発光バンドにおける各成分を
適する分離素子３２により分離すると共に各検出器に指
向させる。
【００７５】レーザーダイオードを作動させると共に異
なる波長バンドにて放出光を検出するための多くの可能
な方式が存在する。これを一般的にレーザーダイオード
および検出器に連通する制御電子ブロック３５として示
す。制御電子装置の特定の調時および他の特性を特定実
施例につき以下説明する。異なる発光バンドを有するが
共通の励起バンドを有する複数のレポータを存在させる
ことができる。この種の場合、システムは単一のレーザ
ーダイオードにつき複数の検出器を備える。同様に、異
なる励起バンドを有するが共通の発光バンドを有する複
数のレポータも存在させうる。この種の場合は、システ
ムは単一の検出器につき複数のレーザーダイオードを備
え、時間多重化技術などを用いて波長を分離する。２個
の光源からの光を、共通の集束メカニズムにより単一位
置に集中させるよう組合せて示す。これは、たとえ試料
の同じ領域を照明することが望ましい場合にも必要でな
い。同様に、集光は単一集光メカニズムによって行う必
要もない。全ての光を保持する必要があれば、合体およ
び分離素子は波長分割マルチプレクサおよび２色フィル
タによるデマルチプレクサを備えることができる。損失
を許容しうる限り、５０％ビームスプリッタおよびフィ
ルタを使用することができる。
【００７６】図面は、試料を通過してライン内で検出さ
れる光を示す。一般的に、燐レポータからの発光は等方
性であり、光を入射光の方向から所定角度で集光して励
起源からのバックグランドを回避することが好ましい。
しかしながら、励起バンドおよび発光バンドは広く分離
されるので、この種のバックグランドは大抵の場合問題
にならないと思われる。寧ろ、他の配慮が他の形状を支
配する。たとえば、入射光線の光路に沿って戻る光を検
出して、光学経路における所定の素子を励起光路と検出
光路との間に共有することが望ましい。共有素子を有す
る典型的な種類の機器は顕微鏡であって、対物レンズを
用いて試料に励起照射線を集中させると共に発光照射線
を集める。この種の構成における極めて有利な実施例は
光学捕獲の現象を利用する。レポータを小ビーズに結合
させる場合は、ビーズを光束焦点近くの領域で捕獲する
ことができる。同一の発生源または異なる発生源を用い
てレポータを励起させることができる。小粒子を捕獲す
るための赤外ダイオードレーザーの使用についてはサト
ー等、「１．３μｍ小型ＩｎＧａＡｓＰレーザーを用い
る小粒子の光学捕獲」、オプチックス・レタース、第１
６巻、第５号（１９９１年３月１日）（参考のためここ
に引用する）に記載されている。
【００７７】特定検出技術 上記に要約したように、多チャンネル検出はたとえばフ
ィルタまたは２色ビームスプリッタのような光学装置を
使用し、燐レポータの発光バンドを充分に分離する。同
様に、共通発光バンドを有する複数レポータを電子技術
により検出しうることも指摘された。これら電子技術に
ついては多重発生源に関し以下説明する。しかしなが
ら、これら技術については単一チャンネルに関し最初に
説明する。これら技術は、この点に関し、測定しようと
する信号と同じ波長範囲にあるバックグランドの発生源
が存在するので有益である。
【００７８】第２Ａ図は、単一チャンネルに関し位相敏
感検波を実施するための装置を示す。対応する参照符号
を上記図面の符号に対応する部材につき使用する。この
点に関し、制御電子装置３５は波形発生器３７と周波数
ミキサ４０とを備える。波形発生器３７は周波数ｆ1 に
てレーザーダイオード２０（１）を作動させると共に、
ｆ1 にて信号を周波数ミキサに送信する。さらに周波数
ミキサは検出器２２（１）から信号を受信すると共に位
相制御入力信号を受信する。この回路は、バックグラン
ドが測定しようとする信号よりもずっと短い寿命（ミリ
秒と比較しナノ秒もしくはマイクロ秒）を有するので、
バックグランド識別をさらに可能にする。これは、信号
およびバックグランドが異なる位相を有するようにする
（これらは両者とも波形発生器の特徴的周波数にて変調
される）。寿命依存性の位相シフトの説明についてはデ
ムトレーダ、レーザー・スペクトロスコピー、スプリン
ガ・フェアラーク出版、ニーヨーク（１９８８）、第５
５７〜５５９頁（参考のためここに引用する）を参照す
ることができる。位相入力信号を制御して、信号を最大
化させると共にバックグランドに対し識別する。このバ
ックグランド識別は、信号を変調すると共にバックグラ
ンドを変調しない位相敏感検波に典型的な識別とは相違
する。未変調バックグランドに対する識別もここでは有
利であって、２種類の識別を与える。信号は２−フォト
ン励起に依存するので、２個の変調レーザーダイオード
を使用する共に変調周波数の合計もしくは差にて信号を
検出することができる。第２Ｂ図はこの種の配置を示
し、第１および第２レーザーダイオード２０（１）およ
び２０（１）′（同じ波長λ1 または恐らく異なる波長
にて発光）はそれぞれ周波数ｆa およびｆb で作動する
波形発生器３７ａおよび３７ｂからの信号により変調さ
れる。波形発生器の出力信号を第１周波数ミキサ４２に
連通すると共に、ｆa ±ｆb における信号を第２周波数
ミキサ４５に連通する。検出器２２（１）からの信号お
よび位相入力信号をも周波数ミキサ４５に連通する。
【００７９】第３図はゲート検出の実施装置を示す。バ
ックグランドは信号よりも短寿命であるため、検出の遅
延は識別向上を可能にする。この目的でレーザーダイオ
ードはパルス発生器５０により作動され、その遅延出力
を用いてゲート積算器または他のゲートアナライザ５５
を作動させうる。
【００８０】第４図は、λ1 およびλ2 に集中する励起
バンドを有すると共にλ3 近くに重なる発光バンドを有
する第１および第２レポータを用いた試料に関する診断
の実施装置を示す。試料にはレーザーダイオード２０
（１）および２０（２）からの光を第１図に関し上記し
たように照射する。第１および第２波形発生器３７
（１）および３７（２）はそれぞれ周波数ｆ1 およびｆ
2 にてレーザーダイオードを作動させ、ｆ1 およびｆ2
にて信号を各周波数ミキサ６０（１）および６０（２）
に送信する。検出器２２（３）からの信号を両周波数ミ
キサに連通し、これらミキサはそれぞれ位相入力信号を
も受信する。したがって、周波数ミキサ６０（１）は周
波数ｆ1 にて変調された放出光の量に対応する出力信号
を発生し、この信号は試料における第１レポータの存在
の尺度となる。同様に、周波数ミキサ６０（２）は周波
数ｆ2 で変調された放出光の量に対応する出力信号を発
生し、この信号は試料における第２レポータの存在の尺
度となる。
【００８１】２種の異なる波長の使用につき、異なる励
起バンドを有する２種のレポータに関し上記に説明し
た。しかしながら、この説明は単一レポータの場合にも
適用しうる。励起は２−フォトン過程であるため、２個
のフォトンが同じエネルギーを有する必要はない。寧
ろ、２個のフォトンの全エネルギーが励起バンド内にあ
ることのみが必要である。すなわち、レーザーダイオー
ドで異なる波長を与えるのは比較的簡単かつ安価である
ため、より可能な組合せ（すなわちより可能な全励起エ
ネルギーの選択）が存在する。これは、アップコンバー
タのための稀土類イオンの選択をより容易にする。何故
なら、励起工程は単一フォトンエネルギーを含むエネル
ギー移動一致性に依存する必要がないからである。さら
に、他の吸収性イオン（実施例におけるイッテルビウム
イオン）からのエネルギー移動を用いることなく中間レ
ベルの共鳴増大を利用して、発光性イオン（上記実施例
にてエルビウムイオン）の直接的な段階励起を達成する
こともできる。さらに、単一レポータにつき異なる波長
を用いて、励起依存性多重化およびバックグランド識別
技術につき他の手法を与えることもできる。
【００８２】単一燐の多重波長励起は、第５Ａ〜５Ｃ図
に示したように多数の方法で生ぜしめることができる。
２個のレーザーは単一イオンの段階的励起を第５Ａ図に
示したように生ぜしめる。第１レーザーはレベル１から
レベル２への励起を刺激すると共に第２レーザーはレベ
ル２からレベル３への励起を刺激し、このレベルにて発
光が生ずる。単一イオン励起は第５Ｂ図に示したように
エネルギー移動により生ずることもある。この場合、第
１レーザーはレベル１からレヘル２への励起を刺激し、
エネルギー移動はレベル２からレベル３まで生じ、第２
レーザーはレベル３からレベル４への励起を刺激する。
後者の過程の変法においては、レベル１および２は第１
イオン（すなわち感作剤イオン）とすることができ、レ
ベル３および４は第２イオン（すなわち活性化剤イオ
ン）とすることができる（第５Ｃ図に示す）。
