PL177136B1

PL177136B1 - Sposób wykrywania specyficznych komórek docelowych w zawiesinach mieszanych populacji komórek i w układach płynnych zawierających mieszane populacje komórek oraz zawiesinach jednokomórkowych przygotowanych z tkanek litych oraz zestaw do stosowania tego sposobu

Info

Publication number: PL177136B1
Application number: PL93308109A
Authority: PL
Inventors: Oystein Fodstad; Gunnar Kvalheim
Original assignee: Oystein Fodstad; Gunnar Kvalheim
Priority date: 1992-09-14
Filing date: 1993-09-10
Publication date: 1999-09-30
Also published as: DE69326956D1; SK32995A3; US6184043B1; WO1994007139A1; JP3417563B2; US6893881B1; DK0660930T3; CZ65995A3; JPH08501390A; AU2593192A; AU686569B2; DE69326956T2; HUT73741A; FI951161A; EP0660930B1; HU9500723D0; SK281566B6; FI951161A0; WO1994007138A1; CA2144328A1

Abstract

1. Sposób wykrywania specyficznych komórek docelowych w zawiesinach mieszanych populacji komórek i w ukladach plynnych zawierajacych mieszane populacje komórek oraz zawiesinach jednokomórkowych przygotowanych z tkanek litych, z wylaczeniem normalnych i nowotworowych komórek krwiotwór- czych w e krwi i szpiku, znam ienny tym , ze obejmuje nastepujace etapy: 1.1. oplaszezanie przy uzyciu znanych procedur paramagnetycznych czastek lub kulek a) przeciwcialami lub fragmentami przeciwcial skierowanych prze- ciwko strukturom blonowym ekspresjonowanym specyficznie na komórkach docelowych, zas nie na komórkach nie bedacych docelowymi, znajdujacych sie w mieszaninie komórkowej, lub; b) przeciwcialami, korzystnie poliklonalnymi przeciw-mysimi lub szczurzymi monoklonalnymi przeciw-mysimi lub przeciwl udzkimi, zdolnymi do wiazania fragmentu Fc przeciwcial, skierowanych przeciwko strukturom blonowym; i 1.2 .1. mieszanie przeciwcial przeciw-komórkom docelowym (mysich lub ludzkich), które zwiazane sa ze wspomnianymi czastkami lub kulkami, lub zwiazane sa z kulkami uprzednio oplaszczonymi przeciwcialami przeciw-mysimi lub przeciw-ludzkimi rozpoznajacymi fragment Fc przeciwcial rozpo- znajacych cel, z zawiesina komórkowa zawierajaca komórki docelowe, lub, 1.2 2. mieszanie wolnych przeciwcial rozpoznajacych komórki docelowe z zawiesina komórkowa zawierajaca komórki docelowe i inkubowanie tej miesza- niny przez 5-10 minut do 2 godzin, korzystnie 30 minut, w temperaturze pomiedzy 0°C i 20°C, korzystnie 4°C przy lagodnym mieszaniu, i, 1 3. inkubowanie mieszaniny zawiesiny komórek i przeciwcial rozpoznajacych komórki docelowe zwiazane z czastkami paramagnetycznymi lub kulkami (1.2 1.), lub czastkami paramagnetycznymi lub kulkami, uprzednio oplaszczonymi przeciw-mysimi lub przeciw-ludzkimi przeciwcialami rozpoznajacymi frag- ment Fc przeciwcial rozpoznajacych cel, z mieszanina inkubowanych wolnych przeciwcial rozpoznajacych cel i zawiesiny komórek (1.2.2.) i inkubowanie przez 5-10 minut do 2 godzin, korzystnie 30 minut, w temperaturze pomiedzy 0°C i 20°C, korzystnie 4°C przy lagodnym mieszaniu, i; 1.4.1 jezeli populacja komórek docelowych zawarta jest we krwi lub aspiracie szpiku, to sily hydrofobowe zwiazane z czastkami oplaszczonymi przeciw- cialami redukowane sa przez uprzednia inkubacje z czastek omaszczonych przeciwcialami i zawiesiny komórek z lagodnym detergentem w odpowiednim steze- niu, np. takim jak ester kwasu laurylowego z polioksoetylenosorbitanem, w stezeniu mniejszym niz 0,1% przez 30 minut w temperaturze 4°C, i/lub 1.4.2 przez inkubowanie zawiesiny komórek, nie traktowanych lub uprzednio traktowanych formalina, alkoholem lub innym utrwalaczem, z innymi prze- ciwcialami lub fragmentami przeciwcial wiazacymi czasteczki zewnatrzkomórkowe lub wewnatrzkomórkowe obecne w komórkach docelowych i uzyte prze- ciwciala uprzednio znakowane peroksydaza, fosfataza alkaliczna czy innymi enzymami umozliwiajacymi obrazowanie wiazania przez dodanie i inkubacje z odpowiednimi substratami, lub 1.4.3. fragmenty przeciwcial s a biotynowane, zas wiazanie obrazowane jest przez inkubowanie z kompleksami awidyny z peroksydaza, fosfataza alka- liczna lub innymi enzymami z dodaniem i inkubacja z odpowiednimi substratami, lub gdy gestosc komórek docelowych jest niska, lub stosunek komórki docelo- we/calkowita liczba komórek w mieszaninie jest niski (= 1%) a nastepnie badaniu i liczeniu znakowanych i nieznakowanych kompleksów czastka-komórka docelowa w zawiesinie komórek, przy uzyciu mikroskopu i/lub odpowiedniego urzadzenia liczacego komórki/czastki, lub 1 .5 . 1. poddanie inkubowanej mieszaniny czastek paramagnetycznych-przeciwcial-komórek (1.3.) dzialaniu pola magnetycznego gdy gestosc komórek do- celowych jest niska, lub stosunek komórki docelowe/calkowita liczba komórek w mieszaninie jest niski (= 1 %), a nastepnie badaniu i liczeniu znakowanych i nie- znakowanych kompleksów czastka-komórka docelowa w zawiesinie komórek, przy uzyciu mikroskopu i/lub odpowiedniego urzadzenia liczacego komórki/czastki, lub 1.5.2. badanie i liczenie komórek docelowych w inkubowanej mieszaninie czastek paramagnetycznych, przeciwcial i komórek (1.3.) lub w przypadku gdy przeciwciala lub fragmenty przeciwcial skonjugowane sa z czastkami nieparamagnetycznymi, które moga byc obrazowane bezposrednio z powodu swego kolo- ru lub przez aktywacje enzymatyczna, przy uzyciu mikroskopu, i/lub odpowiedniego urzadzenia liczacego czastki/komórki gdy stosunek komórki docelo- we/calkowita liczba komórek w zawiesinie komórek jest odpowiedni (1%). PL PL PL PL

Description

Wynalazek dotyczy sposobu wykrywania specyficznych komórek docelowych w zawiesinach mieszanych populacji komórek i w układach płynnych zawierających mieszane populacje komórek oraz zawiesinachjednokomórkowych przygotowanych z tkanek litych oraz zestawu do stosowania tego sposobu.

W biologii, biochemii i pokrewnych dziedzinach istnieje zapotrzebowanie na metody umożliwiające łączenie cząsteczek ze sobą. Znaczenie tych metod wzrasta w badaniach dotyczących zarówno normalnychjak i nieprawidłowych populacji komórek. Zwłaszcza gdy stosuje się stałą podstawę komórki mogą być unieruchomiane, wykrywane i izolowane oraz

1ΊΊ 136 oczyszczane. Ponadto zawartość komórek może być badana przy użyciu wyrafinowanych metod. Jest również istotne izolowanie komórek żywych.

Wiązanie przy użyciu powinowactwa jest wyrafinowanym sposobem łączenia chemiczno/biologicznychjednostek ze sobą. W metodzie tej para wiążących się odpowiedników, które są połączone z cząstkami, które mająbyć połączone, łącząsię ze sobąpo wejściu w kontakt. Jeden z odpowiedników w takim połączeniu może być reprezentowany przez cząsteczkę na powierzchni komórki. Jest znanych kilka układów wiążących się odpowiedników jak np. oddziaływanie w komórce: antygen-przeciwciało, enzym-receptor, ligand-receptor, czy wiązanie awidyna-biotyna, spośród których najczęstsze jest wiązanie antygen-przeciwciało. Ostatnio sugerowany jest również sposób wykorzystujący wiązanie hapten-antyhapten (WO 91/01368).

Gdy powyższe sposoby używane są do izolacji specyficznych komórek, poddawanych dalszym badaniom, niezbędne jest odwrócenie wiązania bez wywoływania szkodliwych efektów na wiążących się odpowiednikach, które najkorzystniej powinny odzyskać swoją funkcję po powrocie do warunków wyjściowych. Nie zawsze ma to miejsce, jakkolwiek zaproponowano sposób odpowiedniego przecinania wiązań antygen/anty-antygen i hapten/anty-hapten (WO-91/15766, WO 91/01368).

