JP7038158B2 - 蛍光検出のための方法およびシステム - Google Patents
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Description
本願は、2015年4月8日に出願された米国特許出願第14/682,026号の利益を主張するものであり、該米国特許出願の内容は、その全体が参照により本明細書中に援用される。
本発明は、概して、サンプルの蛍光ベースの検出または測定、具体的には、異なるフルオロフォアを利用する多重化検出のための方法、装置、およびシステムに関する。本発明は、通常の蛍光検出(FD)および時間分解蛍光(TRF)検出を含む、蛍光ベースの検出のための異なるタイプの技法を実装し得る。
本明細書は、例えば、以下の項目も提供する。
(項目1)
多重化蛍光検出のための方法であって、
第1の被分析物に結合された第1の蛍光標識と、第2の被分析物に結合された第2の蛍光標識とを備える、サンプルを提供するステップと、
前記第1の蛍光標識に第1の励起波長における第1の励起光を照射するステップであって、前記第1の蛍光標識は、第1の発光波長における第1の検出信号を発する、ステップと、
前記第2の蛍光標識に前記第1の励起波長と異なる第2の励起波長における第2の励起光を照射するステップであって、前記第2の蛍光標識は、第2の発光波長における第2の検出信号を発する、ステップと、
第1の測定時間において前記第1の検出信号の強度を測定するステップであって、前記第1の検出信号の前記強度は、前記サンプル中の前記第1の被分析物の量と相関性がある、ステップと、
前記第2の蛍光標識を照射することを中止するステップと、
前記第2の蛍光標識を照射することを中止した後に、第2の測定時間において前記第2の検出信号の強度を測定するステップであって、前記第2の検出信号の前記強度は、前記サンプル中の前記第2の被分析物の量と相関性がある、ステップと、
を含む、方法。
(項目2)
前記第1の蛍光標識は、アップコンバーティング蛍光体(UCP)を備え、前記第2の蛍光標識は、非UCP標識を備える、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記第1の蛍光標識を照射しながら、前記第1の検出信号の前記強度を測定するステップを含む、項目2に記載の方法。
(項目4)
前記第1の蛍光標識を照射することを中止するステップと、前記第1の蛍光標識を照射することを中止した後に、前記第1の検出信号の前記強度を測定するステップとを含む、項目2に記載の方法。
(項目5)
前記UCPは、
反ストークスシフトを呈する、ランタニドをドープした、または遷移金属をドープした無機化合物、
ランタニドをドープした、または遷移金属をドープした無機化合物であって、前記無機化合物は、エルビウム(Er 3+ )、ツリウム(Tm 3+ )、ホルミウム(Ho 3+ )、プラセオジム(Pr 3+ )、ネオジム(Nd 3+ )、ジスプロシウム(Dy 3+ )、イッテルビウム(Yb 3+ )、サマリウム(Sm 3+ )、および前述のうちの2つまたはそれを上回るものの組み合わせから成る群から選択される、ドーパントイオンを含む、無機化合物、
ランタニドをドープした、または遷移金属をドープした無機化合物であって、前記無機化合物は、ハロゲン化物、酸化物、および酸硫化物から成る群から選択される、無機化合物、
のうちの少なくとも1つを備える、
項目2に記載の方法。
(項目6)
前記第1の励起波長は、近赤外範囲内であり、前記第1の発光波長は、可視範囲内である、項目2に記載の方法。
(項目7)
前記第2の励起波長は、紫外線範囲内であり、前記第2の発光波長は、前記第2の励起波長よりも長い、項目2に記載の方法。
(項目8)
前記第1の蛍光標識および前記第2の蛍光標識のうちの少なくとも1つは、遷移金属キレート、ルテニウム(Ru(II))の遷移金属キレート、オスミウム(Os(II))の遷移金属キレート、レニウム(Re(I))の遷移金属キレート、ランタニドキレート、サマリウム(Sm(III))のランタニドキレート、ジスプロシウム(Dy(III))のランタニドキレート、ユーロピウム(Eu(III))のランタニドキレート、およびテルビウム(Tb(III))のランタニドキレートから成る群から選択される、項目1に記載の方法。
