CN113186164B - 一种尺寸可控复合框架平面材料及其制备方法与在细胞富集中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种尺寸可控复合框架平面材料及其制备方法与在细胞富集中的应用,属于生物技术领域。所述复合框架平面材料由网状纳米纤维膜、支撑柱和基底组成,所述基底的一个表面上有纳米阵列结构的支撑柱,网状纳米纤维膜铺设在纳米阵列结构的支撑柱上。本发明所提供的细胞富集技术无需修饰特异性癌细胞识别抗体或核酸适配体,可实现不同癌细胞类型的捕捉,具有成本低廉、操作简便的优势。所制备的复合框架平面材料可用于捕获外周血中的循环肿瘤细胞,有望用癌症患者的早期诊断、检测、分析,癌细胞的去除以及血液净化。
Description
技术领域
本发明涉及一种尺寸可控复合框架平面材料及其制备方法与在细胞富集中的应用,属于生物技术领域。
背景技术
近年来,癌症已成为威胁人类生命健康的重要因素,然而随科技的发展,通过对癌症的早发现、早治疗及对肿瘤形成的机理研究,有望减少癌症的病发,减小人类的死亡率。对癌症的研究一直是一个热点和难点。
恶性肿瘤患者最终死于癌症转移,对于癌症转移的早期发现、监控以及治疗具有重要意义(Wu L,Qu X.Cancer biomarker detection:recent achievements andchallenges[J].Chem Soc Rev,2015,44(10):2963-2997)。循环肿瘤细胞(CTCs)是1869年由澳大利亚籍医生Ashworth首次提出(Zhe X,Cher M L,Bonfil R D.Circulating tμmorcells:finding the needle in the haystack[J].American journal of cancerresearch,2011,1(6):740-751),是指从实体肿瘤病灶脱落,发生上皮-间质转化(EMT)从而具有流动特性而进入外周血的肿瘤细胞,然后在第二个合适的位置侵入细胞外基质中发生增殖生长,最终发展成为肿瘤(Yu M,Ting D T,Stott S L,et al.RNA sequencing ofpancreatic circulating tμmour cells implicates WNT signalling in metastasis[J].Nature,2012,487:510)。因此提取和研究CTCs对于癌症的早期发现、诊断、治疗以及机理研究都具有重要意义。然而,CTCs在外周血中的数量非常少,因此CTCs捕获技术一直是研究的热点和难点(Keilholz U,Rossi CR,et al.Trends in Molecular Medicine.2006,12(3):130-139)。
目前CTCs主要的分离方法有过滤法(Pinzani P,Salvadori B,Simi L,etal.Isolation by size of epithelial tμmor cells in peripheral blood ofpatients with breast cancer:correlation with real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction results and feasibility of molecular analysis bylaser microdissection[J].Hμm Pathol,2006,37(6):711-718)、密度梯度离心法(Gertler R,Rosenberg R,Fuehrer K,et al.Detection of circulating tμmor cellsin