JP2001502053A

JP2001502053A - 膜における分析物の光学的定量

Info

Publication number: JP2001502053A
Application number: JP10517038A
Authority: JP
Inventors: ブルックス，ドナルド，エリオット
Original assignee: ユニバーシティーオブブリティッシュコロンビア
Priority date: 1996-10-10
Filing date: 1997-10-09
Publication date: 2001-02-13
Also published as: WO1998015831A1; CA2267126A1; ZA978922B; AU723534B2; EP0937255A1; US6165798A; TW412637B; AU4546997A

Abstract

(57)【要約】膜に清澄剤を適用する工程を含む、膜における分析物の量を測定する方法が開示される。清澄剤は、膜とほぼ同じ屈折率を有する薬品であることができ、あるいは、清澄剤は、膜を溶解する溶解剤であることができる。分析物は、検出を容易にするように標識することができる。代表的な標識には、蛍光標識および検出可能粒子が含まれる。

Description

【発明の詳細な説明】膜における分析物の光学的定量関連出願本出願は、米国出願第０８／７２７，９９８号明細書の一部継続出願であり、その全体の教示は、参照により本明細書に取り込まれる。発明の背景液体試料、特に体液試料中の細胞と分析物の定量分析は、医者と患者にとって重要な診断情報および治療情報を提供することが多い。抗原−抗体反応の高い特異性を利用する免疫学的試験法（ケネディー（Kennedy，D．M.）とシャラコンベ（S．J．Challacombe）編、ＥＬＩＳＡと他の固相免疫アッセイ：理論的および実践的側面、John Wiley and Sons，Chichester(1988)）は、分析物の測定に対して１つのアプローチを提供する。試料中の分析物の量の定量的測定を提供する免疫アッセイは、複雑な多段階手法および研究室での設定にしか利用できない高価な分析計を用いることが多い。英国特許出願第２，２０４，３９８号明細書；米国特許第５，０９６，８３７号明細書、第５，２３８，６５２号明細書および第５，２６６，４９７号明細書；バーンバウム（Birnbaum，S.）ら、Analytical Biochem．206:168-171(1992);ロバーツ(Roberts，M．A.)とダースト(R．A．Dur st)、Analytical Chem．67:482-491(1995);およびクリモフ(Klimov，A．D.)ら、 Clinical Chem．41:1360(1995)に記載のもの等の免疫クロマトグラフィーアッセイは、比較的単純である。免疫クロマトグラフィーアッセイは、その解釈について、膜の特定の領域で、通常は着色粒子である着色反応産物の観察を拠り所にする。免疫クロマトグラフィーアッセイで検出される分析物の量の定量的基準を得るためには、着色粒子の量を分析する。膜の１以上の領域に蓄積する粒子の量の光学的手段による測定は、通常、反射光測定または光学濃度測定により行われる。これらの技術においては、光線が反射されるかまたは膜の着色部分を透過して検出器に到達した光の強度を測定する。他の方法としては、ビデオカメラを用いて透過光または反射光で解明された膜のイメージを得る方法、およびビデオレコードのフレームでイメージ解析を行う方法が挙げられる。粒子の検出において、イメージ分析ソフトウエアがイメージの考慮すべき操作の感度を最適化させるけれども、これらの方法は、粒子が包埋されている膜の繊維により光の散乱を被る。得られた多方向散乱は、粒子により生成する光のシグナルをおおい隠し、測定のノイズレベルを劇的に増加させる。