【００８３】第５Ａ図に示した段階的励起方式において
エネルギー移動は必要でなく、したがって励起レーザー
の分極に関する情報が保持されて発光照射線の分極を生
ぜしめ、この場合、光の分極解除は信号とバックグラン
ドノイズとの間の識別を向上させうる。第５Ｃ図に示し
た多重イオンマルチレーザー励起方式については、共通
の励起波長を有する数種の燐が存在する。この場合、異
なる燐の間の識別は、異なる発光波長に基づきおよび／
または時間ゲート、周波数変調および／または位相敏感
検波により励起波長の変調を用いて実施することができ
る。
【００８４】特定機器の具体例 第６図は、手持プローブを用いて試料につき本発明を実
施するための装置の特定実施例に関する光学列を示す略
図である。この実施例は小形化された機器の形態を採用
し、ハウジング７５（ファントムで示す）と手持プロー
ブとを備えると共に光学繊維接続ケーブル８２を備え
る。光学および電子部品をハウジング内に位置せしめ
る。例示の目的で、３−チャンネル系の光学部品を示
す。試料は、たとえば可視スペクトルの青色、緑色およ
び青色部分における異なる発光バンドを持った３個まで
のレポータを含むことができる。さらに、レポータは近
赤外に異なる励起バンドを有すると思われる。３個のレ
ーザーダイオード８５ａ〜ｃからの出力ビームを目盛指
数（ＧＲＩＮ）レンズ８７ａ〜ｃを介して連通し、各繊
維セグメント８８ａ〜ｃの端部に集束させると共に、方
向性結合器９０または他の適するデバイスによって単一
繊維９０に連結する。繊維９０の端部から発する光をＧ
ＲＩＮレンズ９５により視準し、この光は２色ビームス
プリッタ９７を通過してＧＲＩＮレンズ１００により光
学繊維ケーブル８２の端部に再集束する。ビームスプリ
ッタは、レーザーダイオードから赤外線を通過させるが
可視光を反射すると思われる。
【００８５】手持プローブ８０はハンドピース１０２と
内部ＧＲＩＮレンズ１０５と裁頭円錐状の整列チップ１
１０とを備える。繊維８２から発する光をＧＲＩＮレン
ズ１０５により整列チップ１１０を僅かに越えた焦点１
１５に集中させる。整列チップを試料を保持する試験管
に近接させて、焦点１１５を試料に集中させる。試験管
はレーザー照射線に対し透過性であると思われる。試料
における焦点１１５の領域から発する光の１部をＧＲＩ
Ｎレンズ１０５によって集め、繊維８２中に集束させる
と共にＧＲＩＮレンズ１００により視準し、２色ビーム
スプリッタ９７にて反射させる。この光は３つまでの発
光バンドにおける波長を有することができる。光学繊維
１２０ａ〜ｃは特定成分を各光検出器１２５ａ〜ｃに指
向させる。特定フィルタ装置を示し、各フィルタは各発
光バンドにて光を反射するが、たとえば１個もしくはそ
れ以上のフィルタが発光バンドの帯域フィルタであれば
他の配置も使用される。制御電子装置は図示しないが、
上記の時間多重化もしくはヘテロダイン技術を用いるこ
ともできる。この種の技術は、たとえば発光バンドが明
確でない場合に必要である。
【００８６】第７Ａ図は、電荷結合素子（ＣＣＤ）画像
形成列１５０をガラスもしくはプラスチック基板に沈着
したペプチドもしくは他の生物学上活性な物質の二次元
列１５２と組合せ検出器として使用する本発明による実
施例の図面である。ＣＣＤ列は重なる不働態化層１５７
を持った多数の個々にアドレスしうる感光性検出素子１
５５を有する一方、ペプチド列は多数の個々の結合部位
１６０を有する。燐を含有するプローブはこのペプチド
列における１つもしくはそれ以上の素子に対し反応特異
性であり、したがってこれら素子のみに物理的に付着す
る。ペプチド列は画像形成列に対し１対１の幾何学関係
を有するよう示され、１個のピクセルがペプチド列にお
ける各素子に対応する。しかしながら、必要であれば１
群の検出器素子を有する大型ペプチド素子を設けること
も可能である。
【００８７】上記各種の技術を用いて、検出器列により
赤外レーザー刺激から燐の発光を識別することができ
る。第１に、検出器列の感度範囲を越えたＩＲ刺激に応
答する燐を使用することができる。この種の燐の例はガ
ドリニウムオキシスルフィド：１０％エルビウムであ
る。この燐は１．５μｍ照射線により刺激され、９６０
ｎｍおよび５２０ｎｍにて発光する。検出器列は１．５
μｍ照射線に対し非感受性であるが、アップコンバート
照射線に対し感受性である。さらに、燐発光は立上およ
び下降時間が比較的遅いので、ＣＣＤ検出器列によりパ
ルスレーザー刺激源から決定した時間とすることができ
る。アップコンバーション過程の減衰時間は特定の発光
移動および燐ホストに応じて可変である。しかしなが
ら、一般にこれは５００μｓ秒〜１０ｍｓの範囲であ
る。これはレーザー励起パルスおよび検出器列の能力と
比較して極めて遅い。ＣＣＤ列を加工する技術は、ＣＣ
Ｄ画像形成列が永年にわたり市販入手されているので周
知されている。この種の各種のデバイスはダビッド・サ
ルノフ・リサーチ・センター、プリンストン、ＮＪから
入手することができる。ペプチド列を加工する技術はホ
ドル等、「光指向の空間アドレス可能な平行化学合
成」、サイエンス、第２５１巻、第７６７〜７７３頁
（１９９１年２月１５日）（参考のためここに引用す
る）による論文に記載されている。記載された特定列は
１．２８ｃｍ×１．２８ｃｍの面積に１０２４個の別々
の素子を有する。
【００８８】第７Ａ図の実施例は、ＣＣＤ列と緊密接触
したペプチド列を示す。実際に、ペプチドを別途の基質
なしに不働化層に対し直接付着させることができる。し
かしながら、空間分離された列が好適である場合も存在
し、第７Ｂ図はペプチド列とＣＣＤ列とが分離された実
施例を示す。レンズ１６５の列は各結合部位からの光を
集光すると共に、これを各検出素子に集束させる。この
配置は、励起照射線を排除する他の技術を使用しない程
度までフィルタの使用を容易化させる。光学捕獲を用い
て、粒子上における燐の存在もしくは不存在を決定すべ
く試料粒子を一時的に固定化することができる。便利に
は、試料粒子を捕えるべく使用する波長範囲は選択され
るアップコンバート性燐のための励起波長範囲と実質的
に同一とすることができ、光学的捕獲および励起照明が
同じ発生源で行われる。第８図は、小粒子の単光束勾配
力（single-beam gradient force）捕獲につき使用する
装置のブロック図を示す。
【００８９】蛍光活性化細胞選別 ここに説明したアップコンバート性燐を流動血球測定法
による蛍光性細胞選別における燐光ラベルとして使用す
ることができる。従来の蛍光染料と異なり、アップコン
バート性燐は遺伝物質および細胞を損傷する波長範囲
（たとえばＵＶ）における励起照明を必要としない明確
な利点を有する。典型的には、アップコンバート性燐ラ
ベルを、懸濁物における細胞集団のサブ群細胞に存在す
る細胞表面蛋白に高い親和性および特異性を以て結合す
るたとえば抗体のような結合試薬に付着させる。燐標識
された結合成分を結合条件下で細胞懸濁物と接触させ
て、細胞表面蛋白を有する細胞が標識結合試薬に結合す
るようにし、これに対し細胞表面蛋白を欠如する細胞は
標識結合試薬に実質的に結合しない。懸濁細胞は、ほぼ
１個しか個別細胞が１度に試料検出帯域に存在しないよ
うな条件下で試料検出器に通過させる。典型的にはＩＲ
レーザーである発生源は各細胞および検出器（典型的に
は光電子増倍管または光ダイオード）を照明して発光照
射線を検出する。検出器は、検出された信号に基づき複
数の試料収集領域の１つへの検出帯域における細胞のゲ
ートを制御する。ＦＡＣＳ装置および方法の一般的説明
は米国特許第４，１７２，２２７号；第４，３４７，９
３５号；第４，６６１，９１３号；第４，６６７，８３
０号；第５，０９３，２３４号；第５，０９４，９４０
号；および第５，１４４，２２４号（参考のため、ここ
に引用する）に示されている。ＦＡＣＳ法につきラベル
として使用されるアップコンバート性燐は細胞もしくは
遺伝物質を損傷しない励起範囲（好ましくはさらに発光
範囲）を有することが好ましい。一般に、遠赤外および
赤外範囲における照射が励起に好適である。２００〜４
００ｎｍの範囲の照射はできれば回避すべきであると思
われ、波長範囲７６０〜７６５ｎｍは生存細胞の維持が
望ましい用途では回避することができる。
【００９０】他の改変 アップコンバートした燐照射線の吸収が高い環境におい
ては、燐微粒子を蛍光染料または染料の組合せにより選
択比率で被覆してアップコンバートした周波数で吸収
し、次いで他の波長にて再放出させる。これらフルオル
に対する単一フォトン吸収断面は典型的には極めて高い
ので、薄い層のみが燐発光の完全吸収につき必要とされ
る。この被覆粒子は次いで包封されて適する抗原もしく
は抗体レセプタ（たとえば微粒子）にて被覆することが
