CN111893024A - 捕获和释放肿瘤细胞的微流体系统的制备方法、微流体装置及其应用 - Google Patents

捕获和释放肿瘤细胞的微流体系统的制备方法、微流体装置及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种捕获和释放肿瘤细胞的微流体系统的制备方法、微流体装置及其应用，所述制备方法包括以下步骤：S1、硅纳米线芯片的制备；S2、微流体芯片的制备；S3、硅纳米线芯片和微流体芯片的组装；S4、肿瘤细胞的捕获和释放。本发明技术方案解决了传统CTC计数的灵敏度不高的技术问题。

Description

捕获和释放肿瘤细胞的微流体系统的制备方法、微流体装置 及其应用
技术领域
本发明涉及生物材料和临床检测技术领域，特别涉及一种捕获和释放肿瘤细胞的微流体系统的制备方法、微流体装置及其应用。
背景技术
循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC)是从原发性肿瘤或转移部位脱落并作为转移瘤的细胞来源在外周血中循环的癌细胞。目前用于癌症诊断的金标准需要侵入性活组织检查和随后对活检样品进行的组织病理学分析。然后，在早期转移或复发时，收集组织活检样品难以确定转移/复发部位。因此，CTC可被认为是肿瘤的“液体活组织检查”，其能够在致命性转移发生之前方便地获得肿瘤细胞。目前临床CTC检测已被公认为人体肿瘤细胞检测及其预后诊断的最好检测手段之一，其主要的技术挑战在于从血液样品的大量(109个细胞/mL)血细胞中有效且特异性地捕获丰度极低(数个至数百个细胞/mL)的CTC。
随着领域内日益增长的需求和可能性，第一代CTC计数的局限性所带来的各种问题和困扰正在被更多更新颖的CTC技术所解决和克服。首先，在CTC研究中检测灵敏度还是至关重要的影响因素。FDA批准通过的CTC技术在50％的mCRPC病人中都无法检测出CTC。其次，基于EpCAM单独抗体的CTC富集技术会无法检测正在发生上皮间质化转化的肿瘤细胞。早期的CTC研究已经证明有些病人的CTC具有间质化特征，所以通常认为上皮间质化现象在CTC的产生过程中起着非常重要的作用。第三，仅仅对CTC进行计数，忽视了CTC中亚群的重要意义。在最近的研究中显示，一些CTC所具有的特异形貌特征和剪接变异体的表达与肿瘤内脏转移和癌症抗药性有关联。这些发现都指出CTC作为肿瘤标志物，不仅仅用来计数。第四，将血液样品先固定化再进行检测的方法会限制分离CTC后下游的分子的分析研究。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种捕获和释放肿瘤细胞的微流体系统的制备方法、微流体装置及其应用，以至少解决至少一个上述技术问题。
为实现上述目的，本发明提出了一种捕获和释放肿瘤细胞的微流体系统的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
S1、硅纳米线芯片的制备：在硅基底上旋转涂覆PMMA-A8光阻胶，并通过标准光刻方法限定蚀刻区域，干燥备用；然后通过NH4F/AgNO3试剂引入金属纳米颗粒于所述蚀刻区域，以在所述硅基底上形成纳米离子膜；然后对所述硅基底进行H2O2/NH4F蚀刻，蚀刻时长1～20分钟，依次经过体积之比为45～85:15～55的浓硫酸/双氧水混合溶液和去离子水洗涤，得到具有纳米线的硅纳米线基底；用无水乙醇进一步洗涤，然后于超净环境下进行N2吹干备用；制备质量浓度为0.1～10％的新鲜的3-氨基丙基三乙氧基硅烷的甲苯溶液，并将上述备用的硅纳米线基底浸没于上述甲苯溶液中进行键合反应，至反应完全，无水乙醇清洗，N2吹干，得表面键合3-氨基丙基三乙氧基硅烷的硅纳米线基底；制备质量浓度为20～100ng/mL的新鲜的N-羟基琥珀酰亚胺-PEG-生物素基的PBS溶液，并将上述表面键合3-氨基丙基三乙氧基硅烷的硅纳米线基底浸没于所述PBS溶液中再次进行键合反应，至反应完全，无水乙醇清洗，N2吹干，得硅纳米线芯片；
