JP2018518657A - 蛍光検出のための方法およびシステム - Google Patents

Abstract

本発明は、時間分解蛍光（ＴＲＦ）検出を含む、多重化蛍光検出を対象とする。蛍光発光におけるスペクトルおよび時間差ならびに励起におけるスペクトル差の組み合わせが、複数の蛍光標識からの検定において信号を分離する能力を増進するために使用される。アップコンバージョン蛍光体ならびにランタニドキレートおよび遷移金属キレートを含む、異なる部類の標識が利用され得る。本方法は、カートリッジベースのマルチモードリーダを含む、光学プレートリーダで実装され得る。

Description

（関連出願）
本願は、２０１５年４月８日に出願された米国特許出願第１４／６８２，０２６号の利益を主張するものであり、該米国特許出願の内容は、その全体が参照により本明細書中に援用される。

（技術分野）
本発明は、概して、サンプルの蛍光ベースの検出または測定、具体的には、異なるフルオロフォアを利用する多重化検出のための方法、装置、およびシステムに関する。本発明は、通常の蛍光検出（ＦＤ）および時間分解蛍光（ＴＲＦ）検出を含む、蛍光ベースの検出のための異なるタイプの技法を実装し得る。

タンパク質検出および特性評価は、医薬ならびに臨床研究のための重要なタスクである。化学発光（ＣＬ）は、生化学分析における、または表面結合および空間的に分離されたタンパク質上のタンパク質の検出のための一般的な方法である。後者の実施例は、ウェスタンブロット（ＷＢ）分析と称される、膜へのタンパク質の電気泳動転写を用いたドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の方法である（Ｔｏｗｂｉｎ ｅｔ ａｌ． （１９７９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ７６（９）：４３５０−４３５４、Ｒｅｎａｒｔ ｅｔ ａｌ． （１９７９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ７６（７）：３１１６−３１２０）。電気化学発光（ＥＣＬ）もまた、特別に設計されたマルチウェルプレート（例えば、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， ＬＬＣの子会社である、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， Ｍｄ．）製ＭＵＬＴＩ ＳＰＯＴ^（Ｒ）およびＭＵＬＴＩ−ＡＲＲＡＹ^ＴＭプレートならびにＳＥＣＴＯＲ^ＴＭ器具）内のスポットに結合されたタンパク質を検出するために適用されている。

ＣＬおよびＥＣＬの利点は、サブピコグラム／ｍｌ範囲内の溶液中のタンパク質のための検出の限界を伴う非常に高い感度である。しかしながら、これらのシステムは、一過性の信号を生成し、化学的に安定しておらず、検出のために要求される化学反応を生じるために複雑な手順を要求する。それらはまた、非線形システムであり（すなわち、１つのプローブが多くの光子を生成する）、不良な再現性を有するため、タンパク質量の定量化が所望される用途のために好適ではない。最後であるが有意な限界は、複数のＣＬ信号を多重化できないことである。それらの発光は、非常に広く、それは、同一の空間場所からの２つの異なるＣＬ発光を検出する能力を非常に困難にする。

蛍光（ＦＬ）プローブは、ＣＬの限界のうちのいくつかを克服する。それらは、励起光子と発光光子との間の関係が一般に線形であるため、より良好な定量化のための能力を提供する。それらはまた、他の反応性分子によるプローブへのアクセスを提供する必要性がないため、より万能である。一般に、ＦＬプローブはまた、概して、非反応性化学種であるため、特に光から保護されるときに、より安定している。おそらく、ＦＬプローブの最も重要な利点は、それらが多重化を行う能力を提供することである。ＦＬ分子は、広範囲の励起および発光帯を伴う多種多様な形態で現れる。したがって、同一の空間場所における２つ（またはそれを上回る）プローブは、独立して励起させられ、検出チャネルの間に最小限の重複（またはクロストーク）を伴って検出されることができる。同一の空間場所から最大４つの独立したフルオロフォアを検出する能力は、カラー帯域通過フィルタを使用して、定期的に報告される。より高いレベルの多重化が、フローサイトメトリおよびマルチスペクトル画像化を用いて報告されている（Ｓｔａｃｋ ｅｔ ａｌ． （２０１４） Ｍｅｔｈｏｄｓ ７０（１）：４６−５８、Ｐｅｒｆｅｔｔｏ ｅｔ ａｌ． （２００４） ４（８）：６４８−６５５）。

残念ながら、ＦＬプローブは、ＣＬと同一のレベルの感度を実証しておらず、典型的には、より低いダイナミックレンジを有する。ＦＬプローブを用いたより低い感度の理由は、共局在化物質の自己蛍光からの背景または他のプローブからの蛍光の干渉の存在である。異なる技法が、時間分解蛍光（ＴＲＦ）と呼ばれる、より長い寿命の蛍光プローブを使用して、自己蛍光からの背景を低減させるために開発された（Ｚｕｃｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ． （２００９） Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．． ８１（２２）：９４４９−９４５３、Ｋｅｍｐｅｒ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ． ２２（５）：８８１−８８９、Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２４５（２）：１８４−１９５、Ｈｕｈｔｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ． （２００５） Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ７７（８）：２６４３−２６４８、Ｖｅｒｅｂ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ． ７４（５）：２２１０−２２２２）。簡潔に述べると、自己蛍光は、典型的には、自己蛍光信号が次第に消えるまでＴＲＦ検出が時間的に遅延されるように、比較的短い寿命（＜２０ナノ秒）を有する。これは、技術的には時間ゲート検出であるが、一般的には時間分解と呼ばれている（Ｌａｋｏｗｉｃｚ， “Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，” ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ２００６）。ＴＲＦ検出の利益は、文書で十分に立証されており、より高い感度、より低い背景、およびより広いダイナミックレンジを含む（Ｅｌｉｓｅｅｖａ ＆ Ｂｕｎｚｌｉ （２０１０） Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｒｅｖ． ３９（１）：１８９−２２７、Ｂｕｎｚｌｉ ＆ Ｐｉｇｕｅｔ （２００５） Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｒｅｖ． ３４（１２）：１０４８−１０７７、Ｄｉａｍａｎｄｉｓ （１９９１） Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． ３７（９）：１４８６−１４９１）。

ＴＲＦの多重化が、多少の成功とともに報告されている。ＥｕおよびＴｂベースのプローブの使用が、２つの異なるタンパク質を検出するために時間分解蛍光共鳴エネルギー移動（ＴＲ−ＦＲＥＴ）を使用した生化学検定において実証されている（Ｄｅｇｏｒｃｅ ｅｔ ａｌ． （２００９） Ｃｕｒｒ． Ｃｈｅｍ． Ｇｅｎｏｍｉｃｓ． ３：２２−３２、Ｂｏｏｋｏｕｔ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｊ． Ａｇｒｉｃ． Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ． ４８（１２）：５８６８−５８７３、Ｈａｍｙ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｊ． Ｂｉｏｍｏｌ． Ｓｃｒｅｅｎ． ６（３）：１７９−１８７）。加えて、ＥｕおよびＳｍ、ならびにＥｕ、Ｔｂ、およびＳｍを用いた多重化の報告も存在している（Ｂａｄｏｒ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． ３３（１）：４８−５１、Ｈｅｉｎｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． ４３（７）：１１４２−１１５０）。しかしながら、これらのシステムは、ランタニドのうちの１つからの発光が他のランタニドの検出チャネルの中へ漏出するにつれて、クロストークに悩まされる。これは、これらの方法の有用性を、１つだけの真に敏感なチャネルを有することに限定する一方で、他方は、第２の種からの背景信号によって限定される。

したがって、チャネルの間のクロストークが最小限である、または全くない状態で、高い感度、背景除去、安定性、光漂白への耐性、および時間分解蛍光検出のダイナミックレンジを維持する、改良された多重化システムの必要性がある。

Ｔｏｗｂｉｎ ｅｔ ａｌ． （１９７９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ７６（９）：４３５０−４３５４ Ｒｅｎａｒｔ ｅｔ ａｌ． （１９７９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ７６（７）：３１１６−３１２０

全体的または部分的に前述の問題、および／または当業者によって観察され得た他の問題に対処するために、本開示は、以下に記載される実装で一例として説明されるような方法、プロセス、システム、装置、器具、および／またはデバイスを提供する。

ある実施形態によると、多重化時間分解蛍光（ＴＲＦ）検出のための方法は、第１の被分析物に結合された第１の蛍光標識と、第２の被分析物に結合された第２の蛍光標識とを備える、サンプルを提供するステップであって、第１の蛍光標識は、背景蛍光発光寿命よりも少なくとも３倍長い第１の蛍光発光寿命と、第１の励起波長と、第１の発光波長とを有し、第２の蛍光標識は、第２の蛍光発光寿命と、第２の励起波長と、第２の発光波長とを有する、ステップと、第１の励起波長を有する第１の励起光で第１の蛍光標識を励起させるステップであって、第１の蛍光標識は、第１の発光波長を有する第１の検出信号を発する、ステップと、第２の励起波長を有する第２の励起光で第２の蛍光標識を励起させるステップであって、第２の蛍光標識は、第２の発光波長を有する第２の検出信号を発する、ステップと、第１の検出信号の強度を測定するステップであって、第１の検出信号の強度は、サンプル中の第１の被分析物の量と正の相関性がある、ステップと、第２の検出信号の強度を測定するステップであって、第２の検出信号の強度は、サンプル中の第２の被分析物の量と正の相関性がある、ステップとを含み、第２の蛍光発光寿命は、第１の蛍光発光寿命よりも少なくとも５倍長い。

別の実施形態によると、サンプルはさらに、付加的被分析物に結合された少なくとも１つの付加的蛍光標識を備え、付加的蛍光標識は、標識特有の励起波長と、標識特有の発光波長と、背景発光寿命よりも少なくとも３倍長い標識特有の蛍光発光寿命とを有し、第１の蛍光発光寿命、第２の蛍光発光寿命、および標識特有の蛍光発光寿命はそれぞれ、相互と少なくとも１桁異なる。付加的蛍光標識は、標識特有の励起波長を有する標識特有の励起光で励起させられ、付加的蛍光標識は、標識特有の発光波長を有する標識特有の検出信号を発する。次いで、標識特有の検出信号の強度が、測定され、標識特有の検出信号の強度は、サンプル中の付加的被分析物の量と正の相関性がある。付加的被分析物に結合された少なくとも１つの付加的蛍光標識はまた、異なる被分析物に結合された複数の異なる蛍光標識を備えてもよい。

別の実施形態によると、多重化時間分解蛍光（ＴＲＦ）検出装置またはシステムは、方法の励起させるステップおよび測定するステップ等の本明細書に開示される方法のうちのいずれかの全てまたは一部を行うために構成される。

別の実施形態によると、蛍光検出を行うための装置またはシステムは、本明細書に開示される方法のうちのいずれかの全てまたは一部を行うために構成される、プロセッサと、メモリとを含む。

別の実施形態によると、コンピュータ可読記憶媒体は、本明細書に開示される方法のうちのいずれかの全てまたは一部を行うための命令を含む。

別の実施形態によると、装置またはシステムは、コンピュータ可読記憶媒体を含む。

別の実施形態によると、多重化時間分解蛍光（ＴＲＦ）検出装置は、サンプルを支持するために構成されるサンプル支持体であって、前記サンプルは、第１の蛍光標識と、第２の蛍光標識とを備え、第１の蛍光標識は、背景蛍光発光寿命よりも少なくとも３倍長い第１の蛍光発光寿命と、第１の励起波長と、第１の発光波長とを有し、第２の蛍光標識は、第２の蛍光発光寿命と、第２の励起波長と、第２の発光波長とを有し、第２の蛍光発光寿命は、第１の蛍光発光寿命よりも少なくとも５倍長い、サンプル支持体と、第１の励起波長における第１の励起光および第２の励起波長における第２の励起光を生成するために構成される、光源と、第１の励起光による励起に応答してサンプルから発せられる第１の検出信号、および第２の励起光による励起に応答してサンプルから発せられる第２の検出信号を測定するために構成される、光検出器と、タイミングシーケンスに従って第１の励起光および第２の励起光を生成するように光源を制御し、第１の検出信号および第２の検出信号の測定に対応する電気出力を光検出器から受信するために構成される、コンピューティングデバイスとを含む。

別の実施形態によると、多重化蛍光検出のための方法は、第１の被分析物に結合された第１の蛍光標識と、第２の被分析物に結合された第２の蛍光標識とを備える、サンプルを提供するステップであって、第１の蛍光標識は、アップコンバーティング蛍光体（ＵＣＰ）を備え、第２の蛍光標識は、非ＵＣＰ標識を備える、ステップと、第１の蛍光標識に第１の励起波長における第１の励起光を照射するステップであって、第１の蛍光標識は、第１の発光波長における第１の検出信号を発する、ステップと、第２の蛍光標識に第１の励起波長と異なる第２の励起波長における第２の励起光を照射するステップであって、第２の蛍光標識は、第１の発光波長と異なる第２の発光波長における第２の検出信号を発する、ステップと、第１の測定時間において第１の検出信号の強度を測定するステップであって、第１の検出信号の強度は、サンプル中の第１の被分析物の量と相関性がある、ステップと、第２の蛍光標識を照射することを中止するステップと、第２の蛍光標識を照射することを中止した後に、第１の測定時間と異なる第２の測定時間において第２の検出信号の強度を測定するステップであって、第２の検出信号の強度は、サンプル中の第２の被分析物の量と相関性がある、ステップとを含む。

別の実施形態によると、サンプルは、第３の被分析物に結合された第３の蛍光標識を備え、第３の蛍光標識は、第２の蛍光標識と異なる非ＵＣＰ標識を備え、本方法はさらに、第３の蛍光標識に第１の励起波長および第２の励起波長と異なる第３の励起波長における第３の励起光を照射するステップであって、第３の蛍光標識は、第１の発光波長および第２の発光波長と異なる第３の発光波長における第３の検出信号を発する、ステップと、第３の蛍光標識を照射することを中止するステップと、第３の蛍光標識を照射することを中止した後に、第１の測定時間および第２の測定時間と異なる第３の測定時間において第３の検出信号の強度を測定するステップとを含む。

別の実施形態によると、蛍光検出装置は、少なくとも、本明細書に開示される方法のうちのいずれかの照射するステップおよび測定するステップを行うために構成され、第１の励起光および第２の励起光を生成するために構成される光源と、第１の検出信号および第２の検出信号を測定するために構成される光検出器とを含む。

別の実施形態によると、蛍光検出装置は、サンプルを支持するために構成されるサンプル支持体であって、前記サンプルは、第１の被分析物に結合された第１の蛍光標識と、第２の被分析物に結合された第２の蛍光標識とを備え、第１の蛍光標識は、アップコンバーティング蛍光体（ＵＣＰ）を備え、第２の蛍光標識は、非ＵＣＰ標識を備える、サンプル支持体と、第１の励起波長における第１の励起光および第１の励起波長と異なる第２の励起波長における第２の励起光を生成するために構成される、光源と、第１の励起光による励起に応答して第１の発光波長においてサンプルから発せられる第１の検出信号、および第２の励起光による励起に応答して第２の発光波長においてサンプルから発せられる第２の検出信号を測定するために構成される、光検出器と、所定の励起時間において、かつ所定の持続時間にわたって、第１の励起光および第２の励起光をそれぞれ生成するように光源を制御し、第１の測定時間において第１の検出信号を測定するように、かつ第２の測定時間において第２の検出信号を測定するように、光検出器を制御するために構成される、コンピューティングデバイスとを含む。

別の実施形態によると、サンプルは、第３の被分析物に結合された第３の蛍光標識を備え、第３の蛍光標識は、第２の蛍光標識と異なる非ＵＣＰ標識を備え、光源は、第１の励起波長および第２の励起波長と異なる第３の励起波長において第３の励起光を生成するために構成され、光検出器は、第３の発光波長における第３の検出信号を測定するために構成され、コンピューティングデバイスは、所定の励起時間において、かつ所定の持続時間にわたって、第３の励起光を生成するように光源を制御し、第３の測定時間において第３の検出信号を測定するように光検出器を制御するために構成される。

別の実施形態によると、蛍光検出装置またはシステムは、装置筐体と、装置筐体の中に除去可能に設置されるカートリッジと、光源からサンプルまでの光学経路を画定するために構成される励起光学部と、サンプルから光検出器までの光学経路を画定するために構成される発光光学部とを含み、光源は、カートリッジの中または装置筐体の中に配置され、光検出器は、カートリッジの中または装置筐体の中に配置され、コンピューティングデバイスは、装置筐体の中に配置される。