(項目9)
前記サンプルは、第3の被分析物に結合された第3の蛍光標識を備え、前記方法はさらに、
前記第3の蛍光標識に前記第1の励起波長および前記第2の励起波長と異なる第3の励起波長における第3の励起光を照射するステップであって、前記第3の蛍光標識は、第3の発光波長における第3の検出信号を発する、ステップと、
前記第3の蛍光標識を照射することを中止するステップと、
前記第3の蛍光標識を照射することを中止した後に、第3の測定時間において前記第3の検出信号の強度を測定するステップと、
を含む、項目1に記載の方法。
(項目10)
前記第1の蛍光標識は、アップコンバーティング蛍光体(UCP)を備え、前記第2の蛍光標識は、非UCP標識を備え、前記第3の蛍光標識は、前記第2の蛍光標識と異なる非UCP標識を備える、項目9に記載の方法。
(項目11)
前記第3の発光波長が、前記第1の発光波長および前記第2の発光波長と異なることと、
前記第3の測定時間が、前記第1の測定時間および前記第2の測定時間と異なることと、
のうちの少なくとも1つを含む、
項目9に記載の方法。
(項目12)
前記第1の蛍光標識は、第1の蛍光発光寿命を有し、前記第2の蛍光標識は、第2の蛍光発光寿命を有し、前記第2の蛍光発光寿命は、
前記第2の蛍光発光寿命が、前記第1の蛍光発光寿命と異なること、
前記第2の蛍光発光寿命が、前記第1の蛍光発光寿命よりも長いこと、
前記第2の蛍光発光寿命が、前記第1の蛍光発光寿命よりも少なくとも5倍長いこと、
前記第2の蛍光発光寿命が、前記第1の蛍光発光寿命よりも少なくとも100倍長いこと、
前記第2の蛍光発光寿命が、前記第1の蛍光発光寿命よりも少なくとも1,000倍長いこと、
前記第2の蛍光発光寿命が、0.1マイクロ秒~10マイクロ秒の範囲内であること、および
前記第2の蛍光発光寿命が、100マイクロ秒~1ミリ秒の範囲内であること、
から成る群から選択される、
項目1に記載の方法。
(項目13)
前記第1の蛍光標識および前記第2の蛍光標識のうちの少なくとも1つは、20nmを上回るストークスシフト、100nmを上回るストークスシフト、250nmを上回るストークスシフト、および約250nm~約350nmの範囲内のストークスシフトから成る群から選択される、ストークスシフトを有する、項目1に記載の方法。
(項目14)
前記第2の発光波長が、前記第1の発光波長と異なること、
前記第2の測定時間が、前記第1の測定時間と異なること、
のうちの少なくとも1つを含む、
項目1に記載の方法。
(項目15)
前記第1の被分析物および前記第2の被分析物は、タンパク質または膜結合タンパク質を含み、さらに、
前記第1の被分析物および前記第2の被分析物のうちの一方は、基準タンパク質であり、前記第1の被分析物および前記第2の被分析物のうちの他方は、未知のタンパク質であり、さらに、前記第2の検出信号を前記第1の検出信号に正規化するステップ、または前記第1の検出信号を前記第2の検出信号に正規化するステップを含む、ことと、
前記第1の被分析物および前記第2の被分析物のうちの一方は、未修飾タンパク質であり、前記第1の被分析物および前記第2の被分析物のうちの他方は、前記タンパク質の修飾またはリン酸化バージョンであり、さらに、前記第1の検出信号および前記第2の検出信号の前記測定された強度に基づいて、前記未修飾タンパク質に対する前記タンパク質の前記修飾またはリン酸化バージョンの比を計算するステップを含む、ことと
のうちの少なくとも1つを含む、項目1に記載の方法。
(項目16)
前記第1の蛍光標識を照射するステップおよび前記第2の蛍光標識を照射するステップは、同時に、または連続的に行われる、項目1に記載の方法。
(項目17)
前記サンプルをカートリッジと光学的に整合させるステップを含み、
前記カートリッジは、前記カートリッジが光学的および/または電気的に蛍光検出装置と通信するように、前記蛍光検出装置の装置筐体の中に除去可能に設置され、