S2、微流体芯片的制备：设计和打印具有微流体信道区域的微流体通道结构和鱼骨结构的掩模板；在硅材料上旋转涂覆SU-8光刻胶，光刻胶的厚度为10～150um，干燥，然后对准微流体通道结构的掩模板和光刻胶上对应的微流体通道结构的光刻区域，光照，成像得微流体通道结构；于上述硅材料上再次旋转涂覆SU-8光刻胶，光刻胶的厚度为50～200um，干燥，然后对齐鱼骨结构的掩模板和光刻胶上对应的微流体信道的光刻区域，光照，成像得构建在所述微流体通道结构的微流体信道区域的鱼骨结构；清洗并干燥微流体通道结构的光刻胶模板，减压气体蒸镀三氯(1H，1H，2H，2H全氟辛基)硅烷，无尘环境保存；采用Sylgard elastomer试剂盒浇筑上述光刻胶模板，所述微流体通道结构的整体厚度为3～6mm；并将所述微流体通道结构裁切成与所述硅纳米线芯片大小相适配，得所需微流体芯片；
S3、硅纳米线芯片和微流体芯片的组装：将所述微流体芯片上的微流体信道区域对齐所述硅纳米线芯片上蚀刻有硅纳米线的区域，然后通过夹具夹紧所述硅纳米线芯片和所述微流体芯片；
S4、肿瘤细胞的捕获和释放：制备1.0～10.0uM的链霉亲和素的PBS溶液，并覆盖在所述硅纳米线芯片上具有纳米线的区域，静置1～2.5小时；然后用PBS溶液清洗，并在含有多肽分子的PBS溶液中共孵育0.5～4.5小时，清洗，并组装上微流体芯片，以形成微流体系统；然后通入含有肿瘤细胞的模拟样品，以实现肿瘤细胞的捕获；向捕获肿瘤细胞后的微流体系统中通入含有释放剂的微流体，以实现肿瘤细胞的释放和富集。
可选地，所述多肽分子为p-EpCAM和CKAAKN中的一种或其组合。
可选地，所述释放剂为ArgC、AspN、Chymotryosin、GluC、LysargiNase、LysC、LysN、Pepsin、Trypsin中的一种或其组合。
可选地，所述微流体芯片的材料为塑料、橡胶和纤维中的一种或其组合。
可选地，所述夹具的材质为金属材质。
可选地，所述微流体信道设有多个；和/或，
多个所述微流体信道平行设置；和/或，
所述所述微流体信道内部设有鱼骨结构，所述鱼骨结构设有多个。
可选地，多个所述微流体信道的宽度为0.3～3um；和/或，
所述微流体信道的高度为25～130um。
可选地，所述鱼骨结构的的宽度为5～13um；和/或，
所述鱼骨结构的间距为8～15um；和/或，
所述鱼骨结构的高度为10～40um。
本发明还提供一种微流体装置，采用如上所述的捕获和释放肿瘤细胞的微流体系统的制备方法制备而成。
本发明还提供一种如上所述的微流体装置在胰腺癌循环肿瘤细胞捕获和释放中的应用。
相较于现有技术，本发明取得了以下有益效果：
本发明技术方案中，通过构建硅纳米线芯片和微流体芯片，并将此二者组装配合形成容置有纳米线的微流体通道的微流体系统，拟实现在具有肿瘤细胞的血液样品经过该微流体通道时，捕获和富集血液样品中的肿瘤细胞，供病理学研究及进一步分析。具体地，在以传统的硅纳米线生物吸附机理的基础上，通过在纳米线的表面修饰具有特异性识别功能的多肽分子，以特异性识别捕获胰腺癌肿瘤细胞，减小其他细胞的干扰；并进一步结合微流体在经过微流体通道时，由于微流体信道内部设有的鱼骨结构形成的微流混合效应(在纳米线与硅基底接触的表面形成湍流现象，以充分加大血液样品在微流体通道内的移动时长)，实现血液样品中细胞与纳米线的完全接触，这样既降低了对血液样品的量的需求，又实现了对该血液样品中肿瘤细胞全方位的检测和高效率的捕获。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1为本发明微流体装置的工作原理图；
