DE69326956T2

DE69326956T2 - Verbessertes verfahren zum nachweis von spezifischen zielzellen in spezialisierter oder gemischter zellpopulation und gemischte zellpopulationen enthaltend

Info

Publication number: DE69326956T2
Application number: DE69326956T
Authority: DE
Inventors: Oystein Fodstad; Gunnar Kvalheim
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1992-09-14
Filing date: 1993-09-10
Publication date: 2000-06-15
Anticipated expiration: 2013-09-11
Also published as: DE69326956D1; SK32995A3; US6184043B1; WO1994007139A1; JP3417563B2; US6893881B1; DK0660930T3; CZ65995A3; JPH08501390A; AU2593192A; AU686569B2; HUT73741A; FI951161A; EP0660930B1; HU9500723D0; SK281566B6; FI951161A0; WO1994007138A1; CA2144328A1; ES2141170T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein immunomagnetisches Verfahren zum Nachweis von spezifischen Zielzellen in Zell - Populationen und Lösungen von Zell - Populationen. Die Erfindung betrifft auch ein Kit für die Durchführung des Verfahrens bei unterschiedlichen Zell - Populationen.
Auf dem Gebiet der Biologie, der Biochemie und benachbarten Gebieten besteht ein deutlicher Bedarf an Verfahren, bei denen chemische Einheiten miteinander verbunden werden. Solche Verfahren sind bei der Forschung betreffend sowohl normale als auch abnormale Zell - Populationen von steigender Bedeutung. Insbesondere bei der Verwendung von festen Trägern, können die Zellen immobilisiert, nachgewiesen und isoliert und gereinigt werden. Außerdem kann der Zellinhalt unter Verwendung einer ganzen Reihe von fortschrittlichen Verfahren untersucht werden. Es ist ebenfalls wichtig, in der Lage zu sein, die Zellen in lebensfähiger Form zu isolieren.
Die Affinitätsbindung ist eine fortschrittliche Weise um chemische/biochemische Einheiten miteinander zu verbinden. Bei einem solchen Verfahren wird ein Paar von Bindungspartnern, die z. B. an die zu verbindenden Substanzen angehaftet sind, aneinander binden, wenn sie in Kontakt miteinander gebracht werden. Einer der Bindungspartner bei einer solchen Bindung kann durch ein Molekül auf der Zell - Oberfläche dargestellt werden. Einige solche Bindungspartnersysteme sind bekannt, wie z. B. Antigen - Antikörper, Enzym - Rezeptor, Liganden - Rezeptor - Wechselwirkungen auf Zellen und die Biotin - Avidinbindung, wobei die Antigen - Antikörperbindung darunter am häufigsten verwendet wird. Vor kurzem wurde auch ein Hapten/Anti-Hapten Bindungspaarverfahren vorgeschlagen (WO 91/01368).
Wenn solche Verfahren für die Isolierung spezifischer Zellen verwendet werden, die dann als Subjekt für unterschiedliche weitere Untersuchungen dienen, ist es notwendig, die Bindung wieder aufzuheben, ohne zerstörerische Wirkungen auf die Bindungspartner auszuüben, die im Idealfall nach Rückkehr in ihren ursprünglichen Zustand ihre Funktion wiedergewinnen sollten. Dies ist nicht immer der Fall, obwohl ein Verfahren zur geeigneten Spaltung von Antigen/Anti-Antigen und Hapten/Anti- Haptenbindungen vorgeschlagen ist (PCT/EP 91/00671, PCT/EP 90/01171).
Es sind Verfahren bekannt, bei denen einer der Bindungspartner an einen unlöslichen Träger gebunden ist, wie z. B. paramagnetische Teilchen und durch den die Isolierung von Zielzellen in einer gemischten Zeilpopulation als negative Isolierung oder positive Isolierung durchgeführt wird. Bei einem negativen Isolierungsverfahren können die unerwünschten Zellen aus der Zellpräparation durch Inkubation der Zellen mit Antikörper -beschichteten Teilchen, die für die unerwünschten Zellen spezifisch sind, entfernt werden. Folgend auf die Inkubation kann der Zell/Antikörperfreilchen - Komplex unter Verwendung der Teilchen entfernt werden, wobei die erwünschten Zielzellen zurückgelassen werden. Das Ergebnis ist häufig nicht zufriedenstellend, da die erwünschten Zellen in der Zellpopulation mehr oder weniger gereinigt zurückgelassen werden und auch da es die Absicht des Isolierungsverfahrens ist, weitere Untersuchungen an den spezifischen Zielzellen oder weitere Studien durchzuführen. Es wurden Versuche unternommen, Teilchen für eine positive Isolierung zu verwenden, wobei die erwünschten Zielzellen aus der gemischten Zellpopulation entfernt werden. Diese Verfahren haben sich jedoch auf bestimmte Zielzellen gerichtet und sind nicht für alle Zielzellsysteme geeignet. Ein positives Isolierungsverfahren, das ein Hapten/Anti- Hapten Bindungssystem involviert, ist vor kurzem vorgeschlagen worden (PCT/EP 90/01171), ebenso wie ein Verfahren für die Isolierung haematopoietischer Vorläuferzellen aus dem Knochenmark (PCT/EP 90/02327). Das letztere ist auf die Verwendung einer Kombination einer positiven und negativen Selektion für den Zweck der Isolierung und dem möglichen Wachstum spezifischer Zellen, d. h. haematopoietischer Vorläuferzellen, in dem Knochenmark gerichtet und hängt von der Entfernung der Teilchen ab.
Die PCT/EP 90/01171 betrifft ein Verfahren zur Verbindung von Zielzellen mit einem unlöslichen Träger unter Verwendung der Fähigkeiten von Hapten, Anti-Hapten Antikörpern und Anti-Zell Antikörpern, aneinander zu binden, so dass eine Verbindung zwischen dem unlöslichen Träger, d. h. dem Teilchen, und der Zielzelle, bestehend mindestens aus Hapten und Anti-Hapten Antikörper oder Kombinationen von Hapten und Anti-Hapten Antikörpern und Anti-Anti-Hapten Antikörpern oder sekundären Anti- Zell Antikörpern, entsteht. Die spätere Spaltung des Komplexes wird durchgeführt, indem er wiederum einem Hapten oder Haptenanalog ausgesetzt wird. So besteht die konstruierte Verbindung immer aus Hapten in Verbindung mit einem oder mehreren Elementen. Das Verfahren ist auf nicht spezifizierte Zielzellen gerichtet und ist auf die Isolierung von Zielzellen und die Freisetzung von dem unlöslichen Träger gerichtet.
Es besteht ein Bedarf an einer einfachen Verbindung um eine Zielzelle an einen unlöslichen Träger zu binden, wobei keine Verbindungen einer ziemlich unspezifizierten Hapten-Gruppe involviert sind und das auf den Nachweis spezifischer Zielzellen gerichtet ist, mit einem Minimum von unspezifischer Zell-Assoziation und das eine spätere Spaltung zwischen dem unlöslichen Träger und der spezifischen Zielzelle unnötig macht.
Es ist daher die Aufgabe der vorliegenden Erfindung für diagnostische Zwecke spezifische Zielzellen nachzuweisen, wenn es in Blut oder Knochenmark verwendet wird, ohne das Problem der unspezifischen Bindung an normale Zellen. Es stellt ein sensibles Nachweisverfahren für eine Vielzahl von Zelltypen dar, so dass eine hohe Anzahl von Zellen einfach im Mikroskop überprüft werden kann, wobei das Verfahren schnell und einfach ist. Ausserdem kann das vorliegende Verfahren für die Isolierung von Zellen für die biochemische, biologische und immunologische Prüfung und für die Untersuchung spezifischer Gene auf dem Nukleotid- oder Proteinniveau verwendet werden, zusätzlich für die Kultivierung von Zellen, ohne dass ein Bedarf an einer Spaltung des Zell - Teilchen Komplexes besteht. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Kits für die Durchführung des Verfahrens, wie in den Ansprüchen gekennzeichnet.
Die Absichten der Erfindung werden durch das Verfahren und den Kit erhalten, die in den beigefügten Ansprüchen gekennzeichnet sind.
Das Verfahren für den immunomagnetischen Nachweis von Zielzellen in einer gemischten Zellpopulation und physiologischen Lösungen, die die Zellpopulationen enthalten, ist für den Nachweis geeignet, kann aber auch für die positive Isolierung spezifischer Arten sowohl normaler Zellen als auch pathogener Zellen verwendet werden. Das Verfahren erzeugt eine Verbindung zwischen einer spezifischen Zielzelle und einem unlöslichen Träger, so wie paramagnetischen Teilchen, die aus einem oder zwei Elementen besteht. Das Teilchen ist entweder mit einem Anti-Zell Antikörper von murinem oder menschlichem Ursprung beschichtet, gerichtet gegen die spezifischen antigenen Determinanten in den Membranen der erwünschten Zielzellen oder die Teilchen werden mit einem polyklonalen Anti-Maus oder anti-humanem Antikörper beschichtet, der in der Lage ist, an die Fc-Bereiche des spezifischen Anti-Zell Antikörpers zu binden, der gegen die antigenen Determinanten in den Ziel-Zell Membranen gerichtet ist. Anstelle der Verwendung der polyklonalen Anti-Maus/Antihumanen Antikörper für die Beschichtung der Teilchen, kann ein monoklonaler Ratten Anti-Maus/anti-humaner Antikörper verwendet werden. Dieser letzte Antikörper kann teilweise aufgrund seines monoklonalen Ursprungs eine spezifischere Bindung an den Anti-Zell Antikörper bereitstellen und das Risiko für mögliche Kreuzreaktionen mit anderen Zellen in Lösungen, so wie Blut, reduzieren. Ausserdem wird die Inkubation der Zellsuspension mit einem milden Detergenz und/oder einem zweiten Set von Antikörpern oder Antikörper-Fragmenten, vorher mit fluoreszierenden Mitteln, Metallkolloiden, Radioisotopen, Biotin-Komplexen oder bestimmten Enzymen, die eine Visualisierung erlauben, oder auch nicht, die Spezifität des Verfahrens deutlich erhöhen.
Im folgenden wird eine detailliertere Offenbarung des Verfahrens vorgestellt, wobei Krebszellen als Zielzellen für den Nachweis und die mögliche Isolierung verwendet werden. Das Verfahren ist jedoch nicht auf Krebszellen begrenzt und die Offenbarung soll das Verfahren nicht auf dieses bestimmte Verwendungsgebiet beschränken, da das Verfahren in einem Bereich von zytologischen Forschungsgebieten geeignet ist.
