JPH04324346A - 化学発光測定方法および測定装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、臨床検査や生化学実験
、理化学実験等において、生体物質、化学物質等の化学
発光分析を行うための化学発光測定方法および測定装置
に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、抗原−抗体反応やホルモン−レセ
プター反応等、生体中で行われる反応を利用して血液中
の抗原、抗体、ホルモン等の微量物質を定量する方法が
数多く実用化されている。その中で最も一般的なものが
、抗原−抗体反応を利用するラジオイムノアッセイ（Ｒ
ＩＡ）とエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）である。 ラジオイムノアッセイは測定感度がｎｇ／ｍｌ〜ｐｇ／
ｍｌと大変高い、共存物質の影響を受けにくい等の利点
を持つ。その反面、放射性同位元素（ラジオアイソトー
プ、以下ＲＩとする）を用いるため、管理施設、廃棄物
処理、測定装置等に費用がかかる、ＲＩの半減期が短い
ため試薬の有効期限が短いといった欠点を持つ。そこで
、こうしたＲＩＡの欠点を補う方法として、ＲＩの代わ
りに酵素を用いるＥＩＡが開発された。ＥＩＡは非放射
性測定という利点により、急速に普及したが、検出手段
にこれまで主として比色法が用いられていたため、実用
感度ではＲＩＡに劣った。しかし、検出法に化学発光・
生物発光（以下、本明細書では両者を含め化学発光とす
る）を用いるこことで、ＲＩＡ並の感度が得られるため
、最近注目を集めている。一方、化学発光は、エンザイ
ムイムノアッセイだけでなく、Ｈ２Ｏ２、ＡＴＰ、ＮＡ
ＤＰといった直接発光物質に作用する生体物質の定量に
も応用されている。

【０００３】化学発光を測定する方法としては、セル中
又はマイクロプレート中の発光反応を光電子増倍管で検
出するルミノメータを用いる方法が一般的であるが、光
電子増倍管は半導体検出器に比べロット内及びロット間
の品質のバラツキが大きい、長時間動作させるとダイノ
ードが劣化し陽極電流が変動する（ドリフト）という欠
点を持つ。これに比べ、ＲＩＡの測定に用いるシンチュ
レーションカウンタや比色法ＥＩＡに用いる比色計では
、標準物質と被測定物の比較により測定結果を得るため
、光電子増倍管のように部品差やドリフトによらず安定
した結果を得ることができる。これらの方法が相対値を
求める測定法であるのに対し、化学発光は絶対値を測定
する方法であり標準物質を得ることが難しい。

【０００４】化学発光の測定に標準光を用いる装置とし
ては、特定のガスの反応による化学発光を測定するもの
として特開昭６３−３７２４３号公報に記載される分析
計が知られている。この分析計は、従来行なわれている
、標準ガスを流すことにより定期的な検出部の感度校正
を行なう代わりに、発光チャンバ内に標準光を発する発
光ダイオードを設け、この発光ダイオードを、感度校正
の必要が生じた場合に点灯させて、検出器の感度を校正
するというものであり、化学発光自体の測定にには補正
は加えられていない。従って、前記の欠点を解決するも
のということはできない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明はかかる化学発
光測定の問題点を解決し、化学発光の強度を機械差や経
時変化によらず、精度良く再現性の良い測定値を得る化
学発光測定方法および測定装置を提供するものである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】すなわち本発明は、化学
発光する被測定物の発光量を測定する方法であって、該
化学発光の発光量および該化学発光のピーク波長λ１と
ほぼ同様のピーク波長λ２を有するように調整された一
定の光量を発する標準光の発光量を、相対光感度特性が
５０％以上の範囲に該ピーク波長λ１及びλ２を有する
光電子増倍管を用いて測定し、標準光の発光量の測定値
に対する該化学発光の発光量の測定値の相対強度から、
被測定物の発光量を定量することを特徴とする化学発光
測定方法に関する。

