CN116096853A

CN116096853A - 多功能聚合物微球/微粒细胞分选方法和系统

Info

Publication number: CN116096853A
Application number: CN202180051809.5A
Authority: CN
Inventors: 杰里米·J·哈里斯; 彼得·D·加布里埃尔; 布莱恩·吉恩
Original assignee: Secant Group LLC
Current assignee: Secant Group LLC
Priority date: 2020-06-30
Filing date: 2021-06-15
Publication date: 2023-05-09
Also published as: JP2023532127A; WO2022005737A1; IL299489A; KR20230026486A; EP4172308A1; US20210405035A1

Abstract

一种细胞选择和分选方法，其包括：将目标细胞类型的细胞附着到第一组聚合物珠上，通过具有第一孔径的第一过滤器清洗室，第一孔径小于第一珠直径，以保留第一组聚合物珠，并大于细胞直径，以去除未附着的细胞，从第一组聚合物珠上释放目标细胞类型的细胞，和收集目标细胞类型的细胞。一种细胞修饰方法，其包括在室中修饰目标细胞类型的细胞。一种细胞修饰系统，其包括具有入口和出口的细胞修饰室、可选地位于出口上的具有预定孔径的过滤器、和具有预定直径的各组聚合物珠，该直径被选择成使得各组聚合物珠可被过滤器分离。

Description

多功能聚合物微球/微粒细胞分选方法和系统

相关申请的交叉引用

本申请要求于2020年6月30日提交的美国临时申请No.62/046,070的优先权和权益，其通过整体引用并入本文。

技术领域

本公开总体上涉及用于选择或分选细胞的系统和方法。更具体地，本公开涉及细胞修饰系统和方法，包括用于控制分离步骤的甘油和癸二酸的共聚物(PGS)的聚合物珠。

背景技术

选择特定类型的细胞并将该特定类型的细胞从其他细胞和其他生物材料中分选出来的能力对于许多不同的细胞操作过程是重要的。例如，细胞修饰过程包括细胞选择和细胞分选。

细胞修饰过程为特定目的收集和修饰细胞。常规的细胞修饰过程包括多个步骤。常规的细胞修饰过程依靠磁珠进行细胞选择，这极大地限制了生产规模。此外，常规的细胞修饰过程需要将被修饰的细胞多次转移到不同的容器中。这需要额外的时间，并且在细胞健康最大化的情况下(对细胞进行最小程度的操作时)，需要对细胞进行额外的操作。

嵌合抗原受体(CAR)T细胞是用于免疫治疗的基因工程T细胞，其表达一种人工受体，赋予T细胞特异性靶向能力。生产CAR T细胞的常规多步骤细胞修饰方法包括从血样中收集T细胞，活化T细胞，转导T细胞，扩增T细胞，和收集所得CAR T细胞。

用于CAR T细胞生产的常规磁珠通常一次只能分离出一个细胞亚群，这是一个缓慢的过程。例如，在含有辅助性T细胞、细胞毒性T细胞和自然杀伤(NK)细胞的系统中，使用常规磁珠的CAR T细胞生产方法需要一次分离这三种细胞亚群，首先磁性分离出CD4+细胞，然后使剩余的混合细胞群依次再进行两次磁分离，以分离CD8+细胞，然后是CD56+细胞。这需要额外的时间，并且在细胞健康最大化的情况下(对细胞进行最小程度的操作时)，需要对细胞进行额外的操作。

发明内容

需要一种更高效、可扩展并减少细胞处理的细胞修饰方法和细胞修饰系统。

在示例性实施方案中，细胞选择和分选方法包括将目标细胞类型的细胞在室中附着到具有第一珠直径的第一组聚合物珠上。该方法还包括通过具有第一孔径的第一过滤器清洗所述室，第一孔径小于第一珠直径，以保留第一组聚合物珠，并大于细胞直径，以去除未附着的细胞。该方法进一步包括从第一组聚合物珠上释放目标细胞类型的细胞。最后，该方法包括从第二组聚合物珠上释放目标细胞类型的细胞并收集修饰的目标细胞类型的细胞。

在示例性实施方案中，细胞修饰方法包括将目标细胞类型的细胞在室中附着到具有第一珠直径的第一组聚合物珠上。该方法还包括通过具有第一孔径的第一过滤器清洗所述室，第一孔径小于第一珠直径，以保留第一组聚合珠，并大于细胞直径，以去除未附着的细胞。该方法进一步包括从第一组聚合物珠上释放目标细胞类型的细胞。该方法进一步包括在室中修饰目标细胞类型的细胞。该方法还包括将目标细胞类型的细胞结合到第二组聚合物珠上，该第二组聚合物珠具有大于第一珠直径的第二珠直径。该方法还包括通过具有第二孔径的第二过滤器清洗所述室，第二孔径小于第二珠直径，以保留第二组聚合物珠，但大于第一珠直径，以去除第一组聚合物珠。最后，该方法包括从第二组聚合物珠上释放修饰的目标细胞类型的细胞并收集修饰的目标细胞类型的细胞。

在示例性实施方案中，细胞修饰系统包括细胞修饰室，该细胞修饰室包括至少一个入口和至少一个出口。该细胞修饰系统还包括可选择地位于所述至少一个出口上的多个过滤器，所述多个过滤器中的每一个都具有预定孔径。该细胞修饰系统还包括多组聚合物珠，每组聚合物珠都具有预定直径，所述预定直径被选择成使得所述多组聚合物珠可通过所述多个过滤器分离。

在示例性实施方案中，流通式细胞修饰系统包括多个捕获室，每个捕获室具有一组预定直径的捕获聚合物珠，以捕获多个预定细胞类型的细胞。该流通式细胞修饰系统还包括多个释放室，多个捕获室和多个释放室交替地顺序布置。该流通式细胞修饰系统进一步包括多个过滤器，每个过滤器都具有预定的孔径，每个过滤器将多个捕获室中的一个和多个释放室中的一个分开，以分开各组捕获聚合物珠。

从以下结合附图的更详细的描述中，本发明的各种特征和优点将变得显而易见，附图以示例的方式示出了本发明的原理。

附图说明

图1示意性地示出了在本公开的一个实施方案中用于在单个密闭容器中生产CART细胞的细胞修饰系统。

图2示意性地示出了图1的细胞修饰系统的活化步骤。

图3示意性地示出了图1的细胞修饰系统的基因修饰步骤。

图4示意性地示出了图1的细胞修饰系统的扩增步骤。

图5示意性地示出了图1的细胞修饰系统的收集步骤。

图6示意性地示出了在本公开的一个实施方案中用于在单个密闭容器中生产CART细胞的细胞修饰系统的垂直堆叠的过滤器。

图7示意性地示出了在本公开的一个实施方案中用于生产CAR T细胞的具有四个象限的细胞修饰系统。

图8示意性地示出了在本公开的一个实施方案中包括次级前室的细胞修饰系统。

图9示意性地示出了在本公开的一个实施方案中包括多个辅助室的细胞修饰系统。

图10示意性地示出了在本公开的一个实施方案中用于生产CAR T细胞的流通式细胞修饰系统。

图11示出了Jurkat细胞附着到聚合物珠上和从其上释放的图像。

在任何可能的情况下，在所有附图中将使用相同的附图标记表示相同的部件。

具体实施方式

提供了在控制分离步骤中使用甘油和癸二酸的共聚物(PGS)的聚合物珠的细胞选择和分选系统和方法。在示例性实施方案中，细胞选择和细胞分选是细胞修饰系统或方法的一部分。用于选择和/或分选的细胞可以是悬浮细胞或贴壁(adherent)细胞。