Bei der Behandlung von Krebspatienten ist die Einstufung der Krankheit im Hinblick darauf, ob sie lokalisiert ist oder ob eine metastatische Verteilung auf andere Gewebe stattgefunden hat, von äußerster Bedeutung für die Wahl der therapeutischen Alternativen für den individuellen Patienten. Maligne Zellen verteilen sich durch direkte Invasion in das umliegende Gewebe, durch die Lymphwege oder durch die Verteilung von Tumorzellen in dem Blut zu entfernteren Organen, einschließlich dem Knochenmark und dem Zentralnervensystem und der Cerebrospinalflüssigkeit.
Der Nachweis von metastatischen Tumorzellen musste sich bis vor kurzem auf morphologische Verfahren unter Verwendung von Licht - und Elektronenmikroskopie an Tumorbiopsieproben stützen, aus Abstrichen vom Knochenmark und vom periphären Blut und auf Objektträger, die nach der Zytozentrifugation von verschiedenen Körperflüssigkeiten hergestellt worden waren. Seit der Erkenntnis, dass monoklonale Antikörper Antigene erkennen, die vorwiegend auf der Oberfläche unterschiedlicher Arten maligner Zellen exprimiert werden, involviert die Identifizierung von metastatischen Zeilen in steigendem Ausmaß auch die Immunocytochemie und die Immunfluoreszenz. So wurden Objektträger, die aus biopsierten Tumoren oder Zytozentrifugaten gewonnen wurden, mit monoklonalen Antikörpern behandelt und die Bindung dieser an die Tumorzellen wird colorimetrisch oder durch Fluoreszenz sichtbar gemacht. Das letztere Verfahren macht die Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops notwendig, alternativ die Herstellung einer Zellsuspension und die Verwendung eines Fluss - Zytometers.
Die früheren Verfahren leiden an ihrer begrenzten Sensibilität und/oder Spezifität und sind in der Regel arbeits- und zeitaufwendig, und sie verlangen außerdem einen hohen Grad an Fachkenntnis. Flusszytometrische Untersuchungen verlangen ausserdem eine teure Ausrüstung.
Die morphologischen Verfahren für den Nachweis von Tumorzellen im Blut und Knochenmark sind sehr viel weniger sensibel als Verfahren, die Immuncytochemie und Immunfluoreszenz involvieren (Beiske et al., Am. J. Pathology 141 (3), September 1992). Die letzteren Verfahren sind aber in den Fällen ungeeignet, wenn die Tumorzellen weniger als 1% der gesamten Menge der kernhaltigen Zellen ausmachen. Die Flusscytometrie stellt möglicherweise eine bessere Sensibilität als Verfahren bereit, bei denen ein Mikroskop verwendet wird, macht aber die Verfügbarkeit einer großen Zellzahl erforderlich und involviert verschiedene technische Schwierigkeiten. So kann die Aggregation der Zellen Probleme verursachen und das Verfahren stellt keine Möglichkeiten bereit, zwischen markierten Tumorzellen und unspezifisch fluoreszierenden normalen Zellen zu unterscheiden.
Die Erfindung ermöglicht einen sehr sensiblen Nachweis von z. B. metastatischen Tumorzellen, da eine große Anzahl von Zellen einfach im Mikroskop überprüft werden kann und die magnetischen Kügelchen sind einfach erkennbar. Die verwendeten monoklonalen Antikörper binden mit ausreichender Spezifität an z. B. Tumorzellen und nicht an andere Zellen als die Zielzellen, die in gemischten Zeilsuspensionen, wie Blut, Knochenmark und anderen Tumormanifestationen vorliegen, so dass alle Zellen mit angehafteten Kügelchen die Zielzellen darstellen. Zudem ist das Verfahren schnell und einfach und kann durch jeden Untersucher mit Zugang zu einem konventionellen Mikroskop durchgeführt werden.
Das neue Verfahren involviert die Bindung von monoklonalen Antikörpern, z. B. von murinem oder humanem Ursprung, die Antigene, die auf Tumorzellen, und nicht auf den normalen Zellen, die in Frage stehen, vorliegen, spezifisch erkennen oder für andere Zwecke auf spezifizierten Subpopulationen von normalen Zellen, an paramagnetische Teilchen, entweder direkt oder an Kügelchen, die zunächst mit Antikörpern bedeckt werden, die spezifisch die jeweiligen Antikörper oder den Fc-Bereich der IgG Antikörper erkennen, die an die Tumorzellen binden. Die Zellbindenden Antikörper können vom IgG oder IgM Typ sein oder können ein Fragment von ab IgG oder IgM sein. Beispiele für verwendete anti-Zielzell-Antikörper können diejenigen sein, die gegen Gruppen von Antigen-Determinanten gerichtet sind, z. B. CD 56/NCAM Antigen (MOC -1), Cluster 2 Epithelialantigen (MOC-31), Cluster 2 (MW ca. 40 kD) Antigen (NrLu 10) (Myklebust et al., Br. J. Cancer Suppl. 63, 49-53, 1991), HMW - Melanom-assoziiertes Antigen (9.2, 27) (Morgan et al., Hybridoma, 1, 27-36, 1981), 80 kD, Sarcom-assoziiertes Antigen (TP 1 und TP 3) (Cancer Res. 48, 5302-5309, 1988), Mucin - Antigene (Diel et al., Breast Cancer Res. Treatm. 1991) oder EGF - Rezeptor Antigen (425.3) (Merck), zusätzlich zu dem anti-pan-humanem Antikörper (Bruland et al., unveröffentlicht), der geeignet ist, menschliche Zellen unter Tierzellen nachzuweisen. Der 425.3 Antikörper ist gegen Antigene sowohl normaler als auch maligner Zellen gerichtet. Antikörper können ausserdem gegen Wachstumsfaktorrezeptoren, z. B. den EGF - Rezeptor, PDGF (A und B) Rezeptor, Insulinrezeptor, Insulin-ähnlicher Rezeptor, Transferrin-Rezeptor, NGF und FGF Rezeptoren, Gruppen von Integrinen, andere Adhäsionsmembranmoleküle und MDR Proteine sowohl in normalen Zelllen als auch abnormalen Zellen gerichtet sein sowie gegen Antigene, die auf Subpopulationen von normalen Zellen vorliegen zusätzlich zu onkogenen Produkten, die auf den Membranen von normalen und malignen Zellen und auf malignen Zellen allein exprimiert werden, z. B. Neu/erb B2/HER2. Im Fall der malignen Zellen können diese Brust-, ovarielle und Lungenkarzinomzellen sein, Melanom, Sarkom, Glioblastom, Krebszellen des Gastrointestinaltrakts und des Retikuloendothelialsystems oder die Zielzellen können mit nicht-neoplastischen Krankheiten assoziiert sein, so wie cardiovaskulären, neurologischen, pulmonalen, Autoimmun-, gastrointestinalen, genitourinären, reticuloendothelialen und anderen Störungen. Ausserdem kann die maligne Zellpopulation im Knochenmark, im periphären Blut, sei es von pleuralen oder peritonealen Effusionen und anderen Körperflüssigkeitsabschnitten, lokalisiert sind, so wie dem Urin, der Cerebrospinalflüssigkeit, dem Samen, der Lymphe oder von festen Tumoren in normalen Geweben und Organen, z. B der Leber, den Lymphknoten, der Milz, der Lunge, dem Pankreas, der Knochenhaut, dem Zentralnervensystem, der Prostata, der Haut und mukösen Membranen. Eine vollständigere Liste der Antigen- Determinanten und der korrespondieren Antikörper oder Antikörperfragmente, die bei dem vorliegenden verbesserten Verfahren verwendet werden, wird in Tabelle 1 dargestellt.
Das Verfahren umfasst die Befestigung der Antikörper direkt an die paramagnetischen Teilchen oder die Befestigung kann stattfinden, indem an Oberflächen-gebundene Antikörper befestigt wird, so wie polyklonale Anti-Maus Antikörper, monoklonale Ratten Anti-Maus Antikörper oder monoklonale anti-humane Antikörper, die spezifisch den Fc- Bereich der individuellen Antikörper erkennen. Die antikörperbeschichteten paramagnetischen Kügelchen werden dann mit der Suspension der Zellen, die untersucht werden sollen, vermischt und unter leichtem Schütteln für 5 bis 10 min bis 2 h, vorzugsweise für 30 min. bei 0-25ºC, vorzugsweise 4ºC, inkubiert. Das vorliegende Verfahren kann auch mit veränderter Reihenfolge der Schritte durchgeführt werden, so dass die freien Ziel-Zell Antikörper zu der Zellsuspension zugefügt werden, für 5 bis 10 min. bis 2 h, vorzugsweise 30 min. bei 0-20ºC, vorzugsweise 4ºC unter leichtem Schütteln inkubiert werden. Die paramagnetischen Teilchen, die mit anti-Maus oder antihumanen Antikörpern vorbeschichtet sind, werden dann zu der inkubierten Zellsuspension wie oben beschrieben zugefügt und die resultierende Suspension wird einer weiteren Inkubation von 5 bis 10 min. bis 2 h, vorzugsweise 30 min., bei 0-25ºC, vorzugsweise 4ºC unter leichtem Schütteln unterzogen.
Proben der Zellsuspension werden dann auf eine zellzählende Vorrichtung übertragen und die Fraktion der Zellen mit angehafteten Kügelchen relativ zu der gesamten Anzahl der Zellen wird durch Lichtmikrokopie bestimmt. Die Anzahl der Antikörperbeschichteten Kügelchen, die der Zellsuspension zugefügt werden, sollte zwischen 0,5 bis 10 Mal die Anzahl der Zielzellen betragen. Wenn die Zahl unbekannt ist, sollte die Menge der zugefügten beschichteten Kügelchen 1-10% der gesamten Zahl der Zellen betragen.
Für bestimmte Zwecke und in den Fällen, in denen die Dichte der Zielzellen gering ist, z. B. maligner Zellen, oder wenn die Zielzellen einen geringen Anteil der gesamten Zahl der Zellen (≤1%) ausmachen, können die Zielzellen von nicht-Zielzellen positiv in einem magnetischen Feld getrennt werden. Die isolierten Zielzellen können dann mikroskopisch ausgezählt werden und die Fraktion der Zielzellen relativ zu der gesamten Anzahl der Zellen in der anfänglichen Zellsuspension kann berechnet werden. Ausserdem können die Zielzellen auf die Gegenwart von spezifischen biochemischen und biologischen Merkmalen hin gekennzeichnet werden. Von besonderer Bedeutung wird die Verwendung solcher Zellen für Untersuchungen in der molekularen Biologie sein. Im Gegensatz zu den obigen zitierten Verfahren aus dem Stand der Technik ermöglicht das vorliegende Verfahren Untersuchungen und Wachstum der Zielzellen ohne dass eine Spaltung der Verbindung von paramagnetischen Teilchen an die Zielzellen durchgeführt werden muss. Für verschiedene Zwecke ist es von Interesse, bestimmte Gene in einer reinen Population von Zielzellen auf dem Niveau von DNA, mRNA und Proteinen durchzuführen, sowohl in Tumorbiopsien als auch in Tumorzellen, die im Blut, Knochenmark und anderen Körperflüssigkeiten vorliegen, z. B. dem Urin, der Cerebrospinalflüssikeit, dem Samen, der Lymphe, oder von ansonsten normalen Geweben und Organen, z. B. der Leber, den Lymphknoten, der Milz, der Lunge, dem Pankreas, der Knochenhaut, dem Zentralnervensystem, der Prostata, der Haut und mukösen Membranen und anderen Bereichen einer zytologischen Forschungsaktivität.
