CN113976195A - 一种用于外泌体分离富集的微流控芯片,以及一种外泌体表面蛋白的分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于外泌体分离富集的微流控芯片,以及一种外泌体表面蛋白的分析方法,所述微流控芯片由含有微通道的PDMS层与玻璃片层粘合而成,所述微流控芯片包括:两个进样口,一个出样口,以及一个用于外泌体捕获的微室,所述微室中包含由若干水滴状微柱组成的阵列结构。所述方法包括:外泌体的分离富集和外泌体表面蛋白的分析。本发明操作简便易推广,有望在评估癌症进展、实时检测和预后评估、个体化治疗等方面提供一个有效的技术平台。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域,更具体地涉及一种用于外泌体分离富集的微流控芯片,以及一种外泌体表面蛋白的分析方法。
背景技术
外泌体(Exosomes)在肿瘤细胞微环境的胞间通讯中发挥着特殊的作用。这些纳米尺度的膜囊泡粒径一般在30-150nm之间,表面携带大量与其来源和功能密切相关的蛋白质和脂质成分,腔内部包含有DNA、microRNA、mRNA和胞质蛋白,是细胞间交流和信号转导的一种载体。肿瘤细胞分泌的外泌体进入前哨淋巴结后发出分子信号,影响肿瘤细胞的招募、细胞外基质的沉积和血管的增生,为肿瘤的侵袭转移创造了有利的环境。血液中肿瘤来源的外泌体含量随着肿瘤的生长而增加、同时随着癌症的有效治愈而下降,它们在体液特别是血液中丰度高且稳定,能够灵敏的反应出肿瘤当前的实际状态。和研究的较为深入的循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells,CTCs)相比,肿瘤细胞分泌外泌体的行为更为活跃,在血液中的含量≥109个/毫升(远远大于CTCs的浓度1-10个/毫升)。由于血液中微乎其微的CTCs对检测技术的要求很高,需要消耗过量珍贵的临床样本,所以外泌体被认为是很多疾病“液体活检”的新一代生物标志物,特别适合一些当前技术水平下难以分离CTCs的癌症的早期诊断。肝癌早期没有典型症状,确诊时多属中晚期,且复发率高达60%。肝癌来源外泌体相关的分析有望为评估癌症进展、实时检测和预后评估、个体化治疗等提供快速的非手术指标。除此之外,分离出的肿瘤外泌体表面蛋白可进一步用于遗传和生物分析,为我们提供一个癌症特异性信息的宝库。
由于外泌体极小的粒径和较宽的粒径分布限制了其识别和定量的准确性和灵敏度,极易产生假阴性结果,外泌体检测技术通常需要初步分离富集和识别分析两个阶段。然而要想在众多尺寸大小接近的膜衍生亚细胞结构(例如脱落小体、凋亡小体、核外颗粒体等)中分离这些变化多样的纳米尺度外泌体囊泡同样存在诸多困难。目前富集体液和细胞培养液中外泌体的方法有超速离心法、分子排阻层析、沉淀法、表面蛋白标记亲和分离方法等。超速离心法是外泌体浓缩的最为经典的方法,它包括离心速度高达200000g的差速离心步骤,需要使用常规医学实验室不具备的昂贵仪器设备,操作繁琐耗时。这种方法不仅回收率较低(5–25%),很难将外泌体同其他细胞外膜泡(Extracellular Vesicles,EVs)彻底分离开来,而且长时间超高速的离心会破坏外泌体的完整性,使其丧失大量蛋白和RNAs。在此基础上发展而来的蔗糖梯度离心法,利用不同浓度蔗糖溶液产生的梯度使外泌体在离心过程中沉降到相应的等密度区,从而获得较高纯度的抽提外泌体。然而这种方法的样品准备过程繁杂,在耗费大量时间的同时也提高了运行成本。基于分子排阻层析分离的商品化试剂盒,实现了外泌体的简便分离和纯化,但是它们往往需要漫长的过夜孵育步骤且价格昂贵,如用于细胞培养液中外泌体分离的ExoQuickTM和Total Exosome IsolationTM等产品。沉淀法是根据外泌体膜疏水的特性,使用疏水的化学物质(例如聚乙二醇,PEG)进行沉淀富集,可以实现低成本、高效快速的外泌体分离。但是生物样品中常共存有大量蛋白质,PEG沉淀的外泌体中不可避免地会存在蛋白质共沉淀,因此后续的清洗步骤对于外泌体蛋白质的可靠鉴定十分重要。