例如，与不包括本文公开的一个或多个特征的概念相比，本公开的实施方案提供了用于基于细胞的治疗的一次性的、独立的、高通量制造系统；将细胞容纳在用于整个多步骤细胞修饰制造过程的一个封闭结构中；降低细胞上的处理压力；产生更高的制造细胞产量；减少消耗品，如培养袋、管和管组；减少设置时间；降低污染风险；依靠微球或细胞的物理尺寸进行选择、分选、分离和/或收集；或其组合。

在示例性实施方案中，混合的细胞群在一步、一个容器的过程中被分离，其中各种细胞群被拴系到各种尺寸的聚合物珠上。例如，使用大尺寸的抗CD4珠、中尺寸的抗CD8珠、小至中尺寸的抗CD19珠和小尺寸的抗CD56珠分别分离出辅助性T细胞、细胞毒性T细胞、B细胞和NK细胞。然后，可使含珠溶液通过一系列过滤器，以根据珠尺寸选择性地分离细胞群。

在示例性实施方案中，细胞选择和分选系统结合了聚合物微球技术以产生特定工程化的微球。

在一些实施方案中，细胞选择和分选系统包括单个可插入的盒，而不是在常规细胞修饰系统中使用的多个袋和管。

在一些实施方案中，细胞选择和分选包括流通过程。

术语“微球”和“珠”在本文中可互换使用。

在一些实施方案中，聚合物珠是商业聚合物珠。合适的商业聚合物珠可以包括但不限于磁性聚合物珠、荧光聚合物微珠、抗体标记的聚合物微珠、聚苯乙烯珠和/或多糖珠。

聚合物珠可以是多孔的或无孔的。

在示例性实施方案中，聚合物珠是由多元醇和酸的聚酯共聚物形成的PGS微球。在示例性实施方案中，聚合物珠是由甘油和癸二酸的共聚物(PGS)形成的PGS微球。PGS可以是聚癸二酸甘油酯、PGS氨基甲酸乙酯(PGSU)、PGS丙烯酸酯(PGSA)或其他甘油酯衍生物。

除了细胞拴系之外，聚合物珠可用于通过在该方法的特定步骤期间与所需的各种试剂一起配制来补充细胞室。例如，聚合物珠还可以装载有细胞营养物、细胞特异性补充物、缓冲剂、抗微生物剂、产氧剂和/或细胞废物螯合剂/吸收剂。

PGS的一个功能是它能够被定制。例如，在生物降解性不是珠的优选特征的情况下，PGS聚合物可以聚合到暂缓降解的程度，以适应暂时的工艺要求。此外，活性官能团，如羟基和羧基，使得可以进行表面修饰，包括用于运送细胞的锚定或结合的对接化学。

这些锚定点可以定制，以解决细胞修饰过程的每个具体步骤。例如，对于具有可用羟基和羧基的PGS微球，可以用光连接(photolink)和抗体修饰该微球，以根据命令通过特定频率的照射捕获(具有抗体特异性)和释放(光连接)。

捕获和释放可以基于包括至少两个分子之间(在这种情况下是细胞或载体上的生物分子和目标对接分子之间)的配位-络合(基于离子-离子电荷的吸引)或结合(共价桥接)的络合。

捕获和释放生物络合/结合可以通过分子目标的对接或结合位置附近的外源或内源化学能变量来促进，导致分子之间的连接(connection)改变或连接(linkage)，无论是离子配位还是共价结合。此外，捕获和释放可以基于通过化学能或物理能可逆的络合或结合位点。在物理的情况下，去连接(delinking)可以基于将频率特定的光发射引入到吸收性结合络合物中。

例如，定制的PGS微球提供了整合光连接剂和抗体特异性“栓系”的选项，用于在治疗后通过光引发的特定细胞的释放来“捕获和释放”。可光裂解的连接(或光连接)可以在一个点处共价连接到微球的羧基上，在另一个点处共价连接到抗体上。光活化以在光连接处释放将抗体结合的细胞与微球分离。Pahattuge等人[“Visible photorelease of liquidbiopsy markers following microfluidic affinity-enrichment”,Chem.Commun.,Vol.56,pp.4098-4101(2020)，其通过整体引用并入本文]描述一种能够共价连接抗体并随后在2分钟内以大于90％的释放率用可见光释放它们的合适的光连接。

PGS本身也是抗微生物的，并且PGS微球可以为细胞提供代谢增强。这是PGS优于其他聚合物微球(例如聚苯乙烯珠或多糖珠)的额外优势。

细胞修饰方法可以是包括附着细胞、在步骤之间去除未附着的组分和分离细胞的多个步骤的任何方法。

在示例性实施方案中，细胞选择和分选方法包括将目标细胞类型的细胞在室中附着到具有第一珠直径的第一组聚合物珠上，通过具有小于第一珠直径的第一孔径的第一过滤器清洗室内容物，以保留第一组聚合物珠，并从第一组聚合物珠上释放目标细胞类型的细胞。当该方法是细胞修饰方法时，该方法还包括在室中修饰所述目标细胞类型的细胞，将目标细胞类型的细胞结合到具有第二珠直径的第二组聚合物珠上，所述第二珠直径大于第一珠直径，以及通过具有第二孔径的第二过滤器清洗所述室，所述第二孔径小于第二珠直径，以保留第二组聚合物珠，但大于第一珠直径，以去除第一组聚合物珠。该方法进一步包括从第二组聚合物珠上释放修饰的目标细胞类型的细胞并收集修饰的目标细胞类型的细胞。

在一些实施方案中，目标细胞类型是T细胞亚群。

在示例性实施方案中，可以通过暴露于与珠群相连接的一种或多种抗原而从混合细胞群中分离T细胞亚群，所述抗原可包括但不限于用于CD4⁺辅助性T细胞的抗CD3+抗CD4，用于细胞毒性T细胞的抗CD3+抗CD8，用于CD4⁺调节性T细胞的抗CD3+抗CTLA-4，用于CD8⁺记忆T细胞的抗CD3+抗CD95，用于γδT细胞的抗-Vδ1+抗-Vγ9Vδ2，或用于自然杀伤T细胞的抗CD3+抗CD57。

暴露于抗原组合可以是顺序的或同时的。在一些实施方案中，暴露包括将细胞混合物按顺序地暴露于更宽的分选抗体珠，例如用于T细胞的CD3，然后去除细胞，随后暴露于第二种不同的亚群珠，例如，取出CD3阳性细胞并将其应用于抗CD4珠以取出辅助性T细胞。在其他实施方案中，暴露包括通过暴露于同时含有多种抗原的珠来直接取出细胞亚群，例如，通过使用在同一珠上具有抗CD3和抗CD4的珠直接从初始混合群体中取出辅助性T细胞。

