JP2007205774A

JP2007205774A - 蛍光測定装置

Info

Publication number: JP2007205774A
Application number: JP2006023006A
Authority: JP
Inventors: Kohei Maruyama; 浩平丸山; Tadashi Matsunaga; 是松永; Haruko Takeyama; 春子竹山
Original assignee: Juki Corp; Tokyo University of Agriculture and Technology NUC; Tokyo University of Agriculture
Current assignee: Juki Corp; Tokyo University of Agriculture and Technology NUC; Tokyo University of Agriculture
Priority date: 2006-01-31
Filing date: 2006-01-31
Publication date: 2007-08-16

Abstract

【課題】安価かつ小型で機械的信頼性の高い蛍光測定装置の提供。
【解決手段】試料に励起光を照射し、試料中の蛍光物質により発せられる蛍光を測定して試料中の測定対象物を測定する蛍光測定装置であって、異なる発光波長を有する複数のＬＥＤからなる励起光源と、該励起光源から射出された励起光のうち特定の波長成分のみ透過させる励起光用波長選択フィルターと、励起光を伝達し先端で照射する複数の投光用ファイバーと、試料から発せられた蛍光を受光する複数の受光用ファイバーと、前記投光用ファイバーと受光用ファイバーから成る投受光部を保持する光ファイバー位置決めフォルダと、受光した蛍光のうち特定の波長成分のみ透過させる受光用波長選択フィルターと、透過した光を一つの光量検出器へ束ねる集光用ファイバーとを有し、前記励起光源は光源を交互に点灯させることにより測定対象物を測定することを特徴とする蛍光測定装置。
【選択図】なし

Description

本発明は、励起光源及び光量検出器を備えてなる蛍光測定ヘッドが、複数の蛍光物質が混合された試料を含む試料容器（マイクロプレート等）に対し相対的に走査測定する方式の蛍光測定装置に関する。

従来から、生化学分野におけるアッセイにおいて、蛍光試薬を反応させて生じた蛍光を測定して定量分析や定性分析を行う蛍光分析が知られている。一般に、斯かる蛍光分析においては、マイクロプレート、マイクロアレイ、マイクロウェル等の試料容器に入った蛍光物質含有溶液に対して、励起ランプあるいはレーザー光等の励起光を照射し、照射した励起光の波長とは異なる波長の発光が観察される現象を利用して、溶液中の目的成分を検出する蛍光測定装置が用いられる（特許文献１参照）。
また、測定対象物の成分によって複数の物質を検出する場合は、検出対象となる物質に応じて、種類の異なる複数の蛍光試薬が試料に混合され、各蛍光試薬に応じた波長の光を別々に照射し、蛍光試薬ごとの波長の蛍光強度を測定することによって成分分析が行われている（特許文献２参照）。

非特許文献１に開示された装置（図１参照）では、複数の物質を検出するための波長選択手段として、波長選択用光学フィルターを装着した光学フィルターホイールを指定のフィルター位置に回転させることで波長選択を行っている。具体的には、ハロゲンランプ５３から照射され、光学フィルターホイール５１に装着された波長選択用光学フィルター５１ａによって波長選択された励起光が、光ファイバー５４を経て測定対象物５５へと誘導されるようになっている。そして、測定対象物５５からの発光は、光ファイバーと検出用フィルターホイール５２に装着された波長選択用光学フィルター５２ａを通して、光電子増倍管（ＰＭＴ）にて光強度が測定される。この装置では、複数の測定対象物を測定するために、光源側又は測定対象側をＸＹ移動させることによって、ひとつ毎に励起して蛍光を測定している。
しかしながら、この非特許文献１に開示されたシステムは、励起光源としてハロゲンランプを採用しているので、光源の安定化時間を多く要すること、また、ランプ寿命が比較的短いという問題がある。加えて、フィルターホイールという機構を要するために、装置が大型化し、高価な装置にならざるを得ず、また、波長選択のための駆動部を持つことからの機械的信頼性に問題が残る。