图2为本发明一实施例中纳米线的蚀刻原理图；
图3为本发明一实施例中纳米线实现表面修饰和生物功能化的原理图；
图4为本发明一实施例中硅纳米线芯片的制备流程图；
图5为本发明一实施例中微流体通道结构的和鱼骨结构的结构示意图；
图6为本发明一实施例中不同多肽分子影响CTC捕获效率的结果数据图；
图7为本发明一实施例中不同微流体流速影响CTC捕获效率的结果数据图；
图8为本发明一实施例中微流体系统的干扰试验结果示意图；
图9为本发明一实施例中不同结构和修饰的基底对CTC捕获效率的影响的结果数据图；
图10为本发明一实施例中微流体系统捕获CTC细胞后的电镜图；
图11为本发明一实施例中不同释放剂对微流体系统中捕获的CTC细胞的释放效率的影响的结果数据图；
图12为本发明一实施例中不同浓度释放剂对微流体系统中捕获的CTC细胞的释放效率的影响的结果数据图；
图13为本发明一实施例中不同浓度的chrymortrypsin释放剂对捕获后和释放后的CTC细胞活度的影响的结果数据图；
图14为本发明一实施例中微流体系统在捕获后和释放后CTC细胞活度检测的结果数据图；
图15为本发明一实施例中对临床胰腺癌病人血液中CTC细胞捕获释放后的基因突变检测结果图；
图16为本发明一实施例中微流体装置的装配图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明，若本发明实施例中有涉及方向性指示(诸如上、下、左、右、前、后……)，则该方向性指示仅用于解释在某一特定姿态(如附图所示)下各部件之间的相对位置关系、运动情况等，如果该特定姿态发生改变时，则该方向性指示也相应地随之改变。
另外，若本发明实施例中有涉及“第一”、“第二”等的描述，则该“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。另外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。
实施例1
本发明提出了一种捕获和释放肿瘤细胞的微流体系统的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
S1、硅纳米线芯片的制备：(本实施例采用0.5毫米厚的医用病理石英载玻片为基础)
参见图2至图4，首先，在硅基底上旋转涂覆PMMA-A8光阻胶，并通过标准光刻方法限定蚀刻区域(仅在微流体信道需要覆盖的区域进行蚀刻)，干燥备用；然后通过NH4F/AgNO3试剂引入金属纳米颗粒于所述蚀刻区域，以在所述硅基底上形成纳米离子膜；然后对所述硅基底进行H2O2/NH4F蚀刻，蚀刻时长10分钟，得到纳米线长度为2～5um的纳米线，依次经过体积之比为70:30的浓硫酸/双氧水混合溶液和去离子水洗涤，得到具有纳米线的硅纳米线基底。此时，可以对所述硅纳米线基底进行表面化学修饰和生物功能化，应当理解，由于在此过程中没有引入HF等对环境以及操作者危害巨大的试剂，使得整个制备过程既可以实现对环境的保护，让整个制备流程能在普通的化学实验室中得以完成，又可以实现对成本的节约。