在一些实施方案中，以下中的一种或多种与珠一起使用以选择滤泡辅助性T细胞：抗BTLA、抗CD3、抗CD4、抗CD10、抗CD40L、抗CD57、抗CD84、抗CD150、抗CXCR4、抗CXCR5、抗ICOS、抗IL-6Rα、抗IL-21R、抗OX40、抗PD-1。在一些实施方案中，以下中的一种或多种与珠一起使用以选择Th1辅助性T细胞：抗CCR1、抗CCR5、抗CD3、抗CD4、抗CXCR3、抗IFNγR1、抗IFNγR2、抗IL-12Rβ2、抗IL-18Rα、抗IL-27Rα。在一些实施方案中，以下中的一种或多种与珠一起使用以选择Th2辅助性T细胞：抗CCR3、抗CCR4、抗CCR8、抗CD3、抗CD4、抗CXCR4、抗IL4Rα、抗IL-17Rb、抗IL-33R、抗TSLP R。在一些实施方案中，以下中的一种或多种与珠一起使用以选择Th9辅助性T细胞：抗CD3、抗CD4、抗IL-4Rα、抗IL-17Rb、抗TGF-βRII。在一些实施方案中，以下中的一种或多种与珠一起使用以选择Th17辅助性T细胞：抗CCR4、抗-CCR6、抗-CD3、抗-CD4、抗-IL-1RI、抗-IL-6Rα、抗-IL21R、抗-IL23R、抗-TGF-βRII。在一些实施方案中，以下中的一种或多种与珠一起使用以选择Th22辅助性T细胞：抗CCR4、抗CCR6、抗CCR10、抗CD3、抗CD4、抗IL-6Rα、抗TGF-βRII、抗TNF RI。在一些实施方案中，以下中的一种或多种与珠一起使用以选择调节性T细胞：抗CD3、抗CD4、抗CD5、抗CD25、抗CD39、抗CD62L、抗CD73、抗CD103、抗CD127、抗CD134、抗CD223、抗CTLA-4、抗叶酸受体(anti-follate receptor)4、抗GITR、抗LAP、抗LRRC32、抗BDCA-4。

在示例性实施方案中，T细胞可以在暴露于具有抗CD3和抗CD28的珠时被活化。在一些实施方案中，T细胞可以在暴露于珠表面结合或吸附有植物血凝素的珠时被活化。

在示例性实施方案中，可以通过顺序或同时暴露于与珠群连接的一种或多种抗原的组合而从混合细胞群中分离B细胞亚群，所述抗原可包括但不限于用于未成熟B细胞的抗CD19+抗CD10、用于过渡B细胞的抗CD19+抗CD10+抗CD27+抗CD24+抗CD38、用于滤泡B细胞的抗CD19+抗CD22、用于活化B细胞(activated B cells)的抗CD19+抗CD69+抗CD86、用于记忆B细胞的抗CD19+抗CD21+抗CD27、用于调节性B细胞的抗CD19+抗CD43，用于浆细胞的抗CD19+抗CD27+抗CD38。在一些实施方案中，以下中的一种或多种与珠一起使用以选择滤泡B细胞：抗CD19、抗CD20、抗CD21、抗CD22、抗CD23、抗CD24、抗CD38、抗CXCR5、抗HLA-DR、抗IgD、抗IgM、抗TACI。在一些实施方案中，以下中的一种或多种与珠一起使用以选择记忆B细胞：抗CD19、抗CD20、抗CD21、抗CD23、抗CD27、抗CD40、抗CD80、抗CD86、抗CD93、抗CD95、抗CD148、抗HLA-DR、抗TACI。在一些实施方案中，以下中的一种或多种与珠一起使用以选择调节性B细胞：抗CD1d、抗CD5、抗CD19、抗CD20、抗CD21、抗CD24、抗CD27、抗CD38、抗CD40、抗IgD、抗IgM。在一些实施方案中，以下中的一种或多种与珠一起使用以选择浆B细胞：抗BCMA、抗CD19、抗CD27、抗CD38、抗CD138、抗CXCR4。

在示例性实施方案中，B细胞可以在暴露于具有抗CD40的珠时被活化。在一些实施方案中，脂多糖结合到珠表面以活化B细胞。在其他实施方案中，细菌荚膜多糖结合到珠表面。

在示例性实施方案中，其他细胞类型可以与含有珠的生物反应器系统一起使用，其他细胞类型包括：树突状细胞、粒细胞、巨噬细胞、单核细胞、先天淋巴细胞、髓源抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cells)、诱导多能干细胞、胚胎干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、神经干细胞。

在一些实施方案中，以下中的一种或多种与珠一起使用以选择树突状细胞：抗CD1a、抗CD1c、抗CD11b、抗CD11c、抗CD14、抗CD16、抗CD40、抗CD80、抗CD83、抗CD86、抗CD123、抗CD141、抗CD172a、抗CD207、抗CD209、抗CXCR1、抗CLEC9a、抗EpCAM、抗HLA-DR、抗IGSF4A、抗XCR1。在一些实施方案中，以下中的一种或多种与珠一起使用以选择炎症性(inflammatory)树突状细胞：抗CD1a、抗CD1c、抗CD11b、抗CD11c、抗CD14、抗CD64、抗CD172a、抗CD206、抗HLA-DR。在一些实施方案中，以下中的一种或多种与珠一起使用以选择表皮朗格汉斯树突状细胞(epidermal Langerhans dendritic cells)：抗CD1a、抗CD1c、抗CD11b、抗CD11c、抗CD172a、抗CD207、抗E-Cadherin、抗EpCAM、抗HLA-DR。在一些实施方案中，以下中的一种或多种与珠一起使用以选择CD14⁺真皮(dermal)树突状细胞：抗CD1c、抗CD11c、抗CD14、抗CD163、抗CD209、抗HLA-DR。在一些实施方案中，以下中的一种或多种与珠一起使用以选择CD1a⁺CD1c⁺真皮树突状细胞：抗CD1a、抗CD1c、抗CD11b、抗CD11c、抗CD141、抗CD172a、抗HLA-DR。在一些实施方案中，以下中的一种或多种与珠一起使用以选择CD1a⁺CD1c⁺真皮树突状细胞：抗CD1a、抗CD1c、抗CD11b、抗CD11c、抗CD141、抗CD172a、抗HLA-DR。在一些实施方案中，以下中的一种或多种与珠一起使用以选择CD1a⁺CD141⁺真皮树突状细胞：抗CD1a、抗CD1c、抗CD11b、抗CD11c、抗CD141、抗CD172a、抗CLEC9a、抗HLA-DR、抗IGSF4A、抗XCR1。

在一些实施方案中，以下中的一种或多种与珠一起使用以选择嗜碱性细胞：抗CCR3、抗CD11c、抗CD22、抗CD45、抗CD49b、抗CD69、抗CD123、抗CD203、抗CRTH-2、抗HLA-DR。在一些实施方案中，以下中的一种或多种与珠一起使用以选择嗜酸性细胞(eosinophilcells)：抗CCR3、抗CD11b、抗CD14、抗CD15、抗CD45、抗CD49d、抗CD66b、抗CD125、抗EMR1、抗HLA-DR、抗Siglec-8。在一些实施方案中，以下中的一种或多种与珠一起使用以选择肥大细胞：抗CD11c、抗CD32、抗CD33、抗CD45、抗CD117、抗CD123、抗CD203c、抗HLA-DR。在一些实施方案中，以下中的一种或多种与珠一起使用以选择嗜中性细胞(neutrophil cells)：抗CD11b、抗CD14、抗CD15、抗CD16、抗CD18、抗CD32、抗CD33、抗CD44、抗CD45、抗CD62L、抗CD66b、抗HLA-DR。

