KR101490881B1 - 표적 특이적 리간드가 결합된 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드를 이용한 표적 세포의 분리 및 배양 방법 - Google Patents

표적 특이적 리간드가 결합된 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드를 이용한 표적 세포의 분리 및 배양 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 표적 특이적 리간드가 결합된 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드를 이용한 표적 세포의 분리 및 배양 방법을 제공한다.
본 발명에 따라 표적 특이적 리간드가 결합된 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드를 이용하면 표적 세포의 분리가 신속하고 간단하면서도 특이적이고 효율적으로 분리할 수 있어 여러 다양한 세포가 혼합되어 있는 시료로부터 원하는 특정 세포를 분리하기 위한 분리 방법 또는 세포 분리 장치의 개발에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

표적 특이적 리간드가 결합된 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드를 이용한 표적 세포의 분리 및 배양 방법{A method for isolating and culturing target cells using target-specific ligands-bound biocompatible polymer nanofiber scaffold}
본 발명은 표적 특이적 리간드가 결합된 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드를 이용한 표적 세포의 분리 및 배양 방법에 관한 것이다.
세포의 분리는 질병의 진단이나 치료에 있어서 생물학적 또는 생의학적인 적용 등의 다양한 분야에 매우 중요한 기술 중 하나로서, 다양한 세포의 혼합으로부터 원하는 특정 세포를 분리하기 위해 사용이 증가하고 있다 (McCloskey KE, et al ., Anal Chem, 75(24):6868, 2003; McCloskey KE, et al., Biotechnol Prog, 19(3):899, 2003). 따라서 이러한 중요성 때문에 현재 많은 연구 그룹에서 세포 분리의 기술과 관련한 많은 연구를 진행 중에 있다. 비중이 서로 다른 세포를 분리하는 경우에는 속도 침강법에 의해 분리할 수 있으며, 세포의 차이가 거의 없는 경우에는 형광항체로 염색한 정보 또는 직접 현미경 관찰을 통한 정보로 세포를 분리할 수 있다. 예를 들어, 형광색소로 표지하여 표지의 강약에 따라 세포를 분획하여 특정의 세포집단을 분리하여 채취하는 세포분별장치(cellsorter)(Kamarck, M.E., Methods Enzymol ., 151:150, 1987)가 이용되고, 최근에는 마이크로 가공기술을 이용해서 만든 미세한 유로에 생긴 층류(層流)중을 흐르는 미립자 (nano- or micro-particles within the microfluidic channel)를 직접 현미경 관찰하면서 분리하는 세포분별장치(Micro Total Analysis, 98:77: Kluwer Academic Publishers, 98:77, 1998; Analytical Chemistry, 70:1909, 1998)가 개발되어 있다.
현재 많이 사용되고 있는 세포 분리 방법 중 하나인 형광활성세포분류 기(fluorescence activated cell sorter, FACS)는 레이저 광선을 사용하여 림프구 등 유리세포의 표면 항원을 해석하거나 표면 항원의 유무 등에 의해 세포를 분리하는 장치로서, 유액 상태의 입자나 세포가 일정 감지 지역을 통과할 때 각각의 입자나 세포를 신속하게 측정하여, 각각의 세포가 갖는 형광의 세기를 측정하고, 수치화된 형광의 세기를 이용하여, 특정 세포를 선택적으로 분리할 수 있다. 형광 염료(fluorescent dye) 또는 단일클론 항체(monoclonal antibodies)를 사용하여 세포의 표면 및 내부가 갖는 면역상태를 파악하여 세포를 분리할 수 있다. 그러나, 장치의 복잡한 조작 기술, 고도로 숙련된 기술자, 많은 시간의 소요, 및 고가의 기계가 필요하다는 단점이 있다 (Lancioni CL, et al., J Immunol Methods, 344(1):15, 2009).
또한, 현재 사용되고 있는 또 다른 방법 중 하나인 자기활성세포분류기(magnetic activated cell sorter)는 자기 입자(magnetic particle)가 붙어있는 항체나 또는 그에 상응하는 물질을 이용하여 자기장의 힘으로 원하는 특정 세포를 분리하는 것으로, 이때, 세포 분리시 필요한 비드(bead)가 세포와 결합하여 세포 내로 들어감으로써 세포의 상태에 변화가 발생한다는 단점이 있다.