Znane są sposoby, w których jeden z wiążących się odpowiedników związany jest z nierozpuszczalnym podłożem, jak np. cząsteczki paramagnetyczne, i w których dokonuje się negatywnej izolacji lub pozytywnej izolacji komórek docelowych w mieszanej populacji komórek. W procedurze negatywnej izolacji, niepożądane komórki mogąbyć usuwane z preparatu komórek przez inkubację komórek z cząstkami opłaszczonymi przeciwciałami, specyficznymi w stosunku do niepożądanych komórek. W następstwie inkubacji kompleks komórka/przeciwciało/cząstka może być usunięty przy użyciu cząstki, pozostawiając pożądane komórki docelowe. Wynik tenjest często niezadowalający, ponieważ pożądane komórki pozostawiane są w populacji komórek, oczyszczone lepiej lub gorzej, a celem procedur oczyszczaniajest badanie i/lub dokonywanie dalszych badań na specyficznych komórkach docelowych. Czyni się próby użycia cząstek do izolacji pozytywnej, w której pożądane komórki usuwane są z mieszanej populacji komórek. Procedury te, jednakże, odnoszą się tylko do niektórych komórek docelowych i nie nadająsię do wszystkich układów komórek docelowych.Procedura izolacji pozytywnej wykorzystująca układ wiązania hapten/anty-hapten została zaproponowana niedawno (WO 91/01368( jak również sposób izolowania krwiotwórczych komórek macierzystych ze szpiku (WO 91/0993 8). Ten ostatni opiera się na kombinacji pozytywnej i negatywnej selekcji w celu izolacji i ewentualnej hodowli specyficznych komórek, np. krwiotwórczych komórek macierzystych, znajdujących się w szpiku, i polega na usuwaniu cząstek.

WO 91/01368 odnosi się do sposobu wiązania komórek docelowych z nierozpuszczalnym podłożem przez użycie właściwości haptenu, przeciwciał przeciwko haptenowi i przeciwciał przeciwko komórkowych wiążących się ze sobą, i tworzących połączenie pomiędzy nierozpuszczalnym podłożem, np. cząstką, i komórką, docelową, składające się z przynajmniej, haptenu i przeciwciała przeciwko haptenowi lub kombinacji haptenu, przeciwciała przeciwko haptenowi i przeciwciał przeciwko przeciwciałom anty-haptenowym lub wtórnych przeciwciał antykomórkowych. Rozłączenie tego ostatniego kompleksu polega na ponownej ekspozycji na hapten lub analog haptenu. Tak więc, powstałe połączenie zawsze składa się z haptenu i dodatkowo jednego lub więcej elementów. Sposób odnosi się do nieokreślonych komórek docelowych i dotyczy izolacji komórek docelowych i uwalniania nierozpuszczalnego podłoża.

Istnieje potrzeba prostego połączenia w celu powiązania komórki docelowej i nierozpuszczalnego podłoża, które nie używa składników raczej nieokreślonej grupy haptenów, i które jest skierowane na wykrywanie specyficznych komórek docelowych z minimalnym powiązaniem z nieokreśloną komórką docelową, i które czyni niepotrzebnym późniejsze rozdzielanie nierozpuszczalnego podłoża ze specyficzną komórką docelową.

WO 92/04961 zawiera sposób i skomplikowane wyposażenie do oddzielania komórek i innych cząsteczek od niemagnetycznego ośrodka przy użyciu koloidalnych cząstek magnetycznych. W sposobie tym używane są małe (submikronowe) cząstki, ponieważ istnieje potrzeba

17*7136 uniknięcia precypitacji cząstek w roztworze oraz sposób wymaga skomplikowanego układu oddzielania, w którym środki zwiększające pole magnetyczne zwilżane są ośrodkiem. Może to mieć negatywny wpływ na komórki.

Stąd przedmiotem niniejszego wynalazku jest wykrywanie, dla celów diagnostycznych, specyficznych komórek docelowych we krwi lub szpiku, bez problemu wiązania niespecyficznego z normalnymi komórkami. Obrazuje to czułą metodę wykrywania różnych typów komórek, tak, że znaczna liczba komórek może być łatwo badana pod mikroskopem oraz jest szybkie i proste. Ponadto sposób ten może być wykorzystywany do izloacji komórek dla celów badań biochemicznych, biologicznych i immunologicznych, oraz do badania specyficznych genów na poziomie nukleotydowym lub białkaj ako uzupełnienie hodowania komórek, bez potrzeby pzecinania kompleksu komórki z cząstką. Dalszym aspektem niniej szego wynalazkuj est dostarczenie zestawu do stosowania sposobu określonego przez zastrzeżenia patentowe.

Cele wynalazku określone sąprzez sposób i zestaw opisane w załączonych zastrzeżeniach patentowych.

Sposób na immunomagnetyczne wykrywanie komórek docelowych w mieszanej populacj i komórek lub roztworach fizj ologicznych zawieraj ących populacj e komórekj est użyteczny do wykrywania, ale może być użyty w izolacji pozytywnej specyficznych typów komórek zarówno normalnych jak i patogennych. Sposób powoduje wytworzenie połączenia pomiędzy specyficzną komórką docelową i nierozpuszczalnym podłożem, jak np. cząstkami paramagnetycznymi składającymi się z jednego lub dwóch elementów Cząstka jest opłaszczana przeciwciałem przeciwkomórkowym pochodzenia ludzkiego lub mysiego, skierowanym przeciwko specyficznym determinatom antygenowym błony pożądanych komórek docelowych, bądź cząstki opłaszczane są przeciwciałem poliklonalnym przeciw-mysim lub przeciw-ludzkim, zdolnym do wiązania fragmentu Fc specyficznego przeciwciała antykomórkowego, skierowanego przeciwko determinantom antygenowym błon komórek docelowych. Zamiast używać przeciwciał poliklonalnych przeciw-mysich/przeciw-ludzkich do opłaszczania cząstek, mogą być użyte przeciwciała monoklonalne szczurze przeci-mysie/przeciw-ludzkie. To ostatnie przeciwciało dzięki, częściowo, swemu monoklonalnemu pochodzeniu może zapewnić bardziej specyficzne wiązanie z przeciwciałem antykomórkowym, i zmniejszyć ryzyko możliwej reakcji krzyżowej z innymi komórkami w zawiesinach jak np. krew·'. Ponadto inkubacja zawiesiny komórek z łagodnym detergentem i/lub zestawem wtórnych przeciwciał lub fragmentów przeciwciał, wstępnie znakowanych lub nie związkami fluorescencyjnymi, związkami koloidowymi metali, radioizotopami, kompleksami z biotynąlub określonymi enzymami umożliwiającymi wizualizację, dramatycznie zwiększa specyficzność metody.

Następnie przedstawione są bardziej szczegółowe zastosowania sposobu, z użyciem komórek nowotworowych jako komórek docelowych wykrywania i ewentualnej izolacji. Sposób nie jestjadnakże, ograniczony do komórek nowotworowych i ujawnienie go nie ogranicza sposobu do tej specyficznej dziedziny, ponieważ sposób jest użyteczny w wielu dziedzinach badań cytologicznych.

W postępowaniu z pacjentami z chorobą nowotworową niezwykle istotne jest, ze względu na dobór indywidualnej terapii dla każdego pacjenta, określenie stanu choroby w zależności od tego czy jest ona zlokalizowana, czy nastąpił rozsiew przerzutów do innych tkanek. Komórki nowotworowe szerzą się przez bezpośrednią inwazję do otaczających tkanek, drogami limfatycznymi czy przez przemieszczenie komórek nowotworowych z krwią do odległych narządów, w tym do szpiku i ośrodkowego układu nerwowego oraz płynu mózgowo-rdzeniowego.

Wykrywanie przerzutujących komórek nowotworowych polegało dotąd na metodach morfologicznych wykorzystujących mikroskopię świetlną i elektronową w próbkach biopsji guza, rozmazach szpiku i krwi obwodowej, oraz preparatach wykonanych z odwirowanych komórek płynów ustrojowych. W związku z dostępnością przeciwciał monoklonalnych, rozpoznających antygeny najczęściej ekspresjonowane na powierzchni komórek nowotworowych różnych typów, identyfikacja komórek przerzutujących wykorzystuje, w rosnącej ilości, immunocytochemię i immunofluorescencję' Preparaty wykonane z biopsji guzów lub odwirowanych komórek, m 136 traktuje się przeciwciałami monoklonalnymi, zaś ich związanie z komórkami nowotworowymi obrazuje się kolorymetrycznie lub przez fluorescencję. Ta ostatnia metoda wymaga użycia mikroskopu fluorescencyjnego, alternatywnie, przygotowuje się zawiesinę komórek do użycia w cytometrii przepływowej.

Wadami wspomnianych wcześniej metod jest ograniczona czułość i/lub specyficzność są one zwykle pracochłonne i czasochłonne oraz wymagają dużego doświadczenia. Badania cytometrią przepływową wymagają również drogiego wyposażenia.

Metody morfologiczne wykrywania komórek nowotworowych w krwi i szpiku są mniej czułe niż metody z użyciem immunocytochemi i immunofluorescencji (Beiske i in., Am. J. Pathology 141 (3), wrzesień 1992). Również te ostatnie nie są odpowiednie w przypadkach gdy komórki nowotworowe stanowią mniej niż 1% całkowitej liczby komórek jądrzastych. Cytometria przepływowa może zapewnić lepszączułość niż metody z użyciem mikroskopii, ale wymaga dostępności znacznej liczby komórek i związana jest z wieloma trudnościami technicznymi. Agregacja komórek może stwarzać problemy i nie umożliwia odróżnienia znakowanych komórek guza od niespecyficznie fluoryzujących normalnych komórek.