発明の要約本発明は、膜を清澄剤によって透過性にして、分析物の量を光学手段を用いて測定する、膜における分析物の量の定量方法に関する。膜を作製した物質の屈折率とほぼ等しい屈折率（ｎ_D）を有する清澄剤で膜を湿らせることにより、該膜を透過性にさせうる。例えば、ニトロセルロース膜は、ポリビニルピロリドン、ポリエチレンイミンまたはベンジルアルコールで透明にすることができる。あるいは、透明なバックグランドを形成するために膜を溶解させる溶解剤を膜に適用することにより、膜を透過性にする。例えば、ニトロセルロース膜は、溶解剤としてポリエチレングリコールを用いて透明にすることができる。膜における分析物の量は、蛍光または散乱光を測定するセンサー等の光学センサーを用いて測定される。分析物は、分析物の定量を容易にするために、蛍光標識または無機粒子、有機分子、リポソームもしくは有機ポリマーラテックス粒子等の検出可能な粒子で標識することができる。膜を透過性にすることは、膜繊維による光散乱を排除または最小にし、それによって測定におけるバックグランドの干渉により生ずるノイズレベルを減少させることにより、分析物の検出を容易にし、粒子の定量の精度と感度を高める。該方法は、単純かつ迅速であり、様々な種類の分析物と膜に使用することができる。図面の簡単な説明図１は、透明および不透明ニトロセルロース膜における様々な濃度のラテックス粒子に対する相対シグナル強度を示すグラフである。発明の詳細な説明本発明は、膜における分析物の光学的検出方法および定量方法に関する。本明細書に記載されるように、散乱光または蛍光手段による膜における分析物の定量の精度と感度は、膜を透過性にすることにより高められる。本明細書に用いられる「分析物」という用語は、量を定量する目的の分子、化合物、粒子、細胞断片、細胞または生物学的実在物をいう。分析物の例には、ホルモンまたは酵素等の蛋白質；糖蛋白質；ペプチド；小分子；多糖類；抗体；核酸；乱用薬物を含む薬物；毒素；コロイド金粒子等の無機粒子；ウイルスまたはウイルス粒子；細菌：細胞全体；細菌もしくは細胞の一部；およびその他の化合物が含まれる。１を越える分析物を定量することができる。また、あるいは追加して、対照の分析物を定量することができる。本発明の方法を実施するために、定量対象の分析物が（存在するとすれば）そこに含まれる目的の膜が提供される。該膜は、透過性にされる能力を有する物質から作られている。該膜は、半透明（即ち、散乱光を通過させることが可能である）または不透明（即ち、光を通過させることができない）であってもよい。膜物質の例には、セルロース、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ガラス繊維、ナイロン、多電解質イオン交換膜、アクリルコポリマー／ナイロンおよびポリエーテルスルホンが含まれる。好ましい態様において、膜は、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ガラス繊維またはナイロンで作られている。膜は、１を越える物質で構成することが可能であり、例えば、Ｍｙｌａｒ^TMで裏打ちされたニトロセルロースで構成されていてもよい。膜が１を越える物質で作られている場合、各物質は、透過性であるかまたは透過性にされることが可能であるかのいずれかであるべきである。膜「中」または膜「に保持された」分析物は、膜の表面上に存在する分析物および膜の物質内の分析物を含む。分析物は、膜に（例えば、膜繊維に）接着することにより膜に保持されうる。あるいは、分析物は、膜の孔内または隙間内に捕捉されうる。また、分析物は、液体中の分析物を膜に適用させ、次いで、膜を乾燥させることによっても膜に保持されうる。別の態様において、分析物は、膜に固定された分析物結合剤に分析物を結合させることにより膜に保持される。