CN111939992A - 捕获和富集循环肿瘤细胞的微流体系统的制备方法及微流体装置 - Google Patents

捕获和富集循环肿瘤细胞的微流体系统的制备方法及微流体装置 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种捕获和富集循环肿瘤细胞的微流体系统的制备方法及微流体装置，所述制备方法包括如下步骤：1)硅纳米线芯片的蚀刻、表面修饰和生物功能化；2)微流体芯片的制备；3)硅纳米线芯片和微流体芯片的组装。本发明技术方案中，通过设计硅纳米线芯片和微流体芯片，并对其进行组装，解决了传统CTC计数的灵敏度不高的技术问题。

Description

捕获和富集循环肿瘤细胞的微流体系统的制备方法及微流体 装置
技术领域
本发明涉及生物材料和临床检测技术领域，特别涉及一种捕获和富集循环肿瘤细胞的微流体系统的制备方法及微流体装置。
背景技术
随着污染程度的增加，肿瘤的患病几率已经高于三分之一的比例。对于肿瘤的诊断方法主要包括：病理学(活检切片)；影像学(超声、X光、CT或PET等)和血清学(血清肿瘤相关蛋白，如CA-125、CA-199或CEA等)。然而这些方法对存在自身的缺陷，不能为不断变化肿瘤和诊断预警提供帮助。目前临床公认的人外周血循环肿瘤细胞(Circulating TumorCell，简称CTC)检测已被公认为最好检测手段之一。在2004年，美国药品与食品监督管理局首次批准通过了第一个有关CTC富集和计数的技术产品。这一产品是利用细胞表面所表达的上皮细胞粘附分子(EpCAM)来完成细胞的分选的。EpCAM在绝大多数的上皮细胞上都有表达，因此，在来源于上皮细胞的肿瘤细胞中也有表达。修饰有anti-EpCAM的磁珠与固化的血液细胞相互作用，这样一来所有表达EpCAM的细胞表面都会附着一些磁珠，最后再通过磁场进行分选。要进一步是别CTC，所有被捕获的细胞首先会从磁珠上解离下来，然后用对应细胞角蛋白CK-8，CK-18和CK-19以及白细胞抗原(CD45)的荧光抗体进行标记。在这一系统中，对于CTC的技术定义是CK+/CD45-有细胞核的物体，该设备和方法已被作为一个嵌入式生物标志物应用在几个治疗相关的临床试验中。首个有关CTC计数检测的大规模临床试验是于2004年进行的，主要针对已经发生转移的乳腺癌病人。这次试验所得出的治疗前和治疗期间的CTC检测结果同时预测了无进展生存期(PFS)和总生存期(OS)。很短时间内，在多种不同的癌症研究中也进行了类似的CTC计数测试，其中就包括肠癌、皮肤癌、肺癌和前列腺癌，并且得出了类似的发现。值得注意的是，这些研究大多将CTC计数检测结果分为两类：定性的作为(对于评价病人病情)有利或者不利，而不是把他们作为一个可连续变化的定量数据。
随着领域内日益增长的需求和可能性，第一代CTC计数的局限性所带来的各种问题和困扰正在被更多更新颖的CTC技术所解决和克服。首先，在CTC研究中检测灵敏度还是至关重要的影响因素。FDA批准通过的CTC技术在50％的mCRPC病人中都无法检测出CTC。其次，基于EpCAM单独抗体的CTC富集技术会无法检测正在发生上皮间质化转化的肿瘤细胞。早期的CTC研究已经证明有些病人的CTC具有间质化特征，所以通常认为上皮间质化现象在CTC的产生过程中起着非常重要的作用。第三，仅仅对CTC进行计数，忽视了CTC中亚群的重要意义。在最近的研究中显示，一些CTC所具有的特异形貌特征和剪接变异体的表达与肿瘤内脏转移和癌症抗药性有关联。这些发现都指出CTC作为肿瘤标志物，不仅仅用来计数。第四，将血液样品先固定化再进行检测的方法会限制分离CTC后下游的分子的分析研究。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种捕获和富集循环肿瘤细胞的微流体系统的制备方法及微流体装置，旨在解决传统CTC计数的灵敏度不高的技术问题。