【０００７】また、本発明は化学発光する被測定物の発
光量を測定する装置であって、被測定物を収容する容器
、測定する該化学発光のピーク波長λ１とほぼ同様のピ
ーク波長λ２を有するように調整された標準光光源、相
対光感度特性が５０％以上の範囲に該ピーク波長λ１及
びλ２を有する光電子増倍管を有する測光部および該測
光部によって測定された、標準光の発光量の測定値に対
する該化学発光の発光量の測定値の相対強度を算出し被
測定物の発光量を定量するデータ解析部を有することを
特徴とする化学発光測定装置に関する。

【０００８】まず、本発明の測定方法について説明する
。本発明に用いられる化学発光する被測定物としては特
に制限はない。例えば、化学発光物質として、過酸化水
素と反応して発光するルミノール（５−アミノ−２，３
−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン）及びイソルミ
ノールとその誘導体、ルシゲニン（１０，１０’−ジメ
チルー９，９’ビアクリジウム二硝酸塩）、アクリジウ
ム塩やそのエステル、熱的冷気で発光する１，２−ジオ
キセタン、強塩基存在下酸素により発光するロフィン（
２，４，５−トリフェニルイミダゾール）、３−メチル
インドール等のインドール誘導体、酸素や空気にさらさ
れると発光するテトラキス（ジメチルアミノ）エチレン
、ジメチルホルムアミド溶液中ｔ−ブチル存在下で発光
するシッフ塩基等が測定できる。中でもルミノールまた
はイソルミノールと過酸化水素存在下でペルオキシダー
ゼを用いる系が最も良く使われる。また、シュウ酸ジエ
ステル等のシュウ酸誘導体にペレリン、８−アニリノナ
フタレン−１−スルホン酸、ダンシルアミノ酸等の蛍光
物質を共存させ蛍光物質を励起させて発光させる方法も
測定できる。

【０００９】また、生物発光物質としてはホタル、発光
バクテリア等のルシフェラーゼ、オワンクラゲから得ら
れるエクオリン等の各種発光蛋白がある。これらの発光
物質は発光を増幅する成分、所謂エンハンサーと共に用
いることができる。これらエンハンサーとしては６−ヒ
ドロキシベンゾチアゾールやヨウドフェノール等のフェ
ノール誘導体がある。

【００１０】被測定物の形態としては固体、液体があり
、具体的な検体として種々のものがあげられるが、本発
明の方法が特に有効なものとして、マストイムノシステ
ムズ（米国マストイムノシステムズ社製、商品名）の測
定容器（図４）の各糸１９の発光の測定が挙げられる。 これはアレルギー診断薬であり、特開昭５８−５０１６
３７号公報、特開昭６０−８９７５３号公報、特開昭６
１−８２１６５号公報、特開昭６２−２２７７０公報に
詳細が記載されるが、アレルギー特異的ＩｇＥ抗体の定
量試薬で、図４に示す様に血清や発光試薬を注入するプ
ラスチック容器中に、多種類の各アレルゲン（アレルギ
ーの原因物質）を結合した各糸１９が配列されている。 アレルギー患者の血清を本容器に注入すると血清中の特
異抗体がアレルゲンに結合する。この複合体に酵素標識
二次抗体（ＩｇＥ）を反応させた後ルミノールと過酸化
水素の組合せで化学発光を誘起し、発光量の測定により
血清中の抗体量を定量する方法である。なお、従来この
発光量の測定はポラロイドフィルムへの露光、得られる
フィルムの透過度電圧の測定により行なわれており、露
光に時間を要し、測定精度も低いものであった。

【００１１】その他、マイクロタイタープレート中の試
料の化学発光、制限酵素で切断したＤＮＡ断片、ＲＮＡ
を電気泳動し、セルロース等の膜にこれを移してＤＮＡ
プローブで相補的配列を調べるサザンブロッティング法
及びノザンブロッティング法、タンパク質を電気泳動し
、セルロース等の膜にこれを移して特異抗体で抗原検索
するウェスタンブロッティング法を化学発光を用いて測
定する場合の測定も可能である。