分析物が分析物結合剤に物理的もしくは化学的に付着、接着または会合している場合に、分析物は、分析物結合剤に「結合」している。分析物結合剤には、分析物特異的抗体、分析物に特異的に結合するレセプター、遺伝子工学的技術で作製された結合試薬、細菌もしくはウイルス接着、アプティマー、キレーター、コンビナトリアルケミストリーにより作製された結合試薬または分析物に結合する他の分子が含まれる。例えば、分析物を、分析物と膜に固定された抗体との相互作用により膜に結合させることができる。本明細書で用いられる「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方ならびに目的のエピトープと反応する１を越える抗体の混合物（例えば、該ペプチドと反応する異なる種類のモノクローナル抗体のカクテル）を含むものである。さらに、抗体という用語は、抗体全体および／またはその生物学的機能断片、１を越える種由来の部分を含有するキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト様抗体、表面抗体および二官能性抗体を含むことが意図されている。用いられうる生物学的機能抗体断片は、抗体断片が目的分析物に結合するのに十分な断片である。分析物は、検出を容易にするために標識することができる。かかる標識の例には、発光標識；燐光標識；色素等の比色標識または蛍光標識が含まれる。代表的な蛍光標識には、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、テトラメチルローダミンイソチオシアニエート（ＴＲＩＴＣ）、テキサスレッド、フィコエリスリンまたは他の蛍光色素が含まれる。分析物は、蛍光色素を分析物に付着させること等により直接標識することができる。あるいは、分析物は、レセプター結合分子（アビジン、ストレプトアビジンまたはジゴキシゲニン抗体等）により認識されうるレセプター分子（ビオチン、ジゴキシゲニン等）で分析物を標識すること等により間接的に標識することができる。次には、レセプター結合分子を蛍光標識に付着させる。また、分析物は、分析物に特異的に結合する抗体で標識することも可能である。分析物結合抗体は、蛍光色素にコンジュゲート化することができる。あるいは、二次抗体が分析物結合一次抗体を認識し、かつ、分析物結合一次抗体に特異的である、蛍光色素にコンジュゲート化した二次抗体の使用を介して；または分析物結合一次抗体が、ストレプトアビジン蛍光色素と相互作用するビオチン化二次抗体により認識されるストレプトアビジン−ビオチンコンジュゲートの使用を介して、分析物結合抗体を標識することができる。別の態様において、分析物は、検出可能粒子で標識することができる。本明細書において「検出可能粒子」とは、光学センサーを用いて検出可能な粒子である。「光学センサー」とは、光強度、反射、屈折、偏光、蛍光の寿命または特定波長の光等の光の特性の測定または推定に基づく電磁放射法を検出するセンサーである。具体例は、蛍光強度測定、光散乱強度測定、光学または蛍光顕微鏡からの像の解析、光学濃度測定および反射光測定である。粒子の表面に被覆した分析物特異的抗体に分析物を結合させること等の適当な方法で、分析物を検出可能な粒子に結合させる。検出可能粒子の例には、コロイド金粒子；コロイド硫黄粒子；コロイドセレン粒子；コロイド硫酸バリウム粒子；コロイド硫酸鉄粒子；金属ヨウ化物粒子；銀ハロゲン化物粒子；シリカ粒子；コロイド（含水）金属酸化物粒子；コロイド金属硫化物粒子；コロイドセレン化鉛粒子；コロイドセレン化カドミウム粒子；コロイド金属リン酸化物粒子；コロイド金属フェライト粒子；有機層もしくは無機層で被覆した前記コロイド粒子；蛋白質もしくはペプチド分子；リポソーム；または有機ポリマーラテックス粒子が含まれる。