別の実施形態によると、蛍光検出装置またはシステムは、本明細書に開示される方法のうちのいずれかの全てまたは一部を行うために構成される。

別の実施形態によると、蛍光検出を行うための装置またはシステムは、本明細書に開示される方法のうちのいずれかの全てまたは一部を行うために構成される、プロセッサと、メモリとを含む。

別の実施形態によると、コンピュータ可読記憶媒体は、本明細書に開示される方法のうちのいずれかの全てまたは一部を行うための命令を含む。

別の実施形態によると、装置またはシステムは、コンピュータ可読記憶媒体を含む。

本発明の他のデバイス、装置、システム、方法、特徴、および利点が、以下の図ならびに発明を実施するための形態の検討に応じて、当業者に明白であろう、または明白となろう。全てのそのような付加的システム、方法、特徴、および利点は、本説明に含まれ、本発明の範囲内であり、添付の請求項によって保護されることが意図される。

本発明は、以下の図を参照することによって、より深く理解されることができる。図中の構成要素は、必ずしも一定の縮尺ではなく、代わりに、本発明の原理を例証することに重点が置かれている。図中、同一参照番号は、異なる図の全体を通して対応する部分を指定する。

図１は、いくつかの実施形態による、多重化時間分解蛍光（ＴＲＦ）検出のための方法のフローチャートである。 図２は、いくつかの実施形態による、サンプル分析装置の実施例の概略図である。 図３Ａは、ある実施形態による、蛍光検出装置の実施例の概略図である。 図３Ｂは、別の実施形態による、蛍光検出装置の実施例の概略図である。 図３Ｃは、別の実施形態による、蛍光検出装置の実施例の概略図である。 図３Ｄは、別の実施形態による、蛍光検出装置の実施例の概略図である。 図３Ｅは、別の実施形態による、蛍光検出装置の実施例の概略図である。 図３Ｆは、別の実施形態による、蛍光検出装置の実施例の概略図である。 図３Ｇは、別の実施形態による、蛍光検出装置の実施例の概略図である。 図３Ｈは、別の実施形態による、蛍光検出装置の実施例の概略図である。 図４Ａは、ＳｃａｎＬａｔｅｒ^ＴＭウェスタンブロット検出システム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ， ＬＬＣ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡ））を使用するＴＲＦ検出の方法の概略図である。 図４Ｂは、ＴＲＦ検出の原理を図示する概略図である。 図５Ａは、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の３倍連続希釈の画像である。 図５Ｂは、１０回の異なるウェスタンブロットの平均にわたる個々の帯域からの積分強度のグラフである。 図６は、ＳｃａｎＬａｔｅｒ^ＴＭカートリッジとともにＳｐｅｃｔｒａＭａｘ^（Ｒ）Ｐａｒａｄｉｇｍ^（Ｒ）リーダを使用して、経時的なウェスタンブロット結果の安定性を示す、グラフである。 図７は、ウェスタンブロット上の単一の帯域の反復走査後のＴＲＦ試薬の光漂白の欠如を示す、グラフである。走査毎に、バーは、強度（「Ｉｎｔ．Ｄｅｎｓｉｔｙ」）を示す。 図８は、ユーロピウム（Ｅｕ）およびテルビウム（Ｔｂ）ベースのプローブのための検出チャネルの間のクロストーク発光を比較する、ドットブロット結果を示す。 図９は、ユーロピウム（Ｅｕ）およびサマリウム（Ｓｍ）ベースのプローブのための検出チャネルの間のクロストーク発光を比較する、ドットブロット結果を示す。 図１０は、ユーロピウム（Ｅｕ）およびルテニウム（Ｒｕ）ベースのプローブを用いて検出チャネルの間のクロストーク発光を比較する、ＧＳＴ希釈系列のウェスタンブロット結果を示す。これらの走査は、レーザダイオード励起を使用するカートリッジを用いて取得された。 図１１は、図１０に示されるウェスタンブロット上のレーンを通した平均ライン走査を示す、グラフである。ＧＳＴ Ｅｕ−Ｅｕカートリッジ用のライン走査は、１１０１と標識され、ＧＳＴ Ｅｕ−Ｒｕカートリッジ用のライン走査は、１１０２と標識され、ＧＳＴ Ｒｕ−Ｒｕカートリッジ用のライン走査は、１１０３と標識され、ＧＳＴ Ｒｕ−Ｅｕカートリッジ用のライン走査は、１１０４と標識される。

本明細書で使用されるように、「被分析物」という用語は、概して、検出される物質を指す。例えば、他の特定の実施形態では、多重化ＴＲＦ検出を行うための方法内の第１の被分析物および第２の被分析物は、タンパク質、より具体的には、膜結合タンパク質を備える。被分析物はまた、抗原物質、ハプテン、抗体、およびそれらの組み合わせを含んでもよい。故に、被分析物は、毒素、有機化合物、タンパク質、ペプチド、微生物、アミノ酸、核酸、ホルモン、ステロイド、ビタミン、薬物（治療目的で投与されるもの、ならびに違法目的で投与されるものを含む）、薬物中間体または副産物、細菌、ウイルス粒子、および上記の物質のうちのいずれかの代謝産物またはそれに対する抗体を含むが、それらに限定されない。

本明細書で使用されるように、「サンプル」という用語は、概して、被分析物を含有することが公知である、または疑われる物質を指す。サンプルは、供給源から取得されたまま直接的に、またはサンプルの性質を修飾する前処理後に使用されてもよい。サンプルは、血液、間質液、唾液、水晶体液、脳脊髄液、汗、尿、乳、腹水、粘液、滑液、腹腔液、膣液、羊水、または同等物を含む、生理液等の任意の生物学的起源に由来してもよい。サンプルは、血液から血漿を調製すること、粘液を希釈すること、および同等物等、使用に先立って前処理されてもよい。前処理の方法は、濾過、沈殿、希釈、蒸留、濃縮、干渉成分の不活性化、クロマトグラフィ、分離ステップ、および試薬の添加を伴うことができる。生理液以外に、水、食品、および同等物等の他の液体サンプルが、環境または食糧生産検定の実施に使用されてもよい。加えて、被分析物を含有することが公知である、または疑われる固体物質が、サンプルとして使用されてもよい。ある事例では、液体媒体を形成するように、または被分析物を放出するように、固体サンプルを修飾することが有益であり得る。

本明細書で使用されるように、「光」という用語は、概して、光子として量子化可能な電磁放射線を指す。本開示に関連する場合、光は、紫外線（ＵＶ）から赤外線（ＩＲ）に及ぶ波長において伝搬してもよい。本開示では、「光」という用語は、可視範囲内の電磁放射線に限定されることを意図していない。本開示では、「光」、「光子」、および「放射線」という用語は、同義的に使用される。

本発明は、通常の蛍光検出（ＦＤ）、時間分解蛍光（ＴＲＦ）検出、または両方の組み合わせを使用する、長い寿命の蛍光染料およびアップコンバージョン蛍光体（ＵＣＰ）を含む、種々のタイプのフルオロフォアを多重化するための方法を対象とする。蛍光発光におけるスペクトルおよび時間差の組み合わせが、複数の染色からの検定において信号を分離する能力を増進するために使用される。いわゆるマルチモードリーダ等のカートリッジベースの光学プレートリーダを組み込む、装置およびシステムを含む、本明細書に開示される方法のうちのいずれかの全てまたは一部を行うために構成される、多重化蛍光検出装置およびシステムも提供される。

従来のＴＲＦ検出は、光の短いパルスで蛍光標識を励起させ、次いで、典型的には、残りの長寿命蛍光信号を測定する前に、励起後ある時間待機することを伴う。このようにして、任意の短寿命蛍光背景信号および散乱励起放射線が、排除される。背景信号の大部分を排除する本能力は、従来の蛍光よりも２〜４桁大きい感度をもたらし得る。したがって、ＴＲＦ検出は、ある蛍光物質の蛍光特性を利用することによって、発光源から、または（励起放射線の散乱から生じる）散乱プロセスから背景信号を低減させるように設計される。

ＴＲＦのための蛍光標識の典型的選択基準は、比較的長い発光寿命を含む。上記で示されるように、これは、任意の短寿命背景信号が消散した後に、標識がその信号を十分に発するように所望される。長い蛍光寿命はまた、時間ゲート蛍光測定のためにフラッシュランプ励起および低コスト回路を使用することも可能にする。加えて、蛍光標識は、比較的大きい「ストークスシフト」を有し得る。「ストークスシフト」という用語は、概して、励起線または帯よりも長い発光波長への発光放射線のスペクトル線または帯の変位として定義される。比較的大きいストークスシフトは、蛍光標識の励起波長がその発光波長から遠く離れて留まることを可能にし、励起および発光波長の間の大きい差が、発せられた信号から励起放射線を排除することをより容易にするため、望ましい。さらに、大きいストークスシフトはまた、サンプル中の蛍光分子からの干渉、および／または一部の体液（例えば、血液）とともに存在するタンパク質またはコロイドに起因する光散乱も最小限にする。加えて、大きいストークスシフトはまた、背景干渉を排除するための高価な高精度フィルタの要件も最小限にする。

比較的長い発光寿命および比較的大きいストークスシフトを両方とも有する、１つのタイプの蛍光化合物は、サマリウム（Ｓｍ（ＩＩＩ））、ジスプロシウム（Ｄｙ（ＩＩＩ））、ユーロピウム（Ｅｕ（ＩＩＩ））、およびテルビウム（Ｔｂ（ＩＩＩ））のキレート等のランタニドキレートである。そのようなキレートは、実質的により短い波長におけるキレートの励起後に、強く赤方偏移した狭帯域の長寿命発光を呈することができる。典型的には、キレートは、分子中のランタニドの近くに位置する発色団に起因する、強い紫外線（ＵＶ）励起帯を保有する。発色団による励起に続いて、励起エネルギーは、励起された発色団からランタニドに転送されることができる。この後には、ランタニドに特徴的な蛍光発光が続く。ランタニドキレートは、例えば、フルオレセインのわずか約２８ナノメートルと比較して、約２５０〜約３５０ナノメートル（ｎｍ）の例外的に大きいストークスシフトを有する。また、ランタニドキレートの蛍光は、他の蛍光標識の約１〜約２０ナノ秒（ｎｍ）と比較して、約１００〜約１０００マイクロ秒（μｓ）の寿命を伴って、長寿命である。加えて、これらのキレートは、典型的には、約５０％発光において約１０ナノメートル未満の帯域幅を有する、非常に狭い発光スペクトルを有する。

比較的長い発光寿命および比較的大きいストークスシフトを両方とも有する、別のタイプの蛍光化合物は、ルテニウム（Ｒｕ（ＩＩ））、オスミウム（Ｏｓ（ＩＩ））、およびレニウム（Ｒｅ（Ｉ））のキレート等の遷移金属キレートである。遷移金属キレートの蛍光寿命は、典型的には、約０．１〜約１０マイクロ秒である。

上記で説明されるように、本発明は、一側面では、ＴＲＦ検出を使用して長い寿命の蛍光染料を多重化する新規の方法を対象とする。蛍光発光におけるスペクトルおよび時間差の組み合わせが、複数の染色からの検定において信号を分離する能力を増進するために使用される。本方法は、１％を下回るまで、より具体的には、０．０１％を下回るまで、クロストークを低減させるように、ＴＲＦ染料の間の時間ドメインおよび波長ドメイン差を両方とも活用する。

本発明の多重化ＴＲＦ検出方法は、従来の方法と比較して、いくつかの利点を提供する。例えば、改良された定量化が、基準または標準として１つのチャネルを使用することによって、達成されてもよい。例えば、ウェスタンブロットを行うようにゲル上のカラムの中へサンプルを装填するための従来の方法を使用するときに、どれだけのサンプルが実際にレーンに辿り着くかに有意な誤差があり得る。１つのチャネルで（ハウスキーピングタンパク質としても公知である）基準タンパク質信号を利用することによって、次いで、第２（または第３）のチャネル内の「未知の」タンパク質からの信号は、相対正確度を向上させるように基準チャネルに正規化されることができる。

本発明の多重化ＴＲＦ検出方法の別の利点は、それらが改良されたレシオメトリック測定を可能にすることである。ウェスタンブロットの一般的な用途は、信号伝達事象のインジケータとしてタンパク質のリン酸化反応を見て、未修飾（または総）タンパク質に対するリンタンパク質の比を計算することである。そのような比を計算するために単一チャネルウェスタンブロットを使用することは、第１のタンパク質を測定し、ウェスタンブロット膜を剥離し、次いで、第２のタンパク質を再精査して測定することを要求する。２チャネル検出は、同時にリンおよび総タンパク質の両方の精査ならびに測定を可能にする。これは、剥離して再精査する必要がないことによって、実験誤差の原因が除去されるため、有意な時間を節約し、正確度を増加させる。

図１は、いくつかの実施形態による、多重化ＴＲＦ検出のための方法１００のフローチャートである。最初に、第１の被分析物に結合された第１の蛍光標識と、第２の被分析物に結合された第２の蛍光標識とを備える、サンプルが提供され、第１の蛍光標識は、背景蛍光発光寿命よりも少なくとも３倍長い第１の蛍光発光寿命と、第１の励起波長と、第１の発光波長とを有し、第２の蛍光標識は、第２の蛍光発光寿命と、第２の励起波長と、第２の発光波長とを有し、第２の蛍光発光寿命は、第１の蛍光発光寿命よりも少なくとも５倍長い（ステップ１１０）。次に、第１の蛍光標識は、第１の励起波長を有する第１の励起光で励起させられ、第１の蛍光標識は、第１の発光波長を有する第１の検出信号を発する（ステップ１２０）。次いで、第２の蛍光標識は、第２の励起波長を有する第２の励起光で励起させられ、第２の蛍光標識は、第２の発光波長を有する第２の検出信号を発する（ステップ１３０）。次に、第１の検出信号の強度が測定され、第１の検出信号の強度は、サンプル中の第１の被分析物の量と正の相関性がある（ステップ１４０）。次いで、第２の検出信号の強度が測定され、第２の検出信号の強度は、サンプル中の第２の被分析物の量と正の相関性がある（ステップ１５０）。特定の実施形態では、第２の蛍光発光寿命は、第１の蛍光発光寿命よりも少なくとも１００倍または少なくとも１，０００倍長い。

いくつかの実施形態では、図１のフローチャートは、上記で説明される方法１００のステップの全てまたは一部を実施するために構成される、サンプル分析装置を概略的に表すと見なされてもよい。サンプル分析装置のさらなる実施例が、以下で説明される。

他の特定の実施形態では、多重化ＴＲＦ検出を行うための方法は、１００マイクロ秒〜１ミリ秒の範囲内の第２の蛍光発光寿命を有する、第２の蛍光標識の使用を含み、より具体的には、第２の蛍光標識は、サマリウム（Ｓｍ（ＩＩＩ））、ジスプロシウム（Ｄｙ（ＩＩＩ））、ユーロピウム（Ｅｕ（ＩＩＩ））、およびテルビウム（Ｔｂ（ＩＩＩ））のランタニドキレートから成る群から選択される。さらなる特定の実施形態では、多重化ＴＲＦ検出を行うための方法は、０．１マイクロ秒〜１０マイクロ秒の範囲内の第１の蛍光発光寿命を有する、第１の蛍光標識の使用を含み、より具体的には、第１の蛍光標識は、ルテニウム（Ｒｕ（ＩＩ））、オスミウム（Ｏｓ（ＩＩ））、およびレニウム（Ｒｅ（Ｉ））の遷移金属キレートから成る群から選択される。

さらなる特定の実施形態では、多重化ＴＲＦ検出を行うための方法内の蛍光標識は、約２０ナノメートルを上回る、いくつかの実施形態では、１００ナノメートルを上回る、いくつかの実施形態では、約２５０〜約３５０ナノメートルのストークスシフトを有する。