为实现上述目的，本发明提出了一种捕获和富集循环肿瘤细胞的微流体系统的制备方法，其特征在于，采用以下制备方法制备：
1)硅纳米线芯片的蚀刻、表面修饰和生物功能化
S1、在硅基底上旋转涂覆光阻胶，干燥备用；
S2、对涂覆的光阻胶进行O2反应离子蚀刻，以形成点状纳米结构；
S3、对点状纳米结构进行CF4蚀刻，依次用体积之比为55～85:15～45浓硫酸/双氧水混合液以及去离子水洗涤，得到硅纳米线基底；
S4、无水乙醇进一步清洗硅纳米线基底，N2吹干备用；
S5、制备质量浓度为0.1～10％的新鲜的巯丙基三甲氧基硅烷的甲苯溶液，并将步骤S4中吹干的硅纳米线基底浸没于上述甲苯溶液中进行键合反应，至反应完全，无水乙醇清洗，N2吹干，得表面键合巯丙基三甲氧基硅烷的硅纳米线基底；
S6、制备质量浓度为20ng/mL～1mg/mL的新鲜的马来酰亚胺-聚乙二醇-生物素基的DMSO溶液，并将表面键合巯丙基三甲氧基硅烷的硅纳米线基底浸没于上述DMSO溶液进行二次键合反应，至反应完全，无水乙醇清洗，N2吹干，得硅纳米线芯片；
2)微流体芯片的制备
S1、设计和打印具有微流体信道区域的微流体通道结构和鱼骨结构的掩模板；
S2、在硅材料上旋转涂覆光刻胶，光刻胶的厚度为10～150um，干燥，然后对准微流体通道结构的掩模板和光刻胶上对应的微流体通道结构的光刻区域，光照，成像得微流体通道结构；
S3、于步骤S2中的硅材料上再次旋转涂覆光刻胶，光刻胶的厚度为50～200um，干燥，然后对齐鱼骨结构的掩模板和光刻胶上对应的微流体信道的光刻区域，光照，成像得构建在所述微流体通道结构的微流体信道区域的鱼骨结构；
S4、清洗并干燥微流体通道结构的光刻胶模板，减压气体蒸镀三氯(1H，1H，2H，2H全氟辛基)硅烷，无尘环境保存；
S5、采用Sylgard elastomer试剂盒浇筑步骤S4中的光刻胶模板，所述微流体通道结构的整体厚度为3～6mm；并将所述微流体通道结构裁切成与所述硅纳米线芯片大小相适配；
3)硅纳米线芯片和微流体芯片的组装
将所述微流体芯片上的微流体信道区域对齐所述硅纳米线芯片上蚀刻有硅纳米线的区域，然后通过夹具夹紧所述硅纳米线芯片和所述微流体芯片。
可选地，所述微流体通道包括依次连通的第一分型通道、微流体信道和第二分型通道；
所述第一分型通道具有连通的一个第一流入端和多个第一流出端，以将所述第一流入端的微流体分流至多个所述第一流出端；
所述微流体信道设有多个，多个所述微流体信道的流入端与多个所述第一流出端一一对应连通；
所述第二分型通道具有连通的多个第二流入端和一个第二流出端，多个所述微流体信道的流出端与多个所述第二流入端一一对应连通，所述第二分型通道用于将流入多个所述第二流入端的微流体汇聚至所述第二流出端。
可选地，所述微流体信道内部设有多个鱼骨结构。
可选地，所述鱼骨结构的宽度为5～13um；和/或，
所述鱼骨结构的间距为8～15um；和/或，
所述鱼骨结构的高度为10～40um。
可选地，多个所述微流体信道平行间隔设置；
多个所述微流体信道的宽度为0.3～3mm；和/或，
所述微流体信道的高度为25～130um。
可选地，所述微流体通道的材料为塑料、橡胶和纤维材料中的一种或其组合。
可选地，所述纳米线的长度为2～5um；和/或，
所述纳米线的直径为50～400nm。
可选地，所述点状纳米结构的间距为10～900nm。
可选地，所述光阻胶为PMMA-A8光阻胶；和/或，
所述光刻胶为SU-8光刻胶。
本发明还提供一种微流体装置，采用如上所述的捕获和富集循环肿瘤细胞的微流体系统的制备方法制备而成。
相较于现有技术，本发明取得了以下有益效果：
