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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Identifizierung
und Charakterisierung von eukaryotischen Zellen.
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Bei
etlichen Krankheiten wie zum Beispiel bei primären und sekundären Malignomen,
allergischen, autoimmunen, entzündlichen,
proliferativen, infektiösen
und destruktiven Funktionsstörungen
oder Krankheiten, für
welche die zugrunde liegenden Mechanismen unklar sind, wäre es von äußerster
Wichtigkeit, so viele Kennzeichen von an den pathologischen Prozessen
beteiligten Zellen wie möglich
ermitteln zu können.
Eine genaue Bestimmung einer Anzahl von verschiedenen Markern von
solchen Zellen würde
die Diagnose, das Abgeben einer Prognose und die Wahl der nachfolgenden
Therapie erheblich verbessern. Wenn ein solches Verfahren einfach
und schnell ist, wäre
es einfach, pathologische Zustände
in einem frühen
Stadium der Erkrankung zu diagnostizieren, womit die Wahrscheinlichkeit
der Wahl der besten therapeutischen Alternative zu einem Zeitpunkt,
an dem die Therapie am wirksamsten sein kann, gesteigert wird. Darüber hinaus
ist es in einigen Situationen von entscheidender Bedeutung, eine
unverzügliche
und korrekte Diagnose zu stellen, wie zum Beispiel zwischen einem
gutartigen und einem bösartigen
Tumor zu unterscheiden, um den Chirurgen bei der Wahl eines angemessenen
chirurgischen Vorgehens zu leiten.
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Derzeit
sind in Bezug auf die oben erwähnten,
pathologischen Zustände
die folgenden diagnostischen Verfahren vorhanden: Herkömmliche,
morphologische Untersuchung von Gewebeschnitten, Zell-Cytospins oder
Abstriche und immunologische Verfahren einschließlich Immunzytochemie, Durchflusszytometrie
und Immunfluoreszenzmikroskopie. Zusätzlich wird an gefrorenen Schnitten
eine perioperative, morphologische Beurteilung von biopsierten Gewebeproben
vorgenommen.
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Mit
den nicht immunologischen Verfahren kann die Diagnose nur eine auf
morphologischen Kriterien beruhende Unterscheidung zwischen normalen
und pathologischen Zellen bieten.
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Immunologische
Verfahren wie zum Beispiel Immunzytochemie und Durchflusszytometrie
stellen nützliche
diagnostische Hilfsmittel dar, obwohl sie an mehreren erheblichen
Einschränkungen
leiden. Mit beiden Verfahren werden heterogene Zellpopulationen
Antikörpern
oder anderen Liganden für
ihre Bindung an Zielzellen ausgesetzt. Für durchflusszytometrische Untersuchungen
können
lebende oder fixierte Zellen inkubiert werden, um es Fluoreszenz-markierten
Antikörpern
zu ermöglichen,
an entsprechende Membranantigene oder intrazelluläre Antigene
zu binden, bevor die Zellsuspension in dem Gerät untersucht wird. Immunzytochemie
erfordert eine Präparation
von Gewebeschnitten, Cytospins oder Abstrichen, Fixation und Immunfärbung der
Zellen vor der Beurteilung unter einem Mikroskop. Die Sichtbarmachung
von gebundenen Antikörpern
wird indirekt über
einen oder mehrere Schritte, die mit einer Enzym-Substrat-Farbreaktion enden,
erreicht, was es ermöglicht,
dass die gefärbten
Zellen in einem Mikroskop betrachtet werden. Das Mehrschrittverfahren
kann nicht am Tag des Entnehmens der Zellprobe abgeschlossen werden.
Darüber
hinaus ist üblicherweise
eine gründliche
Beurteilung durch einen erfahrenen Pathologen erforderlich, um verlässliche
Ergebnisse zu erhalten. Wenn zum Beispiel die abnormalen Zellen
in einer gemischten Zellpopulation identifiziert werden und das Verhältnis von
pathologischen zu normalen Zellen niedrig ist, wie zum Beispiel
maligne Zellen in Proben von Knochenmark oder peripherem Blut, kann
eine übermäßige Menge
von Arbeit durch einen erfahrenen Pathologen zur Identifizierung
der Zellen erforderlich sein. Ein anderes Problem betrifft die Tatsache,
dass es sehr wenig Antikörper
gibt, die Antigene erkennen, welche selektiv und beständig in
allen Zielzellen exprimiert werden. Wenn es das Ziel ist, Tumorzellen
in Blut und Knochenmark zu identifizieren, werden üblicherweise
gegen „gewebetypische" Marker, wie zum
Beispiel in Epithelzellen beobachtete Zytokeratine, gerichtete Antikörper verwendet.
Da jedoch bekannt ist, dass einige normale Zellen auch Zytokeratine
exprimieren können
und dass dies nicht alle malignen Epithelzellen machen, besteht
ein Risiko sowohl von falsch positiven als auch negativen Ergebnissen.
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Fluoreszenz-markierte
Antikörper
können
eingesetzt werden, um Zielzellen entweder durch Fluoreszenzmikroskopie
oder mittels Durchflusszytometrie nachzuweisen. Das erstgenannte
Verfahren kann erfolgreich eingesetzt werden, um die Bindung eines
einzelnen Antikörpers
zu zeigen, obwohl die Verwendung morphologischer Kriterien als zusätzlicher
Weg des Unterscheidens zwischen normalen und pathologischen Zellen
sehr eingeschränkt
ist. Darüber
hinaus klingt die Fluoreszenz üblicherweise
ab und verschwindet schnell unter der Untersuchung im Mikroskop.
Somit ist es erforderlich, dass die Fluoreszenzzellen innerhalb
eines kurzen Zeitfensters nach der Bindung des Antikörpers mikroskopisch
untersucht und beurteilt werden. Eine durchflusszytometrische Untersuchung
erfordert das Vorliegen einer großen Zahl von Zielzellen, um
zuverlässige
Ergebnisse bereitzustellen. Darüber
hinaus bietet das Verfahren keinerlei Möglichkeiten für morphologische
Untersuchungen oder zum Unterscheiden zwischen fluoreszierenden
Ziel- und Nicht-Zielzellen. Weiterhin haben mehrere der erwähnten Verfahren
den Nachteil, dass in den verfahrenstechnischen Schritten Zellen verloren
werden.
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In
letzter Zeit wurden verbesserte Möglichkeiten zum Nachweisen
von Zielzellen beschrieben (
WO94/07138 ,
WO94/07139 ,
WO95/24648 ). In diesen Verfahren werden
Antikörper,
die an superparamagnetische Partikel gebunden sind, zum Nachweis
und zur Selektion von den zu identifizierenden Zellen verwendet. Eine
Einschränkung
dieser Verfahren besteht darin, dass es schwierig sein kann, die
pathologische Natur von Zellen mit gebundenen Partikeln auf der
Oberfläche
direkt zu beweisen. Ein Vorteil im Vergleich mit den anderen beschriebenen
Verfahren ist jedoch die Einfachheit des Verfahrens und, dass Ergebnisse
innerhalb eines sehr kurzen Zeitrahmens erhalten werden können.