然后，用无水乙醇进一步洗涤上述蚀刻好纳米线的硅纳米线基底，并于超净环境下进行N2吹干备用；制备质量浓度为1％的新鲜的3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)的甲苯溶液，并将上述备用的硅纳米线基底浸没于上述甲苯溶液中进行键合反应，反应2小时，至反应完全，无水乙醇清洗，N2吹干，得表面键合3-氨基丙基三乙氧基硅烷(MPTMS)的硅纳米线基底；制备质量浓度为50ng/mL的新鲜的N-羟基琥珀酰亚胺-PEG-生物素基(NHS-PEGn-Biotin，n＝1000)的PBS溶液，并将上述表面键合3-氨基丙基三乙氧基硅烷的硅纳米线基底浸没于所述PBS溶液中再次进行键合反应，反应2小时，至反应完全，无水乙醇清洗，N2吹干，得硅纳米线芯片。
S2、微流体芯片的制备：
参见图5，本实施例采用PDMS微流体通道结构，设计分型结构，从一个入口逐级分为8条平行的微流体信道，所述微流体信道的长度为20mm，宽度为1mm，深度为100um。所述微流体信道内部设有鱼骨结构，所述鱼骨结构的宽度为10um，高度为30um，间距为10um，以在微流体经过所述微流体信道时，产生垂直微流体信道底部的湍流，从而加强液流流过所述微流体信道时细胞与硅纳米线基底的接触时长，增加结合捕获抗体后的基底与目标细胞的生物粘附性。
具体地，所述微流体通道包括依次连通的第一分型通道、微流体信道和第二分型通道；所述第一分型通道具有连通的一个第一流入端和多个第一流出端，以将所述第一流入端的微流体分流至多个所述第一流出端；所述微流体信道设有多个，多个所述微流体信道的流入端与多个所述第一流出端一一对应连通；所述第二分型通道具有连通的多个第二流入端和一个第二流出端，多个所述微流体信道的流出端与多个所述第二流入端一一对应连通，所述第二分型通道用于将流入多个所述第二流入端的微流体汇聚至所述第二流出端。可选地，所述微流体通道的材料为塑料、橡胶和纤维材料中的一种或其组合。
上述微流体芯片的制备方法如下：
设计和打印具有微流体信道区域的微流体通道结构和鱼骨结构的掩模板；在硅材料上旋转涂覆SU-8光刻胶，光刻胶的厚度为70um，干燥，然后对准微流体通道结构的掩模板和光刻胶上对应的微流体通道结构的光刻区域，光照，成像得微流体通道结构；于上述硅材料上再次旋转涂覆SU-8光刻胶，光刻胶的厚度为100um，干燥，然后对齐鱼骨结构的掩模板和光刻胶上对应的微流体信道的光刻区域，光照，成像得构建在所述微流体通道结构的微流体信道区域的鱼骨结构；清洗并干燥微流体通道结构的光刻胶模板，减压气体蒸镀三氯(1H，1H，2H，2H全氟辛基)硅烷，无尘环境保存；采用Sylgard elastomer试剂盒(所述Sylgard elastomer试剂盒中的184silicone elastomer base和Sylgard 184siliconeelastomer curing ageent的比例为10:1)浇筑上述光刻胶模板，所述微流体通道结构的整体厚度为4.5mm，裁切成适合石英病理载玻片的大小，以便装配，然后在所述微流体通道结构的流入位置和流出位置打孔，得所需微流体芯片，清理备用。
S3、硅纳米线芯片和微流体芯片的组装：
将所述微流体芯片上的微流体信道区域对齐所述硅纳米线芯片上蚀刻有硅纳米线的区域，然后通过夹具夹紧所述硅纳米线芯片和所述微流体芯片。
具体地，其组装步骤入下：
S1、制备5.0uM的链霉亲和素(Streptavidin，SA)PBS溶液200uL，覆盖在蚀刻有纳米线的硅纳米线芯片区域，静置60分钟；
S2、PBS溶液清洗三遍，然后在含有多肽分子的200uL PBS溶液中共孵育1小时，清洗，然后用夹具组装微流体芯片和硅纳米线芯片；
S3、连接进口处和出口处的Tygon流体输送管，并和已经安装在注射泵上的1mL注射器连接。