blood using an optimized density gradient centrifugation[M]//MolecularStaging of Cancer.Springer,Berlin,Heidelberg,2003:149-155)、磁性纳米颗粒(LiaoC-J,Hsieh C-H,Wang H-M,et al.Isolation of label-free and viable circulating tμmour cells(CTCs)from blood samples of cancer patients through atwo-stepprocess:Negative selection-type immunomagnetic beads and spheroid cellculture-based cell isolation[J].RSC Advances,2017,7(47):29339-29349)等,虽然这些方法具有一定的CTCs捕获效果,但也存在各种不足,如材料制备过程较为复杂,有的捕获率不高或富集时间较长等。
随着技术的发展,越来越多的纳米阵列(支撑柱)应用于细胞富集上面。纳米阵列有很多种,除了硅纳米线外,还有TiO2阵列、铜纳米针、MoO2阵列等,但在细胞上的应用主要还是硅纳米阵列(Adv.Mater.2019,1903663)。这些纳米阵列可以显著影响着细胞的粘附、生长、分化及蛋白表达等生命活动,在细胞富集方面都是增大比表面积增加与CTCs的接触机会,进一步提高CTCs的捕获率。各种纳米阵列在生产成本、生长可控性、掺杂、对环境影响等方面各有优劣,比如就硅纳米阵列而言,氧化辅助生长法制备硅纳米阵列不需要引入催化剂但缺点是需要高温,金属辅助化学刻蚀法制备硅纳米阵列则反应条件温和但硅纳米阵列表面会有团簇等。
静电纺丝起源于200多年前人们对静电雾化过程的研究。1929年,Hagiwara(MASARU H.Process for manufacturing artificial silk.Compiler:US,1603080[P].1926-10-12)公开了一种以人造蚕丝胶体溶液为原料,通过高压静电制备人造蚕丝的专利。随后Simons(SIMONS H L.Process and apparatus for producing patterned non-woven fabrics.Compiler:US,3280229[P],1966-10-18)发明了一种生产静电纺丝的装置,获得了具有不同形态的纤维膜。在20世纪90年代,Reneker(RENEKER D H,CHUNI.Nanometre diameter fibres of polymer,produced by electrospinning[J].Nanotechnology,1996,7(3):216-223)研究小组对静电纺丝技术的研究,引起了科研人员的广泛关注,其在英国Nanotechnology杂质上发表了关于静电纺丝技术制备聚合物纤维及其应用展望的综述论文。进入21世纪,静电纺丝技术进入了快速发展时期,静电纺丝的成型机理和过程逐渐被揭示。
静电纺丝技术的基本原理是高分子溶液在注射器推动下在针头处并形成泰勒锥液滴,若液体表面的电荷斥力大于表面张力,便会形成射流,射流在电场力下产生拉伸,同时溶剂挥发,沉积在接收器上得到纳米纤维。与模板合成法、熔喷法、海岛法、闪蒸法等制备的纳米纤维相比,该技术产生的纤维直径小、比表面积大,同时纤维膜还具有孔径小、孔隙率高、孔道连通性好等优势。
而最近报到,花粉在不需要修饰特异性识别分子的情况下虽可达到近90%以上的CTCs捕获率(Adv.Sci.2020,2002259),但是花粉的孔径难以调控,基本上是固定的,而支撑柱和网状纳米纤维膜通过调节实验参数可以控制高度粗细和网孔大小,来控制对细胞的富集。目前,纳米阵列与纳米纤维膜相结合形成复合框架用来细胞富集还没有报到。