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Um
die pathologische Natur von gefärbten,
fluoreszierenden oder Immunobeadbindenden Zellen weiter zu bestätigen, ist
es wichtig, die Zielzellen für
mehr als einen Marker zu charakterisieren. Das Ziel ist es, wichtige
biologische Informationen und Informationen von entscheidender diagnostischer
und prognostischer Bedeutung zu erhalten. Wenn die Zahl der Zielzellen
groß ist,
kann Durchflusszytometrie eingesetzt werden, um parallel die Bindung
von zwei verschiedenen, zellgebundenen Antikörpern zu untersuchen. Diesem
Verfahren fehlt jedoch die Möglichkeit,
einzelne Zellen und Zellmorphologie zu untersuchen und fluoreszierende Zellen
tatsächlich
als echte Zielzellen zu identifizieren. Immunzytochemie erlaubt
es, ein Maximum von zwei Markern nebeneinander zu untersuchen, einen
mit herkömmlicher,
enzymatischer Sichtbarmachung von gebundenem Antikörper und
einen mit einem Silber/Gold-Verstärkungsverfahren.
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Beide
Mehrschrittverfahren sind relativ kompliziert, zeitaufwändig, und
erfordern kostspielige Ausrüstung
und/oder besondere Fachkenntnis auf den betreffenden Gebieten.
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Mit
dem immunomagnetischen Verfahren kann eine weitere Charakterisierung
von ganzen Zellen erreicht werden, indem man Cytospins der magnetisch
selektierten Zellen anfertigt und danach eine Immunfärbung wie
für herkömmliche
Immunzytochemie vornimmt. Daher gelten dieselben Einschränkungen,
wie für
die Immunzytochemie beschrieben, und weiterhin kann es schwierig
sein, die Zellen zum Anhaften an den Objektträgern, die für herkömmliche Cytospin-Anfertigung
verwendet werden, zu bringen, weil die Zielzellen Beads an ihrer
Oberfläche
angeheftet haben.
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US-A-5 340 719 und
DE-A-3811566 offenbaren
Verfahren zum optischen Durchmustern, in denen die Zellen mit einer
oder mehreren Gruppen von Mikrosphären, die sich in Farbe oder
Größe unterscheiden,
kombiniert werden.
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WO 94/07142 offenbart eine
Untersuchung auf das Vorliegen und den relativen Überfluss
von Subpopulationen von T-Lymphozyten unter Einsatz verschiedener
Antikörper,
die an ein anderes Teilchen angeheftet sind. Beide Verfahren werden
eingesetzt, um hämatopoetische
Zellen ohne Anforderungen an die Spezifität zu isolieren, und wenden
verfahrenstechnische Schritte, die das Risiko für eine Schädigung der Zielzellen erhöhen, an.
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Schließlich stellen
die vorhandenen Verfahren Möglichkeiten
zum Untersuchen eines Maximums von zwei unabhängigen Markern bereit und es
gibt mehrere erhebliche Probleme und Einschränkungen, die den beschriebenen
Verfahren inhärent
sind. Daher war es wünschenswert,
ein Verfahren zu entwickeln, das viel einfacher, schneller und zuverlässiger dabei
helfen könnte,
pathologische Zielzellen zu identifizieren und zu charakterisieren.
Die Komplexität
und Heterogenität
von Zellbiologie macht es auch erforderlich, in der Lage zu sein,
die Expression von verschiedenen, unabhängigen, biologischen Markern
auf denselben Zellen zu untersuchen. Eine solche biologische Information
wäre von
entscheidender diagnostischer und prognostischer Bedeutung, die
bei der Wahl der therapeutischen Alternative helfen kann. Wenn mehrere
Marker parallel untersucht wür den,
wäre es
möglich
eine zuverlässigere
Bestätigung
der pathologischen Natur der Zielzellen zu erhalten, womit man die
diagnostische Zuverlässigkeit
verbessern würde
und dabei helfen würde,
falsch positive und auch negative Ergebnisse auszuschließen. Wichtigerweise
könnte
eine Multiparameter-Charakterisierung Marker der Zellproliferation,
des Zelltods (wie zum Beispiel der Apoptose), der Adhäsion, der
Beweglichkeit, des Eindringens, der Antigenität, der Entzündung, der Zellzerstörung, von
Autoimmunmechanismen, der Angiogenese, der Aggressivität von Krankheiten,
der Tumormetastasierung und von Hemmstoffen all dieser Funktionen
einschließen.
Ferner wäre
es, wenn mehrere Marker auch auf der Ebene einer einzelnen Zelle
untersucht werden könnten,
möglich,
die Zellheterogenität
zu untersuchen und Untergruppen von Zellen mit speziellen biologischen
Eigenschaften zu identifizieren. Bei einigen Krankheiten wäre es auch
wichtig, pathologische Zellen, die von verschiedenen Stellen im
selben Patienten gewonnen wurden, zu untersuchen, um festzustellen,
ob Zellcharakteristika sich von einer zur anderen Stelle unterscheiden
könnten,
und somit zusätzliche,
biologisch und prognostisch wichtige Informationen bereitzustellen.
In Ganzen können
die Auswirkungen eines Erhaltens von Informationen der hier beschriebenen
Art auf die klinische Beurteilung und die Behandlung von Patienten
kaum überschätzt werden.
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Diese
Ziele werden in der vorliegenden Erfindung erreicht, wie durch die
beigefügten
Ansprüche
charakterisiert.
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Wir
führen
hier ein neues Konzept in die Charakterisierung von intakten Zielzellen
in Zellsuspensionen ein, wobei wir eine direkte mikroskopische Identifizierung
von mehr als zwei Membran-assoziierten Marken möglich machen. Mit diesem Verfahren
können
mehrere Zellmembranmarker des Ursprungs, der Biologie und des möglichen
Schicksals von Zielzellen in demselben Arbeitsgang untersucht werden.
Das Verfahren ist sehr einfach und kann innerhalb eines sehr kurzen
Zeitrahmens ohne das Erfordernis einer hoch entwickelten und teuren
Geräteausstattung
ausgeführt
werden. Mit dem Verfahren können
Zielzellen mit einem Minimum an Bearbeitungsschritten ohne jeden
Zellverlust mikroskopisch auf die Expression von mehreren unabhängigen Markermolekülen hin
untersucht werden, auch auf der Ebene von einzelnen Zellen. Somit
erlaubt ein solches Verfahren zusätzlich zum Erhalten eines Gesamtbildes
von biologischen Parametern, die in der Population der Zielzellen
vorliegen, auch ein Untersuchen der Schwankung in der Expression
von Markermolekülen
von Zelle zu Zelle, was eine Information mit entscheidenden biologischen
und medizinischen Auswirkungen bereitstellt.