一方、非特許文献２に開示された装置（図２参照）では、複数の物質を検出するための波長選択手段として、複数の各波長専用の光ファイバーを備えることで波長選択を行っている。具体的には、ハロゲンランプ５７に４枚の波長選択用光学フィルター５６が装着されており、ハロゲンランプ５７から照射され、かつ波長選択された励起光が、光ファイバーを経て測定対象物５９へと誘導されるようになっている。そして、測定対象物５９からの発光は、光ファイバーと波長選択用光学フィルター５８を通して、各波長専用の光電子増倍管（ＰＭＴ）にて光強度が測定される。
しかしながら、この非特許文献２に開示されたシステムは、光電子増倍管を各波長専用に複数備えていることから、非常に高価な装置にならざるを得ない。
特開２０００−２４９６５０号公報特表２０００−５０３７７４号公報 "MX3000P Real-Time PCR System Brochure"、STRATAGENE社個別カタログ、［online］、[平成１７年１２月２０日検索]、インターネット＜URL:http://www.bmbio.com/product/mx3000p/index.shtml＞ "MX4000 Multiplex Quantitative PCR System Brochure"、STRATAGENE社個別カタログ、［online］、[平成１７年１２月２０日検索]、インターネット＜URL: http://www.bmbio.com/product/mx4000/＞

本発明は、安価かつ小型で機械的信頼性の高い蛍光測定装置を提供することを目的とする。

すなわち、本発明は、試料に励起光を照射し、試料中の蛍光物質により発せられる蛍光を測定して試料中の測定対象物を測定する蛍光測定装置であって、異なる発光波長を有する複数のＬＥＤからなる励起光源と、該励起光源から射出された励起光のうち特定の波長成分のみ透過させる励起光用波長選択フィルターと、励起光を伝達し先端で照射する複数の投光用ファイバーと、試料から発せられた蛍光を受光する複数の受光用ファイバーと、前記投光用ファイバーと受光用ファイバーから成る投受光部を保持する光ファイバー位置決めフォルダと、受光した蛍光のうち特定の波長成分のみ透過させる受光用波長選択フィルターと、透過した光を一つの光量検出器へ束ねる集光用ファイバーとを有し、前記励起光源は光源を交互に点灯させることにより測定対象物を測定することを特徴とする蛍光測定装置を提供するものである。

本発明の装置は、波長選択のための駆動部を必要とせず、１台の光量検出器のみしか必要としないことから、安価かつ小型で、機械的信頼性の高い蛍光測定装置とすることができる。また、励起光源を交互に点灯し一つの測定対象容器のみ励起光を照射することから、クロストークがなく、複数の蛍光物質が混合された試料を測定する場合に精度良い測定を行うことができる。また、投光用ファイバーと受光用ファイバーから成る投受光部をウェルピッチ又はその倍数の距離で並べてホルダーに固定すれば、ホルダーをＸＹ方向に移動させる回数が減り、測定時間の短縮を図ることができる。また、光源としてＬＥＤ光源を用いることから、従来の装置と比べ寿命が長く、また消費電力を抑えることができる。

以下、添付図面に示す実施例に基づき、本発明の実施形態を説明する。
図３は本発明の蛍光測定装置の構成図である。図３において、１ａは第１のＬＥＤ光源、１ｂは第２のＬＥＤ光源、２ａは第１の励起光用波長選択フィルター、２ｂは第２の励起光用波長選択フィルター、２ｃは第１の受光用波長選択フィルター、２ｄは第２の受光用波長選択フィルター、３ａは第１の投光用ファイバー、３ｂは第２の投光用ファイバー、４は光ファイバー位置決めホルダー、５は集光用ファイバー、６は光量検出器、７ａは第１の受光用ファイバー、７ｂは第２の受光用ファイバー、８は測定対象物、９は測定対象容器、９ａはウェル、１０ａは第１の投受光部、１０ｂは第２の投受光部、Ｐはウェルピッチを示す。

図３において、第１のＬＥＤ光源１ａから射出された励起光は、第１の投光用ファイバー３ａの基端に入る前に、第１の励起光用波長選択フィルター２ａによって、特定の波長成分のみに分離される。第１の投光用ファイバー３ａは、第１の励起光用波長選択フィルター２ａを透過した励起光を導いて、当該第１の投光用ファイバー３ａ先端から、測定対象容器９中の測定対象物８に当該励起光を照射する。第１の励起光用波長選択フィルター２ａは、光の予め選択した波長または帯域を反射しつつ、同時に、反射光における所望の波長または帯域を通過可能としている。測定対象物８から発せられた蛍光は、第１の受光用ファイバー７ａの先端より受光され、第１の受光用波長選択フィルター２ｃを透過した後、集光用ファイバー５によって一箇所に束ねられ、光量検出器６へと導かれる。第１の受光用波長選択フィルター２ｃは、測定対象物８から発せられた蛍光のうち特定の波長成分のみ通過可能としている。第１の受光用波長選択フィルター２ｃにより、測定対象物８や測定対象容器９の底面や側面から反射した迷光を遮断でき、精度の良い測定を行うことができる。