さらなる実施形態では、ステップ１１０に先立って、サンプルは、以下のステップ、すなわち、
ａ）サンプルを、
ｉ）第１の被分析物に特異的に結合する第１の抗体と、
ｉｉ）第２の被分析物に特異的に結合する第２の抗体と
ｉｉｉ）第１の抗体に特異的に結合する第１の蛍光抗体複合体であって、第１の蛍光抗体複合体は、第１の蛍光発光寿命と、第１の励起波長と、第１の発光波長とを有する、第１の蛍光標識を備える、第１の蛍光抗体複合体と
ｉｖ）第２の抗体に特異的に結合する第２の蛍光抗体複合体であって、第２の蛍光抗体複合体は、第２の蛍光発光寿命と、第２の励起波長と、第２の発光波長とを有する、第２の蛍光標識を備える、第２の蛍光抗体複合体と、
接触させるステップと、
ｂ）抗体および抗体複合体が免疫複合体を形成することを可能にするための十分な条件下で、かつ十分な時間にわたって、サンプルを培養するステップとに従って調製される。いくつかの実施形態では、抗体および抗体複合体は、溶液中の混合物の形態で提供されてもよい、または抗体および／または抗体複合体は、固形支持体の表面に付着させられてもよい。固形支持体は、磁気ビーズ、金ナノ粒子、生分解性有機ポリマーナノ粒子、マイクロウェル、またはマイクロタイタープレートであってもよいが、それらに限定されない。他の実施形態では、第１または第２の抗体は、それらに直接付着させられ、抗体複合体の必要性を排除する、第１または第２の蛍光標識を有してもよい。故に、本開示される方法は、膜に結合されたタンパク質、ビーズに結合されたタンパク質、（潜在的に分離された）マイクロ流体チャネル内のタンパク質、マルチウェルプレートのウェル内のタンパク質、および／または（潜在的に分離された）ゲルまたは他の粘性媒体内のタンパク質の検出等の被分析物の検出のための広範囲の検定を包含する。

他の特定の実施形態では、多重化ＴＲＦ検出を行うための方法内のサンプルは、付加的被分析物に結合された少なくとも１つの付加的蛍光標識を備える。付加的蛍光標識は、標識特有の励起波長と、標識特有の発光波長と、背景発光寿命よりも少なくとも３倍長くあり得る、標識特有の蛍光発光寿命とを有する。さらに、第１の蛍光発光寿命、第２の蛍光発光寿命、および標識特有の蛍光発光寿命はそれぞれ、相互と少なくとも１桁異なり得る。付加的蛍光標識は、標識特有の励起波長を有する標識特有の励起光で励起させられ、それによって、付加的蛍光標識は、標識特有の発光波長を有する標識特有の検出信号を発する。次いで、標識特有の検出信号の強度が、測定され、標識特有の検出信号の強度は、サンプル中の付加的被分析物の量と正の相関性がある。付加的被分析物に結合された少なくとも１つの付加的蛍光標識はまた、異なる被分析物に結合された複数の異なる蛍光標識を備えてもよい。

さらなる実施形態では、多重化ＴＲＦ検出を行うための方法内で、第１の被分析物は、基準タンパク質であり、第２の被分析物は、未知のタンパク質であり、さらに、第２の検出信号は、第１の検出信号に正規化される。

別の実施形態では、多重化ＴＲＦ検出を行うための方法内で、第１の被分析物は、タンパク質であり、第２の被分析物は、タンパク質の修飾バージョンであり、さらに、未修飾タンパク質に対する修飾タンパク質の比が、計算され、具体的には、タンパク質の修飾バージョンは、タンパク質のリン酸化バージョンである。

さらなる実施形態では、１つまたはそれを上回るアップコンバージョン蛍光体（ＵＣＰ）が、蛍光標識として利用されてもよく、本明細書に説明されるランタニドキレートおよび遷移金属キレート等の他のタイプの蛍光標識（すなわち、「非ＵＣＰ」標識）と組み合わせて利用されてもよい。当業者によって理解されるように、ＵＣＰは、正のストークスシフトではなくて反ストークスシフト（または負のストークスシフト）を呈する。すなわち、光子アップコンバージョンのプロセスでは、ＵＰＣによる励起光の２つまたはそれを上回る光子の順次吸収は、励起波長よりも長い波長ではなくて励起波長よりも短い波長において、ＵＰＣによる発光をもたらす。典型的実施例では、ＵＰＣは、赤外線（ＩＲ）スペクトル（例えば、９８０ｎｍ）内の光を吸収することに応答して、可視スペクトル（例えば、６００ｎｍ）内の発光を発する。本明細書に説明される非ＵＣＰ蛍光標識のように、ＵＣＰ蛍光標識は、長期発光寿命を有するように構成（調合、加工）されることができる。また、ＵＣＰ蛍光標識が照射されるＩＲ波長は、非ＵＣＰ蛍光標識が照射されるＵＶ波長と有意に異なり（すなわち、スペクトル的に遠く分離され）、背景雑音が有意に低減させられることを可能にする。ＵＣＰ標識の発光波長もまた、測定信号の非常に良好な分解能および非常に低減したクロストークを提供するために、非ＵＣＰ標識と十分に異なる。本開示のある側面によると、ＵＣＰ標識および１つまたはそれを上回る異なる非ＵＣＰ標識等の異なる標識の使用は、非常に少ないクロストークをもたらす、異なる励起波長、異なる発光波長、および異なる発光寿命の使用を伴う。非ＵＣＰ標識の場合のように、具体的励起波長、発光波長、および発光寿命は、所与のＵＣＰの特定の構成に依存する。多重化（例えば、二重、三重等）実験において１つまたはそれを上回るＵＣＰ標識の使用を１つまたはそれを上回る非ＵＣＰ標識（例えば、ランタニドキレートおよび／または遷移金属キレート）と組み合わせることはまた、要求されるサンプル実験時間の量を削減し得る。加えて、あるＵＣＰ標識が、ＵＣＰと関連付けられる非常に低い背景信号に起因して、通常の蛍光ベースの実験、すなわち、サンプルを照射しながら（すなわち、励起と発光の検出／測定との間で要求される遅延が殆どまたは全くない状態で）サンプルを同時に検出／測定するために有用である。したがって、本明細書に開示されるいくつかの実施形態では、本方法は、非ＵＣＰ標識と組み合わせてそのようなＵＣＰを利用するときに、ＴＲＦまたは通常の蛍光およびＴＲＦの組み合わせを伴ってもよい。

非限定的実施例として、ＵＣＰは、反ストークスシフトを呈する、ランタニドをドープした、または遷移金属をドープした無機化合物であってもよい。無機化合物は、アップコンバージョン活性を有効にする、または増進する、１つまたはそれを上回るドーパントでドープされた透明ホスト格子を含む、結晶性物質であってもよい。あるＵＣＰの基礎を形成する無機化合物の実施例は、種々のハロゲン化物（例えば、ＮａＹＦ_４、ＹＦ_３、ＬａＦ_３）、酸化物（例えば、Ｙ_２Ｏ_３、ＺｒＯ_２）、および酸硫化物（例えば、Ｙ_２Ｏ_２Ｓ、Ｌａ_２Ｏ_２Ｓ）を含むが、それらに限定されない。好適なドーパントの実施例は、三価ランタニドイオン、ならびにエルビウム（Ｅｒ^３＋）、ツリウム（Ｔｍ^３＋）、ホルミウム（Ｈｏ^３＋）、プラセオジム（Ｐｒ^３＋）、ネオジム（Ｎｄ^３＋）、ジスプロシウム（Ｄｙ^３＋）、イッテルビウム（Ｙｂ^３＋）、および／またはサマリウム（Ｓｍ^３＋）等の遷移金属を含むが、それらに限定されない。別の実施例として、ＵＣＰは、その内容全体が参照することによって本明細書に組み込まれる、Ｒｉｕｔｔａｍａｋｉ， Ｔｅｒｈｉ， ＵＰＣＯＮＶＥＲＴＩＮＧ ＰＨＯＳＰＨＯＲ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ： Ｅｘｃｅｐｔｉｏｎａｌ Ｐｈｏｔｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｌｉｇｈｔ Ｕｐ Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ａｓｓａｙｓ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｕｒｋｕ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ （２０１１）によって説明されるように、利用されてもよい。別の実施例として、好適なＵＣＰは、Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ Ｍａｔｅｒｉａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ， ＵＳＡ）によって製造され、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｉｎｃ．（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ， ＵＳＡ）によって市販されているＳＵＮＳＴＯＮＥ（Ｒ） ＵＣＰナノ結晶であってもよい。

本明細書に開示される方法は、好適なサンプル分析装置の使用を伴って実装されてもよい。好適なサンプル分析装置の実施例が、図２−３Ｈを参照して以下で説明される。

図２は、いくつかの実施形態による、サンプル分析装置２００の実施例の概略図である。サンプル分析装置２００は、これらの用語が本明細書の他の場所で定義されているように、複数の被分析物を検出するようにサンプル上で多重化蛍光検出を行うために構成される。いくつかの実施形態では、サンプル分析装置２００は、ユーザが、行われる所望のタイプの光学測定、すなわち、ＴＲＦ測定だけでなく、他の蛍光ベースの測定、ならびに、例えば、ルミネセンス、吸光度、細胞画像化等の他のタイプの光学測定を選択することを可能にするように構成される。例えば、ユーザは、所望のタイプの蛍光測定を行うようにサンプル分析装置２００の光学部を再構成することが可能であり得る。したがって、いくつかの実施形態では、サンプル分析装置２００は、マルチモードリーダであってもよい。例えば、マルチモードリーダとして、サンプル分析装置２００は、ユーザが、いくつかの利用可能な異なるカートリッジの間で用途特有のカートリッジを選択し、所望の用途に特有の光学および電気回路を確立するようサンプル分析装置２００の中へ選択されたカートリッジを装填することを可能にすることによって、再構成可能であり得る。選択されたカートリッジは、サンプル分析装置２００に結合され、それによって、サンプル分析装置２００は、選択された実験を実施するために適切に構成される。カートリッジは、例えば、多重化ＴＲＦ検出等の特定のタイプの用途に特有である、またはそのために最適化される光学部を含有してもよい。カートリッジ内に収納される内部光学部は、カートリッジの筐体の光学ポートを通して、サンプル分析装置２００の筐体内に収納される外部光学部と通信してもよい。いくつかのカートリッジは、加えて、１つまたはそれを上回る内部光源および／または１つまたはそれを上回る光検出器を含んでもよい。カートリッジベースのマルチモードリーダの実施例は、その内容が参照することによってそれらの全体として本明細書に組み込まれる、米国特許第９，１８８，５２７号および第８，１１９，０６６号で説明される。

概して、光学ベースのサンプル分析器具の中に提供される種々の構成要素の構造および動作は、当業者によって理解され、したがって、本開示される主題の理解を促進するように、簡潔にのみ本明細書で説明される。図示される実施形態では、サンプル分析装置２００は、分析下の１つまたはそれを上回るサンプルを支持するために構成される、サンプル支持体２０４と、サンプルから発せられる放射光２１２を受光して測定するために構成される、光検出器２０８とを含む。サンプル上で光学測定を実施するための動作位置にあるときのサンプル支持体２０４、ならびに図２に図示される光検出器２０８および他の構成要素は、サンプル分析装置２００の装置筐体２０６に封入されてもよい。装置筐体２０６は、サンプル支持体２０４（および提供される場合はカートリッジ）を装填し、サンプル分析装置２００の内部領域にアクセスするため等の１つまたはそれを上回るパネル、ドア、引き出し等を含んでもよい。

概して、サンプル支持体２０４は、分析中に１つまたはそれを上回るサンプルを保持するために構成される、１つまたはそれを上回るコンテナであってもよい。非限定的実施例として、サンプル支持体２０４は、マルチウェルプレート（マイクロタイタープレート、マイクロプレート、または光学プレートとしても公知である）、１つまたはそれを上回るキュベット、個別のサンプルを含有するスポットまたはブロットを支持する基板等であってもよい。サンプル支持体２０４は、１つまたはそれを上回る軸に沿ってサンプル支持体２０４を移動させるために構成される、サンプルキャリア（またはサンプル支持体キャリア）２１０上に配置されてもよい。例えば、サンプルキャリア２１０は、手動作動型、半自動、または電動式ステージまたはプラットフォームであってもよい。サンプルキャリア２１０は、図２の矢印によって示されるように、装置筐体２０６の中へ、かつそこから外へ移動可能であり得る。サンプル、または１つまたはそれを上回るサンプルを含有するサンプル支持体２０４は、サンプルキャリア２１０上に搭載され得、その一方で、サンプルキャリア２１０は、例えば、サンプルキャリア２１０が少なくとも部分的に装置筐体２０６の外側に位置付けられる外側位置にあり得る。したがって、サンプルキャリア２１０はまた、サンプル支持体と見なされてもよい。次いで、サンプルキャリア２１０は、サンプルをサンプル分析装置２００の光学構成要素および／または液体取扱構成要素と整合させる（または複数のサンプルを逐次的に整合させる）よう、サンプルキャリア２１０が完全に装置筐体２０６の中に位置付けられる、内側位置まで移動させられてもよい。

種々の実施形態では、光検出器２０８の光学入力端は、典型的には、レンズを含む。出力端は、電力を提供し、光検出器２０８によって生成される測定信号が、サンプル分析装置２００を提供される、またはサンプル分析装置２００の外部にある信号処理回路（例えば、データ取得回路）に出力されることを可能にするように、電気コネクタ（例えば、接点、端子、ピン、ワイヤ支持体等）を含んでもよい。実施形態に応じて、光検出器２０８は、検出される発光波長に対する感度を最適化するように、必要に応じて、光電子増倍管（ＰＭＴ）、フォトダイオード、電荷結合素子（ＣＣＤ）、相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）デバイス等のアクティブピクセルセンサ（ＡＰＳ）等であってもよい。

典型的実施形態では、サンプル分析装置２００はさらに、サンプルから光検出器２０８に放射光２１２を伝達するために構成される、発光光学部２１６を含む。発光光学部２１６はまた、放射光２１２を処理するために構成されてもよい。処理の実施例は、収集、集束、平行化、フィルタ処理、ビーム操向、ビーム分割、および光学経路切替を含むが、それらに限定されない。したがって、実施形態に応じて、発光光学部２１６は、１つまたはそれを上回るレンズ、読取ヘッド、開口、フィルタ、光ガイド、鏡、ビームスプリッタ、モノクロメータ、回折格子、プリズム、光学経路スイッチ等を含んでもよい。発光光学部２１６は、サンプルの上方（例えば、上部読取ヘッド）および／またはサンプルの下方（例えば、底部読取ヘッド）から放射光２１２を受光するために構成されてもよい。

いくつかの実施形態では、サンプル分析装置２００はさらに、サンプルがサンプル分析装置２００の中に動作可能に位置付けられる前または後に、液体をサンプルに（例えば、選択されたウェルの中へ、またはサンプル支持体２０４の選択されたブロットの上に）添加するために構成される、液体分注システム２２０（例えば、注入器針、管類、ポンプ、リザーバ等）を含む。例えば、標識剤が、当業者によって理解されるように、蛍光、ルミネセンス、または他のタイプの測定のために、サンプルに添加されてもよい。いくつかの実施形態では、２つまたはそれを上回る異なるタイプの試薬が、添加されてもよい。

本明細書に開示される蛍光検出技法等の励起を要求する実施形態では、サンプル分析装置２００は、サンプルに指向される所望の波長の励起光２２８を生成するための１つまたはそれを上回る光源２２４を含む。実施形態に応じて、光源２２４は、広帯域光源（例えば、フラッシュランプ）、または１つまたはそれを上回る発光ダイオード（ＬＥＤ）、レーザダイオード（ＬＤ）、レーザ等を含んでもよい。ユーザが所望の励起波長を選択することを可能にするように、複数の光源２２４が提供されてもよい。典型的実施形態では、サンプル分析装置２００はさらに、光源２２４からサンプルに励起光２２８を伝達するために構成される、励起光学部２３２を含む。励起光学部２３２は、例えば、上記のように、１つまたはそれを上回るレンズ、読取ヘッド、開口、フィルタ、光ガイド、鏡、ビームスプリッタ、モノクロメータ、回折格子、プリズム、光学経路スイッチ等を含んでもよい。

