JP2006349574A - 発光測定方法、発光測定装置及びプログラム - Google Patents

Abstract

【課題】蛍光測定時の励起時間を自由に設定することが可能であると同時に、蛍光測定時に必要となる暗電流測定を省略することによって測定時間の短縮化を実現すること。
【解決手段】電荷結合素子（ＣＣＤ）を検出器として用いる蛍光測定装置において、予め複数パターンの露光時間で暗電流像を取得、保持しておき、蛍光測定時の測定条件として励起光源の点灯時間、すなわち励起時間を任意に設定し、設定された励起時間に基づいて、蛍光測定時の露光時間として、前記暗電流像を取得した複数の露光時間の中から最適な露光時間が選択されることを特徴とする蛍光測定装置。
【選択図】図６

Description

本発明は、発光測定方法、発光測定装置及びプログラムに関する。

下記特許文献１には、マイクロアレイチップの読み取り方法及び読取装置が開示されている。この技術においては、被検物が配置されているマイクロアレイチップ上の全面を励起光で走査するのではなく、予め設定された所定の位置のみを励起光で照射するように、被検物よりも大きいビーム径の励起光で、間歇的に走査する。

特開２０００−１３１２３７号公報

電荷結合素子（ＣＣＤ）は光の像を電気信号に変換して取り出すイメージセンサである。検出器にＣＣＤを用いる発光測定装置では、ＣＣＤから出力される信号に蛍光や燐光以外の原因によって発生する暗電流が含まれる。暗電流は光に依存しないためノイズとして扱わなければならず、より正確な蛍光解析を実施するためには、暗電流を含まない蛍光のみに起因する信号を取り出す必要がある。これは、蛍光測定によって得られたＣＣＤの出力信号から暗電流分を差し引くことによって実現される。

暗電流はＣＣＤに光を入射させない状態で撮影することによって得られるが、その信号量はＣＣＤの露光時間と温度に依存するため、蛍光測定を実施したときと同じ露光時間、同じ温度で暗電流像を取得する必要がある。そのため、蛍光試料濃度の違い等、測定条件が変わることによって蛍光測定時の露光時間を変える必要が発生した場合は、その都度、同じ条件で暗電流像を再取得しなければならず、手間がかかる。暗電流測定の精度を高めるために複数の暗電流像を積算するとなると、さらに測定時間が長期化する。予め暗電流像を取得しておき再利用すれば、２度目以降の暗電流測定を省略することが可能となるが、この方法では蛍光測定時に選択できる露光時間が限定されてしまうという問題が発生する。

本発明の目的は、発光測定時の励起時間を自由に設定することが可能であると同時に、発光測定時に必要となる暗電流測定を省略することによって測定時間の短縮化を実現する発光測定方法を提供することである。また、その方法を実施するのに適した発光測定装置及び前記方法をコンピュータに実行するように機能させるためのプログラムに関する。

前記目的を達成するために、本発明は、予め複数の露光時間条件で暗電流像を取得しておき、励起光の点灯時間、すなわち任意の励起時間を設定し、設定された励起時間に基づいて、暗電流像を取得済みの複数の露光時間条件の中から最適な露光時間が選択されることを特徴とする発光測定方法、発光測定装置及び前記方法をコンピュータに実行させるためのプログラムに関する。特に、検出器に電荷結合素子（ＣＣＤ）を用いる発光測定方法、発光測定装置及び前記方法をコンピュータに実行させるためのプログラムに関し、これらは例えばＤＮＡチップ上に配置されたＤＮＡ試料の一塩基多型（ＳＮＰ）解析をするＳＮＰ解析装置に適している。

本発明により、分析者は蛍光測定時の励起時間を自由に設定することによって所望の信号強度を得ることが可能であると同時に、発光測定時に必要となる暗電流測定を省略することによって測定時間の短縮化を図ることが可能となる。

以下、本発明の蛍光測定装置について、特にＳＮＰ解析装置を例にとり、図面を参酌して説明する。ただし、図面は専ら説明のためのものであって、この発明の範囲を限定するものではない。なお、本発明は、蛍光及び燐光を含む発光測定を対象とするが、以下においては、蛍光測定を代表として説明する。

本発明が適用される核酸分析装置では、例えば、アフィメトリックス社製ＤＮＡチップに代表される一般的なＤＮＡチップが分析対象とされる他、ナノチップと呼ばれる半導体チップも好適に分析対象とされる。ナノチップとは、マトリックス状に電極が配置され、その表面が透過層構造によりコーティングされた半導体チップである。ユーザーが所望のオリゴヌクレオチド−アレイを構築し、そのオリゴヌクレオチド−アレイに試薬をスパイクして、ＰＣＲ生成物であるサンプルを分析する。

一般的なＤＮＡチップの場合、ＤＮＡチップメーカが、既知の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド−アレイを備えるＤＮＡチップを供給する。このＤＮＡチップは、ガラス基板等を用い、ガラス基板の所定位置に、オリゴヌクレオチドの前駆体である４種類の塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ）を配置し、オリゴヌクレオチド−アレイを形成する。つまり、ガラス基板上でオリゴヌクレオチドを伸長させ、オリゴヌクレオチド−アレイを作成する。一方、ナノチップでは、寒天質の透過層構造に表面が覆われた半導体チップを用い、この透過層構造に、予め作成した核酸を固定することで、核酸アレイを構成する。