本发明技术方案中，通过构建硅纳米线芯片和微流体芯片，并将此二者组装配合形成容置有纳米线的微流体通道的微流体系统，拟实现在具有肿瘤细胞的血液样品经过该微流体通道时，捕获和富集血液样品中的肿瘤细胞，供病理学研究及进一步分析。具体地，在以传统的硅纳米线生物吸附机理的基础上，通过在纳米线的表面修饰具有特异性识别功能的生物素，以特异性识别捕获肿瘤细胞，减小其他细胞的干扰；并进一步结合微流体在经过微流体通道时，由于微流体信道内部设有的鱼骨结构形成的微流混合效应(在纳米线与硅基底接触的表面形成湍流现象，以充分加大血液样品在微流体通道内的移动时长)，实现血液样品中细胞与纳米线的完全接触，这样既降低了对血液样品的量的需求，又实现了对该血液样品中肿瘤细胞全方位的检测和高效率的捕获。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1为本发明一实施例中微流体装置的组装图；
图2为本发明一实施例中硅纳米线芯片的制备流程示意图；
图3为本发明一实施例中硅纳米线芯片的电镜图；
图4为本发明一实施例中硅纳米线芯片上捕获CTC细胞后的电镜图；
图5为本发明一实施例中在纳米线上进行修饰和生物功能化的制备流程示意图；
图6为本发明一实施例中微流体通道结构的和鱼骨结构的结构示意图；
图7为本发明一实施例中微流体系统最优流速的结果示意图；
图8为本发明一实施例中微流体系统最优捕获用抗体浓度的结果示意图；
图9为本发明一实施例中微流体系统最优鱼骨结构高度的结果示意图；
图10为本发明一实施例中微流体系统最优纳米线高度的结果示意图；
图11为本发明一实施例中微流体系统的干扰试验结果示意图；
图12为本发明微流体系统的方法检测限的测试结果示意图；
图13为本发明一实施例微流体系统在临床癌症患者血液样品的测试中捕获肿瘤细胞的电镜结果示意图；
图14为本发明一实施例中利用微流体系统进行临床测试的结果示意图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明，若本发明实施例中有涉及方向性指示(诸如上、下、左、右、前、后……)，则该方向性指示仅用于解释在某一特定姿态(如附图所示)下各部件之间的相对位置关系、运动情况等，如果该特定姿态发生改变时，则该方向性指示也相应地随之改变。
另外，若本发明实施例中有涉及“第一”、“第二”等的描述，则该“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。另外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。
实施例1
本发明提出了一种捕获和富集循环肿瘤细胞的微流体系统的制备方法，采用以下制备方法制备：(本实施例采用0.5毫米厚的医用病理石英载玻片为基础)
1)硅纳米线芯片的蚀刻、表面修饰和生物功能化
参见图1至图5，为硅纳米线芯片的蚀刻过程，具体步骤如下：
S1、在病理载玻片上旋转涂覆PMMA-A8光阻胶，所述PMMA-A8光阻胶的厚度为500nm，干燥备用；
S2、对涂覆的PMMA-A8光阻胶进行O2反应离子蚀刻，以形成点状纳米结构，其中蚀刻时长为2分钟；
S3、对点状纳米结构进行CF4蚀刻，蚀刻10分钟，依次用体积之比为70:30的浓硫酸/双氧水混合液以及去离子水洗涤，得到硅纳米线基底，以进行纳米线表面化学修饰和生物功能化；
S4、无水乙醇进一步清洗硅纳米线基底，然后在超净环境下进行N2吹干，备用；
S5、制备质量浓度为1％的新鲜的巯丙基三甲氧基硅烷(MPTMS)的甲苯溶液，并将步骤S4中吹干的硅纳米线基底浸没于上述甲苯溶液中进行键合反应，反应2小时，至反应完全，无水乙醇清洗，超净环境下N2吹干，得表面键合巯丙基三甲氧基硅烷的硅纳米线基底；
S6、制备质量浓度为50ng/mL的新鲜的马来酰亚胺-聚乙二醇-生物素基(Maleimide-聚乙二醇2-Biotin)的DMSO溶液，并将表面键合巯丙基三甲氧基硅烷的硅纳米线基底浸没于上述DMSO溶液进行二次键合反应，反应2小时，至反应完全，无水乙醇清洗，超净环境下N2吹干，得硅纳米线芯片，4℃干燥环境保存备用。