发明内容
本发明所要解决的问题是单一硅纳米阵列的捕获率细胞捕获率低的问题。
本发明是通过以下技术方案实现的:
本发明提供了一种尺寸可控复合框架平面材料,所述复合框架平面材料由网状纳米纤维膜、支撑柱和基底组成,所述基底的一个表面上有纳米阵列结构的支撑柱,网状纳米纤维膜铺设在纳米阵列结构的支撑柱上。
进一步地,所述网状纳米纤维膜中纤维的直径为50~500nm;所述支撑柱的高度为1000~10000nm;所述支撑柱的直径为50~300nm;所述基底为平面材料,其面积大小为1~100cm2。
进一步地,所述网状纳米纤维膜包括丝素蛋白纤维网、聚氨酯纤维网、腈纶纤维网、聚乙烯醇纤维膜或丝素/聚乳酸聚己内酯纤维网;
进一步地,所述基底的材质包括铁板、塑料板、铜板、纸板、陶瓷板、玻璃或硅片。
进一步地,所述支撑柱包括二氧化钛纳米阵列、硅纳米阵列或氧化锌纳米阵列。
本发明还提供了一种复合框架平面材料的制备方法,包括以下步骤:
(1)采用电化学沉积合成法、水热/溶剂热合成法、模板合成法、CVD合成法中的一种制备具有纳米阵列结构的支撑柱,并将支撑柱接到基底的一个表面上;或直接在基底的一个表面上采用金属辅助刻蚀法、磁控溅射法,制备具有纳米阵列结构的支撑柱;
(2)配置纺丝液,置于静电纺丝设备中,将基底材料的具有支撑柱的一面向上,放于静电纺丝仪的接收器上;纺丝液通过静电纺丝设备喷出纳米纤维,在纳米阵列结构的支撑柱表面形成网状结构的纳米纤维膜,得到复合框架平面材料。
进一步地,步骤(1)所述金属辅助刻蚀法为将基底依次放入腐蚀液、掩膜液和刻蚀液中处理,得到一个表面具有纳米阵列结构的支撑柱的基底材料;所述腐蚀液包括氢氟酸,所述腐蚀液的浓度为0.1~1.0%(v/v);所述掩膜液包括硝酸银与氢氟酸的混合液,硝酸银浓度为0.001~0.010%(w/v),氢氟酸浓度为1~10%(v/v);所述刻蚀液包括双氧水与氢氟酸的混合液,双氧水浓度为0.1~1.0%(v/v),氢氟酸浓度为1~10%(v/v)。
进一步地,基底在掩膜液和刻蚀液中处理后,用去离子水清洗、晾干;基底清洗和腐蚀时配合超声;
进一步地,步骤(2)所述纺丝液包括丝素蛋白、聚乳酸聚己内酯、聚氨酯、腈纶、聚乙烯醇中的一种或两种混合溶液;当纺丝液为两种溶液时,两种溶液的质量比为1:10~10:1,所述纺丝液的浓度为4%~16%(w/v),所述纺丝液的溶剂包括六氟异丙醇、三氟乙酸或甲酸。
本发明还提供了一种复合框架平面材料在细胞富集中的应用。
有益的效果:
本发明的复合框架平面材料能够有效地富集细胞。本发明所提供的细胞富集技术无需修饰特异性癌细胞识别抗体或核酸适配体,具有成本低廉、操作简便的优势。所制备的复合框架平面材料可以调节支撑柱大小、高度以及网状纳米纤维膜的密度,来解决单一硅纳米线捕获率低的问题,有望用于癌症患者的早期诊断、检测、分析,癌细胞的去除以及血液净化。
附图说明
图1是本发明实施例2中P/100单抛硅片在捕获A431细胞后的扫描电镜照片,比例尺为100μm。
图2是本发明实施例2制备的硅纳米线的俯视及截面的扫描电镜照片,比例尺分别为10μm和5μm。
图3是本发明实施例2制备的硅纳米阵列捕获癌细胞扫描电镜照片,比例尺为10μm。
图4是本发明实施例2制备的丝素/聚乳酸聚己内酯的网状纳米纤维膜的低倍和高倍镜下扫描电镜照片,比例尺分别是100μm和2μm。
图5是本发明实施例2制备的复合框架平面材料在捕获A431细胞后的低倍和高倍镜下扫描电镜照片,比例尺分别为100μm和10μm。
图中,1:基底;2:癌细胞;3:支撑柱;4:网状纳米纤维膜;5:伪足。
具体实施方式