図１は、本実施例にかかるＤＮＡチップを用いるＳＮＰ解析装置の分解斜視図である。
以下、図１を参照して、ＳＮＰ解析装置の概要を説明する。

ＳＮＰ解析装置は、主にＤＮＡのＳＮＰを検出することを目的としている。ＳＮＰはＳｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍの略で一塩基多型と呼ばれ、一塩基だけ異なる遺伝子のことを指す。このＳＮＰが病気と関連していると考えられ、さまざまな病気と関連するＳＮＰの探索が精力的に行われている。

本ＳＮＰ解析装置の最終的な出力は、次の３状態である。サンプルＤＮＡにおいて着目するＳＮＰが両対立遺伝子で存在する、又は存在しない状態（ホモ）と、片方の対立遺伝子のみに存在する状態（ヘテロ）である。これらを判定する方法として、例えば、着目するＳＮＰを持つサンプルと反応し結合する（ハイブリダイズする）試薬を第１番目の蛍光色素により標識しておき、それを持たないサンプルとハイブリダイズする試薬を第１番目とは励起波長、蛍光波長の異なる第２番目の蛍光色素により標識しておく。サンプルＤＮＡに対し前記両試薬を反応させる。第１番目と第２番目の蛍光色素からの蛍光を検出し、それぞれの検出強度の比を求める。この比をもとに、着目するＳＮＰに対する前記３状態を判定する。

ここで、上記ナノチップを用いたＰＣＲ生成物であるサンプルを分析する手順の一例を具体的に説明する。分析手順は、”Ａｍｐｌｉｃａｏｎ Ｄｏｗｎ Ｆｏｒｍａｔ”と”Ｃａｐｔｕｒｅ Ｄｏｗｎ Ｆｏｒｍａｔ”の２種類がある。

Ａｍｐｌｉｃａｏｎ Ｄｏｗｎ Ｆｏｒｍａｔでは、まず、半導体チップ上に、一部の塩基配列が不明であり、一端がビオチン化された分析対象ＰＣＲ生成物（Ｓａｍｐｌｅ Ｏｌｉｇｏｓ）を供給し、半導体チップ上の所定の電極に電圧を印可する。すると、そのＳａｍｐｌｅ Ｏｌｉｇｏｓは、当該電極に引き寄せられ、半導体チップ表面の透過層構造と接触する。そして、Ｓａｍｐｌｅ Ｏｌｉｇｏｓのビオチン標識と透過層構造が反応し（ａｖｉｄｉｎ−ｂｉｏｔｉｎ反応）、Ｓａｍｐｌｅ Ｏｌｉｇｏｓは透過層構造に固定される。半導体チップ表面を洗浄し、別のＳａｍｐｌｅ Ｏｌｉｇｏｓを用いて上述の工程を繰り返すことにより、半導体チップ上に、Ｓａｍｐｌｅ Ｏｌｉｇｏｓからなる所望のオリゴヌクレオチド−アレイを形成する。

Ｓａｍｐｌｅ Ｏｌｉｇｏｓがマトリックス状に配置されたオリゴヌクレオチド−アレイを形成した後、その上に、一端が蛍光標識されたオリゴヌクレオチド（Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｏｌｉｇｏｓ）を供給する。Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｏｌｉｇｏｓは、相補的配列を有するＳａｍｐｌｅ Ｏｌｉｇｏｓとハイブリダイズする。半導体チップ表面を洗浄後、半導体チップ上に励起光を照射する。これにより、Ｓａｍｐｌｅ ＯｌｉｇｏｓとハイブダイズしたＲｅｐｏｒｔｅｒ Ｏｌｉｇｏｓから蛍光が発生する。この蛍光パターンを検出し、解析することで、Ｓａｍｐｌｅ Ｏｌｉｇｏｓの塩基配列を分析することができる。

一方、Ｃａｐｔｕｒｅ Ｄｏｗｎ Ｆｏｒｍａｔでは、まず、半導体チップ上に、既知の塩基配列を有し、一端がビオチン化されたオリゴヌクレオチド（Ｃａｐｔｕｒｅ Ｏｌｉｇｏ）を供給し、半導体チップ上の所定の電極に電圧を印可する。すると、そのＣａｐｔｕｒｅ Ｏｌｉｇｏは、当該電極に引き寄せられ、半導体チップ表面の透過層構造と接触する。そして、Ｃａｐｔｕｒｅ Ｏｌｉｇｏのビオチン標識と透過層構造が反応し（ａｖｉｄｉｎ−ｂｉｏｔｉｎ反応）、Ｃａｐｔｕｒｅ Ｏｌｉｇｏは透過層構造に固定される。半導体チップ表面を洗浄し、別のＣａｐｔｕｒｅ Ｏｌｉｇｏを用いて上述の工程を繰り返すことにより、半導体チップ上に、Ｃａｐｔｕｒｅ Ｏｌｉｇｏからなる所望のオリゴヌクレオチド−アレイを形成する。Ｃａｐｔｕｒｅ Ｏｌｉｇｏがマトリックス状に配置されたオリゴヌクレオチド−アレイを形成した後、その上に、一部の塩基配列が不明である分析対象ＰＣＲ生成物（Ｓａｍｐｌｅ Ｏｌｉｇｏｓ）を供給する。