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In
Kürze kann
das Verfahren wie hier beschrieben ausgeführt werden: Gefärbte oder
fluoreszierende Mikrosphären
(Beads, Partikel), die mit Antikörpern
oder Liganden, die an zu untersuchende Determinanten der Zellmembran
binden können,
konjugiert sind, werden zu der Zellsuspension gegeben und unter
behutsamer Rotation inkubiert. Danach werden Proben der Zellsuspension
unter einem Fluoreszenzmikroskop auf Zellen mit oberfächengebundenen
Mikrosphären
von unterschiedlich hellen oder fluoreszierenden Farben untersucht.
Das Ausmaß und
die Schwankung der Zellbindung der verschiedenen Mikrosphären kann
festgestellt und quantifiziert werden. Die Bestimmung von zellgebundenen
Partikeln kann, wenn gewünscht,
durch ein automatisiertes Verfahren ausgeführt werden.
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Im
Folgenden wird die vorliegende Erfindung ausführlicher mit den Beispielen,
die keinesfalls dazu vorgesehen sind, die Erfindung einzuschränken, beschrieben
und mit Figuren, in denen:
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1 die
Bindung von vier Arten von Mikrosphären an vier unterschiedliche
antigene Determinanten, die auf der Membran einer Zielzelle exprimiert
werden, darstellt. Die Bindung wird in diesem Fall durch vier verschiedene
Antikörper,
von denen jeder eines der genannten vier Antigene erkennt, vermittelt,
indem die Antikörper
zuerst an die entsprechenden Mikrosphären konjugiert worden waren,
entweder direkt durch eine chemischen Bindung (1,
die drei Beispiele auf der linken Seite) oder indirekt, wobei die
Beads vor der Konjugation an einen biotinylierten Antikörper mit
Avidin vorbeschichtet worden waren (1, rechtes
Beispiel). Wie in 1 dargestellt wurde ein Antikörper an
eine blau gefärbte
Mikrosphäre
gebunden, ein Antikörper
an eine kleine und ein weiterer an eine größere rot fluoreszierende Mikrosphäre, wohingegen
der vierte Antikörper
an eine grün
fluoreszierende Mikrosphäre
Biotin-Avidin-konjugiert worden war.
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2 darstellt,
wie die Erfindung verwendet werden kann, um zwei oder mehr Determinanten
der Zellmembran in einer Situation, in der die Zielzellen in einer
gemischten Zellsuspension selten sind, zu charakterisieren, womit
ein Anreicherungsverfahren vor der Beurteilung der Probe gewährleistet
wird. In dem dargestellten Fall werden mit Antikörper beschichtete, superparamagnetische
Beads zusammen mit rot und grün
fluoreszierenden Mikrosphären,
die entweder direkt oder durch eine Avidin-Biotin-Bindung an gesonderte
Antikörper
konjugiert sind, an die Zellmembran gebunden. In einer solchen Situation
kann eine immunomagnetische Anreicherung erreicht werden, indem
man einen starken Magneten, der Zellen mit gebundenen magnetischen
Beads anziehen wird, verwendet. Die angereicherte Zellsuspension
wird danach unter einem Mikroskop, durch das die Bindung der fluoreszierenden
Mikrosphären
an Zielzellen mit gebundenen magnetischen Beads beobachtet werden
kann, untersucht.
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Die
visuell oder instrumentell unterschiedlich gefärbten oder fluoreszierenden
Partikel, die von ähnlichen
oder unterschiedlichen Größen sein
können
und in der Erfindung verwendet werden, werden an Liganden wie zum
Beispiel Antikörper
oder Fragmente von Antikörpern,
Lektine und Wachstumsfaktoren, die an bestimmte Moleküle, die
auf Membranen von abnormalen Zellen exprimiert werden, binden können, konjugiert, so
dass die gebundenen Partikel mikroskopisch identifiziert werden
können.
Beispiele schließen
die Verwendung von fluoreszierenden Polystyren-Latex-Mikrosphären von
verschiedenen Farben, die in einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet
werden können,
und gefärbte,
nicht fluoreszierende Partikel wie zum Beispiel rote, gelbe, grüne, schwarze
und blaue, die mittels Lichtmikroskopie nachgewiesen werden können, ein.
An die Mikrosphären
konjugierte Antikörper
schließen
alle diejenigen ein, die Antigene, Rezeptoren und andere Determinanten,
die auf den Membranen von abnormalen Zellen und auf normalen Zellen
exprimiert werden, erkennen, siehe unten. Durch Kombinieren verschiedener
Konjugate von Antikörper
und Partikel, die für
die zu untersuchenden Zellen von Bedeutung sind, kann schnell und
direkt in der Zellsuspension ein Fingerabdruck der Zellcharakteristika
erhalten werden. Solche antigenen Fingerabdrücke würden beim Beurteilen wichtiger
biologischer Charakteristika von Zellen, siehe oben, Zellpopulationen
oder Subpopulationen in hohem Maße wertvoll sein. Die Einfachheit
und Geschwin digkeit, mit denen das Verfahren eine solche Information
bereitstellen kann, sind überraschend
und stellen einen Hauptbestandteil der Erfindung dar.
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Antikörper-konjugierte,
fluoreszierende und gefärbte
Partikel wurden in verschiedenen Arten von Immunassays verwendet,
um zum Beispiel das Vorliegen von freien Antigenen, Proteinen, Viren
und Bakterien in biologischen Flüssigkeiten
zu untersuchen. Mit intakten eukaryotischen Zellen wurden an Antikörper konjugierte,
fluoreszierende Mikrosphären
verwendet, um in jedem Fall ein einzelnes, in einer bestimmten Art
von normalen Zellen, wie zum Beispiel Monozyten, Lymphozyten, Hepatozyten
und Fibroblasten, exprimiertes Molekül zu untersuchen. Der Zweck
solcher Untersuchungen war beispielsweise die Untersuchung der Motilität von Membranmarkern
in Makrophagen oder von metabolischen Parametern in Hepatozyten.
In der Literatur wird kein Bericht über Bestrebungen, abnormale
Zellen wie zum Beispiel bösartige
und gutartige neoplastische Zellen und abnormale Zellen, die bei
verschiedenen infektiösen,
reaktiven, autoimmunen, entzündlichen
und proliferativen Funktionsstörungen
vorkommen, zu untersuchen, gefunden. Weiterhin ist die Kombination
von mehreren Antikörpern,
die an verschiedene gefärbte
oder fluoreszierende Mikrosphären
in derselben Zellpopulation oder auf einzelnen Zellen konjugiert
sind, nicht beschrieben. Solche Verfahren wurden auch nicht eingesetzt,
um Subpopulationen von Zielzellen in einer gemischten Zellpopulation
zu biologischen oder diagnostischen Zwecken zu untersuchen.