이에, 본 발명은 복잡한 과정을 거치지 않고 신속하고 간단한 방법으로 표적세포를 특이적이고 효율적으로 분리할 수 있는 표적 세포의 분리 방법 및 배양 방법을 제공하고자 한다.
본 발명자들은 표적 세포가 혼합되어 있는 시료로부터 원하는 특정 세포를 신속하고 간편하게 분리하는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 표적 특이적 리간드가 결합된 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드를 이용하면 이러한 목적을 달성할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 용어 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 표적 특이적 리간드가 결합된 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드에 표적 세포를 포함하는 시료를 접촉시키고, 상기 스캐폴드에 결합된 표적 특이적 리간드에 의해 포획된 표적 세포를 분리하는 것을 포함하는 표적 세포의 분리 방법을 제공한다.
나노섬유는 적은 공간에 넓은 표면적을 지니고 있으며, 내구성이 강하고, 다루기가 매우 간편하고, 다양한 형태로 제작이 가능하며 또한, 다양한 물질을 화학적으로 결합시키는 것이 용이하다는 특징이 있을 뿐만 아니라 생체적합성 소재를 이용하여 제작가능하기 때문에 의료 분야에 활용하기 적합하다. 특히, 생체적합성 고분자 나노섬유의 경우 독성이 없고 생체 내에서 분해가 가능하여 이미 상처치료, 인공피부, 혈액투석, 인대 등 다양한 생의학적 분야에 널리 상용화가 되어 있는 상태이다.
본 발명의 한 구체예에서, 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드의 제조를 위해 사용되는 상기 생체적합성 고분자는 PLGA(poly(lactide-co-glycolide)), PLA (poly(lactic acid)), PGA (poly(glycolic acid)), PCL(poly(caprolactone)) 등일 수 있다. 이 중 PLGA, PLA 및 PGA는 미국 식품의약청(FDA)으로부터 인체에 사용가능한 생분해성 고분자로 승인되어 사용되고 있는 것이므로 바람직하게 이용될 수 있다. 본 발명에서 사용하는 생체적합성 고분자는 이에 제한되는 것은 아니나, 수평균 분자량이 10,000 내지 1,000,000, 예컨대, 50,000 내지 500,000의 범위인 것을 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 이 중 PLGA를 이용하여 나노섬유 스캐폴드를 제작하여 표적 세포의 분리 및 배양에 사용하였다.
생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드는 당업계에 공지된 방법을 통하여 제조할 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드는 전기방사법을 이용하여 제조될 수 있다.
상기 전기방사법은 통상의 나노섬유 제조시 사용되는 방법으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 생체적합성 고분자를 용매에 용해시켜 고분자 용액을 제조한 후, 상기 고분자 용액을 전기방사 장치에 주입하고 토출시켜 다공성 구조를 갖는 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드를 제조한다. 생제적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드의 제조를 위해 사용되는 고분자 용액의 제조시 사용되는 용매, 고분자 용액의 농도, 전기방사에 사용되는 전압, 방사거리, 유속 등은 사용되는 고분자의 종류나 목적하는 생제적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드의 물성 등에 따라 당업자가 적절히 조절할 수 있다.
본 발명에 따라 얻어진 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드에 있어서, 나노섬유의 직경, 공극의 크기, 공극률 등은 분리를 원하는 표적세포의 크기, 표적세포의 분리나 배양시 사용되는 버퍼나 배양시 사용되는 배양액의 유동성, 표적세포의 포획 효율 등을 고려하여 필요에 따라 고분자 용액의 농도, 전기방사의 조건 등을 적절히 조절함으로써 제어할 수 있다.
마찬가지로, 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드의 크기와 두께는 별달리 제한되지 않으며, 당업자가 스캐폴드의 기계적 강도가 확보될 수 있는 크기와 두께를 적절히 선택하여 제조할 수 있다.
제조된 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드는 친수성을 갖도록 하거나 리간드와의 결합력을 향상시키기 위해 추가적으로 표면개질될 수 있다. 이러한 표면개질의 방법은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 필요에 따라 적절히 선택하여 적용가능하다.