应当理解，为了增强所述微流体芯片与所述硅纳米线芯片之间的密封性，所述微流体通道的材料采用塑料、橡胶和纤维材料等高分子聚合物中的一种或其组合。
S4、肿瘤细胞的捕获和释放：
参见图1，制备5.0uM的链霉亲和素的PBS溶液，并覆盖在所述硅纳米线芯片上具有纳米线的区域，静置1小时；然后用PBS溶液清洗三次，并在含有p-EpCAM和CKAAAKN多肽分子的200uL PBS溶液中共孵育1小时，清洗，并组装上微流体芯片，以形成微流体系统，用于肿瘤细胞的捕获；通入含有肿瘤细胞的模拟样品，以实现肿瘤细胞的捕获；向捕获肿瘤细胞后的微流体系统中通入含有释放剂的微流体，以实现肿瘤细胞的释放和富集。
实施例2
1)模拟样品的制备
从培养丰度为95％左右的非小细胞肺癌细胞系B*PC3(胰腺癌细胞)培养皿中制备密度为10000/mL的细胞悬浊液(精确计数)，并梯度稀释分选处200/20uL待用溶液，加入180uL含有2*105白细胞悬浊液(细胞都用PBS稀释和配置)，作为200uL模拟样品。
2)捕获CTC的多肽试剂的选择
分别测试p-EpCAM和CKAAAKN多肽分子及其组合对CTC捕获的影响，测试对象为B*PC3代表的胰腺癌细胞。为测试相同浓度下单一抗体和组合抗体在CTC捕获效率上的不同，将制备的血液模拟样品通过荧光染色计数，得到如图6所示的结果数据图。
结果分析：组合抗体对肿瘤细胞的捕获能力更强。
3)最优流速的测试和选择
①实验步骤：
选择实验1)中的模拟样品为测试对象，分别测试0.1mL/h、0.2mL/h、0.5mL/h、1.0mL/h、2.0mL/h和5.0mL/h流速下B*PC3细胞的捕获效率，并得到如图7所述的结果数据图。具体按如下操作步骤进行实验:
a、将200uL模拟样品装入1mL注射器中，连接好系统，按上述流速将模拟样品注射进微流体系统中；
b、注射完毕后，在注射器中装载100uL浓度为2％的PFA(多聚甲醛)溶液，以流速1.0mL/h流经微流体系统，以对捕获的细胞进行固定；
c、拆装微流体系统后，取出硅纳米线载玻片，PBS溶液清洗，然后将制备的5uM细胞角蛋白抗体(anti-pan cytokeratin)和5uM CD45抗体(anti-CD45)混合溶液200uL覆盖在蚀刻有纳米线的硅纳米线芯片区域，4℃下静置24小时，清洗，并用标准方法进行二抗的染色，具体地，采用Alex488标记CK抗体，采用Alex555标记CD45抗体，二抗染色时间为30分钟；然后清洗，并尽量吸取除去表面的溶液残留，然后用含有Hoechest染核试剂的封固液80uL封装，加上盖玻片，进行荧光成像并计数；
d、将成像结果中CK+/CD45-/DAPI+的细胞计数为捕获的癌细胞，通过对比起始加入的癌细胞数目200颗，计算得出相应的捕获效率。
②结果分析。参见图7，可知，在一定微流体流速范围内，随着微流体流速的增加，微流体系统对肿瘤细胞的捕获数目也增加；具体地，在微流体流速为1.0mL/h时，微流体系统对肿瘤细胞的捕获达到最大，捕获的细胞数目接近200个(初始肿瘤细胞数目，也即捕获率接近100％)；在微流体流速超过1.0mL/h时，随着微流体流速的增加，微流体系统对肿瘤细胞的捕获数量逐渐减少。
4)干扰试验
提取健康血液中的白细胞作为干扰细胞2.0*106/mL，制备模拟样品，并比较对于不同类型的癌细胞(B*PC3，Panc-1和AsPC-1)的捕获能力，得到图8所示的结果数据，证明与实际血液中白细胞等量的干扰，不会影响检测的效率。
5)不同结构和修饰的基底对CTC捕获效率的影响
分别制备含有B*PC3，Panc-1和AsPC-1癌细胞的模拟样品，分别于无修饰无纳米线的平整基底、修饰多肽无纳米线的平整基底、无修饰有纳米线的纳米线基底以及有修饰多肽有纳米线的纳米线基底上进行模拟样品的癌细胞的捕获，并得到如图9所示的结果数据图。