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Die
zu verwendenden Partikel können
fluoreszierende Polystyren-Latex-Mikrosphären oder nicht fluoreszierende
Partikel von verschiedenen Farben sein. Die Größe der Mikrosphären beträgt zwischen
0,01 μm und
6 μm. Die
Partikel sollten Möglichkeiten
zum Konjugieren von Antikörpern
oder anderen Liganden an ihre Oberfläche bieten. Dies kann direkt,
wie zum Beispiel durch chemische Gruppen wie Carboxyl-, Amino- oder andere
Gruppen, oder indirekt durch Binden der Antikörper an Mikrosphären, die
vorher mit Proteinen wie zum Beispiel Avidin, Streptavidin, Protein
A oder mit Antikörpern,
die mit einem zweiten Antikörper
reagieren können,
beschichtet worden sind, erreicht werden. Die Größe der Mikrosphären kann
so gewählt
werden, dass sie zur Größe der Zellen
und zu dem Zweck der Untersuchung passt, so dass sie die Identifizierung
von unterschiedlichen, gebundenen Konjugaten aus Antikörper und
Mikrosphäre
erleichtern würde.
Es wird in Betracht gezogen, dass eine Partikelgröße von beispielsweise
1 μm die
Identifizierung einer relativ kleinen Zahl von gebundenen Partikeln
erleichtert, wohingegen eine kleinere Größe möglicherweise vorteilhaft sein
kann, wenn ein Markerprotein, das mit einer hohen Dichte exprimiert
wird, untersucht werden soll. Eine andere, wichtige Besonderheit
der Erfindung besteht darin, dass sie in beiden Fällen angewendet
werden kann, wenn eine sehr kleine oder eine sehr große Zahl
von Zellen zu untersuchen ist. Es ist auch wichtig, dass die fluoreszierenden Mikrosphären ihre
Stärke
der Fluoreszenz für
eine erhebliche Zeitdauer beibehalten können.
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Die
Antikörper,
welche die entsprechenden Membranmarkerantigene oder Rezeptoren
erkennen, können
entweder ganze IgG von jedem Isotyp, IgM-Antikörper oder jegliche Fragmente
von solchen Antikörpern, einschließlich auch
rekombinanten Antikörpern
oder Antikörperfragmenten,
sein. Das neue Verfahren beinhaltet ein Binden von den genannten
fluoreszierenden oder gefärbten
Mikrosphären
an Zielzellen in einer Suspension mit einer niedrigen Zahl von Zellen,
bei denen es sich nicht um Zielzellen handelt, oder in anderen Fällen, bei
denen die Zahl der Zielzellen im Vergleich mit Zellen, bei denen
es sich nicht um Zielzellen handelt, niedrig ist. Die Zellsuspension
wird mit 2-6 Antikörpern,
von denen jeder an unterschiedliche Mikrosphären von denselben oder unterschiedlichen
Größen und
von einem bestimmten Farbstoff oder fluoreszierender Farbe konjugiert
ist, inkubiert. Das Verhältnis
zwischen der Zahl der Partikel und der Zahl der Zielzellen reicht
von 5:1 bis 0,5:1, vorzugsweise 5:1, begrenzt durch die Größe der Partikel.
Die Zellsuspension sollte 5-10 Minuten bis zu 2 Stunden lang, vorzugsweise
30 Minuten lang, mit antikörperbeschichteten
Beads bei 0°-37°C, vorzugsweise
bei 4°C
unter behutsamer Rotation inkubiert werden. Nach der Inkubation
werden Proben der Zellsuspension zur Beurteilung unter einem Fluoreszenzmikroskop
oder in anderen visualisierenden oder bildgebenden Geräten, in
denen fluoreszierende Partikel und gefärbte Partikel beobachtet werden
können,
entnommen. Mikrosphären,
die an Zellen gebunden sind, können
dann sichtbar gemacht werden und die Zahl der Zellen, welche die
unterschiedlichen Arten von Partikeln an ihren Oberflächen angeheftet
haben, kann mit oder ohne Auszählung
auch der Zahl der an die Zellen angehefteten Beads festgestellt
werden. Da es möglich
ist, eine Kombination von mehreren antikörperbeschichteten Mikrosphären zu verwenden,
können
Fluoreszenzfilter, die geeignet sind, verschie dene Fluoreszenzemissionsspektren
der zu untersuchen, eingesetzt werden. Das Verfahren bietet auch
Möglichkeiten
für eine
semiautomatisierte Video- und Computerbildanalyse des Vorliegens
von gefärbten
oder fluoreszierenden Partikeln, die an die Zellen gebunden sind.
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Die
Antikörper
können
von der Maus, der Ratte, dem Kaninchen oder dem Menschen stammen
und können
vorzugsweise Antigene, die auf Zielzellen und nicht auf normalen
Zellen in gemischten Zellsuspensionen vorhanden sind, erkennen.
Eine Liste von Antikörpern/Liganden
beinhaltet jene, die gegen Gruppen von antigenen Determinanten,
zum Beispiel CD56/NCAM Antigen, panepitheliales EGP2/cluster2 Antigen, Brust-Mucin
(MUC1) und andere Mucin-Epitope, HMW und andere Melanom-assoziierte
Antigene wie zum Beispiel gp100, MAGE 1, 2 und 3 und MUC18, 80 kD
Sarkom-assoziiertes Antigen, erbB2, Rezeptoren für Wachstumsfaktor wie zum Beispiel
EGF, TGF, PDGF, bFCF, VEGF, IGF1 und IGF2, Laminin, Laminin5, uPA, uPAr,
PAI, TIMP1 und 2, Stromelysin und andere Invasions-bezogene Moleküle, CEA,
PSA, PSM, NSE, c-Met, CD44 und Varianten, ICAM-1, Integrine, Cadherine,
Catenine und andere Zelladhäsions-assoziierte Moleküle, Medikamentenresistenz-Marker
wie zum Beispiel MDR und MRP, Apoptose-bezogene Moleküle wie zum
Beispiel Fas und FasL, Marker der Zellproliferation, der Motilität, der Differenzierung,
der Metastasierung, der Angiogenese, der Signalübertragung und Entzündungs-bezogene
Membranmoleküle,
Onkogenprodukte und Chemokinrezeptoren wie zum Beispiel OCR 1-5,
CXCR 1-4 und Duffy-Antigen und alle Arten von hämatopoetischen und lymphatischen
Zellmarkern, die im CD-System klassifiziert sind, gerichtet sind,
ist aber nicht darauf beschränkt.