본 발명에서 사용하는 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드는 표적 특이적 리간드가 결합되어 있다. 표적 특이적 리간드라 함은 사용자가 분리하고자 하는 세포, 즉 표적 세포에 특이적으로 결합하는 물질을 의미한다. 본 발명의 한 구체예에서, 표적 특이적 리간드는 항체 또는 앱타머일 수 있다. 표적 세포의 종류에 따른 표적 특이적 리간드에 대해서는 당업계에 공지되어 있으며, 필요에 따라 하나 이상의 리간드를 조합하여 사용할 수 있다. 2종 이상의 표적 특이적 리간드를 사용하는 경우에는 표적세포의 분리시 1종의 표적 특이적 리간드가 결합되어 있는 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드를 2종 이상 사용함으로써 표적세포 분리의 효율 및 순도를 높일 수 있다.
생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드에 표적 특이적 리간드를 결합하는 방법은 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 표적 특이적 리간드가 항체인 경우 별도의 표면 개질을 수행하거나 결합제를 사용하지 않더라도 단순한 혼합에 의해서도 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드에 항체를 결합시킬 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 딥코팅을 통해 항체를 스캐폴드에 결합시킨다.
한편, 표적 세포는 세포를 분리하고자 하는 목적에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 표적 세포는 분리 후 배양하여 세포수를 확장시킬 필요가 있는 세포일 수 있다. 예컨대, 세포면역치료에서는 혈액, 골수 등으로부터 특정 면역세포를 분리하여 생체외에서 대량으로 배양시킨 후 이를 생체 내로 다시 도입시키므로, 본 발명의 방법을 적용하면 유용하다. 따라서, 본 발명의 한 구체예에서, 표적 세포는 조혈모세포(CD34+ 또는 CD133+ 세포), 중간엽 기질 세포(CD271+, CD105+ 또는 MSCA-1+ 세포), T 세포 (CD3+ 세포), CD4+ T 세포 (CD4+ 세포), CD8+ T 세포 (CD8+ 세포), 항원특이적 CD4+ T 세포 (CD4+CD154+ 세포), 항원특이적 CD8+ T 세포 (CD8+CD137+ 세포), 중심 기억 CD4+ T 세포 (CD4+CD45RO+CCR7+ 세포), 효과기 기억 CD4+ T 세포 (CD4+CD45RO+CCR7- 세포), 중심 기억 CD8+ T 세포 (CD8+CD44+CD62L+ 세포), 효과기 기억 CD8+ T 세포(CD8+CD44+CD62Llow), γ/δ T 세포 (TCRγ/δ+ 세포), Skin-homing T 세포 (CLA+ 세포), NK 세포 (CD56+, DX5+, NK1.1+ 세포), B 세포(CD19+, B220+ 세포), 항원특이적 기억 B세포(CD19+B220-CD138- 세포), 기억 B 세포 (CD27+ 세포), Pre-B 세포 (CD138+ 세포), 대식세포 (CD14+ 세포), 수지상세포 (OX62+, CD209+, PDCA-1+ 세포), 과립구 (CD15+, Ly-6G+ 세포), 골수세포 (CD33+ 세포), 백혈구 (CD45+ 세포), 비만세포 (CD117+ 적혈구 생성 세포 (CD71+ 세포), 적혈구 (CD235a+, Ter-119+ 세포), 거핵구 (CD61+ 세포), 내피세포 (CD31+, CD105+ 세포), 섬유아세포 (fibroblast+ 세포), 신경세포 (CD133+ 세포), 상피종양세포 (CD326+, EbrB-2+ 세포), 흑색종세포 (MCSP+ 세포) 등일 수 있다. 또한, 표적 세포를 포함하는 시료로는 혈액, 골수 또는 림프절, 비장, 파이어판과 같은 2차 면역기관을 포함한다.
표적 특이적 리간드와 표적 세포 간에는 특이적이고도 자발적인 결합이 일어나므로, 표적 세포를 포함하는 시료와 표적 특이적 리간드가 결합된 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드를 접촉시키면 상기 스캐폴드에 결합된 표적 특이적 리간드에 의해 표적 세포가 포획되게 된다. 표적 세포는 배양을 통해 활성화되고 증식되어 스캐폴드로부터 분리된다. 따라서, 표적 특이적 리간드를 결합시킨 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드를 이용하면 신속하면서도 간단하게 표적 세포를 분리할 수 있을 뿐만 아니라 특이적이고도 효율적인 분리를 가능하게 한다.