结果分析：无修饰无纳米线的平整基底对癌细胞的捕获效率不明显；修饰有多肽但是无纳米线结构的平整基底，对癌细胞具备一定的捕获能力；不修饰多肽分子的具有纳米线结构的纳米线基底对癌细胞的捕获能力大于修饰有多肽但是无纳米线结构的平整基底的捕获能力；修饰多肽且具有纳米线结构的纳米线基底对癌细胞的捕获能力最大。
实施例3
1)临床癌症患者血液样品中CTC的捕获和表型分析：
①临床样品的采血需要用BD Vacutainer Glass ACD Solution A tube 8.5mL，以避免EDTA抗凝对于血液中细胞表面的抗原损伤，导致影响捕获抗体的结合，降低捕获效率；采取抽血的第一管只抽取2mL，不用于测试(以检测因针头刺进血液时脱落上皮细胞，而出现假阳性细胞的现象)。
②以4mL全血为例，本方法采取梯度密度离心对癌症患者血液进行初步纯化。首先加入4mL PBS溶液以对血样进行等体积稀释，混合均匀，然后在已经加入4mL梯度密度离心液(1077)的15mL离心管中缓慢加入稀释后的血液样品；选用300g，40分钟离心，去除血清(黄色)，收取约2～4mL的单核细胞层(PBMC，peripheral blood mononuclear cell)；然后对收取的单核细胞层进一步离心，选用400g，5分钟，去除上清液，用2mL PBS溶液清洗；再次离心、去除上清液，然后加入新鲜制备的5uM细胞角蛋白抗体(anti-pan cytokeratin)和5uM CD45抗体(anti-CD45)的混合溶液400uL，打散细胞聚集，共孵育45分钟；清洗并定容在400uL的PBS溶液中。
③如实施例1中所述，组装好硅纳米线芯片和微流体芯片以形成微流体系统，所述微流体系统的微流体流速为1.0mL/h，捕获用抗体浓度为5.0umol，鱼骨结构高度为30um，纳米线高度为327nm。将上述制备的200uL模拟样品进行两组平行测试，得到如图10所示的结果数据。
2)结果分析。参见图10，可知，本实施例主要针对胰腺癌患者血液中含有的CTC细胞的捕获和荧光染色，对于CTC中存在的表达上皮间质化的CTC表型族群进行了有效的检出和分析，对于转移的早期预警有重要的作用。
实施例4
1)对捕获后的胰腺癌CTC细胞的释放条件的优化：
①不同释放剂对CTC细胞的释放的影响
a、实验步骤：以B*PC3细胞系为研究对象制备模拟样品，并利用微流体系统捕获模拟样品中的CTC细胞，备用；分别用ArgC、AspN、Chymotryosin、GluC、LysargiNase、LysC、LysN、Pepsin、Trypsin 9种不同的多肽分子释放剂富集微流体系统捕获的CTC细胞，对应地，9组用以释放剂富集CTC细胞的微流体系统于相同环境下捕获CTC细胞，以确保用于每一组释放剂的微流体系统的CTC细胞捕获的数量相同。其中，每组释放剂的浓度相同，均采用0.25％200uL的溶液；含有释放剂的微流体的冲洗速度相同，均为1.0mL/h。得到如图11所示的结果数据图。
b、结果分析：9种释放剂对微流体系统捕获的CTC细胞均有释放作用，其对CTC细胞的释放效率超过65％。其中，Chymotryosin释放剂和Trypsin释放剂对CTC细胞的释放效率最高，其释放效率高达90％。
②不同释放剂浓度对CTC细胞释放的影响
a、实验步骤：选用不同浓度的Chymotryosin和Trypsin两种释放剂进行微流体系统捕获的CTC细胞释放效率测定。具体操作步骤参见实验①所述，在此不再一一赘述，得如图12所示的结果数据图。