当前针对分离提纯后的外泌体进行特征分析的传统手段主要有纳米颗粒跟踪分析(Nanoparticle Tracking Analysis,NTA)、动态光散射(Dynamic light scattering,DLS)、流式细胞术(Flow cytometry)、透射电镜(Transmission electron microscope,TEM)、酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)等。NTA技术是近些年新兴的一种表征纳米颗粒的方法,它通过光学显微镜和软件追踪并分析纳米颗粒的布朗运动,从而计算出纳米颗粒的流体力学半径和浓度。它可以实时观察外泌体的活性,有利于表征蛋白聚合和分解的状态,已经成为外泌体定量技术中最为流行的技术之一。但它还是存在重现性不高的致命缺陷,由于在测试中需要手动调节仪器和软件来消除偏差,对操作者的经验和技能都提出了较高要求,浪费时间的同时也极易带来误差。TEM和DLS都是广泛应用的纳米颗粒表征形貌和粒径分布的技术手段,但由于其仪器的固有属性较难实现高通量的外泌体分析。流式细胞术可进行高通量的细胞分析,然而当它面对比细胞小100倍的外泌体时分辨率还是有所欠缺。
2012年来自麻省综合医院和哈佛医学院的Weissleder和Lee课题组在Naturemedicine杂志上报道了一种可灵敏分析特异性磁粒子标记的外泌体的微型化核磁共振平台(μNMR);随后的2014年他们在Nature biotechnology杂志上发表了基于表面等离子体共振(Surface Plasmon Resonance,SPR)技术的外泌体传感研究,采用包被有不同亲和配体的纳米孔阵列来捕获特定类型的外泌体,耗样量极少且满足了大规模平行实验的需求;2016年他们又在ACS nano杂志上报道了可用来进行外泌体分析的磁力-电化学平台,这种结合了免疫磁珠富集和酶信号放大的微型传感器可实现高度灵敏和特异性的高通量外泌体检测。除此之外,国内外其他课题组也相继报道了一些将外泌体分析和这类传统检测工具相结合的研究成果,这类研究的不断涌现,不仅丰富了外泌体定量分析的工具,还进一步引领了外泌体相关的研究工作向微型化的道路上发展趋势。
微流控芯片作为一种新颖的技术平台,近年来凭借其集成化程度高、液体流动可控等优势,已逐渐支撑起细胞分选和操控等相关研究的半壁江山。微流控芯片通道尺寸在微米量级和细胞尺寸匹配,可以灵活的将细胞培养、分选和检测等基本操作单元集成到一块几平方厘米的芯片上,非常适合进行细胞分析。根据分离的作用力或者机理不同,微流控细胞分离技术一般可分为主动式和被动式。主动分离法利用外部力场(如电场、磁场和超声等)具有分离效率高、特异性好、参数可精确控制等优点,但同时也存在制作工艺和样品标记复杂、可能改变细胞正常的形态和理化性质等问题。被动分离法利用微通道几何设计和流体水动力等方法进行筛选,需要合理的结构设计来实现高通量的分离。
近年来,越来越多的研究者尝试将微流控技术应用于外泌体的捕获和分选上,例如2010年哈佛医学院的Irimia课题组首次报道了用微流控分离外泌体的平台,他们通过微通道中功能化的anti-CD63成功捕获到血清中的外泌体。密歇根大学的Kanwar等人设计了一种由多个窄通道相连的循环微室结构增加样品和anti-CD63的混合度。澳大利亚昆士兰大学的Trau课题组报道了一种在微流控装置中借助交流电流体动力(ac-EHD)的作用高特异性捕获和检测多种外泌体的方法。这种电流体动力诱导的剪切力造成样品在电极表面纳米级别的侧向液流,增加靶外泌体和通道中修饰的抗体之间的碰撞从而带来特定的捕获。这些改进措施提高了样品的混合以及捕获效率,却依然受制于操纵时有效接触面积和抗体固定密度。