在一些实施方案中，以下中的一种或多种与珠一起使用以选择1型先天淋巴细胞：抗CD25、抗CD45、抗CD49a、抗CD69、抗CD117、抗CD122、抗CD127、抗CD161、抗CXCR3、抗ICOS、抗IL-1RI、抗IL12Rβ2、抗NKp46。在一些实施方案中，以下中的一种或多种与珠一起使用以选择2型先天淋巴细胞：抗CD25、抗CD45、抗CD90、抗CD117、抗CD127、抗CD161、抗CRTH-2、抗ICOS、抗IL-1RI、抗IL-12Rβ2、抗IL-17RB、抗KLG1、抗Sca-1、抗ST2、抗TSLP R。在一些实施方案中，以下一种或多种与珠一起使用以选择3型先天淋巴细胞：抗-CCR6、抗CD25、抗CD45、抗CD90、抗CD117、抗CD127、抗IL-1RI、抗IL12Rβ2、抗IL-23R、抗CD56、抗NKp44、抗NKp46、抗Sca-1。在一些实施方案中，以下中的一种或多种与珠一起使用以选择自然杀伤细胞：抗CD56、抗CD94、抗CD122、抗CD16、抗KIR、抗NKG2A、抗NKG2D、抗NKp30、抗NKp44、抗NKp46、抗NKp80。在一些实施方案中，以下中的一种或多种与珠一起使用以选择调节性先天淋巴细胞：抗CD25、抗CD45、抗Cd90、抗CD122、抗CD127、抗Sca-1、抗TGF-βRI、抗TGF-βRII。

在一些实施方案中，以下中的一种或多种与珠一起使用以选择巨噬细胞：抗CCR5、抗CD11a、抗CD11b、抗CD11c、抗CD14、抗CD15、抗CD16、抗CD32、抗CD33、抗CD64、抗CD68、抗CD80、抗CD85k、抗CD86、抗CD107b、抗CD115、抗CD162、抗EMR1、抗Galectin-3、抗GITRL、抗HLA-DR、抗MHC-class II、抗TLR2、抗TLR4。在一些实施方案中，以下中的一种或多种与珠一起使用以选择M1巨噬细胞：抗CD16、抗CD32、抗CD36、抗CD68、抗CD80、抗Cd86、抗HLA-DR、抗IFNγR、抗MHC class II。在一些实施方案中，以下中的一种或多种与珠一起使用以选择M2a巨噬细胞：抗CD163、抗CD200R1、抗CD206、抗CD209、抗CD301、抗CXCR1、抗CXCR2、抗Dectin-1、抗HLA-DR、抗IL-1RII、抗IL-4Rα、抗MHC class II。在一些实施方案中，以下中的一种或多种与珠一起使用以选择M2b巨噬细胞：抗CD86、抗HLA-DR、抗IL-4Rα、抗MHC classII。在一些实施方案中，以下中的一种或多种与珠一起使用以选择M2c巨噬细胞：抗CCR2、抗CD150、抗CD163、抗IL-4α、抗CD206、抗SR-AI、抗SR-BI、抗TLR1。

在一些实施方案中，以下中的一种或多种与珠一起使用以选择单核细胞：抗CD11b、抗CD14、抗CCR2、抗HLA-DR、抗CD115、抗CD62L。在一些实施方案中，以下中的一种或多种与珠一起使用以选择中间型单核细胞：抗CD11b、抗CD14、抗CD16、抗CD62L、抗CD115、抗CD163、抗CCR2、抗CCR5、抗CX3CR1、抗HLA-DR。在一些实施方案中，以下中的一种或多种与珠一起使用以选择非经典型单核细胞：抗CD11b、抗CD14、抗CD16、抗CD115、抗CX3CR1、抗HLA-DR。

在一些实施方案中，以下中的一种或多种与珠一起使用以选择单核细胞髓源抑制性细胞：抗CD11b、抗CD14、抗CD33、抗HLA-DR、抗IL-4Rα。在一些实施方案中，以下中的一种或多种与珠一起使用以选择多形核髓源抑制性细胞：抗CD11b、抗CD15、抗CD16、抗CD33、抗CD66b、抗IL-4Rα、抗VEGF R1。

在一些实施方案中，以下中的一种或多种与珠一起使用以选择诱导多能干细胞：抗ABCG2、抗碱性磷酸酶、抗Cripto-1、抗E-Cadherin、抗Frizzled-5、抗CD29、抗CD49f、抗PODXL、抗SSEA-3、抗SSEA-4、抗TRA-1-60。在一些实施方案中，以下中的一种或多种与珠一起使用以选择造血干细胞：抗ABCG2、抗CD10、抗CD34、抗CD38、抗CD43、抗CD44、抗CD48、抗CD90、抗CD93、抗CD117、抗CD133、抗CD150、抗CDCP1、抗CXCR4、抗Flt-3、抗VEGF R2。在一些实施方案中，以下中的一种或多种与珠一起使用以选择间充质干细胞：抗BMP R、抗CD29、抗CD44、抗CD49a、抗CD51、抗CD73、抗CD90、抗CD105、抗CD106、抗CD117、抗CD166、抗STRO-1。在一些实施方案中，以下中的一种或多种与珠一起使用以选择神经干细胞：抗ABCG2、抗CD133、抗CXCR4、抗FGF R4、抗Frizzled-9、抗Glut1、抗Notch-1、抗Notch-2、抗PDGF Rα、抗SSEA-1。

在示例性实施方案中，细胞修饰过程是CAR T细胞过程。在示例性实施方案中，CART细胞修饰过程包括分离步骤、活化步骤、基因修饰步骤、扩增步骤和收集步骤。

在示例性的实施方案中，细胞修饰系统结合了聚合物微球技术，以产生特别设计的微球，使T细胞在CAR过程中穿梭，并将细胞保持在单个密闭容器中。

参考图1，细胞修饰系统10包括：细胞室12，包括用于白细胞单采T细胞(leukapheresis T cell)分离的抗体标记珠的第一试剂袋14，包括例如用抗CD3和/或抗CD28标记物标记的活化珠的第二试剂袋16，具有用于基因修饰的珠的第三试剂袋18、具有扩增珠的第四试剂袋20和废物袋22。每组珠都是为CAR过程的步骤设计的PGSU智能珠。每种类型的珠的直径从第一袋14、第二袋16、第三袋18到第四袋20逐渐变大。细胞修饰系统10是一次性使用的，并且被装载到包括用户界面和泵以及其它引导流体流动的装置的主机中。

在示例性实施方案中，在细胞修饰过程中，T细胞从抗体标记珠穿梭至活化珠再至基因修饰珠再至扩增珠。这些珠具有离散递增的尺寸，每组珠具有紧密的直径分布，以允许一组珠与下一组珠良好分离。一组珠的合适直径分布为±50％或更小，或者±40％或更小，或者±25％或更小，或者±10％或更小，或者±5％或更小，或者其间的任何值、范围或子范围。各组聚合物珠的合适平均直径在约5μm至约1000μm的范围内，或者约10μm至约800μm，或者约10μm至约200μm，或者约20μm至约100μm，或者其间的任何值、范围或子范围。各组聚合物珠的合适直径在约5μm至约1000μm的范围内，或者约10μm至约800μm，或者约10μm至约200μm，或者约50μm至约500μm，或者其间的任何值、范围或子范围。两组珠之间合适的平均直径变化为约20μm，或者约20μm或更大，或者约20μm至约50μm，或者约40μm至约60μm，或者约50μm或更大，或者约50μm至约100μm，或者约100μm或更大，或者其间的任何值、范围或子范围。