Tabelle 1 zählt
Gruppen von Membrandeterminanten, auf die gezielt werden kann, auf
und es wird auch eine Zahl von Beispielen innerhalb einer jeden
Gruppe aufgezeigt. Tabelle 1 Antigene/Rezeptoren und entsprechende
Antikörper/Liganden
| Antigene/Rezeptoren | Beispiele
von Antikörpern/Liganden |
| | |
| Adhäsionsmoleküle | |
| | |
| Integrine | Pierce
36114, BTC 21/22, |
| | M-Kiol
2 |
| | BTC
41/42, Calbiochem |
| | 407277-84 |
| | |
| ICAM-1
(CD54) | C57-60,
CL 203.4 |
| VCAM-1 | Genzyme
2137-01 |
| | |
| HCAM | BCA
9 |
| LCAM | BM
1441 892 |
| | |
| ELAM-1 | Genzyme
2138-01 |
| E-Selectin | BBA
8 |
| P-Selectin | BTC
71/72 |
| LFA-3
(CD58) | TS
2/9 |
| MACAM-1 | NKI-M9 |
| E-Cadherin | BTC
111, 6F9 |
| P-Cadherin | NCC-CAD-299 |
| Tenascin | BM
1452 193 |
| Thrombospondin-Rezeptor
(CD36) | BM
1441 264 |
| VLA-2 | A1.43 |
| | |
| Kohlenhydrat-Antigene | |
| T-Antigen | HH8,
HT-8, Lektine |
| Tn-Antigen | TKH6,
BaGs2, Lektine |
| Sialyl
Tn | TKH2 |
| Galbl-4GlcNac
(nL4, 6, 8) | 1B2,
Lektine |
| Gastrointestinalkrebs-assoziiertes
Antigen | |
| (M.
200 kD) | CA
19-9 |
| Ley | MLuC1,
BR96, BR64 |
| di-Lex, tri-Lex | B3 |
| CA15-3
Epitop | CA15-3 |
| CEA | I-9,
I-14, I-27, II-10, I-46, |
| Lacto-N-fucopentanose
III (CD 15) | PM-81 |
| | |
| Glykolipide | |
| GD3 | ME
36.1, R24 |
| GD2 | ME
36.1, 3F8 |
| Gb3 | 38-13 |
| GM3 | M2590 |
| GM2 | MKI-8,
MKI-16 |
| FucGM1 | 1D7,
F12 |
| | |
| Rezeptoren
von Wachstumsfaktoren | |
| EGF
Rezeptor | 425.3,
2.E9, 225 |
| c-erbB-2
(HER2) | BM
1378 988, 800 E6 |
| PDGFα Rezeptor | Genzyme
1264-00 |
| PDGFβ Rezeptor | Sigma
P 7679 |
| Transferrin
Rezeptor | OKT
9, D65.30 |
| NGF
Rezeptor | BM
1198 637 |
| IL-2
Rezeptor (CD25) | BM
1295 802, Bm 1361 937 |
| c-kit | Bm
428 616, 14 A3, ID9.3D6 |
| TNF
Rezeptor | Genzyme
1995-01, PAL-M1 |
| NGF
Rezeptor | |
| | |
| Melanom-Antigene | |
| Hohes
Molekulargewicht Antigen | |
| (HMW
250.000) | 9.2.27,
NrML5, 225.28 |
| Mw105
Melanom-assoziiertes Glykoprotein | ME20 |
| 100
kDa Antigen | 376.96 |
| (Melanom/Karzinom) | |
| gp
113 | MUC18 |
| p95-100 | PAL-M2 |
| gp75/TRP-1 | 15.75,
TA99 |
| Gp
100-107 | NKI-beteb |
| MAA | K9.2 |
| M125
kD (gp125) | Mab
436 |
| MAGE
1, 2, 3 | anti-MAGE
1, 2, 3 |
| Tyrosinase | anti-Tyrosinase |
| | |
| Sarkom-Antigene | |
| Epitop
TP-1 und TP-3 | TP-1,
TP-3 |
| M.200
kD | 29-13,
29.2 |
| M.160.kD | 35-16,
30-40 |
| | |
| Karzinom-Marker | |
| EGP-2
(Cluster 2 epitheliales Antigen) | MOC-31,
NrLu10 |
| MUC-1-Antigene
(wie zum Beispiel DF3-Epitop (gp290
kD) | BM7, DF3, BCP-7 bis -10 |
| MUC-2
und MUC-3 | PMH1 |
| LUBCRU-G7
Epitop (gp 230 kD) | LUBCRU-G7 |
| Prostata-spezifisches
Antigen | BM
1276 972 |
| Prostatakrebs-Antigen | E4-SF |
| Prostata-Antigen,
hochmolekular, | PD41 |
| M. > 400 kD | |
| Polymorphe,
epitheliale Mucine | BM-2,
BM-7, 12-H-12 |
| | 7E11-C5 |
| Humanes
Milchfett-Globulin | Immunotech
HMFG-1, 27.1 |
| 42
kD Mammakarzinom-Epitop | B/9189 |
| Mw > 106 Mucin | TAG-72,
CC-49, CC-83 |
| Ovarialkarzinom
OC125 Epitop (m. 750 kD) | OC125,
OVX1 |
| HMW-Glykoprotein
aus Pankreas | DU-PAN-2 |
| Colon-Antigen
Co-17-1A (M.37000) | 17-1A |
| Ga
733.2 | GA733,
KS1.4 |
| TAG
72 | 672.3,
CC-49, CC-83 |
| Pancreaskrebs-assoziiert | MUSE
11 |
| Pankarzinom | CC49 |
| Prostata-Adenokarzinom
Antigen | PD41 |
| Mw 150-130 kD Adenokarzinom von | AF-10 |
| Mw 92 kD Blasenkarzinom | 3G2-C6 |
| Mw 600 kD Blasenkarzinom | C3 |
| Blasenkarzinom
Antigen | AN43,
BB369 |
| Hepatozelluläres Karzinom
Antigen | KM-2 |
| M.
900 kD | |
| Mw 48 kD kolorektales Karzinom | D612 |
| Colon-spezifisches
Antigen | Mu-1,
Mu-2 |
| Lungenkarzinom-Antigen
M. 350-420 kD | DF-L1,
DF-L2 |
| Colonkrebs-assoziiert | C242,
NCRC37 |
| Blasenkarzinom
Antigene | T16,
T43, T138 |
| | |
| Neuroblastom
Antigen | |
| Neuroblastom-assoziiert
wie zum Beispiel | |
| UJ13A-Epitop | UJ13A |
| | |
| Gliom
Antigene | |
| Met-14-Epitop | Mel-14 |
| HMW
250 kD | 9.2.27 |
| | |
| Kopf-
und Nackenkrebs Antigene | |
| M.