Ｓａｍｐｌｅ Ｏｌｉｇｏｓは、相補的配列を有するＣａｐｔｕｒｅ Ｏｌｉｇｏとハイブリダイズする。これにより、Ｓａｍｐｌｅ Ｏｌｉｇｏｓは、Ｃａｐｔｕｒｅ Ｏｌｉｇｏを介して、半導体チップ上に固定される。

半導体チップ表面を洗浄し、一端が蛍光標識されたオリゴヌクレオチ（Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｏｌｉｇｏｓ）を供給する。Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｏｌｉｇｏｓは、相補的配列を有するＳａｍｐｌｅ Ｏｌｉｇｏｓとハイブリダイズする。半導体チップ表面を洗浄後、半導体チップ上に励起光を照射する。これにより、Ｓａｍｐｌｅ ＯｌｉｇｏｓとハイブリダイズしたＲｅｐｏｒｔｅｒ Ｏｌｉｇｏｓから蛍光が発生する。この蛍光パターンを検出し、解析することで、Ｓａｍｐｌｅ Ｏｌｉｇｏｓの塩基配列を分析することができる。

ＳＮＰ解析装置は主に、分注ユニット、流路系ユニット、インターフェイスユニット、光学系ユニットおよび電源ユニットから構成され、外部機器（ＰＣ）により制御される。ＳＮＰ解析装置は、ＤＮＡチップを備えたカートリッジを装着し、分析を行う。カートリッジは、その内部に半導体素子からなるＤＮＡチップを配置したフローセルを内蔵している。ＤＮＡチップは、最大４００の核酸プローブを所定位置に配置し、所望のプローブアレイを構築できる。尚、ＤＮＡチップ上への核酸プローブの貼り付けから、測定までを自動で行え、オペレータがサンプル毎に装置を操る必要はない。例えば、９６個のサンプルの分析は、およそ３時間で行える。

図１に示すように、ＳＮＰ解析装置（１０１）は、トップカバー（１０２）、カバー（１０３）、装置本体（１０４）、フロントパネル（１０５）からなる。

分注ユニットは、サンプルや試薬を配置保管できるサンプルハンドリングステーション（１０６）と、サンプル及び試薬を所定位置へ搬送するためのロボットアーム（１１２）を含む。サンプルハンドリングステーション（１０６）は、サンプルや試薬が入っているサンプルトレイ（１１１）を２つ、試薬ボトルを４つ搭載できる。また、反応酵素を冷却保管できる反応酵素冷却部も備えている。そして、液体を吸引吐出できるプローブチップを備えたロボットアーム（１１２）を用い、所定のサンプルや試薬を分注し、水ポンプ１１３、ヒスチジンポｍｍプ１１４、カートリッジポンプ１１５により注入ポートに投入できる。

流路系ユニットは、３台のシリンジポンプを駆動し、注入ポートから投入されたサンプルや試料、水ボトルに蓄えられた水等を、自動的にフローセル内のＤＮＡチップへ搬送できる。また、洗浄ポートによりプローブチップを洗浄したり、フローセル内や流路を洗浄したりすることができる。更に、装置内から生じた廃液を、装置外に配置された廃液ボトルへ排出できる。

インターフェースユニット（１０７）はカートリッジを着脱保持でき、カートリッジにニードルを挿入し、ニードルを介して流路接続できる。これにより、所定のサンプルや試薬をフローセル内に搬送することが可能となる。また、ＤＮＡチップと電気的接続することにより、核酸プローブの配置場所等を制御可能とする。更に、ＤＮＡチップと熱的接続することにより、フローセル内の温度を制御可能とする。

光学系ユニット（１０８）は、ＤＮＡチップ上に存在する蛍光試薬を励起できる光源と、蛍光試薬から生じた蛍光を検出できる検出器を含み、ＤＮＡチップ上の画像を出力できる。電源ユニット（１０９）は、各ユニットへ駆動電力を供給し、電源電圧として、１００、１１０、１２０、２００、２２０、２３０、２４０ＶＡＣが使用可能であり、電流値は４Ａ以下で、周波数は５０／６０Ｈｚに対応している。

ＳＮＰ解析装置（１０１）の装置側面には外部機器接続部（１１０）が配され、図示しないパーソナルコンピュータ（ＰＣ）及びバーコードリーダーを接続できる。ＰＣは、ＳＮＰ解析装置（１０１）の操作、測定結果の表示、解析、保存を担う。ＳＮＰ解析装置（１０１）とＰＣはイーサネット（登録商標）によって接続される。ハブを介することで１台のＰＣが最高４つのＳＮＰ解析装置（１０１）を操作することも可能である。また、バーコードリーダーは、サンプルの入ったサンプルトレイやカートリッジに貼付されたバーコードを読み取り、ＰＣへ送信することで測定されるサンプル、試薬、カートリッジの管理を容易にする。