하기 실시예에서는, PLGA를 전기방사하여 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드를 제조하였으며, 얻어진 스캐폴드에 CD4+ T세포를 특이적으로 분리할 수 있는 항-CD4 항체를 혼합하여 항-CD4 항체가 결합된 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드를 얻었다.
상기 특이 항체가 결합된 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드의 섬유 직경과 섬유의 구조를 관찰하기 위하여 SEM(Scanning Electron Microoscope) 및 AFM(Atomic Force Microscope)을 이용하여 측정한 결과, 나노섬유에 결합된 항체의 농도가 올라갈 수 나노섬유의 표면이 거칠어지는 것을 확인하였다 (도 1 및 도 2). 또한, X-ray를 이용하여 항체를 처리하지 않은 스캐폴드와 항-CD4 항체가 결합되어 있는 스캐폴드의 표면의 원자구성 비율을 확인해본 결과, 항-CD4 항체가 결합된 스캐폴드에서만 C-N 피크(도 3A)와 N1s피크(도 3B)를 보이는 것을 확인하여 본 발명에 따른 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드에 항체가 결합되어 있는 것을 확인하였다.
상기 특이 항체가 결합된 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드에 항체가 안정적으로 결합이 되는지 알아보기 위해, 형광이 결합된 항-CD4 항체를 농도별로 처리한 결과, 항체 농도가 증가할수록 형광의 세기가 강하지는 것을 확인하였으며(도 4), micro BCA 방법을 이용하여 항-CD4 항체가 결합된 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드에 처리한 항체의 농도에 따른 결합된 항체의 함량을 확인한 결과, 항체의 농도가 증가함에 따라 결합된 항체의 함량도 이에 비례하여 증가하는 것을 확인하였다 (도 5). 또한, 항체농도를 50㎍/㎖로 고정하여 시간이 흐름에 따라 형광세기의 변화를 측정한 결과, 5일 경과 후에도 약 80% 정도 결합이 유지되는 것을 확인할 수 있었다 (도 6).
또한, 본 발명에서 항-CD4 항체가 결합된 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드가 항체에 대한 표적세포를 얼마나 효과적으로 부착시키는지 확인하기 위하여 마우스 비장의 혼합된 단일 세포 (T, B 또는 NK 세포)를 첨가한 후, 스캐폴드에 부착되지 않은 세포를 측정한 결과, 혼합된 세포에서 CD4+ T세포가 24.9%에서 5.58%로 감소하는 것을 확인하였으며(도 7), 이 결과로 CD4+ T세포가 항-CD4 항체가 결합된 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드에 부착되었다는 것을 알 수 있었다. 또한, 항체농도를 12.5㎍/㎖ 및 50㎍/㎖로 고정하여 스캐폴드에 부착되지 않고 회수된 세포의 수 및 분리효율을 측정한 결과, 항체의 농도가 올라갈수록 미부착된 세포의 수가 감소하여 항-CD4 항체가 결합된 스캐폴드에 부착된 세포가 증가했다는 것을 확인하였으며(도 8A), 항체 농도가 50㎍/㎖일 때 86.96%의 분리 효율이 나타나는 것을 확인하였다 (도 8B).
또한, 항체를 처리하지 않은 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드 및 항-CD4 항체가 결합된 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드에 부착된 세포를 확인한 결과 항체를 처리하지 않은 스캐폴드에는 적은 양의 세포가 부착되어 있으며 CD4+ T세포가 특이적으로 많이 부착되어 있지 않았으나, 항-CD4 항체가 결합된 스캐폴드의 경우에는 많은 세포가 부착되었고 대부분이 CD4+ T세포인 것을 확인하였다 (도 9).
본 발명은 또한 상기 방법에 따라 분리된 표적 세포를 배양하는 것을 포함하는 표적 세포의 배양 방법을 제공한다.
앞서 설명한 바와 같이, 표적 세포는 사용 목적에 따라 단순한 분리뿐만 아니라 세포수의 확장을 위한 배양을 필요로 한다. 본 발명의 한 구체예에서, 표적 세포는 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드에 포획된 상태에서 배양될 수 있다. 본 발명에 따른 표적 특이적 리간드가 결합된 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드는 표적 특이적 리간드에 의해 스캐폴드에 대한 표적 세포의 부착력을 높여주고 있기 때문에 장기간의 배양에서도 안정성을 제공하며, 표적 세포들간의 적절한 공간 확보를 통해 효율적인 세포 증식을 가능하게 한다.