できる。この層状化の例を第９図に図示する。可視範囲
に強力な吸収移行部を有する広範な種類の蛍光染料が存
在し、その発光は可視範囲を包含すると共に赤外まで及
ぶ。大抵のものは１０％もしくはそれ以上の蛍光効率を
有する。このようにして、発光波長は粒子環境を通過す
るよう企画することができ、光学干渉フィルタを再び使
用して、励起波長と発光波長とを識別することができ
る。試験媒体に比較的大きい波長「ウインドー」が存在
すれば、単一種類の燐に被覆しうる発光波長の種類は入
手しうる染料および染料組合せの数によってのみ制限さ
れる。各種のリポータ間の識別は分光技術およびここに
説明した多重化技術により容易に行われる。すなわち、
複数標的の不均質混合物にて案出使用しうるプローブ／
レポータ「指紋」の個数は実質的に無制限である。
【００９１】上記原理は、スペシース特異性の光触媒的
および光化学的反応を行うにも適用することができる。
分光法の選択の他に、燐の長い発光減衰時間は比較的遅
い反応もしくは一連の反応を光露出の後の発光時間内に
生ぜしめることができる。これは、燐−［触媒もしくは
反応体］結合体が励起波長の侵入しえない環境に入る際
に特に有用である。この遅い放出は、より多数の標的が
粒子と相互作用する可能性を増大させる。燐粒子の独特
な減衰速度は動的研究をも可能にする。励起源への連続
露出が可能でない或いは浸蝕的であるため望ましくない
システムにおいては、パルス励起に続く遅延蛍光検出が
必要である。燐レポータが光励起された後、燐または燐
／染料結合体粒子からの発光は典型的には約１ミリ秒間
にわたり持続する。動的環境（たとえば運動する標的を
有する静的もしくは流動的システム）において、粒子は
励起／検出装置に対し相対移動する際に特徴的に減衰す
る強度の光を発する。システムの規模およびシステム内
の速度に適する画像形成光学系と組合せて、ＣＣＤ光電
気センサ列を用いて列視野を横切る粒子運動を検出す
る。充分特性化された時間の関数である燐の遅延発光は
個々の粒子位置、方向および速度の動的追跡を可能にす
ると共に、必要に応じ粒子寸法、密度および流体力学構
成の計算をも可能にする。粒子が運動する際、これはよ
り多くの列の素子に露出するが常に減少する強度を有す
る。減衰時間の所定部分にわたり露出される素子が多い
ほど急速に移動する。したがって、列により収集される
粒子発光「トラック」の積算強度パターンは粒子の速度
に直接関係する。これら粒子は再びパルスもしくはチョ
ップＣＷ励起源により任意の時間で更新される。第１０
図はこの経過を示す。「サイドオン」励起および検出の
みを図示するが、サイドオンおよびエンドオンの検出お
よび励起配置もしくは組合せも可能である。コンピュー
タ分析によるＣＣＤ列強度情報の整理は、動的に関与す
るシステムにおける粒子の実時間に近い追跡を可能にす
る。コンピュータにより行われるデータ分析および整理
は燐発光の固有減衰、照明されるピクセルの個数および
その信号レベル、列に対する減衰信号の方向性、および
列の焦点面に対し移動する粒子の錯乱円からの強度寄与
を包含する。エンドオン流動検出配置において、錯乱円
の寸法は、粒子がどのように迅速に焦点から移動するか
に直接関係し、粒子の速度を測定しうる１つの可能な手
段は反応カラムにおける化学および速度論を監視するこ
とであり、或いは流動血球測定に対するこの方法の適用
は流体力学特性（寸法、形状、密度）に基づく細胞の解
析を可能にする。さらに、この方法はインビボ診断用途
（たとえば血液還流速度）にも有用である。
【００９２】さらにアップコンバート性燐ラベルを用い
て、アップコンバート性燐ラベルが結合する領域におけ
る温度を検知することもできる。アップコンバート性燐
の温度測定法はＨ．バーソウおよびＣ．Ｋ．ヨルゲンセ
ン（１９９０年１０月）、オプチックス・レタース、第
１５（１９）巻、第１１００頁（参考のためここに引用
する）に記載されている。理解を明瞭にする目的で例示
のため本発明を詳細に説明したが、本発明の範囲内で多
くの改変をなしうることが了解されよう。以下、限定は
しないが実施例により本発明をさらに説明する。
【００９３】実験例 レポータとしてのアップコンバート性無機燐の確認 イッテルビウム−エルビウムでドープされたナトリウム
イットリウムフルオライドからなるアップコンバート性
燐粒子をサブミクロン寸法まで微粉砕し、粒子寸法によ
り分別すると共に、ポリカルボン酸で被覆した。Ｎａ
（Ｙ0.80Ｙｂ0.18Ｅｒ0.02）Ｆ4 を範囲９４０〜９６０
ｎｍにおける励起に基づくその高効率につき選択した。
Ｎｄ；Ｙａｇポンプ染料レーザー／ＩＲ染料組合せを用
いて、上記周波数範囲における８ｎｓ〜１０ｎｓ時間の
パルスを発生させた。レーザーパルスを用いて液体にお
ける微粉砕燐粒子の懸濁物を照明すると共に、その場で
ガラススライドに付着させた。直角で観察された懸濁物
ルミネセンスを集光レンズと最大可能範囲まで分散励起
光を濾過する空間フィルタと光電子増倍管と減圧光ダイ
オードもしくは簡単な固相光ダイオードとを用いて監視
した（観察される光レベルに応ずる）。
【００９４】ルミネセント信号レベルを溶液ｐＨ（範囲
６〜８）、粒子寸法、粒子量（μｇ／ｃｍ3 ）および安
定化用陰イオン型表面活性剤の種類の関数として決定し
た。信号をボックスカー積算器および長ＲＣ時間定数か
らの時間積分として或いは一時的デジタイザによる一時
的信号として記録し、特定実験条件下におけるルミネセ
ンス寿命を示した。その場での信号をもレーザー走査顕
微鏡法により測定した。第１１図は９７７．２ｎｍの波
長最大におけるレーザー源での励起に入射する燐発光ス
ペクトルの蛍光走査図であり、発光最大は約５４１．０
ｎｍである。第１２図は燐励起スペクトルの励起走査図
であり、発光収集ウインドーを５４１．０ｎｍに設定
し、燐の励起最大を５４１．０ｎｍに設定し、発光波長
を約９７７ｎｍに設定した。第１３図は励起照明の終了
後における５４１．０ｎｍの燐ルミネセンスの時間−減
衰測定図である。最大燐光は約４００μｓで出現し、約
１０００μｓにて燐光の低い安定レベルまで徐々に減衰
する。第１４図は燐発光強度を励起照明強度の関数とし
て示す。燐光強度は励起強度と共に、ほぼ約１０００Ｗ
／ｃｍ3 まで増大する。
【００９５】サブミクロンのＮａ（Ｙ0.8 Ｙｂ0.12Ｅｒ
0.08）Ｆ4 粒子の燐光効率を測定した。Ｔｉ：サファイ
ヤレーザーを励起源として使用すると共に、分光光度計
および光電子増倍管を検出システムとして使用した。２
種類の測定を行った。第１の測定は、燐懸濁物につき粒
子１個当りの絶対発光を５４０ｎｍおよび６６０ｎｍに
おける発光バンドで測定する直接的測定とした。検定し
た断面を第１５図に示し、寸法依存性を第１６図に示
す。これは、９７５ｎｍにおける励起光および約２０Ｗ
／ｃｍ3 の強度にて０．３μｍの粒子につき約１×１０
-16 ｃｍ2 の燐光断面に相当する。約２５μｍの乾燥燐
粉末の発光効率も測定した。結晶ホストにおけるＹｂ+3
の吸収断面に関する既知の数値［ラコバラ等（１９９
１）、オプチックス・レタース、第１６巻、第１０８９
頁、参考のためここに引用する］および粒子寸法に対す
る燐光発光の測定された依存性に基づき、約１×１０
-15 ｃｍ 2 の燐光断面が判明した。これら２種の測定値
の間の差は、乾燥燐と水性懸濁液との間の燐光効率の差
または乾燥燐における多重分散フォトンの吸収に起因す
る。これら断面推定値のいずれかに基づき、断面は中庸
レーザー強度における単一サブミクロン燐粒子の検出を
可能にするのに充分大である。約１０Ｗ／ｃｍ2 のレー
ザー強度にて燐光はレーザー強度として１．５乗まで増
大する。
【００９６】燐粒子性能：検出の感度 （Ｙ0.86Ｙｂ0.08Ｅｒ0.06）2 Ｏ2 Ｓよりなる単分散の
０．３μｍアップコンバート性燐粒子のシリーズ希釈物
を含有する一連のテラサキプレートを、ＩＲダイオード
レーザー照明の下でプロトタイプ機器でアップコンバー
ション蛍光につき試験した。燐粒子をＤＭＳＯでの沈降
により作成し、０．１％アラビヤゴム水溶液にシリーズ
で希釈した。これは全ゆる水分散問題を完全に排除する
と思われた。使用したシリーズ希釈物を第ＩＩＩ表に示
す。
【００９７】
【表３】
【００９８】保存ＤＭＳＯ分散物は、４−１ｍＬ試料を
蒸発させることにより重力測定して、１．７０±０．０
９ｍｇ／ｍＬ（９５％信頼限界）の燐密度を有した。こ
れは２３．６×１０9 粒子／ｍＬに相当する（０．３μ
ｍの平均粒子寸法および５．３ｇ／ｍＬの粒子密度と仮
定する）。１１０〜１２０℃にて週末にわたり試料を蒸
発させた後の残留物は顕著に黄色であったが、ＩＲダイ
オードレーザーで試験した際に燐光を発した。目に見え
