JP4678516B2 - 材料の分離、反応、および顕微鏡分析のための基板 - Google Patents
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Description
試料、この場合にはDNAを含有している、は、電気泳動によってゲル媒体上で分離され、水酸化ナトリウムによる処理によって変性される。
該ゲル上に微孔性ニトロセルロース膜が置かれる。
該膜上に吸取り紙が置かれてゲルから水が吸収され、表面に重りがかけられる。重りは、ゲルが膜の下でつぶれる時、水および分離された分子を微孔性膜内へ追込む。このことは、分離された生体分子より構成される膜上に画像を残す。
帯域からのDNAは、非特異的に微孔性ニトロセルロース膜へ結合される。
ニトロセルロース膜は洗浄され、拡散法によりブロックされる。
検定を行なうためには、ニトロセルロース膜は次に既知の標識されたDNAの溶液とインキュベートされる。
もし添加されたDNAが、電気泳動的分離から固定化されたDNAの帯域に対して正確に適合すれば、標識されたDNAは結合し、帯域は標識されるであろう。
連続的な洗浄の後、もし放射能標識が使用されたのであれば、X線フィルムを用いて標識された帯域の視像が次に作成され、したがって帯域が同定される。
マイクロアレイ作成のための、固体または微孔性表面上での生物学的流体のスポットの付着の実施を特に参照すれば、このことは広く記述されている。たとえばニトロセルロースの多孔性膜を載せているスライドガラス、たとえば厚さ12〜15ミクロンのものを用いた場合、製造業者シュライカー&シュール(Schleicher & Schuell)は、50nl以上もの懸濁液を用いた生物学的液体の各スポットの作成を推奨してきた。
蛍光標識された生物材料の固定およびイメージングのため、新規の別のアプローチが提示される。それは、生物学的結合特性をもつ高分子、たとえばニトロセルロースからなる基板の連続した超薄層を用いる。この技術は、タンパク質固定高分子基板を用いることにより、蛍光標識されたタンパク質のイメージングを可能にするために有効である。この技術は、発光標識物で標識されたタンパク質を用いた、および蛍光あるいは発光標識物で標識された他の生体材料を用いるといった、他の潜在性の広範囲の用途をもつ。この技術は、ウイルス、ペプチド、抗体、受容体、および他のタンパク質に対して;植物、動物、ヒト、真菌、および細菌の細胞を含めた広範囲の他の標識された生物材料に対して;他の物質よりも問題の少ない、非常に実用的な基板としての核酸、たとえばcDNAクローン用の、DNAプローブ、合成オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド、およびポリメラーゼ連鎖反応(PCR)産物に対し;およびまた標識された化学物質に対して、有利に使用されてよい。それは、たとえばGAPのような(GAPは、高い反応性の故に、コンタミネーションを避けるため、費用および時間のかかる防止策を必要とする)先の物質を超えて、低コストの実用的な基板であるという魅力的な可能性をもっている。
(a)ペイントされた/カバーされた領域は、スライドの外縁をたどる1〜3mm(および好ましくは2mm)幅の枠の付加を用いるかまたは用いずに、艶消し区域の上に適用される。艶消し区域の上のペイントされた領域は、後に、識別およびシリーズ化か、または他の所望のマーキングを用いて、レーザーマークされてもよい。使用されたプロセスは、シリーズ化されていないマーキングでもよい。
(b)艶消しされた表面側のスライド全体に、蒸着またはスパッターコーティングによってコーティングが適用され、たとえば、635nmの通常のレーザー波長に関して10%と90%の間の範囲にある不透明度を提供する目的で、タンタニウムに続く空気酸化により、酸化タンタルの薄層を形成する。艶消し区域の上のコートされた領域は、後に、識別およびシリーズ化か、またはシリーズ化されないマーキングを含む他のマーキングを用いてレーザーマークされるのに適している。スポットされるべき領域はまた、たとえば、個々のアレイを取囲んでいる酸化タンタルの、円形または四角形のモートを除去することにより、亜領域(または島)に分割されてもよい。このよう分離された領域は、実験の間にモートの外側に接着性のガスケットが適用される場合、スポットされたアレイを離層から保護するために役立つかもしれない。