하기 실시예에서는, 항-CD4 항체가 결합된 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드에 부착되어 있는 세포를 1, 3 및 5일 동안 배양하여 측정한 결과, 배양 1일째에 세포들이 부착되어 있는 것을 확인하였으며, 항체를 처리하지 않은 대조군과는 달리 항-CD4 항체가 결합된 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드의 경우 대부분 CD4+ T세포인 것을 확인하였다. 또한, 배양 3일째의 경우 항-CD4 항체가 결합된 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드에서 세포들의 클러스터를 관찰하여 세포의 성장이 증가하는 것을 확인하였으며, 배양 5일째까지도 많은 양의 CD4+ T세포가 부착되어 자라고 있는 것을 확인하였다 (도 10).
또한 상기의 항-CD4 항체가 결합된 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드에 부착되어 있는 세포를 관찰하기 위해 배양 3일째에 SEM을 이용하여 관찰한 결과 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드에 세포들이 부착되어 있는 것을 확인하였으며(도 11), 배양 1, 3 및 5일에 각각 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드에서 떨어져 나오는 세포의 개수를 확인한 결과, 항-CD4 항체가 결합된 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드에서 5일 후 6 X 105 개로 가장 많은 세포가 나오는 것을 확인하였으며, 분리되어 나오는 세포가 대부분 CD4+ T세포인 것을 확인하였다 (도 12).
추가로 항-CD4 항체가 결합된 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드에 부착된 세포의 활성화 여부를 확인하기 위해 항-CD4+ T 세포가 활성화되었을 때 분비하는 IFN-gamma및 세포의 분열시 나타나는 Ki-67에 대한 항체를 이용하여 유세포 분석을 수행한 결과, 3, 5일에는 거의 모든 세포들이 분열을 하고 있는 것을 확인하였으며(도 13 A), 항-CD4 항체가 결합된 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드로부터 분리된 세포의 상당수가 IFN-gamma를 생성하였고(도 13 B), 분열하고 있는 세포들 역시 상당수가 분열과 동시에 IFN-gamma를 생성하는 것을 확인할 수 있었다 (도 13C).
이상 살펴본 바와 같이, 표적 특이적 리간드가 결합된 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드를 이용하면 표적 세포의 분리가 신속하고 간단하면서도 특이적이고 효율적으로 분리할 수 있어 여러 다양한 세포가 혼합되어 있는 시료로부터 원하는 특정 세포를 분리하기 위한 분리 방법 또는 세포 분리 장치의 개발에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 항-CD4 항체가 결합된 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드의 표면을 SEM(Scanning Electron Microscope)을 이용하여 관찰한 사진이다.
도 2는 항-CD4 항체가 결합된 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드의 표면을 AFM(Atomic Force Mircoscope)을 이용하여 관찰한 사진이다.
도 3은 항-CD4 항체의 결합 유무에 따른 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드 표면의 원자 결합을 비교 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 형광이 결합된 항-CD4 항체를 농도별로 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드에 처리하였을 때, 형광의 세기를 측정한 그림이다.
도 5는 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드에 결합된 항체의 함량을 micro BCA 방법을 이용하여 측정한 그래프이다.
도 6은 항-CD4 항체가 결합된 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드의 결합의 안정성을 알아보기 위해 형광의 세기를 측정한 그래프이다.
도 7은 항-CD4 항체가 결합된 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드에 세포 혼합물을 처리하였을 때, 부착되지 않은 CD4+ T세포의 비율을 FACS(fluorescence activated cell sorter)를 이용하여 확인한 그래프이다.
도 8은 항-CD4 항체가 결합된 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드를 이용하여 세포를 분리하였을 때, 부착되지 않고 나온 세포의 수(A) 및 분리효율(B)을 나타낸 그래프이다.
도 9는 항-CD4 항체가 미결합된 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드와 항-CD4 항체가 결합된 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드에 결합된 세포를 형광염색을 통해 확인한 사진이다.
도 10은 항-CD4 항체가 미결합된 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드와 항-CD4 항체가 결합된 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드에 결합된 세포를 1, 3 및 5일 동안 배양한 결과를 형광염색을 통해 확인한 사진이다.