【００１２】本発明に用いる標準光源は、発光ダイオー
ド、タングステンランプ、半導体レーザなど電力で発光
する部品であれば特に制限はないが、被測定物の化学発
光のピーク波長λ１とほぼ同様のピーク波長λ２を有す
るものか、有するように調整できるものである必要があ
る。ここでほぼ同様とは、両ピーク波長の差が、１００
ｎｍ以内、特に５０ｎｍ以内の範囲にあることが好まし
い。両ピーク波長の差が大きいと、光パワーメータで測
定した光量のバラツキが大きくなるという欠点を持ち、
結果として再現性のよい測定値は得られない。

【００１３】例えば、化学発光に最も広く用いられるル
ミノールの発光ピーク波長λ１は４２５ｎｍである。発
光ダイオードや半導体レーザといった半導体部品は、一
定の波長幅を持ち動作電流を少なくして用いれば出力も
安定であるが、比較的長波長の光を放出するものが多く
、汎用で最も短い波長を出すのは緑色発光ダイオードで
５７０ｎｍにピークを持ち、４２５ｎｍではほとんど出
力が無い。そこで、ランプやフィルターの寿命が比較的
短いという問題はあるが、タングステンランプの光を複
数のフィルターで加工して、ピーク波長λ２が３２５〜
５２５ｎｍ、特に３７５〜４７５ｎｍとなるように調整
することが好ましい。なお最近、４７０ｎｍにピーク波
長λ２を持つ青色ダイオードも開発され市販され始めた
ため、これらの発光ダイオードを用いる方法も好ましい
。さらに、無機、有機の各種単結晶やアモルファスポリ
マー系のレーザ光波長変換素子を用いて二次高調波を取
りだすことで、８００〜１，０００ｎｍの光から４２５
ｎｍとほぼ同様のピーク波長λ２を有する光を得ても良
い。

【００１４】上記被測定物の発光量及び標準光の発光量
は、相対光感度特性が５０％以上の波長範囲に、被測定
物の化学発光のピーク波長λ１及び標準光のピーク波長
λ２を有する光電子増倍管を用いて測定される。ここで
、相対光感度特性とは、光電子増倍管の光感度のピーク
値を１００％とした各波長における光感度の割合をいう
。波長λ１またはλ２が、相対光感度特性が５０％未満
の範囲にある光電子増倍管を用いると、同一試料を測定
したときに装置間のバラツキが大きくなる。

【００１５】被測定物の発光量は、標準光の発光量の測
定値に対する該化学発光の発光量の測定値の相対強度か
ら定量される。具体的には、例えば標準光の測定値を常
に一定の強度になるように換算し、これと同様の換算操
作を被測定物の発光量の測定値に行なうことによって求
めたり、単純に両測定値の差の値を基に求めることもで
きる。

【００１６】また、本発明の測定方法においては、標準
光の発光量を常に一定とする為に、光パワーメータを用
いて定期的に標準光の発光量を検定し、調整することが
必要である。ここで、光パワーメータとは、半導体ダイ
オードや光電子増倍管等からなる検出部と光電変換され
た電気信号をＷやｄＢといった光のパワーに換算し表示
する本体からなり、機電研の標準光源により直接または
間接的に較正されたものをいう。検定の頻度は、光源の
種類や測定装置の使用頻度により異なるが、おおよそ６
ヵ月に１回程度行なうのが好ましい。