正如前文所述,在诸多亲和纯化外泌体的方法中,当前最为常用的是基于外泌体表面蛋白(CD9、CD63、CD81等)特定的抗体进行外泌体的捕获。但是这些方法很难在温和的洗脱条件下分离抗体或外泌体结合分子,洗脱后的外泌体易受损伤破坏了其完整性,不利于后续外泌体功能的综合分析,因此非常有必要发展一些能完整分离高度纯化的外泌体的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于外泌体分离富集的微流控芯片,以及一种外泌体表面蛋白的分析方法,从而解决现有技术中缺乏一种能完整分离高度纯化的外泌体并对外泌体表面蛋白进行分析的方法的问题。
为了解决上述技术问题,本发明采用以下技术方案:
根据本发明的第一方面,提供一种用于外泌体分离富集的微流控芯片,所述微流控芯片由含有微通道的PDMS层与玻璃片层粘合而成,所述微流控芯片包括:两个进样口,一个出样口,以及一个用于外泌体捕获的微室,所述微室中包含由若干水滴状微柱组成的阵列结构。
优选地,所述微柱的高度为60-80μm,任意两相邻微柱间的距离为90-150μm。
特别优选地,所述微柱的高度为70μm,任意两相邻微柱间的距离为120μm。
根据本发明的第二方面,提供一种外泌体表面蛋白的分析方法,包括:外泌体的分离富集:利用磁珠修饰的Ca2+离子依赖性的磷脂酰丝氨酸结合蛋白和外泌体表面暴露出的磷脂酰丝氨酸特异性结合原理,在微流控芯片中利用水滴状微柱阵列结构有效提高磁珠和外泌体的碰撞机会,从而实现外泌体的快速、高特异性识别,然后在金属离子螯合剂的作用下将外泌体从磁珠上洗脱下来,实现外泌体的分离富集;以及外泌体表面蛋白的分析:构建一种基于多种核酸适配体及苝四酸二酰亚胺衍生物的信号开关策略,针对分离富集的外泌体,进行外泌体表面蛋白的表达量的分析。
所述外泌体的分离富集包括以下步骤:S1,提供一种微流控芯片:所述微流控芯片包括用于捕获外泌体的微室,所述微室中具有通过若干个水滴状微柱组成的阵列结构,并采用含有BSA的封闭液对所述微流控芯片中的通道和微柱表面进行封闭处理;S2,制备预偶联Tim4蛋白磁珠:将链霉亲和素磁珠与生物素修饰的鼠源Tim4蛋白在缓冲液中孵育制得预偶联Tim4蛋白磁珠;S3,预偶联Tim4蛋白磁珠的预吸附:以一定流速将步骤S2制备的预偶联Tim4蛋白磁珠进样到步骤S1提供的微流控芯片中,并在所述微流控芯片底部放置磁铁,使所述预偶联Tim4蛋白磁珠均匀吸附在微柱区域;S4,外泌体的分离富集:以同样流速将含有外泌体的样品进样到所述微流控芯片中,使外泌体与预偶联Tim4蛋白磁珠在微室中相结合形成Tim4磁珠-外泌体;S5,外泌体的洗脱:以一定流速将清洗缓冲液进样到所述微流控芯片中,并移去所述磁铁,使所述Tim4磁珠-外泌体从所述微室中流出,然后采用洗脱液将外泌体从磁珠上洗脱下来。
步骤S1中,所述微流控芯片包括两个进样口,以及一个出样口。
步骤S3中,通过显微镜观察磁珠快要流到出样口的时候再加磁铁,使磁珠均匀吸附在微柱区域。
步骤S3和步骤S4中,预偶联Tim4蛋白磁珠与含有外泌体的样品的流速为0.1~1.5μL/min。
步骤S3和步骤S4中,预偶联Tim4蛋白磁珠与含有外泌体的样品的流速为0.25μL/min时,外泌体的捕获效率最高。
所述外泌体表面蛋白的分析包括:将核酸适配体与纯化后的外泌体孵育10~30min,随后加入PTCDI复合物并孵育10~30min,测量496nm激发波长下的荧光,所述外泌体表面蛋白的表达量与加入外泌体前后的荧光强度差值线性相关。
所述外泌体的膜表面不少于6种表面蛋白可用该方法进行分析并取得理想效果,包括:CD63,PD-L1,Nucleolin,EpCAM,PTK-7,PSMA。
通过更换不同蛋白的核酸适配体,实现外泌体表面不同蛋白的表达量分析。