在示例性实施方案中，在每个分离步骤中，不同的过滤器基于珠的尺寸和过滤器的孔的尺寸来分离两组珠。过滤器优选为低蛋白结合性和低细胞结合性材料。在示例性实施方案中，过滤器是纺织品过滤器，例如不可降解的织造纺织品。在一些实施方案中，纺织品是主动智能纺织品，例如嵌入了用于细胞修饰过程的组件的纺织品，而不仅仅是被动屏障。在示例性实施方案中，主动智能纺织品包括嵌入的生长因子，例如白细胞介素，或包括嵌入在纺织品中的传感器，例如用于葡萄糖监测或细胞密度监测。在一些实施方案中，纺织品包括鞘-芯结构，例如芯是聚酯并且鞘是浸涂的。

在示例性实施方案中，细胞修饰系统包括细胞修饰室，该细胞修饰室包括至少一个入口和至少一个出口。该细胞修饰系统还包括可选择地位于所述至少一个出口上的多个过滤器，所述多个过滤器中的每一个都具有预定的孔径。该细胞修饰系统还包括多组聚合物珠，每组聚合物珠都具有预定直径，所述预定直径被选择成使得所述多组聚合物珠可通过所述多个过滤器分离。

在示例性实施方案中，细胞在整个过程中保持在单个室中。允许所有过程步骤在单个室中进行减少了真正制造“床边”细胞修饰系统所需的占地面积。紧凑的尺寸使CAR有能力成为真正的现场护理系统，允许现场生产，而不是在加工场所和治疗中心之间运送材料。微球是为特定的细胞结合而定制的，并且容易制成各种直径，以允许基于物理的分离将细胞保持在一个中心室中。细胞不会从一个袋转移到另一个袋，消除了袋的连接，并降低了污染的可能性。

当T细胞留在中央处理室中时，它们受到的剪切力减小。细胞分离是通过尺寸排阻完成的，消除了对磁性系统的需求，允许更高的通量。可以持续监测细胞室的所有处理参数，并根据需要自动调整。这样的监测参数可以包括但不限于pH、溶解氧水平和/或溶解二氧化碳水平。

在一些实施方案中，主室在初始处理期间部分填充有培养基和珠，例如25％填充，并且在随后的步骤期间发生额外的填充以支持细胞的活化、转导和扩增。例如，在扩增过程中，培养基体积可以增加到75％，然后可以加入装载营养物的珠，使得50％的体积被珠填充。较高的培养基与珠的比率使得自由漂浮的T细胞能够占据更多空间，从而最大化处理产量。

附加地或可替代地，细胞室可以被配置为仅依靠重力来用过滤器分离微球和产物，消除了对泵和其他可能潜在地失效的机械系统的需求。

在示例性实施方案中，T细胞选择性PGS或PGSU(“Leuka”)珠用于从由患者收集的白细胞单采产物中初步分离预定的T细胞表型。Leuka珠用特定抗原修饰，以选择性地结合适当的T细胞表型，并且剩余的单采材料通过室下方的过滤器外壳从室中取出。特定步骤的过滤器的孔径小于Leuka珠的直径，将它们保持在细胞室内，从而分离选定的T细胞表型。室和珠可以容易地按照常规程序冲洗和清洁。该实施方案有效地消除了在CAR处理之前通常需要的离心步骤需求。

参考图2，细胞修饰过程的活化步骤开始于将适当的活化培养基与活化(“Act”)珠24一起添加到细胞室12中，细胞室12已经容纳有栓系在Leuka珠28上的预定T细胞26。Act珠24被修饰以促进适当的T细胞活化。

栓系在Leuka珠28上的T细胞26被分开，然后与Act珠24结合，此时，Leuka珠28可以通过特定Act步骤的过滤器30从室中冲洗出来，过滤器30的孔径大于Leuka珠28的直径但小于Act珠24的直径，使得Act珠24和栓系的T细胞26保留在细胞室12中。特定Act步骤的过滤器30是纺织品过滤器。

在一些实施方案中，栓系在Leuka珠28上的T细胞26被分开，然后与Act珠24结合，此时，具有栓系的T细胞26的Act珠24通过过滤器30从细胞室12冲洗到次级容器中，过滤器30的孔径大于Act珠24但小于Leuka珠28。

在其他实施方案中，细胞选择和活化发生在同一处理步骤中。在这样的实施方案中，双重分离和活化发生在同一珠上，消除了具有单独的Leuka珠和Act珠的需要。

参考图3，细胞修饰过程的基因修饰步骤遵循与活化步骤相似的程序。将适当的基因修饰培养基与基因修饰(“GM”)珠32一起添加到细胞室12中，细胞室12已经容纳有拴系在Act珠24上的活化T细胞26。

T细胞26与来自Act步骤的Act珠24分开，然后栓系到GM珠32上，这允许Act珠24通过特定GM步骤的过滤器34从细胞室中去除，过滤器34的孔径大于Act珠24的直径但小于GM珠32的直径，使得GM珠32保留在细胞室12中，而Act珠24不保留。

在一些实施方案中，GM珠32是病毒修饰的。在这样的实施方案中，病毒通过特定的抗原位点栓系在GM珠32上。这导致病毒发现T细胞26的效率增加，因为它们都对接在同一GM珠32上。

在其他实施方案中，修饰细胞的病毒与小得多的病毒珠(未显示)连接，使得病毒包被病毒珠。例如，Act珠24的直径可以为约250μm，而病毒珠的直径可以为约25μm。在示例性实施方案中，病毒珠是聚合物珠。在一些实施方案中，聚合物珠是PGS珠。

参考图4，细胞修饰过程的扩增步骤也遵循与活化步骤相似的程序。将适当的扩增培养基与扩增(“Exp”)珠36一起添加到细胞室12中，细胞室12已经容纳有拴系在GM珠32上的修饰的T细胞26。

T细胞26与GM珠32分开，然后栓系到Exp珠36上，这允许GM珠32通过特定Exp步骤的过滤器38从细胞室12中去除，过滤器38的孔径大于GM珠32的直径但小于Exp珠36的直径，使得Exp珠36保留在细胞室12中，而GM珠32不保留。

在一些实施方案中，T细胞26保留在Act珠24上用于扩增步骤。在这样的实施方案中，细胞修饰系统包括预定数量(Y)的Act珠24，每个Act珠24与最大数量(X)的T细胞26相互作用，使得当总细胞计数(N)大于X×Y时，不能被捕获在Act珠24上的过量(N-(X×Y))扩增的T细胞26自由漂浮，使得“种子”T细胞26不需要从Act珠24上移除。在这样的实施方案中，在扩增步骤期间，细胞修饰系统可以包括在室底部的纺织品过滤器。纺织品过滤器允许自由漂浮的T细胞26向下漂浮并穿过，但阻止Act珠24穿过。

在扩增步骤之后，可以在收集步骤中清洁CAR T细胞26并准备用于低温保存。参考图5，T细胞26与Exp珠36分开，并通过孔径小于Exp珠36直径的特定收集步骤的过滤器42，直接进入低温保存袋44，该低温保存袋可直接从细胞修饰系统10中取出并置于低温保存中。或者，收集的CAR T细胞26可以在收集后立即使用。在一些实施方案中，低温保存袋无菌连接到扩增室，用于在非无菌环境中使用该系统。

在示例性实施方案中，细胞室还容纳各种处理传感器以监测某些室条件，例如pH、O₂水平、营养物、CO₂水平和/或微生物负载，从而提供室条件的实时数据。基于传感器反馈，可以容易地调节室环境以保持最佳的处理条件。在示例性实施方案中，O₂可以鼓泡通过网状过滤器以帮助细胞增殖。或者，细胞修饰系统可包括穿过室的透气材料的中心垂直管，以添加O₂和抽出CO₂。