18-22 kD Antigen | M48 |
| | |
| HLA
Antigene | |
| HLA
Klasse 1 | TP25.99 |
| HLA-A | VF19LL67 |
| HLA-B | H2-149.1 |
| HLA-A2 | KS1 |
| HLA-ABC | W6.32 |
| HLA-DR,
DQ, DP | Q
5/13, B 8.11.2 |
| β2-Mikroglobulin | NAMB-1 |
| | |
| Apoptose-assoziierte
Moleküle | |
| Fas
(CD95/APO-1) | Apo
1 |
| FasL | Anti-FasL |
| P75 | NGF |
| | |
| Verschiedene | |
| Cathepsin
D | CIS-Diagnostici,
Italien |
| Neuroglanduläres Antigen | ME91,
NKI-C3, LS62 |
| pan-humanes
Zellantigen | pan-H |
| | |
| Motilitäts-bezogene
Antigene | anti-KAI-1,
anti-AMF |
| Proliferations-assoziierte
Marker | anti-gp120,
anti-Ki-67 |
| Differenzierungs-assoziierte
Marker | MUC
18, TA99 |
| Medikamentenresistenz-bezogene
Marker | C219,
MRK 16, anti-MRP |
| Angiogenese-assoziierte
Marker | anti-VEGF,
anti-bFGF |
| Chemokinrezeptor-Marker | anti-CCR,
anti-CXCR |
| Invasions-bezogene
Marker | Antikörper gegen: |
| | PAI,
MMP1, MMP9, |
| | TIMP1,
TIMP2, |
| | Laminin
V, Stromelysin |
| | uPAR,
uPA |
-
Die
unten beschriebenen Beispiele erläutern Ausführungsformen und geben das
Leistungsvermögen des
neuen Verfahrens zum Nachweis und zur Charakterisierung von Zielzellen,
das Fachleuten vorher nicht bekannt war, wieder. Es war in hohem
Maße überraschend,
dass gemischte Zellpopulationen simultan oder aufeinander folgend
mit einer Zahl von verschiedenen, Partikel-gebundenen Antikörpern inkubiert
werden konnten, dass für
jeden Antikörper
die Bindung des Antikörper-Partikel-Komplexes
an die Zielzellen spezifisch war und dass die Bindung von verschiedenen
Komplexen im einem Fluoreszenzmikroskop mit einzelnen und/oder mehreren,
mit den Fluoreszenzemissionsspektren der fluoreszierenden Mikrosphären kompatiblen Filtern
oder durch Wechslen auf herkömmliche
Lichtmikroskopie, um die Bindung von gefärbten, nicht fluoreszierenden
Beads besser zu identifizieren, leicht sichtbar gemacht und unterschieden
werden konnte.
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Wenn
mehrere Antikörper-Partikel-Komplexe
simultan mit Zielzellen in einer gemischten Zellsuspension inkubiert
werden, würde
man leicht erwarten, dass sich die Komplexe zusammenballen oder
auf eine andere Weise miteinander reagieren könnten, wobei sie Komplexe,
die unspezifisch an Zellen binden könnten, bilden würden, dass
sie aus sterischen oder anderen Gründen sich gegenseitig beim
Binden an Zielantigene blockieren könnten oder dass die Fluoreszenz
der Partikel gedämpft
werden könnte,
was es schwierig machen würde,
zwischen den verschiedenen Arten von Partikeln zu unterscheiden. Überraschenderweise
werden jedoch durch das Einhalten des Verfahrens gemäß der Erfindung
keine solchen Probleme beobachtet. Die Spezifität dieses Ansatzes wird weiter
in Experimenten gezeigt, welche die Inkubation der Zielzellen mit
einem Antikörper-Partikel-Konjugat,
das im Mikroskop eine gelbe Fluoreszenz ergeben würde, und
danach mit demselben Antikörper,
der an ein Partikel mit einer roten Fluoreszenz gekoppelt war, beinhalteten.
In diesem Fall wurde eine Bindung des gelben Antikörper-Partikel-Konjugats
beobachtet, wohingegen die Bindung des zweiten Komplexes vollständig blockiert
war, weil derselbe Antikörper
zur Konjugation sowohl an die gelben als auch an die roten Partikel
verwendet worden war.
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In
Fällen,
in denen die Zielzellen in einer gemischten Zellsuspension selten
sind, wie zum Beispiel Tumorzellen im peripheren Blut und im Knochenmark,
kann ein Anreicherungsverfahren vor oder in Kombination mit dem
Farb/Fluoreszenz-Partikel-Verfahren einbezogen werden. Die Anreicherung
kann mit verschiedenen, vorher bekannten Vorgehensweisen einschließlich immunologischer
Verfahren wie zum Beispiel „panning", Säulen-Separation
oder immunomagnetische, positive oder negative Selektion erreicht
werden. Wenn eine immunomagnetische Selektion bevorzugt wird, kann
derselbe Inkubationsschritt sowohl die magnetisierbaren als auch
die nicht Eisen enthaltenden Beads mit dem entsprechenden, Zell-bindenden
Antikörper
umfassen. Nach dem Anreicherungsschritt kann die Zellsuspension,
welche die Zielzellen enthält,
untersucht und mikroskopisch auf die Bindung fluoreszierender oder
gefärbter
Partikel hin ausgewertet werden. Darüber hinaus können, wenn
immunomagnetische Beads einer Größe von beispielsweise
mindestens 1 μm
für die
Anreicherung verwendet werden, solche an Zellen gebundene Beads
auch beobachtet und als zusätzliche
Zellmarker verwendet werden (2).
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Die
Möglichkeit,
einen schnellen, einfachen und zuverlässigen Weg, Expressionsmuster
verschiedener, wichtiger Marker auf Zellpopulationen oder auf der
Ebene einzelner Zellen simultan aufzuzeichnen, zu haben, eröffnet neue
Wege in der zellbiologischen Forschung und für die Routinediagnostik, die
Stadienbestimmung und die prognostische Bewertung einer großen Auswahl
von Krankheiten, die von allen Arten von menschlichen und tierischen
Geweben herrühren.
Unter vielen Umständen
ist eine schnelle Diagnose von großer Bedeutung für die Wahl
der therapeutischen Alternative. Beispiele davon umfassen chirurgische
Verfahren, die in Abhängigkeit
davon zu wählen
sind, ob zum Beispiel ein Mamma-, Prostata- oder Gehirntumor bösartig ist
oder nicht, ob eine Lymphknotenvergrößerung von einer Tumorzellinfiltration
oder einer Entzündungsreaktion
verursacht wurde, davon, von welcher Art die Zellen, die eine Verdickung
der Syno vialmembranen in Gelenken bilden, sind, davon, von welcher
Art die Zellen, die in chirurgischen, Nadel- oder fiberoptischen
Biopsien aus Läsionen
in der Haut, der Lunge, der Leber, dem Knochen, den Ovarien oder
im Darm oder in anderen Geweben vorliegen, sind und davon, welcher
Art die Zellen, die in Pleuraergüssen
oder Ascites, in CSF, Lymphe, peripherem Blut und Knochenmark vorhanden
sein können,
sind. Derzeit beruht die Diagnose von solchen Zellen hauptsächlich auf
morphologischen Bewertungen und auch auf Immunzytochemie, die nach der
Anfertigung von Gewebeschnitten, Cytospins oder Abstrichen durchgeführt wird.