2)微流体芯片的制备
参见图6，本实施例采用PDMS微流体通道结构，设计分型结构，从一个入口逐级分为8条平行的微流体信道，所述微流体信道的长度为20mm，宽度为1mm，深度为100um。所述微流体信道内部设有鱼骨结构，所述鱼骨结构的宽度为10um，高度为30um，间距为10um，以在微流体经过所述微流体信道时，产生垂直微流体信道底部的湍流，从而加强液流流过所述微流体信道时细胞与硅纳米线基底的接触时长，增加结合捕获抗体后的基底与目标细胞的生物粘附性。
具体地，所述微流体通道包括依次连通的第一分型通道、微流体信道和第二分型通道；所述第一分型通道具有连通的一个第一流入端和多个第一流出端，以将所述第一流入端的微流体分流至多个所述第一流出端；所述微流体信道设有多个，多个所述微流体信道的流入端与多个所述第一流出端一一对应连通；所述第二分型通道具有连通的多个第二流入端和一个第二流出端，多个所述微流体信道的流出端与多个所述第二流入端一一对应连通，所述第二分型通道用于将流入多个所述第二流入端的微流体汇聚至所述第二流出端。可选地，所述微流体通道的材料为塑料、橡胶和纤维材料中的一种或其组合。
上述微流体芯片的制备方法如下：
S1、设计和打印具有微流体信道区域的微流体通道结构和鱼骨结构的掩模板；
S2、在硅材料上旋转涂覆SU-8光刻胶，光刻胶的厚度为70um，干燥，然后对准微流体通道结构的掩模板和光刻胶上对应的微流体通道结构的光刻区域，光照，成像得微流体通道结构；
S3、于步骤S2中的硅材料上再次旋转涂覆SU-8光刻胶，光刻胶的厚度为100um，干燥，然后对齐鱼骨结构的掩模板和光刻胶上对应的微流体信道的光刻区域，光照，成像得构建在所述微流体通道结构的微流体信道区域的鱼骨结构；
S4、清洗并干燥微流体通道结构的光刻胶模板，减压气体蒸镀三氯(1H，1H，2H，2H全氟辛基)硅烷，无尘环境保存；
S5、采用Sylgard elastomer试剂盒，其中184silicone elastomer base和Sylgard 184 silicone elastomer curing ageent的比例为10:1。PDMS微流体通道结构的整体厚度为4.5mm，裁切成适合石英病理载玻片的大小，以便装配，然后在所述微流体通道结构的流入位置和流出位置打孔，清理后备用。
3)硅纳米线芯片和微流体芯片的组装
参见图1，将所述微流体芯片上的微流体信道区域对齐所述硅纳米线芯片上蚀刻有硅纳米线的区域，然后通过夹具夹紧所述硅纳米线芯片和所述微流体芯片。
具体地，其组装步骤入下：
S1、制备5.0uM的链霉亲和素(Streptavidin，SA)PBS溶液200uL，覆盖在蚀刻有纳米线的硅纳米线芯片区域，静置45分钟；
S2、PBS溶液清洗三遍，并吸干表面残余溶液，然后用夹具组装微流体芯片和硅纳米线芯片；
S3、连接进口处和出口处的Tygon流体输送管，并和已经安装在注射泵上的1mL注射器连接。
应当理解，为了增强所述微流体芯片与所述硅纳米线芯片之间的密封性，所述微流体通道的材料采用塑料、橡胶和纤维材料等高分子聚合物中的一种或其组合。
实施例2
1)模拟样品的制备
从培养丰度为95％左右的非小细胞肺癌细胞系H2228培养皿中制备密度为10000/mL的细胞悬浊液(精确计数)，并梯度稀释分选处200/20uL待用溶液，加入180uL含有2*105Jurkat细胞悬浊液(细胞都用PBS稀释和配置)，作为200uL模拟样品。在模拟样品中加入含有5umol生物素标记的EpCAM抗体(anti-EpCAM)1.5mL溶液，室温共孵育45分钟。之后离心(400g，5分钟)，去除上层清液后，再用PBS清洗一遍，并定容在200uL PBS溶液中，作为测试模拟样品。