好ましい態様において、該粒子は、ポリスチレンラテックスビースであり、特に、界面活性剤を含有しない超活性な均一のアルデヒド／サルフェートラテックス(Interfacial Dynamics Corp.，Portland，OR)等の界面活性剤の非存在下で調製されたポリスチレンラテックスビーズである。検出可能粒子は、検出を高めるためにさらに標識することができる：例えば、リポソームまたはラテックスビーズを染色したり、蛍光色素を取り込むように作製することができる。分析物用の標識の型は、分析物、膜、用いる検出方法、想定される結果およびその他の因子に依存して変わるだろう。粒子自体が透過性でない場合（即ち、光学センサーを用いて粒子を検出できる場合）、粒子を標識する必要性はない。本発明のアッセイを行うためには、清澄剤を使用する。清澄剤とは、膜を透過性になるようにさせ；分析物を溶解させず、または使用するいかなる標識とも干渉せず；分析物を有意に動かさない薬品である。本明細書において「透過性」という用語は、膜の構成物質により生ずる散乱がほとんどないかまたは全くない状態で、光が膜を通過することを示す。１つの態様において、清澄剤は、膜自体の中にある。例えば、清澄剤は、膜内に取り込まれている固相物質であってもよい。例えば、膜がニトロセルロースである場合、清澄剤は、ポリエチレングリコール、好ましくは分子量１，０００を有するポリエチレングリコールであってもよい。清澄剤は、適当な活性化手段を用いて適当な時期に活性化される。例えば、清澄剤が一定の温度で液化され、液化されたときに膜を透明にする固体の薬品である場合、清澄剤は、清澄剤を含む膜を適当な温度に加熱することにより活性化させることができる。清澄剤が液化したときに膜を透明にする。別の態様において、清澄剤を、分析物の定量のためにアッセイ対象の膜上に適用させる。当業者に公知の標準的技術を用いて、清澄剤を膜に適用する。例えば、清澄剤を被覆し、噴霧し、滴下し、毛管現象で運び、振りかけ、または膜にブロットさせることができる。あるいは、膜を清澄剤に短時間浸漬することができる。好ましい態様において、膜への液体の適用が容易であるという理由により、清澄剤は液体である。１つの態様において、清澄剤は、それが液体である場合、膜とほぼ同じ屈折率を有する薬品である。散乱光の強度は、散乱対象物とそれが浸漬されている媒体との間の屈折率の差の二乗に依存している。したがって、膜とほぼ同じ屈折率を有する薬品は、干渉を排除するであろう。例えば、ニトロセルロースの屈折率は、ｎ_D＝１．５３８である（下付き文字は、屈折率を測定するための通常の波長である、波長が５８９ｎｍであるナトリウムＤ線を示す）。したがって、ニトロセルロース用の清澄剤は、約１．５３０〜１．５４５の屁折率、好ましくは約１．５３５〜１．５４０の屈折率、さらに好ましくは約１．５３８の屈折率を有する。ニトロセルロース用の代表的な清澄剤には、ポリビニルピロリドン（分子量によりｎ_D＝1．５１〜１．５４）；ポリエチレンイミン（ＰＥＩ；分子量によりｎ_D＝１．５２〜１．５３）およびベンジルアルコール（ｎ_D＝１．５３８）が含まれる。好ましい態様において、約７００の分子量を有するＰＥＩを、ニトロセルロース膜用の清澄剤として使用する。その他の清澄剤としては、ガラス繊維膜に関しては水とＰＥＩの混合物が挙げられ、正確な組成はガラスの屈折率（タイプによりｎ_D＝１．４６〜１．５２）に適合したものであるように決定される。清澄剤が膜とほぼ同じ屈折率を有する薬品であり、分析物の検出手段が散乱光である場合、そのときは分析物に使用する標識はいずれも清澄剤と膜の屈折率とは異なる屈折率を有するべきである。異なる標識（蛍光等）を使用する場合、そのときは清澄剤は標識の屈折率とは異なる屈折率を有する必要はない。本発明の第２の態様において、清澄剤は溶解剤である。本明細書で記載される「溶解剤」という用語は、膜を透明な物質に溶解させる薬品である。