应当知晓的是,PTCDI复合物是本实验室参考已有文献(Angew.Chem.Int.Ed.2010,49,1485–1488)合成保存的,其全称为苝四酸二酰亚胺衍生物(Perylene tetracarboxylic acid diimide derivatives)。
正如本发明的背景技术部分所述,当前在微流控芯片或常规体系中,亲和纯化外泌体的方法常用的是基于外泌体表面蛋白(CD9、CD63、CD81等)特定的抗体进行外泌体的捕获。但是这些方法很难在温和的洗脱条件下分离抗体或外泌体结合分子,洗脱后的外泌体易受损伤破坏了其完整性,不利于后续外泌体功能的综合分析。
首先,根据本发明提供的一种外泌体的分离富集方法,通过设计一种新颖的微流控芯片微柱结构,并利用磁珠修饰的Ca2+离子依赖性的磷脂酰丝氨酸结合蛋白和外泌体表面暴露出的磷脂酰丝氨酸特异结合,从而实现外泌体的高效特异性捕获,具有较高的捕获效率。此外,该微流控芯片所需的样品量极少,在两小时内可完成整个处理过程,在进行血样分析的时候具有很大的优势。
其次,根据本发明提供的外泌体表面蛋白分析方法,基于苝四酸二酰亚胺的衍生物(PTCDI复合物)的信号开关策略进行外泌体表面蛋白表达量的分析时,可灵活更换不同蛋白的核酸适配体进行表达量的分析,荧光信号灵敏度高,不需要复杂的样品处理及反应条件,成本低廉,反应速度快。
综上所述,根据本发明提供的一种外泌体的分离富集以及表面蛋白分析方法,操作简便易推广,有望在评估癌症进展、实时检测和预后评估、个体化治疗等方面提供一个有效的技术平台。
附图说明
图1是根据本发明的一个优选实施例提供的微流控芯片的平面图;
图2是根据本发明的一个优选实施例提供的微流控芯片的使用状态示意图;
图3示出了外泌体在不同情况下的捕获效果,其中,A为不同流速下微流控芯片中外泌体的捕获效率,B为不同流速下微流控芯片纯化外泌体的释放效率,C为该芯片最优的捕获效率与商品化试剂盒对比,D为该芯片对不同细胞来源外泌体的捕获效率对比;
图4示出了不同核酸适配体用来检测纯化后外泌体表面蛋白表达的标准工作曲线,其中,A-F分别示出了CD63,PD-L1,Nucleolin,EpCAM,PTK-7,PSMA这六种蛋白的实验数据。
具体实施方式
以下结合具体实施例,对本发明做进一步说明。应理解,以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。
实施例1微流控芯片的制备
如图1所示,为根据本发明的一个优选实施例提供的微流控芯片100,该微流控芯片100由含有微通道的PDMS层与玻璃片层粘合而成,该PDMS层上有一个用于外泌体捕获的微室10,两个进样口20,一个出样口30,微室10中包含由若干“水滴状”的微柱40组成的阵列结构,该微柱40的高度为60-80μm,任意两微柱40间的距离为90-150μm,这样的微柱设计能够使液体在纳米尺度微通道中不断交叉混合,从而有效提高磁珠和外泌体的碰撞几率,进而提高外泌体的捕获效率。
如图2所示,为根据本发明的一个优选实施例提供的微流控芯片的使用状态示意图,在将PDMS层和玻璃片层粘合好以后,提供一种微流控装置,该装置包括依次连接的进样泵、微量注射器、微流控芯片、废液及样品收集管,其中,微流控芯片100下方还设置一块磁铁200。优选地,采用LSP04-1A进样泵。
为了防止在通道内发生非特异性吸附或生成气泡,在实验前需采用封闭液(2.5w/w%BSA,0.01w/w%Tween-20,1×PBS)对PDMS微通道的表面进行封闭处理,具体地,将封闭液以1μL/min的进样速度进样到该微流控芯片中使其充满整个通道,处理15~30min后将封闭液排出去,应当理解的是,该封闭处理是对整个通道及微柱表面进行修饰。
实施例2预偶联Tim4蛋白磁珠的制备