前記カートリッジは、前記光源から整合したサンプルまでの光学経路を画定する励起光学部、または前記整合したサンプルから前記光検出器までの光学経路を画定する発光光学部、または前述の両方を封入し、
前記光源は、前記カートリッジの中または前記装置筐体の中に配置され、
前記光検出器は、前記カートリッジの中または前記装置筐体の中に配置される、
項目1に記載の方法。
(項目18)
少なくとも、項目1に記載の方法の照射するステップおよび測定するステップを行うために構成される、蛍光検出装置であって、
前記第1の励起光および前記第2の励起光を生成するために構成される光源と、
前記第1の検出信号および前記第2の検出信号を測定するために構成される光検出器と、
を備える、蛍光検出装置。
(項目19)
サンプルを支持するために構成されるサンプル支持体であって、前記サンプルは、第1の被分析物に結合された第1の蛍光標識と、第2の被分析物に結合された第2の蛍光標識とを備える、サンプル支持体と、
第1の励起波長における第1の励起光および前記第1の励起波長と異なる第2の励起波長における第2の励起光を生成するために構成される、光源と、
前記第1の励起光による励起に応答して、第1の発光波長において前記サンプルから発せられる第1の検出信号、および前記第2の励起光による励起に応答して、第2の発光波長において前記サンプルから発せられる第2の検出信号を測定するために構成される、光検出器と、
コンピューティングデバイスであって、
所定の励起時間において、かつ所定の持続時間にわたって、前記第1の励起光および前記第2の励起光をそれぞれ生成するように前記光源を制御することと、
第1の測定時間において前記第1の検出信号を測定するように、かつ第2の測定時間において前記第2の検出信号を測定するように、前記光検出器を制御することと
を行うように構成される、コンピューティングデバイスと、
を備える、蛍光検出装置。
(項目20)
装置筐体と、前記装置筐体の中に除去可能に設置されるカートリッジと、前記光源から前記サンプルまでの光学経路を画定するために構成される励起光学部と、前記サンプルから前記光検出器までの光学経路を画定するために構成される発光光学部とを備え、
前記光源は、前記カートリッジの中または前記装置筐体の中に配置され、
前記光検出器は、前記カートリッジの中または前記装置筐体の中に配置され、
前記励起光学部の少なくとも一部、または前記発光光学部の少なくとも一部、または前記励起光学部の少なくとも一部および前記発光光学部の少なくとも一部は、前記カートリッジの中または前記装置筐体の中に配置される、
項目19に記載の蛍光検出装置。
a)サンプルを、
i)第1の被分析物に特異的に結合する第1の抗体と、
ii)第2の被分析物に特異的に結合する第2の抗体と
iii)第1の抗体に特異的に結合する第1の蛍光抗体複合体であって、第1の蛍光抗体複合体は、第1の蛍光発光寿命と、第1の励起波長と、第1の発光波長とを有する、第1の蛍光標識を備える、第1の蛍光抗体複合体と
iv)第2の抗体に特異的に結合する第2の蛍光抗体複合体であって、第2の蛍光抗体複合体は、第2の蛍光発光寿命と、第2の励起波長と、第2の発光波長とを有する、第2の蛍光標識を備える、第2の蛍光抗体複合体と、
接触させるステップと、
b)抗体および抗体複合体が免疫複合体を形成することを可能にするための十分な条件下で、かつ十分な時間にわたって、サンプルを培養するステップとに従って調製される。いくつかの実施形態では、抗体および抗体複合体は、溶液中の混合物の形態で提供されてもよい、または抗体および/または抗体複合体は、固形支持体の表面に付着させられてもよい。固形支持体は、磁気ビーズ、金ナノ粒子、生分解性有機ポリマーナノ粒子、マイクロウェル、またはマイクロタイタープレートであってもよいが、それらに限定されない。他の実施形態では、第1または第2の抗体は、それらに直接付着させられ、抗体複合体の必要性を排除する、第1または第2の蛍光標識を有してもよい。故に、本開示される方法は、膜に結合されたタンパク質、ビーズに結合されたタンパク質、(潜在的に分離された)マイクロ流体チャネル内のタンパク質、マルチウェルプレートのウェル内のタンパク質、および/または(潜在的に分離された)ゲルまたは他の粘性媒体内のタンパク質の検出等の被分析物の検出のための広範囲の検定を包含する。