溶解剤は、溶解剤の適用前または活性化前に膜が保持している位置から分析物を有意に動かすことなく、膜を溶解させるのに十分な粘性がある。例えば、ニトロセルロースは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の低分子量ポリマーにより溶解する。清澄剤として、単一のポリマーまたは異なるポリマーの混合物を使用することができる。膜は、膜を透明にさせるのに十分な条件下で維持される。膜の「透明化」という用語は、膜が透過性になることを示す。また、本明細書に記載される膜の透明化とは、透明な（透過性の）物質に膜を溶解することをいう。例えば、液化したときに膜を透明にする清澄剤が、膜内に存在する薬品であるか膜に適用される場合、清澄剤を液化させるために適当な温度で膜を維持する。別の例において、透明化を進行させるために十分な時間を経過させなければならない。透明化の時間は、薬品の粘度と膜の特性に依存して数秒〜数時間の範囲で変更する。適用または活性化の際に瞬間的に効果的に作用する薬品もあれば、膜を透明にするのに時間を要する薬品もある。膜を透明にした後、光学センサー等の電磁放射を検出する適当なセンサーにより分析物の量を定量することができる。例えば、分析物を蛍光標識で標識した場合、分析物の量は、蛍光強度を測定することにより定量することができる。分析物の量は、蛍光シグナルの強さに基づいて計算することができる。あるいは、分析物が標識なしで検出可能な場合、または分析物が検出可能粒子を用いて標識される場合、分析物の量は、入射光の方向から１以上の角度で散乱光を測定することにより定量することができる。広い範囲の種々の型の膜に使用可能な代表的な光学センサーには、下記のものが含まれる：蛍光測定用の放射波長を選択するためのフィルターまたはその他の手段；光の強度を測定するための単一チャンネルまたはマルチチャンネル光検出器装置；蛍光の励起または反射率の測定のための光源；前方散乱光測定のためのコリメーター光源；および／または濃縮された分析物の透過率測定用散乱光源。光源および／またはフィルターは、所望の測定モードに適するように選択することができる。１を越える型の分析物を同時に定量することができる：例えば、異なる蛍光標識を有する分析物を、各標識の蛍光強度を測定することにより検出することができる。あるいは、１つの分析物を蛍光により定量し、別のものを散乱光の測定により定量することができる。また、対照分析物を用いて定量することができる。本発明の方法は、膜において分析物の高感度な検出と定量を可能にする。該方法は、液体試料中の分析物の量を評価する目的で、ＲａｐｉｄＡｎｔｉｇｅｎＭｅａｓｕｒｅｍｅｎｔＰｌａｔｆｏｒｍ（ＲＡＭＰ^TM）装置を用いる定量的免疫クロマトグラフィーアッセイに特に有用である。かかる定量的免疫クロマトグラフィーアッセイにおいて、ＲＡＭＰ^TM装置を使用する。１つの態様において、該装置は、ニトロセルロース製の膜片を含み、該膜片は、適用点、検出ゾーンおよび適用点と検出ゾーンとの間の接触領域を有する。接触領域において、目的の分析物に対する抗体で被覆されたコロイド金属粒子、有機分子、リポソームまたは有機ポリマーラテックス粒子等の粒子集団が埋め込まれている。目的の分析物に対する抗体または目的の分析物それ自体等の検出試薬が、検出ゾーンに移動する。目的の分析物のアッセイ対象の液体試料を適用点に適用し、装置を、膜片に沿って接触領域に目的の分析物を輸送するための液体の毛細管作用を可能にする条件下に維持し、分析物が接触領域に到達したときに、抗体被覆粒子に結合する。抗体被覆粒子は、液体により移動性をもたらされ、膜に沿って検出ゾーンに毛細管作用により移動する。検出ゾーンにおいて、検出試薬は、抗体被覆粒子と相互作用し、検出ゾーンで分析物結合抗体被覆粒子の停止状態を導く。