Wynalazek umożliwia bardzo czułe wykrywanie, przykładowo przerzutujących komórek nowotworowych, ponieważ znaczna liczba komórek może być badana pod mikroskopem, zaś przyłączone kulki magnetyczne są łatwo rozpoznawalne. Użyte przeciwciała monoklonalne wiążą się z wystarczającą specyficznością, z przykładowo komórkami nowotworowymi, a nie z innymi komórkami obecnymi w mieszanych zawiesinach komórkowych, jak krew, szpik oraz w innych objawach nowotworowych, w taki sposób, że wszystkie komórki z przyłączonymi kulkami sąkomórkami docelowymi. Dodatkowo, procedurajest szybka i prosta, i może być wykonana przez każdego badacza z dostępem do mikroskopu.

Nowa metoda polega na wiązaniu przeciwciał monoklonalnych, np. pochodzenia mysiego lub ludzkiego, rozpoznających specyficzne antygeny obecne na komórkach nowotworowych, zaś nie na normalnych komórkach, lub dla innych celów na określonych subpopulacjach komórkach normalnych, z cząstkami paramagnetycznymi, bezpośrednio bądź z kulkami uprzednio opłaszczonymi przeciwciałami specyficznie rozpoznającymi odpowiednie przeciwciała, lub fragmenty Fc przeciwciał IgG, które wiążą się z komórkami nowotworowymi. Przeciwciała wiążące się z komórkami mogą być typu IgG lub IgM lub być fragmentami przeciwciał IgG lub IgM. Przykładami użytych przeciwciał przeciwko komórkom docelowym mogą być skierowane przeciwko grupom determinant np. antygen CD56/NCAM (MOC-1) grupa 2 antygenów nabłonkowych (MOC-31), antygen grupy 2 (MA~40 kDa) (NrLu10) (Myklebust i in., Br. J. Cancer Suppl. 63,49-53,1991), antygen związany z czerniakiem HMW (9.12,27) (Morgani in., Hybridoma, 1, 27-36, 1981), antygen związany z mięsakiem, 80 kDa,, (TP1 i TP3) (Cancer Res . 48, 1988), antygeny mycyny (Diel i in., Breast Cancer Res. Treatm., 1991) czy antygen receptora EGF (425.3) (Merck), oraz dodatkowo przeciwciała przeciwko ludzkie (Bruland i in., nieopublikowane), użyteczne do wykrywania komórek ludzkich wśród komórek zwierzęcych. Przeciwciało 425.3 skierowane jest przeciwko antygenom zarówno komórek normalnych jak i nowotworowych. Przeciwciała mogąbyć również skierowane przeciwko receptorom dla czynników wzrostowych, np. receptorowi EGF, receptorowi PDGF (A i B), receptorowi insuliny, receptorowi dla czynników podobnych do insuliny, receptorowi transferyny, receptorom NGF i FGF, grupie integryn, innych błonowych cząsteczek adhezyjnych oraz białek MDR na komórkach normalnych jak i nienormalnych, oraz antygenom obecnym na subpopulacjach komórek normalnych, oraz dodatkowo produktom onkogenów, ekspresjonowanym na błonie komórek normalnych i nowotworowych lub tylko komórek nowotworowych, przykładowo: Neu/erb B2/HER2. Co do komórek nowotworowych to mogą to być komórki raka sutka, jajnika i płuca, czerniaka, mięsaka, glioblastomy, komórki raka przewodu pokarmowego i układu siateczkowośródbłonkowego, lub komórki docelowe mogą być związane z chorobami nienowotworowymi jak choroby sercowo-naczyniowe, nieurologiczne, płucne, autoimmunizacyjne, układu trawiennego, układu moczopłciowego, siateczkowo-śródbłonkowego i inne. Ponadto populacja komórek nowotworowych może być zlokalizowana w szpiku, krwi obwodowej, pochodzić z wysięku

177 136 opłucnowego lub otrzewnowego i innych płynów ustrojowych, jak mocz, płyn mózgowo-rdzeniowy, nasienie, chłonka lub z guzów litych w normalnych tkankach i narządach jak np. wątroba, węzły chłonne, śledziona, płuca, trzustka, tkanka kostna, ośrodkowy układ nerwowy, gruczoł sterczowy, skóra i błony śluzowe. Bardziej kompletna lista determinant antygenowych i odpowiadających przeciwciał i fragmentów przeciwciał użytych w niniejszym ulepszonym sposobie przedstawiona została w tabeli 2.

Sposób obejmuje przyłączenie przeciwciał bezpośrednio do cząstek paramagnetycznych, lub przyłączenie może się odbyć przez przyłączenie do przeciwciał związanych z powierzchnią, jak np. poliklonalne przeciwciała przeciwmysie, monoklonalne przeciwciała szczurze przeciw-mysie, lub przeciwciała monoklonalne przeciw-ludzkie specyficznie rozpoznające fragment Fc wspomnianych przeciwciał. Kulki paramagnetyczne opłaszczone przeciwciałami mieszane są. z zawiesiną komórek, które mająbyć badane, i inkubowane przez 5-10 minut do 2 godzin, zaś najkorzystniej 30 minut w temperaturze 0-25°C, korzystnie w temperaturze 4°C, przy ciągłym mieszaniu. Niniejszy sposób może być wykonywany w zmienionej kolejności etapów, w taki sposób, że wolne przeciwciała przeciw-komórkowe dodawane są do zawiesiny komórkowej, inkubowane

5-10 minut do 2 godzin, zaś korzystnie przez 30 minut w temperaturze 0-20°C, zaś korzystnie 4°C, przy ciągłym mieszaniu. Paramagnetyczne cząstki, opłaszczone uprzednio przeciwciałami przeciw-mysimi lub przeciw-ludzkimi dodawane są do inkubowanej zawiesiny komórek, tak jak to opisano powyżej, a powstała zawiesina poddawana jest dalszej inkubacji przez 5-10 minut do dwóch godzin, korzystnie 30 minut, w temperaturze 0-25°C, korzystnie w temperaturze 4°C przy ciągłym wytrząsaniu. Próbki zawiesiny komórek przenoszone są do urządzenia liczącego komórki, oraz oznaczanajest, przy użyciu mikroskopii świetlnej, frakcja komórek z przyłączonymi kulkami w całkowitej ilości komórek. Liczba kulek opłaszczonych przeciwciałami dodanych do zawiesiny komórek powinna zawierać się pomiędzy 0.5-10 razy liczba komórek docelowych. Gdy liczba tajest nieznana ilość opłaszczonych kulek powinna wynosić 1 -10% całkowitej liczby komórek.

Dla specyficznych zastosowań i w przypadkach gdy gęstość komórek docelowych jest mała, przykładowo komórek nowotworowych, lub gdy komórki docelowe reprezentują bardzo małą frakcję całkowitej liczby komórek (< 1%) komórki docelowe mogą być pozytywnie izolowane od reszty komórek przy użyciu pola magnetycznego. Izolowane komórki docelowe mogą być liczone mikroskopowo i możliwe jest obliczenie frakcji komórek docelowych w całkowitej liczbie komórek w zawiesinie. Ponadto, komórki docelowe mogą być charakteryzowane na obecność specyficznych własności biochemicznych i biologicznych. Szczególnie istotne jest użycie takich komórek w biologii molekularnej. W przeciwieństwie do powyżej cytowanych metod dotychczas stosowanych, niniejszy sposób umożliwia badanie i hodowlę komórek docelowych bez wykonywania cięcia połączeń cząstek z komórkami docelowymi. Dla niektórych zastosowań istotne jest badanie specyficznych genów w czystej populacji komórek docelowych na poziomie DNA, mRNA i białek, zarówno w biopsjach z guzówjak również w komórkach nowotworowych obecnych w krwi, szpiku i innych płynach ustrojowychjak mocz, płyn mózgowo-rdzeniowy, nasienie, chłonka, lub skądinąd normalnych narządów i tkanek jak wątroba, węzły chłonne, śledziona, płuca, trzustka, tkanka kostna, ośrodkowy układ nerwowy, gruczoł sterczowy, skóra i błony śluzowe oraz z innych rejonów stanowiących obszar badań cytologicznych.

Przy użyciu metod stosowanych uprzednio, sygnały uzyskane przy użyciu testów metodą Southern, Northern i Western biot, przedstawiały zarówno normalne jak również nowotworowe komórki w biopsji. Gdy wykonywanajestjednokomórkowa zawiesina z materiału pochodzącego z guza, a następnie immunomagnetycznie pozytywnie wykrywana i izolowana, każde badanie genetyczne na tym materiale przedstawiać będzie wyłącznie komórki docelowe. Dotyczy to również przykładowo komórek nowotworowych znajdujących się w tkankach ssaków, przykładowo w szpiku, krwi obwodowej, wysięku opłucnowym i otrzewnowym i innych płynach ustroj owych jak mocz, płyn mózgowo rdzeniowy, nasienie, chłonka. Badania wykorzystujące reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) również zyskują na specyficzności i rzetelności, gdy wykonywane są

1ΊΊ 136 na czystych populacjach komórek nowotworowych uzyskanych przy wykorzystaniu nowego sposobu.