2)最优流速的测试和选择
①实验步骤：
选择实验1)中的模拟样品为测试对象，分别测试0.1mL/h、0.2mL/h、0.5mL/h、1.0mL/h、2.0mL/h和5.0mL/h流速下H2228细胞的捕获效率，并得到如图7所述的结果数据图。具体按如下操作步骤进行实验:
a、将200uL模拟样品装入1mL注射器中，连接好系统，按上述流速将模拟样品注射进微流体系统中；
b、注射完毕后，在注射器中装载100uL浓度为2％的PFA(多聚甲醛)溶液，以流速1.0mL/h流经微流体系统，以对捕获的细胞进行固定；
c、拆装微流体系统后，取出硅纳米线载玻片，PBS溶液清洗，然后将制备的5uM细胞角蛋白抗体(anti-pan cytokeratin)和5uM CD45抗体(anti-CD45)混合溶液200uL覆盖在蚀刻有纳米线的硅纳米线芯片区域，4℃下静置24小时，清洗，并用标准方法进行二抗的染色，具体地，采用Alex488标记CK抗体，采用Alex555标记CD45抗体，二抗染色时间为30分钟；然后清洗，并尽量吸取除去表面的溶液残留，然后用含有Hoechest染核试剂的封固液80uL封装，加上盖玻片，进行荧光成像并计数；
d、将成像结果中CK+/CD45-/DAPI+的细胞计数为捕获的癌细胞，通过对比起始加入的癌细胞数目200颗，计算得出相应的捕获效率。
②结果分析。参见图7，可知，在一定微流体流速范围内，随着微流体流速的增加，微流体系统对肿瘤细胞的捕获数目也增加；具体地，在微流体流速为1.0mL/h时，微流体系统对肿瘤细胞的捕获达到最大，捕获的细胞数目接近200个(初始肿瘤细胞数目，也即捕获率接近100％)；在微流体流速超过1.0mL/h时，随着微流体流速的增加，微流体系统对肿瘤细胞的捕获数量逐渐减少。
3)最优捕获用抗体浓度的选择
①实验步骤：在200颗肿瘤细胞加入的模拟样品中，分别选择0.5umol、1.0umol、2.0umol、5.0umol、10.0umol及50.0umol不同的捕获抗体浓度进行共孵育，得到如图8所示的结果。具体操作步骤如上述2)中的①所述，在此不再一一赘述。
②结果分析。参见图8，可知，在一定捕获抗体浓度的范围内，随着捕获抗体浓度的增加，微流体系统对肿瘤细胞的捕获数量逐渐增加；具体地，在捕获抗体浓度为5.0umol时，微流体系统对肿瘤细胞的捕获数量达到最优值；在捕获抗体浓度超过5.0umol时，微流体系统对肿瘤细胞的捕获数量的多少几乎不受捕获抗体浓度的影响。
4)最优鱼骨结构高度的测试
①实验步骤：在微流体信道中，分别光刻10um、20um、30um、40um、50um及60um的鱼骨结构，然后测试对应的所述微流体系统对肿瘤细胞的捕获效率的增益功能，并得到如图9所示的结果。具体操作步骤如上述2)中的①所述，在此不再一一赘述。需要说明的是，本实施例组在微流体信道的总高度为100um的情况下进行选择的，并不包含对不同微流体信道高度的鱼骨结构高度的选择。
②结果分析。参见图8，可知，在一定鱼骨结构高度的范围内，随着鱼骨结构高度的增加，微流体系统对肿瘤细胞的捕获数量逐渐增加；具体地，在鱼骨结构高度为30um时，微流体系统对肿瘤细胞的捕获数量达到最优值；在鱼骨结构高度超过30um时，微流体系统对肿瘤细胞的捕获数量随着鱼骨结构高度的逐渐增加而大幅降低。
5)最优纳米线高度的选择
①实验步骤：分别蚀刻127nm、256nm、327nm、452nm及578nm的纳米线长度，然后测试对应的所述微流体系统对肿瘤细胞的捕获效率，并得到如图10所示的结果。具体操作步骤如上述2)中的①所述，在此不再一一赘述。
②结果分析。参见图10，可知，在一定纳米线长度的范围内，随着纳米线长度的增加，微流体系统对肿瘤细胞的捕获数量逐渐增加；具体地，在纳米线长度为327nm时，微流体系统对肿瘤细胞的捕获数量达到最优值；在纳米线长度超过327nm时，微流体系统对肿瘤细胞的捕获数量的多少几乎不受纳米线长度的影响。