る緑色光が１０-3（すなわち０．７μｇ／ｍＬもしくは
２３．６×１０6 粒子／ｍＬ）までの全てのシリーズ希
釈物から、１ｍＬのポリプロピレン微小遠沈管で手持ダ
イオードレーザーにより暗室にて発した。１０-1および
１０-2希釈物は肉眼で濁っていた。各シリーズ希釈物の
１μＬまたはその次の高い希釈物の０．１μＬをピペッ
トでテラサキプレートの穴に入れた。１μＬは穴の底部
を埋め、０．１μＬは穴の縁部に沿って広がったが全表
面を覆わないことが判明した。低い粒子濃度を有する小
容積に関連した統計的問題およびピペット操作問題のた
め、２〜４反復を各希釈物につき作成した。テラサキプ
レートの穴は１０μＬ容積の試料を保持する。この容積
に含まれる全燐粒子が試料穴の底部に付着すると仮定し
て、等価検出器感度を推定することができる（第ＩＩＩ
表）。１０-15 〜１０-18 Ｍが酵素結合表面分析の正常
範囲であることに注目すべきである。
【００９９】比較試料の結果 比較試料を、プロトタイプのアップコンバーション蛍光
測定装置（ダビッド・サルノフ・リサーチ・センター）
を用いて走査した。モータ操作Ｘ−Ｙ位置決定段階を用
い、プレートを赤外ダイオードレーザーの焦点に対し５
０μｍ増し分にて移動させることにより試料を走査し
た。ＩＲダイオードレーザーを６３ｍＷ（１００ｍＡ）
にて操作した。ビームを焦点に２．４×１０-3ｃｍ2 ま
で集束させた。試料穴の底部が約１．４×１０-2ｃｍ2
（直径１３６５μｍ）であるため、ビームは個々の位置
にて穴底部表面の１７％以下を覆う。さらに穴は傾斜側
壁部をも有し、この側壁部は試料穴の底部から頂部まで
拡開すると共に徐々に発散するレーザービームにより応
答する。光学系におけるロスを無視し、焦点（試料穴の
底部）のＩＲ光強度は９８０ｎｍの波長にて約２６〜２
７Ｗ／ｃｍ2 であった。光電子増倍管（ＰＭＴ）を試料
から放出される可視光（アップコンバート光）の検出に
使用した。レーザービーム幅は試料穴の底部における表
面積よりも小さいので、プレートをダイオードレーザー
の焦点に対し肉眼検査により整列させて、レーザーを中
央穴に集中させた（穴Ｃ５、Ｃ６およびＣ７を読取る際
にはＣ６また穴Ｄ５、Ｄ６およびＤ７を読取る際にはＤ
６とした）。ＰＭＴ信号（ａｍｐ）を各プレート位置で
記録し、試料穴の幅（約４０００μｍ）にわたり数字的
に積算した。１０-2〜１０0 希釈試料の穴における種々
異なる位置で数回の走査を行って、粒子分布の均一性を
決定した。４０００μｍ距離にわたるＰＭＴの平均的暗
視野電流を積算することによりバックグランド信号を決
定して、１×１０-9μａ−ｍの積算バックグランド信号
を得た。試料穴の積算値をこのバックグランド信号に変
換し、これを第１９図に示す。
【０１００】免疫診断試料検出 免疫収着分析形式におけるアップコンバート性燐レポー
タの能力を示すため一連のＩｇＧ／抗−ＩｇＧ試料を作
成した。これら試料は抗原（マウスＩｇＧ）および牛血
清アルブミン（ＢＳＡ）で被覆された６個の個々の穴
（陽性試料）、並びにＢＳＡのみで被覆された６個の穴
（陰性比較）で構成した。ヤギ抗−マウスＩｇＧ抗体
（抗−ＩｇＧ）で被覆した公称０．３μｍの（Ｙ0.86Ｙ
ｂ0.08Ｅｒ0. 06）2 Ｏ2 Ｓ燐粒子を次いでレポータ−抗
体結合体として使用した。透明なポリスチレン製テラサ
キプレートの６個の穴（Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｄ５、Ｄ６
およびＤ７）をマウスＩｇＧで被覆し、その際３７℃に
て燐酸塩緩衝塩水（ＰＢＳ）における５μＬの１００μ
ｇ／μＬマウスＩｇＧ溶液に対し培養した。１時間の
後、この溶液を吸引すると共に各試料穴をＰＢＳにおけ
る１０μＬの３％ＢＳＡで洗浄した。これを直ちに吸引
除去し、ＰＢＳにおける２０μＬの３％ＢＳＡで置換し
た。各試料穴をＢＳＡで後被覆し、その際２０μＬのＢ
ＳＡ／ＰＢＳ溶液に対し３７℃で１時間培養した。後被
覆溶液を吸引除去し、プレートを４℃にて１晩貯蔵し
た。これら穴を陽性試料とみなした。第２のテラサキプ
レートにおける同じ６個の穴を同様に作成したが、ただ
しマウスＩｇＧで被覆しなかった。この第２群の試料穴
を陰性比較とみなした。
【０１０１】燐−抗体結合体 乾燥燐をＤＭＳＯに懸濁させることにより、（Ｙ0.86Ｙ
ｂ0.08Ｅｒ0.06）2 Ｏ 2 Ｓ燐粒子の溶液を作成した。初
期粒子密度は、光学顕微鏡の視野に含まれる粒子の個数
を計数することにより測定して、約１０7 粒子／ｍＬで
あった。０．３μｍの基礎粒子寸法は顕微鏡の解像限界
以下であることに注目すべきである。この溶液を３日間
にわたり乱すことなく沈降させた。濁って恐らく殆ど単
分散の小粒子を含有する上澄液をその後の結合に使用し
た。ヤギ抗−マウスＩｇＧ抗体（Ａｂ）をＤＭＳＯ分別
された燐粒子に（吸着により）結合させた。これは、２
００μＬのＡｂ溶液（０．１ＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．
２における）をＤＭＳＯにおける１００μＬの燐懸濁物
と混合して行った。数種の異なるＡｂ濃度を０．０２５
〜１μｇ／μＬの範囲で試みた。０．２５μｇ／μＬの
濃度が最も効率的な被覆をもたらすと思われた（すなわ
ち、最小の燐粒子の凝集を伴って最大のＡｂ利用率）。
燐を室温にて１晩にわたりこのＤＭＳＯ／トリス溶液に
おけるＡｂとゆっくり撹拌しながら平衡化させた。得ら
れた燐−Ａｂ結合体をこの溶液から遠心分離すると共
に、後被覆するためＰＢＳにおける３μｇ／ｍＬのＢＳ
Ａ溶液に再懸濁させた。得られたＢＳＡ／ＰＳＡ再懸濁
物を分析のため直接使用した。
【０１０２】燐に対するＡｂ吸着程度および残留Ａｂ活
性のを、燐結合したＡｂをフルオレスセインイソチオシ
アネート（ＦＩＴＣ）結合−マウスＩｇＧで滴定して測
定した。得られたＦＩＴＣ標識燐をサイテロン・アブソ
ルート流動血球測定計に通過させ、この測定計は粒子の
相対寸法を測定することができる。２種の異なる寸法の
サブ集団を観察し、計数した粒子の約６５％が小さい恐
らく単分散の粒子として出現し、３５％がずっと大きい
恐らく凝集体として出現した。小さいサブ集団の６０％
のみが著量の活性Ａｂを有すると思われた（ＦＩＴＣ蛍
光により測定）。目的とする凝集体のうち、約９０％が
活性Ａｂを含有すると思われた（ＦＩＴＣ蛍光によ
る）。これは、燐−Ａｂ結合体の４０％未満が適する寸
法（公称０．３μｍ）であって抗−マウスＩｇＩ活性を
示したことを示唆する。燐−Ａｂ結合体の同様な割合
（３１％）が活性であったが、顕著に大きい燐レポータ
を有した。ＰＭＴ信号（ａｍｐ）を各プレート位置で記
録し、試料穴の幅（約４０００μｍ）にわたり数値的に
積算した。平均信号（９５％信頼限界）は次の通りであ
った： 陽性試料の平均値＝１．３０×１０-4±１．２５×１０
-4μａ−ｍ； 陰性比較の平均値＝４．２０×１０-6±６．８２×１０
-6μａ−ｍ。 陽性試料および陰性比較は９９．９％信頼レベルにて統
計的に相違する。陽性試料は平均で陰性比較よりも３
０．０±２９．７倍多い光を発する。
【０１０３】生物学的巨大分子に対する燐の結合 生化学レポータとしてのアップコンバート性燐に関する
パラメータをさらに評価するため、生物学的リンカを燐
粒子に付着させた。ナトリウムイットリウムフルオライ
ド−イッテルビウム／エルビウム燐粒子をストレプトア
ビジンで被覆した。燐単独およびストレプトアビジンで
被覆された燐の励起および発光スペクトル特性を測定し
（第１７Ａ、１７Ｂ、１８Ａおよび１８Ｂ図）、未被覆
およびストレプトアビジン被覆の両燐はその吸収および
発光特性においてほぼ同一であり、このことは巨大分子
リンカ（たとえば蛋白）の付着がたとえ存在したとして
もアップコンバート性燐の燐光性に対し殆ど作用を示さ
ないことを示唆する。次いでストレプトアビジン被覆さ
れた燐はビオチニル化された磁性ビーズに特異的に結合
し、これはたとえば免疫分析、免疫組織化学、核酸ハイ
ブリッド化および他の分析のような生化学分析における
レポータとしてのリンカ結合無機燐の利用可能性を示
す。磁性ビーズ技術は溶液からのビオチン結合ストレプ
トアビジン被覆燐の容易な分離を可能にし、磁性ビーズ
が固体基質であるサンドイッチ分析につき特に適してい
る。
【０１０４】有利には、ストレプトアビジン−ビオチン
化学は、アップコンバート性燐レポータが適している各
種の生物学的分析に広く使用される。第２０図は、限定
はしないがたとえばアナライト（たとえば抗原標的）を
ビオチニル化抗体に結合させることにより溶液中のアナ
ライトを検出するための免疫分析の１実施例を示し、こ
こでアナライトは固体支持体（たとえば磁性ビーズ）に
固定化されたサンドイッチ複合体を形成し、これは最初