下述非限定性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明,但不以任何方式限制本发明。
所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
本发明的复合框架平面材料的制备方法,包括以下步骤:
①将干净基底放入到腐蚀液中,将干净基底表面氧化物除去,得到纯单质基底;
②将所述纯单质基底放入到掩膜液中进行掩膜,然后对所得基底清洗,晾干,得到掩膜基底;
③将所述掩膜基底放入到刻蚀液中进行刻蚀,将刻蚀后的基底用去离子水清洗,晾干;得到表面具有纳米阵列结构的支撑柱的基底材料;
④配置纺丝液,并置于静电纺丝设备中;
⑤将步骤③所得基底材料放置在静电纺丝设备的取向接受仪上,启动静电纺丝设备进行纺丝,纺丝液通过静电纺丝设备喷出纳米纤维,在纳米阵列结构的支撑柱表面形成网状结构的纳米纤维膜,得到复合框架平面材料。
进一步,步骤②中,所述腐蚀液包括氢氟酸,所述腐蚀液的浓度为0.1~0.2%(v/v)。
进一步,步骤①或②中,可以边超声边进行清洗或腐蚀基底。对于超声时间,选择在常温条件下超声5~30min。
进一步,步骤③中,所述掩膜液包括硝酸银与氢氟酸的混合液,硝酸银浓度为0.0034~0.0068%(w/v),氢氟酸浓度为1~5%(v/v)。
进一步,步骤④中,所述刻蚀液包括双氧水与氢氟酸的混合液,双氧水浓度为0.2~0.8%(v/v),氢氟酸浓度为1~5%(v/v)。
进一步,步骤④中,通过将基底用例如去离子水进行清洗,并进行烘干,从而得到基底阵列。进行清洗的次数为1~5次。
进一步,步骤⑤中,纺丝液包括丝素蛋白、聚乳酸聚己内酯、聚氨酯、腈纶、聚乙烯醇中的一种或两种混合溶液;当纺丝液为两种溶液时,两种溶液的质量比为1:10~10:1,所述纺丝液的浓度为4%~16%(w/v),所述纺丝液的溶剂包括六氟异丙醇、三氟乙酸或甲酸。
所得的复合框架平面材料上层具有若干的微纳网状结构,下层有凹凸不平的沟壑,这有利于捕获循环肿瘤细胞,如人表皮癌细胞(A431细胞)。本发明所用材料价格低廉,操作简单,还无需固载特异性癌细胞识别抗体或核酸适配体,能有效的降低使用成本。
实施例2
本实施例选用的单抛硅片(型号/晶向:P/100)在顺生电子科技公司购买,以购买于中科院细胞库的人表皮癌细胞(A431细胞)为待捕获的循环肿瘤细胞模型,对本发明的捕获体系做进一步的阐述和验证,包括以下步骤:
1.制备用于捕获循环肿瘤细胞的复合框架平面材料中的支撑柱
切长为1cm、宽为1cm的单抛硅片。
将单抛硅片放入浓度为0.125%(v/v)的HF溶液中超声清洗10分钟用来除去表面的有机物和氧化物薄膜。
将得到的单抛硅片用去离子水清洗3遍,随后用氮气枪吹干,把清洗干净的硅片浸入硝酸银浓度为0.0034%(w/v),氢氟酸浓度为2.325%(v/v)的混合溶液中,反应5min,硅表面沉积一层纳米银颗粒后为下一步做准备。
把镀有纳米银颗粒的单抛硅片浸入双氧水浓度为0.455%(v/v),氢氟酸浓度为2.325%(v/v)的混合溶液中,放于聚四氟乙烯反应釜中,在常温下反应30min。
将反应完成后的单抛硅片放入浓度为50%(v/v)的硝酸中放置1个小时进行处理,然后立即用去离子水冲洗干净并在室温下干燥。
在显微镜下观察单抛硅片的表面结构,其中,图1示出了实施例2得到的单抛硅片的扫描电镜照片(比例尺为100μm),图1中清晰地示出该单抛硅片表面光滑;图2示出了实施例2得到的复合框架平面材料中的支撑柱俯视及截面的扫描电镜照片(比例尺分别为10μm和5μm),从图2可知,单抛硅片经硝酸银掩膜,氢氟酸刻蚀后会形成一根根柱子排列在硅片上,增加了单抛硅片的表面粗糙度。图3示出了实施例2得到的硅纳米阵列捕获癌细胞扫描电镜照片(比例尺为10μm),可见癌细胞伪足较短。
2.制备用于捕获循环肿瘤细胞的复合框架平面材料中的网状纳米纤维膜:
称取0.1g丝素蛋白和0.1g聚乳酸聚己内酯置于5mL离心管中,并用1mL移液枪吸取2mL六氟异丙醇置于上述离心管中,使其充分混合1~2天得到纺丝液;
将纺丝液置于静电纺丝设备中得到网状纳米纤维膜,本实验采用北京永康乐业科技发展有限公司生产的ET-2535H静电纺丝设备,纺丝喷头采用21号针头,内径0.5毫米,外径0.8毫米。操作条件为室温,施加电压为10kv,接收距离为20cm,灌注速度为0.12mm/min,接收器为取向接收仪(转速为2800r/min)。
在显微镜下观察所得网状纳米纤维膜结构,其中,图4示出了实施例2得到丝素蛋白/聚乳酸聚己内酯的网状纳米纤维膜的低倍和高倍镜下扫描电镜照片(比例尺分别是100μm和2μm),图4中清晰地示出该网状纳米纤维膜由粗细不一的纳米线交错而成,再放大可以看到纤维与纤维之间有更细的纳米纤维,呈现出“蛛网”的结构,这增加了网状纳米纤维膜的比表面积。
3.制备用于捕获循环肿瘤细胞的复合框架平面材料:
将制备好的长为1cm、宽为1cm的支撑柱置于上述取向接收仪(转速为2800r/min)上,并按上述操作条件启动静电纺丝设备并持续1min进行纺丝,试验结束后得到复合框架平面材料,留待备用。
在显微镜下观察所得复合框架平面材料,其中,图5示出了实施例2得到的复合框架平面材料在捕获A431细胞后的低倍和高倍镜下扫描电镜照片(比例尺分别为100μm和10μm),由图看出,网状纳米纤维膜紧密依附在支撑柱上,增加了癌细胞与基底的接触面积,即癌细胞与支撑柱相连,又与网状纳米纤维膜接触。
4.准备待测的循环肿瘤细胞样品:
取A431细胞悬浮液10μL,用细胞计数器计数并计算其浓度。吸取一定量的上述细胞悬浮液,用DMEM细胞培养基稀释至5*104个细胞/mL。
5.捕获实验:
将上述步骤3中得到的复合框架平面材料放入细胞培养板中,然后将上述步骤4混合均匀的细胞悬浮液1mL滴加到复合框架平面材料表面,然后置于细胞培养箱中,捕获时间为90分钟。
作为对照实验组1,对上述步骤1所得的支撑柱层也进行相同的待测样品中的捕获循环肿瘤细胞实验。
捕获时间结束后,将捕获有循环肿瘤细胞的复合框架平面材料表面用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗三次,用质量浓度为4%的多聚甲醛水溶液固定捕获的癌细胞30分钟,将捕获的癌细胞浸泡在浓度为10pg/mL的DAPI水溶液中30分钟,达到染色的目的。最后在Olympus倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(共计80张),利用Image Pro软件对捕获的循环肿瘤细胞进行计数,计算捕获率。对照实验组1也按照上述步骤进行,并计算捕获率。
捕获率的计算方法如下:
将步骤3中复合框架平面材料放入细胞培养板中(底面积为2cm2)。
捕获率=[(x/Ax)/(N/A)]*100%(式1)
x:10倍荧光显微镜下所照得的荧光照片中循环肿瘤细胞的捕获数量;
Ax:10倍荧光显微镜下所照得的荧光照片视野大小;
x/Ax:实际捕获的细胞密度;
N:细胞的总投放量(本实施例中为“5*104个细胞/毫升”);
A:细胞培养版底面积(本实施例中为“2cm2”)
N/A:投放细胞的密度
通过上式1计算每一个视野的捕获率,然后取所有视野的捕获率的平均值,即得到复合框架平面材料对循环肿瘤细胞的捕获率。
上述实验结果表明,A431癌细胞在复合框架平面材料表面伸出较多伪足,铺展状态良好(参见图5),复合框架平面材料对A431癌细胞的捕获率达到85%,而对照实验组1中,支撑柱层表面对A431癌细胞的捕获率为78%,表明网状纳米纤维膜的引入可以提高循环肿瘤细胞的捕获。
实施例3