도 11은 배양 3일째에 항-CD4 항체가 미결합된 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드와 항-CD4 항체가 결합된 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드에 결합된 세포를 SEM (Scanninf Electron Mircoscope)을 이용하여 관찰한 사진이다.
도 12는 항-CD4 항체가 미결합된 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드와 항-CD4 항체가 결합된 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드에 세포를 배양하였을 때, 스캐폴드에서 떨어져 나오는 세포의 총 개수(A) 및 CD4+ T세포의 수(B)를 확인한 그래프이다.
도 13은 항-CD4 항체가 미결합된 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드와 항-CD4 항체가 결합된 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드에 세포를 배양하였을 때, 스캐폴드에서 떨어져 나오는 세포에서 활성화 되었을 때 분비되는 IFN-gamma (A)와 세포 분열시 나타나는 Ki-67 (B) 그리고 IFN-gamma를 분비하면서 Ki-67을 발현하고 있는 세포를 확인한 그래프이다 (C).
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
실시예 1: 전기방사법( electrospinning )을 이용한 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드의 제조 및 표적 세포 특이 항체의 결합
PLGA(Poly(lactide-co-glycolide))를 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로-2-프로판올 (HFIP) 에 2wt%(W/V)로 녹인 후, PLGA용액을 유속 2㎖/h, Spinnig 속도 200rpm, 전압 10kV 및 거리 25cm의 조건으로 전기방사를 하여 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드를 제조하였다.
상기에서 제조한 전기방사된 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드를 건조시켜, 알콜로 세척하고 1cm X 1cm 크기에 맞게 시트형의 스캐폴드를 제작하였다. 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드를 멸균한 후 다시 PBS(phosphate buffered sailne) 버퍼로 세척하였다.
표적 세포를 CD4+ T 세포로 설정하고, 이에 대한 표적 특이적 리간드로 항-CD4 항체를 사용하였다. 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드에 항체를 결합시키기 위하여, PBS 버퍼에 항-CD4 항체를 처리하여 항체용액을 만든 후 스캐폴드를 항체 용액에 담가 4℃에서 밤새 인큐베이션한 다음 PBS로 2회 세척하여 항-CD4 항체가 결합된 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드를 제작하였다.
실시예 2: 표적 세포 특이 항체가 결합된 스캐폴드의 표면 관찰
2-1: SEM ( Scanning Electron Microscope )을 이용한 관찰
상기 실시예 1에서 제조된 스캐폴드의 나노섬유의 직경과 섬유의 구조를 관찰하기 위하여 SEM(Scanning Electron Mircoscope)을 이용하여 측정하였다. 각 샘플들을 sputter-coater를 사용하여 금(gold)으로 코팅한 후에 전압을 15kV로 유지하여 관찰하였다.
그 결과, 나노섬유에 결합된 항체의 농도가 올라갈수록 나노섬유의 표면이 거칠어지는 것을 확인하였다 (도 1).
2-2 : AFM ( Atomic Force Microscope )을 이용한 관찰
생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드의 표면을 좀 더 자세히 관찰하기 위하여 AFM(Atomic Force Microscope)을 이용하여 측정하였다. AFM은 나노섬유의 표면을 분석하기 위해 사용되는 방법으로 titanium cantilever를 사용하여 ocillation mode로 측정하였다.
그 결과, 나노섬유에 결합된 항체의 농도가 올라갈수록 나노섬유의 표면이 거칠어지는 것을 확인하였다 (도 2).
2-3 : 표적 세포 특이 항체가 결합된 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드 표면의 원자결합 분석
표적 세포 특히 항체의 결합 유무에 따른 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드의 표면을 비교하기 위하여 XPS 방법을 이용하여 측정하였다. XPS는 X-ray를 이용하여 나노섬유 표면의 원자 구성을 알아보는 방법으로 항-CD4 항체의 결합 유무에 따른 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드 표면의 원자 구성 비율의 차이를 알아볼 수 있다.
그 결과, 항-CD4 항체가 결합된 스캐폴드에서는 C-N 피크를 관찰하였으며(도 3A), 이는 항체가 결합되어 있음을 나타내는 것이다. 또한, 항-CD4 항체가 결합된 스캐폴드에서만 N1s 부분에서 피크가 나타나는 것을 확인하였다 (도 3B).