在示例性实施方案中，聚合物珠是球形或基本球形的。在一些实施方案中，聚合物珠可形成为具有非球形的预定形状，例如高宽比大于1，以有助于例如过滤选择或处理效率。

在一些实施方案中，聚合物珠被设计成在细胞修饰过程的一个步骤中溶解，例如用于递送细胞营养物或遗传修饰剂。在一些实施方案中，溶解可由室条件如室的pH触发。该条件和溶解可以指示处理步骤的完成。

用于细胞分离和分选过程或系统的过滤器可以是适于基于粒径进行分离的任何类型。合适的过滤器可以包括有机膜过滤器、无机膜过滤器、烧结玻璃过滤器和/或纺织网。

在示例性实施方案中，过滤器是纺织网。因为过滤网是为每个步骤选择的，所以网可以用PGS修饰，例如为特定步骤提供处理剂。在一些实施方案中，通过激光烧蚀产生纺织网层的孔径。

在一些实施方案中，过滤器30、34、38、42垂直堆叠，如图6所示，其中每个过滤器30、34、38、42具有不同的孔径，并且每次过滤后，剩下的具有最小孔径的过滤器被移除。

在一些实施方案中，过滤器30、34、38、42布置在细胞室12的不同象限中，如图7示意性所示，其中每个象限中的过滤器(未示出)具有不同的孔径。在图7的视图中，过滤器平行于页面定向。掩模45允许在给定时间覆盖四个象限中的三个，并通过旋转过滤器或掩模45使细胞室12暴露于不同的过滤器。在图7的视图中，掩模45或过滤器在垂直于页面的轴上旋转。

在一个示例性实施方案中，细胞修饰系统10包括小的次级病毒前室46，如图8中示意性所示，其中病毒或另一种基因修饰剂被加入并附着在小GM珠48上或保持在其中。前室46通过前室端口50与细胞室12分开，该前室端口50可以是过滤器或阀。室过滤器52位于细胞室12的另一边缘。

在活化步骤期间，前室46的内容物被清洗到主细胞室12中。在一些实施方案中，测量细胞因子水平或其他可溶性标识物变化的传感器(未示出)确定何时将病毒加入主细胞室12。前室端口50在生物安全柜外部保持无菌以用于即插即用功能，并且过滤器或阀将遗传修饰前室46和主室分开。

在示例性实施方案中，细胞修饰系统10是模块化的，并且包括单采室54、病毒室46、主室12、分级室56、浓缩的CAR T细胞收集室58和废物室60，如图9中示意性所示。

单采室54和病毒室46各自分别具有通向主室12的独立端口62、50。单采产物通过单采室54装入细胞修饰系统10。病毒或其它遗传修饰剂通过病毒室46装入到细胞修饰系统10。额外的装载单元(未示出)也可位于主室12的顶部，例如，以容纳装有用于细胞扩增的营养支持剂的珠。

主室12包括在室过滤器52处的两个出口，一个用于收集废物(例如洗去的病毒/GM珠)的废物室60，一个通向分级室56，用于分级T细胞26以在扩增后收集。分级室56具有通向浓缩CAR T细胞收集室58的出口64。在示例性实施方案中，细胞修饰系统10在没有人工干预的情况下操作。

在分级室56达到预定的CAR T细胞26群体大小后，将CAR T细胞26收集在浓缩室58中以供立即使用或冷冻。CAR T细胞26被浓缩在单独的室58中，因为在处理期间分级室56中的T细胞浓度低于收集所需的浓度。在示例性实施方案中，在没有离心机的情况下进行浓缩。在一些实施方案中，低温保存袋连接到浓缩室58。

在一些实施方案中，光子辐射产生去连接，从聚合物珠释放捕获的细胞。为了通过光子吸收去连接，目标连接需要发射光子源的视线，因为光子能量以直线传播。光子辐射可以被分散，但是不能在超出其通过的折射率界面限制的角落周围传播。

为了有效地使成熟的细胞培养物去连接，每一个连接的结构都应该能够接触到启动辐射。可能难以确保整个相连的细胞和载体的群体都暴露于启动辐射而不损害培养物。细胞培养系统可能存在光密度问题，在其中每个细胞都有可能遮蔽或在能量上竞争去连接的光子。因此，在使用光子系统捕获和释放的一些实施方案中，物理操作，例如培养物的湍流混合，可以用于暴露所有的连接吸收位点。

在其他实施方案中，由磁或电磁能量源(例如无线电微波或磁场)产生的远程物理电磁场诱导的感应产生去连接。在适当的电场下，分子通过改变它们的电子键排列或配位络合关系来响应。如果相关分子中的一种是顺磁性的或具有磁敏感性的特征，系统会像开关一样在感应场的存在下重新排列。

在一些实施方案中，分子结构的转变是经典的酮-烯醇构象变化，其可以是光子和磁两者诱导的。在一些实施方案中，该化学物质包括基于三嗪结构或液晶化学的氰尿酸，并选择具有强偶极官能团和易受影响的电子构型的氨基酸。场诱导的去连接通过成键电子或电荷与诱导场的相互作用逆转了连接结合。在一些实施方案中，与金属如锰络合的氨基酸具有这样的磁敏感性。

在这样的实施方案中，整个培养物暴露于诱导场，而不用担心能量启动的遮蔽或竞争。磁共振成像(MRI)清楚地证明了这样的效应。在示例性实施方案中，选择低能量、非电离且不影响培养物的启动频率。

从微球释放细胞的其他合适的释放机制可包括但不限于机械搅拌、冷冲击(coldshock)、酸度、竞争性结合、微粒表面侵蚀或其组合。

在一些实施方案中，通过加入竞争性结合到细胞配体位点的试剂，如向含有链霉亲和素标记的微球的培养基溶液中加入生物素，使细胞从PGS颗粒表面脱离，所述微球与已被生物素化的小分子和蛋白质如抗体相互作用。

在一些实施方案中，细胞通过PGS表面的侵蚀从PGS粒子表面脱离。在其他实施方案中，使用对刺激敏感的PGS颗粒，其在存在培养基条件下，例如存在酶、pH、溶液离子强度变化的条件下溶解。

在一些实施方案中，如图10示意性所示，细胞修饰系统10作为流通式过程操作。

参考图10，细胞修饰系统10包括连续或半连续的流动相“活性营养物”流通式过程，其中箭头指示流动方向，交替的捕获(组装)室70、74、78、82和释放(分选)室72、76、80需要尺寸排阻微球运送。在该流通式过程中，垂直过滤器84优选具有刚好足够大以允许目标细胞通过的孔。在一些实施方案中，珠具有离散增加的尺寸，每组珠具有紧密的直径分布，以允许一组珠与下一组珠良好分离。在一些实施方案中，上述过程中的水平过滤器86具有刚好足够大以让载体珠通过的孔。因此，每组珠的相对尺寸对于尺寸排阻是重要的，因为每组珠是通向下一个室的运送。活性营养物流动相可以包括代谢支持化学物质与组装和释放生物“汤”的结合。在其他实施方案中，珠具有离散减小的尺寸。在其他实施方案中，珠可以具有相同的尺寸或没有尺寸趋势。