同様にして、第２のＬＥＤ光源１ｂから射出された励起光は、第２の投光用ファイバー３ｂの基端に入る前に、第２の励起光用波長選択フィルター２ｂによって、特定の波長成分のみに分離される。第２の投光用ファイバー３ｂは励起光を導いて、当該第２の投光用ファイバー３ｂの先端から、測定対象容器９中の測定対象物８に当該励起光を照射する。測定対象物８から発せられた蛍光は、第２の受光用ファイバー７ｂの先端より受光され、第２の受光用波長選択フィルター２ｄを通過した後、集光用ファイバー５によって一箇所に束ねられ、光量検出器６へと導かれる。
第１及び第２の投光用ファイバー３ａ、３ｂは、１本の光ファイバーで構成されるのに対して第１及び第２の受光用ファイバー７ａ、７ｂは、複数本の光ファイバーで構成される。そして、測定対象物８に接近する先端部において、例えば第１の投光用ファイバー３ａの光ファイバー１本を中心として周囲に第１の受光用ファイバー７ａの光ファイバー６本が均等に配置されて束ねられて第１の投受光部１０ａを構成している。中央の光ファイバーの基端側は第１のＬＥＤ光源１ａ側に連結されており、また、周囲６本の光ファイバーの基端側は集光用ファイバー５側に束ねて連結されている。なお、第２の投光用ファイバー３ｂと第２の受光用ファイバー７ｂについても前記と同様に第２の投受光部１０ｂを構成している。

測定対象物容器９には、測定対象物８を含有する試料が収容され、蛍光測定装置に設けられた載置領域に配置されて上記測定が行われる。試料中には、例えば測定対象物としての複数の異なる波長を有する蛍光物質で標識された細胞、抗原、抗体、核酸、それらを含有する緩衝液等が含まれる。測定対象物容器９は、例えば図３に示すように、上方に開口したＶ底のウェル９ａが、平面状に８行１２列で計９６個形成されているマイクロプレート９である。このウェル９ａは、その上部径φ３．０ｍｍ、深さが９．０ｍｍに設定されており、隣り合うウェル９ａ間は９．０ｍｍピッチで、各ウェルごとに入れられた測定対象物８に対して個別に測定が行われる。

第１及び第２の投受光部１０ａ、１０ｂの先端は、光ファイバー位置決めホルダー４によって固定されており、この光ファイバー位置決めホルダー４は制御機構（図示しない）によって測定対象容器９の上方をＸＹ方向に移動可能となっている。
測定対象容器９の上方に、第１の投光用ファイバー３ａの先端が移動した後、第１のＬＥＤ光源１ａは電圧を印加することで点灯し、容器中の蛍光物質が発した蛍光強度を光量検出器６で測定する。続いて、同容器の上方に、光ファイバー位置決めホルダー４の第２の投光用ファイバー３ｂの先端が移動した後、第２のＬＥＤ光源１ｂは電圧を印加することで点灯し、容器中の蛍光物質が発した蛍光強度を光量検出器６で測定する。このように、複数のＬＥＤ光源は交互に点灯し、一つの測定対象物容器９ごとに励起光を照射して測定することにより、クロストークなしに、高精度に蛍光検出することができる。

ここで、第１及び第２の投受光部１０ａ、１０ｂの先端とを、測定対象容器９のウェルピッチＰ又はその倍数の間隔で並べて光ファイバー位置決めホルダー４に固定すれば、時間的なメリットがある。すなわち、測定対象容器９として９６ウェルマイクロプレートを用いる場合、そのウェルピッチＰは通常９．０ｍｍであり、第１及び第２の投光用ファイバー３ａ、３ｂの先端の距離をこの９．０ｍｍ又はその倍数とすれば、本来、光ファイバー位置決めホルダー４を１９２（９６×２）回ＸＹ方向に動かす必要があるのに対し、１０８回だけＸＹ方向に動かせば良く、１枚の９６ウェルマイクロプレートあたり、約４０％の時間短縮が見込める。