Mit den Verfahren aus dem Stand der Technik, stellen Signale, die durch Southern, Northern und Western Blots erhalten werden, die normalen Zellen als auch die Tumorzellen in der Biopsie dar. Wenn eine Einzelzellsuspension zunächst aus dem Tumormaterial präpariert wird und die Tumorzellen dann positiv immunomagnetisch nachgewiesen und abgetrennt werden, würden alle Gen-Untersuchungen, die an diesem Material durchgeführt würden, nur die Zielzellen darstellen. Dies betrifft auch z. B. maligne Zellen, die in Geweben von Säugern vorliegen, z. B im Knochemmark, im periphären Blut, in pleuralen und peritonealen Effusionen und anderen Körperflüssigkeiten, z. B. dem Urin, der Cerebrospinalflüssigkeit, dem Samen und der Lymphe. Untersuchungen, an denen die Polymerasekettenreaktion (PCR) beteiligt ist, werden ebenfalls an Spezifität und Verlässlichkeit gewinnen, wenn sie an reinen Tumorzellpopulationen durchgeführt werden, die durch das neue Verfahren erhalten werden.
Die Anwendung der neuen Verfahrensschritte kann abhängig von der Art der Gewebe differieren, die untersucht werden sollen.
a) Das Gewebe von festen oder Nadeltumorbiopsien wird durch milde enzymatische Behandlung oder mechanisch in eine Einzelzellsuspension hergestellt, zu der die primären, spezifischen Antikörper oder Antikörperfragmente direkt oder nach Waschen der Zellsuspension mit phosphatgepufferter Salzlösung oder Kulturmedium mit oder ohne Serum, so wie fötalem Kälberserum, Rinder-, Pferde-, Schweine-, Ziegen- oder menschlichem Serum, zugegeben werden.
b) Wenn das Material eine Probe einer pleuralen oder Ascites-Effusion ist, Cerebrospinalflüssigkeit, Urin, Lymphe oder Körperflüssigkeiten so wie Effusionen in den Gelenken der Patienten mit verschiedenen Formen von Arthritis, werden die spezifischen Antikörper oder Antikörper-Fragmente entweder direkt oder nach einer Zentrifugation, mit oder ohne Waschen bevor oder nachdem die Zellen in den Proben abzentrifugiert und wieder in Suspension gebracht worden sind, der Probe zugefügt.
c) Wenn das Material aus Blut oder Knochenmarkaspirat besteht, wird die mononukleäre Zelifraktion durch Gradientenzentrifugation z. B. auf Lymphoprep vor dem Waschen, der Resuspension und der Zugabe der geeigneten Antikörper oder Antikörperfragemnte isoliert.
Die Verfahrensbedingungen für a und b werden wie beispielhaft durch die Ergebnisse in erfolgreichen Experimenten, wie den unten beschriebenen, dargestellt, etabliert.
Für c hat sich herausgestellt, dass die Ergebnisse durch eine große Anzahl von Faktoren beeinflusst werden, die im Detail untersucht worden sind. Unter diesen sind die Antikörperkonzentration, das Verhältnis der Anzahl der paramagnetischen Teilchen gegenüber der Anzahl der Zellen, die Inkubationszeit und Volumen, die Art des Inkubationsmediums und das pH Niveau. Das Verhältnis von Teilchen zu den mononukleären Zellen bei allen Experimenten sollte im Bereich von 0,5/l-2/l liegen, abhängig von der Bindungsaffinität der primären spezifischen Antikörper oder Fragmente.
Ein Hauptproblem war die unspezifische Bindung von Teilchen, die entweder mit Schaf- oder Ratten Anti-Maus Antikörpern allein oder zusätzlich zu den spezifischen Antikörpern beschichtet waren, an normale Blut oder Knochenmarkszellen. Experimente haben gezeigt, dass die unspezifische Bindung ohne die Gegenwart der spezifischen Antikörper ähnlich hoch ist, was nahelegt, dass das Problem nicht durch die Kreuzreaktivität der Zielantikörper an normale Zellen erzeugt wird. Die Möglichkeit, dass die weniger als optimale Spezifität durch eine Ionenbindung erzeugt wird, ist ausgeschlossen worden. Eine weitere Möglichkeit war, dass die Subpopulationen von normalen Zellen der B-Linie an die Teilchen-Antikörperkomplexe binden könnten. Die immunomagnetische Entfernung von B-Zellen aus der Zellsuspension vor der Zugabe der spezifischen Antikörper/Antikörper-Teilchenkomplexe verbesserte jedoch die Spezifität der letzteren nicht.
Das Problem bei dem Verfahren, das bei isolierten mononukleären Fraktionen von Knochenmark und periphärem Blut verwendet wird, dass nämlich einige nicht-Zielzellen ebenfalls an die paramagnetischen Teilchen binden könnten, ist umgangen worden oder überwunden worden. So wurde die Anzahl der Teilchen, die sich unspezifisch an eine geringe Fraktion von mononukleären Blut- oder Knochenmarkszellen anhaftete von einem Durchschnitt von 10 auf ungefähr 1 reduziert und parallel dazu nahm die Fraktion der normalen Zellen mit Teilchen von 1-2% auf 0,5 bis 1% oder weniger ab, wenn Schaf-Anti-Maus Antikörper beschichtete Teilchen allein oder mit spezifischen Antikörpern verwendet wurden.
Es wurden Beweise gefunden, dass das Problem durch hydrophobe Kräfte ausgelöst werden kann, die mit den Antikörpern assoziiert sind, die an die paramagnetischen Teilchen gebunden sind. Verfahren zur Reduktion dieser Hydrophobozität sind daher nötig. Ein solches Verfahren ist die Präinkubation der Antikörper beschichteten Teilchen und der Zellsuspension mit milden Detergentien in geeigneten Konzentrationen, z. B. Tween 20 in Konzentrationen von weniger als 0,1% für 30 min. bei 4ºC. Wenn eine mögliche Selektion der Zielzellen angezeigt ist, sollte die Zellsuspension ein geringe Konzentration des Detergenz, z. B. 0,01% Tween 20, enthalten. In verschiedenen Experimenten hat dieses Verfahren das Problem der unspezifischen Bindung, das bei den mononukleären Zellfraktionen von Blut oder Knochenmark beobachtet wird, fast eliminiert oder dramatisch reduziert.
Die andere Verbesserung, die, falls sie angezeigt ist, zusammen mit dem Detergensschritt verwendet werden kann, ist die folgende:
Nach Inkubation der Zellsuspension mit den primären Antikörpern oder Antikörperfragmenten und den Antikörper beschichteten paramagnetischen Teilchen, wie vorher beschrieben, wird die Zellsuspension mit einem zweiten Satz Antikörper oder Antikörperfragmenten inkubiert, die gegen andere extrazelluläre oder gegen intrazelluläre Determinanten der Zielzellen gerichtet sind, mit oder ohne Vorbehandlung mit Zellfixativen, wie Formaldehyd oder Alkoholen. Diese Antikörper oder ihre Fragmente sollten mit fluoreszierenden Mitteln, Metallocolloiden, Radioisotopen, Biotin- Komplexen oder Enzymen, wie Peroxidase und alkalische Phosphatase vorher markiert worden sein, was die Visualisierung durch per se bekannte Verfahren in dem Mikroskop und/oder einer geeigneten Zählvorrichtung ermöglicht.
Die Zielzellen werden sowohl mit dem letzteren Verfahren visualisiert und weisen auf ihrer Oberfläche gebundene Teilchen auf und können so ausgezählt werden.
Um die Unterscheidung zwischen nicht-Ziel und Zielzellen zu erleichtern, kann die Zellsuspension vor dem zweiten Visualisierungsschritt entweder einer Zytospin- Zentrifugation unterzogen werden oder Teile der Suspension werden an beschichtete Glasobjektträger angehaftet, auf denen sich die teilchengebundenen Zellen in einer dünnen Schicht ausbreiten werden, was die Erkennung von doppelt "gefärbten" Zellen vereinfacht.
Für die Verwendung in dem neuen Verfahren, werden Kits z. B. vorbeschichtete paramagnetische Teilchen enthalten, die für jeden monoklonalen Antikörper hergestellt wurden. Bei einer anderen Ausführungsform enthalten die Kits paramagnetische Teilchen, die mit IgG Isotyp spezifischen Anti-Maus oder anti-humanem Antikörper als Teil davon vorbeschichtet wurden und unterschiedliche, Zielzell assoziierte, z. B. Tumorzell-, Antikörper als anderen Teil. Bei einer dritten Ausführungsform enthält das Kit paramagnetische Teilchen, die mit spezifischen anti-Fc Antikörpern vorbeschichtet sind, wie z. B. polyklonalen Anti-Maus oder monoklonalen Ratten Anti-Maus oder Anti- Maus oder anti-humanen Antikörpern, die in der Lage sind, an den Fc-Bereich der Zielzell-assoziierenden Antikörper zu binden, die an die spezifischen anti-Zielzell- Antikörper gebunden sind. Bei einer weiteren Ausführungsform enthält das Kit andere spezifische Antikörper oder Antikörperfragmente, die gegen Antigene/Rezeptoren in oder auf den erwünschten Zielzellen gerichtet sind, wobei diese Antikörper oder Antikörperfragmente an Peroxidase, alkalische Phosphatase oder andere Enzyme gebunden sind, zusammen mit relevanten Substraten für solche Enzyme, oder wobei die Antikörper oder Antikörperfragmente an nicht paramagnetische Teilchen mit spezifischen Farben oder mit gebundenen Enzymen, so wie Peroxidase und alkalische Phosphatase, gebunden sind.
Das vorliegende Verfahren wird im folgenden durch Modellexperimente illustriert werden, durch Beispiele der Nützlichkeit des neuen Verfahrens und Beispiele für praktische Anwendungen. Diese Beispiele sollen in keiner Weise als die Erfindung begrenzend angesehen werden.