仍然参照图10，白细胞26通过过滤器，与血液68中的其它形成的血液成分(红细胞和血小板)分离，并进入第一捕获室70。Leuka珠28捕获第一捕获室70中的白细胞26。白细胞26与Leuka珠28一起进入第一释放室72，在其中它们从Leuka珠28上释放。白细胞26通过另一个过滤器并进入第二捕获室74。Act珠24捕获第二捕获室74中的白细胞26。白细胞26与Act珠24一起进入第二释放室76，在其中它们从Act珠28上释放。白细胞26通过另一个过滤器并进入第三捕获室78。GM珠32捕获第三捕获室78中的白细胞26，并且病毒颗粒88被引入白细胞26。白细胞26与GM珠32一起进入第三释放室80，在其中它们从GM珠32上释放。白细胞26通过另一个过滤器并进入第四捕获室82。Exp珠36捕获第四捕获室82中的白细胞26。最后，白细胞72和Exp珠36离开第四捕获室82。

随后的释放和捕获流通式分段部分单元仅允许已根据分段和尺寸限制的PGS微球进行处理的受试细胞进入下一个室工艺装配(process assembly)。每个分段室提供工艺步骤生物化学和生物成分以支持相关的工艺步骤。在一些实施方案中，每组珠仅在其相应的捕获室和释放室之间来回穿梭，并且不与其它组珠相互作用，使得一组珠相对于另一组珠的相对尺寸不重要。

从开始到结束，流通式系统的路径是一个连续的排出和进料的室装配，其包括将每个过程步骤局部隔离一段适于结束细胞操作的时间的能力。优选地，从一个室容积和内容物到下一个室的移动被“暂时”推动并保持特定的时间段，在该时间段中允许每个室过程有时间发展。例如，每次流体体积从一个室转移到另一个室时，存在体积保持期，直到细胞与载体分离。在该暂时保持期的过程中，该室可以暂时隔离与相邻室的流体连通。在此期间，碎片和不需要的化学物质也可以通过电泳、电泳作用和化学洗涤来消除，包括在细胞释放到下一个室之前通过局部再循环和过滤的流体管理。来自碎片的活细胞可以进一步在电泳或其它主动生理电或生理机械装置过程的帮助下被引导选择性地通过垂直网，该过程将活细胞相关特性与非活细胞和化学碎片区分开。小分子污染物也可以用标准的商业化学方法，例如Miltenyi Biotec(Bergisch Glad Bach，德国)细胞化学进行类似地分离或过滤或洗涤，。因此，每个室可以作为部分生物反应器操作。

在示例性实施方案中，特定尺寸的PGS微球是基于分配给相应的室工艺装配事件的微球尺寸的室之间的受限运送。通过每个分段室的移动受到微球尺寸排阻的限制，因此每个特定尺寸定义的微球只能在一个方向上移动，并且在捕获室和释放室之间受到“限制”。每个特定尺寸的微球都用细胞特定的“生物”栓系进行了修饰，以在不施加剪切或力的情况下捕获细胞。

只有经分选或修饰的细胞才能从一个特定尺寸的分段室通向另一个。在一些实施方案中，细胞的定向通过受到室壁的孔径的限制，如图10中的垂直虚线84所示。

尽管CAR T细胞过程的步骤在本文中被描述和示出为以特定的顺序发生，但是CART细胞过程的步骤可以以任何顺序发生。在一些实施方案中，该过程以选择、活化、转导、扩增、任选的产物选择和收集的顺序发生。在一些实施方案中，该过程可以通过重新安排一些步骤、部分步骤序列或单个步骤来进行。

尽管本文在CAR T细胞形成的实施方案中具体描述了细胞修饰过程，但细胞修饰过程可以是包括细胞的拴系、释放和分离的任何过程。在一些实施方案中，细胞修饰过程可包括生物加工栓系到珠表面的免疫细胞，并允许拴系的细胞产生单克隆抗体(mAbs)，该抗体容易通过过滤器除去并收集，同时拴系的细胞留在室中。

实施例

在以下实施例的上下文中进一步描述本发明，这些实施例以举例说明而非限制的方式给出。

实施例1

通过以下方法产生用于栓系抗体的PGSU微球：首先在设置为100℃的烘箱中熔化PGS树脂1小时。然后将熔化的树脂倒入混合杯中，并让其冷却5分钟，然后加入约50％重量的丙酮以溶解树脂。将PGS树脂和丙酮在FlackTek混合器(FlackTek，Inc.，Landrum，SC)中以2000RPM混合2分钟，形成均匀的预聚物溶液。通过将1200mL油加入2L反应容器中制备连续油相。将36克表面活性剂脱水山梨糖醇三油酸酯(

85)加入反应容器中，然后构建叶轮、盖和夹具装配以形成密封。然后使氮气流过连续油相。然后打开叶轮，以约800RPM的速度混合连续油相。任选地，在允许加热套30分钟以平衡反应容器温度的热电偶测量后，可以使用升高的温度来提高反应速率。此时，将六亚甲基二异氰酸酯(HDI)加入PGS预聚物溶液中，并在FlackTek混合器中以2000RPM混合1分钟。将14.85mL的HDI加入56克PGS中，形成PGS:HDI比为3.6:1.0的预聚物。将完成的含HDI的预聚物溶液放入与反应容器相连的125-mL加料漏斗中，然后计量进入连续油相。然后将PGS微球乳化并交联一段时间，该时间取决于连续油相的温度，但通常在数分钟至24小时的范围内。微球的交联完成后，从反应容器中提取PGSU微球，用庚烷洗涤以去除残余油，在真空下干燥数天，然后筛分至应用所需的期望尺寸。

实施例2

如实施例1所述制备尺寸为45μm至75μm的PGSU微球颗粒，用于抗体与PGSU微球表面的结合。对于基于1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的抗体与微球的结合，通过将2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)缓冲液稀释至50mM并加入0.5mg/mL的十二烷基硫酸钠(SDS)作为表面活性剂来制备50mL活化缓冲液。称取500mg干燥且清洁的PGSU颗粒，并将其置于15mL离心管中。通过向微球中加入10mL的0.1M NaOH溶液，然后在旋转混合器上混合5分钟，以确保微球表面均匀活化来对PGSU微球表面进行氢氧化物蚀刻。5分钟后，将PGSU微球在800g力下离心3分钟形成沉淀，然后去除上清液。去除NaOH后，用10mL活化缓冲液清洗微球3次，每次5分钟，在800g下离心3分钟，并在两次清洗之间去除上清液。第三次清洗后，将微球悬浮在3mL的活化缓冲液中并静置。通过以下制备EDC/NHS的溶液：将0.2g EDC和0.2g NHS分别称量到1.5mL的Eppendorf管中，然后向每个管中加入1mL活化缓冲液，然后涡流搅拌直到EDC和NHS固体溶解。然后将溶解的EDC溶液加入容纳微球的管中，然后将溶解的NHS溶液加入容纳微球和EDC的管中。将合并的溶液在室温下在旋转混合器上混合30分钟，然后在800g下离心3分钟。移除上清液EDC/NHS溶液，用5mL活化液替换，共清洗两次，每次5分钟，每次清洗结束后进行离心并移除上清液。然后将活化的微球悬浮在的5mL pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中。通过向活化的微球中加入400μg抗体然后在旋转混合器上混合2小时来进行抗体的结合。结合后，将抗体结合的微球在5mlpH7.4的PBS缓冲液中清洗三次，并在800g下离心3分钟，在清洗步骤之间移除上清液。最后一次清洗循环后，将微球悬浮在5ml PBS缓冲液中，形成10％w/v的PGSU-ab微球溶液。