Użycie nowego sposobu może różnić się w zależności od rodzaju badanej tkanki.

a) Tkanka z biopsji guzów litych lub biopsji igłowych poddawanajest obróbce mechanicznej lub delikatnemu trawieniu enzymatycznemu do zawiesiny jednokomórkowej, do której dodawane są specyficzne przeciwciała pierwotne lub fragmenty przeciwciał, bezpośrednio bądź po przepłukaniu zawiesiny komórek roztworem fizjologicznym soli buforowanym fosforanem lub pożywką hodowlaną z dodatkiem lub bez surowicy, jak surowica płodowa cielęca, wołowa, końska, świńska, kozia lub ludzka.

b) Jeżeli materiał jest próbką pochodzącą z wysięku opłucnowego lub otrzewnowego, moczu, płynu mózgowo rdzeniowego, nasienia, chłonki lub płynów ustrojowych jak wysięk stawowy pacjentów z różnymi postaciami zapalenia stawów, specyficzne przeciwciała lub fragmenty przeciwciał dodawane są do próbki bezpośrednio lub po odwirowaniu z lub bez płukania przed lub po tym jak komórki znajdujące się w próbce zostały zwirowane i ponownie zawieszone.

c) Jeżeli materiał pochodzi z aspiratów krwi lub szpiku, frakcja komórek jednojądrzastych jest izolowana przez wirowanie na gradiencie np. Lymphoprep przed odpłukaniem, ponownym zawieszeniem i dodaniem odpowiednich przeciwciał lub fragmentów przeciwciał.

Warunki procedur dla a) i b) są ustalone, jak przykładowo pokazano w wynikach uzyskanych w pomyślnych doświadczeniach opisanych poniżej. Dla c) stwierdzono, że na wyniki rzutuje szereg czynników, które badane były szczegółowo. Wśród nich były: stężenie przeciwciał, stosunek liczby cząstek paramagnetycznych do liczby komórek, czas i objętość inkubacji, typ medium do inkubacji i pH. Stosunek cząstek do komórek jednojądrzastych we wszystkich doświadczeniach powinien wynosić 0.5/1-2/1, zależnie od powinowactwa pierwotnego przeciwciała lub fragmentów.

Głównym problemem jest niespecyficzne wiązanie z normalnymi komórkami krwi lub szpiku cząstek opłaszczonych owczymi bądź szczurzymi przeciwciałami przeciw-mysimi samymi, lub z dodatkiem specyficznych przeciwciał. Doświadczenia wykazały, że niespecyficzne wiązanie jest równie duże bez obecności specyficznych przeciwciał, co wskazuje, że problem nie jest spowodowany reakcjąkrzyżowąprzeciwciał z normalnymi komórkami. Możliwość, że specyficzność mniej sza niż optymalna może być spowodowana wiązaniemjonowym została wykluczona. Inną możliwością było, że subpopulacja normalnych komórek pochodzenia B może wiązać się kompleksami cząstek i przeciwciał. Jednakże, immunomagnetyczne usunięcie limfocytów B z zawiesiny komórek przed dodaniem specyficznych przeciwciał/kompleksów przeciwciało-cząstka, nie poprawiło specyficzności.

Problemy z procedurą zastosowaną na izolowanych frakcjach jednojądrzastych ze szpiku i krwi obwodowej, polegające na wiązaniu cząstek paramegnetycznych przez niektóre komórki nie będące docelowymi, zostały ominięte lub przezwyciężone. Tak więc, używając cząstek opłaszczonych owczymi przeciwciałami przeciw-mysimi samymi lub ze specyficznym przeciwciałem liczba cząstek związanych niespecyficznie z niską frakcją komórek jednojądrzastych krwi lub szpiku zmniejszono z około 10 do około 1 z równoczesnym zmniejszeniem frakcji normalnych komórek z około 1-2% do 0.5-1% lub mniej.

Uzyskano dowody, że problem może być spowodowany przez siły hydrofobowe związane z wiązaniem przeciwciał z cząstkami paramagnetycznymi. Sposób na zmniejszenie tych hydrofobowości jest zastrzeżony. Jednym ze sposobów jest preinkubacja cząstek opłaszczonych przeciwciałem i zawiesin komórek z łagodnym detergentem w odpowiednim stężeniu, przykładowo Tween 20™ w stężeniu mniejszym niż 0.1% przez 30 minut w temp. 4°C. Gdy prawdopodobna selekcja komórek docelowych jest zapewniona, zawiesina komórek powinna zawierać niskie stężenie detergentu, np. 0.01% Tween 20™. W kilku doświadczeniach procedura ta niemal całkowicie wyeliminowała lub dramatycznie zmniejszyła problem wiązania niespecyficznego obserwowanego we frakcjach jednojądrzastych komórek krwi i szpiku.

Inne ulepszenie może być użyte wraz z etapem stosowania detergentu w następujący sposób:

Po inkubacji zawiesiny komórek z przeciwciałem pierwotnym lub fragmentami przeciwciał oraz cząstkami paramagnetycznymi opłaszczonymi przeciwciałemjak to opisano uprzednio, zawiesina komórekj est inkubowana z zestawem przeciwciał lub fragmentów przeciwciał skierowanych przeciwko innym determinatom zewnątrz- lub wewnątrzkomórkowym na komórkach docelowych, z lub bez traktowania utrwalaczami jak formaldehyd czy alkohole. Przeciwciała te lub fragmenty przeciwciał powinny być znakowane czynnikami fluorescencyjnymi, metalami koloidalnymi, radioizotopami, kompleksami biotynowanymi lub enzymami jak peroksydaza lub fosfataza alkaliczna, umożliwiającymi wizualizację znanymi metodami w mikroskopie lub innym urządzeniu zliczającym.

Komórki docelowe mogą być wizualizowane wspomnianymi ostatnio metodami oraz mogą mieć przyłączone do ich powierzchni cząstki i w ten sposób mogą być policzone.

W celu uproszczenia rozróżnienia pomiędzy komórkami docelowymi i niedocelowymi, zawiesina komórek może być przed drugim etapem wizualizacji poddana odwirowaniu cytospinowemu lub porcje zawiesiny mogą być przytwierdzone do szkiełek mikroskopowych, na których komórki ze związanymi cząstkami mogą być rozproszone w postaci cienkiej warstwy, co ułatwi rozpoznanie podwójnie znakowanych komórek.

Zestaw do użycia w nowym sposobie, powinien zawierać przykładowo opłaszczone cząstki paramagnetyczne przygotowane dla każdego przeciwciała monoklonalnego. W innym wykonaniu zestaw powinien zawierać cząstki paramagnetyczne opłaszczone przeciwciałem izotypu IgG specyficznym przeciw-mysim lub przeciw-ludzkimjakojeden ze składników, oraz różne przeciwciała skierowane przeciw komórkom, przykładowo, komórkom nowotworowym, jako inny ze składników. W trzecim wykonaniu zestaw zawiera cząstki paramagnetyczne opłaszczone przeciwciałem skierowanym przeciw fragmentom Fc, jak np. przeciwciała poliklonalne, przeciw-mysie, monoklonalne szczurze przeciw-mysie, czy przeciw-mysie lub przeciw-ludzkie przeciwciała zdolne do wiązania fragmentów Fc przeciwciał związanych z komórkami docelowymi, związane ze specyficznymi przeciwciałami skierowanymi przeciwko komórkom docelowym. W dalszym wykonaniu, zestaw zawiera inne specyficzne przeciwciała lub fragmenty przeciwciał skierowane przeciwko antygenom/receptorom w lub na poszukiwanych komórkach docelowych, które to przeciwciała lub fragmenty przeciwciał skonjugowane są z peroksydazą, fosfatazą alkaliczną lub innymi enzymami, wraz z odpowiednimi substratami dla enzymów lub wspomniane przeciwciała lub fragmenty przeciwciał są związane z nieparamagnetycznymi cząstkami o specyficznych kolorach lub związane są z enzymami jak peroksydaza i fosfataza alkaliczna.

Niniejszy sposób będzie następnie zilustrowany przez modelowe doświadczenia, będące przykładami użyteczności nowego sposobu i przykładami praktycznych zastosowań. Przykłady te nie powinny być rozumiane jako ograniczenia wynalazku.

Doświadczenia modelowe:

1. Wiązanie kompleksów przeciwciał z kulkami z liniami komórek nowotworowych przy użyciu nowej procedury.

W celu określenia stężeń przeciwciał i warunków optymalnych dla wiązania kompleksów przeciwciało/cząstka paramagnetyczna z komórkami nowotworowymi użyto szerokiego panelu nowotworowych linii komórkowych. Kulki paramagnetyczne wiązano z komórkami przez opłaszczanie specyficznymi przeciwciałami opłaszczonych owczym przeciwciałem przeciw-mysim (SAM) cząstek paramagnetycznych, bądź przez inkubację komórek ze specyficznymi przeciwciałami, odpłukanie a następnie przez powtórną inkubację z cząstkami opłaszczonymi SAM. Wyniki tych doświadczeń dane są w tabeli 1 a i 11?, w któiych + oznacza wiązanie kilku kulek z wszystkimi komórkami, (+) oznacza albo małą liczbę kulek związaną z każdą z komórek, lub nie związanie się kulek z wszystkimi komórkami nowotworowymi i (-) oznacza bardzo słabe wiązanie.

2. W celu wykrycia komórek nowotworowych w jednojądrzastej frakcji szpiku lub krwi obwodowej, wykonano doświadczenia modelowe, w których specyficzne przeciwciała lub

1ΊΊ 136 cząstki paramagnetyczne opłaszczone SAM były dodane do komórek jednojądrzastych bądź do zawiesiny komórek, do których dodano różne liczby komórek nowotworowych z hodowanych in vitro linii komórkowych do wspomnianych jednojądrzastych komórek. W niektórych doświadczeniach komórki jednojądrzaste bądź komórki nowotworowe znakowane były uprzednio barwnikiem fluorescencyjnym w celu umożliwienia rozróżnienia pomiędzy dwoma typami komórek. We wszystkich doświadczeniach jako kontroli używano nie wiążących pierwotnych przeciwciał i/lub kulek opłaszczonych owczym przeciwciałem przeciw-mysim.