図２は、本実施例のＳＮＰ解析装置の概略図である。以下、図２を参照して装置全体の機構部を説明する。尚、図２では、装置本体にカートリッジ（２１８）が挿入され、装置本体とフローセル（２１９）がニードル（２１１）により接続された状態を示している。流路系ユニットは、ロボットアーム（２０４）のプローブチップ（２０５）、水ボトル（２０１）、ヒスチジンボトル（２０２）、廃液ボトル（２０３）、水ポンプ（２０６）、ヒスチジンポンプ（２０７）、カートリッジポンプ（２０８）、洗浄ポート（２０９）、注入ポート（２１０）、及びニードル（２１１）が複数の流路で結ばれた構造となっている。

プローブチップ（２０５）は、サンプル及び溶液を吸引吐出する配管が接続され、ロボットアーム（２０４）によりその先端を所定位置に移動させることができる。そして、サンプルハンドリングステーション上に配置されたサンプルトレイ、Ｒｅａｇｅｎｔボトル及び反応酵素冷却部から、所定のサンプルや試薬を分注し、注入ポートへ投入できる。ここで、注入ポート（２１０）は、サンプル及び溶液をカートリッジ（２１８）内フローセル（２１９）に送り込む前に存在するポートタンクである。注入ポート（２１０）は、４０℃から６０℃の範囲で温度制御可能である。

後述するようにカートリッジ内に備えられたフローセルの温度を制御することが可能であるが、試料の温度とフローセルの温度が異なる状態で試料をフローセルへ導入すると、フローセル内の温度が変動してしまう。そのため、事前に注入ポート（２１０）より試料を温調することで、試料導入時のフローセル内温度の変動を軽減できる。また、プローブチップ（２０５）は、洗浄ポート（２０９）において洗浄することができる。

水ポンプ（２０６）は、水ボトル（２０１）からプローブチップ（２０５）に水を送ること、プローブチップ（２０５）によりサンプル及び試料の吸引・吐出を行うこと、廃液ボトル（２０３）に溶液を送ることができる。

また、ヒスチジンポンプ（２０７）は、ヒスチジンボトル（２０２）からヒスチジンを注入ポート（２１０）に送ること、水ボトル（２０１）から注入ポート（２１０）に水を送ること、注入ポート（２１０）に空気を送ること、廃液ボトル（２０３）にシリンジ内溶液を送る事ができる。

また、カートリッジポンプ（２０８）は、注入ポート（２１０）からカートリッジ（２１８）内フローセル（２１９）に溶液及び空気を送ること、カートリッジ（２１８）内のフローセル（２１９）からカートリッジポンプ（２０８）に溶液及び空気を送ることができる。装置内で生成された廃液は、接続部を介して着脱可能に搭載されている装置外部の廃液ボトル（２０３）へ排出できる。

水ポンプ（２０６）とカートリッジポンプ（２０８）を駆動することにより、注入ポートに投入された試薬や洗浄液を、カートリッジ流路を介して、フローセル（２１９）内へ搬送できる。カートリッジ流路は、ヒスチジンポンプ（２０７）とカートリッジポンプ（２０８）を駆動することにより、ヒスチジンによって洗浄される。ヒスチジンポンプ（２０７）から注入ポート（２１０）及びカートリッジポンプ（２０８）までの流路は、ヒスチジン溶液から水に置換できる構造と成っている。水により流路を洗浄することでヒスチジン溶液が流路配管内に析出することを回避している。尚、水ボトル（２０１）とヒスチジンボトル（２０２）には、それぞれ１Ｌの水とヒスチジンを入れることが可能である。この為、９６サンプルの貼り付けから測定までの間、水やヒスチジンをユーザーが追加する必要がない。

インターフェイスユニットは、カートリッジ（２１８）内のフローセル（２１９）と装置本体を結ぶ流路となるニードル（２１１）、カートリッジ冷却ペルチェ（２１２）、およびポゴピン（２１３）を含んでいる。カートリッジ冷却ペルチェは、カートリッジと接触し、フローセル（２１９）の温度を制御できる。ポゴピン（２１３）は、カートリッジ（２１８）に設けられた端子に接続され、装置本体とＤＮＡチップの電気的接続を行う。ポゴピン（２１３）の本数は、１２本と少数である為、カートリッジへの接続が容易である。

光学系ユニットは、ＣＣＤ（２１４）、ＥＭフィルター（２１５）、ＥＸフィルター（２１６）、及びＬＥＤ（２１７）を含む。ＬＥＤ（２１７）による発光は、ＥＸファイル（２１６）により波長選別され、フローセル（２１９）内のＤＮＡチップ上の蛍光体に励起光を照射できる。蛍光体から生じた蛍光は、ＥＭフィルター（２１５）により波長選別され、ＣＣＤ（２１４）により検出される。