【００１７】次に、本発明の化学発光測定方法を実施す
るための本発明の化学発光測定装置について詳述する。 本発明の測定装置の一例の要部を図１（斜視図）に示す
。図１では、被測定物として、マストイムノシステムズ
の専用反応容器１０　　５本を固定台１１（収容容器）
上に固定し、プレートホルダ１２上に設置している。図
１に示されるように測光部１はレンズ２、３、移動方向
と垂直方向に長いスリット４、５、反射ミラー６、光電
子増倍管８及び増幅器７から構成される。該測光部１は
、標準光光源及び収容容器（固定台１１）上を、ガイド
棒９に沿って、図中に示されるＸ方向に一定速度で走査
し、発光強度を測定することが可能である。また、プレ
ートホルダ１２は図中で示されるＹ方向に移動が可能で
ある。プレートホルダ１２の一端の下部には標準光の光
源としてタングステンランプ１４が固定台１３上に固定
され、タングステンランプ１４の上部には干渉フィルタ
１５及び１６がフィルタ固定部品１７で固定される。 該フィルタ及び標準光穴１８を通して標準光が発せられ
る。

【００１８】図１における被測定物はマストイムノシス
テムズ（ルミノール発光、発光波長ピーク４２５ｎｍ）
であるので、この測定装置における標準光は干渉フィル
タにより４２５ｎｍに波長ピークを有するように調整さ
れている。また、光電子増倍管８は、図３のグラフに示
されるような相対光感度特性を有する。図３に、合わせ
てルミノール発光及び標準光の波長と発光強度の関係を
示す。

【００１９】実際の測定は、測光部１が測定開始直後に
標準光穴１８上に移動し、標準光の光量を測定してから
ガイド棒９に沿って移動し、被測定物上を走査しながら
化学発光量を測定する。測定部において測定され電気信
号に変換された測定値から、データ解析部において、標
準光の発光量の測定値に対する化学発光量の測定値の相
対強度が算出され、この値を基に被測定物の発光量が定
量される。該データ解析部としては、マイクロプロセッ
サが使用される。

【００２０】図２に前記測定装置の概略図を示す。標準
光又は被測定物からの光は反射ミラーを経て光電子増倍
管に入り、増幅器、Ａ／Ｄコンバータを経てマイクロプ
ロセッサーに取り込まれ、相対強度が演算されてプリン
タに出力される。一方マイクロプロセッサーは測光部や
プレートホルダーの駆動モータも制御する。例えば、測
光部が所定のサンプリング回数のデータを取り込んだ後
、測光部を次の位置へ微小送りする。

【００２１】以上のような本発明の化学発光測定方法及
び測定装置によれば、測定装置の機械差や、測定装置の
使用による経時変化によらず、再現性の良い一定の測定
値を得ることができる。

【００２２】

【実施例】以下に本発明の実施例を示す。本実施例では
図１及び図２に示す化学発光測定装置であって、図３に
示す特性の標準光と光電子増倍管を有する化学発光測定
装置を使用した。被測定検体は、アレルギー診断薬マス
トイムノシステムズ（米国マストイムノシステムズ社製
、輸入元日立化成工業（株））の反応容器（図４）に該
商品の使用説明書に従って、検体血清、酵素標識抗体を
反応させた後、化学発光用ルミノール溶液を充填したも
のを用いた。本装置は、１サイクルの測定で最大５本の
反応容器まで測定できる。各サイクルの測定のはじめに
、測光部はステージ左上の部分の標準光の光強度を測定
し、この値を常に５，０００カウントに換算する。標準
光の光源にはタングステンランプと色ガラスフィルター
２枚の組合せを用い、この光強度は８０ｐＷに設定した
。標準光の光強度の測定にはアンリツ製光パワーメータ
ＭＬ９００１Ａを、光パワーメータの測光センサーには
ペルチェ素子で温度の影響を除外したアンリツ製ＭＡ９
４１３Ａを用いた。また、光電子増倍管は、浜松ホトニ
クス製、ヘッドオン型を用いた。