に固体基質に直接結合した第１結合成分を第２結合成分
（たとえばビオチニル化抗体）に結合させて行われる。
次いでストレプトアビジン被覆されたアップコンバート
性燐はサンドイッチにおけるビオチニル化抗体に特異的
に結合して、固体支持体におけるサンドイッチ複合体の
形成をリポートするよう作用する（これはアナライト濃
度の尺度である）。固体基質が磁性ビーズである場合、
これは磁気分離により試料溶液から容易に除去され、サ
ンドイッチ複合体におけるビーズに付着した燐の量は特
定アップコンバート性燐光を測定して決定される。すな
わち、サンドイッチ複合体の燐光はアナライト濃度の定
量的尺度を与える。さらにビオチニル化ポリヌクレオチ
ドもハイブリッド化プローブとして便利に使用され、こ
れらプローブはストレプトアビジン被覆アップコンバー
ト性燐により結合されてハイブリッド形成をリポートす
ることができる。
【０１０５】生物学的試料におけるバックグランド燐光 免疫分析における生じうるバックグランドを決定すべ
く、２種の生物学的試料にてバックグランド信号を測定
した。唾液および尿を、燐光感度測定（上記）につき使
用したと同じ装置で試料として使用した。光電子増倍管
の暗電流により設定されたシステムのノイズレベルより
高いバックグランドレベルは観察されなかった。このノ
イズレベルは数百個の粒子／ｃｍ3 の程度にて信号の検
出を可能にする。これは、システムの検出量にて単一の
粒子に近い。光電子増倍管はアップコンバート性燐の高
感度測定につき好適な検出器の選択である。何故なら、
光電子増倍管はアップコンバート（すなわち発光）され
た波長にて高い量子効率を発生すると共に長い励起波長
の範囲では反応しないよう選択しうるからである。
【０１０６】燐標識抗体による細胞抗原の検出 ストレプトアビジンを上記と同様にアップコンバート性
燐粒子に付着させる。マウスのリンパ腫細胞ラインＥＬ
−４を、３０ｋＤ細胞表面ＥＬ−４ ＣＤ３Ｔリンパ球
分化抗原に対し特異的に結合するハムスター抗−ＣＤ３
抗体で検査する。次いで一次ハムスター抗体をビオチニ
ル化ヤギ−抗ハムスター二次抗体により特異的に結合さ
せる。次いでビオチニル化された二次抗体をストレプト
アビジン−燐結合体で検出する。この種類の多重抗体付
着および標識を抗体レイヤリング（layering）と称す
る。複数層の付加（たとえば一次ハムスターＡｂとヤギ
−抗ハロスターＡｂとの結合に続く、ビオチニル化ウサ
ギ−抗ヤギＡｂとの結合）を用いて、標的から燐を分離
する距離を増大させる。信号強度と標的検出特異性とに
対するレイヤリング作用を検量すると共に、１つの層
（一次抗体はビオチニル化される）から少なくとも５層
への層抗体レイアリングを行いかつＥＬ−４細胞におけ
るＣＤ３を検出するための最適層数を確認することによ
り個々の使用につき最適化した。
【０１０７】第２１図は、励起スペクトルおよび／また
は発光スペクトルに基づいて識別しうる燐を用いた２種
のＥＬ−４細胞表面抗原の同時的検出を図示する。第２
１図に示した方式における両抗原の検出は、Ａｂ層状化
試料と共に培養する前にストレプトアビジン被覆燐（Ｎ
ｏ．１もしくはＮｏ．２）に結合させるビオチニル化末
端抗体を使用する。すなわち、燐−抗体特異性はストレ
プトアビジンと一次抗体結合試料と共に培養する前に予
備生成されるビオチンとの間の異常に強い（Ｋ D 約１×
１０15Ｍ-1）非共有結合により保持される。各抗原の定
量は、それぞれ個々の燐物質に起因する異なる信号を検
出して行われる。燐光信号は励起スペクトル、発光スペ
クトル、蛍光減衰時間またはこれらもしくは他の性質の
組合せに基づいて識別することができる。第２２図は、
さらにバックグランド識別を与える位相敏感検波の装置
の図面である。パルスもしくは周波数ミキサを、信号を
通過させると共に最大バックグランド排除のため周波数
検定の後にバックグランドを識別するよう設定する。
【０１０８】アビジンに対するアップコンバート性燐ラ
ベルの共有結合 アップコンバート性イットリウム−イッテルビウム−エ
ルビウム（Ｙ0.86Ｙｂ 0.08Ｅｒ0.06）オキシスルフィド
（Ｏ2 Ｓ）燐を次の手順によりアビジンに結合させた：
単分散アップコンバート性燐粒子を、アルクレスにより
詳述された手順［シリコーン化合物：レジスタ・アンド
・レビュー、ヒルス・アメリカ、第５９〜７５頁（１９
９１）］に従いチオプロピルトリエトキシシラン（Ｈｕ
ｌｓ）でシラン化した。これはチオプロピルトリエトキ
シシラン（２ｇ）と９５％水性エタノール（１００ｍ
Ｌ）とを５００ｍＬの三角フラスコに添加して行い、２
分間撹拌した。次いで、ＤＭＳＯにおける約８ｍＬの６
５ｍｇ／ｍＬ燐懸濁物を混合物に添加した。この懸濁物
をさらに２分間攪拌し、次いで遠沈管に移して遠心分離
することにより燐粒子を分離した。ペレットをそれぞれ
９５％水性エタノールで遠心分離して２回洗浄した。得
られた粒子を集め、減圧下で約３０℃にて１晩乾燥させ
た。所定量（１２７ｍｇ）の乾燥シラン化燐を１．５ｍ
ＬのＤＭＳＯに再懸濁させた（燐保存液）。
【０１０９】１．０ｍＬの硼酸塩緩衝液（５０ｍＬの脱
イオン水における９５４ｍｇの硼酸ナトリウム十水塩お
よび１７．７ｍＬの０．１Ｍ ＨＣｌ、ｐＨ８．３）に
１．１９ｍｇのアビジン（ピアス社）を含有する溶液を
作成した（アビジン保存液）。１．２ｍＬのＤＭＳＯ中
に１．７ｍｇのＮ−スクシニミジル（４−イオドアセチ
ル）−アミノベンゾエート（ピアス・ケミカル社）を含
有する他の溶液を作成した（ＳＩＡＢ保存液）。所定量
（１０μＬ）のＳＩＡＢ保存液を１．０ｍＬのアビジン
保存液に添加し、室温にて３０分間撹拌してＳＩＡＢの
Ｎ−ヒドロキシスクシミドエステルをアビジンにおける
第一アミンと反応させた（アビジン−ＳＩＡＢ保存
液）。１０ｍＬの硼酸塩緩衝液（ｐＨ８．３）を含有す
る２０ｍＬのシンチレーション小瓶を作成した。次い
で、この小瓶に対し次の添加を行った：２１．６μＬの
アビジン−ＳＩＡＢ保存液に続く１．５ｍＬの燐保存
液。この反応混合物を暗所にて室温で１晩撹拌して、Ｓ
ＩＡＢ活性化アビジンをシラン化燐表面に存在するチオ
ール基と反応させ、燐粒子に対するアビジンの共有結合
を生ぜしめた。１晩培養した後、１．０ｍＬの反応混合
物を遠心分離し（１０，０００ｇにて１分間）、上澄液
を除去した。ペレットを１．０ｍＬの燐酸塩緩衝塩水
（ｐＨ７．２、ピアス社）に再懸濁させ、再び遠心分離
して未結合の蛋白を燐から洗浄除去した。この洗浄工程
を反復した。洗浄されたペレットを１．０ｍＬの燐酸塩
緩衝塩水に再懸濁させ、下記する診断分析に直接使用し
た。
【０１１０】測定装置 燐試料からの蛍光スペクトルを測定すべく改変ＳＬＭア
ミンコ４８０００型フルオリメータを使用した。この装
置の改変はレーザーダイオード（ダビッド・サルノフＣ
Ｄ−２９９Ｒ−ＦＡ Ｎｏ．１３）を付加することから
なり、これをポート３によりフルオリメータに入力し
た。このレーザーダイオードはλ＝９８５．１ｎｍにて
発光する。ダビッド・サルノフ・リサーチ・センターに
より提供されるスペクトルデータも９８０．２ｎｍにて
小ピークを示す。このピークは、９８５ｎｍにおけるピ
ーク強度の１５％を有する。５．０８ｃｍ焦点長さのレ
ンズを用いてダイオードレーザービームを視準した。Ｉ
Ｒレーザー光線の出力は、７５ｍＡの作動電流にてキュ
ベット位置で６．１ｍＷとして測定された。このビーム
はキュベットの中心に集束しなかった。これはフルオリ
メータ励起モノクロメータからの標準可視光線について
も言える。レーザーダイオードビームはキュベットホル
ダに突入する際に発散し、セルの中心に達する時点で約
４ｍｍ（Ｈ）×２ｍｍ（Ｖ）となる（セル壁部および液
体の屈折率における変化を無視する）。放出される光を
モノクロメータで走査すると共に、励起光の方向から９
０°にて光電子増倍管（ＰＭＴ）により検出する。改変
ＳＬＭアミンコ４８０００の型フルオリメータ検出限界
は、ＰＢＳにおける４×１０-16 Ｍ（１ｍＬ当り２４
０，０００個の燐粒子）までシリーズ希釈して決定し
た。スペクトルにおける燐発光ピークは４０６±２ｎ
ｍ、４３４±２ｎｍ、５２２±２ｎｍおよび５４８±２
ｎｍの波長にて見られた。最大ピークは５４８ｎｍであ
った。５４８ｎｍピークの強度を用いて試料を識別し
た。
【０１１１】細胞表面マーカーに対するアビジン−燐結
合体の結合 リンパ芽球腫細胞ライン（ヒト遺伝子突然変異細胞寄託
Ｎｏ．ＧＭ ０７０９０）を、１５％熱失活胎児牛血清
を含有するＲＰＭＩ １６４０培地で培養した。細胞の
懸濁物（１０7 細胞）を遠心分離し、等容積の燐酸塩緩
衝塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）に再懸濁させた。細胞