図７は図２に示したＳＮＰ解析装置の制御装置の概略図であり、図２のＬＥＤ２１７、ＣＣＤ２１４等を制御する。入力装置６０１からＬＥＤ点灯時間を入力し、制御部（コンピュータ）６０２によりＬＥＤ６０３の点灯時間を制御する。制御信号により、ＣＣＤの蓄積時間を設定し（６０８）、ＣＣＤ６０４の蓄積時間を制御する。ＣＣＤから出力画像が出力され、かつ記憶部６０９からＤａｒｋ画像が読み出され、制御部からの信号により、Ｄａｒｋ引算処理が行われる（６０５）。これにより、データ解析が行われ（６０６）、データ表示がなされる（６０７）。また、データ解析の結果得られたデータは記憶部６０９に記憶される。

上記制御装置のコンピュータの記憶装置には、制御装置のコンピュータに対し、予め複数パターンの露光時間で暗電流像を取得、保持し、発光測定時の測定条件として励起光源の点灯時間又は励起時間を任意に設定し、設定された励起時間に基づいて、発光測定時の露光時間として、前記暗電流像を取得した複数の露光時間の中から最適な露光時間を選択する発光測定方法を実行させるためのプログラムが格納されている。

以下、光学系ユニットの構成について説明する。図３に光学系ユニットの概観図を示す。光学系ユニットは主にＬＥＤ（３０１）、ＥＸフィルター（３０２）、ＥＭフィルター（３０３）、レンズユニット（３０４）、ＣＣＤ（３０５）、移動ステージ（３０６）、オートフォーカス駆動部（３０７）を有する。

ＤＮＡチップ上の蛍光色素を励起するための光源として発光ダイオード（ＬＥＤ）を用いている。ＬＥＤ（３０１）から放射された光はＥＸフィルター（３０２）を透過し、ＤＮＡチップ（３０８）全面に同時照射される。ＤＮＡチップ上に分布した蛍光色素から放出された蛍光は、複数枚のレンズによって構成されるレンズユニット（３０４）により検出器上に結像される。レンズユニット内の光路上には、ＥＭフィルター（３０３）が挿入されており、蛍光色素から発光した蛍光が波長選別された後、検出器に到達する。検出器には電荷結合素子（ＣＣＤ）を採用する。レンズユニット（３０３）、ＥＭフィルター（３０４）、ＣＣＤ（３０５）は、ボールネジ及びステッピングモータによって構成されるオートフォーカス駆動部（３０７）によって光軸方向に移動可能な移動ステージ（３０６）上にまとめて配置され、焦点合わせのため移動する。

図４に光学系ユニットの光学素子配置図を示す。前述のように、本実施例では励起光源にＬＥＤ（４０１）、検出器にＣＣＤ（４０２）を用いている。これにより、一定濃度以上の蛍光体の有無を測定でき、病気との関連が既知のＳＮＰを検出し、病気の診断を行うことができる。

一方、励起光源にレーザー発振器、検出器に光電子増倍管（ＰＭＴ）を使用した共焦点光学系を用いた従来技術がある。この方式では、光源と検出器の各点を対応させるために、ＤＮＡチップ上の各点の情報のみが得られるので、ＤＮＡチップの２次元情報を得るためにはＤＮＡチップ内を走査する仕組みが必要となる。また、本実施例同様、測定対象となる蛍光色素は２種類であるため、レーザー発振器及び光電子増倍管を２組用いている。したがって、実際に蛍光測定を実施する際には、ＤＮＡチップ上の測定サイト数だけＤＮＡチップを走査し、測定サイト毎に、検出すべき蛍光色素の数だけ、光源及び検出器を切り替えて測定することになるため、測定時間が長くなる。

一般的にＤＮＡチップは、それ自身を高集積化し、より多くのサンプルを一枚のＤＮＡチップ上に載せ、それを短い測定時間で読み取ることが望まれている。上記従来技術で使用するＤＮＡチップの測定サイト数は１００箇所であるが、本実施例で説明する装置では、その４倍の４００箇所の測定サイト数を持つＤＮＡチップを読み取るため、従来技術の光学系では、測定時間が４倍になってしまう。また、レーザー発振器、光電子増倍管は非常に高価であるため、コストが高くなってしまう問題がある。さらにレーザー発振器は、その種類によっては、寿命がそれほど長くないこと、また故障率も他の光源と比較して高いことから、信頼性の面でも問題がある。

上記理由から、本実施例では励起光源にＬＥＤ（４０１）を、検出器にＣＣＤ（４０２）を用いている。これにより、低コスト、省スペース、高スループットを図ることが可能となる。ＬＥＤは、レーザー発振器と比較して非常に安価であり、大きさも非常に小さいことから大幅なコスト削減、省スペース化を図ることが可能となる。また、寿命の面でもＬＥＤはレーザー発振器を含む他の光源と比較して長寿命であり、故障率も極めて低いことから、交換等のメンテナンスの必要性がほとんど発生しない。また、ＬＥＤ（４０１）により励起光はＤＮＡチップ（４０３）全面に同時照射され、蛍光検出もＣＣＤ（４０２）によりＤＮＡチップ（４０３）全面について同時に行われるため、上記従来技術に対して、大幅に測定時間を短縮することが可能となる。