【００２３】実際の測定は、測光部を０．１８８ｍｍ間
隔で移動し停止する度に発光強度を測定することを繰返
すことにより行ない、１つの反応容器について約１，０
００点発光強度を測定した。図１に示すように、プラス
チック容器に沿って（Ｘ方向）、測光部を走査し発光強
度を測定した。これをマイクロプロセッサーで数値解析
し、各ピーク値を各アレルゲンの発光量に割当て、標準
光との相対強度を求めた。図５に示すような波形グラフ
を得た。１本あたりの走査時間は２０秒であった。３台
の測定装置（Ｎｏ．１，２，３）を試作し、３０検体の
マスト反応容器の測定（各検体に３５本のアレルゲン固
定糸を有するので実質的には１０５０の検体試料を測定
）を行い機械間の相関を求めたところ、表１に示すよう
な良好な相関を得た。なお、Ｙ切片は、フルレンジ１０
０００に対しての値である。

【００２４】

【表１】

【００２５】

【発明の効果】化学発光では安定した標準物質を入手す
ることが難しいが、本発明の測定方法及び測定装置によ
れば、装置の機械差や経時変化によらず、再現性の良い
一定の測定値を得ることができる。さらにこの標準光の
出力を光パワーメータを用いて定期的に検定し一定とす
ることにより、さらに再現性の良い測定値を得ることが
できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の化学発光測定装置の１例の要部を示す
斜視図である。

【図２】本発明の化学発光測定装置の１例を示す概略図
である。

【図３】本発明の化学発光測定装置の１例における被測
定物の化学発光及び標準光の発光強度と波長の関係並び
に光電子増倍管の光感度と波長の関係を示すグラフであ
る。

【図４】本発明の化学発光測定方法が有用であるマスト
イムノシステムズの反応容器をしめす斜視図である。

【図５】本発明の実施例において測定された１反応容器
の発光強度の相対強度による波形グラフである。

【符号の説明】

１…測光部 ２…レンズ ３…レンズ ４…スリット ５…スリット ６…反射ミラー ７…増幅器 ８…光電子増倍管 ９…ガイド棒 １０…専用反応容器 １１…固定台 １２…可動式プレートホルダ １３…固定台 １４…タングステンランプ １５…干渉フィルタ １６…干渉フィルタ １７…フィルタ固定部品 １８…標準光穴 １９…アレルゲン固定糸

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　化学発光する被測定物の発光量を測定
   する方法であって、該化学発光の発光量および該化学発
   光のピーク波長λ１とほぼ同様のピーク波長λ２を有す
   るように調整された一定の光量を発する標準光の発光量
   を、相対光感度特性が５０％以上の範囲に該ピーク波長
   λ１及びλ２を有する光電子増倍管を用いて測定し、標
   準光の発光量の測定値に対する該化学発光の発光量の測
   定値の相対強度から、被測定物の発光量を定量すること
   を特徴とする化学発光測定方法。
2. 【請求項２】　　標準光の発光量を光パワーメータを用
   いて定期的に検定し、常に一定とする請求項１記載の化
   学発光測定方法。
3. 【請求項３】　　化学発光する被測定物の発光量を測定
   する装置であって、被測定物を収容する容器、測定する
   該化学発光のピーク波長λ１とほぼ同様のピーク波長λ
   ２を有するように調整された標準光光源、相対光感度特
   性が５０％以上の範囲に該ピーク波長λ１及びλ２を有
   する光電子増倍管を有する測光部および該測光部によっ
   て測定された、標準光の発光量の測定値に対する該化学
   発光の発光量の測定値の相対強度を算出し被測定物の発
   光量を定量するデータ解析部を有することを特徴とする
   化学発光測定装置。
4. 【請求項４】　　測光部が、被測定物を収容する容器お
   よび標準光光源上を走査するように構成される請求項３
   記載の化学発光測定装置。
5. 【請求項５】　　測光部が、レンズ、移動方向と垂直方
   向に長いスリット、反射ミラー、光電子増倍管及び増幅
   器を有する請求項３又は４記載の化学発光測定装置。