をＰＢＳで２回洗浄し、５×１０6 細胞／ｍＬの最終濃
度まで再懸濁させた。次いで、これら細胞をヒトβ2 −
マイクログロブリン（すなわち種類Ｉ組織適合性抗原）
に対するマウスＩｇＧ１モノクローナル抗体と共にポリ
スチレン遠沈管で培養した。細胞を４℃にて３０分間に
わたり１０μｇ／ｍＬの抗体濃度にて免疫沈殿させた。
これら細胞を遠心分離により回収し、ＰＢＳで２回洗浄
し、ＰＢＳに再懸濁させ、次いで６本の新たな遠沈管に
分けた（２５０μＬ）。これら試料の４種にはビオチニ
ル化ヤギ抗−マウスＩｇＩを添加する一方、残余の２種
にはＦＩＴＣ標識ヤギ抗−マウスＩｇＧを添加した。こ
れら免疫沈殿は、４００μＬの容積にて４℃で３０分間
にわたり２０μｇ／ｍＬの最終的な第２抗体濃度にて行
った。細胞を回収すると共に上記と同様にＰＢＳで洗浄
したが、５０μＬの封鎖用緩衝液（ＰＢＳにおける０．
２％精製カゼイン、トロピックス社、ベッドフォード、
ＭＡ）に再懸濁させた。細胞−抗体複合体をこの溶液に
て室温で３０分間にわたり封鎖し、次いで新たな試験管
に移した。
【０１１２】アビジン−燐結合体、アビジン−ＦＩＴ
Ｃ、アビジンまたは未結合燐のいずれかである予備封鎖
された懸濁物（４０μＬ）を、ビオチニル化抗−マウス
ＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）と結合した細胞試料の４種に添加し
た。さらに、同量の予備封鎖されたアビジン−燐または
未結合燐を非ビオチルニル化ＦＩＴＣ標識抗−マウスＩ
ｇＧ（Ｈ＆Ｌ）で免疫沈殿された残余の２種の細胞試料
に添加した。アビジン−レポータ結合体または陰性比較
を次のように予備封鎖した。アビジン−燐および燐単独
を、１００μＬの最終容積まで１０μＬの６．７ｍｇ／
ｍＬ懸濁物を添加することにより封鎖緩衝液で希釈し
た。アビジン−ＦＩＴＣおよびアビジン単独比較をも、
１００μＬの最終容積まで２７μＬの２．５ｍｇ／ｍＬ
溶液を添加することにより封鎖緩衝液で希釈した。これ
ら試薬を室温にて３時間にわたり中間的に再懸濁しなが
ら封鎖し、次いでビオチニル化もしくは非ビオチニル化
第２抗体で標識された５０μＬの細胞に添加した。アビ
ジン−ビオチン反応を、時々再懸濁させながら室温にて
３０分間行った。遠心分離により細胞を回収すると共に
封鎖用緩衝液で２回洗浄することにより反応を停止させ
た。これら試料を１００μＬの封鎖用緩衝液に再懸濁さ
せ、４〜５分間にわたり沈降させた。画像形成用のスラ
イドを、５μＬの沈降細胞を試験管の底部からピペット
採取することにより作成した。細胞を適する条件下での
共焦点レーザー顕微鏡法により画像形成して、細胞表面
ＦＩＴＣおよびアップコンバート性燐信号を観察した。
これら観察を第ＩＶ表に要約する。
【０１１３】残余の試料を用いて、ヒツジ抗−マウスＩ
ｇＧと結合した常磁性ポリスチレンビーズを再懸濁させ
た。６種の各試料につき、３×１０7 ビーズを封鎖用緩
衝液で室温にて１時間にわたりエッペンドルフ管中で予
備洗浄した。緩衝液を、エッペンドルフ管を磁気ラック
に入れながら吸引して除去した。抗−マウスＩｇＧを有
する磁性ビーズを抗体標識細胞に室温にて１時間にわた
り間歇的に再懸濁させながら結合させた。次いで磁性ビ
ーズを磁気ラックに集め、封鎖用緩衝液で４回洗浄し、
１００μＬの封鎖用緩衝液に再懸濁し、新たなチューブ
に移し、次いでアップコンバート性燐光をフルオリメー
タで測定した。
【０１１４】燐発光につき走査するため発光モノクロメ
ータバンド幅を８ｎｍに設定し、スペクトルを５００〜
７００ｎｍにて２ｎｍの段階寸法で走査した。さらに試
料を２ｎｍのバンド幅にてλ＝４９０ｎｍで３７μＭに
より励起させてＦＩＴＣ信号につき測定した。励起波長
（４９０ｎｍ）および発光波長（５１４ｎｍ）はＦＩＴ
Ｃにつき極めて近似するので、分離可能な信号を得るに
は燐標識の場合よりも高い解像が必要とされた。４９０
ｎｍ信号の強度は穴の中心にて２４０μＷ／ｃｍ2 であ
った。ＦＩＴＣ発光スペクトルを４５０ｎｍから７５０
ｎｍまで２ｎｍのバンド幅にて発光モノクロメータによ
り０．５ｎｍの増し分にて走査した。試料１は陽性比較
であり、最高の発光信号を明かに与えた。試料２は、試
料に対する燐の非特異的吸着が制限されると共にアビジ
ン結合燐に起因する信号から容易に識別されることを示
し、さらにアビジン結合燐がプローブと結合する際にの
み、この実施例ではビオチン−アビジン結合を介して特
異的に結合しうることを示す。試料３は陰性比較であっ
て、燐を含有せず、アビジンのみを含有する。試料４は
ＦＩＴＣ結合アビジンを示す。ＦＩＴＣ信号はレーザー
顕微鏡法により細胞表面で観察されたが、これら信号は
ＦＩＴＣの測定につきフルオリメータでの検出レベルよ
り低く、また試料には燐が存在しなかったので顕著な燐
信号も存在しなかった。試料５および６は、ＦＩＴＣ結
合一次抗体を検出することができ、さらに燐もしくはア
ビジン−燐の存在が標的抗原に対する一次抗体の結合を
顕著には阻害しないことを示す。
【０１１５】
【表４】
【０１１６】ＤＮＡに対するアビジン−燐結合体の結合 プラスミドＤＮＡ（２５μｇ）の２０ｍＭのｄＧＴＰと
２０ｍＭのｄＣＴＰと２０ｍＭのビオチン−１４ ｄＡ
ＴＰと１３ｍＭのｄＴＴＰと７ｍＭのジゴキシゲニン−
１１ ｄＵＴＰとの存在下にニック翻訳すると共に、エ
タノール沈殿により精製した。ビオチニル化されたジゴ
キシゲニン標識断片の平均寸法は、ゲル電気泳動により
推定して２００〜３００ヌクレオチドの範囲であると推
定された。約２０μｇのＤＮＡを、２００μＬ容積にお
ける１０μｇ／ｍＬのマウスモノクローナル抗−ジゴキ
シゲニンＩｇＧ１溶液（ＰＢＳ）により２２℃にて１時
間にわたり免疫沈殿させた。ＤＮＡを含有しない均等な
反応物も作成した。これら２種の試料のそれぞれを次い
で３本の新たなエッペンドルフ管に分け入れた（５０μ
Ｌ）。アビジン結合体を、５００μｇのアビジン−燐懸
濁物、未結合燐懸濁物またアビジン溶液を３００μＬの
封鎖緩衝液で希釈して室温で１時間にわたり封鎖した。
各試料（第Ｖ表に要約する）のそれぞれにつき、５０μ
Ｌの抗−ジゴキシゲニン結合体を１５０μＬの予備封鎖
されたアビジン結合体もしくはアビジンに添加し、室温
にて３０分間培養した。
【０１１７】ヒツジ抗−マウスＩｇＧ（封鎖緩衝液で予
備封鎖）と結合させた３×１０7 個の常磁性ビーズを再
懸濁させることにより未結合アビジン−結合体を除去し
た。間歇的に再懸濁しながら室温にて３０分間培養した
後、ビーズを磁気ラック上で分離すると共にＰＢＳで４
〜６回洗浄した。抗体−ＤＮＡ結合ビーズを次いでフル
オリメータで測定した。各試料を８ｎｍのバンド幅およ
び２ｎｍの段階寸法にて５００〜７００ｎｍで走査し
た。示した各ＰＭＴ値（第Ｖ表）は５回の走査の平均値
を示す。試料１は最高のＰＭＴ信号を与えると予想され
る。何故なら、ビオチニル化ＤＮＡが存在してアビジン
結合燐に結合しうるからである。試料２は、顕著でない
ことが判明した試料への燐の非特異的吸着のレベルを示
す。何故なら、ＰＭＴ信号は燐を含有しない陰性比較
（試料４）におけると同じであると観察されたからであ
る。試料３は他の比較であって、アビジン結合燐がＤＮ
Ａの不存在下で常磁性ビーズに結合しないことを示す。
試料５および６は分析を確認すべく用いたＦＩＴＣ標識
アビジンの結果を示す。
【０１１８】
【表５】
【０１１９】燐ダウンコンバーションの評価 （Ｙ0.86Ｙｂ0.08Ｅｒ0.06）2 Ｏ2 Ｓ燐の試料をダウン
コンバート信号の存在につき走査した。これは、上記単
分散燐の試料（ＤＭＳＯ中４×１０-12 Ｍ）を３５０ｎ
ｍにて励起源につき１６ｎｍバンド幅で１．３ｍＷの単
色光により励起させて行った。検出は、この試料を３５
０〜８００ｎｍにて８ｎｍのモノクロメータバンド幅で
走査することにより行った。走査は２ｎｍの増し分で行
った。ダウンコンバーションは観察されなかった。さら
に、タンケ等（米国特許第５，０４３，２６５号）に引
用された励起波長でもダウンコンバーションは見られな
かった。すなわち、試験したアップコンバート性燐はタ
ンケ等に報告されたものとは異なる。均質分析 アップコンバート性燐に特徴的なマルチフォトン活性化
法を開発して、試料洗浄工程を必要としない分析を行う
ことができる。未結合の燐ラベルを試料から除去する必
要がないこの種の診断分析をここでは均質分析と称し、
プソイド均質分析と称することもできる。
【０１２０】均質分析例１ 均質分析の１実施例は、適するプローブ（たとえば抗体
もしくはＤＮＡ）に結合したアップコンバート性燐ラベ
ルを使用する。燐標識されたプローブは、捕獲表面に結
合する標的（たとえば抗原もしくは核酸）に対し特異的
に結合する。適する捕獲表面は光伝導性光学繊維の先端