本实施例选用的Al2O3、氮气、刚玉坩埚等市面上均可购买,实验设备使用PECVD炉,对本发明的捕获体系做进一步的阐述和验证,包括以下步骤:
1.在基底上制备支撑柱:
将0.5g镓块放在刚玉坩埚中;
将切长为1cm、宽为1cm的Al2O3衬底倒扣在镓块正上方,然后将坩埚置于PECVD炉腔中央;
将PECVD炉腔门关好,抽真空到5Pa,设置升温曲线,升温速率为20℃/min,然后通入氩气,通气量为50sccm;
当PECVD炉温度达到1000℃时开始保温,关闭氩气,并通入氮气,气流量为40sccm。然后打开射频设置射频功率为100w,保温反应两小时。
保温反应结束后,等炉冷却,取出所得样品,留待备用。
2.接着,与实施例2的步骤2和步骤3同样操作,得到用于捕获循环肿瘤细胞的复合框架平面材料。
Claims (8)
1.尺寸可控复合框架平面材料,其特征在于,所述复合框架平面材料由网状纳米纤维膜、支撑柱和基底组成,所述基底的一个表面上有纳米阵列结构的支撑柱,网状纳米纤维膜铺设在纳米阵列结构的支撑柱上;所述支撑柱为硅纳米阵列;所述支撑柱的高度为1000~10000nm;所述支撑柱的直径为50~300nm;
所述网状纳米纤维膜为丝素/聚乳酸聚己内酯纤维网;浓度为4%~16%(w/v);所述网状纳米纤维膜中纤维的直径为50~500nm。
2.根据权利要求1所述的复合框架平面材料,其特征在于,所述基底为平面材料,其面积大小为1~100cm2。
3.根据权利要求1所述的复合框架平面材料,其特征在于,所述基底的材质包括铁板、塑料板、铜板、纸板、陶瓷板、玻璃或硅片。
4.一种权利要求1〜3中任一项所述的复合框架平面材料的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)采用电化学沉积合成法、水热/溶剂热合成法、模板合成法、CVD合成法中的一种制备具有纳米阵列结构的支撑柱,并将支撑柱接到基底的一个表面上;或直接在基底的一个表面上采用金属辅助刻蚀法、磁控溅射法,制备具有纳米阵列结构的支撑柱;
(2)配置纺丝液,置于静电纺丝设备中,将基底材料的具有支撑柱的一面向上,放于静电纺丝仪的接收器上;纺丝液通过静电纺丝设备喷出纳米纤维,在纳米阵列结构的支撑柱表面形成网状结构的纳米纤维膜,得到复合框架平面材料。
5.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)所述金属辅助刻蚀法为将基底依次放入腐蚀液、掩膜液和刻蚀液中处理,得到一个表面具有纳米阵列结构的支撑柱的基底材料;所述腐蚀液包括氢氟酸,所述腐蚀液的浓度为0.1~1.0%(v/v);所述掩膜液包括硝酸银与氢氟酸的混合液,硝酸银浓度为0.001~0.010%(w/v),氢氟酸浓度为1~10%(v/v);所述刻蚀液包括双氧水与氢氟酸的混合液,双氧水浓度为0.1~1.0%(v/v),氢氟酸浓度为1~10%(v/v)。
6.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,基底在掩膜液和刻蚀液中处理后,用去离子水清洗、晾干。
7.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)所述纺丝液包括丝素蛋白、聚乳酸聚己内酯、聚氨酯、腈纶、聚乙烯醇中的一种或两种混合溶液;当纺丝液为两种溶液时,两种溶液的质量比为1:10~10:1,所述纺丝液的浓度为4%~16%(w/v),所述纺丝液的溶剂包括六氟异丙醇、三氟乙酸或甲酸。
8.一种权利要求1~3中任一项所述的复合框架平面材料在细胞富集中的应用。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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