Tabela 1a

Przeciwciała	Linie
MCF-7	SKBR3	T47D	MDA231	MDA435	DU 145	FMEX-1	LOX
NrLulO IgG2b		+	+	(+)	(+)	+
Moc31 IgG1	+	+	+	(+)	(+)	+
Moc1 IgG1			(+)	(+)	+
12H12IgG1		+	+		+	+
2E11 IgG3	+	+	+		+	+
5A6 IgG1		(+)	+
5F2 IgM			(+)
CC3 IgG2a	-	-	-				-
CC1 IgM			-				(+)
CU18 IgG1	-	-	-
CU46 IgG1	(+)	-	-
7F11 IgG1	-	-	+			-	-	-
D7 IgG3			(+)
E4SF IgG1?		+	+			(-)	-	50%+
425-3			+				-	+
9.2.27							+	+
MUC18		-				-	-	-
2G12 IgG1							+
4b7 IgG1							+
BM2 (=2F11)
BM7 (=7F11)
TP-3
TP-1
CEA
GINTES IgG
3C9 IgM
HH8 IgM
5F4 IgM
3F1 IgG1

17*7136

Tabela 1b

Przeciwciała	Linie
PM1	MA-11	CRL1435	CRL1740	H-146	Colo205	786-0	WIDR
NrLu10 IgG2b	+	+	+	+'	+	+	-
Moc31 IgG1	+	+	+	+	+	+	+	+
Moc1 IgG1					+	-
12H12 IgG1	+	+	(+)		-	-	-
2E11 IgG3	(+)	+	-	+	-	-	-
5A6 IgG1	+	+
5F2 IgM
CC3 IgG2a					-		-
CC1 IgM					(+)		-
CU18 IgG1					-		-
CU46 IgG1					-		-
7F11 IgG1	(+)	+	-		-	-
D7 IgG3					-			-
E4SF IgG1?	+	+	+	+	-	-		-
425-3
9.2.27
MUC 18	-
2g12IgG1					-		-
4b7 IgG1					-		-
BM2(=2F11)	+	+
BM7 (=7F11)	+
TP-3
TP-1
CEA
GINTES IgG					+			-
3C9 IgM					-			-
HH8 IgM					-			-
5F4 IgM					-			-
3F1 IgG1					-			-

W kilku doświadczeniach obserwowano nieznaczne niespecyficzne wiązanie z komórkami jednojądrzastymi co, jak stwierdzono, nie było związane z naturąprzeciwciał specyficznych i co było również wyrażone gdy używano tylko cząstek opłaszczonych SAM. Wielkość tego niespecyficznego wiązania wahała się od niemal 0 do poziomu pomiędzy 0.5-2%. Owe niespecyficzne wiązanie było niemal całkowicie wyeliminowane przez łagodne traktowanie detergentem (Tween 2θ™) wykonane w celu zmniejszenia problemu komórkowych oddziaływań hydrofobowych.

ΠΊ 136

Przykłady użyteczności nowej procedury

1. Wykrywanie mikroprzerzutowej choroby nowotworowej we krwi i szpiku.

Wczesne i rzetelne rozpoznanie rozsiewu komórek nowotworowych do krwi i/lub szpiku staje się coraz ważniejsze dla wyboru optymalnego leczenia, z prawdopodobieństwem wyleczenia w wielu typach nowotworów, włączywszy raki, jak to opisano w przykładzie 1 zgłoszenia. Podobne procedury w stosunku do czerniaka, mięsaka, neuroblastomy i kilku innych raków są opracowane lub w trakcie opracowania.

2. Wykrywanie komórek nowotworowych w wysięku opłucnowym lub otrzewnowym i w moczu.

Natura tych wysięków może stanowić istotny problem diagnostyczny, szczególnie gdy obecna jest mała liczba komórek nowotworowych wraz z normalnymi komórkami odczynowymi lub nabłonkowymi. W kilku przypadkach, używając nowego sposobu, bardzo szybko postawione zostało pewne rozpoznanie, w przypadkach gdy konwencjonalne badanie cytologiczne dało wynik negatywny lub niepewny. Podobne zalety mogą być stwierdzone w przypadkach nowotworu nerek lub dróg moczowych i pęcherza.

3. Wykrywanie komórek nowotworowych w płynie mózgowo-rdzeniowym.

Ponieważ leczenie układowe wielu typów nowotworów poprawiło się, częstość przypadków dających objawy przerzutów do mózgu znacznie się zwiększyła, a co za tym idzie potrzeba wczesnego wykrywania tego typu rozsiewu. Przy użyciu nowej procedury nawet mała liczba komórek nowotworowych może być łatwo identyfikowana, co umożliwia interwencję z wyborem leczenia na wczesnym etapie objawów guza śródczaszkowego.

4. Wykrywanie nowotworu w tkance pochodzącej z biopsji.

Gdy istnieje podejrzenie raka, pobiera się biopsję tkanki zabiegiem chirurgicznym lub np. biopsję igłową, możliwe jest znacznie szybsze i prostsze rozpoznanie przy użyciu nowego sposobu z użyciem zawiesiny komórkowej, w porównaniu z konwencjonalnymi procedurami morfologicznymi lub immunohisto- i cytochemicznymi.

Rozróżnienie pomiędzy kilkoma prawdopodobnymi nowotworami może być zrobione przy użyciu odpowiednich przeciwciał.

5. Stwierdzenie wskaźników rokowniczych.

Ponieważ wykazano, że ekspresja niektórych cząsteczek błonowych koreluje z progresją choroby nowotworowej w niektórych nowotworach, niniejszy sposób może być użyty do stwierdzenia wskaźników rokowniczych, jak to przykładowo opisano w przykładzie 2 wniosku.

6. Stwierdzenie komórek wskazujących nakonkretaąchorobę lub postęp choroby lub stan.

W wielu typach chorób reumatoidalnych (jak reumatoidalne zapalenie stawów) jak również w chorobach alergicznych, autoimmunizacyjnych i sercowo-naczyniowych, stwierdzenie układowej lub miejscowej obecności specyficznych subpopulacji komórekjest ważne dla rozpoznania i określenia stanu choroby. Szybkie stwierdzenie owych subpopulacji komórek, przy użyciu nowego sposobu, jest istotne dla rozpoznania i leczenia.

7. Stwierdzenie subpopulacji normalnych komórek.

Dla niektórych zastosowań ważne jest wykrywanie frakcji szczególnej subpopulacji komórek normalnych w populacji. Dotyczy to np. biopsji wątroby gdzie stwierdzenie komórek ekspresjonujących żółciowy antygen nabłonkowy może być ważne. Podobnie, zapewnione jest stwierdzenie i możliwa izolacja specyficznych komórek śródbłonkowych z zawiesiny komórek przygotowanych z różnych normalnych tkanek.

Niektóre spośród cząsteczek błony komórkowej wspomnianych w działach 1-6 mogą być użyte jako cele immunoterapii z wykorzystaniem kilku typów pobudzonych komórek zabijających lub np. immunotoksyn. Stwierdzenie, przy użyciu nowego sposobu, ekspresji tych cząsteczek posiada dużą wartość dla stwierdzenia, w których przypadkach ten typ leczenia może być użyty.

Przykłady praktycznego zastosowania sposobu:

Przykład 1. W celu rozpoznania rozsiewu komórek nowotworu we krwi i/lub szpiku na etapie wczesnym użyto w nowej procedurze przeciwciał przeciw nowotworowych MOC-31,

177 136

NrLu10, BM2, BM7, 12H12 i MLuC1 do stwierdzenia czy choroba mikroprzerzutowa z nowotworu sutka, płuc, okrężnicy i prostnicy i stercza może być w sposób czuły wykryta w tych płynach ustrojowych. Pomyślny wynik z tymi przeciwciałami niesie istotne implikacje kliniczne.

Przykład 2. Wykazano, że ekspresja niektórych cząsteczek błony komórkowej koreluje z postępem choroby nowotworowej w niektórych typach raka. Wykrycie wiązania tych przeciwciał z odpowiednimi przeciwciałami może więc być użyte do uzyskania informacj i o dużej wartości rokowniczej. Pośród tych antygenów znajduje się znaczna liczba cząsteczek adhezyjnych, antygenów węglowodanowych, glikolipidów, receptorów dla czynników wzrostowych i markerów nowotworowych wymienionych poniżej. Stwierdzono, przy użyciu nowej procedury, wiązanie kompleksów cząstka-przeciwciało z wariantami CD44, E-kadheryną, Le^y, CEA, EGF-r, receptorem transferyny, epitopem MUC-1, epitopem LUBCRU-G7, antygenem raka stercza, epitopem UJ13A, ^-mikroglobuliną, antygenami HLA i receptorem apoptozy.