1.多重化蛍光検出のための方法であって、
第1の被分析物に結合された第1の蛍光標識と、第2の被分析物に結合された第2の蛍光標識とを備える、サンプルを提供するステップであって、第1の蛍光標識は、アップコンバーティング蛍光体(UCP)を備え、第2の蛍光標識は、非UCP標識を備える、ステップと、第1の蛍光標識に第1の励起波長における第1の励起光を照射するステップであって、第1の蛍光標識は、第1の発光波長における第1の検出信号を発する、ステップと、第2の蛍光標識に第1の励起波長と異なる第2の励起波長における第2の励起光を照射するステップであって、第2の蛍光標識は、第2の発光波長における第2の検出信号を発する、ステップと、第1の測定時間において第1の検出信号の強度を測定するステップであって、第1の検出信号の強度は、サンプル中の第1の被分析物の量と相関性がある、ステップと、
本発明の種々の側面または詳細は、本発明の範囲から逸脱することなく変更され得ることが理解されるであろう。さらに、前述の説明は、限定の目的ではなく、例証の目的のためにすぎず、本発明は、請求項によって定義される。
Claims (23)
- 多重化蛍光検出のための方法であって、前記方法は、
第1の被分析物に結合された第1の蛍光標識と、第2の被分析物に結合された第2の蛍光標識とを備えるサンプルを提供することであって、前記第1の蛍光標識は、アップコンバーティング蛍光体(UCP)を備え、前記第2の蛍光標識は、非UCP標識を備える、ことと、
前記第1の蛍光標識に第1の励起波長における第1の励起光を照射することであって、前記第1の蛍光標識は、第1の発光波長における第1の検出信号を発する、ことと、
前記第1の蛍光標識に照射した後に、前記第2の蛍光標識に前記第1の励起波長と異なる第2の励起波長における第2の励起光を照射することであって、前記第2の蛍光標識は、第2の発光波長における第2の検出信号を発する、ことと、
第1の測定時間において前記第1の検出信号の強度を測定することであって、前記第1の検出信号の前記強度は、前記サンプル中の前記第1の被分析物の量と相関性がある、ことと、
前記第2の蛍光標識に照射することを中止することと、
前記第2の蛍光標識に照射することを中止した後に、第2の測定時間において前記第2の検出信号の強度を測定することであって、前記第2の検出信号の前記強度は、前記サンプル中の前記第2の被分析物の量と相関性がある、ことと、
を含み、
前記サンプルは、第3の被分析物に結合された第3の蛍光標識を備え、前記第3の蛍光標識は、前記第2の蛍光標識と異なる非UCP標識を備え、前記方法はさらに、
前記第2の蛍光標識に照射した後に、前記第3の蛍光標識に前記第1の励起波長および前記第2の励起波長と異なる第3の励起波長における第3の励起光を照射することであって、前記第3の蛍光標識は、第3の発光波長における第3の検出信号を発する、ことと、
前記第3の蛍光標識に照射することを中止することと、
前記第3の蛍光標識に照射することを中止した後に、第3の測定時間において前記第3の検出信号の強度を測定することと、
を含む、方法。 - 前記第1の蛍光標識に照射しながら、前記第1の検出信号の前記強度を測定することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の蛍光標識に照射することを中止することと、前記第1の蛍光標識に照射することを中止した後に、前記第1の検出信号の前記強度を測定することとを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第2の蛍光標識は、遷移金属キレート、ルテニウム(Ru(II))の遷移金属キレート、オスミウム(Os(II))の遷移金属キレート、およびレニウム(Re(I))の遷移金属キレートから成る群から選択され、前記第3の蛍光標識は、ランタニドキレート、サマリウム(Sm(III))のランタニドキレート、ジスプロシウム(Dy(III))のランタニドキレート、ユーロピウム(Eu(III))のランタニドキレート、およびテルビウム(Tb(III))のランタニドキレートから成る群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記第3の発光波長が、前記第1の発光波長および前記第2の発光波長と異なることと、