一般的にＬＥＤからの発光は指向性がないため、それ自身だけでは所望の範囲に限定して光を照射することは困難である。そのため、ＬＥＤから放出される励起光はレンズによりＤＮＡチップ上に集光される。このとき、ＤＮＡチップ上での励起光強度が測定サイトの位置によって異なるという現象が発生する。前述のように本装置は、２種類の蛍光色素に対する蛍光強度比から、３状態あるＳＮＰの有無を判定する。したがって、２種類のＬＥＤのＤＮＡチップ上での励起光強度分布が測定サイトによって異なっていると、仮にＤＮＡチップ上の異なる測定サイトに全く同じサンプルが存在していたとしても、２波長の蛍光強度比が測定サイトによって異なってしまうという問題が発生する。その対策として、本装置ではあらかじめ２波長それぞれのＬＥＤに対し、ＤＮＡチップ上での励起光強度分布を記憶しておき、得られた測定結果をその分布に従って補正するという方法を採用している。これにより、励起光強度の大小の差によって生じる検出強度の差をキャンセルすることが可能となる。

ＬＥＤによる励起光は、そのままではＤＮＡチップ上で反射し、検出すべき蛍光とともに検出器へ到達する。この励起光の反射成分は、微弱な蛍光検出の大きなバックグラウンドとなる。そのため、本実施例では、励起光の反射成分を排除するため、各蛍光色素に対して透過波長帯の異なる２種類のバンドパスフィルターを組合わせて使用する。第１のバンドパスフィルターを透過することのできる光は、第２のバンドパスフィルターを透過することができない。逆も同様である。第１のバンドパスフィルターである励起用フィルター（３０２）、図４中には図示していない）はＬＥＤ（４０１）の発光波長域に透過波長帯を持ち、ＬＥＤ発光の一部を透過させる。

一方、第２のバンドフィルターである検出用フィルター４０４は、蛍光色素の蛍光波長帯域に透過波長帯を持ち、蛍光の一部を透過させる。励起用フィルター（３０２）は、ＬＥＤ（４０１）とＤＮＡチップ（４０３）の間に挿入され、これを透過した波長成分のみが励起光としてＤＮＡチップ（４０３）上に照射される。検出用フィルター（４０４）は、ＤＮＡチップ（４０３）とＣＣＤ（４０２）の間に挿入され、ＤＮＡチップ上で反射した励起光は、検出用フィルター（４０４）によって透過を禁止され、蛍光のみがレンズユニット（４０５）を通して検出器であるＣＣＤ（４０２）上に結像される。

ＳＮＰ検出に必要となる２種類の蛍光色素を励起するため、発光波長の異なる２種類のＬＥＤを採用している。本実施例では、１枚の基板上に４個のＬＥＤがアレイ状に配置されたＬＥＤアレイを１波長につき２組配置している。ＬＥＤ（４０１）によって励起光がＤＮＡチップ（４０３）上に照射され、ＤＮＡチップ上に分布した蛍光色素から蛍光が生じる。ＤＮＡチップからの蛍光は、レンズユニット（４０５）によりＣＣＤ（４０２）上に結像され、蛍光によるＤＮＡチップ像が取得される。レンズユニット（４０５）は５枚のレンズで構成されており、第１レンズと第２レンズ間に、ＥＭファイタ（３０３）が挿入される。ここに挿入されるＥＭフィルターには３種類あり、それぞれ異なる透過帯域を持っている。これらのＥＭフィルター（３０３）は、測定の目的に応じて自動で切り替えられる。

ＣＣＤに到達した蛍光は、ＣＣＤにより電気信号に変換され出力される。しかし、ＣＣＤから出力される信号には光以外の原因によって発生する信号が蛍光信号のバックグランドとして常に含まれる。これは大きく分けて次に挙げる２つの要素によって構成される。第一の要素は、バイアスである。これは露光時間がゼロの場合でも、信号がゼロ以下にならないように電気的に出力値を持ち上げているものである。バイアスはその特性上、露光時間には依存しないため、ＣＣＤの露光時間を変えても、そのレベルは変わらない。第２の要素は、暗電流である。暗電流は、熱によって発生する電荷に起因している。暗電流の量は、その特性からＣＣＤの温度と露光時間に依存して変動する。ＣＣＤの温度が高くなれば、また露光時間が長くなれば、暗電流は増加する。

ＣＣＤによって取得された全信号量の内、光に起因する信号のみを取り出すためには、前述のバイアス、暗電流に大別される光以外の原因によって発生する信号量を元の全信号量から差し引く必要がある。特に低濃度の蛍光試料から発生する微弱な蛍光を検出する蛍光測定装置では、バックグランドの影響が大きくなるため、この補正が重要となる。

暗電流は、光を完全に遮断した状態で撮影を行うことで得られる。こうして得られた像にはバイアスも含まれているため、蛍光像から暗電流像を差し引くことによって、蛍光に起因する信号のみを得ることができる。ただし、前述のように、暗電流はＣＣＤの温度および露光時間に依存するため、暗電流測定は、蛍光測定時と同一の温度かつ同一の露光で行う必要がある。