光源２２４がＬＥＤ光源である、実施形態では、サンプル分析装置２００（またはサンプル分析装置２００に動作可能に結合されるカートリッジ）は、ＬＥＤ光源をパルス化することが可能である電子電流供給部、ＬＥＤ光源からの励起光の強度を変化させるための制御、および／またはＬＥＤ光源を安定させるために使用され得る、ＬＥＤ光源によって生成される励起光の強度を測定することが可能であるフォトダイオードを有してもよい。好ましいＬＥＤ光源は、Ｌｕｍｉｌｅｄｓ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ）、Ｌｕｘｅｏｎ Ｓｔａｒ， Ｎｉｃｈｉａ（Ｔｏｋｕｓｈｉｍａ， Ｊａｐａｎ）、およびＲｏｉｔｈｎｅｒ−Ｌａｓｅｒ（Ｖｉｅｎｎａ， Ａｕｓｔｒｉａ）から入手される。他の実施形態では、光源２２４は、キセノンフラッシュランプモジュールであってもよく、モジュールは、光源としてキセノンフラッシュランプを有し、パルス状光ビームを生成するように対応する電子機器を有する。キセノンフラッシュランプ等の広帯域光源を使用する場合において、光学システムは、励起光の波長を制御するための波長セレクタ、フィルタ、または同等物を含む。好ましいキセノンフラッシュランプモジュールは、Ｅｘｃｅｌｉｔａｓ（Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ）およびＨａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ（Ｊａｐａｎ）から入手される。

また、図２で概略的に図示されるように、サンプル分析装置２００はさらに、コンピューティングデバイス（またはシステムコントローラ）２３６を含んでもよい。当業者によって理解されるように、コンピューティングデバイス２３６は、サンプル分析装置２００の種々の機能的側面を制御、監視、および／または時間調整するため、および／または光検出器２０８からの測定信号等のデータまたは他の信号をサンプル分析装置２００から受信し、制御信号を光検出器２０８および／または他の構成要素に伝送するために構成される、１つまたはそれを上回るモジュールを表してもよい。全てのそのような目的のために、コンピューティングデバイス２３６は、コンピューティングデバイス２３６と光検出器２０８との間の鎖線によって描写されるように、有線または無線通信リンクを介してサンプル分析装置２００の種々の構成要素と通信してもよい。簡単にするために、コンピューティングデバイス２３６とサンプル分析装置２００の他の構成要素との間に存在し得る、他の通信リンクは、示されていない。典型的実施形態では、コンピューティングデバイス２３６は、全体的制御を提供する主要電子プロセッサを含み、かつ専用制御動作または具体的信号処理タスクのために構成される１つまたはそれを上回る電子プロセッサを含んでもよい。コンピューティングデバイス２３６はまた、データおよび／またはソフトウェアを記憶するための１つまたはそれを上回るメモリおよび／またはデータベースを含んでもよい。コンピューティングデバイス２３６はまた、本明細書に開示される方法のうちのいずれかを行うための命令を含む、コンピュータ可読媒体２３６を含んでもよい。コンピューティングデバイス２３６の機能モジュールは、回路または他のタイプのハードウェア（またはファームウェア）、ソフトウェア、または両方を備えてもよい。例えば、モジュールは、光検出器２０８から測定信号を受信するための信号処理（またはデータ取得）回路と、グラフィカルデータを生成するため等の測定信号を処理するためのソフトウェアとを含んでもよい。コンピューティングデバイス２３６はまた、ユーザ入力デバイス（例えば、キーパッド、タッチスクリーン、マウス、および同等物）、ユーザ出力デバイス（例えば、表示画面、プリンタ、視覚インジケータまたはアラート、可聴インジケータまたはアラート、および同等物）、ソフトウェアによって制御されるグラフィカルユーザインターフェース（ＧＵＩ）、および電子プロセッサによって可読である媒体（例えば、ソフトウェア、データ、および同等物で具現化される論理命令）をロードするためのデバイス等の１つまたはそれを上回るタイプのユーザインターフェースデバイスを表してもよい。コンピューティングデバイス２３６は、コンピューティングデバイス２３６の種々の機能を制御および管理するためのオペレーティングシステム（例えば、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）ソフトウェア）を含んでもよい。

いくつかの実施形態によると、分析システム２００を利用する光学測定を伴う実験が、以下のように実装されてもよい。サンプルは、サンプル分析装置２００の中に導入され、サンプル分析装置２００の光学部および他の構成要素に対して適切な動作位置に置かれる。概して、サンプルの「動作」位置は、「光学的に整合した」位置、すなわち、サンプルからの光学データ取得のために十分な光学経路を確立する位置である。実験に応じて、動作位置はまた、サンプル分析装置２００と「流体的に整合させられている」、すなわち、液体分注システム２２０を操作すること等によって、サンプル上に流体を分注することができるよう位置付けられている、サンプルに対応してもよい。サンプル導入は、マイクロプレートの１つまたはそれを上回るウェルまたは他のタイプのサンプル支持体２０４の中に１つまたはそれを上回るサンプルを装填するステップ（例えば、当業者によって理解されるように、ウェスタンブロット等のボッティング技法に従ってサンプルを調製するステップ）と、上記のようなサンプルキャリア２１０の使用等によって、サンプル分析装置２００の中にサンプル支持体２０４を装填または搭載するステップとを伴ってもよい。また、上記のように、サンプルおよび行われる測定のタイプに応じて、サンプルは、当業者によって理解されるように、サンプル分析装置２００の中に位置付けられることに先立って、調製または処理（培養、混合、均質化、遠心分離、緩衝、試薬添加、固相抽出等の分析分離、クロマトグラフィ、電気泳動等）を受けてもよい。

サンプル導入に加えて、サンプル分析装置２００またはそのある構成要素（光学部、電子機器等）は、行われる具体的タイプの測定を実装するために構成される必要があり得る。例えば、カートリッジベースである場合、適切なカートリッジ（または複数のカートリッジ）が、サンプル分析装置２００の中に設置されてもよい。カートリッジを設置した後、カートリッジの中に提供される光学部は、サンプル分析装置２００の筐体２０６内の光学回路の一部になる。例えば、カートリッジ光学部は、発光光学部２１６および光検出器２０８と、いくつかの実施形態では、また、励起光学部２３２および光源２２４と整合させられ（光学連通し）てもよい。カートリッジを設置することは、カートリッジに、および／またはそこから、電力、データ、ならびに制御信号を伝送するための電気経路を確立することをもたらす。

次いで、サンプルは、蛍光に関して、液体分注システム２２０を使用する試薬の添加、および／または光源２２４ならびに関連付けられる励起光学部２３２を使用する照射／励起を包含し得る、サンプルからの光子の放出を誘発するように、必要に応じて処理される。発光光学部２１６は、サンプルから放射光２１２を収集し、放射光２１２を光検出器２０８に指向する。光検出器２０８は、これらの光学信号を電気信号（検出器信号または測定信号）に変換し、上記で説明されるようなサンプル分析装置２００のコンピューティングデバイス２３６によって提供され得るように、電気信号を信号処理回路に伝送する。複数のサンプルの場合、サンプル支持体２０４は、各付加的サンプルを実験に利用されている光学部と連続的に整合させるように（上記で説明されるようなサンプルキャリア２１０を使用することによって等）移動させられてもよく、それによって、測定が、全てのサンプルから連続的に得られる。

上記のように、サンプル分析装置２００は、本明細書に開示される方法のうちのいずれかの全てまたは一部を実施するために利用されてもよい。故に、サンプル分析装置２００はまた、蛍光検出装置と称されてもよい。例えば、光源２２４は、サンプルに、サンプルの第１の蛍光標識を励起させるために最適化される第１の励起波長を有する、第１の励起信号、およびサンプルの第２の蛍光標識を励起させるために最適化される第２の励起波長を有する、第２の励起信号を照射するように操作されてもよい。光検出器２０８は、第１の励起信号による励起に応答して、第１の発光波長においてサンプルから発せられる第１の検出信号、および第２の励起信号による励起に応答して、第２の発光波長においてサンプルから発せられる第２の検出信号を測定するように操作されてもよい。これらの目的のために、いくつかの実施形態では、光源２２４は、少なくとも２つの離散光源を含んでもよく、および／または光検出器２０８は、少なくとも２つの離散光検出器を含んでもよい。

別の実施形態によると、多重化蛍光検出のための装置（または多重化蛍光検出装置）が提供される。ここで図３Ａを参照すると、多重化蛍光検出のための装置３００が示されている。サンプル３３２は、マイクロプレート、またはサンプルを支持する膜または基板等のサンプル支持体３３４上で、装置３００内に保持されてもよい。装置３００は、第１の励起光３２０を生成する第１の光源３１０と、第２の励起光３２２を生成する第２の光源３１２とを備える。装置３００は、図２と併せて上記で説明されるように、それぞれ、第１の励起光３２０および第２の励起光３２２をサンプル３３２に指向するための構成要素を有する、第１の励起光光学システム３２４および第２の励起光光学システム３２６を有する。第１の被分析物３３０および第２の被分析物３３１を含有するサンプル３３２は、第１の放射光３４０および第２の放射光３４２を発する。装置３００は、第１の放射光３４０を受光する第１の放射光光学システム３４４と、第２の放射光３４２を受光する第２の放射光光学システム３４６とを有する。次いで、第１の放射光光学システム３４４は、第１の放射光３４０を第１の検出器３５０に指向し、次いで、第２の放射光光学システム３４６は、第２の放射光３４２を第２の検出器３５２に指向する。前述の構成要素は、装置３００の主要装置筐体（例えば、図２に図示される装置筐体２０６）の中に位置付けられてもよい。

図３Ｂ−３Ｈは、いくつかの実施形態にしたがい、装置３００の種々の構成要素が、１つまたはそれを上回るカートリッジの内側または外側に含有されるものとして図示される、図３Ａに図示される装置３００の構成要素の概略図である。すなわち、そのようなカートリッジは、概して、装置３００の１つまたはそれを上回る構成要素を封入する（含有する）カートリッジ筐体を含んでもよい。そのようなカートリッジは、カートリッジが装置３００の主要装置筐体（例えば、図２に図示される装置筐体２０６）の内部に封入されるように、装置３００の中に装填または設置されてもよい。カートリッジベースのリーダの実施例は、上記で参照された米国特許第９，１８８，５２７号および第８，１１９，０６６号で説明される。

ここで図３Ｂを参照すると、装置３００はさらに、第１の励起光光学システム３２４と、第２の励起光光学システム３２６と、第１の放射光光学システム３４４と、第２の放射光光学システム３４６とを備える、カートリッジ３６０を備える。

ここで図３Ｃを参照すると、装置３００はさらに、第１の光源３１０と、第２の光源３１２と、第１の励起光光学システム３２４と、第２の励起光光学システム３２６とを備える、カートリッジ３６０を備える。

ここで図３Ｄを参照すると、装置３００はさらに、第１の放射光光学システム３４４と、第２の放射光光学システム３４６と、第１の検出器３５０と、第２の検出器３５２とを備える、カートリッジ３６０を備える。

ここで図３Ｅを参照すると、装置３００はさらに、第１の励起光光学システム３２４と、第１の光源３１０と、第１の放射光光学システム３４４と、第１の検出器３５０とを備える、カートリッジ３６０を備える。

ここで図３Ｆを参照すると、装置３００はさらに、第１の光源３１０と、第２の光源３１２と、第１の励起光光学システム３２４と、第２の励起光光学システム３２６と、第１の放射光光学システム３４４と、第２の放射光光学システム３４６と、第１の検出器３５０と、第２の検出器３５２とを備える、カートリッジ３６０を備える。

ここで図３Ｇを参照すると、装置３００はさらに、第１の光源３１０と、第１の励起光光学システム３２４と、第１の放射光光学システム３４４と、第１の光検出器３５０とを備える、第１のカートリッジ３６０を備える。装置３００はさらに、第２の光源３１２と、第２の励起光光学システム３２６と、第２の放射光光学システム３４６と、第２の光検出器３５２とを備える、第２のカートリッジ３７０を備える。代替実施形態では、第１のカートリッジ３６０は、示されるような第１の光源３１０および第１の光検出器３５０の両方を含有しなくてもよく、さらなる実施形態では、第１の光源３１０および第１の光検出器３５０は両方とも、第１のカートリッジ３６０の外部にあってもよい。同様に、第２のカートリッジ３７０は、示されるような第２の光源３１２および第２の光検出器３５２の両方を含有しなくてもよく、さらなる実施形態では、第２の光源３１２および第２の光検出器３５２は両方とも、第２のカートリッジ３７０の外部にあってもよい。

付加的被分析物に結合された少なくとも１つの付加的蛍光標識を伴う蛍光検出の方法に関して、装置およびシステムは、付加的蛍光標識の励起ならびに検出を行うために構成されるであろうことが、当業者に理解されるであろう。例えば、標識特有の励起波長において標識特有の励起光を生成するために構成される付加的光源、ならびに標識特有の励起光による励起に応答して、サンプルから発せられる標識特有の検出信号を測定するために構成される付加的光検出器が、使用され得る。付加的被分析物に結合された少なくとも１つの付加的蛍光標識が、異なる被分析物に結合された複数の異なる蛍光標識を備える場合、複数の異なる付加的光源および光検出器が、使用され得る。

実施例として、図３Ｈに図示される実施形態では、装置３００は、それぞれ、第１の励起光３２０および第２の励起光３２２を生成するために構成される、第１の光源３１０および第２の光源３１２に加えて、第３の励起光３２７を生成するために構成される、第３の光源３１３を含んでもよい。装置３００はまた、それぞれ、第１の被分析物３３０および第２の被分析物３３１から発せられる第１の検出信号３４０および第２の検出信号３４２を受信して測定するために構成される、第１の光検出器３５０および第２の光検出器３５２に加えて、サンプル３３２の第３の被分析物３３３から発せられる第３の検出信号３４３を受信して測定するために構成される、第３の光検出器３５３を含んでもよい。装置３００はまた、第１の励起光学部３２４および第２の励起光学部３２６に加えて、第３の励起光学部３２７を含んでもよい。装置３００はまた、第１の発光光学部３４４および第２の発光光学部３４６に加えて、第３の発光光学部３４７を含んでもよい。

本明細書に説明される他の実施形態のように、前述の構成要素のうちの１つまたはそれを上回るものは、装置３００の中に除去可能に設置され得る、１つまたはそれを上回るカートリッジ（図示せず）の中に提供されてもよい。本明細書に説明される他の実施形態のように、図３Ｈに示される装置３００は、異なる被分析物に結合された２つの異なる蛍光標識を採用する、二重測定に利用されてもよい。加えて、図３Ｈに示される装置３００は、異なる被分析物に結合された３つの異なる蛍光標識を採用する、三重測定に利用されてもよい。他の実施形態では、装置３００は、３つより多くの光源および／または３つより多くの光検出器を含んでもよい。

本明細書に説明される他の実施形態のように、装置２００はさらに、装置３００の種々の機能的側面を制御、監視、および／または時間調整し、光検出器からの検出信号等のデータまたは他の信号を装置３００から受信し、制御信号を光検出器および／または他の構成要素に伝送するために構成される、上記で説明され、図２で概略的に図示される、コンピューティングデバイス（またはシステムコントローラ）２３６等のコンピューティングデバイスを含んでもよい。例えば、二重実験では、コンピューティングデバイスは、所定の励起時間において、かつ所定の持続時間にわたって、それぞれ、第１の励起光３２０および第２の励起光３２２を生成するように、第１の光源３１０および第２の光源３１２を制御し、第１の測定時間において第１の検出信号３４０を測定するように第１の光検出器３５０を制御し、第１の測定時間と異なる第２の測定時間において第２の検出信号３４２を測定するように第２の光検出器３５２を制御するために構成されてもよい。コンピューティングデバイスはまた、第１の検出信号３４０および第２の検出信号３４２の測定に対応する、個別の光検出器３５０ならびに３５２からの電気出力を受信し、測定をサンプル３３２中の第１の被分析物３３０の量およびサンプル３３２中の第２の被分析物３３１の量と相関させるために構成されてもよい。コンピューティングデバイスはまた、第２の励起光３２２を生成することを中止するように第２の光源３１２を制御し、第２の励起光３２２を生成することを中止した後に、第２の検出信号３４２を測定するように第２の光検出器３５２を制御するために構成されてもよい。

別の実施例として、三重実験では、コンピューティングデバイスは、所定の励起時間において、かつ所定の持続時間にわたって、第３の励起光３２３を生成するように第３の光源３１３を制御し、第１の測定時間および第２の測定時間と異なる第３の測定時間において第３の検出信号３４３を測定するように第３の光検出器３５３を制御するために構成されてもよい。コンピューティングデバイスはまた、第３の励起光３２３を生成することを中止するように第３の光源３１３を制御し、第３の励起光３２３を生成することを中止した後に、第１の測定時間および第２の測定時間と異なる第３の測定時間において第３の検出信号３４３を測定するように第３の光検出器３５３を制御するために構成されてもよい。コンピューティングデバイスはまた、第３の検出信号３４３の測定に対応する、第３の光検出器３５３からの電気出力を受信し、測定をサンプル３３２中の第３の被分析物３３３の量と相関させるために構成されてもよい。