検出ゾーンの分析物結合抗体被覆粒子の量を定量する。液体試料中の分析物の量は、検出ゾーンの分析物結合抗体被覆粒子の量に基づいて計算することができる。定量免疫クロマトグラフィーアッセイに関するさらに詳細な教示は、１９９６年３月２９日に出願された「定量免疫クロマトグラフィーアッセイ」と題する米国特許出願番号第０８／６２５，０４８号明細書に記載されており、その全体の教示が参照により本明細書に取り込まれる。この定量免疫クロマトグラフィーアッセイの精度と感度は、本明細書に記載された方法により大いに高められる。膜の検出ゾーンにおいて分析物結合抗体被覆粒子が停止した後、清澄剤をＲＡＭＰ^TM装置の膜に適用し、膜の透明化を可能にするのに十分な条件下で装置を維持する。検出ゾーンでの分析物結合抗体被覆粒子の定量は、膜を透明にすることにより約２０倍高められる。以下の実施例により本発明をさらに説明する。実施例１：ニトロセルロース膜に埋め込まれたラテックス粒子の定量分析ＷｉｌｄＡＰＯＺＯＯＭレンズシステムに装着されたＤＶＣ１０ビットデジタルＣＣＤカメラ、ＩｍａｇｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩＣ−ＰＣＩ− ２．０フレームグラッパーおよび１２０ＭＨＺＰｅｎｔｉｕｍＰＣでのＯＰＴＩＭＡＳ５．２イメージ分析ソフトウエアを利用するビデオイメージ分析システムを用いて、透過性Ｍｙｌａｒ^TM裏打ちを有するＳａｒｔｏｒｉｕｓＮＣ５ニトロセルロース膜に埋め込まれたラテックス粒子の集団により生成したシグナルを定量した。濃紺に染色して０．５３μｍの直径を有するラテックス粒子の試料を、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で、約３ｘ１０^-4ｍｇ／ｃｍ²の表面濃度で被覆し、該ニトロセルロース膜の検出ゾーンまで、０．０５Ｍｔｒｉｓ− ＨＣｌ緩衝液で毛細管作用により約３ｃｍ移動させた。検出ゾーン（分析物を定量するために分析される膜の領域）は、３ｘ５μｌのウサギ抗ＢＳＡＩｇＧのポリクローナル抗体標品を膜に適用することにより予め調製しておき、約４時間１％ポリビニルアルコール（分子量１５，０００）でブロッキングし、次いで、蒸留水で３回洗浄した。ラテックスの濃度を、１．６ｘ１０^-5ｇ／ｍｌ〜１．３ｘ１０^-3ｇ／ｍｌまで変化させ、５μｌのラテックス懸濁液を検出ゾーンから反対端の膜に適用した。膜での移動が完了した際のいかなる膜においても、検出ゾーン以外でラテックスは検出されず、したがって、本質的にすべてのラテックスが検出ゾーンで停止していたことを意味した。各対が異なる濃度のラテックス粒子を有する２連の膜片を調製した。各組の１つを、清澄剤を使用しないで透過光でイメージし、一方、２番目のものは、分析前にＰＥＧ６００を滴下して検出ゾーンを覆って処理した。未処理の膜に関しては、膜上部の垂直軸でのビデオカメラおよび膜下方の散乱源により供給される光で分析を行ない、カメラで直接照準を定めた。次いで、透過光により形成された検出ゾーンの焦点を合わせたイメージを分析した。清澄剤で処理した膜に関しては、膜を、垂直から約３０°の角度に向けたコリメータービームで下方から照らしたときに得られたイメージを、試料の上方の垂直軸に再び位置するカメラを用いて記録および分析することにより分析を行った。この場合、カメラにより集めた前方散乱光の結果として停止したラテックスが明るいバンドを形成し、焦点を合わせた検出ゾーンのイメージのバックグランドが暗いように思われた。各場合、イメージを、バックグランドを差し引くことにより最適化し、最終イメージをまとめて、ラテックス粒子由来のシグナルを表す統合された画素の強度を提供した。結果を図１に示し、図中、相対的な統合シグナル強度を、各膜に適用されたラテックス粒子の相対数の関数としてプロットした。