실시예 3: 표적 세포 특이 항체가 결합된 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드에 고정된 항체의 안정성 확인
생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드에 결합되는 항체의 함량을 측정하기 위해, 형광이 결합된 항-CD4 항체를 농도별로 생분해성 나노섬유에 처리 후 4℃에서 하룻밤 인큐베이션한 다음 PBS로 2회 세척하였다.
그 결과, 항체 농도가 증가할수록 형광의 세기가 강하지는 것을 관찰하였으며, 항체의 농도가 증가할수록 평균 형광 강도도 증가하는 것을 형광현미경을 통하여 확인하였다 (도 4).
스캐폴드에 처리한 항체의 농도에 따른 스캐폴드에 결합된 항체의 함량을 확인하기 위하여 micro BCA 방법을 이용하여 562nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 항체의 농도가 증가함에 따라 스캐폴드에 결합된 항체의 함량도 이에 비례하여 증가하는 것으로 나타났다 (도 5).
항체가 처리된 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드가 안정적으로 항체와 결합되었는지 확인하기 위해, 나노섬유 스캐폴드에 항체를 도입하기 위하여 항체 농도를 50㎍/㎖로 고정하고, 제조된 항체용액에 나노섬유 스캐폴드를 딥-코팅 (dip coating) 의 방법으로 도입한 후 시간이 흐름에 따라 형광세기의 변화를 측정하였다.
그 결과, 5일 경과 후에도 약 80%정도 결합이 유지되는 것을 확인할 수 있었다 (도 6).
실시예 4: 표적 세포 특이 항체가 결합된 생체적합성 나노섬유 스캐폴드의 표적 세포 분리 효율 확인
항-CD4 항체가 결합된 생체적합성 나노섬유 스캐폴드가 표적 세포를 얼마나 효과적으로 포획하는지 확인하기 위하여, 마우스 비장의 혼합된 단핵 세포들(mononuclear cells)(T, B 또는 NK 세포가 혼합되어 있음)을 항-CD4 항체가 결합된 생체적합성 나노섬유 스캐폴드에 처리하고, 20분 동안 4℃에서 반응시킨 다음 부착되지 않은 세포를 회수하여 유세포 분석을 실시하였다.
그 결과, 비장으로부터 수득한 상기 혼합된 단핵 세포 중 CD4+ T세포가 24.9% 였으나, 50㎍/㎖ 항-CD4 항체가 처리된 생체적합성 나노섬유 스캐폴드에 상기 세포를 접촉시키면 20분 후에 5.58%로 감소하여 스캐폴드에 CD4+ T세포가 부착됨을 확인할 수 있다 (도 7). 또한, 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드에 부착되지 않고 회수된 세포의 수 및 분리 효율을 측정한 결과, 50㎍/㎖ 항-CD4 항체가 처리된 생체적합성 나노섬유 스캐폴드에서 가장 적은 수의 세포가 회수되었으며, 86.96%의 분리효율이 나타나는 것을 확인하였다 (도 8).
세포 반응 후 항-CD4 항체가 미처리된 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드 및 항-CD4 항체가 처리된 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드를 형광 염색하여 부착되어 있는 세포를 확인하였다. 그 결과 항-CD4 항체가 미처리된 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드에는 적은 양의 세포가 부착되어 있었으며, 항-CD4 항체가 처리된 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드의 경우 많은 양의 세포가 결합이 되어 있었으며, 또한 이렇게 부착되어 있는 대부분의 세포가 CD4+ T세포인 것을 확인하였다 (도 9).
실시예 5: 표적 세포 특이 항체가 결합된 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드에 부착된 표적 세포의 배양
항-CD4 항체가 미처리된 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드 및 항-CD4 항체가 처리된 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드에 부착된 세포를 RPMI-1640 (5% FBS, antibiotics (penicillin 100 U/ml, streptomycin 100 μg/ml), 1X NEAA, 10 mM HEPES Buffer, 1 mM sodium, 55 M 2-ME) 배지에 anti-CD3 (1 μg/ml) 와 anti-CD28 (2μg/ml)을 넣고1, 3, 5일 동안 배양하였다.