図２−３Ｈに図示される実施形態のうちのいずれかでは、装置３００のある構成要素は、１つより多くのチャネルに共通であり得る（またはそれらによって共有されてもよい）。したがって、提供される光源の数は、提供される光検出器の数、または励起または発光光学部のセットの数等と異なり得る。例えば、光検出器は、それが２つまたはそれを上回るチャネルを経由して伝送される信号を検出することに効果的であることを可能にする、波長感度の範囲を有してもよい。別の実施例として、発光光学部は、２つまたはそれを上回るチャネルを経由して伝送される検出信号をフィルタ処理するために効果的な波長帯域通過を有する、発光フィルタを含んでもよい。共通または共有構成要素を提供することは、装置３００のために要求される構成要素の総数と、それによって要求される全空間とを削減し得、装置３００および／または装置３００とともに利用されるカートリッジがよりコンパクトになることを可能にし得る。

代表的実施形態による、多重化蛍光検出のための方法の実施例が、ここで説明されるであろう。本明細書に説明される他の装置またはシステムもまた、本方法を実装するように構成され得るという理解の下で、本方法を実装するために利用され得る蛍光検出装置３００の実施例を図示するものとして、図３Ｈが主に参照される。

本方法によると、分析されるサンプル３３２が提供される。サンプル３３２は、第１の被分析物３３０に結合された第１の蛍光標識と、第２の被分析物３３１に結合された第２の蛍光標識とを含んでもよい。第１の蛍光標識は、アップコンバーティング蛍光体（ＵＣＰ）標識であってもよく、またはそれを含んでもよく、第２の蛍光標識は、非ＵＣＰ標識であってもよい、またはそれを含んでもよい。本明細書に説明されるように、ＵＣＰ標識は、反ストークスシフトを呈する、ランタニドをドープした、または遷移金属をドープした無機化合物であってもよく、またはそれを含んでもよく、非ＵＣＰ標識は、（正の）ストークスシフトを呈する、遷移金属キレートまたはランタニドキレートであってもよい、またはそれを含んでもよい。非限定的実施例として、非ＵＣＰ標識のストークスシフトは、２０ｎｍを上回ってもよい、または１００ｎｍを上回ってもよい、または２５０ｎｍを上回ってもよい、または約２５０ｎｍ〜約３５０ｎｍの範囲内であってもよい。

いくつかの実施形態では、本明細書の他の場所で説明されるように、サンプル３３２は、サンプル３３２を、第１の被分析物３３０に特異的に結合する第１の抗体と、第２の被分析物３３１に特異的に結合する第２の抗体と、第１の抗体に特異的に結合する第１の蛍光抗体複合体であって、第１の（ＵＣＰ）蛍光標識である、またはそれを含む、第１の蛍光抗体複合体と、第２の抗体に特異的に結合する第２の蛍光抗体複合体であって、第２の（非ＵＣＰ）蛍光標識である、またはそれを含む、第２の蛍光抗体複合体と接触させることによって、提供されてもよい。次いで、サンプル３３２は、抗体および抗体複合体が免疫複合体を形成することを可能にするための十分な条件下で、かつ十分な時間にわたって、培養されてもよい。

他の実施形態では、本明細書の他の場所で説明されるように、サンプル３３２は、サンプル３３２を、第１の被分析物に特異的に結合する第１の抗体と、第２の被分析物に特異的に結合する第２の抗体と接触させることによって、提供されてもよい。第１の蛍光標識は、第１の抗体に直接付着させられてもよく、および／または第２の蛍光標識は、第２の抗体に直接付着させられてもよい。

第１の蛍光標識は、第１の励起波長における第１の励起光３２０を照射される。それに応答して、第１の蛍光標識は、第１の発光波長における第１の検出信号３４０を発する。第２の蛍光標識は、第１の励起波長と異なる第２の励起波長における第２の励起光３２２を照射される。それに応答して、第２の蛍光標識は、第１の発光波長と異なり得る、第２の発光波長における第２の検出信号３４２を発する。本実施形態では、第１の励起波長は、近赤外範囲内であってもよく、第１の発光波長は、可視範囲内であってもよい。第２の励起波長は、紫外線範囲内であり、第２の発光波長は、第２の励起波長より長い。第１の蛍光標識の照射および第２の蛍光標識の照射は、同時に、または連続的に行われてもよい。

第１の検出信号３４０の強度が、第１の測定時間において測定される。第２の蛍光標識の照射が、中止され、その後に、第２の検出信号３４２の強度が、第１の測定時間と異なり得る、第２の測定時間において測定される。第１の検出信号３４０の強度は、サンプル３３２中の第１の被分析物３３０の量と相関性があり、第２の検出信号３４２の強度は、サンプル３３２中の第２の被分析物の量と相関性がある。発光光学部３４４、３４６、および３４７は、共通発光フィルタを通して、または異なる発光フィルタを通して、第１の検出信号３４０ならびに第２の検出信号３４２を指向するように構成されてもよい。

いくつかの実施形態では、本明細書の他の場所で説明されるように、ＵＣＰ標識は、長期発光寿命を有するかどうかにかかわらず、通常の蛍光技法に従って読取値を得る（または測定を行う）ために好適である。そのような場合において、第１の検出信号３４０の強度は、第１の蛍光標識を照射しながら測定されてもよい。他の実施形態では、本明細書の他の場所で説明されるように、ＵＣＰ標識は、ＴＲＦ技法に従って読取値を得ることによって活用される、長期発光寿命を有する。そのような場合において、第１の蛍光標識の照射が、中止され、その後に、第１の検出信号の強度が、測定される。いずれの場合にも、第１の測定時間および第２の測定時間は、相互と異なり得る。また、（ＵＣＰ標識の）第１の蛍光発光寿命および（非ＵＣＰ標識の）第２の蛍光発光寿命も、相互と異なり得る。非限定的実施例として、第２の蛍光発光寿命は、０．１マイクロ秒〜１０マイクロ秒の範囲内、または１００マイクロ秒〜１ミリ秒の範囲内であってもよい。

いくつかの実施形態では、本明細書の他の場所で説明されるように、第１の被分析物３３０および第２の被分析物３３１は、タンパク質または膜結合タンパク質である、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、被分析物３３０および３３１のうちの一方は、基準タンパク質であり、他方は、未知のタンパク質である。そのような場合において、いずれの被分析物３３０および３３１が基準タンパク質であるかに応じて、第２の検出信号３４２は、第１の検出信号３４０に正規化されてもよい、または第１の検出信号３４０は、第２の検出信号３４２に正規化されてもよい。さらなる実施形態では、被分析物３３０および３３１のうちの一方は、未修飾タンパク質であり、他方は、タンパク質の修飾またはリン酸化バージョンである。そのような場合において、未修飾タンパク質に対するタンパク質の修飾またはリン酸化バージョンの比は、第１の検出信号３４０および第２の検出信号３４２の測定された強度に基づいて計算されてもよい。

いくつかの実施形態では、本明細書の他の場所で説明されるように、複数のサンプルが、マルチウェルプレートの別個のウェル、または膜または他の好適な基板の別個のブロットの中等で提供される。本明細書に説明されるような多重化蛍光検出は、各サンプル上で、第１の蛍光標識を照射するステップ、第２の蛍光標識を照射するステップ、第１の検出信号３４０の強度を測定するステップ、および第２の検出信号３４２の強度を測定するステップを行うことによって、各サンプル上で行われてもよい。各サンプルは、（典型的には、連続的に）第１の光源３１０および第１の光検出器３５０と、そして、第２の光源３１２および第２の光検出器３５２と光学的に整合させられてもよい。選択された光源および光検出器とのサンプルの光学的整合は、カートリッジが光学的および／または電気的に蛍光検出装置３００と連通するように、蛍光検出装置３００の装置筐体の中に除去可能に設置されるカートリッジとのサンプルの光学的整合を伴ってもよい。本明細書の他の場所で説明されるように、カートリッジは、蛍光検出装置３００の１つまたはそれを上回る構成要素を封入してもよい。

他の実施形態では、本方法は、３つまたはそれを上回る異なる蛍光標識の使用に拡張されてもよく、本明細書に説明されるように、有意に低減した信号チャネルクロストーク等の利点を提供する、２つまたは異なる部類または群の蛍光標識（例えば、ＵＣＰ、ランタニドキレート、遷移金属キレート等）の組み合わせを利用してもよい。

三重蛍光検出のための方法の実施例として、サンプル３３２は、第３の被分析物３３３に結合された第３の蛍光標識を含む。抗体および抗体複合体、または直接結合が、実施形態に応じて行われてもよい。第３の被分析物３３３は、例えば、本明細書に説明されるように、タンパク質、膜結合タンパク質、基準タンパク質、未知のタンパク質、未修飾タンパク質、またはタンパク質の修飾またはリン酸化バージョンであってもよい。第３の蛍光標識は、第２の蛍光標識と異なる非ＵＣＰ標識であってもよい、またはそれを含んでもよい。例えば、第２の蛍光標識は、遷移金属キレートであってもよく、またはそれを含んでもよく、第３の蛍光標識は、ランタニドキレートであってもよい、またはそれを含んでもよい。

現在説明されている三重方法では、第３の蛍光標識は、第１の励起波長および第２の励起波長と異なる第３の励起波長における第３の励起光３２３を照射される。それに応答して、第３の蛍光標識は、第１の発光波長および第２の発光波長と異なり得る、第３の発光波長における第３の検出信号３４３を発する。次いで、第３の蛍光標識の照射が、中止され、その後に、第３の検出信号３４３の強度が、第１の測定時間および第２の測定時間と異なり得る、第３の測定時間において測定される。ＵＣＰ含有被分析物（第１の被分析物３３０）の測定が、上記で説明されるように、通常の蛍光またはＴＲＦによって取得されてもよい。

いくつかの実施形態では、第１の励起波長は、近赤外範囲内であり、第１の発光波長は、可視範囲内であり、第２の励起波長および第３の励起波長のうちの少なくとも１つは、紫外線範囲内である。いくつかの実施形態では、第１の蛍光標識のＵＣＰは、第１の蛍光発光寿命を有し、第２の蛍光標識は、第２の蛍光発光寿命を有し、第３の蛍光標識は、第３の蛍光発光寿命を有し、第１の蛍光発光寿命は、第２の蛍光発光寿命および第３の蛍光発光寿命と異なる。いくつかの実施形態では、第２の蛍光発光寿命は、第３の蛍光発光寿命よりも少なくとも５倍、または少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍、または少なくとも５００倍、または１，０００倍長い。

タンパク質検出および特性評価は、医薬ならびに臨床研究のための重要なタスクである。例えば、タンパク質検出および特性評価は、細胞中のタンパク質の上方および下方調節、細胞信号伝達中のリン酸化反応、ならびにトランスフェクトタンパク質の発現についての情報を提供することができる。複数の技法が、プレートリーダベースの酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、およびルミネセンス読み出しを利用するスポットまたはビーズベースの捕捉システムを含む、タンパク質分析のために開発されている。しかしながら、タンパク質の検出および定量化のための分析方法の改良が、疾患機構を理解することに役立つ、より良好なツールを提供するために重要である。

いくつかのルミネセンスプローブが、タンパク質の検出および分析を可能にするために開発されている。典型的には、プローブは、次いで、着目タンパク質に選択的に結合する一次または二次抗体に付着させられる。これらのプローブは、別の反応性分子（例えば、基質）またはある他の刺激物（例えば、電流）と接触させられるときに光を生成するであろう、電磁放射線または反応種を用いた励起に応じて光を生成する、蛍光分子であることができる。そのようなプローブは、周知の化学反応を通して、タンパク質、ヌクレオチド、または小分子に付着させられることができるため、万能である。サンプル中のタンパク質の相対量は、タンパク質定量化を行う能力につながる、プローブによって生成される光の量によって判定されることができる。そのようなプローブはまた、低分解能（１００〜１０００μＭ）スポットまたはブロットから高分解能（＜１μＭ）細胞内画像化まで、着目タンパク質の空間的場所を判定することも促進する。これらのプローブは、有機染料、無機化合物、蛍光タンパク質、または酵素であることができる。

化学発光（ＣＬ）は、生化学分析における、または表面結合および空間的に分離されたタンパク質上のタンパク質の検出のための一般的な方法である。後者の実施例は、ウェスタンブロット（ＷＢ）分析と称される、膜へのタンパク質の電気泳動転写を用いたドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の方法である（Ｔｏｗｂｉｎ ｅｔ ａｌ． （１９７９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ７６（９）：４３５０−４３５４、Ｒｅｎａｒｔ ｅｔ ａｌ． （１９７９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ７６（７）：３１１６−３１２０）。電気化学発光（ＥＣＬ）もまた、特別に設計されたマルチウェルプレート（例えば、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， ＬＬＣの小会社である、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， Ｍｄ．）製ＭＵＬＴＩ ＳＰＯＴ^（Ｒ）およびＭＵＬＴＩ−ＡＲＲＡＹ^ＴＭプレートならびにＳＥＣＴＯＲ^ＴＭ器具）内のスポットに結合されたタンパク質を検出するために適用されている。

ＣＬおよびＥＣＬの利点は、サブピコグラム／ｍｌ範囲内の溶液中のタンパク質のための検出の限界を伴う非常に高い感度である。しかしながら、これらのシステムは、一過性の信号を生成し、安定しておらず、検出のために要求される化学反応を生じるために複雑な手順を要求する。それらはまた、非線形システムであり（すなわち、１つのプローブが多くの光子を生成する）、不良な再現性を有するため、タンパク質量の定量化が所望される用途のために好適ではない。最後であるが有意な限界は、複数のＣＬ信号を多重化できないことである。それらの発光は、非常に広く、それは、同一の空間場所からの２つの異なるＣＬ発光を検出する能力を非常に困難にする。

蛍光（ＦＬ）プローブは、ＣＬの限界のうちのいくつかを克服する。それらは、励起光子と発光光子との間の関係が一般に線形であるため、より良好な定量化のための能力を提供する。それらはまた、他の反応性分子によるプローブへのアクセスを提供する必要性がないため、より万能である。一般に、ＦＬプローブはまた、概して、非反応性化学種であるため、特に光から保護されるときに、より安定している。おそらく、ＦＬプローブの最も重要な利点は、それらが多重化を行う能力を提供することである。ＦＬ分子は、広範囲の励起および発光帯を伴う多種多様な形態で現れる。したがって、同一の空間場所における２つ（またはそれを上回る）プローブは、独立して励起させられ、検出チャネルの間に最小限の重複（またはクロストーク）を伴って検出されることができる。同一の空間場所から最大４つの独立したフルオロフォアを検出する能力は、カラー帯域通過フィルタを使用して、定期的に報告される。より高いレベルの多重化が、フローサイトメトリおよびマルチスペクトル画像化を用いて報告されている（Ｓｔａｃｋ ｅｔ ａｌ． （２０１４） Ｍｅｔｈｏｄｓ ７０（１）：４６−５８、Ｐｅｒｆｅｔｔｏ ｅｔ ａｌ． （２００４） ４（８）：６４８−６５５）。

残念ながら、ＦＬプローブは、ＣＬと同一のレベルの感度を実証しておらず、典型的には、より低いダイナミックレンジを有する。ＦＬプローブを用いたより低い感度の理由は、共局在化物質の自己蛍光からの背景または他のプローブからの蛍光の干渉の存在である。異なる技法が、時間分解蛍光（ＴＲＦ）と呼ばれる、より長い寿命の蛍光プローブを使用して、自己蛍光からの背景を低減させるために開発された（Ｚｕｃｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ． （２００９） Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．． ８１（２２）：９４４９−９４５３、Ｋｅｍｐｅｒ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ． ２２（５）：８８１−８８９、Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２４５（２）：１８４−１９５、Ｈｕｈｔｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ． （２００５） Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ７７（８）：２６４３−２６４８、Ｖｅｒｅｂ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ． ７４（５）：２２１０−２２２２）。簡潔に述べると、自己蛍光は、典型的には、自己蛍光信号が次第に消えるまでＴＲＦ検出が時間的に遅延されるように、比較的短い寿命（＜２０ナノ秒）を有する。これは、技術的には時間ゲート検出であるが、一般的には時間分解と呼ばれている（Ｌａｋｏｗｉｃｚ， “Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，” ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ２００６）。ＴＲＦ検出の利益は、文書で十分に立証されており、より高い感度、より低い背景、およびより広いダイナミックレンジを含む（Ｅｌｉｓｅｅｖａ ＆ Ｂｕｎｚｌｉ （２０１０） Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｒｅｖ． ３９（１）：１８９−２２７、Ｂｕｎｚｌｉ ＆ Ｐｉｇｕｅｔ （２００５） Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｒｅｖ． ３４（１２）：１０４８−１０７７、Ｄｉａｍａｎｄｉｓ （１９９１） Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． ３７（９）：１４８６−１４９１）。