Modellexperimente:

1: Bindung der Antikörper-Kügelchen Komplexe an Tumorzelllinien mit dem neuen Verfahren:
Um Antikörperkonzentrationen und optimale Bedingungen für die Bindung von Antikörper-paramagnetischen Teilchen-Komplexen an Tumorzellen zu bestimmen, wurde eine große Serie von Krebszelllinien verwendet. Die paramagnetischen Kügelchen wurden an die Zellen gebunden, entweder durch Beschichtung der spezifischen Antikörper an Schaf-anti-Maus Antikörper (SAM) beschichtete paramagnetische Teilchen oder indem die Zellen zunächst mit den spezifischen Antikörpern inkubiert und gewaschen wurden, gefolgt von einer zweiten Inkubation mit SAM-beschichteten Teilchen. Die Ergebnisse dieser Experimente sind in den Tabellen 2a und 2b angegeben, wobei ein + die Bindung von mehreren Kügelchen an alle Zellen anzeigt, ein (+) entweder eine geringere Anzahl von Kügelchen, die an jede Zelle gebunden sind, anzeigt, oder, dass nicht alle Tumorzellen an ihrer Oberfläche gebundene Kügelchen aufwiesen, während ein - keine Bindung wiedergibt und ein (-) eine sehr schwache Bindung wiedergibt.
2. Für den Nachweis von Tumorzellen in der mononukleären Fraktion des Knochenmarks oder des periphären Blutes, wurden Modellexperimente durchgeführt, bei denen spezifische Antikörper und SAM-beschichtete paramagnetische Teilchen entweder zu solchen mononukleären Zellen oder zu einer Zellsuspension zugefügt wurden, wobei eine Unterschiedliche Anzahl von Krebszellen von in vitro kultivierten Zelllinien diesen mononukleären Zellen zugefügt wurden. Bei einigen Experimenten wurden entweder die mononukleären Zellen oder die malignen Zellen mit einem fluoreszierenden Farbstoff vorgefärbt um in der Lage zu sein, die beiden Arten von Zellen zu unterscheiden. Bei allen Experimenten wurden nicht bindende primäre Antikörper und/oder Schaf-anti-Maus Antikörper beschichtete Kügelchen getrennt als Kontrollen verwendet. Tabelle 2a Tabelle 2b
Bei verschiedenen Experimenten wurde etwas unspezifische Bindung an die mononukleären Zellen beobachtet, von der sich herausstellte, dass sie nicht mit der Natur des spezifischen Antikörpers in Verbindung stand und die ebenso ausgeprägt war, wenn SAM-beschichtete Teilchen allein verwendet wurden. Die Menge der unspezifischen Bindung variierte von fast 0 bis zu einem Niveau zwischen 0,5-2%. Diese unspezifische Bindung wurde fast völlig durch eine Behandlung mit einem Detergenz (Tween 20) eliminiert, durchgeführt, um das Problem hydrophober Zellwechselwirkungen zu reduzieren.

BEISPIELE FÜR DIE NÜTZLICHKEIT DES NEUEN VERFAHRENS

1. Nachweis von mikrometastatischer neoplastischer Erkrankung im Blut und im Knochenmark

Eine frühe und verläßliche Diagnose der Verteilung von Krebszellen in das Blut und/oder das Knochenmark hat sich als immer wichtiger für die Wahl der optimalen Therapie, unter Umständen kurativ bei vielen Arten von Krebs, einschließlich Karzinomen, erwiesen, wie beschrieben in dem Anmeldungsbeispiel 1. Ähnliche Verfahren für maligne Melanome, Sarkom, Neuroblastom und verschiedene andere Krebsarten sind etabliert worden oder befinden sich in der Entwicklung.