Ｃｙ３およびＣｙ５の蛍光色素を含む測定対象物８について測定する場合を例に詳述すると、第１のＬＥＤ光源１ａはＣｙ３を励起するための光源であり、５２０ｎｍ〜５５０ｎｍの緑色の光を発する。第２のＬＥＤ光源１ｂはＣｙ５を励起するための光源であり、６２０ｎｍ〜６４５ｎｍの赤色の光を発する。
第１の励起光用波長選択フィルター２ａは、第１のＬＥＤ光源１ａから発せられた光のうち、５４０ｎｍ±１０ｎｍの成分のみを透過する。第２の励起光用波長選択フィルター２ｂは、第２のＬＥＤ光源１ｂから発せられた光のうち、６４０ｎｍ±１０ｎｍの成分のみを透過する。第１の受光用波長選択フィルター２ｃは、蛍光物質から発せられた光のうち、５８０ｎｍ±１０ｎｍの成分のみを透過する。第２の受光用波長選択フィルター２ｄは、蛍光物質から発せられた光のうち、６７０ｎｍ±１０ｎｍの成分のみを透過する。第１及び第２の受光用波長選択フィルター２ｃ、２ｄを通った各蛍光物質から発せられた光は、集光用ファイバー５により一つに束ねられ、一つの光量検出器６へ至る。

第１及び第２の投光用ファイバー３ａ、３ｂ、並びに第１及び第２の受光用ファイバー７ａ、７ｂとしては、特に限定されないが、プラスチック光ファイバーを用いることができる。光ファイバーのコア材料としては、例えばＰＭＭＡ、ＰＣ、α−ＰＯ等が挙げられ、またクラッド材料としては、例えばフッ素系樹脂等が挙げられる。投光用ファイバー及び受光用ファイバーの直径・長さは、特に制限されないが、例えば直径φ１ｍｍ〜２ｍｍ、長さ４００ｍｍ〜１２００ｍｍ程度が好ましい。

光量検出器６は第１の蛍光発光および第２の蛍光発光の光量を検出するための検出器で、特に限定されず、例えば微弱光を測定するものとして多用されている光電子増倍管である。

第１及び第２の受光用波長選択フィルター２ｃ、２ｄを通った各蛍光物質から発せられた光を、一つの光量検出器６に束ねる集光用ファイバー５は、例えば直径０．２５ｍｍ、長さ１００ｍｍの光ファイバー４０本を束ねた先端部と、双方の８０本を束ねた基端部で構成される。集光用ファイバー５は、上記第１及び第２の投光用ファイバー３ａ、３ｂ並びに第１及び第２の受光用ファイバー７ａ、７ｂと同様の素材のものを用いることができる。

図１は、従来の蛍光測定装置を示す図である。図２は、従来の蛍光測定装置を示す図である。図３は、本発明の蛍光測定装置の構成図を示す図である。

符号の説明

１ａ第１のＬＥＤ光源
１ｂ第２のＬＥＤ光源
２ａ第１の励起光用波長選択フィルター
２ｂ第２の励起光用波長選択フィルター
２ｃ第１の受光用波長選択フィルター
２ｄ第２の受光用波長選択フィルター
３ａ第１の投光用ファイバー
３ｂ第２の投光用ファイバー
４光ファイバー位置決めホルダー
５集光用ファイバー
６光量検出器
７ａ第１の受光用ファイバー
７ｂ第２の受光用ファイバー
８測定対象物
９測定対象容器（マイクロプレート）
９ａウェル
１０ａ第１の投受光部
１０ｂ第２の投受光部
５１光学フィルターホイール
５１ａ波長選択用光学フィルター
５２検出用フィルターホイール
５２ａ波長選択用光学フィルター
５３ハロゲンランプ
５４光ファイバー
５５測定対象物
５６波長選択用光学フィルター
５７ハロゲンランプ
５８波長選択用光学フィルター
５９測定対象物
Ｐウェルピッチ

Claims

試料に励起光を照射し、試料中の蛍光物質により発せられる蛍光を測定して試料中の測定対象物を測定する蛍光測定装置であって、異なる発光波長を有する複数のＬＥＤからなる励起光源と、該励起光源から射出された励起光のうち特定の波長成分のみ透過させる励起光用波長選択フィルターと、励起光を伝達し先端で照射する複数の投光用ファイバーと、試料から発せられた蛍光を受光する複数の受光用ファイバーと、前記投光用ファイバーと受光用ファイバーから成る投受光部を保持する光ファイバー位置決めフォルダと、受光した蛍光のうち特定の波長成分のみ透過させる受光用波長選択フィルターと、透過した光を一つの光量検出器へ束ねる集光用ファイバーとを有し、前記励起光源は光源を交互に点灯させることにより測定対象物を測定することを特徴とする蛍光測定装置。
前記複数の投受光部が、ウェルピッチ又はその倍数の間隔で並べて光ファイバー位置決めフォルダに固定されてなるものである、請求項１記載の蛍光測定装置。