Przykład3. Pobrano dwa litry wysięku opłucnowego od pacjenta podejrzanego o czerniaka. Po odwirowaniu, komórki zawieszono w objętości 2 ml RPMI z dodatkiem 10^o% surowicy płodowej cielęcej i inkubowano z przeciwciałem przeciw-czerniakowym 9.2.27 (10 pg/ml w temp. 4°C przez 30 minut, odpłukano i ponownie inkubowano z Dynabeads™ SAM M450/1gG2a w temp. 4°C przez 30 minut. Zawiesinę komórek badano pod mikroskopem w celu określenia frakcji komórek z cząstkami paramagnetycznymi przyłączonymi do ich powierzchni. Rozpoznanie czerniaka zostało potwierdzone, ponieważ około 10%o komórek posiadało znaczną liczbę rozetek utworzonych z cząstek.

Przykład 4. Tkankę z biopsji uzyskanej z podskórnego guza w przypadku ze wskazaniami klinicznymi raka drobnokomórkowego płuca lub czerniaka. Przygotowano zawiesinę jednokomórkową, podzielono na dwie porcje, po czym jedną inkubowano z przeciwciałem przeciw-czemiakowym 9.2.27, zaś drugą z przeciwciałem przeciw-rakowym MOC-31 (oba w stężeniu 10pg/ml). Inkubacja była podobna do użytej w powyższym przykładzie. Żadna z komórek inkubowanych z przeciwciałem czemiakowym nie związała kulek, podczas gdy wszystkie komórki nowotworowe inkubowane z MOC-31 były pozytywne.

Przykład5. Tkankę z biopsji, od pacjenta podejrzanego o czerniaka, badano przez przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej, inkubację z przeciwciałem przeciw-czerniakowym 9.2.27 oraz procedurę opisaną powyżej. Większość komórek była pozytywna ze znaczną liczbą rozetek utworzonych z cząstek przyłączoną do ich błon.

Przykład 6. Wysięk opłucnowy od pacjenta z rakiem sutka badano w celu stwierdzenia czy w płynie można stwierdzić komórki guza. Litr płynu odwirowano, komórki ponownie zawieszono i inkubowano osobne naczynka z każdym z trzech przeciwciał przeciw-rakowych (MOC-31,2E11 i 12H12). Po zakończeniu procedury jak w poprzednim przykładzie, stwierdzono, że większość komórek związała cząstki opłaszczone przeciwciałami we wszystkich trzech przypadkach.

Przykład 7. Zawiesinę szpiku, uzyskaną od pacjenta z rakiem sutka, badano w celu stwierdzenia czy obecne sąmikroprzerzutowe komórki nowotworowe. Po przygotowaniu komórekjednojądrzastych, inkubowano je z tymi samymi trzema przeciwciałami użytymi w przykładzie powyżej, ale w tym przypadku przeciwciała były wpierw przyłączone do paramagnetycznych cząstek Dynabeads™ SAMIgG. Po pierwszej inkubacji z bezpośrednio opłaszczonymi cząstkami zawiesinę komórek badano pod mikroskopem i stwierdzono znaczną liczbę pozytywnych komórek z licznymi rozetkami utworzonymi z cząstek przyłączoną do ich błon.

Podobne doświadczenia wykonano w wielu wysiękach opłucnowych i otrzewnowych oraz szpikach od pacjentów z rakiem sutka.

Przykład 8. Komórki ludzkiego raka sutka T47D inkubowano przez różne okresy czasu z barwnikiem fluorescencyjnym f-my Hoechst po czym badano żywotność znakowanych komórek. Różne liczby znakowanych komórek raka dodawano do 1X10⁶ komórek szpiku uzyskanych od zdrowych dawców. W różnych doświadczeniach, dodawano różne stężenia cząstek paramagnetycznych (Dynabeads™ P450) opłaszczonych pojedynczymi przeciwciałami przeciwrakowymi (NrLu10, MOC31 czy 12H12). Po inkubacji przez 30 minut na lodzie, próbki z

17-7 136 różnych probówek badano w kamerach do liczenia mikroskopią świetlną i fluorescencyjną. Gdy stosunek komórki nowotworowe/całkowita liczba komórek jądrzastych był niski zawiesinę komórkową poddawano działaniu pola magnetycznego i izolowano komórki przed badaniem ich pod mikroskopem. Stwierdzono, że przy optymalnym stosunku 1-10 kulek paramagnetycznych na komórkę nowotworową, wszystkie komórki nowotworowe posiadają przyłączone na powierzchni 2-25 kulek. Czułość metody była bliska jednej komórce docelowej na 10⁴ jądrzastych komórek. W doświadczeniach kontrolnych ze znakowanymi komórkami nowotworowymi przy użyciu przeciwciał znanych ze swojej reaktywności krzyżowej z komórkami normalnymi, owa reaktywność krzyżowa była potwierdzona z użyciem cząstek paramagnetycznych opłaszczonych przeciwciałem. W doświadczeniach z kulkami bez opłaszczania przeciwciałami przeciw-nowotworowymi żadna z komórek docelowych nie związała żadnej kulki.

Podobne doświadczenia wykonano z innymi liniami raka sutka i liniami raka drobnokomórkowego płuc. W doświadczeniach tych uzyskano podobną czułość i specyficzność.

Przykład 9. Płyn opłucnowy i otrzewnowy od pacjentów z rakiem sutka i rakiem jajnika owirowano, dodano tych samych co w przykładzie 1 cząstek paramagnetycznych, inkubowano i zagęszczono w polu magnetycznym przed badaniem pod mikroskopem świetlnym. Zwykle, komórki o wyraźnych morfologicznie własnościach nowotworowych posiadały przyłączone kulki, podczas gdy żadna z kilku normalnych komórek nie związała opłaszczonych przeciwciałem kulek. W dwóch przypadkach wysięku opłucnowego niezależne badanie morfologiczne nie wykazało obecności żadnych komórek nowotworowych, podczas gdy z użyciem kulek opłaszczonych przeciwciałem wykryto liczne komórki nowotworowe. W kilku przypadkach komórki nowotworowe oddzielono w polu magnetycznym i przeniesiono do butelek hodowlanych zawierających pożywkę specjalnie przygotowaną do hodowli komórek raka sutka, w celu ustalenia ciągłej linii komórkowej z tych hodowli. Równocześnie komórki z wysięków nowotworowych hodowano bezpośrednio bez pozytywnej selekcji z użyciem kulek magnetycznych. W tych próbach nie udało się ustalić żadnej linii komórkowej, podczas gdy w próbach gdzie używano pozytywnej selekcji w ponad połowie przypadków udało się ustalić linię komórkową.

Przykład 10.W kilku przypadkach badano szpik i krew obwodową, pobrane od pacjentów z rakiem sutka, przy użyciu nowej procedury przez dodanie paramagnetycznych kulek opłaszczonych przeciwciałem, inkubowanie przez 30 minut w temp. 4°C i zagęszczenie w polu magnetycznym i badanie pod mikroskopem świetlnym. W obu przypadkach stwierdzono wiązanie paramagnetycznych kulek z komórkami nowotworowymi stanowiącymi 0.1-1% jądrzastych komórek szpiku i krwi obwodowej, komórek, które nie mogły być stwierdzone innymi metodami.

Przykład 11. Przeciwciała przeciwko szczególnym receptorom czynników wzrostowych lub innych produktów genów ekspresj onowanych na powierzchni specyficznych populacj i komórek mogą być użyte do stwierdzenia i selekcji pozytywnej tych komórek. Kulki opłaszczone przeciwciałami przeciwko receptorowi transferyny, użyte nowym sposobem według niniejszego wynalazku, przedstawiały, jak to wykazano, szybką, prostą i czułą metodę identyfikacji komórek ekspresjonujących receptor transferyny.

Przykład 12. Zapewnia się również izolację specyficznych populacji komórek normalnych do różnych celów. Komórki śródbłonka wyściełające kapilary i drobne naczynia w tkankach normalnych i nowotworowych mogą być selekcjonowane pozytywnie z zawiesin komórek przygotowanych z odpowiednich tkanek. Procedura obejmuje użycie kulek opłaszczonych przeciwciałem skierowanym przeciwko strukturom ekspresjonowanym na powierzchni komórek śródbłonka, zaś nie innych komórkach w zawiesinie komórek.

Przykład 13. Wykazano obecność ludzkich komórek, wstrzykniętych gryzoniom z defektem odporności, w zawiesinach komórek przygotowanych z guzów przeszczepionych w układzie ksenogenicznym i różnych narządów/tkanek gospodarza przy użyciu cząstek magnetycznych opłaszczonych przeciwciałem przeciw ludzkim.