結果は、不透明膜に比べて透明膜により提供されたシグナルが大きく増加していることを示す。実施例２蛍光でのバックグランドの低下の示唆適当な領域で有効な蛍光の検出を可能にするフィルターを備えたブレッドボードリーダーを用いた。１ｃｍ当たり１μｌの１ｍｇ／ｍｌの抗ミオグロリンモノクローナル抗体のテストラインを、ＳａｒｔｏｒｉｕｓＣＮ８ミクロンｍｙｌａｒ−裏打ちニトロセルロース膜上に置き、膜を乾燥させた。乾燥後、膜を１％ｗ／ｖポリビニルアルコール（分子量約１５，０００）でブロックし、次いで、未処理のまま放置するか５０μｌのＰＥＧ４００で透明にした。バックグランド蛍光を蛋白質を置いたラインで測定した。使用した波長は：ＹＧ：約４８０ｎｍで励起、約５２０ｎｍで発光；ＢＬＵＥ：約５９０ｎｍで励起、約６８２ｎｍで発光であった。結果を表に示す。表：不透明および透明膜に関するバックグランドの蛍光強度これらの結果は、透明膜におけるバックグランドシグナルの劇的な低下を示す。均等物当業者であれば、単なる日常的な実験方法によって、本明細書に記載された発明の具体的態様に対する多くの均等物を認識し、あるいは確認することができるであろう。そのような均等物は、以下の請求の範囲の範鴫に含まれることを意図されている。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１０年９月３０日（１９９８．９．３０）【補正内容】請求の範囲１．下記工程：ａ．膜に清澄剤を適用する工程、ここで、清澄剤は、膜を透過性にするものであり、分析物を溶解せず、または使用するいかなる標識とも干渉せず、分析物を有意に動かさない薬品である；ｂ．膜を透明にさせるのに十分な条件下で膜を維持する工程；およびｃ．光学センサーを用いて分析物の量を測定する工程を含む、膜における目的の分析物の量を測定する方法。２．清澄剤が膜とほぼ同じ屈折率を有する薬品である請求項１記載の方法。３．清澄剤がポリマーである請求項２記載の方法。４．清澄剤がポリマーの混合物である請求項２記載の方法。５．膜がニトロセルロース膜である請求項２記載の方法。６．清澄剤がポリビニルピロリドン、ポリエチレンイミンおよびベンジルアルコールからなる群より選ばれたものである請求項５記載の方法。７．清澄剤が溶解剤である請求項１記載の方法。８．溶解剤が低分子量ポリマーである請求項７記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．下記工程：ａ．膜に清澄剤を適用する工程；ｂ．膜を透明にさせるのに十分な条件下で膜を維持する工程；およびｃ．光学センサーを用いて分析物の量を測定する工程を含む、膜における目的の分析物の量を測定する方法。２．清澄剤が膜とほぼ同じ屈折率を有する薬品である請求項１記載の方法。３．清澄剤がポリマーである請求項２記載の方法。４．清澄剤がポリマーの混合物である請求項２記載の方法。５．膜がニトロセルロース膜である請求項２記載の方法。６．清澄剤がポリビニルピロリドン、ポリエチレンイミンおよびベンジルアルコールからなる群より選ばれたものである請求項５記載の方法。７．清澄剤が溶解剤である請求項１記載の方法。８．溶解剤が低分子量ポリマーである請求項７記載の方法。９．溶解剤が低分子量ポリマーの混合物である請求項７記載の方法。１０．膜がニトロセルロースである請求項７記載の方法。１１．溶解剤がポリエチレングリコールである請求項１０記載の方法。１２．分析物が標識されている請求項１記載の方法。１３．標識が蛍光標識である請求項１２記載の方法。１４．光学センサーが蛍光強度を測定する請求項１３記載の方法。１５．標識が検出可能粒子である請求項１２記載の方法。１６．検出可能粒子が蛍光標識されている請求項１５記載の方法。１７．該粒子がラテックスビーズである請求項１５記載の方法。１８．光学センサーが散乱光の強度を測定する請求項１５記載の方法。