別の方式においては、レーザーマーキングおよびセグメンテーションは、コーティングに続いて行なわれてよい。
好ましくは、レーザーは、除去されるべきコーティングによって吸収され、かつ支持体、ガラス、またはその他の材料によって吸収されない波長を用いて使用されるであろう。
処理されるべき表面を、標準的な2.5cmの丸形ヘッドのラボラトリー・コロナ処理機によるジェットに対し垂直に、およそ1と4cmの間暴露しながら、スライドを2と8cm/分の間(好ましくは4.3cm/分)の速度で、平行移動させることにより誘導される。ラボラトリー・コロナ処理機(エレクトロ・テクニック・プロダクツ社、イリノイ州、シカゴ、からのモデルBD−20AC)は、その最適レベルの付近で作動されるべきある。好ましくは、環境の圧力、温度、および湿度は、先に記述したように、ヒトの快感帯域の範囲内に保持される。
生体材料がそれに結合される、基板からの低い蛍光ノイズの問題を超えて、生体分子を分離し、結合し、反応させるための、また、さらに一般的には、小さい試料についての光学分析の高い精度のため、および生物学的組織において稀な事象を検出するための、基板およびそれらの支持体についての新規な概念もまた本明細書に提示されている。
・顕微鏡スライドの形状の支持体、典型的には約25×75mmの幅および長さの、厚さ1mmの平面。
・バイオカセットの形状にある支持体、たとえば様々な共通構造のもの
・CDディスクの形状に近い支持体
・マルチウェルプレートのウェル
・反応チューブ
を含めた生物学的反応を支持するための新規な装置において、有利に取込まれる。
を含む工程を行う。
Claims (20)
- 生物学的固定特性を有する高分子基板層を備え、生物材料を固定し、当該固定化された材料に関連した蛍光色素標識からの光学的に誘導された蛍光発光の定量分析を画像機器124によって可能とする装置であって、前記基板層が硬質支持体12上に設けられ、前記生物材料を受容するように晒された外側の付着物受容領域を有し、前記基板層20、20′、20″は5ミクロン未満の厚さtutを有するニトロセルロース又はポリスチレンを含み、前記外側の付着物受容表面は、前記生物材料の固定を増大するために表面処理された状態にあり、前記硬質支持体は、当該硬質支持体からのバックグランド蛍光または発光の前記画像機器124における光学的混乱または汚染作用を阻止するために十分な厚さの接着性光吸収材料を有する、装置。
- 形成された前記基板層は、0.1〜0.5ミクロンの厚さを有する実質的に透明な固形薄膜である、請求項1に記載の装置。
- 生物学的固定特性を有する高分子基板層を備え、生物材料を固定し、当該固定化された材料に関連した蛍光色素標識からの光学的に誘導された蛍光発光の定量分析を画像機器124によって可能とする装置であって、前記基板層が硬質支持体12上に設けられ、前記生物材料を受容するように晒された外側の付着物受容領域を有し、前記基板層20′、20″は5ミクロン未満の厚さtutを有するニトロセルロース又はポリスチレンを含み、形成された前記基板層は、実質的に透明な固形膜であり、前記硬質支持体は、当該硬質支持体からのバックグランド蛍光または発光の前記画像機器124における光学的混乱または汚染作用を阻止するために十分な厚さの接着性光吸収材料を有する、装置。
- 前記基板層は、検定の実施の用に供する生物材料の付着物Sのアレイを有する、請求項1ないし3のうち何れか一項に記載の装置。
- 前記基板層はニトロセルロースであり、前記生物材料はタンパク質である、請求項1ないし4のうち何れか一項に記載の装置。
- 前記硬質支持体12は、まっすぐな支持体表面を画定し、前記基板層20、20′、20″は、直接的又は間接的に、硬質支持体に対して、引き抜くことにより膜が適用される、請求項1ないし5のうち何れか一項に記載の装置。