Morphologisch kann es schwierig sein, die Art der Zellen zu bestimmen,
und Immunzytochemie kann, wie vorher erwähnt, maximal das Vorliegen
von zwei Markern nachweisen. Mit dem neuen Verfahren werden Zellen
aus den Proben zum Beispiel in physiologischer Salzlösung oder
in Medium dispergiert, mit den entsprechenden Antikörper-Mikrosphären-Kombinationen
für den
erforderlichen Zeitraum, üblicherweise
30 Minuten, inkubiert und dann mikroskopisch untersucht. In der
Zellsuspension können
die gebundenen Partikel leicht erkannt werden, was ein überraschend
schnelles und einfaches immunologisches Erstellen von Fingerabdrücken oder
einem Profil der Zielzellen ermöglicht.
Wegen dieser Einfachheit, der Charakterisierung von mehreren Parametern,
des sehr kurzen Zeitrahmens, der erforderlich ist, um sowohl die
Prozedur als auch die Beurteilung auszuführen, stellt das Verfahren
einen bedeutenden Beitrag zu den Bemühungen, eine schnelle und zuverlässige Krankheitsdiagnose
zu erhalten und Informationen von entscheidender Bedeutung für die weitere
Behandlung der Patienten zu gewinnen, dar.
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Um
Situationen, in denen eine solche Charakterisierung wichtig ist,
zu veranschaulichen, werden die folgenden, theoretischen Beispiel
aufgenommen:
Bei Brustkrebs ist bekannt, dass die Expression
von Markern wie zum Beispiel erbB2, EGF-Rezeptor und IGF2 auf den
Tumorzellen mit gesteigerter Proliferation und Aggressivität der Krankheit
verbunden sein kann. Zusätzlich
kann die Expression von anderen Determinanten wie zum Beispiel EGP2,
uPAr, VEGF, MUC1, MDR, Fas und FasL Charakteristika widerspiegeln,
die für
die Fähigkeit
der Zellen zu metastasieren, Angiogenese zu induzieren, einer Chemotherapie
zu widerstehen und auch für
die Apoptose der Tumorzellen oder der T-Zellen des Trägers wichtig
sind. Durch Verwenden einer Kombi nation von Mikrosphären können mehrere
von diesen Parametern simultan in nur einem Vorgang aufgezeichnet
werden. Solche Untersuchungen können
an den Biopsien aus dem Primärtumor,
an Nadelbiopsien aus soliden Metastasen und an Proben aus Ascites
oder Pleuraergüssen,
Blut und Knochenmark vorgenommen werden.
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Bei
HIV-infizierten Patienten ist die Charakterisierung der verschiedenen
Untergruppen von T-Lymphozyten von entscheidender Bedeutung. Beispiele
von Determinanten, die mit dem neuen Verfahren zusätzlich zu
den am meisten verbreiteten T-Zell-Markern untersucht werden können, sind
Chemokinrezeptoren und Apoptose-bezogene Moleküle wie zum Beispiel Fas und
FasL.
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Beim
malignen Melanom kann das Ausmaß oder
das Fehlen von Differenzierung der Tumorzellen die mögliche Aggressivität der Erkrankung
auf die Art widerspiegeln, dass eine geringere Differenzierung mit
einer gesteigerten Malignität
in Beziehung steht. Zusätzlich
sind verschiedene Moleküle
einschließlich
Markern wie zum Beispiel gp100, MAGE1, 2, 3, B7, Fas und FasL für eine immunologische
Reaktion wichtig. Da solche Marker für die Wirkung von Immuntherapie
und Impfung wichtig sind, ist eine umfassende Charakterisierung von
diesen und auch von anderen Melanom-assoziierten Antigenen von großer Bedeutung
für die
klinische Führung
der Patienten. Eine solche Charakterisierung kann mit dem neuen
Verfahren leicht vorgenommen werden.
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Eine
Lymphknotenvergrößerung kann
verschiedene Arten von reaktiven, infektiösen oder malignen Zuständen widerspiegeln.
Somit kann es wichtig sein, zu bestimmen, ob solche Lymphknoten
Tumorzellen enthalten oder nicht. Wenn Tumorzellen vorhanden sind,
kann die Bestimmung der Art der malignen Zellen die Wahl der Therapie
ausschlaggebend beeinflussen. Ein Beispiel ist eine Lymphknotenmetastase,
die entweder von einem kleinzelligen Lungenkrebs (EGP2) oder einem
malignen Melanom (HMW250000) stammen könnte. Mit der geeigneten Wahl
von Antikörper-Mikrosphären-Konjugaten kann diese
Unterscheidung mit der neuen Vorgehensweise leicht innerhalb von
weniger als einer Stunde getroffen werden.
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Beispiele des Einsatzes des neuen Verfahrens
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1. Untersuchung der Spezifität von Antikörper-konjugierten,
fluoreszierenden Partikeln in menschlichen Brustkrebszellen.
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MCF-7-Zellen
aus menschlichem Brustkrebs wurden mit hellrosa fluoreszierenden,
mit Avidin beschichteten Mikrosphären von 1 μm mit oder ohne Biotin-konjugierten
MOC31 anti-EGP2 (antiepithelialer Zellmarker) Antikörper und/oder
mit immunomagnetischen Beads (4,5 μm), die mit einem anti-Brust-Mucin (MUC1)
Antikörper
(BM7) beschichtet waren, inkubiert.
-
Eine
Suspension von MCF-7-Zellen, die mit fluoreszierenden Partikeln
ohne gebundenen Antikörper MOC31
inkubiert worden war, wurde unter einem Mikroskop untersucht. Es
hafteten keine fluoreszierenden Beads an den Tumorzellen an. Ähnliche
Experimente mit MOC31 Biotin-Avidin-konjugierten, fluoreszierenden Partikeln
zeigten von 5 bis 10 fluoreszierende Partikel, die an die Oberfläche der
Tumorzellen gebunden waren. In anderen Experimenten wurden MCF-7-Zellen
mit immunomagnetischen Beads, die mit dem Antikörper BM7, der an die Tumorzellen
bindet, beschichtet waren, inkubiert, gefolgt von einer Inkubation
mit fluoreszierenden Partikeln mit und ohne Antikörper MOC31.
Es wurde festgestellt, dass die Tumorzellen mit oberflächengebundenen,
immunomagnetischen Beads eine Bindung auch und nur von MOC31-konjugierten,
fluoreszierenden Partikeln zeigten. Diese beiden Arten von Partikeln
konnten leicht nebeneinander verwendet werden und die Ergebnisse
zeigten keine unspezifische Zelladhärenz von Partikeln, denen ein
zielgerichteter Antikörper
fehlte.