まず、温度については、ＣＣＤを常に一定温度に調節すれば良い。一般的に、ＣＣＤを用いて微弱光を検出する場合、高感度なＣＣＤを採用することはもちろん、暗電流によるバックグラウンド増加を低減するため、ＣＣＤを冷却して使用する。本実施例でもＣＣＤは、図示されないペルチェ素子によって冷却され、一定温度に保たれているため、温度変化による暗電流の変動を気にする必要はない。

一方、露光時間については、蛍光測定時の設定に依存する。常に同一の露光時間で蛍光測定を行うのであれば、一度、同条件で暗電流像を取得、保存しておき、蛍光測定の度にそれを読み出せば、２度目以降の暗電流測定は必要ない。しかし、例えば得られた信号強度が期待する値より低いため、露光時間を変えて測定したい場合は、暗電流像を再取得しなければならない。暗電流測定の精度を高めるために複数の暗電流像を取得し、平均化する処理を行うとなると、その数だけ測定時間が増加する。予め複数の露光時間設定で暗電流像を取得しておき再利用すれば、２度目以降の暗電流測定を省略することが可能となるが、この方法では蛍光測定時に選択できる露光時間が限定されてしまい、分析者の自由度が制限されてしまう。

以下、このような問題を解決するための最良の手段を提示する。図６は、蛍光測定のフローチャートを示している。本発明によれば、まず分析者は測定前に測定条件として、露光時間ではなく励起光源の点灯時間、すなわち励起時間を設定する（５０１）。少なくとも１つ以上の露光時間条件で暗電流像が予め取得され、保存されており、設定された励起時間に基づき、暗電流取得時の露光時間条件の中から最適な露光時間が自動選択される（５０２）。これらの条件に従い、蛍光測定が実行され、取得された蛍光像は、同一の露光時間条件で予め取得されている暗電流像によって引き算処理される（５０４）。蛍光測定の度に、暗電流測定を実施する必要はない。引き算処理後の蛍光像に含まれる信号強度は、光に起因する信号のみで構成され、それらが解析対象となる（５０５）。

図５は、本発明による励起光源および検出器の制御に関するタイミングチャートを示している。分析者によって入力された励起時間に従い、励起光源制御部は、励起光源を点灯・消灯させる。本実施例では光源にＬＥＤを用いている。ＬＥＤは、点灯・消灯指示信号に対して応答性が良く、点灯直後から安定した出力が得られるため、好適な光源の１つである。励起時間に対する蛍光強度の直線性を得るため、本実施例ではＬＥＤ駆動電流を定電流制御している。これはＬＥＤに流れる順方向電流の大きさによってＬＥＤの光度が変化するためである。同様に、ＬＥＤはその温度によっても光度が変化する。ＬＥＤの放熱が不十分である場合や周囲温度の変動量が大きい場合等、ＬＥＤ自身の温度変化が無視できない場合は、ＬＥＤの温度を一定に保つための温調機構を追加しても良い。

ＬＥＤの点灯のタイミングはＣＣＤのフラッシング終了時、すなわち露光開始のタイミングと同期している。フラッシングは、それまでにＣＣＤに蓄積している電荷を廃棄するための動作である。フラッシングは使用しているＣＣＤの特性に合わせて複数回実施される。ＣＣＤの前面に機械式シャッタを使用している場合は、シャッタが開き始めてから完全に開くまでにかかる時間分だけ、ＬＥＤの点灯開始のタイミングを遅らせても良い。

露光時間は、予め暗電流像を取得した時の露光時間条件の中から自動的に選択される。このとき、露光時間は分析者によって設定された励起時間より長く、かつ励起時間に最も近い設定が選択される。

測定終了後、取得された蛍光像は、そのとき選択された露光時間と同一の露光時間で取得されている暗電流像で引き算処理が施される。例えば、（ｔ１）秒、（ｔ２）秒、（ｔ３）秒の３種類の露光時間で予め暗電流像が取得されている場合、分析者が蛍光測定時に設定した励起時間Ｔがｔ１＜Ｔ＜ｔ２であれば、そのときの露光時間にはｔ２が自動選択される。このとき、励起時間Ｔと露光時間ｔ２の差である（ｔ２−Ｔ）秒が励起光の存在しない非励起時間となり、基本的に蛍光も発生しない。ナノ秒オーダーでは、励起光の消灯直後も蛍光が残存するが、本実施例のようなＳＮＰ解析を目的とする蛍光測定においては、ミリ秒から秒オーダーの励起時間で測定を行うため、十分無視できるレベルである。したがって、非励起時間に蓄積される電荷は暗電流成分のみであると見なすことができ、その後の暗電流引算処理で除去される。励起時間Ｔで得られた引算処理後の信号強度が分析者の期待する値と異なるときは、励起時間Ｔを調節して再測定すれば良い。ＬＥＤの放射強度がほぼ一定に保たれているため、得られる信号強度は励起時間に比例する。そのため、分析者は次に設定すべき励起時間を容易に決定することが可能である。