ＥｕおよびＴｂに基づく最も頻用されている実体とのランタニド配位錯体に基づいて、ＴＲＦプローブを開発して最適化するために、有意な努力が行われている（Ｋｅｍｐｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｊ． Ｂｉｏｍｏｌ． Ｓｃｒｅｅｎ． ４（６）：３０９−３１４、Ｌｏｐｅｚ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． ３９（２）：１９６−２０１、Ｄｅｇｏｒｃｅ ｅｔ ａｌ． （２００９） Ｃｕｒｒ． Ｃｈｅｍ． Ｇｅｎｏｍｉｃｓ． ３：２２−３２）。これらのプローブは、膜以外に広範囲の用途を有し、組織切片中および生体細胞中のタンパク質の検出のための良好な感度を示している（Ｓｕ ｅｔ ａｌ． （２００５） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３４７（１）：８９−９３、Ｇａｈｌａｕｔ ＆ Ｍｉｌｌｅｒ （２０１０） Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ａ． Ｄｅｃ ２０１０；７７（１２）：１１１３−１１２５）。種々の器具が、特に２次元アレイ用のＴＲＦの測定のために開発されている。ランタニドプローブは、紫外線（ＵＶ）励起とともに標準カメラシステムを使用して、画像化されることができるが、報告された感度は、ナノグラムのタンパク質範囲内にすぎない（Ｋｅｍｐｅｒ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ． ２２（５）：８８１−８８９）。感度の改良は、細断またはパルス状高強度紫外線光源とともに時間ゲートカメラを使用することによって、行われることができる（Ｇａｈｌａｕｔ ＆ Ｍｉｌｌｅｒ （２０１０） Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ａ． ７７（１２）：１１１３−１１２５）。しかしながら、これは、計装の全体的コストを増加させる。スポット走査システムが、パルス状紫外線レーザおよび時間ゲート光子計数を使用して開発された（Ｚｕｃｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ． （２００９） Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ８１（２２）：９４４９−９４５３）。ドットブロットおよびウェスタンブロットの両方のための優れた感度、ならびに化学発光および蛍光と比較して拡張したダイナミックレンジが、報告された。

我々は、ＴＲＦ染色で標識された膜結合タンパク質の検出および定量化のための能力を実証している。膜は、着目タンパク質に特異的に結合するユーロピウムキレート標識二次抗体またはストレプトアビジンを用いて培養される。ユーロピウム（Ｅｕ）は、約１ミリ秒の長い蛍光寿命を有し、検出は、短い寿命の発光の自己蛍光または他の源からの背景を有意に低減させる、５０マイクロ秒遅延を伴う時間分解蛍光（ＴＲＦ）モードで行われる（図４Ａおよび図４Ｂ参照）。図４Ａは、いくつかの実施形態では、ＷＢ検出のために特異的に構成されるカートリッジを利用し得る、ＳｃａｎＬａｔｅｒ^ＴＭウェスタンブロット検出システム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ， ＬＬＣ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡ））を使用する、ＴＲＦ検出の方法の一非限定的実施例の概略図である。既存の一次抗体４０１が、着目タンパク質４０２に結合する。次いで、Ｅｕ標識二次抗体４０３が、一次抗体４０１に結合する。次いで、ＳｃａｎＬａｔｅｒ^ＴＭシステムが、検出（測定）４０４に利用される。ＳｃａｎＬａｔｅｒ^ＴＭシステム以外の検出システムが利用されてもよいことが理解されるであろう。図４Ｂは、ＴＲＦ検出の原理を図示する概略図である。図４Ｂは、時間が励起パルスの開始に対応する０である、時間の関数としてランプ励起パルスおよび蛍光減衰の強度をプロットする。図４Ｂはまた、先行励起パルスに対して測定が行われ得る、時間期間も示す。

膜は、プレートリーダシステムの中へ置かれ、そこで、ＷＢ走査のために最適化されたフラッシュランプベースのＴＲＦカートリッジを用いて走査される。フラッシュランプは、感度を維持しながら、以前に報告されたパルス状紫外線レーザシステムと比較して、システムのコストを削減する（Ｚｕｃｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ． （２００９）， Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ８１（２２）：９４４９−９４５３）。本方法は、酵素検出を伴わず、Ｅｕキレートが光漂白に耐性を示すため、信号が長い時間期間（数週間から数ヶ月）にわたって安定したままである。これは、膜の反復読取と、より正確な定量化のための既知の標準との帯強度の比較の潜在性とを可能にする。

ＴＲＦ検出は、光子計数を採用する。故に、理論的ダイナミックレンジは、＞１０^５である。実践では、ダイナミックレンジは、高存在量帯上の結合部位の飽和および背景膜への非特異的結合によって限定される。また、化学発光または蛍光検出で起こり得るような高強度光による飽和からのカメラ「ブルーミング」がなく、したがって、本システムは、鮮明な帯域および優れた画質を生じる。本システムは、高い感度、広いダイナミックレンジ、および長期安定性を伴う膜結合タンパク質分析のための無基質環境を提供する。これは、改良された定量化と、参照のため、または器具標準としてサンプルを再走査する能力とを可能にすることによって、現在のシステムに優る利点を提供する。

グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の３倍連続希釈が、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ^（Ｒ）Ｐａｒａｄｉｇｍ^（Ｒ）マルチモード検出プラットフォーム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ， ＬＬＣ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡ））によって走査されるようなＳｃａｎＬａｔｅｒ^ＴＭのダイナミックレンジを実証するために使用された（図５Ａ参照）。ＧＳＴタンパク質の検出のために、ビオチン標識ウサギ抗ＧＳＴ一次抗体が使用された。ＳｃａｎＬａｔｅｒ^ＴＭＥｕ標識ストレプトアビジンが、検出に使用された。ブロットは、洗浄され、乾燥させられ、走査された。本システムは、ＧＳＴの量と対比した信号の肯定的反応の４ログ超を伴うＧＳＴのサブピコグラム検出限界を実証した（図５Ｂ参照）。図５Ａは、ＧＳＴ希釈系列の画像であり、図５Ｂは、１０回の異なるウェスタンブロットの平均にわたる個々の帯域からの積分強度のグラフである。

ＣＬおよびＦＬ検出方法の限界は、信号安定性を含む。典型的ＣＬ試薬の場合、信号は、５〜２０分にわたって安定し、その後、基質が使い尽くされ、帯強度が減少する。ＦＬに関して、有機フルオロフォアは、適切な条件に保たれるときにより安定しているが、光漂白の傾向があり、信号は、励起光への反復暴露後に減衰するであろう。ＴＲＦ検出は、これらの限界の両方を回避し、改良された安定性能を提供する。長期安定性を示すために、ＧＳＴの３倍連続希釈が、５７日間にわたって、信号安定性を実証するために使用された。ＷＢが、前述のように調製され、調製の直後（第１日目）、次いで、周囲条件下で暗環境内に貯蔵してから５７日後に測定された。図６は、ＳｃａｎＬａｔｅｒ^ＴＭカートリッジとともにＳｐｅｃｔｒａＭａｘ^（Ｒ）Ｐａｒａｄｉｇｍ^（Ｒ）リーダを使用して、経時的なウェスタンブロット結果の安定性を示す、グラフである。２つの走査が、背景にわたる平均帯強度について分析され、結果が、図６に提示されている。ＷＢの劣化または信号の減少は、貯蔵から５７日後には観察されなかった。

光漂白の効果を研究するために、トランスフェリンの２倍連続希釈とともに発現されたＷＢが、反復読取を受けた。図７は、ウェスタンブロット上の単一の帯域の反復走査後のＴＲＦ試薬の光漂白の欠如を示す、グラフである。走査毎に、積分強度（「Ｉｎｔ．Ｄｅｎｓｉｔｙ」）を示すバーが、右側にある。２５０ｐｇ帯からの平均強度が、走査毎に測定され、結果が、図７に示されている。信号強度の系統的減少が観察されず、ＴＲＦ試薬の光漂白が問題ではなかったことを示す。

ＴＲＦの多重化が、多少の成功とともに報告されている。ＥｕおよびＴｂベースのプローブの使用が、２つの異なるタンパク質を検出するために時間分解蛍光共鳴エネルギー移動（ＴＲ−ＦＲＥＴ）を使用した生化学検定において実証されている（Ｄｅｇｏｒｃｅ ｅｔ ａｌ． （２００９） Ｃｕｒｒ． Ｃｈｅｍ． Ｇｅｎｏｍｉｃｓ． ３：２２−３２、Ｂｏｏｋｏｕｔ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｊ． Ａｇｒｉｃ． Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ． ４８（１２）：５８６８−５８７３、Ｈａｍｙ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｊ． Ｂｉｏｍｏｌ． Ｓｃｒｅｅｎ． ６（３）：１７９−１８７）。加えて、ＥｕおよびＳｍ、ならびにＥｕ、Ｔｂ、およびＳｍを用いた多重化の報告も存在している（Ｂａｄｏｒ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． ３３（１）：４８−５１、Ｈｅｉｎｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． ４３（７）：１１４２−１１５０）。これらのシステムのための分析方式は、励起のための単一のカラー帯域通過フィルタおよび複数の発光帯域通過フィルタとともに、フラッシュランプを使用する。

上記で説明される従来技術のこれらのシステムは、ランタニドのうちの１つからの発光が他のランタニドの検出チャネルの中へ漏出するにつれて、クロストークに悩まされる。実践では、良好な分離は、ランタニドスペクトル内の発光ピークの存在量のため、比のうちの１つのみでしか達成されることができない。例えば、ＥｕおよびＴｂを用いると、Ｔｂチャネル内に最小限のＥｕ信号しかないが、Ｅｕチャネルの中へのＴｂクロストークは、１０％も高くあり得る。Ｅｕチャネルの中へのＳｍクロストークがないが、Ｓｍチャネルの中への有意な（＞１０％）Ｅｕクロストークがある場合、ＥｕおよびＳｍが逆転される。これは、これらの方法の有用性を、１つだけの真に敏感なチャネルを有することに限定する一方で、他方は、第２の種からの背景信号によって限定される。Ｅｕ、Ｔｂ、およびＳｍドットブロット用のこれらの実施例が、図８ならびに図９に示されている。図８は、ユーロピウム（Ｅｕ）およびテルビウム（Ｔｂ）ベースのプローブのための検出チャネルの間のクロストーク発光を比較する、ドットブロット結果を示す。図９は、ユーロピウム（Ｅｕ）およびサマリウム（Ｓｍ）ベースのプローブのための検出チャネルの間のクロストーク発光を比較する、ドットブロット結果を示す。

本明細書の他の場所で説明されるように、本発明のある側面は、ＴＲＦ検出を使用して長い寿命の蛍光染料を多重化する新規の方法に関する。我々は、複数の染色からの検定において信号を分離する能力を増進するために、蛍光発光におけるスペクトルおよび時間差の組み合わせを使用した。いくつかの実施形態では、これは、多重化ウェスタンブロット検出方式においてルテニウム（Ｒｕ）およびユーロピウム（Ｅｕ）標識の組み合わせを用いた実践に要約されたが、免疫学的検定、タンパク質アレイ、および他の多重化生物学的検定への適用も有する。Ｒｕは、タンパク質、ＤＮＡ、および他の化合物の検出のための染料として使用されているが、その長い寿命は、より短い寿命の信号を除去する分析システムを作成するために使用されている（Ｄｅｍａｓ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ７１（２３）：７９３Ａ−８００Ａ、Ｂｅｒｇｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２７６（２）：１２９−１４３、Ｕｌｌｍｅｒ ｅｔ ａｌ． （２０１２） Ｂｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． １６７（７）：１４４８−１４６６）。しかしながら、多重化システムにおいて、ＲｕおよびＥｕまたは他の非常に長い寿命のランタニドを組み合わせることの報告は存在していない。

我々が開発した解決策は、１％を下回るまで、より具体的には、０．０１％を下回るまで、クロストークを低減させるように、ＴＲＦ染料の間の時間ドメインおよび波長ドメイン差を両方とも活用する。時間的分離：その半減期が約１マイクロ秒であるＲｕは、より短い時間積分（２マイクロ秒）で検出され、その半減期が約８００マイクロ秒であるＥｕは、より長い時間積分（１０００マイクロ秒）で検出される。スペクトル分離：Ｒｕは、４７０ｎｍにおいて励起させられ、６２４ｎｍにおいて検出され、Ｅｕは、３７０ｎｍにおいて励起させられ、６１６ｎｍにおいて検出される。

図１０は、ユーロピウム（Ｅｕ）およびルテニウム（Ｒｕ）ベースのプローブを用いて検出チャネルの間のクロストーク発光を比較する、ＧＳＴ希釈系列のウェスタンブロット結果を示す。これらの走査は、レーザダイオード励起を使用するカートリッジを用いて得られた。

図１１は、図１０に示されるウェスタンブロット上のレーンを通した平均ライン走査を示す、グラフである。ＧＳＴ Ｅｕ−Ｅｕカートリッジ用のライン走査は、１１０１と標識され、ＧＳＴ Ｅｕ−Ｒｕカートリッジ用のライン走査は、１１０２と標識され、ＧＳＴ Ｒｕ−Ｒｕカートリッジ用のライン走査は、１１０３と標識され、ＧＳＴ Ｒｕ−Ｅｕカートリッジ用のライン走査は、１１０４と標識される。

これらの結果は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ^（Ｒ）Ｐａｒａｄｉｇｍ^（Ｒ）リーダ内の２つの異なるカートリッジを用いて得られたが、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ^（Ｒ）Ｐａｒａｄｉｇｍ^（Ｒ）およびＳｐｅｃｔｒａＭａｘ^（Ｒ）ｉ３マルチモードマイクロプレートリーダ検出プラットフォームシステム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ， ＬＬＣ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡ））の両方で稼働する単一のカートリッジにも拡張されることができる。

例示的実施形態

本開示される主題に従って提供される例示的実施形態は、以下を含むが、それらに限定されない。
１．多重化蛍光検出のための方法であって、
第１の被分析物に結合された第１の蛍光標識と、第２の被分析物に結合された第２の蛍光標識とを備える、サンプルを提供するステップであって、第１の蛍光標識は、アップコンバーティング蛍光体（ＵＣＰ）を備え、第２の蛍光標識は、非ＵＣＰ標識を備える、ステップと、第１の蛍光標識に第１の励起波長における第１の励起光を照射するステップであって、第１の蛍光標識は、第１の発光波長における第１の検出信号を発する、ステップと、第２の蛍光標識に第１の励起波長と異なる第２の励起波長における第２の励起光を照射するステップであって、第２の蛍光標識は、第２の発光波長における第２の検出信号を発する、ステップと、第１の測定時間において第１の検出信号の強度を測定するステップであって、第１の検出信号の強度は、サンプル中の第１の被分析物の量と相関性がある、ステップと、

第２の蛍光標識を照射することを中止するステップと、第２の蛍光標識を照射することを中止した後に、第２の測定時間において第２の検出信号の強度を測定するステップであって、第２の検出信号の強度は、サンプル中の第２の被分析物の量と相関性がある、ステップとを含む、方法。

２．第１の蛍光標識を照射しながら、第１の検出信号の強度を測定するステップを含む、実施形態１に記載の方法。

３．第１の蛍光標識を照射することを中止するステップと、第１の蛍光標識を照射することを中止した後に、第１の検出信号の強度を測定するステップとを含む、実施形態１に記載の方法。

４．サンプルは、第３の被分析物に結合された第３の蛍光標識を備え、第３の蛍光標識は、第２の蛍光標識と異なる非ＵＣＰ標識を備え、本方法はさらに、第３の蛍光標識に第１の励起波長および第２の励起波長と異なる第３の励起波長における第３の励起光を照射するステップであって、第３の蛍光標識は、第３の発光波長における第３の検出信号を発する、ステップと、第３の蛍光標識を照射することを中止するステップと、第３の蛍光標識を照射することを中止した後に、第３の測定時間において第３の検出信号の強度を測定するステップとを含む、前記実施形態のうちのいずれかに記載の方法。