（第２３図）または試料容器の底部表面（第２４図）と
することができる。標的標識された捕獲表面を燐標識プ
ローブと共に培養すると、燐粒子は捕獲表面上に存在す
る標的の量に応じて捕獲表面に蓄積する。標的は捕獲表
面に直接に結合することができ、或いはそれ自身で捕獲
表面に結合する結合剤（たとえば標的に対し反応性の特
異的抗体、標的を結合するポリヌクレオチドなど）との
相互作用により固定化することもできる。捕獲表面に結
合した燐の検出は、大断面の低強度ビームから小断面の
高強度ビームまで、捕獲表面に存在する或いはそれに極
めて近いビームの焦点で集束する励起光を用いて行われ
る。励起光の集束は、極めて小さい焦点距離を有する光
学部材に対する伝送によって行われ、ビームが捕獲表面
の短距離内で発散して強度が低くなる。
【０１２１】アップコンバート性燐ラベルから放出され
る光の強度は２乗もしくはそれ以上まで上昇する励起光
強度に比例するので、励起源の焦点近くの燐は、捕獲表
面から離れた試料における懸濁状態に保たれる燐よりも
顕著に多い光を発光する。したがって、アップコンバー
ト性燐結合プローブと捕獲表面との結合は、全体として
試料から測定される或いは燐が捕獲表面に結合しない比
較試料から測定される発光光強度の増加をもたらす。発
光光強度は、所定の標的濃度を有する一連の試料を基準
化（検量）につき用いて、標的濃度の関数としてプロッ
トすることができる。試験試料（未知濃度の標的）から
の発光光強度を標準曲線と比較して、標的の濃度を測定
することができる。適する均質分析形式の例は限定はし
ないが免疫診断サンドイッチ分析、並びに抗原および／
または抗体表面競合分析を包含する。
【０１２２】均質分析例２ 他の実施例は、遠心分離もしくは重力沈降を用いて検出
表面におけるアップコンバート性燐結合プローブの蓄積
を可能にする。この実施例において、アップコンバート
性燐は複数プローブに結合する。全てのプローブは同じ
標的に結合せねばならないが、この結合は異なる位置で
得ることができる（たとえば抗体プローブは単一抗原に
おける種々異なるエピトープを標的とすることができ
る）。次いでマルチプローブ燐を用いて、試料における
溶液もしくは懸濁物の標的の凝集を行うことができる。
この凝集は、溶液もしくは懸濁物から沈殿する大きい不
溶性燐−プローブ−標的複合体の形成をもたらす。燐を
含有する凝集複合体は検出表面に蓄積する一方、非凝集
物質は溶液もしくは懸濁物に残留する。検出は、急激に
収束する励起ビームを用いて上記例に記載したように行
われる。
【０１２３】以上、明瞭に理解する目的で実施例により
本発明を詳細に説明したが、本発明の範囲内において多
くの改変をなしうることが当業者には了解されよう。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明により試料につき診断を行うための代
表的装置を示す光学および電子ブロック図。
【図２Ａ】 単一チャンネルに関連して位相敏感検波を
行う装置を示す。
【図２Ｂ】 波形発生器からの信号により第１および第
２レーザーダイオードを変調する装置を示す。
【図３】 ゲート検出を行う装置を示す。
【図４】 それぞれλ1 およびλ2 に集中すると共にλ
3 の近くに重なる発光バンドを有する第１および第２レ
ポータ励起バンドを用いて試料につき診断を行う装置を
示す。
【図５】 図５Ａ、ＢおよびＣはマルチフォトン励起方
式におけるエネルギー状態の転移を図示する。
【図６】 手持プローブを用いる小型化装置を示す。
【図７】 図７Ａは多数の結合部位からの放出を検出す
べく使用する電荷結合装置（ＣＣＤ）列の使用を示し、
図７Ｂはレンズ列と組合せて使用するＣＣＤ列を示す。
【図８】 光学的捕獲を用いる実施例を示す。
【図９】 アップコンバート性燐粒子の染料被覆および
包封を図示する。
【図１０】 標的の粒子速度および水力学もしくは空気
力学特性を決定する装置を示す。
【図１１】 ９７７．２ｎｍの波長最大および約５４
１．０ｎｍにおける発光最大の励起レーザー源によるナ
トリウムイットリウムフルオライド−イッテルビウム／
エルビウムアップコンバート性燐の燐発光スペクトルで
ある。
【図１２】 ５４１．０ｎｍに設定された発光収集ウイ
ンドーによるナトリウムイットリウムフルオライド−イ
ッテルビウム／エルビウム燐励起スペクトルの励起走査
である。
【図１３】 ナトリウムイットリウムフルオライド−イ
ッテルビウム／エルビウムに関する励起照明を終了した
後の５４１．０ｎｍにおける燐ルミネセントの時間減衰
測定である。
【図１４】 ナトリウムイットリウムフルオライド−イ
ッテルビウム／エルビウム燐に関する励起照明強度の関
数としての燐発光強度を示す。
【図１５】 ９７０ｎｍにて２００Ｗ／ｃｍ2 で励起し
た後におけるＮａ（Ｙ0.8 Ｙｂ0.12Ｅｒ0.08）Ｆ4 の
０．３μｍ粒子に関する有効な単一フォトン燐光断面を
示す。
【図１６】 Ｎａ（Ｙ0.8 Ｙｂ0.12Ｅｒ0.08）Ｆ4 粒子
に関する燐光断面の寸法依存性を示す。
【図１７Ａ】 ９７０ｎｍレーザー源での励起により誘
起されたＨｅｐｅｓ緩衝塩水におけるアップコンバート
性燐レポータの蛍光走査を示す。
【図１７Ｂ】 ９７０ｎｍレーザー源での励起により誘
起されたＨｅｐｅｓ緩衝塩水におけるストレプトアビジ
ン被覆されたアップコンバート性燐レポータの蛍光スペ
クトル走査を示す。
【図１８Ａ】 ５４１ｎｍにおける発光の単色検出によ
るＨｅｐｅｓ緩衝塩水におけるアップコンバート性燐レ
ポータの励起スペクトル走査を示す。
【図１８Ｂ】 ５４１ｎｍにおける発光の単色検出によ
るＨｅｐｅｓ緩衝塩水におけるストレプトアビジン被覆
されたアップコンバート性燐レポータの励起スペクトル
走査を示す。
【図１９】 燐濃度とアップコンバート信号との関係を
示す（Ｙ0.86Ｙｂ0. 08Ｅｒ0.06）2 Ｏ2 Ｓの試料から得
られた積分信号を示す。
【図２０】 アナライト（たとえば抗原標的）をビオチ
ニル化抗体および固定化抗体に結合させ、アナライトが
固体基質超常磁性マイクロビーズに固定化されたサンド
イッチ複合体を形成することによる、溶液中のアナライ
トを検出するためのサンドイッチ免疫分析の１実施例を
図示する。
【図２１】 異なる燐光特性を有する２種の燐で標識さ
れた特異的抗体による２種の細胞表面抗原の検出および
識別を図示する。
【図２２】 位相敏感検波のための装置を図示する。
【図２３】 ラベルとして燐を用いると共に捕獲表面に
おける光学繊維照射を用いる競合均一分析を図示する。
【図２４】 ラベルとして燐を用いると共に捕獲表面に
集中した収束照射ビームを用いる競合均一抗原捕獲分析
を図示する。
【図２５】 ラベルとして燐を用いると共に捕獲表面に
集中した収束照射ビームを用い捕獲表面が免疫沈殿物を
集める均質免疫沈殿分析を図示する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ロッシ，ミシェル・ジェイ スイス国エクレパン州シーエイチ1312、 ラ・グラヴェイル ２ (72)発明者 ペッパーズ，ノーマン・エー アメリカ合衆国カリフォルニア州94002 ベルモント、ヒルクレスト・ドライヴ 3619 (72)発明者 ケーン，ジェームズ アメリカ合衆国ニュージャージー州08648 ローレンスヴィル、ロイヤル・オーク・ ロード 32 (72)発明者 ファリス，グレゴリー・ダブリュー アメリカ合衆国カリフォルニア州94025 メンロ・パーク、フーヴァー・ストリート 1259 (72)発明者 ダイヤー，マーク・ジェー アメリカ合衆国カリフォルニア州95123 サン・ホゼ、ブラックフット・コート 705 Ｆターム(参考） 2G043 AA03 BA16 DA02 EA01 FA03 FA06 GA01 GB01 HA01 HA02 HA05 JA02 JA03 JA04 KA01 KA02 KA05 KA08 KA09 LA02 LA03 MA01 NA04 2G045 CB01 CB21 DA12 DA13 DA14 DA30 DA36 FA12 FA25 FA26 FB02 FB03 FB07 FB12 FB13 GC15 JA07

Claims (19)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 第１範囲の波長における励起バンドと第
    １範囲における波長よりも短い第２範囲の波長における
    発光バンドとを特徴とするアップコンバート性ルミネセ
    ントレポータを有しうる試料における診断を実施する装
    置において：レポータを励起バンドの少なくとも１部と
    重なる範囲の波長にて発光しうる発生源と；前記発生源