予め取得し、保存しておく暗電流像は、装置製造者によって提供されても良いし、ユーザーが自分自身で用意しても良い。本実施例では、暗電流取得のための露光時間設定手段も有しているため、分析者は所望の露光時間で暗電流像を取得することが可能である。これにより、選択可能な露光時間条件の構成を見直し、蛍光測定時に入力可能な励起時間域を変更することが可能である。例えば、分析者が通常使用する励起時間域に変更が生じても、予め暗電流像が取得されている露光時間条件の構成の中に、条件を満足する露光時間条件が含まれていなければ、つまり、設定したい励起時間よりも長い露光時間で取得、保存された暗電流像がなければ、その励起時間を設定することが出来ない。このように、これまでの露光時間条件の構成に不足が生じた場合は、所望の露光時間条件で暗電流像を追加取得すれば良い。

本実施例では、蛍光測定時の励起時間を自由に設定することが可能であると同時に、蛍光測定時に必要となる暗電流測定を省略することによって測定時間の短縮化を図り、高効率な蛍光測定を実現することが可能となる。

ＤＮＡチップを用いるＳＮＰ解析装置の分解斜視図。 ＳＮＰ解析装置の概略図。 光学系ユニット概略図。 光学系外観図。 蛍光測定処理フロー図。 蛍光測定タイミングチャート。 ＳＮＰ解析装置の制御装置を示す概略図。

符号の説明

１０１…ＳＮＰ解析装置、１０２…トップカバー、１０３…カバー、１０４…装置本体、１０５…フロントパネル、１０６…サンプルハンドリングステーション、１０７…インターフェースユニット、１０８…光学系ユニット、１０９…電源ユニット、１１０…外部機器接続部、１１１…サンプルトレイ、１１２…ロボットアーム、１１３…水ポンプ、１１４…ヒスチジンポンプ、１１５…カートリッジポンプ、２０１…水ボトル、２０２…ヒスチジンポンプ、２０３…廃液ボトル、２０４…ロボットアーム、２０５…プローブチップ、２０６…水ポンプ、２０７…ヒスチジンポンプ、２０８…カートリッジポンプ、２０９…洗浄ポート、２１０…注入ポート、２１１…ニードル、２１２…カートリッジ冷却ペルチェ、２１３…ポゴピン、２１４…ＣＣＤ、２１５…ＥＭフィルター、２１６…ＥＸフィルター、２１７…ＬＥＤ、２１８…カートリッジ、３０１…ＬＥＤ、３０２…ＥＸフィルター、３０３…ＥＭフィルター、３０４…レンズユニット、３０５…ＣＣＤ、３０６…移動ステージ、３０７…オートフォーカス駆動部、３０８…ＤＮＡチップ、３０９…検出系設置台、４０１…ＬＥＤ、４０２…ＣＣＤ、４０３…ＤＮＡチップ、４０４…検出用フィルター、４０５…レンズユニット。

Claims (12)

1. 発光像信号を電荷結合素子により検出する発光測定方法であって、予め複数パターンの露光時間で暗電流像を取得、保持し、発光測定時の測定条件として励起光源の点灯時間又は励起時間を設定し、設定された励起時間に基づいて、発光測定時の露光時間として、前記暗電流像を取得した複数の露光時間の中から最適な露光時間を選択することを特徴とする発光測定方法。
2. 前記発光は蛍光であることを特徴とする請求項１記載の発光測定方法。
3. 更に、発光測定によって取得された発光像の信号強度から、略同一の露光時間で取得、保持されている暗電流像の信号強度を電荷結合素子のピクセル毎に引き算することを特徴とする請求項１に記載の発光測定方法。
4. 電荷結合素子を検出器として用いる発光測定装置において、予め複数パターンの露光時間で暗電流像を取得、保持する手段と、発光測定時の測定条件として励起光源の点灯時間、又は励起時間を設定する手段と、設定された励起時間に基づいて、発光測定時の露光時間として、前記暗電流像を取得した複数の露光時間の中から最適な露光時間を選択する手段を有することを特徴とする発光測定装置。
5. 前記発光は蛍光であることを特徴とする請求項４記載の発光測定装置。
6. 発光測定によって取得された発光像の信号強度から、略同一の露光時間で取得、保持されている暗電流像の信号強度を電荷結合素子のピクセル毎に引き算する手段を有することを特徴とする請求項４に記載の発光測定装置。
7. 請求項４記載の発光測定装置を備えた一塩基多型解析装置。
8. 請求項５記載の発光測定装置を備えた一塩基多型解析装置。
9. 請求項６記載の発光測定装置を備えた一塩基多型解析装置。
10. 制御装置のコンピュータに対し、発光像信号を電荷結合素子により検出し、予め複数パターンの露光時間で暗電流像を取得、保持し、発光測定時の測定条件として励起光源の点灯時間又は励起時間を任意に設定し、設定された励起時間に基づいて、発光測定時の露光時間として、前記暗電流像を取得した複数の露光時間の中から最適な露光時間が選択する発光測定方法を実行するように機能させるためのプログラム。
11. 前記発光は蛍光であることを特徴とする請求項１０記載の発光測定方法を実行するように機能させるためのプログラム。
12. 発光測定によって取得された発光像の信号強度から、略同一の露光時間で取得、保持されている暗電流像の信号強度を電荷結合素子のピクセル毎に引き算する機能を有することを特徴とする請求項１０に記載のプログラム。

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