实施例3

将Jurkat细胞(一种人T细胞的永生化细胞系)以100万个细胞/mL的浓度接种，用于附着于抗CD3/抗CD28 PGSU细胞活化微球过夜。图11的第一图像90和第二图像92示出了高放大倍数的微球100和附着的细胞102，其中第一图像90中的比例尺代表150μm，第二图像92中的比例尺代表50μm。

实施例4

使用1mL移液管将实施例3的具有附着的Jurkat细胞的微球90暴露于剧烈移液形式的机械搅拌2分钟。通过机械搅拌将附着的Jurkat细胞从细胞活化微球表面释放。图11的第三图像94示出了通过机械搅拌释放的细胞104。第三图像94中的比例尺代表150μm。

实施例5

将实施例3的具有附着的Jurkat细胞的微球90暴露于冷却培养基(特别是在4℃温度下的培养基)形式的冷冲击15分钟，以硬化细胞膜并释放细胞。通过冷冲击将附着的Jurkat细胞从细胞活化微球表面释放。图11的第四图像96示出了通过冷冲击释放的细胞104。第四图像96中的比例尺代表150μm。

实施例6

将实施例3的具有附着的Jurkat细胞的微球90暴露于酸性培养基，特别是pH为3.5的酸性培养基10分钟。通过酸性培养基将附着的Jurkat细胞从细胞活化微球表面释放。图11的第五图像98示出了通过酸性培养基释放的细胞104。第五图像98中的比例尺代表150μm。

所有上述参考文献通过引用并入本文。

尽管已经参考一个或多个示例性实施方案描述了本发明，但是本领域技术人员将理解，在不脱离本发明的范围的情况下，可以进行各种改变并且可以用等同物代替其元件。另外，在不脱离本发明的实质范围的情况下，可以做出许多改进以使特定情况或材料适应本发明的教导。因此，本发明不限于作为预期用于实施本发明的最佳方式而公开的特定实施方案，而是本发明将包括落入所附权利要求范围内的所有实施方案。另外，在详细说明中标识的所有数值应被解释为精确值和近似值都被明确标识。

Claims

1.一种细胞选择和分选方法，其包括：

将目标细胞类型的细胞在室中附着到具有第一珠直径的第一组聚合物珠上；

通过具有第一孔径的第一过滤器清洗所述室，所述第一孔径小于所述第一珠直径，以保留第一组聚合物珠，并大于细胞直径，以去除未附着的细胞；

从第一组聚合物珠上释放目标细胞类型的细胞；和

收集目标细胞类型的细胞。

2.根据权利要求1所述的细胞选择和分选方法，其中所述聚合物珠包括甘油和癸二酸的共聚物。

3.根据权利要求1所述的细胞选择和分选方法，其中所述聚合物珠包含对用于附着的目标细胞类型的细胞具有特异性的表面修饰。

4.根据权利要求1所述的细胞选择和分选方法，其中所述目标细胞类型的细胞是T细胞，并且修饰的细胞是嵌合抗原受体T细胞。

5.根据权利要求1所述的细胞选择和分选方法，其进一步包括在清洗所述室之前活化所述目标细胞类型的细胞。

6.根据权利要求1所述的细胞选择和分选方法，其进一步包括在清洗所述室之前转染所述目标细胞类型的细胞。

7.根据权利要求1所述的细胞选择和分选方法，其进一步包括：

在收集所述目标细胞类型的细胞后，将所述目标细胞类型的细胞结合到第二组聚合物珠上，所述第二组聚合物珠具有大于第一珠直径的第二珠直径；

通过具有第二孔径的第二过滤器清洗所述室，所述第二孔径小于第二珠直径，以保留第二组聚合物珠，但大于第一珠直径，以去除第一组聚合物珠和未附着的细胞；和

从第二组聚合物珠释放上所述目标细胞类型的细胞。

8.一种细胞修饰方法，其包括：

通过具有第一孔径的第一过滤器清洗所述室，所述第一孔径小于第一珠直径，以保留第一组聚合物珠，并大于细胞直径，以去除未附着的细胞；

从所述第一组聚合物珠上释放所述目标细胞类型的细胞；

在所述室中修饰所述目标细胞类型的细胞；

将所述目标细胞类型的细胞结合到第二组聚合物珠上，所述第二组聚合物珠具有大于第一珠直径的第二珠直径；

通过具有第二孔径的第二过滤器清洗所述室，所述第二孔径小于第二珠直径，以保留第二组聚合物珠，但大于第一珠直径，以去除第一组聚合物珠；

从第二组聚合物珠上释放修饰的目标细胞类型的细胞；和

收集修饰的目标细胞类型的细胞。

9.根据权利要求8所述的细胞修饰方法，其中所述聚合物珠包括甘油和癸二酸的共聚物。

10.根据权利要求8所述的细胞修饰方法，其中所述聚合物珠包含对用于附着的目标细胞类型的细胞具有特异性的表面修饰。

11.根据权利要求8所述的细胞修饰方法，其中修饰所述目标细胞类型的细胞包括在清洗所述室之前活化所述目标细胞类型的细胞。

12.根据权利要求8所述的细胞修饰方法，其中修饰所述目标细胞类型的细胞包括在清洗所述室之前转染所述目标细胞类型的细胞。

13.根据权利要求8所述的细胞修饰方法，其中所述目标细胞类型的细胞是T细胞，并且所述修饰的细胞是嵌合抗原受体T细胞。

14.一种细胞修饰系统，其包括：

细胞修饰室，其包含至少一个入口和至少一个出口；

多个过滤器，其可选择地位于所述至少一个出口上，所述多个过滤器中的每一个都具有预定孔径；和

多组聚合物珠，每组聚合物珠都具有预定直径，所述预定直径被选择成使得所述多组聚合物珠通过所述多个过滤器分离。

15.根据权利要求14所述的细胞修饰系统，其进一步包括在所述至少一个出口处的掩模，以选择所述多个过滤器中的一个用于清洗细胞修饰室。

16.根据权利要求14所述的细胞修饰系统，其中所述聚合物珠包括甘油和癸二酸的共聚物。

17.根据权利要求14所述的细胞修饰系统，其中所述多组聚合珠中的每一个包含对用于附着的目标细胞类型的细胞具有特异性的表面修饰。

18.根据权利要求14所述的细胞修饰系统，其中所述至少一个入口包括单采产物入口和遗传修饰剂入口。

19.根据权利要求14所述的细胞修饰系统，其中所述至少一个出口包括细胞出口和废物收集口。

20.根据权利要求19所述的细胞修饰系统，其进一步包括在所述细胞出口处与所述细胞修饰室连接的细胞分级室。

21.根据权利要求14所述的细胞修饰系统，其中所述细胞修饰室是单细胞修饰室，并且细胞修饰过程的所有步骤都发生在所述单细胞修饰室中。

22.一种流通式细胞选择和分选系统，其包括：

多个捕获室，每个捕获室具有一组预定直径的捕获聚合物珠，以捕获预定细胞类型的多个细胞；

多个释放室，所述多个捕获室和多个释放室交替地顺序布置；和

多个过滤器，每个过滤器都具有预定的孔径，每个过滤器将多个捕获室中的一个和多个释放室中的一个分开，以分开各组捕获聚合物珠。

23.根据权利要求22所述的流通式细胞选择和分选系统，其中所述捕获聚合物珠包括甘油和癸二酸的共聚物。

24.根据权利要求22所述的流通式细胞选择和分选系统，其中每组捕获聚合物珠包含对用于附着的目标细胞类型的细胞具有特异性的表面修饰。