2. Nachweis von malignen Zellen in pleuralen oder Ascites-Effusionen und im Urin.

Die Natur solcher Effusionen kann ein wichtiges diagnostisches Problem darstellen, insbesondere wenn neben einer geringen Anzahl von Krebszellen normal reaktive oder epitheliale Zellen vorliegen. In verschiedenen Fällen wurde mit dem neuen Verfahren eine definitive Diagnose schnell erreicht, auch in Fällen, in denen eine konventionelle zytologische Prüfung negativ oder nicht konkludent war. Ein ähnlicher Vorteil wurde bei Fällen von Krebs der Nieren oder im Urethraltrakt und der Blase festgestellt.

3. Nachweis von neoplastischen Zellen in der Cerebrospinalflüssigkeit

Da sich die systemische Behandlung vieler Krebsarten verbessert hat, ist die Häufigkeit der Fälle mit Symptom-ausfösenden Gehirnmetastasen deutlich angestiegen und parallel dazu die Notwendigkeit für einen frühen Nachweis einer solchen Verteilung. Mit der Verwendung des neuen Verfahrens kann sogar eine geringe Anzahl von malignen Zellen einfach identifiziert werden, was eine Intervention mit therapeutischen Alternativen in einem frühen Stadium der intracranialen Tumormanifestationen ermöglicht.

4. Diagnose von Krebs in Biopsien aus Gewebe

Wenn ein Verdacht auf Krebs besteht und Gewebebiopsien durch chirurgische Verfahren oder z. B. durch Nadelbiopsien gewonnen werden, kann im Vergleich mit konventionellen morphologischen oder immunohisto- oder zytochemischen Verfahren eine sehr viel einfachere und schnellere Diagnose durch das neue Verfahren erreicht werden, das an präparierten Zellsuspensionen durchgeführt wird.
Die Unterscheidung zwischen verschiedenen alternativen Krebsarten kann durch die Verwendung der geeigneten Antikörper erreicht werden.

5. Identifizierung von Prognose-Indikatoren

Da für die Expression von verschiedenen Membranmolekülen gezeigt wurde, dass sie mit dem Fortschreiten einer malignen Erkrankung bei verschiedenen Krebsarten korreliert, kann das vorliegende Verfahren verwendet werden um die Prognose- Indikatoren zu identifizieren, wie z. B. beschrieben in dem Beispiel 2 der Anmeldung.

6. Identifizierung von Zellen, die spezifische Krankheiten oder das Fortschreiten der Krankheit oder ihren Zustand anzeigen

Bei verschiedenen Arten von rheumatoiden Erkrankungen (so wie der rheumatoiden Arthritis) wie auch bei allergischen, Autoimmun- und cardiovaskulären Erkrankungen, ist die Identifikation der systemischen oder lokalen Präsenz von spezifischen Subpopulationen von Zellen wichtig für die Diagnose und für die Bestimmung des Stadiums der Krankheit. Ein schneller Nachweis solcher Zeilpopulationen durch das neue Verfahren ist daher von bedeutender diagnostischer und therapeutischer Bedeutung.

7. Nachweis von Subpopulationen von normalen Zellen

Für verschiedene Zwecke wird es wichtig sein, die Fraktion einer bestimmten Subpopulation von normalen Zellen in einer Population nachzuweisen. Dies gilt z. B. für Leberbiopsien, bei denen die Identifizierung von Zellen, die das biliäre epitheliale Antigen exprimieren, von Bedeutung sein kann. Ähnlich kann die Identifizierung und die mögliche Isolierung von spezifischen endothelialen Zellen aus einer Zellsuspension, die aus verschiedenen normalen Geweben hergestellt wurde, angezeigt sein.
Verschiedene der Zellmembranmoleküle, die in den Sektionen 1 bis 6 erwähnt wurden, können auch als Ziele für die Immuntherapie mit verschiedenen Arten von aktivierten Killerzellen oder z. B. mit Immuntoxinen verwendet werden. Die Identifizierung der Expression solcher Moleküle durch das neue Verfahren ist daher auch wertvoll für die Bestimmung, in welchen Fällen eine solche Art der Therapie verwendet werden sollte. Beispiele für die praktische Anwendung des Verfahrens:

Beispiel 1

Um die Verteilung von Krebszellen im Blut und/oder im Knochenmark in einem frühen Stadium nachzuweisen haben wir für das neue Verfahren die MOC-31, NrLu10, BM2, BM7, 12H12 und MLuC1 Anti-Karzinom Antikörper verwendet um zu bestimmen, ob oder ob nicht die mikrometastatische Erkrankung von Brust-, Lungen-, colorektal und Prostata-Krebs in solchen Körperflüssigkeiten sensibel identifiziert werden kann. Die erfolgreichen Ergebnisse mit diesen Antikörpern haben signifikante klinische Implikationen.

Beispiel 2

Für die Expression von verschiedenen Zellmembranmolekülen wurde nachgewiesen, dass sie mit dem Fortschreiten der malignen Erkrankung bei verschiedenen Arten von Krebs korreliert. Der Nachweis der Bindung solcher Antikörper an respektive Antikörper kann daher verwendet werden um Informationen von hohem Prognose-Wert zu erlangen. Unter solchen Antigenen befindet sich eine hohe Anzahl von Adhäsionsmolekülen, Kohlenhydrat-Antigenen, Glykolipiden, Wachstumsfaktor- Rezeptoren und Karzinom Markern, wie unten aufgeführt. Durch das neue Verfahren haben wir die Bindung von Teilchen-Antikörper Komplexen an CD44-Varianten, E- Cadherin, LeY, CEA, EGF-r, Transferrin-Rezeptor, MUC-1 Epitop, LUBCRU-G7 Epitop, Prostata-Krebsantigen, UJ13A Epitop, ß&sub2;-Mikroglobulin, HLA-Antigene und den Apoptose-Rezeptor identifiziert.

Beispiel 3

Zwei Liter von einer Pleuraldiffusion von einem Patienten, von dem man annahm, dass er an einem malignen Melanom litt, wurden gewonnen. Nach einer Zentrifugation wurden die Zellen in einem Volumen von 2 ml RPMI mit 10% fötalem Kälberserum suspendiert, mit 9.2.27 Anti-Melanom Antikörper (10 ug/ml) bei 4ºC für 30 min. inkubiert, gewaschen und wieder mit Dynabeads SAM M 450/IgG2A bei 4ºC für 30 min. inkubiert. Die Zellsuspension wurde dann unter einem Mikroskop für die Bestimmung der Fraktion von Zellen untersucht, die paramagnetische Teilchen an ihre Oberfläche gebunden aufwiesen. Die Diagnose eines malignen Karzinoms wurde bestätigt, da ungefähr 10% der Zellen eine signifikante Anzahl von Teilchenrosetten aufwies.

Beispiel 4

Gewebebiopsien wurden aus einem subkutanem Tumor, in einem Fall mit klinischen Indikationen von entweder Kleinzell-Lungenkrebs oder einem malignen Melanom, entnommen. Eine Einzelzellsuspension wurde aus der Biopsie hergestellt, auf zwei Fraktionen verteilt, wobei eine mit dem 9.2.27 anti-Melanom Antikörper und die andere mit dem MOC-31 anti-Karzinom Antikörper (beide mit 10 ug/ml) inkubiert wurde. Die Inkubation war entsprechend der in dem obigen Beispiel verwandten. Keine der Zellen, die mit dem Melanomantikörper inkubiert worden waren, band Kügelchen, während alle Tumorzellen, die mit MOC-31 inkubiert worden waren, positiv waren.

Beispiel 5

Gewebebiopsien von einem Patienten, von dem man annahm, das er an einem malignen Melanom litt, wurden überprüft, indem eine Einzelzellsuspension hergestellt, mit 9.2.27 anti-Melanom Antikörper inkubiert und dann dem oben beschriebenen Verfahren gefolgt wurde. Die meisten der Zellen waren positiv mit einer hohen Anzahl von Teilchen-Rosetten, die an ihren Membranen hafteten.

Beispiel 6

Eine Pleuraleffusion von einem Patienten mit Brustkrebs wurde untersucht, um zu bestimmen, ob die Tumorzellen in der Flüssigkeit nachgewiesen werden könnten. Ein Liter der Flüssigkeit wurde zentrifugiert, die Zellen wurden resuspendiert und in getrennten Gefäßen mit jedem von drei unterschiedlichen anti-Karzinom Antikörpern (MOC-31, 2E11,1 2H12) inkubiert. Nach Abschluss des Verfahrens wie in dem vorherigen Beispiel wurde festgestellt, dass die meisten der Zellen in allen drei Fällen an Antikörper beschichtete Teilchen banden.

Beispiel 7

Eine Knochenmarkssuspension, die von einem Patienten mit Brustkrebs erhalten worden war, wurde untersucht, um zu bestimmen, ob mikrometastatische Tumorzellen vorliegen könnten. Nach der Präparation von mononukleären Zellen, wurden diese mit denselben drei anti-Karzinom Antikörpern inkubiert, die in dem obigen Beispiel verwendet worden waren, jedoch wurden die Antikörper diesmal zunächst an Dynabeads SAM IgG paramagnetische Teilchen gebunden. Nach einer Inkubation mit diesen direkt beschichteten Teilchen wurde die Zellsuspension im Mikroskop untersucht und es wurde eine hohe Anzahl als positiv gefunden, mit einer Anzahl von Teilchen- Rosetten, die an ihrer Membran hafteten.
Ähnliche Experimente sind bei einer Anzahl von pleuralen oder Ascites-Effusionen und Knochenmark von Patienten mit Brustkrebs durchgeführt worden.