6)干扰试验
提取健康血液中的白细胞作为干扰细胞2.0*106/mL，制备模拟样品，并比较对于不同类型的癌细胞(A549，H2228和H1975)的捕获能力，得到图11所示的结果数据，证明与实际血液中白细胞等量的干扰，不会影响检测的效率。
7)方法检测限的测试
制备含有1颗、5颗、10颗、50颗、100颗、200颗、500颗及1000颗的H2228癌细胞的模拟样品，具体制备方法参照上述200颗H2228癌细胞模拟样品的制备方法，在此不再一一赘述，然后测试该方法的检测线性和捕获下限，得到如图12所述的结果数据，证明该方法可以捕获只存在1颗H2228癌细胞的模拟样品中的癌细胞。
实施例3
1)临床癌症患者血液样品的测试和应用：
①临床样品的采血需要用BD Vacutainer Glass ACD Solution A tube8.5mL，以避免EDTA抗凝对于血液中细胞表面的抗原损伤，导致影响捕获抗体的结合，降低捕获效率；采取抽血的第一管只抽取2mL，不用于测试(以检测因针头刺进血液时脱落上皮细胞，而出现假阳性细胞的现象)。
②以4mL全血为例，本方法采取梯度密度离心对癌症患者血液进行初步纯化。首先加入4mL PBS溶液以对血样进行等体积稀释，混合均匀，然后在已经加入4mL梯度密度离心液(1077)的15mL离心管中缓慢加入稀释后的血液样品；选用300g，40分钟离心，去除血清(黄色)，收取约2～4mL的单核细胞层(PBMC，peripheral blood mononuclear cell)；然后对收取的单核细胞层进一步离心，选用400g，5分钟，去除上清液，用2mL PBS溶液清洗；再次离心、去除上清液，然后加入新鲜制备的5um细胞角蛋白抗体(anti-pan cytokeratin)和5um CD45抗体(anti-CD45)的混合溶液400uL，打散细胞聚集，共孵育45分钟；清洗并定容在400uL的PBS溶液中。
③如实施例1中所述，组装好硅纳米线芯片和微流体芯片以形成微流体系统，所述微流体系统的微流体流速为1.0mL/h，捕获用抗体浓度为5.0umol，鱼骨结构高度为30um，纳米线高度为327nm。对60位肺癌患者、10位患有肺部疾病的非肺癌患者以及10位健康人进行测试，并得到如图13和图14所示的结果数据。
2)结果分析。参见图13和图14，可知，肺癌基因的亚型在60个癌症病人细胞中都有检出，尤其在肺癌晚期的病人中检测到的CTC细胞数目更多，在10个患有肺部疾病的非肺癌患者微量检出，而在10个健康病人的细胞中几乎没有检出。
综上所述，本发明提供的一种捕获和富集肿瘤细胞的微流体系统，可以在较少血液样品的情况下精准捕获血液样品中的肿瘤细胞，以供病理学研究，对癌症预后治疗和临床医学具有一定的指导意义。同时，本发明对CTC中存在的表达上皮间质化的CTC表型族群进行了有效的检出和分析，对于转移的早期预警有重要的作用。
以上所述仅为本发明的可选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种捕获和富集循环肿瘤细胞的微流体系统的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
1)硅纳米线芯片的蚀刻、表面修饰和生物功能化
S1、在硅基底上旋转涂覆光阻胶，干燥备用；
S2、对涂覆的光阻胶进行O2反应离子蚀刻，以形成点状纳米结构；
S3、对点状纳米结构进行CF4蚀刻，依次用体积之比为55～85:15～45浓硫酸/双氧水混合液以及去离子水洗涤，得到硅纳米线基底；
S4、无水乙醇进一步清洗硅纳米线基底，N2吹干备用；