称取0.15mg链霉亲和素磁珠(购自Wako公司,日本)和0.25μg的生物素修饰的鼠源Tim4蛋白(购自Wako公司,日本),在400μL缓冲液(20mM Tris-HCl,pH 7.4,2mM CaCl2,150mM NaCl,0.0005%Tween20)中孵育20分钟,以获得预偶联Tim4蛋白磁珠。然后,用清洗缓冲液洗三次,并用200μL的缓冲液重悬以进行下一步的实验。应当理解的是,在该比例下Tim4蛋白过量,反应后未结合的Tim4蛋白会被清洗掉。
实施例3外泌体的分离富集
进行外泌体捕获实验的时候,首先,将预偶联Tim4蛋白磁珠以0.25μL/min的流速进样到微室,操作的时候通过显微镜观察到磁珠马上流到出样口的时候,将磁铁放置到微流控芯片下方,使其覆盖整个微柱区域,从而使预偶联Tim4蛋白磁珠均匀吸附在整个微柱区域。
然后,通过进样泵将含有外泌体的样品以0.25μL/min的流速精确地注入微流控芯片中,应当理解的是,含有外泌体的样品可以是简单预处理的细胞上清液或者血清。无论是预偶联Tim4蛋白磁珠,还是样品,均通过两个进样口同时注入,这样分散性更好。通过两种液体的流动差异以获得更好的分散性。外泌体与预偶联Tim4蛋白磁珠相结合形成Tim4磁珠-外泌体。
随后,将清洗缓冲液(20mM Tris-HCl,pH 7.4,150mM NaCl,0.0005%Tween20,2mMCaCl2)以3μL/min的进样速度进样到芯片中,10min后移去磁铁,将清洗缓冲液的流速提高至10μL/min,Tim4磁珠-外泌体随着清洗缓冲液被移至离心管中。最后,采用包含有金属离子螯合剂的洗脱液(20mM Tris-HCl,pH 7.4,150mM NaCl,2mM EDTA)将外泌体从磁珠上洗脱下来,用于后续表面蛋白的分析。
参见图3:结果A显示样品的流速为0.25μL/min时外泌体的捕获效率最高;结果B显示外泌体的释放效率随着流速降低而减小,最优的捕获效率大于80%;结果C显示本发明方法比商品化试剂盒的捕获效率高;结果D显示该芯片对不同细胞来源外泌体的捕获效率对比,L-02为正常肝细胞,结果说明该方案针对肿瘤细胞的捕获效率更高,说明其适用范围为肿瘤细胞来源外泌体。
实施例4外泌体表面蛋白分析的原理及方法
苝四酸二酰亚胺的衍生物(即PTCDI复合物)为本实验室预先制备保存。在本实施例中,首先,将7.5μM,20μL核酸适配体与实施例3中纯化后的外泌体共同孵育20min,随后向该核酸适配体和外泌体孵育后的混合液中加入PTCDI复合物(50μM,300μL)并孵育20min,随后测496nm激发波长下的荧光值变化。即分别测量包含核酸适配体和PTCDI复合物的混合液(荧光恢复前),以及核酸适配体、外泌体和PTCDI复合物的混合液(荧光恢复后)的荧光值,即有外泌体时荧光值的变化。应当理解的是,外泌体表面蛋白的表达量与加入外泌体前后的荧光强度差值线性相关。核酸适配体和PTCDI复合物的混合液在加入外泌体之前,荧光强度较低,核酸适配体和PTCDI复合物的混合液加入外泌体之后,荧光强度变强,这种荧光强度的变化在一定程度上显示了外泌体表面蛋白的表达量。外泌体表面蛋白的表达量越高,则检测到的荧光强度值越高。
PTCDI荧光信号变化的原理为:PTCDI复合物含有两个正电荷,阳离子PTCDI作为荧光探针,在水溶液中PTCDI能够以单体形式存在,显示出很强的荧光效应,由于核酸适配体本质上是一段寡核苷酸序列,核酸链带负电荷,它能在静电相互作用下引起带正电荷的PTCDI聚集,导致荧光淬灭;当适配体核酸与外泌体孵育之后,对PTCDI的结合能力下降,检测到的荧光发射强度即随外泌体浓度的增加而梯度上升。
本发明通过选择使用几种肿瘤细胞中常见蛋白的核酸适配体,来验证该方案用来分析外泌体表面蛋白的可行性。如图4所示,本实施例中分别选取了肝癌细胞HepG2细胞上表达的六种蛋白:CD63,PD-L1,Nucleolin,EpCAM,PTK-7,PSMA,针对这六种蛋白,其荧光信号均随着外泌体浓度的升高而增高,足以说明蛋白表达量与荧光信号之间具有良好的线性关系。