177 136

Tabela 2

Lista odpowiednich antygenów i przykładów przeciwciał wiążących antygen

Antygeny	Przeciwciała monoklonalne
1	2
Cząsteczki adhezyjne Receptor fibronektyny (α5β1 integryna)	Pierce 36114, BTC 21/22 Calbiochem 341649
Integryna α3β1	M-Kiol 2
Receptor witronektyny (α β3 integryna)	TP36.1, BTC 41/42
Integryna α2	Calbiochem 407277
Integryna α3	Calbiochem 407278
Integryna α4	Calbiochem 407279
Integryna α5	Calbiochem 407280
Integryna αν	Calbiochem 407281
Integryna β2	Calbiochem 407283
Integryna β4	Calbiochem 407284
GpUpiIIa	8221
ICAM-I(CD54)	C57-60, CL203.4, RR 1/1
VCAM-1	Genzyme 2731-01
ELAM-1	Genzyme 2138-01
E-selektyna	BBA 8
P-selektyna/GMP-140	BTC 71/72
LFA-3(CD58)	TS 2/9
CD44	BM 1441 272, 25.32
Warianty CD44	11.24, 11.31, 11.10
N-CAM (CD56)	MOC-1
H-CAM	BCA9
L-CAM	BM 1441 892
N-CAM	TURA-27
MACAM-1	NKI-M9
E-kadheryna	BTC 111, HECD-1, 6F9
P-kadheryna	NCC-CAD-299
Tenascyna	BM 1452 193, Calbiochem 80664
Receptor trombospondyny (CD36)	BM 1441 264
VLA-2	A1.43
Receptor lamininy epitop HNK-1	HNK-1
Antygeny węglowodanowe
Antygen T	HH8, HT-8
Antygen Tn	TKH6, BaGs2
Sialylo Tn	TKH-2

ΠΊ 136 cd. tabeli 2

1	2
Antygen związany z rakiem przewodu pokarmowego (MW 200kDa)	CA 19-9
Antygen związany z rakiem	C-50
Lc^y	MLuCl, BR96, BR64
di-Le^x, tri-Le^x	B3
Epitop dimeru Le^x	NCC-ST-421
Antygen typu H2	BI
Epitop CA 15-3	CA 15-3
CEA	1-9,1-14,1-27,11-10,1-46, Calbiochem 250729
Galb l-4GlcNac (nL4, 6, 8)	1B2
H-II	BE2
Antygen typu A3	HH8
Lakto-N-fukopentanoza ΠΙ (CD 15) Glikolipidy	PM-81
gd₃	ME36.1.R24
gd₂	ME36.I,3F8,14.18
Gb₃	38-13
gm₃	M2590
gm₂	MKI-8, MKI-16
FucGMi	1D7, F12
Receptory czynników wzrostowych
Receptor EGF	425.3, 2E9,225
c-erbB-2 (HER2)	BM 1378 988, 800 E6
Receptor PDGFa	Genzyme 1264-00
Receptor ΡϋΰΡβ	Sigma P 7679
Receptor transferyny	OKT 9, D65.30
Receptor NGF	BM 1198 637
Receptor IL-2 (CD25)	BM 1295 802, BM 1361 937
c-kit	BM 428 616, 14A3, ID9.3D6
Receptor TNF Receptor NGF	Genzyme 1995-01, PAL-M1
Antygeny czerniaka
Antygen o wysokiej masie cząsteczkowej (HMW 2500.000)	9.2.27, NrML5, 225.28, 763.74, TP41.2, IND1.
Glikoproteiną związana z czerniakiem Mwl05	ME20
Antygen 100 kDa (czemiak/rak)	376.96
gP 113	MUC 18

17-7 136 cd. tabeli 2

1	2
p95-100	PAL-M2
Sp75	15.75
gr 100-107	NKI-bereb
MAA	K9.2
M_w125 kDa (Gp 125)	Mab 436
Antygeny mięsaka
Epitopy TP-1 i TP-3	TP-1, TP-3
M_w200 kDa	29-13, 29.2
M_w160 kDa	35-16, 30-40
Markery raka
Epitop MOC-31 (grupa 2 antygenów nabłonkowych)	MOC-31, NrLu10
Antygeny MUC-1 (jak epitop DF-3 (gp290 kDa))	MUC-1, DF3, BCP-7 do-10
MUC-2 i MUC-3	PMH1
Epitop LUBCRU-G7 (gp 230 kDa)	LUBCRU-G7
Antygen specyficzny dla stercza	BM 1276 972
Antygen raka stercza	E4-SF
Antygen stercza o wysokiej masie Mw>400 kDa	PD41
Polimorfi czne mucyny nabłonkowe	BM-2, BM- 7, 12-H-12
Antygen błonowy specyficzny dla stercza (Cyt-356)	7E11-C5
Globulina tłuszczu mleka ludzkiego	Immunotech HMFG-1,27.1
Epitop raka sutka 42 kDa	B/9189
Mucyna Mw>10⁶	TAG-72, CC-49, CC-83
Epitop OC125 raka jajnika (mw 750 kDa)	OC125
Glikoproteina trzustkowa HMW	DU-PAN-2
Antygen okrężnicy Col7-1A (Mw 37000)	17-1A
Epitop G9 (rak okrężnicy)	G9
Ludzka sulfomucyna okrężnicy	91.9H
Antygen trzustkowy Mw300 kDa	MUSE11
GA 733.2	GA733, KS1.4
TAG 72	B72.3, CC49, CC83
Nie zdefiniowane	Oat1, SM1
Związany z rakiem trzustki	MUSE11
Antygen raka	CC49
Antygen gruczolakoraka stercza	PD41
Antygen o Mw150-130 kDa gruczolakoraka płuca	AF-10
Antygen raka płuca gp160 (Carcer Res.48,2768,1988)	anty gp160

177 136 cd. tabeli 2

1	2
Antygen raka pęcherza M_w92 kDa	3G2-C6
Antygen raka pęcherza M_w600 kDa	C3
Antygen raka pęcherza (Cancer Res. 49, 6720, 1989)	AN43, BB369
Epitop CAR-3 Mw>400 kDa	AR-3
Epitop MAM-6 (C15.3)	115D8
Antygen o wysokiej masie cząsteczkowej raka jajnika	OVX1,OVX2
Epitop Ia3 mucyny	Ia3
Antygen raka wątroby Mw900 kDa	KM-2
Epitop Hepema1 (gp43) antygen raka wątroby	Hepemal
Mucyna O-związana zawierająca kwas N-glikoliloneuraminowy	3E1.2
Antygen raka jelita grubego Mw48 kDa	D612
Antygen raka sutka Mw71 kDa	BCA 227
Epitop 16.88 (antygen raka jelita grubego)	16.88
CAK1 (raki jajnika)	K1
Antygen p specyficzny dla okrężnicy	Mu-1, Mu-2
Antygen raka płuca Mw350-420 kDa	DF-L1, DF-L2
Antygen raka pęcherza gp54	T16
Antygen raka pęcherza gp85	T43
Antygen raka pęcherza gp25	T138
Antygeny neuroblastomy
Antygen związany z neuroblastomąjak epitop UJ13A	UJ13A
Antygeny gliomy
Epitop Mel-14	Mel-14
Antygeny raka głowy i szyi
Antygen Mw18-22 kDa	E48
Antygeny HLA
HLA klasy I	TP25.99
HLA-A	VE19LL67
HLA-B	H2-149.1
HLA-A2	KS1
HLA-ABC	W6.32
HLA-DR, DQ, DP	Q 5/13, B 8.11.2
p2-mikroglobulina	NAMB-1
Receptor apoptozy
epitop Apo-1	Apo 1

177 136 cd. tabeli 2

1	2
Inne Receptory i antygeny aktywatora plazminogenu Glikoproteina p Katepsyna D Antygen nabłonka żółciowego Antygen neurowydzielniczy (CD63) CD9 Antygen komórek ludzkich	królicze poliklonalne C219, MRK 16, JSB-1,265/F4 CIS-Diagnostici, Italy HEA 125 ME491, NKI-C3, LS62 TAPA-1, R2, SM23 pan-H

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Claims

1. Sposób wykrywania specyficznych komórek docelowych w zawiesinach mieszanych populacji komórek i w układach płynnych zawierających mieszane populacje komórek oraz zawiesinach jednokomórkowych przygotowanych z tkanek litych, z wyłączeniem normalnych i nowotworowych komórek krwiotwórczych we krwi i szpiku, znamienny tym, że obejmuje następujące etapy:

1.1. opłaszczanie przy użyciu znanych procedur paramagnetycznych cząstek lub kulek a) przeciwciałami lub fragmentami przeciwciał skierowanych przeciwko strukturom błonowym ekspresjonowanym specyficznie na komórkach docelowych, zaś nie na komórkach nie będących docelowymi, znajdujących się w mieszaninie komórkowej, lub; b) przeciwciałami, korzystnie poliklonalnymi przeciw-mysimi lub szczurzymi monoklonalnymi przeciw-mysimi lub przeciw-ludzkimi, zdolnymi do wiązania fragmentu Fc przeciwciał, skierowanych przeciwko strukturom błonowym; i

1.2.1. mieszanie przeciwciał przeciw-komórkom docelowym (mysich lub ludzkich), które związane są ze wspomnianymi cząstkami lub kulkami, lub związane są z kulkami uprzednio opłaszczonymi przeciwciałami przeciw-mysimi lub przeciw-ludzkimi rozpoznającymi fragment Fc przeciwciał rozpoznających cel, z zawiesiną komórkową zawierającą, komórki docelowe, lub,

1.2.2. mieszanie wolnych przeciwciał rozpoznających komórki docelowe z zawiesiną komórkowązawierającąkomórki docelowe i inkubowanie tej mieszaniny przez 5-10 minut do 2 godzin, korzystnie 30 minut, w temperaturze pomiędzy 0°C i 20°C, korzystnie 4°C przy łagodnym mieszaniu, i;

1.3. inkubowanie mieszaniny zawiesiny komórek i przeciwciał rozpoznających komórki docelowe związane z cząstkami paramagnetycznymi lub kulkami (1.2.1.), lub cząstkami paramagnetycznymi lub kulkami, uprzednio opłaszczonymi przeciw-mysimi lub przeciw-ludzkimi przeciwciałami rozpoznającymi fragment Fc przeciwciał rozpoznających cel, z mieszaninąinkubowanych wolnych przeciwciał rozpoznających cel i zawiesiny komórek (1.2.2.) i inkubowanie przez 5-10 minut do 2 godzin, korzystnie 30 minut, w temperaturze pomiędzy 0°C i 20°C, korzystnie 4°C przy łagodnym mieszaniu, i;