b、结果分析：参见图12，在一定浓度范围值内，随之释放剂浓度的提高，CTC细胞的释放效率也逐步提高；在最优浓度值后，随着释放剂浓度的进一步增大，对微流体系统CTC细胞的释放效率几乎没有影响。具体的，在浓度为0.5％200uL的微流体释放剂溶液中，CTC细胞的释放效率达到最高，此时CTC细胞的释放效率可达90％以上。
③不同浓度释放剂对于CTC细胞释放效率和释放后CTC活度的影响
a、实验步骤：选用不同浓度的Chymotryosin释放剂进行微流体系统CTC细胞的释放效率和释放后CTC细胞活度(AO/EB染色)的测定。具体操作步骤参见实验①所述，在此不再一一赘述，得如图13所示的结果数据图。
b、结果分析：参见图13，随着释放剂浓度的增大，CTC细胞的释放效率逐渐降低，CTC细胞释放后的活度逐渐增大。较优地，在Chymotryosin释放剂浓度为1％时，具有较大的CTC细胞释放效率和CTC细胞释放后的活度。
④捕获CTC细胞和释放CTC细胞后活度的变化
a、实验步骤：在实验③中，分别对捕获后的CTC细胞的活度以及释放后的CTC细胞的活度进行测定，得如图14所示的结果数据图。
b、结果分析：参见图14，捕获后的CTC细胞和释放后的CTC细胞均具有很高的活度，两者的活度均能达到93％以上，具备病理学研究的细胞活性条件。并且，CTC细胞通过释放剂剪切富集后具有更高的细胞纯度，更利于研究分析。
2)对释放的胰腺癌CTC细胞的基因检测应用：
实验步骤：本实施例对6个样本进行测试分析(其中，包含5个胰腺癌病人和1个健康病人)进行测试。然后如实施例1中所述，组装好硅纳米线芯片和微流体芯片以形成微流体系统，所述微流体系统的微流体流速为1.0mL/h，捕获用抗体浓度为5.0umol，鱼骨结构高度为30um，纳米线高度为327nm。并通过组装好的微流体系统收集释放出的CTC细胞悬浮液，所述释放剂为Chymotryosin，所述释放剂的浓度为1.0％。中和、清洗，CTC血细胞沉积，然后使用WGA4单细胞全基因组扩增试剂盒进行DNA提取和扩增；然后针对胰腺癌标志性基因KRAS进行扩增和Sanger测序，得到如图15所示的结果数据。
结果分析：参见图15，两种KRAS亚型在5个胰腺癌患者中都有检出，而健康人样本中没有检出。可知，胰腺癌病人血液中含有的CTC细胞可以通过本方法进行富集，且其携带的KRAS基因突变可以实现快速检出。本方法为以CTC细胞为基础的液体活检提供了无创实时以及操作简单，且结果准确。
本发明还提供一种微流体装置，所述微流体装置采用如上所述的微流体系统的制备方法制备而成。具体地，所述微流体装置的结构示意图如图16所示。
以上所述仅为本发明的可选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种捕获和释放肿瘤细胞的微流体系统的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
S1、硅纳米线芯片的制备：在硅基底上旋转涂覆PMMA-A8光阻胶，并通过标准光刻方法限定蚀刻区域，干燥备用；然后通过NH4F/AgNO3试剂引入金属纳米颗粒于所述蚀刻区域，以在所述硅基底上形成纳米离子膜；然后对所述硅基底进行H2O2/NH4F蚀刻，蚀刻时长1～20分钟，依次经过体积之比为45～85:15～55的浓硫酸/双氧水混合溶液和去离子水洗涤，得到具有纳米线的硅纳米线基底；用无水乙醇进一步洗涤，然后于超净环境下进行N2吹干备用；制备质量浓度为0.1～10％的新鲜的3-氨基丙基三乙氧基硅烷的甲苯溶液，并将上述备用的硅纳米线基底浸没于上述甲苯溶液中进行键合反应，至反应完全，无水乙醇清洗，N2吹干，得表面键合3-氨基丙基三乙氧基硅烷的硅纳米线基底；制备质量浓度为20～100ng/mL的新鲜的N-羟基琥珀酰亚胺-PEG-生物素基的PBS溶液，并将上述表面键合3-氨基丙基三乙氧基硅烷的硅纳米线基底浸没于所述PBS溶液中再次进行键合反应，至反应完全，无水乙醇清洗，N2吹干，得硅纳米线芯片；