Beispiel 8

T47D humane Brustkarzinomzellen wurden für variierende Zeitspannen mit einem fluoreszierenden Farbstoff (Hoechst) inkubiert und die Lebensfähigkeit der markierten Zellen wurde überprüft. Variierende Zahlen von markierten Brustkarzinomzellen wurden dann zu 1 · 106 Knochenmarkszellen hinzugefügt, die von gesunden Freiwilligen gewonnen worden waren. In unterschiedlichen Experimenten wurden unterschiedliche Konzentrationen von paramagnetischen, monodispersen Teilchen (Dynabeads (TM) P 450), beschichtet mit individuellen Antikarzinom-Antikörpern (NrLu 10, MOC 31 oder 12 H 12), hinzugefügt. Nach einer Inkubation für 30 min. auf Eis wurden Proben der unterschiedlichen Teströhrchen in einer Zählkammer mit Licht- und Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Wenn das Verhältnis von Tumorzellen/totalen kernhaltigen Zellen gering war, wurde die Zellsuspension einem magnetischen Feld unterworfen und die Zellen mit den angehafteten Teilchen wurden isoliert, bevor sie in dem Mikroskop untersucht wurden. Es stellte sich heraus, das bei einem optimalen Verhältnis von 1 - bis 10 paramagnetischen Kügelchen pro Tumorzellen in der Zellmischung alle Tumorzellen von 2 bis 15 Kügelchen an ihre Oberfläche gebunden aufwiesen. Die Empfindlichkeit des Nachweisverfahrens war nahe an einer Zielzelle pro 104 kernhaltigen Zellen.
In Kontrollexperimenten mit markierten Tumorzellen unter Verwendung von Antikörpern, von denen bekannt ist, dass sie etwas Kreuzreaktivität mit normalen Zellen aufweisen, wurde diese Kreuzreaktivität mit den Antikörper beschichteten paramagnetischen Teilchen bestätigt. In Experimenten mit Kügelchen ohne Tumor assoziierte Antikörperbeschichtung band keine der Zielzellen Kügelchen.
Ähnliche Experimente wurden sowohl mit anderen Brustkrebszelllinien als auch einer kleinzelligen Lungenkrebszelllinie durchgeführt. Eine ähnliche Empfindlichkeit und Spezifität wurde mit diesen Experimenten erhalten.

Beispiel 9

Pleural- und Ascitesflüssigkeit von Patienten mit Brustkrebs und Ovarkarzinom wurden zentrifugiert, dieselben beschichteten paramagnetischen Teilchen, die in Beispiel 1 verwendet wurden, wurden hinzugefügt, inkubiert und in einem magnetischen Feld konzentriert, bevor die Suspension durch Lichtmikroskopie untersucht wurde. Im typischen Fall wiesen die Zellen, die die eindeutigen morphologischen Merkmale von Tumorzellen aufwiesen, Kügelchen angehaftet auf, während keine der wenigen normalen Zellen die Antikörperkörper beschichteten Kügelchen band. In zwei Fällen bei der Pleuraleffusion ergab eine unabhängige morphologische Überprüfung keine Gegenwart irgendeiner Tumorzelle, während eine signifikante Anzahl maligner Zellen durch die Verwendung der Antikörper beschichteten Kügelchen nachgewiesen wurde. In einigen Fällen wurden die Tumorzellen in einem magnetischen Feld getrennt und auf Gewebekulturkolben verteilt, die eine Wachstumsmedium enthielten, das speziell für wachsende Brustkrebszellen hergestellt worden war, in einem Versuch, permanente Zelllinien aus diesen Kulturen zu etablieren. Parallel dazu wurden Zellen von den malignen Effusionen direkt ohne positive Selektion mit magnetischen Kügelchen kultiviert. In den letzten Fällen könnte keine Zelllinie etabliert werden, während in mehr als 50% der Fälle, in denen positiv selektierte Tumorzellen verwendet worden waren, Zelllinien erfolgreich etabliert wurden.

Beispiel 10

In einigen Fällen wurden Knochenmark und periphäres Blut, das von Patienten mit Brustkrebs gewonnen worden war, mit dem vorliegenden Verfahren durch Zugabe von Antikörper beschichteten paramagnetischen Teilchen, Inkubation für 30 min. bei 4ºC und Konzentration in einem Magnetfeld durch Überprüfung der Suspension durch Lichtmikroskopie untersucht. In beiden Fällen wurde eine Bindung der paramagnetischen Teilchen an die Tumorzellen, die 0,1-1% der kernhaltigen Zellen im Knochenmark und im Blut ausmachten, nachgewiesen, und zwar Zellen, die durch kein anderes Verfahren identifiziert werden konnten.

Beispiel 11

Antikörper gegen bestimmte Wachstumsfaktorrezeptoren oder andere Genprodukte, die auf der Oberfläche von spezifischen Zellpopulationen exprimiert werden, können verwendet werden, um diese Zellen zu identifizieren und positiv zu selektieren. Kügelchen, die mit anti-Transferrin Rezeptor Antikörpern beschichtet sind, die in dem neuen Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, erwiesen sich als ein schnelles, einfaches und sensibles Verfahren für die Identifizierung von Zellen, die den Transferrin-Rezeptor exprimieren.

Beispiel 12

Für verschieden Zwecke ist die Isolierung von spezifischen Populationen von normalen Zellen angezeigt. Endotheliale Zellen, die die Kapillaren oder kleinen Gefäße in normalem oder Tumorgewebe auskleiden, könnten positiv aus Zellsuspensionen selektiert werden, die aus den relevanten Geweben hergestellt wurden. Das Verfahren involvierte die Verwendung von Kügelchen, die mit Antikörpern beschichtet waren, die gegen Strukturen gerichtet sind, die auf den endothelialen Zellen, aber nicht auf den anderen normalen Zellen in der Zeilmischung gerichtet sind.

Beispiel 13

Für humane Zellen, die in immundefiziente Nager injiziert worden waren, konnte gezeigt werden, dass sie in Zeilsuspensionen vorlagen, die aus Tumor Xenograften und von verschiedenen Wirtsorganen/Geweben durch Verwendung magnetischer Teilchen hergestellt worden waren, die mit anti-pan humanem Antikörper beschichtet worden waren.

Tabelle 1

Liste der relevanten Antigene und Beispiele für assoziierte Antigen-bindende Antikörper

ANTIGENE MONOKLONALE ANTIKÖRPER

Adihäsionsmoleküle
Fibronektinrezeptor (α5ß1 Integrin) Pierce 36114, BTC 21/22 Calbiochem 341649
Integrin α3ß1 M-Kiol 2
Vitronektin Rezeptor (αvß3 Integrin) TP36.1, BTC 41/42
Integrin α2 Calbiochem 407277
Integrin α3 Calbiochem 407278
Integrin α4 Calbiochem 407279
Integrin α5 Calbiochem 407280
Integrin αV Calbiochem 407281
Integrin β2 Calbiochem 407283
Integrin β4 Calbiochem 407284
Gpllβlllα 8221
ICAM-I (CD 54) C 57-60, CL 203.4, RR 1/1'
VCAM-1 Genzyme 2137-01
ELAM-1 Genzyme 2138-01
E-Selektin BBA 8
P-Selektin/GMP-140 BTC 71/72
LFA-3 (CD 58) TS 2/9
CD 44 BM 1441 272, 25.32
CD-44 Varianten 11.24, 11.31, 11.10
N-CAM (CD 56) MOC-1
H-CAM BCA 9
L-CAM BM 1441 892
N-CAM TU RA-27
MACAM-1 NKI - M9
E-Cadherin BTC 111, HECD-1, 6F9
P-Cadherin NCC CAD 299
Tenascin BM 1452 193
Calbiochem 580664
Thrombospondin Rezeptor (CD 36) BM 1441 264
VLA-2 A 1.43
Laminin Rezeptor
HNK-¹ Epitop HNK-¹

Kohlenhydratantigene

T-Antigen HH 8, HT-8
Tn-Antigen TKH6, BaGs 2
Sialyl Tn TKH-2
Gastrointestinalkrebs-assoziiertes
Antigen (MW 200 kD) CA 19-9
Karzinom assoziiertes Antigen C-50
Ley MLuCl, BR 96, BR 64
di-LeX, tri-LeX B3
Dimeres Le" Epitop NCC-ST-421
H-Typ 2 B1
Ca 15-3 Epitop CA 15 - 3
CEA I-9, I-14, I-27, II-10, I-46,
Calbiochem 250729
Galbl-4 GicNac (nL4,6,8) 1 B2
H-II BE 2
ATyp3 HH 8
Lacto-N-Fucopentanose IIl (CD 15) PM - 81