前記第3の測定時間が、前記第1の測定時間および前記第2の測定時間と異なることと、
のうちの少なくとも1つを含む、請求項1に記載の方法。 - 前記UCPは、
反ストークスシフトを呈する、ランタニドをドープした、または遷移金属をドープした無機化合物、
ランタニドをドープした、または遷移金属をドープした無機化合物であって、前記無機化合物は、エルビウム(Er3+)、ツリウム(Tm3+)、ホルミウム(Ho3+)、プラセオジム(Pr3+)、ネオジム(Nd3+)、ジスプロシウム(Dy3+)、イッテルビウム(Yb3+)、サマリウム(Sm3+)、および前述のうちの2つ以上の組み合わせから成る群から選択される、ドーパントイオンを含む、無機化合物、
ランタニドをドープした、または遷移金属をドープした無機化合物であって、前記無機化合物は、ハロゲン化物、酸化物、および酸硫化物から成る群から選択される、無機化合物、
のうちの少なくとも1つを備える、請求項1に記載の方法。 - 前記第2の蛍光標識は、遷移金属キレート、ルテニウム(Ru(II))の遷移金属キレート、オスミウム(Os(II))の遷移金属キレート、レニウム(Re(I))の遷移金属キレート、ランタニドキレート、サマリウム(Sm(III))のランタニドキレート、ジスプロシウム(Dy(III))のランタニドキレート、ユーロピウム(Eu(III))のランタニドキレート、およびテルビウム(Tb(III))のランタニドキレートから成る群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の励起波長は、近赤外範囲内であり、前記第1の発光波長は、可視範囲内である、請求項1に記載の方法。
- 前記第2の励起波長は、紫外線範囲内であり、前記第2の発光波長は、前記第2の励起波長よりも長い、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の蛍光標識の前記UCPは、第1の蛍光発光寿命を有し、前記第2の蛍光標識は、第2の蛍光発光寿命を有し、前記第1の蛍光発光寿命は、前記第2の蛍光発光寿命と異なる、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の蛍光標識の前記UCPは、第1の蛍光発光寿命を有し、前記第2の蛍光標識は、第2の蛍光発光寿命を有し、
前記第2の蛍光発光寿命が0.1マイクロ秒~10マイクロ秒の範囲内であること、および
前記第2の蛍光発光寿命が100マイクロ秒~1ミリ秒の範囲内であること、
のうちの少なくとも1つを含む、請求項1に記載の方法。 - 前記第2の蛍光標識は、250nm~350nmの範囲内のストークスシフトを有する、請求項1に記載の方法。
- 前記第2の発光波長が前記第1の発光波長と異なること、
前記第2の測定時間が前記第1の測定時間と異なること、
のうちの少なくとも1つを含む、請求項1に記載の方法。 - 前記サンプルを提供することは、前記サンプルを、前記第1の被分析物に特異的に結合する第1の抗体、前記第2の被分析物に特異的に結合する第2の抗体、前記第1の抗体に特異的に結合する第1の蛍光抗体複合体であって、前記第1の蛍光抗体複合体は、前記第1の蛍光標識を備える、第1の蛍光抗体複合体、および、前記第2の抗体に特異的に結合する第2の蛍光抗体複合体であって、前記第2の蛍光抗体複合体は、前記第2の蛍光標識を備える、第2の蛍光抗体複合体と接触させることと、前記抗体および前記抗体複合体が免疫複合体を形成することを可能にするための十分な条件下でかつ十分な時間にわたって、前記サンプルを培養することとを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記サンプルを提供することは、前記サンプルを、前記第1の被分析物に特異的に結合する第1の抗体、および、前記第2の被分析物に特異的に結合する第2の抗体と接触させることを含み、前記第1の蛍光標識が前記第1の抗体に直接付着させられるか、または、前記第2の蛍光標識が前記第2の抗体に直接付着させられるか、または、前述の両方である、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の被分析物および前記第2の被分析物は、タンパク質または膜結合タンパク質を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の被分析物および前記第2の被分析物のうちの一方は、基準タンパク質であり、前記第1の被分析物および前記第2の被分析物のうちの他方は、未知のタンパク質であり、前記第3の被分析物は、膜結合タンパク質、未修飾タンパク質、またはタンパク質の修飾もしくはリン酸化バージョンであり、さらに、前記第2の検出信号を前記第1の検出信号に正規化すること、または前記第1の検出信号を前記第2の検出信号に正規化することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の被分析物および前記第2の被分析物のうちの一方は、未修飾タンパク質であり、前記第1の被分析物および前記第2の被分析物のうちの他方は、前記タンパク質の修飾またはリン酸化バージョンであり、前記第3の被分析物は、膜結合タンパク質、基準タンパク質、または未知のタンパク質であり、さらに、前記第1の検出信号および前記第2の検出信号の前記測定された強度に基づいて、前記未修飾タンパク質に対する前記タンパク質の前記修飾またはリン酸化バージョンの比を計算することを含む、請求項1に記載の方法。
- 共通発光フィルタを通して、または異なる発光フィルタを通して、前記第1の検出信号および前記第2の検出信号を指向することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の蛍光標識に照射することおよび前記第2の蛍光標識に照射することは、同時に、または連続的に行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記サンプルを提供することは、複数のサンプルを提供することを含み、各サンプル上で、前記第1の蛍光標識に照射するステップ、前記第2の蛍光標識に照射するステップ、前記第1の検出信号の強度を測定するステップ、および前記第2の検出信号の強度を測定するステップを行うことによって、各サンプル上で多重化蛍光検出を行うことをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 各サンプル上で多重化蛍光検出を行うことは、個別のサンプルを、前記第1の励起光および前記第2の励起光を生成するために構成される光源、ならびに前記第1の検出信号および前記第2の検出信号を測定するために構成される光検出器と光学的に整合させることを含む、請求項21に記載の方法。
- 前記個別のサンプルを前記光源および前記光検出器と光学的に整合させることは、前記個別のサンプルをカートリッジと光学的に整合させることを含み、
前記カートリッジは、前記カートリッジが光学的および/または電気的に蛍光検出装置と通信するように、前記蛍光検出装置の装置筐体の中に除去可能に設置され、
前記カートリッジは、前記光源から整合したサンプルまでの光学経路を画定する励起光学部、または前記整合したサンプルから前記光検出器までの光学経路を画定する発光光学部、または前述の両方を封入し、
前記光源は、前記カートリッジの中または前記装置筐体の中に配置され、
前記光検出器は、前記カートリッジの中または前記装置筐体の中に配置される、請求項22に記載の方法。
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