以上所述的,仅为本发明的较佳实施例,并非用以限定本发明的范围,本发明的上述实施例还可以做出各种变化。凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰,皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。
Claims (10)
1.一种用于外泌体分离富集的微流控芯片,其特征在于,所述微流控芯片由含有微通道的PDMS层与玻璃片层粘合而成,所述微流控芯片包括:两个进样口,一个出样口,以及一个用于外泌体捕获的微室,所述微室中包含由若干水滴状微柱组成的阵列结构。
2.根据权利要求1所述的微流控芯片,其特征在于,所述微柱的高度为60-80μm,任意两相邻微柱间的距离为90-150μm。
3.一种外泌体表面蛋白的分析方法,其特征在于,包括:
外泌体的分离富集:利用磁珠修饰的Ca2+离子依赖性的磷脂酰丝氨酸结合蛋白和外泌体表面暴露出的磷脂酰丝氨酸特异性结合原理,在微流控芯片中利用水滴状微柱阵列结构有效提高磁珠和外泌体的碰撞机会,从而实现外泌体的快速、高特异性识别,然后在金属离子螯合剂的作用下将外泌体从磁珠上洗脱下来,实现外泌体的分离富集;以及
外泌体表面蛋白的分析:构建一种基于多种核酸适配体及苝四酸二酰亚胺衍生物的信号开关策略,针对分离富集的外泌体,进行外泌体表面蛋白的表达量的分析。
4.根据权利要求3所述的分析方法,其特征在于,所述外泌体的分离富集包括以下步骤:
S1,提供一种根据权利要求1~2中任意一项所述的微流控芯片,并采用含有BSA的封闭液对所述微流控芯片中的通道和微柱表面进行封闭处理;
S2,制备预偶联Tim4蛋白磁珠:将链霉亲和素磁珠与生物素修饰的鼠源Tim4蛋白在缓冲液中孵育制得预偶联Tim4蛋白磁珠;
S3,预偶联Tim4蛋白磁珠的预吸附:以一定流速将步骤S2制备的预偶联Tim4蛋白磁珠进样到步骤S1提供的微流控芯片中,并在所述微流控芯片底部放置磁铁,使所述预偶联Tim4蛋白磁珠均匀吸附在微柱区域;
S4,外泌体的分离富集:以同样流速将含有外泌体的样品进样到所述微流控芯片中,使外泌体与预偶联Tim4蛋白磁珠在微室中相结合形成Tim4磁珠-外泌体;
S5,外泌体的洗脱:以一定流速将清洗缓冲液进样到所述微流控芯片中,并移去所述磁铁,使所述Tim4磁珠-外泌体从所述微室中流出,然后采用洗脱液将外泌体从磁珠上洗脱下来。
5.根据权利要求4所述的分析方法,其特征在于,步骤S1中,所述微流控芯片包括两个进样口,以及一个出样口。
6.根据权利要求4所述的分析方法,其特征在于,步骤S3和步骤S4中,预偶联Tim4蛋白磁珠与含有外泌体的样品的流速为0.1~1.5μL/min。
7.根据权利要求6所述的分析方法,其特征在于,步骤S3和步骤S4中,预偶联Tim4蛋白磁珠与含有外泌体的样品的流速为0.25μL/min时,外泌体的捕获效率最高。
8.根据权利要求4所述的分析方法,其特征在于,所述外泌体表面蛋白的分析包括:将核酸适配体与纯化后的外泌体孵育10~30min,随后加入PTCDI复合物并孵育10~30min,测量496nm激发波长下的荧光,所述外泌体表面蛋白的表达量与加入外泌体前后的荧光强度差值线性相关。
9.根据权利要求8所述的分析方法,其特征在于,所述外泌体膜表面不少于6种表面蛋白可用该方法进行分析并取得理想效果,包括:CD63,PD-L1,Nucleolin,EpCAM,PTK-7,PSMA。
10.根据权利要求9所述的分析方法,其特征在于,通过更换不同蛋白的核酸适配体,实现外泌体表面不同蛋白的表达量分析。
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