Glykolipide

GD&sub3; ME 36.1, R24
GD&sub2; ME 36.1, 3F8, 14.18
Gb&sub3; 38-13
GM&sub3; M 2590
GM&sub2; MKI-8, MKI-16
FucGM, ID 7, F 12

Wachstumsfaktorrezeptoren

EGF-Rezeptor 425.3, 2.E9, 225
c-erbB-2 (HER 2) BM 1378 988, 800 E6
PDGFα Rezeptor Genzyme 1264-00
PDGFβ Rezeptor Sigma P 7679
Transferrin Rezeptor OKT 9, D 65.30
NGF Rezeptor BM 1198 637
IL-2 Rezeptor (CD 25) BM 1295 802, BM 1361 937
c-Kit BM 428 616, 14 A3, ID 9.3 D 6
TNF Rezeptor Genzyme 1995-01, PAL-M1
NGF Rezeptor

Melanomantigene

Hochmolekulargewichtsantigen
(HMW 250.000) 9.2.27, NrMLS, 225.28,
763.74, TP 41.2, IND1
Mw 105 Melanom asooziiertes Glykoprotein ME 20
100 kDa Antigen (Melanom/Karzinom) 376.96
gp 113 MUC 18
p95-100 PAL-M2
Sp 75 15.75
gr 100-107 NKI-bereb
MAA K 9.2
MW 125 kD (gp 125) Mab 436

Sarkomantigene

TP-1 und TP-3 Epitop TP-1, TP-3
MW 200 kD 29-13, 29.2
MW 160 kD 35-16, 30-40

Karzinommmarker

MOC 31 Epitop (Cluster 2 Epithelialantigen) MOC-31, NrLu 10
MUC-1 Antigene (so wie DF3-Epitop (gp 290 kD)) MUC-1, DF3, BCP-7 bis 10
MUC-2 und MUC-3 PMH1
LUBCRU-G7 Epitop (gp 230 kd) LUBCRU-G7
Prostata spezifisches Antigen BM 1276 972
Prostatakrebsantigen E4-SF
Psotata hochmolekulares Antigen MW > 400 kD PD 41
Polymorphe epitheliale Mucine BM-2, BM-7, 12-H-12
Prostata spezifisches Membranantigen (Cyt-356) 7E11-C&sub5;
Humanes Milchfettglobulin Immunotech HMFG-1, 27.1
42 kD Brustkarzinomepitop B/9189
MW > 10&sup6; Mucin TAG-72, CC-49, CC-83
Ovarielles Karzinom OC 125 Epitop (MW 750 kD) OC 125
Pankreatisches HMW Glykoprotein DU-PAN-2
Colonantigen Col7-1 A (MW 37000) 17-1 A
G9-Epitop (Colonkarzinom) G9
Humanes Colonsulfomucin 91.9 H
MW 300 kD Pankreasantigen MUSE 11
GA 733.2 GA 733, KS 1.4
TAG 72 B 72.3, CC 49, CC83
nicht definiert Oat1, SM1
Pankreatisches Krebsassoziiertes MUSE 11
Pankarzinom CC 49
Prostata Adenokarzinom-Antigen PD 41
MW 150-130kD Adenokarzinom der Lunge AF-10
gp 160 Lungenkrebsantigen (Cancer Res. 48, 2768, 1988) anti gp 160
MW 92 kD Blasenkarzinomantigen 3G2-C&sub6;
Mw 600 kD Blasenkarzinomantigen C3
Blasenkarzinomantigen (Cancer Res. 49, 6720, 1989) AN43, BB 369
CAR-3 Epitop MW > 400 10 AR-3
MAM-6 Epitop (C 15.3) 115 D 8
Hochmolekulares ovarielles Krebsantigen OVX1, OVX2
Mucinepitop la3 la3
Hepatozelluläres Karzinomantigen
MW 900 kD KM-2
Hepemales Epitop (gp 43) Hepatozelluläres Karzinomantigen Hepema-1
O-gebundes Mucin, enthaltend N-Glycolylneuraminsäure 3E1.2
MW 48 kD colorektales Karzinomantigen D 612
MW 71 10 Brustkarzinomantigen BCA 227
16. 88 Epitop (colorektales Karzinomantigen) 16.88
CAK 1 (ovarielle Krebsarten) K1
Colon spezifisches Antigen p Mu-1, Mu-2
Lungenkarzinomantigen
Mw 350-420 kD DF-L1, DF-L2
gp 54 Blasenkarzinomantigen T 16
gp 85 Blasenkarzinomantigen T 43
gp 25 Blasenkarzinomantigen T 138

Neuroblastom-Antigene

Neuroblastom-assoziierte, so wie UJ 13 A Epitop UJ 13 A

Gliom-Antigene

Mel-14 Epitop Mel-14

Kopf- und Halskrebsantigene

MW 18-22 kDAntigen B 48

HLA-Antigene

HLA Klasse 1 TP 25.99
HLA-A VF 19 LL 67
HLA-B H&sub2;-149.1
H LA-A2 KS 1
HLA-ABC W 6.32
HLA-DR, DQ, DP Q 5/13, B 8.11.2
β&sub2;-Mikroglobulin NAMB-1

Apoptose Rezeptor

APO-1 Epitop Apo 1

Verschiedene

Plasminogen Aktivator Antigene
und Rezeptoren Kaninchen Polyklonale
p-Glycoprotein C 219, MRK 16, JSB-1, 265/F4
Cathepsin D CIS-Diagnostici, Italien
Biliäres Epithelialantigen HEA 125
Neuroglanduläres Antigen (CD 63) ME 491, NKI-C3, LS 62
CD 9 TAPA-1, R2, SM 23
pan-humanes Zellantigen pan-H

Claims

1. Verfahren zum Nachweis spezifischer Zielzellen in Zellsuspensionen gemischter Zeilpopulationen und in flüssigen Systemen, die gemischte Zellpopulationen enthalten und in Einzelzell-Suspensionen, die aus festen Geweben hergestellt wurden, mit Ausnahme normaler und maligner hämatopoetischer Zellen in Blut und im Knochenmark, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst:

1. 1 Beschichten durch ein per se bekanntes Verfahren von paramagnetischen Teilchen oder Kügelchen mit entweder a) Antikörpern oder Antikörperfragmenten, die gegen Membranstrukturen gerichtet sind, die spezifisch auf Zielzellen, jedoch nicht auf Nicht-Zielzeflen in der Zellmischung exprimiert werden, oder

b) Antikörpern, vorzugsweise polyklonalen Anti-Maus oder monoklonalen Ratten Anti-Maus Antikörpern oder anti-humanen Antikörpern, die an die Fc-Bereiche der Antikörper binden können, die gegen die Membranstrukturen gerichtet sind; und

1.2.1 Vermischen der Zielzell-assoziierenden Antikörper (Maus oder humane), die an die Teilchen oder Kügelchen gebunden sind oder die an die Kügelchen gebunden sind, die zunächst mit Anti-Maus oder Anti-humanen Antikörpern beschichtet wurden, die die Fc-Bereiche der Ziel-assoziierenden Antikörper erkennen, mit der Zellsuspension, die die Zielzellen enthält, oder

1.2.2 Vermischen von freien, die Zielzellen assoziierenden Antikörpern mit der Zellsuspension, die die Zielzellen enthält und Inkubation dieser Mischung für 5-10 min bis 2 h, vorzugsweise 30 min., bei einer Temperatur zwischen 0ºC und 20ºC, vorzugsweise 4ºC, bei leichter Rotation, und

1.3 Inkubation der Mischung der Zellsuspension und der Ziel-assoziierenden Antikörper, die an die paramagnetischen Teilchen oder Kügelchen (1.2.1) gebunden sind oder der paramagnetischen Teilchen oder Kügelchen, die mit Anti-Maus oder Anti-humanen Antikörpern vorbeschichtet wurden, die den Fc-Bereich der Zielassoziierenden Antikörper erkennen, mit der Mischung der inkubierten freien Zielassoziierenden Antikörper und der Zellsuspension (1.2.2.) und Inkubation für 5-10 min bis 2 h, vorzugsweise 30 min. bei einer Temperatur zwischen 0ºC und 25ºC, vorzugsweise 4ºC, bei leichter Rotation, und

1.4.1. falls die Zielzell-Population in Blut oder in Knochenmarks-Aspiraten enthalten ist, werden die hydrophoben Kräfte, die mit Antikörper beschichteten Teilchen assoziiert sind, durch Vorinkubation der Antikörper eschichteten Teilchen und der Zellsuspension mit milden Detergentien in geeigneten Konzentrationen reduziert, z. B. Tween 20 TM in Konzentrationen von weniger als 0.1% für 30 min. bei 4ºC und/oder

1.4.2. durch Inkubation der Zellsuspensionen, unbehandelt oder vorbehandelt mit Formalin, Alkohol oder anderen Fixativen, mit anderen Antikörpern oder Antikörper- Fragmenten, die an extrazelluläre oder intrazelluläre Moleküle binden, die in den Zielzellen vorliegen und die verwendeten Antikörper werden vorher mit Peroxidase, alkalischer Phosphatase oder anderen Enzymen markiert, die die Sichtbarmachung der Bindung durch Addition und Inkubation mit entsprechenden Substraten möglich machen, oder