-
2. Wirkung von simultaner
oder nachfolgender Inkubation mit Antikörper-beschichteten Beads
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SKBr3-Zellen
aus menschlichem Brustkrebs wurden mit verschiedenen Kombinationen
von hellrosa fluoreszierenden Latex-Mikrosphären, die mit dem Antikörper MOC31
konjugiert waren, mit oder ohne simultane oder nachfolgende Inkubation
mit immunomagnetischen Beads, die entweder mit MOC31 oder mit BM7-Antikörpern beschichtet
waren, inkubiert. Die Größen der
Beads wie in Beispiel 1. Wenn sowohl die fluoreszierenden als auch
die immunomagnetischen Beads denselben zielgerichteten Antikörper hatten
und simultan inkubiert wurden, wurde beobachtet, dass beide Arten
von Beads an die Tumorzellen gebunden waren. Wenn eine von diesen
Mikrosphären/Beads
zuerst 30 Minuten lang inkubiert wurde und danach weitere 30 Minuten
lang mit den anderen Antikörper-konjugierten
Partikeln, war die Bindung des zweiten Antikörper-Partikel-Komplexes vollständig blockiert.
Die Bindung einer jeden Art von Beads, die mit unterschiedlichen
Antikörpern
konjugiert und simultan inkubiert wurden, zeigte dasselbe Bindungsmuster
wie das, das beobachtet wurde, wenn jede davon in getrennten Experimenten
untersucht wurde.
-
3. Simultane Bindung von verschiedenen
Arten von Mikrosphären/Beads
an dieselben Zielzellen
-
Brustkrebszellen,
von denen bekannt war, dass sie eine Anzahl von verschiedenen Antigenen
auf ihrer Oberfläche
exprimieren, wurden mit Antikörpern,
die vier verschiedene von diesen Antigenen erkennen, simultan inkubiert.
Jeder Antikörper
war unabhängig
an vier Arten von Mikrosphären/Beads
konjugiert worden: 1) blau gefärbte
Latex-Mikrosphären (0,5 μm), 2) hellrosa
fluoreszierende Latex-Mikrosphären
(1 μm),
3) gelb fluoreszierende Mikrosphären
(1 μm) und
4) immunomagnetische, superparamagnetische Partikel (4,5 μm). Das der
Erfindung gemäße Verfahren
zeigte, dass die Tumorzellen alle vier verschiedenen Arten von Beads,
die durch den Einsatz einer Kombination von Fluoreszenz- und Lichtmikroskopie
eindeutig erkannt werden konnten, banden. Die Zahl von Partikeln,
die an jeder Zelle anhafteten, war in Übereinstimmung mit dem bekannten Expressionsmuster
des entsprechenden Antigens für
jeden Antikörper-Partikel-Komplex unterschiedlich.
Die Antikörper
erkannten die folgenden Antigene: EGP2, MUC1, EGF-Rezeptor und einen
unabhängigen,
epithelialen Marker, der vom Antikörper 595 erkannt wird.
-
4. Bindung von fluoreszierenden
Mikrosphären
an Zielzellen nach immunomagnetischer Anreicherung
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Menschliche
MCF7-Tumorzellen wurden zu mononukleären, peripheren Blutzellen
von gesunden Freiwilligen in einem Verhältnis von 1/1000 Tumorzellen
zu mononukleären
Zellen gegeben. Die Zellsuspension wurde mit dem antiepithelialen
Antikörper
MOC31, der durch eine Avidin/Biotin-Bindung an hellrosa fluoreszierende
Mikrosphären
(1 μm) angeheftet
war, und simultan mit superparamagnetischen Immunobeads (4,5 μm), die mit
dem anti-MUC1 Antikörper
BM7 beschichtet waren, inkubiert. Nach einer Inkubation von 30 Minuten
wurde eine magnetische Selektion von Tumorzellen mit an ihre Oberflächen gebundenen
immunomagnetischen Beads durchgeführt und Proben der resultierenden
Zellsuspension wurden mikroskopisch untersucht. Es wurde festgestellt,
dass die verbleibenden Tumorzellen mit Beadrosetten auf ihrer Oberfläche auch 5-10
fluoreszierende Partikel an die Membran gebunden hatten, während eine
kontaminierende, normale Zelle keine Bindung von irgendeinem der
Partikel/Beads zeigte.
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5. Bindung von fluoreszierenden Zellen
an maligne Zellen aus Ascites.
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Eine
Suspension von Zellen aus Ascites, die einem Patienten abgenommen
worden waren, wurde ohne jede Information über die Herkunft der Zellen
ins Labor gebracht. Die Zellsuspension wurde mit verschiedenen,
Antikörper-beschichteten,
fluoreszierenden Partikeln und paramagnetischen Immunobeads gemäß der Erfindung
inkubiert. Partikel, die mit Antikörpern, die verschiedene Marker-Antigene
erkannten, beschichtet waren, banden an die Zellen in der Suspension,
was die maligne und epitheliale Natur der Zellen zeigte und somit
die Diagnose eines Ovarialkrebses bestätigte. In einem anderen Fall
mit Ascites wurden in Übereinstimmung
mit der Schlussfolgerung des einsendenden Pathologen keine Zellen
mit Antikörper-beschichteten
Partikeln gesehen. In beiden Fällen
lieferte das in der Erfindung beschriebene Verfahren die Ergebnisse über mehrere,
verschiedene Marker innerhalb von 45 Minuten, wohingegen die parallele
morphologische und immunzytochemische Untersuchung eines einzigen
Markers erst mehr als 24 Stunden später abgeschlossen war.
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6. Nachweis von Zellen in
einem Pleuraerguss
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Ohne
jegliche vorherige Kenntnis der zugrunde liegenden Erkrankung zeigte
die Inkubation der Zellsuspension mit verschiedenen anti-Tumor Antikörpern, mit
denen fluoreszierende und immunomagnetische Partikel beschichtet
waren, eine starke Bindung aller Mikrosphären und Immunobeads mit Antikörpern gegen Karzinom
und Brust-Mucin (MUC1). Die Diagnose des Patienten war Brustkrebs
mit Pleuraerguss.
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Mikrosphären, die
mit einem anti-Melanom Antikörper
konjugiert waren, banden nicht. Als Schlussfolgerung wurden auch
in diesem Fall die Zeilen in der klinischen Probe erfolgreich identifiziert.
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7. Nadelaspirat aus einem
Schilddrüsentumor
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Die
aus dem Nadelaspirat erhaltene Zellsuspension wurde mit fluoreszierenden
Mikrosphären
mit einem Antikörper,
von dem bekannt war, dass er mit kolorektalen Krebszellen reagiert,
und simultan mit immunomagnetischen Beads, die mit dem antiepithelialen
Antikörper
MOC13 beschichtet waren, inkubiert. Die fluoreszierenden Antikörper banden
nicht an irgendwelche Zellarten in der Suspension, wohingegen die MOC31-Immunobeads stark
an Schilddrüsenepithelzellen
banden, aber nicht an die große
Zahl von Makrophagen, wie in der Suspension vorhanden waren.
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Die
obigen Beispiele zeigen, dass das neue Verfahren gemäß der Erfindung
eine beträchtlich
gesteigerte diagnostische Stärke
und Zuverlässigkeit
aufweist, indem eine größere Zahl
von antigenen Determinanten von Zielzellen in einem Arbeitsgang,
in einem sehr kurzen Zeitraum im Vergleich mit vorher bekannten
Verfahren entfernt werden kann.