S5、制备质量浓度为0.1～10％的新鲜的巯丙基三甲氧基硅烷的甲苯溶液，并将步骤S4中吹干的硅纳米线基底浸没于上述甲苯溶液中进行键合反应，至反应完全，无水乙醇清洗，N2吹干，得表面键合巯丙基三甲氧基硅烷的硅纳米线基底；
S6、制备质量浓度为20ng/mL～1mg/mL的新鲜的马来酰亚胺-聚乙二醇-生物素基的DMSO溶液，并将表面键合巯丙基三甲氧基硅烷的硅纳米线基底浸没于上述DMSO溶液进行二次键合反应，至反应完全，无水乙醇清洗，N2吹干，得硅纳米线芯片；
2)微流体芯片的制备
S1、设计和打印具有微流体信道区域的微流体通道结构和鱼骨结构的掩模板；
S2、在硅材料上旋转涂覆光刻胶，光刻胶的厚度为10～150um，干燥，然后对准微流体通道结构的掩模板和光刻胶上对应的微流体通道结构的光刻区域，光照，成像得微流体通道结构；
S3、于步骤S2中的硅材料上再次旋转涂覆光刻胶，光刻胶的厚度为50～200um，干燥，然后对齐鱼骨结构的掩模板和光刻胶上对应的微流体信道的光刻区域，光照，成像得构建在所述微流体通道结构的微流体信道区域的鱼骨结构；
S4、清洗并干燥微流体通道结构的光刻胶模板，减压气体蒸镀三氯(1H，1H，2H，2H全氟辛基)硅烷，无尘环境保存；
S5、采用Sylgard elastomer试剂盒浇筑步骤S4中的光刻胶模板，所述微流体通道结构的整体厚度为3～6mm；并将所述微流体通道结构裁切成与所述硅纳米线芯片大小相适配；
3)硅纳米线芯片和微流体芯片的组装
将所述微流体芯片上的微流体信道区域对齐所述硅纳米线芯片上蚀刻有硅纳米线的区域，然后通过夹具夹紧所述硅纳米线芯片和所述微流体芯片。
2.如权利要求1所述的捕获和富集循环肿瘤细胞的微流体系统的制备方法，其特征在于，所述微流体通道包括依次连通的第一分型通道、微流体信道和第二分型通道；
所述第一分型通道具有连通的一个第一流入端和多个第一流出端，以将所述第一流入端的微流体分流至多个所述第一流出端；
所述微流体信道设有多个，多个所述微流体信道的流入端与多个所述第一流出端一一对应连通；
所述第二分型通道具有连通的多个第二流入端和一个第二流出端，多个所述微流体信道的流出端与多个所述第二流入端一一对应连通，所述第二分型通道用于将流入多个所述第二流入端的微流体汇聚至所述第二流出端。
3.如权利要求2所述的捕获和富集循环肿瘤细胞的微流体系统的制备方法，其特征在于，所述微流体信道内部设有多个鱼骨结构。
4.如权利要求3所述的捕获和富集循环肿瘤细胞的微流体系统的制备方法，其特征在于，所述鱼骨结构的宽度为5～13um；和/或，
所述鱼骨结构的间距为8～15um；和/或，
所述鱼骨结构的高度为10～40um。
5.如权利要求2所述的捕获和富集循环肿瘤细胞的微流体系统的制备方法，其特征在于，多个所述微流体信道平行间隔设置；
多个所述微流体信道的宽度为0.3～3mm；和/或，
所述微流体信道的高度为25～130um。
6.如权利要求1至5任一项所述的捕获和富集循环肿瘤细胞的微流体系统的制备方法，其特征在于，所述微流体通道的材料为塑料、橡胶和纤维材料中的一种或其组合。
7.如权利要求1至5任一项所述的捕获和富集循环肿瘤细胞的微流体系统的制备方法，其特征在于，所述纳米线的长度为2～5um；和/或，
所述纳米线的直径为50～400nm。
8.如权利要求1至5任一项所述的捕获和富集循环肿瘤细胞的微流体系统的制备方法，其特征在于，所述点状纳米结构的间距为10～900nm。
9.如权利要求1至5任一项所述的捕获和富集循环肿瘤细胞的微流体系统的制备方法，其特征在于，所述光阻胶为PMMA-A8光阻胶；和/或，
所述光刻胶为SU-8光刻胶。
10.一种微流体装置，其特征在于，采用如权利要求1至9任一项所述的捕获和富集循环肿瘤细胞的微流体系统的制备方法制备而成。
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