- 前記基板層20、20′、20″の外側の付着物受容領域は、その上に生物材料の付着物の接着を増大するために、コロナ処理機122又はガンマ線に晒すことにより提供されるようなエネルギー表面改質処理により表面処理された状態にある、請求項1ないし6のうち何れか一項に記載の装置。
- 少なくとも一つの介在層14、14′、112が、前記硬質支持体12と前記高分子基板層20、20′、20″との間にあり、前記介在層は、その反対方向の各々の面上で前記装置の材料と接着して結合し、前記介在層14、14′112の反対側面上に直接隣接する材料は、各々、前記介在層に対する程には互いに接着適合性がなく、前記介在層は、光吸収材料を提供する、請求項1ないし7のうち何れか一項に記載の装置。
- 前記介在層14、14′、112は、機能的に不透明な厚さの酸化タンタルである、請求項8に記載の装置。
- 前記基板層は、1ミクロン未満の厚さを有する、請求項1ないし3のうち何れか一項に記載の装置。
- 前記基板層は、0.1ミクロンと0.5ミクロンとの間のtuts厚さの実質的に固形の実質的に透明な膜である、請求項3に記載の装置。
- バイオカセット、CDディスク又はマルチウェルプレートの底の形状である、請求項1ないし11のうち何れか一項に記載の装置。
- カセットの前記基板層は、その上に、タンパク質スポット422のアレイを予めスポットしている、バイオカセット(4)の形態の請求項12に記載の装置。
- 前記基板層20、20′、20″は、生体材料420の付着物を受容し、かつ、エラストマーガスケット430により付着物に隣接した物体によって一時的に係合するように構成され、前記基板層は、除去された前記物体に対する前記基板の接着がアレイを破壊しないように分断され、前記基板層の下の介在性接着促進層14′は、そこに適用された基板層20″が金属酸化物の接着促進介在層14′のパターンにおけるギャップによって形成されたモートによって破壊されるように分断された、請求項1ないし12のうち何れか一項に記載の装置。
- 基板層のための高分子を含有している流体コーティング溶液を、基板層を形成する条件下で、コーティング組成物の浴から前記固体支持体を引抜くことによって硬質支持体に直接的又は間接的に適用することを含む、請求項1ないし14のうち何れか一項に記載の装置を形成するための方法。
- 前記基板層の適用の前に、機能的に不透明な酸化タンタル層を形成する条件下でタンタルを適用してタンタルを酸化させることによって前記硬質支持体に直接的又は間接的に接着促進層を適用することを含む、請求項15に記載の方法。
- 前記基板層として、実質的に透明固形のニトロセルロース又はポリスチレンフィルム膜を製造するための形成条件を維持することを含む、請求項15ないし16のうち何れか一項に記載の方法。
- コロナ放電又はガンマ線に晒すことにより膜にエネルギー表面改質条件を享受させることによって前記基板層の膜を後処理して前記基板層の表面を改質し、前記基板層上への生物材料の接着を増大させることを含む、請求項15ないし17のうち何れか一項に記載の方法。
- 検定を実行する方法であり、請求項1ないし18のうち何れか一項に記載の装置を提供し、基板に生物材料のスポットアレイを適用し、少なくともいくつかのスポットを蛍光標識を用いて標識する検定を行い、前記アレイを洗浄した後、蛍光の光学的検出によりアレイを読取ることを含み、前記検定は、タンパク質−タンパク質相互作用に基づく、又は核酸若しくは他の遺伝物質を含む、あるいはウイルス、ペプチド、抗体、受容体、cDNAクローン、DNAプローブ、合成オリゴヌクレオチドを含めたオリゴヌクレオチド、又はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)産物を含むアレイを含む、あるいは前記アレイは、植物、動物、ヒト、真菌、細菌細胞、悪性細胞又は生検組織由来の細胞を含有することを含む、方法。
- 前記読取りは、CCDセンサーにより実行される、請求項19に記載の方法。
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