S2、微流体芯片的制备：设计和打印具有微流体信道区域的微流体通道结构和鱼骨结构的掩模板；在硅材料上旋转涂覆SU-8光刻胶，光刻胶的厚度为10～150um，干燥，然后对准微流体通道结构的掩模板和光刻胶上对应的微流体通道结构的光刻区域，光照，成像得微流体通道结构；于上述硅材料上再次旋转涂覆SU-8光刻胶，光刻胶的厚度为50～200um，干燥，然后对齐鱼骨结构的掩模板和光刻胶上对应的微流体信道的光刻区域，光照，成像得构建在所述微流体通道结构的微流体信道区域的鱼骨结构；清洗并干燥微流体通道结构的光刻胶模板，减压气体蒸镀三氯(1H，1H，2H，2H全氟辛基)硅烷，无尘环境保存；采用Sylgardelastomer试剂盒浇筑上述光刻胶模板，所述微流体通道结构的整体厚度为3～6mm；并将所述微流体通道结构裁切成与所述硅纳米线芯片大小相适配，得所需微流体芯片；
S3、硅纳米线芯片和微流体芯片的组装：将所述微流体芯片上的微流体信道区域对齐所述硅纳米线芯片上蚀刻有硅纳米线的区域，然后通过夹具夹紧所述硅纳米线芯片和所述微流体芯片；
S4、肿瘤细胞的捕获和释放：制备1.0～10.0uM的链霉亲和素的PBS溶液，并覆盖在所述硅纳米线芯片上具有纳米线的区域，静置1～2.5小时；然后用PBS溶液清洗，并在含有多肽分子的PBS溶液中共孵育0.5～4.5小时，清洗，并组装上微流体芯片，以形成微流体系统；然后通入含有肿瘤细胞的模拟样品，以实现肿瘤细胞的捕获；向捕获肿瘤细胞后的微流体系统中通入含有释放剂的微流体，以实现肿瘤细胞的释放和富集。
2.如权利要求1所述的捕获和释放肿瘤细胞的微流体系统的制备方法，其特征在于，所述多肽分子为p-EpCAM和CKAAKN中的一种或其组合。
3.如权利要求2所述的捕获和释放肿瘤细胞的微流体系统的制备方法，其特征在于，所述释放剂为ArgC、AspN、Chymotryosin、GluC、LysargiNase、LysC、LysN、Pepsin、Trypsin中的一种或其组合。
4.如权利要求1至3任一项所述的捕获和释放肿瘤细胞的微流体系统的制备方法，其特征在于，所述微流体芯片的材料为塑料、橡胶和纤维中的一种或其组合。
5.如权利要求4所述的捕获和释放肿瘤细胞的微流体系统的制备方法，其特征在于，所述夹具的材质为金属材质。
6.如权利要求1至3任一项所述的捕获和释放肿瘤细胞的微流体系统的制备方法，其特征在于，所述微流体信道设有多个；和/或，
多个所述微流体信道平行设置；和/或，
所述所述微流体信道内部设有鱼骨结构，所述鱼骨结构设有多个。
7.如权利要求6所述的捕获和释放肿瘤细胞的微流体系统的制备方法，其特征在于，多个所述微流体信道的宽度为0.3～3um；和/或，
所述微流体信道的高度为25～130um。
8.如权利要求6所述的捕获和释放肿瘤细胞的微流体系统的制备方法，其特征在于，所述鱼骨结构的的宽度为5～13um；和/或，
所述鱼骨结构的间距为8～15um；和/或，
所述鱼骨结构的高度为10～40um。
9.一种微流体装置，其特征在于，采用如权利要求1至8任一项所述的捕获和释放肿瘤细胞的微流体系统的制备方法制备而成。
10.一种如权利要求9所述的微流体装置在胰腺癌循环肿瘤细胞捕获和释放中的应用。
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