５．第１の蛍光標識を照射しながら、第１の検出信号の強度を測定するステップを含む、実施形態４に記載の方法。

６．第１の蛍光標識を照射することを中止するステップと、第１の蛍光標識を照射することを中止した後に、第１の検出信号の強度を測定するステップとを含む、実施形態４に記載の方法。

７．第２の蛍光標識は、遷移金属キレートを備え、第３の蛍光標識は、ランタニドキレートを備える、実施形態４〜６のいずれかに記載の方法。

８．第２の蛍光標識は、ルテニウム（Ｒｕ（ＩＩ））、オスミウム（Ｏｓ（ＩＩ））、およびレニウム（Ｒｅ（Ｉ））の遷移金属キレートから成る群から選択される、遷移金属キレートを備え、第３の蛍光標識は、サマリウム（Ｓｍ（ＩＩＩ））、ジスプロシウム（Ｄｙ（ＩＩＩ））、ユーロピウム（Ｅｕ（ＩＩＩ））、およびテルビウム（Ｔｂ（ＩＩＩ））のランタニドキレートから成る群から選択される、ランタニドキレートを備える、実施形態４〜６のいずれかに記載の方法。

９．第１の励起波長は、近赤外範囲内であり、第１の発光波長は、可視範囲内であり、第２の励起波長および第３の励起波長のうちの少なくとも１つは、紫外線範囲内である、実施形態４〜８のいずれかに記載の方法。

１０．第１の蛍光標識のＵＣＰは、第１の蛍光発光寿命を有し、第２の蛍光標識は、第２の蛍光発光寿命を有し、第３の蛍光標識は、第３の蛍光発光寿命を有し、第１の蛍光発光寿命は、第２の蛍光発光寿命および第３の蛍光発光寿命と異なる、実施形態４〜９のいずれかに記載の方法。

１１．第１の蛍光標識のＵＣＰは、第１の蛍光発光寿命を有し、第２の蛍光標識は、第２の蛍光発光寿命を有し、第３の蛍光標識は、第３の蛍光発光寿命を有し、第２の蛍光発光寿命は、少なくとも５倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、および少なくとも１０００倍から成る群から選択される倍数だけ第３の蛍光発光寿命より長い、実施形態４〜９のいずれかに記載の方法。

１２．第１の蛍光標識のＵＣＰは、第１の蛍光発光寿命を有し、第２の蛍光標識は、第２の蛍光発光寿命を有し、第２の蛍光発光寿命および第３の発光寿命のうちの少なくとも１つが０．１マイクロ秒〜１０マイクロ秒の範囲内であること、ならびに第２の蛍光発光寿命および第３の発光寿命のうちの少なくとも１つが１００マイクロ秒〜１ミリ秒の範囲内であることのうちの少なくとも１つを含む、実施形態４〜９のいずれかに記載の方法。

１３．第２の蛍光標識および第３の蛍光標識のうちの少なくとも１つは、２０ｎｍを上回るストークスシフト、１００ｎｍを上回るストークスシフト、２５０ｎｍを上回るストークスシフト、および約２５０ｎｍ〜約３５０ｎｍの範囲内のストークスシフトから成る群から選択される、ストークスシフトを有する、実施形態４〜１２のいずれかに記載の方法。

１４．第２の発光波長は、第１の発光波長と異なる、実施形態４〜１３のいずれかに記載の方法。

１５．第２の測定時間は、第１の測定時間と異なる、実施形態４〜１４のいずれかに記載の方法。

１６．第３の発光波長は、第１の発光波長および第２の発光波長と異なる、実施形態４〜１５のいずれかに記載の方法。

１７．第３の測定時間は、第１の測定時間および第２の測定時間と異なる、実施形態４〜１６のいずれかに記載の方法。

１８．サンプルを提供するステップは、サンプルを、第１の被分析物に特異的に結合する第１の抗体と、第２の被分析物に特異的に結合する第２の抗体と、第３の被分析物に特異的に結合する第３の抗体と、第１の抗体に特異的に結合する第１の蛍光抗体複合体であって、第１の蛍光抗体複合体は、第１の蛍光標識を備える、第１の蛍光抗体複合体と、第２の抗体に特異的に結合する第２の蛍光抗体複合体であって、第２の蛍光抗体複合体は、第２の蛍光標識を備える、第２の蛍光抗体複合体と、第３の抗体に特異的に結合する第３の蛍光抗体複合体であって、第３の蛍光抗体複合体は、第３の蛍光標識を備える、第３の蛍光抗体複合体と接触させるステップと、抗体および抗体複合体が免疫複合体を形成することを可能にするための十分な条件下で、かつ十分な時間にわたって、サンプルを培養するステップとを含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法。

１９．サンプルを提供するステップは、サンプルを、第１の被分析物に特異的に結合する第１の抗体と、第２の被分析物に特異的に結合する第２の抗体と、第３の被分析物に特異的に結合する第３の抗体と接触させるステップを含み、第１の蛍光標識、第２の蛍光標識、および第３の蛍光標識のうちの少なくとも１つは、個別の第１の抗体、第２の抗体、または第３の抗体に直接付着させられる、実施形態４〜１７のいずれかに記載の方法。

２０．第１の被分析物、第２の被分析物、および第３の被分析物は、タンパク質または膜結合タンパク質を備える、前記実施形態のいずれかに記載の方法。

２１．第１の被分析物、第２の被分析物、および第３の被分析物のうちの少なくとも１つは、基準タンパク質であり、第１の被分析物、第２の被分析物、および第３の被分析物のうちの少なくとも１つの他方は、未知のタンパク質であり、未知のタンパク質から取得される検出信号を基準タンパク質から取得される検出信号に正規化するステップをさらに含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法。

２２．第１の被分析物、第２の被分析物、および第３の被分析物のうちの少なくとも１つは、未修飾タンパク質であり、第１の被分析物、第２の被分析物、および第３の被分析物のうちの少なくとも１つの他方は、タンパク質の修飾またはリン酸化バージョンであり、未修飾タンパク質およびタンパク質の修飾またはリン酸化バージョンから取得される検出信号の測定された強度に基づいて、未修飾タンパク質に対するタンパク質の修飾またはリン酸化バージョンの比を計算するステップをさらに含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法。

２３．共通発光フィルタを通して、第１の検出信号、第２の検出信号、および第３の検出信号のうちの少なくとも２つを指向するステップを含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法。

２４．ＵＣＰは、反ストークスシフトを呈する、ランタニドをドープした、または遷移金属をドープした無機化合物を備える、前記実施形態のいずれかに記載の方法。

２５．無機化合物は、エルビウム（Ｅｒ^３＋）、ツリウム（Ｔｍ^３＋）、ホルミウム（Ｈｏ^３＋）、プラセオジム（Ｐｒ^３＋）、ネオジム（Ｎｄ^３＋）、ジスプロシウム（Ｄｙ^３＋）、イッテルビウム（Ｙｂ^３＋）、サマリウム（Ｓｍ^３＋）、および前述のうちの２つまたはそれを上回るものの組み合わせから成る群から選択される、ドーパントイオンを備える、実施形態２４に記載の方法。

２６．無機化合物は、ハロゲン化物、酸化物、および酸硫化物から成る群から選択される、実施形態２４または２５に記載の方法。

２７．第２の蛍光標識は、遷移金属キレートまたはランタニドキレートを備える、前記実施形態のいずれかに記載の方法。

２８．第２の蛍光標識は、ルテニウム（Ｒｕ（ＩＩ））、オスミウム（Ｏｓ（ＩＩ））、およびレニウム（Ｒｅ（Ｉ））の遷移金属キレートから成る群から選択される、遷移金属キレートを備える、前記実施形態のいずれかに記載の方法。

２９．第２の蛍光標識は、サマリウム（Ｓｍ（ＩＩＩ））、ジスプロシウム（Ｄｙ（ＩＩＩ））、ユーロピウム（Ｅｕ（ＩＩＩ））、およびテルビウム（Ｔｂ（ＩＩＩ））のランタニドキレートから成る群から選択される、ランタニドキレートを備える、前記実施形態のいずれかに記載の方法。

３０．第１の励起波長は、近赤外範囲内であり、第１の発光波長は、可視範囲内である、前記実施形態のいずれかに記載の方法。

３１．第２の励起波長は、紫外線範囲内であり、第２の発光波長は、第２の励起波長よりも長い、前記実施形態のいずれかに記載の方法。

３２．第１の蛍光標識のＵＣＰは、第１の蛍光発光寿命を有し、第２の蛍光標識は、第２の蛍光発光寿命を有し、第１の蛍光発光寿命は、第２の蛍光発光寿命と異なる、前記実施形態のいずれかに記載の方法。

３３．第１の蛍光標識のＵＣＰは、第１の蛍光発光寿命を有し、第２の蛍光標識は、第２の蛍光発光寿命を有し、第２の蛍光発光寿命が０．１マイクロ秒〜１０マイクロ秒の範囲内であることと、第２の蛍光発光寿命が１００マイクロ秒〜１ミリ秒の範囲内であることとのうちの少なくとも１つを含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法。

３４．第２の蛍光標識は、２０ｎｍを上回るストークスシフト、１００ｎｍを上回るストークスシフト、２５０ｎｍを上回るストークスシフト、および約２５０ｎｍ〜約３５０ｎｍの範囲内のストークスシフトから成る群から選択される、ストークスシフトを有する、前記実施形態のいずれかに記載の方法。

３５．第２の発光波長は、第１の発光波長と異なる、前記実施形態のいずれかに記載の方法。

３６．第２の測定時間は、第１の測定時間と異なる、前記実施形態のいずれかに記載の方法。

３７．サンプルを提供するステップは、サンプルを、第１の被分析物に特異的に結合する第１の抗体と、第２の被分析物に特異的に結合する第２の抗体と、第１の抗体に特異的に結合する第１の蛍光抗体複合体であって、第１の蛍光抗体複合体は、第１の蛍光標識を備える、第１の蛍光抗体複合体と、第２の抗体に特異的に結合する第２の蛍光抗体複合体であって、第２の蛍光抗体複合体は、第２の蛍光標識を備える、第２の蛍光抗体複合体と接触させるステップと、抗体および抗体複合体が免疫複合体を形成することを可能にするための十分な条件下で、かつ十分な時間にわたって、サンプルを培養するステップとを含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法。

３８．サンプルを提供するステップは、サンプルを、第１の被分析物に特異的に結合する第１の抗体と、第２の被分析物に特異的に結合する第２の抗体と接触させるステップを含み、第１の蛍光標識は、第１の抗体に直接付着させられる、または第２の蛍光標識は、第２の抗体に直接付着させられる、または前述の両方である、実施形態１〜３６のいずれかに記載の方法。

３９．第１の被分析物および第２の被分析物は、タンパク質または膜結合タンパク質を備える、前記実施形態のいずれかに記載の方法。

４０．第１の被分析物および第２の被分析物のうちの一方は、基準タンパク質であり、第１の被分析物および第２の被分析物のうちの他方は、未知のタンパク質であり、第２の検出信号を第１の検出信号に正規化するステップ、または第１の検出信号を第２の検出信号に正規化するステップをさらに含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法。

４１．第１の被分析物および第２の被分析物のうちの一方は、未修飾タンパク質であり、第１の被分析物および第２の被分析物のうちの他方は、タンパク質の修飾またはリン酸化バージョンであり、第１の検出信号および第２の検出信号の測定された強度に基づいて、未修飾タンパク質に対するタンパク質の修飾またはリン酸化バージョンの比を計算するステップをさらに含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法。

４２．共通発光フィルタを通して、または異なる発光フィルタを通して、第１の検出信号および第２の検出信号を指向するステップを含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法。

４３．第１の蛍光標識を照射するステップおよび第２の蛍光標識を照射するステップは、同時に、または連続的に行われる、前記実施形態のいずれかに記載の方法。

４４．サンプルを提供するステップは、複数のサンプルを提供するステップを含み、各サンプル上で、第１の蛍光標識を照射するステップ、第２の蛍光標識を照射するステップ、第１の検出信号の強度を測定するステップ、および第２の検出信号の強度を測定するステップを行うことによって、各サンプル上で多重化蛍光検出を行うステップをさらに含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法。

４５．各サンプル上で多重化蛍光検出を行うステップは、個別のサンプルを、第１の励起光および第２の励起光を生成するために構成される光源、ならびに第１の検出信号および第２の検出信号を測定するために構成される光検出器と光学的に整合させるステップを含む、実施形態４４に記載の方法。

４６．個別のサンプルを光源および光検出器と光学的に整合させるステップは、個別のサンプルをカートリッジと光学的に整合させるステップを含み、カートリッジは、カートリッジが光学的および／または電気的に蛍光検出装置と通信するように、蛍光検出装置の装置筐体の中に除去可能に設置され、カートリッジは、光源から整合したサンプルまでの光学経路を画定する励起光学部、または整合したサンプルから光検出器までの光学経路を画定する発光光学部、または前述の両方を封入し、光源は、カートリッジの中または装置筐体の中に配置され、光検出器は、カートリッジの中または装置筐体の中に配置される、実施形態４５に記載の方法。

４７．サンプルは、それぞれ、マルチウェルプレートの別個のウェルまたは膜の別個のブロットの中に配置される、実施形態４４〜４６のいずれかに記載の方法。

４８．少なくとも、前記実施形態のうちのいずれかの方法の照射するステップおよび測定するステップを行うために構成される、蛍光検出装置であって、第１の励起光および第２の励起光を生成するために構成される光源と、第１の検出信号および第２の検出信号を測定するために構成される光検出器とを備える、蛍光検出装置。

４９．光源が、第１の励起光を生成するために構成される第１の光源と、第２の励起光を生成するために構成される第２の光源とを備えることと、光検出器が、第１の検出信号を測定するために構成される第１の光検出器と、第２の検出信号を測定するために構成される第２の光検出器とを備えることとのうちの少なくとも１つを含む、実施形態４８に記載の蛍光検出装置。

５０．第３の励起光を生成するために構成される第３の光源と、第３の検出信号を測定するために構成される第３の光検出器とをさらに備える、実施形態４９に記載の蛍光検出装置。

５１．サンプルを支持するために構成されるサンプル支持体であって、前記サンプルは、第１の被分析物に結合された第１の蛍光標識と、第２の被分析物に結合された第２の蛍光標識とを備え、第１の蛍光標識は、アップコンバーティング蛍光体（ＵＣＰ）を備え、第２の蛍光標識は、非ＵＣＰ標識を備える、サンプル支持体と、第１の励起波長における第１の励起光および第１の励起波長と異なる第２の励起波長における第２の励起光を生成するために構成される、光源と、第１の励起光による励起に応答して第１の発光波長においてサンプルから発せられる第１の検出信号、および第２の励起光による励起に応答して第２の発光波長においてサンプルから発せられる第２の検出信号を測定するために構成される、光検出器と、所定の励起時間において、かつ所定の持続時間にわたって、第１の励起光および第２の励起光をそれぞれ生成するように光源を制御し、第１の測定時間において第１の検出信号を測定するように、かつ第２の測定時間において第２の検出信号を測定するように、光検出器を制御するために構成される、コンピューティングデバイスとを備える、蛍光検出装置。

５２．コンピューティングデバイスは、第１の検出信号および第２の検出信号の測定に対応する電気出力を光検出器から受信し、測定をサンプル中の第１の被分析物の量およびサンプル中の第２の被分析物の量と相関させるために構成される、実施形態５１に記載の蛍光検出装置。

５３．コンピューティングデバイスは、第２の励起光を生成することを中止するように光源を制御し、第２の励起光を生成することを中止した後に、第２の検出信号を測定するように光検出器を制御するために構成される、実施形態５１に記載の蛍光検出装置。

５４．サンプルは、第３の被分析物に結合される第３の蛍光標識であって、第２の蛍光標識と異なる非ＵＣＰ標識を備える、第３の蛍光標識を備え、光源は、第１の励起波長および第２の励起波長と異なる第３の励起波長において第３の励起光を生成するために構成され、光検出器は、第３の発光波長において第３の検出信号を測定するために構成され、コンピューティングデバイスは、所定の励起時間において、かつ所定の持続時間にわたって、第３の励起光を生成するように光源を制御し、第３の測定時間において第３の検出信号を測定するように光検出器を制御するために構成される、実施形態４８〜５３のいずれかに記載の蛍光検出装置。

５５．コンピューティングデバイスは、第３の励起光を生成することを中止するように光源を制御し、第３の励起光を生成することを中止した後に、第１の測定時間および第２の測定時間と異なる第３の測定時間において第３の検出信号を測定するように光検出器を制御するために構成される、実施形態５４に記載の蛍光検出装置。