1.4.1. jeżeli populacja komórek docelowych zawarta jest we krwi lub aspiracie szpiku, to siły hydrofobowe związane z cząstkami opłaszczonymi przeciwciałami redukowane są przez uprzednią inkubację z cząstek opłaszczonych przeciwciałami i zawiesiny komórek z łagodnym detergentem w odpowiednim stężeniu, np. takim jak ester kwasu laurylowego z polioksoetylenosorbitanem, w stężeniu mniejszym niż 0,1% przez 30 minut w temperaturze 4°C, i/lub

1.4.2. przez inkubowanie zawiesiny komórek, nie traktowanych lub uprzednio traktowanych formaliną, alkoholem lub innym utrwalaczem, z innymi przeciwciałami lub fragmentami przeciwciał wiążącymi cząsteczki zewnątrzkomórkowe lub wewnątrzkomórkowe obecne w komórkach docelowych i użyte przeciwciała uprzednio znakowane peroksydazą, fosfatazą alkaliczną czy innymi enzymami umożliwiającymi obrazowanie wiązania przez dodanie i inkubację z odpowiednimi substratami, lub

1.4.3. fragmenty przeciwciał sąbiotynowane, zaś wiązanie obrazowane jest przez inkubowanie z kompleksami awidyny z peroksydazą, fosfatazą alkaliczną lub innymi enzymami z dodaniem i inkubacją z odpowiednimi substratami, lub gdy gęstość komórek docelowych jest

177 136 niska, lub stosunek komórki docelowe/całkowita liczba komórek w mieszaninie j est niski (< 1 %) a następnie badaniu i liczeniu znakowanych i nieznakowanych kompleksów cząstka-komórka docelowa w zawiesinie komórek, przy użyciu mikroskopu i/lub odpowiedniego urządzenia liczącego komórki/cząstki, lub

1.5.1. poddanie inkubowanej mieszaniny cząstek paramagnetycznych-przeciwciał-komórek (1.3.) działaniu pola magnetycznego gdy gęstość komórek docelowych jest niska, lub stosunek komórki docelowe/całkowita liczba komórek w mieszaninie jest niski (< 1%), a następnie badaniu i liczeniu znakowanych i nieznakowanych kompleksów cząstka-komórka docelowa w zawiesinie komórek, przy użyciu mikroskopu i/lub odpowiedniego urządzenia liczącego komórki/cząstki, lub

1.5.2. badanie i liczenie komórek docelowych w inkubowanej mieszaninie cząstek paramagnetycznych, przeciwciał i komórek (1.3.) lub w przypadku gdy przeciwciała lub fragmenty przeciwciał skonjugowane są z cząstkami nieparamagnetycznymi, które mogą być obrazowane bezpośrednio z powodu swego koloru lub przez aktywację enzymatyczną, przy użyciu mikroskopu, i/lub odpowiedniego urządzenia liczącego cząstki/komórki gdy stosunek komórki docelowe/całkowita liczba komórek w zawiesinie komórek jest odpowiedni (>1%).

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że przeciwciała lub ich fragmenty skierowane są przeciwko antygenom w normalnych, żywych komórkach jak hepatocyty wątroby, komórki Kupffera i komórki śródbłonka typu 1 i 2 i komórki Clara płuc, komórki śródbłonka specyficznych narządów, komórki trzustki egzokrynne i endokrynne, komórki przewodów nerki, komórki nabłonkowe pęcherza, komórki gleju i wyściółki mózgu, komórki nabłonkowe pęcherza i stercza, urzęsione komórki dróg oddechowych, różne subpopulacje komórek śluzowych w przewodzie pokarmowym, komórki przysadki i inne komórki endokrynne w różnych narządach wytwarzających hormony.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się jako wspomniane przeciwciała przeciwko komórkom docelowym przeciwciało reagujące z antygenami obecnymi na subpopulacjach komórek normalnych i produktami onkogenów ekspresjonowanymi w błonie komórek normalnych tkanek.

4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że używa się jako wspomniane przeciwciało selekcjonujące pozytywnie przeciwciała, które jest skierowane przeciwko receptorom dla czynników wzrostowych w błonie komórek normalnych, przykładowo receptorowi EGF, receptorowi PDGF (A i B), receptorom insuliny, receptorom substancji przypominających insulinę, receptorowi transferyny, receptorom NGF i FGF.

5. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że używa się przeciwciał skierowanych przeciwko grupie integryn i innych błonowych cząsteczek adhezyjnych i białek MDR w normalnych komórkach.

6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że używane przeciwciała lub ich fragmenty skierowane są przeciwko antygenom lub receptorom w komórkach o nieprawidłowym wzorcu rozwoju, najkorzystniej jak np. komórki raka pierwotnego lub przerzutowego.

7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako wspomnianych przeciwciał przeciwko komórkom docelowym używa się przeciwciał izotypu IgG lub fragmentów F(ab')₂ lub F(ab), lub IgM lub fragmentów IgM.

8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że przygotowuje się wspomnianą zawiesinę komórek z mieszanych populacji obejmujących tkanki ludzkie, przykładowo ludzki szpik i krew obwodową, wysięki opłucnowe i otrzewnowe, inne płyny ustrojowe, korzystnie mocz, płyn mózgowo-rdzeniowy, nasienie, chłonkę, lub guzy lite w normalnych narządach i tkankach, korzystnie wątrobie, węzłach chłonnych, śledzionie, płucach, trzustce, tkance kostnej, ośrodkowym układzie nerwowym, gruczole sterczowym, skórze i błonach śluzowych.

9. Sposób według zastrz. 3 albo 6, znamienny tym, że przeciwciało lub jego fragmenty skierowane są przeciwko grupom determinant antygenowych, jak te wymienione w tabeli 2.

10. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że wspomniane przeciwciało przeciwko komórkom docelowym jest przeciwciałem lub fragmentem przeciwciała skierowanego przeciwko

177 136 receptorom dla czynników wzrostowych i produktom onkogenów, ekspresjonowanym w błonie komórek nowotworowych, korzystnie receptorom insuliny, receptorom substancji przypominających insulinę i receptorom FGF dodatkowo do wymienionych w tabeli 2.

11. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że używa się przeciwciał lub ich fragmentów skierowanych przeciwko grupie integryn, innych błonowych cząsteczek adhezyjnych i białek MDR w komórkach nieprawidłowych według tabeli 2.

12. Sposób według zastrz. 3 albo 6, znamienny tym, że używane przeciwciała, fragmenty przeciwciał lub ich kombinacje skierowane są przeciwko determinantom antygenowym wymienionym w tabeli 2.

13. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako wspomnianych przeciwciał używa się przeciwciał reagujących z antygenami obecnymi na komórkach nieprawidłowych, korzystnie komórkach raka sutka, jajnika i płuca, czerniaka, mięsaka, glioblastomy i komórkach raka układu pokarmowego i moczopłciowego, i układu siateczkowo-śródbłonkowego i/lub komórkach docelowych w chorobach nienowotworowych jak sercowo-naczyniowe, neurologiczne, płucne, autoimmunizacyjne, przewodu pokarmowego, układu moczopłciowego, układu siateczkowo-śródbłonkowego i innych.

14. Zestaw do stosowania sposobu wykrywania specyficznych komórek docelowych w zawiesinach mieszanych populacji komórek i w układach płynnych zawierających mieszane populacje komórek oraz zawiesinach jednokomórkowych przygotowanych z tkanek litych, z wyłączeniem normalnych i nowotworowych komórek krwiotwórczych we krwi i szpiku, znamienny tym, że zawiera:

1. specyficzne przeciwciała lub fragmenty przeciwciał skierowane przeciwko antygenowym receptorom na pożądanych komórkach, które to przeciwciała lub fragmenty przeciwciał są związane lub mogą być związane z dołączonymi cząstkami paramagnetycznymi bez utraty ich zdolności do wiązania antygenu, i/lub

2. cząstki paramagnetyczne uprzednio opłaszczone specyficznymi przeciwciałami przeciw-Fc, najkorzystniej poliklonalnymi przeciw-mysimi, lub monoklonalnymi szczurzymi przeciw-mysimi, lub przeciw-ludzkimi przeciwciałami zdolnymi do wiązania fragmentów Fc przeciwciał rozpoznających komórki docelowe i specyficzne wolne przeciwciała rozpoznające komórki docelowe i/lub

3. cząstki paramagnetyczne uprzednio opłaszczone przeciwciałami specyficznymi przeciw-Fc, najkorzystniej poliklonalnymi przeciw-mysimi, lub monoklonalnymi szczurzymi przeciw-mysimi, lub przeciw-ludzkimi przeciwciałami zdolnymi do wiązania fragmentów Fc przeciwciał rozpoznających komórki docelowe, związane ze specyficznymi przeciwciałami przeciwko komórkom docelowym i/lub

4. inne specyficzne przeciwciała lub fragmenty przeciwciał skierowane przeciwko antygenom/receptorom w poszukiwanych komórkach docelowych, które to przeciwciała lub fragmenty przeciwciał skonjugowane są z biotyną, peroksydazą, fosfatazą, alkaliczną lub innymi enzymami lub wspomniane przeciwciało lub fragmenty przeciwciał związane są z nieparamagnetycznymi cząstkami o specyficznych kolorach lub związane z enzymami jak peroksydaza i fosfataza alkaliczna.