1.4.3. die Antikörper-Fragmente werden biotinyliert und die Bindung wird durch Versetzen des Inkubats mit Avidin, komplexiert an Peroxidase, alkalische Phosphatase oder andere Enzyme, durch Addition und Inkubation mit den entsprechenden Substraten, sichtbar gemacht, oder

1.5.1 die inkubierte, paramagnetische Telichen-Antikörper-Zellmischung (1.3) wird einem magnetischen Feld ausgesetzt, wenn die Dichte der Zielzellen gering ist oder wenn das Verhältnis von Zielzellen zu den Gesamtzellen in der Zeilmischung gering

(≤1%) ist und darauffolgend Überprüfung und Auszählung der gefärbten und nichtgefärbten Teilchen-Zielzell-Komplexe in der Zellsuspension unter Verwendung eines Mikroskops und/oder einer geeigneten Zell/Teilchen-Zählvorrichtung, oder

1.5.2. Überprüfung und Auszählen der Zielzellen in der inkubierten Mischung paramagnetischer Teilchen, der Antikörper und der Zellmischung (1.3) oder in dem Fall, in dem die Antikörper oder Antikörperfragmente mit nicht-paramagnetischen Teilchen konjugiert sind, die aufgrund ihrer Farbe oder durch enzymatische Aktivierung direkt sichtbar gemacht werden können, unter Verwendung eines Mikroskops und/oder einer geeigneten Zell/Teilchen-Zählvorrichtung, falls das Verhältnis der Zielzellen zu den Gesamtzellen in der Zellsuspension adäquat ist (> 1%).

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper oder seine Fragmente gegen die Antigene in normalen, lebenden Zellen, wie zum Beispiel Leber-Hepatozyten, Kupffer-Zellen und Endothel-Zellen vom Typ 1 und 2 und Clara-Zellen der Lunge, Endothel-Zellen spezifischer Organe, pankreatische exokrine und endokrine Zellen, Nieren-Tubulus-Zellen, Blasen-Epithel-Zellen, Gehirn-Glia-Zellen und Gehirn-Ependymal-Zellen, Blasen und Prostata-Epithel- Zellen, Zilien-tragende Zellen der Luftwege, unterschiedliche Subpopulationen von Mukosa-Zellen im Gastrointestinaltrakt, Hypophysen-Zellen und andere endokrine Zellen verschiedener Hormon-produzierender Organe, gerichtet wird.

3. Verfahren nach einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Zielzell-Antikörper ein Antikörper verwendet wird, der mit Antigenen reagieren kann, die auf Subpopulationen normaler Zellen vorliegen und mit onkogenen Produkten, die auf der Membran normaler Gewebezellen exprimiert werden.

4. Verfahren nach einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als positiv selektierender Antikörper ein Antikörper verwendet wird, der gegen Wachstumsfaktor-Rezeptoren auf der Membran normaler Zellen gerichtet ist, z. B. den EGF-Rezeptor, PDGF (A und B)- Rezeptor, Insulin-Rezeptoren, Insufin-ähnliche Rezeptoren, Transferrin-Rezeptor, NGF und FGF-Rezeptoren.

5. Verfahren nach einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ein Antikörper verwendet wird, der gegen die Gruppe der Integrine und andere Adhäsions-Membranmoleküle und MDR Proteine in normalen Zellen gerichtet ist.

6. Verfahren nach einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper oder Fragmente davon gegen Antigen oder Rezeptoren in Zellen mit abnormem Entwicklungsmuster gerichtet wird, vorzugsweise z. B. primäre und metastatische Krebszellen.

7. Verfahren nach einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als die Zielzell-assoziierenden Antikörper Antikörper des IgG Isotyps oder F(ab')&sub2; oder F(ab) Fragmente oder IgM oder Fragmente von IgM verwendet werden.

8. Verfahren nach einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die erwähnte Zellsuspension aus gemischten Zellpopulationen hergestellt wird, die Säugetiere-Gewebe, z. B. menschliches Knochenmark und peripheres Blut umfassen, aus pleuralen und peritonealen Effusionen, anderen Körperflüssigkeiten, z. B. Urin, Cerebrospinal-Flüssigkeit, Samen, Lymphe oder aus festen Tumoren in normalen Geweben und Organen, z. B. der Leber, den Lymphknoten, der Milz, der Lunge, dem Pankreas, der Knochenhaut, dem zentralen Nervensystem, der Prostatadrüse, der Haut und mukösen Membranen.

9. Verfahren nach einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper oder die Antikörperfragmente gegen Gruppen von Antigen-Determinanten gerichtet ist, wie z. B. diejenigen, die in Tabelle 1 der Beschreibung aufgeführt sind.

10. Verfahren nach einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Zielzell-Antikörper ein Antikörper oder Antikörperfragment verwendet wird, der gegen Wachstumsfaktor-Rezeptoren und Onkogen-Produkte gerichtet ist, die auf der Membran maligner Zellen exprimiert werden, z. B. Insulin-Rezeptoren, Insulin-ähnliche Rezeptoren und FGF- Rezeptoren zusätzlich zu denjenigen, die in Tabelle 1 der Beschreibung aufgeführt sind.

11. Verfahren nach einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ein Antikörper oder ein Antikörper-Fragment verwendet wird, der gegen die Gruppe der Integrine, andere Adhäsions-Membran-Moleküle und MDR Proteine in abnormalen Zellen, wie aufgeführt in Tabelle 1, gerichtet ist.

12. Verfahren nach einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die verwendeten Antikörper, Antikörper-Fragmente oder Kombinationen davon gegen die Antigen-Determinanten gerichtet sind, wie aufgeführt in Tabelle 1 der Beschreibung.

13. Verfahren nach einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Antikörper ein Antikörper verwendet wird, der mit Antigenen reagieren kann, die auf abnormalen Zellen vorliegen, z. B. Brust-, Ovarien- und Lungen-Karzinomzellen, Melanom-, Sarkom-, Glioblastom- und Krebszellen des Gastrointestinal und genitourethralen Trakts und des Retikuloendothelial-Systems und/oder Zielzellen, die mit nicht-neoplastischen Krankheiten assoziiert sind, wie z. B. cardiovaskuläre, neurologische, pulmonale, Autoimmun-, gastrointestinale, genitourethrale, reticuloendotheliale und andere Störungen.

14. Verwendung des Nachweisverfahrens gemäß einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche zur Isolierung von Zielzellen, wobei der Komplex der Zellen und die paramagnetischen Teilchen einem Magnetfeld ausgesetzt werden und die resultierenden magnetisch aggregierten Zellen weiter biologischen, biochemischen und immunologischen Untersuchungen unterzogen werden, einschließlich auch der Charakterisierung von spezifischen Genen auf DNAmRNA und Protein-Niveau, einschließlich der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und der PCR mit reverser Transkriptase.

15. Verwendung des Nachweisverfahrens spezifischer Zielzellen nach einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche, wobei es in in vitro Zellkulturen von den abgetrennten paramagnetischen Teilchen-Zielzell-Komplexen etabliert wird und/oder zur Inokulation in immunodefiziente Tiere, vorzugsweise um humane Tumor-Xenografte in den Tieren zu etablieren.

16. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es folgendes umfasst:

1, spezifische Antikörper oder Antikörperfragmente, die gegen Antigen- Rezeptoren auf den gewünschten Zielzellen gerichtet sind, wobei der Antikörper oder das Antikörperfragment gebunden ist oder an die enthaltenen paramagnetischen Teilchen gebunden werden kann, ohne seine Antigen-bindende Eigenschaft zu entfernen, und/oder

2, paramagnetische Teilchen, die mit spezifischen Anti-Fc-Antikörpern vorbeschichtet wurden, vorzugsweise polyklonalen Anti-Maus oder monoklonalen Ratten Anti-Maus oder Anti-humanen Antikörpern, die an die Fc-Bereiche der Zielzell-assoziierenden Antikörper binden können und spezifische freie Zielzell- Antikörper, und/oder

3, paramagnetische Teilchen, die mit spezifischen Anti-Fc Antikörpern vorbeschichtet wurden, vorzugsweise polyklonalen Anti-Maus oder monoklonalen Ratten Anti-Maus oder Anti-humanen Antikörpern, die an die Fc-Bereiche der Zielzell-assoziierenden Antikörper binden können, gebunden an die spezifischen Anti-Zielzell-Antikörper, und/oder

4, andere spezifische Antikörper oder Antikörperfragmente, die gegen Antigene/Rezeptoren in oder an den gewünschten Zielzellen gerichtet sind, wobei die Antikörper oder Antikörperfragmente mit Biotin, Peroxidase, alkalischer Phosphatase oder anderen Enzymen konjugiert sind, oder wobei die Antikörper oder Antikörperfragmente an nicht paramagnetische Teilchen mit spezifischen Farben oder mit gebundenen Enzymen, wie z. B. Peroxidase und alkalische Phosphatase, gebunden sind.