５６．装置筐体と、装置筐体の中に除去可能に設置されるカートリッジと、光源からサンプルまでの光学経路を画定するために構成される励起光学部と、サンプルから光検出器までの光学経路を画定するために構成される発光光学部とを備え、光源は、カートリッジの中または装置筐体の中に配置され、光検出器は、カートリッジの中または装置筐体の中に配置され、コンピューティングデバイスは、装置筐体の中に配置される、実施形態４８〜５５のいずれかに記載の蛍光検出装置。

５７．励起光学部および発光光学部のうちの少なくとも１つは、カートリッジの中に配置される、実施形態５６に記載の蛍光検出装置。

５８．サンプル支持体は、マルチウェルプレートまたはマルチブロット膜を備える、またはそれを支持するために構成される、実施形態４８〜５７のいずれかに記載の蛍光検出装置。

本明細書に説明されるプロセス、サブプロセス、およびプロセスステップのうちの１つまたはそれを上回るものが、１つまたはそれを上回る電子またはデジタル制御型デバイス上で、ハードウェア、ファームウェア、ソフトウェア、または前述のうちの２つまたはそれを上回るものの組み合わせによって、行われ得ることが理解されるであろう。ソフトウェアは、例えば、図２で概略的に描写されるコンピューティングデバイス２３６等の好適な電子処理構成要素またはシステム内のソフトウェアメモリ（図示せず）の中に常駐してもよい。ソフトウェアメモリは、論理機能（すなわち、デジタル回路またはソースコード等のデジタル形態で、またはアナログ電気、音声、またはビデオ信号等のアナログソース等のアナログ形態で実装され得る「論理」）を実装するための実行可能命令の順序付けられたリストを含んでもよい。命令は、例えば、１つまたはそれを上回るマイクロプロセッサ、汎用プロセッサ、プロセッサの組み合わせ、デジタル信号プロセッサ（ＤＳＰ）、または特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）を含む、処理モジュール内で実行されてもよい。さらに、概略図は、アーキテクチャまたは機能の物理的レイアウトによって限定されない物理的（ハードウェアおよび／またはソフトウェア）実装を有する、機能の論理的分割を説明する。本明細書に説明されるシステムの実施例は、種々の構成で実装され、単一のハードウェア／ソフトウェアユニット内または別個のハードウェア／ソフトウェアユニット内のハードウェア／ソフトウェア構成要素として動作してもよい。

実行可能命令は、電子システムの処理モジュール（例えば、図２のコンピューティングデバイス２３６）によって実行されると、命令を実行するように電子システムに指図する、その中に記憶された命令を有する、コンピュータプログラム製品として実装されてもよい。コンピュータプログラム製品は、命令実行システム、装置、またはデバイスから命令を選択的にフェッチし、命令を実行し得る、電子コンピュータベースのシステム、プロセッサ含有システム、または他のシステム等の命令実行システム、装置、またはデバイスによって使用するための、またはそれらと関連する、任意の非一過性のコンピュータ可読記憶媒体で選択的に具現化されてもよい。本開示と関連して、コンピュータ可読記憶媒体は、命令実行システム、装置、またはデバイスによって使用するための、またはそれらと関連する、プログラムを記憶し得る、任意の非一過性の手段である。非一過性のコンピュータ可読記憶媒体は、選択的に、例えば、電子、磁気、光学、電磁、赤外線、または半導体システム、装置、またはデバイスであってもよい。非一過性のコンピュータ可読媒体のより具体的な実施例の非包括的リストは、１つまたはそれを上回るワイヤ（電子）を有する電気接続、携帯用コンピュータディスケット（磁気）、ランダムアクセスメモリ（電子）、読取専用メモリ（電子）、例えば、フラッシュメモリ（電子）等の消去可能プログラマブル読取専用メモリ、例えば、ＣＤ−ＲＯＭ、ＣＤ−Ｒ、ＣＤ−ＲＷ（光学）等のコンパクトディスクメモリ、およびデジタル多用途ディスクメモリ、すなわち、ＤＶＤ（光学）を含む。プログラムが、例えば、紙または他の媒体の光学走査を介して電子的に捕捉され、次いで、必要であれば、好適な様式でコンパイル、解釈、または別様に処理され、次いで、コンピュータメモリまたはマシンメモリに記憶されることができるため、非一過性のコンピュータ可読記憶媒体は、プログラムが印刷される紙または別の好適な媒体でさえあり得ることに留意されたい。

また、本明細書で使用されるような「信号通信する」という用語は、２つまたはそれを上回るシステム、デバイス、構成要素、モジュール、またはサブモジュールが、あるタイプの信号経路を経由して進行する信号を介して相互と通信することが可能であることも理解されるであろう。信号は、第１および第２のシステム、デバイス、構成要素、モジュール、またはサブモジュールの間の信号経路に沿って、第１のシステム、デバイス、構成要素、モジュール、またはサブモジュールから、第２のシステム、デバイス、構成要素、モジュール、またはサブモジュールに情報、電力、またはエネルギーを通信し得る、通信、電力、データ、またはエネルギー信号であってもよい。信号経路は、物理、電気、磁気、電磁、電気化学、光学、有線、または無線接続を含んでもよい。信号経路はまた、第１および第２のシステム、デバイス、構成要素、モジュール、またはサブモジュールの間に、付加的システム、デバイス、構成要素、モジュール、またはサブモジュールを含んでもよい。

より一般的に、「通信する」および「と．．．連通する」という用語（例えば、第１の構成要素が、第２の構成要素と「通信する」または「連通する」）は、２つまたはそれを上回る構成要素または要素の間の構造、機能、機械、電気、信号、光学、磁気、電磁、イオン、または流体関係を示すために、本明細書で使用される。したがって、１つの構成要素が第２の構成要素と通信すると言われる事実は、付加的構成要素が、第１および第２の構成要素の間に存在し得る、および／またはそれらと動作可能に関連付けられ得る、または係合され得る可能性を除外することを意図していない。
本発明の種々の側面または詳細は、本発明の範囲から逸脱することなく変更され得ることが理解されるであろう。さらに、前述の説明は、限定の目的ではなく、例証の目的のためにすぎず、本発明は、請求項によって定義される。

Claims (20)

1. 多重化蛍光検出のための方法であって、
   第１の被分析物に結合された第１の蛍光標識と、第２の被分析物に結合された第２の蛍光標識とを備える、サンプルを提供するステップと、
   前記第１の蛍光標識に第１の励起波長における第１の励起光を照射するステップであって、前記第１の蛍光標識は、第１の発光波長における第１の検出信号を発する、ステップと、
   前記第２の蛍光標識に前記第１の励起波長と異なる第２の励起波長における第２の励起光を照射するステップであって、前記第２の蛍光標識は、第２の発光波長における第２の検出信号を発する、ステップと、
   第１の測定時間において前記第１の検出信号の強度を測定するステップであって、前記第１の検出信号の前記強度は、前記サンプル中の前記第１の被分析物の量と相関性がある、ステップと、
   前記第２の蛍光標識を照射することを中止するステップと、
   前記第２の蛍光標識を照射することを中止した後に、第２の測定時間において前記第２の検出信号の強度を測定するステップであって、前記第２の検出信号の前記強度は、前記サンプル中の前記第２の被分析物の量と相関性がある、ステップと、
   を含む、方法。
2. 前記第１の蛍光標識は、アップコンバーティング蛍光体（ＵＣＰ）を備え、前記第２の蛍光標識は、非ＵＣＰ標識を備える、請求項１に記載の方法。
3. 前記第１の蛍光標識を照射しながら、前記第１の検出信号の前記強度を測定するステップを含む、請求項２に記載の方法。
4. 前記第１の蛍光標識を照射することを中止するステップと、前記第１の蛍光標識を照射することを中止した後に、前記第１の検出信号の前記強度を測定するステップとを含む、請求項２に記載の方法。
5. 前記ＵＣＰは、
   反ストークスシフトを呈する、ランタニドをドープした、または遷移金属をドープした無機化合物、
   ランタニドをドープした、または遷移金属をドープした無機化合物であって、前記無機化合物は、エルビウム（Ｅｒ^３＋）、ツリウム（Ｔｍ^３＋）、ホルミウム（Ｈｏ^３＋）、プラセオジム（Ｐｒ^３＋）、ネオジム（Ｎｄ^３＋）、ジスプロシウム（Ｄｙ^３＋）、イッテルビウム（Ｙｂ^３＋）、サマリウム（Ｓｍ^３＋）、および前述のうちの２つまたはそれを上回るものの組み合わせから成る群から選択される、ドーパントイオンを含む、無機化合物、
   ランタニドをドープした、または遷移金属をドープした無機化合物であって、前記無機化合物は、ハロゲン化物、酸化物、および酸硫化物から成る群から選択される、無機化合物、
   のうちの少なくとも１つを備える、
   請求項２に記載の方法。
6. 前記第１の励起波長は、近赤外範囲内であり、前記第１の発光波長は、可視範囲内である、請求項２に記載の方法。
7. 前記第２の励起波長は、紫外線範囲内であり、前記第２の発光波長は、前記第２の励起波長よりも長い、請求項２に記載の方法。
8. 前記第１の蛍光標識および前記第２の蛍光標識のうちの少なくとも１つは、遷移金属キレート、ルテニウム（Ｒｕ（ＩＩ））の遷移金属キレート、オスミウム（Ｏｓ（ＩＩ））の遷移金属キレート、レニウム（Ｒｅ（Ｉ））の遷移金属キレート、ランタニドキレート、サマリウム（Ｓｍ（ＩＩＩ））のランタニドキレート、ジスプロシウム（Ｄｙ（ＩＩＩ））のランタニドキレート、ユーロピウム（Ｅｕ（ＩＩＩ））のランタニドキレート、およびテルビウム（Ｔｂ（ＩＩＩ））のランタニドキレートから成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
9. 前記サンプルは、第３の被分析物に結合された第３の蛍光標識を備え、前記方法はさらに、
   前記第３の蛍光標識に前記第１の励起波長および前記第２の励起波長と異なる第３の励起波長における第３の励起光を照射するステップであって、前記第３の蛍光標識は、第３の発光波長における第３の検出信号を発する、ステップと、
   前記第３の蛍光標識を照射することを中止するステップと、
   前記第３の蛍光標識を照射することを中止した後に、第３の測定時間において前記第３の検出信号の強度を測定するステップと、
   を含む、請求項１に記載の方法。
10. 前記第１の蛍光標識は、アップコンバーティング蛍光体（ＵＣＰ）を備え、前記第２の蛍光標識は、非ＵＣＰ標識を備え、前記第３の蛍光標識は、前記第２の蛍光標識と異なる非ＵＣＰ標識を備える、請求項９に記載の方法。
11. 前記第３の発光波長が、前記第１の発光波長および前記第２の発光波長と異なることと、
    前記第３の測定時間が、前記第１の測定時間および前記第２の測定時間と異なることと、
    のうちの少なくとも１つを含む、
    請求項９に記載の方法。
12. 前記第１の蛍光標識は、第１の蛍光発光寿命を有し、前記第２の蛍光標識は、第２の蛍光発光寿命を有し、前記第２の蛍光発光寿命は、
    前記第２の蛍光発光寿命が、前記第１の蛍光発光寿命と異なること、
    前記第２の蛍光発光寿命が、前記第１の蛍光発光寿命よりも長いこと、
    前記第２の蛍光発光寿命が、前記第１の蛍光発光寿命よりも少なくとも５倍長いこと、
    前記第２の蛍光発光寿命が、前記第１の蛍光発光寿命よりも少なくとも１００倍長いこと、
    前記第２の蛍光発光寿命が、前記第１の蛍光発光寿命よりも少なくとも１，０００倍長いこと、
    前記第２の蛍光発光寿命が、０．１マイクロ秒〜１０マイクロ秒の範囲内であること、および
    前記第２の蛍光発光寿命が、１００マイクロ秒〜１ミリ秒の範囲内であること、
    から成る群から選択される、
    請求項１に記載の方法。
13. 前記第１の蛍光標識および前記第２の蛍光標識のうちの少なくとも１つは、２０ｎｍを上回るストークスシフト、１００ｎｍを上回るストークスシフト、２５０ｎｍを上回るストークスシフト、および約２５０ｎｍ〜約３５０ｎｍの範囲内のストークスシフトから成る群から選択される、ストークスシフトを有する、請求項１に記載の方法。
14. 前記第２の発光波長が、前記第１の発光波長と異なること、
    前記第２の測定時間が、前記第１の測定時間と異なること、
    のうちの少なくとも１つを含む、
    請求項１に記載の方法。
15. 前記第１の被分析物および前記第２の被分析物は、タンパク質または膜結合タンパク質を含み、さらに、
    前記第１の被分析物および前記第２の被分析物のうちの一方は、基準タンパク質であり、前記第１の被分析物および前記第２の被分析物のうちの他方は、未知のタンパク質であり、さらに、前記第２の検出信号を前記第１の検出信号に正規化するステップ、または前記第１の検出信号を前記第２の検出信号に正規化するステップを含む、ことと、
    前記第１の被分析物および前記第２の被分析物のうちの一方は、未修飾タンパク質であり、前記第１の被分析物および前記第２の被分析物のうちの他方は、前記タンパク質の修飾またはリン酸化バージョンであり、さらに、前記第１の検出信号および前記第２の検出信号の前記測定された強度に基づいて、前記未修飾タンパク質に対する前記タンパク質の前記修飾またはリン酸化バージョンの比を計算するステップを含む、ことと
    のうちの少なくとも1つを含む、請求項１に記載の方法。
16. 前記第１の蛍光標識を照射するステップおよび前記第２の蛍光標識を照射するステップは、同時に、または連続的に行われる、請求項１に記載の方法。
17. 前記サンプルをカートリッジと光学的に整合させるステップを含み、
    前記カートリッジは、前記カートリッジが光学的および／または電気的に蛍光検出装置と通信するように、前記蛍光検出装置の装置筐体の中に除去可能に設置され、
    前記カートリッジは、前記光源から整合したサンプルまでの光学経路を画定する励起光学部、または前記整合したサンプルから前記光検出器までの光学経路を画定する発光光学部、または前述の両方を封入し、
    前記光源は、前記カートリッジの中または前記装置筐体の中に配置され、
    前記光検出器は、前記カートリッジの中または前記装置筐体の中に配置される、
    請求項１に記載の方法。
18. 少なくとも、請求項１に記載の方法の照射するステップおよび測定するステップを行うために構成される、蛍光検出装置であって、
    前記第１の励起光および前記第２の励起光を生成するために構成される光源と、
    前記第１の検出信号および前記第２の検出信号を測定するために構成される光検出器と、
    を備える、蛍光検出装置。
19. サンプルを支持するために構成されるサンプル支持体であって、前記サンプルは、第１の被分析物に結合された第１の蛍光標識と、第２の被分析物に結合された第２の蛍光標識とを備える、サンプル支持体と、
    第１の励起波長における第１の励起光および前記第１の励起波長と異なる第２の励起波長における第２の励起光を生成するために構成される、光源と、
    前記第１の励起光による励起に応答して、第１の発光波長において前記サンプルから発せられる第１の検出信号、および前記第２の励起光による励起に応答して、第２の発光波長において前記サンプルから発せられる第２の検出信号を測定するために構成される、光検出器と、
    コンピューティングデバイスであって、
    所定の励起時間において、かつ所定の持続時間にわたって、前記第１の励起光および前記第２の励起光をそれぞれ生成するように前記光源を制御することと、
    第１の測定時間において前記第１の検出信号を測定するように、かつ第２の測定時間において前記第２の検出信号を測定するように、前記光検出器を制御することと
    を行うように構成される、コンピューティングデバイスと、
    を備える、蛍光検出装置。
20. 装置筐体と、前記装置筐体の中に除去可能に設置されるカートリッジと、前記光源から前記サンプルまでの光学経路を画定するために構成される励起光学部と、前記サンプルから前記光検出器までの光学経路を画定するために構成される発光光学部とを備え、
    前記光源は、前記カートリッジの中または前記装置筐体の中に配置され、
    前記光検出器は、前記カートリッジの中または前記装置筐体の中に配置され、
    前記励起光学部の少なくとも一部、または前記発光光学部の少なくとも一部、または前記励起光学部の少なくとも一部および前記発光光学部の少なくとも一部は、前記カートリッジの中または前記装置筐体の中に配置される、
    請求項１９に記載の蛍光検出装置。