그 결과 1일째에 세포들이 부착되어 있는 것을 확인할 수 있었으며, 항-CD4 항체가 처리된 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드의 경우 대부분 CD4+ T세포인 것을 볼 수 있었다. 또한 3일째의 경우 항-CD4 항체가 처리된 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드에서는 세포들이 활발하게 자랄 때 나타나는 세포들의 클러스터를 확인할 수 있었으며, 5일째까지도 많은 양의 CD4+ T세포가 부착되어 자라고 있는 것을 확인하였다 (도 10).
배양 3일째에 SEM을 이용하여 관찰한 결과 항-CD4 항체가 처리된 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드에 세포들이 부착되어 있는 것을 확인하였으며(도 11), 배양 1, 3, 5일에 각각 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드에서 떨어져 나오는 세포의 개수를 확인한 결과로 항-CD4 항체가 결합된 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드에서 5일 후 6 X 105개로 가장 많은 세포가 나오는 것을 확인하였고 또한 항-CD4 항체가 결합된 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드에서 분리되어 나오는 세포가 대부분 CD4+ T세포인 것을 확인하였다 (도 12).
실시예 6: 표적 세포 특이 항체가 결합된 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드에 부착된 표적 세포의 활성화 확인
항-CD4 항체가 결합된 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드에 붙어서 자라는 세포의 분열 정도를 확인하기 위해, 상기 실시예 5에서 분리되어 나온 세포에 IFN-gamma가 분비되지 못하도록 Golgi stop을 6시간 처리 후 내부 세포 염색(intra cellular staining)을 통하여 세포내에 존재하는 IFN-gamma 및 세포의 분열시 나타나는 Ki-67을 각각에 대한 항체를 이용하여 염색을 한 다음 유세포 분석기를 이용하여 측정하였다.
그 결과, 처리 3, 5일째에는 거의 모든 세포들이 분열을 하고 있는 것을 확인하였으며(도 13 A), 항-CD4+ T 세포가 활성화되었을 때 분비하는 사이토카인 중에 하나인 IFN-gamma를 확인한 결과 항-CD4 항체가 결합된 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드로부터 분리되어 나온 세포의 경우 약 35%의 세포들이 IFN-gamma를 생성하고 있는 것으로 확인되어 항체가 미처리된 스캐폴드 및 평면배양을 이용하여 배양한 경우보다 더욱 활성화 되어있는 것을 확인할 수 있었다 (도 13 B). 또한, 분열하고 있는 세포 중 IFN-gamma가 얼마나 분비를 하고 있는지 확인한 결과 항-CD4 항체가 결합된 생체적합성 고분자 나노섬유의 경우 약 35%로 가장 많은 세포들이 분열과 동시에 IFN-gamma를 생성하는 것을 확인할 수 있었다 (도 13C).

Claims (7)

  1. 표적 특이적 리간드가 딥코팅에 의해 결합된 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드에 표적 세포를 포함하는 시료를 접촉시키고, 상기 스캐폴드에 결합된 표적 특이적 리간드에 의해 포획된 표적 세포를 분리하는 것을 포함하며,
    상기 생체적합성 고분자는 PLGA(poly(lactide-co-glycolide))인
    표적 세포의 분리 방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    표적 특이적 리간드는 항체 또는 앱타머인 표적 세포의 분리 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    표적 세포는 조혈모세포, 중간엽 기질 세포, T 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 항원특이적 CD4+ T 세포, 항원특이적 CD8+ T 세포, 중심 기억 CD4+ T 세포, 효과기 기억 CD4+ T 세포, 중심 기억 CD8+ T 세포, 효과기 기억 CD8+ T 세포, γ/δ T 세포, Skin-homing T 세포, NK 세포, B 세포, 항원특이적 기억 B세포, 기억 B 세포, Pre-B 세포, 대식세포, 수지상세포, 과립구, 골수세포, 백혈구, 비만세포, 적혈구 생성 세포, 적혈구, 거핵구, 내피세포, 섬유아세포, 신경세포, 상피종양세포, 또는 흑색종세포인 표적 세포의 분리 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 시료는 혈액, 림프절, 비장, 파이어판(peyer's patch) 또는 골수인 표적 세포의 분리 방법.
  6. 제1항, 제3항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항에 따라 표적 세포를 시료로부터 분리하고 이를 배양하는 것을 포함하는 표적 세포의 배양 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    표적 세포는 생체적합성 고분자 나노섬유 스캐폴드에 포획된 상태에서 배양되는 것인 표적 세포의 배양 방법.

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