    を付勢する手段と；レポータの発光バンドの少なくとも
    １部と重なる範囲の波長にて光を検出しうる検出器と；
    前記発生源により発光された光の少なくとも１部（第１
    範囲の波長における光を含むと共に第２範囲の波長にお
    ける光を排除する）を試料の箇所に指向させる第１手段
    と；試料の前記箇所から発散する第２範囲の波長におけ
    る光を含む光の少なくとも１部を前記検出器に指向させ
    る第２手段と；第２範囲における波長を含むと共に第１
    範囲における波長を排除する範囲の波長にて前記検出器
    に入射する光の強度を示す電気信号を発生する前記検出
    器に連結させた手段とを備えることを特徴とする試料に
    おける診断の実施装置。
  2. 【請求項２】 前記検出器が第１および第２範囲におけ
    る光に応答し；前記第２指向手段が波長選択部材を備
    え；第２範囲における波長を有する光のみが前記検出器
    に到達する請求項１に記載の装置。
  3. 【請求項３】 励起バンドが近赤外にあり、発光バンド
    が可視範囲にある請求項１に記載の装置。
  4. 【請求項４】 前記第１および第２の指向手段が共通の
    部材を持たない請求項１に記載の装置。
  5. 【請求項５】 前記第１および第２の指向手段が共通の
    少なくとも１個の部材を有する請求項１に記載の装置。
  6. 【請求項６】 試料が第３範囲の波長における励起バン
    ドと第４範囲の波長における発光バンドとを特徴とする
    第２レポータを必要に応じさらに含み、第１および第３
    範囲が重ならず、第２および第４範囲が重ならず：さら
    に第２レポータの励起バンドの少なくとも１部と重なる
    範囲の波長にて発光しうる第２発生源と；前記第２発生
    源を付勢する手段と；第２レポータの発光バンドの少な
    くとも１部と重なる範囲の波長における光を検出しうる
    第２検出器と；前記第２発生源により発生した光の少な
    くとも１部（第３範囲の波長における光を含むと共に第
    ４範囲の波長における光を排除する）を試料における箇
    所に指向させる第３手段と；前記箇所から発散した光の
    少なくとも１部を第４範囲の波長における光を含め前記
    検出器まで指向させる第４手段と；第４範囲における波
    長を含むと共に第１、第２および第３範囲における波長
    を排除する範囲の波長にて前記第２検出器に入射する光
    の強度を示す電気信号を発生させるための前記第２検出
    器に連結した追加手段とを備える請求項１に記載の装
    置。
  7. 【請求項７】 前記第２および第４指向手段が少なくと
    も１個の波長選択部材を備え；第２範囲における波長を
    有する光のみが前記最初に挙げた検出器に到達し；第４
    範囲における波長を有する光のみが前記第２検出器に到
    達する請求項６に記載の装置。
  8. 【請求項８】 試料が第３範囲の波長における励起バン
    ドと第４範囲の波長における発光バンドとを特徴とする
    第２レポータを必要に応じさらに含み、第１および第３
    範囲が重なると共に第２および第４範囲が重ならず；さ
    らに第２レポータの発光バンドの少なくとも１部と重な
    る範囲の波長における光を検出しうる第２検出器と；試
    料における前記箇所から発散する光の少なくとも１部を
    第４範囲の波長における光を含め検出器まで指向させる
    第３手段と；第４範囲における波長を含むと共に第１、
    第２および第３範囲における波長を排除する範囲の波長
    にて前記第２検出器に入射する光の強度を示す電気信号
    を発生させるための前記第２検出器に連結した追加手段
    とを備えることを特徴とする請求項１に記載の装置。
  9. 【請求項９】 発光しうる前記発生源が励起照明の共焦
    ビームを発生する請求項１に記載の装置。
  10. 【請求項１０】 第１および第２のアップコンバート性
    ルミネセントレポータを有し、第１レポータが第１範囲
    の波長における励起バンドと第１範囲における波長より
    も短い第２範囲の波長における発光バンドとを特徴と
    し、第２レポータが第３範囲の波長における励起バンド
    と第４範囲の波長における発光バンドとを特徴とし、第
    １および第３範囲が重ならず、第２および第４範囲が重
    なる試料における診断の実施装置において：第１レポー
    タの励起バンドの少なくとも１部と重なる範囲の波長に
    て発光しうる第１発生源と；第２レポータの励起バンド
    の少なくとも１部と重なる範囲の波長にて発光しうる第
    ２発生源と；前記第１に挙げた発生源および第２発生源
    に対し異なる強度パターンを与える手段を含め前記第１
    および第２発生源を付勢する手段と；前記第１および第
    ２発生源により発光された光の少なくとも１部（第１お
    よび第３範囲の波長における光を含むと共に第２および
    第４範囲の波長における光を排除する）を試料における
    箇所まで指向させる手段と；第２および第４範囲内であ
    るが第１および第３範囲外における波長にて前記検出器
    に入射する光の各強度を示す第１および第２電気信号を
    発生させるため、前記異なる強度パターンを識別する手
    段を包含する、前記検出器と連結した手段とを備える試
    料における診断の実施装置。
  11. 【請求項１１】 異なる強度パターンを与える前記手段
    が：前記第１発生源に連結されて第１周波数における強
    度を変調する第１波形発生器と；前記第２発生源に連結
    されて前記第１周波数とは異なる第２周波数における強
    度を変調する第２波形発生器とを備える請求項１０に記
    載の装置。
  12. 【請求項１２】 前記識別手段が：前記第１波形発生器
    に連結された第１入力ターミナルと前記検出器に連結さ
    れた第２入力ターミナルとを有する第１周波数ミキサ
    と；前記第２波形発生器に連結された第１入力ターミナ
    ルと前記検出器に連結された第２入力ターミナルとを有
    する第２周波数ミキサとを備える請求項１１に記載の装
    置。
  13. 【請求項１３】 異なる強度パターンを与える前記手段
    が：第１時間間隔に際し前記第１発生源を付勢すると共
    に、前記第１時間間隔と重ならない第２時間間隔にて前
    記第２発生源を付勢するパルス発生器を備える請求項１
    ０に記載の装置。
  14. 【請求項１４】 前記識別手段が：前記パルス発生器お
    よび前記検出器に連結されて、前記第１および第２時間
    間隔につき別々の出力信号を発生するよう作動しうるゲ
    ート積算器を備える請求項１３に記載の装置。
  15. 【請求項１５】 第１範囲の波長における励起バンドと
    第１範囲における波長よりも短い第２範囲の波長におけ
    る発光バンドとを特徴とするアップコンバート性ルミネ
    セントレポータを含む試料における診断の実施方法にお
    いて：レポータの励起バンド内にある範囲の波長にて発
    光しうる発生源を設け；レポータの発光バンド内にある
    波長にて光を検出しうる検出器を設け；前記発生源によ
    り発光された光を試料における箇所に指向させ；試料に
    おける前記箇所から発散する光を検出器に指向させ；第
    ２範囲における波長を含むと共に第１範囲における波長
    を排除する範囲の波長にて光の強度を示す電気信号を発
    生させることを特徴とする試料における診断の実施方
    法。
  16. 【請求項１６】 励起バンドが近赤外にあり、発光バン
    ドが可視範囲にある請求項１５に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 無機アップコンバート性燐に付着した
    少なくとも１種の蛍光性有機染料分子を含む組成物。
  18. 【請求項１８】 蛍光性有機染料分子がローダミン、シ
    アニン、キサンテン、アクリジン、オキサジン、ポルフ
    ィリンおよびフタロシアニンよりなる群から選択される
    請求項１７に記載の組成物。
  19. 【請求項１９】 スペクトルの赤外、近赤外もしくはウ
    ルトラレッド部分における励起波長で照明した際に光触
    媒細胞毒性を発生させることによる光力学療法のため組
    成物を患者に投与する請求項１７に記載の組成物。
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