ES2928557T3 - Métodos y sistemas de procesamiento de muestras - Google Patents

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ES2928557T3 ES17180590T ES17180590T ES2928557T3 ES 2928557 T3 ES2928557 T3 ES 2928557T3 ES 17180590 T ES17180590 T ES 17180590T ES 17180590 T ES17180590 T ES 17180590T ES 2928557 T3 ES2928557 T3 ES 2928557T3
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Martin Biehl
Eiad Kabaha
Holger Lantow
Stefan Miltenyi
Elmar Niklas Neuschäfer
Winfried Schimmelpfennig
Jürgen Schulz
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Miltenyi Biotec GmbH
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Abstract

La invención se refiere a un método que comprende proporcionar un sistema, comprendiendo el sistema: a) una unidad de procesamiento de muestras, que comprende un puerto de entrada y un puerto de salida acoplados a un recipiente giratorio que tiene al menos una cámara de muestra, la unidad de procesamiento de muestras configurada proporciona una primera paso de procesamiento a una muestra o girar el contenedor para aplicar una fuerza centrífuga a una muestra depositada en la cámara y separar al menos un primer componente y un segundo componente de la muestra depositada; y b) una unidad de separación de muestras acoplada al puerto de salida de la unidad de procesamiento de muestras, comprendiendo la unidad de separación de celdas un soporte de columna de separación, una bomba y una pluralidad de válvulas configuradas para controlar al menos parcialmente el flujo de fluido a través de un circuito de fluido y una columna de separación colocada en el soporte, la columna de separación configurada para separar los componentes etiquetados y no etiquetados de la muestra fluía a través de la columna. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos y sistemas de procesamiento de muestras
La invención se refiere a un método según la reivindicación 1. En particular, el método comprende las siguientes etapas: proporcionar un sistema; realizar una etapa de procesamiento para separar al menos un primer componente y un segundo componente de una muestra; y realizar una etapa de separación de muestras en un componente procesado de la muestra, comprendiendo la separación separar los componentes marcados y no marcados magnéticamente del componente de muestra procesado.
Se conoce un aparato y un método de separación magnética a partir del documento US 5,691,208 A, y se conoce un sistema para la separación de células por afinidad magnética a partir de concentrados celulares a partir del documento WO 90/04019 A1. En el documento US 20020014439 A1 se describe la eliminación de impurezas de las corrientes de hidrocarburos, en el documento WO 2005012480 A2 se describen sistemas y métodos para separar y concentrar células regenerativas de tejido; en el documento US 2003 0134416 A1 se describen métodos, composiciones y sistemas automatizados para separar células poco frecuentes de muestras fluidas.
Antecedentes de la invención
Actualmente, diversas enfermedades humanas no pueden ser tratadas de manera satisfactoria con los fármacos habituales, proponiéndose el uso de células humanas primarias como una alternativa u opción adicional para el tratamiento de varias enfermedades. Esas propuestas de terapia celular generalmente requieren una manipulación y un procesamiento significativos de los productos celulares para separar las funciones deseadas de las no deseadas, por ejemplo, el empobrecimiento de las células en una reacción de injerto contra huésped no deseada y posiblemente mortal o el enriquecimiento de las células involucradas en los efectos del injerto deseado comparado con los de leucemia/tumor.
Los métodos conocidos en la técnica requieren una infraestructura masiva en los hospitales para cumplir con los requisitos reglamentarios y de seguridad, incluidos buenos procedimientos de fabricación, salas limpias compatibles y personal para mantener las salas, los dispositivos, la producción, el control de calidad y los procedimientos de garantía de la calidad. Los productos celulares generalmente se procesan utilizando una combinación de diferentes dispositivos desechables con transferencia manual de muestras entre esos sistemas.
La invención actual integra varias etapas de procesamiento de células en un solo dispositivo desechable, controlado en un procedimiento totalmente automatizado, eliminándose los requisitos para la transferencia manual de células, los controles durante el procedimiento, los riesgos relacionados con el producto celular y las medidas de reducción de riesgos y, por lo tanto, proporciona un método para la fabricación de productos de terapia celular que están listos para su uso directo.
La presente invención se relaciona generalmente con el procesamiento de materiales biológicos. Más específicamente, la presente invención proporciona métodos para el procesamiento de materiales biológicos para cultivar y/o separar componentes de una muestra biológica, y para separar adicionalmente componentes de la muestra mediante técnicas de separación, incluida la aplicación de separación magnética.
Se conocen varias técnicas para separar componentes de una muestra o material biológico en que se hace uso de técnicas de separación. Tales técnicas incluyen, entre otras, panning, separación magnética, centrifugación, filtración, separación por inmunoafinidad, separación por gravedad, separación por gradiente de densidad y elutriación.
Los métodos de inmunoafinidad pueden incluir el marcado selectivo de ciertos componentes de una muestra (por ejemplo, marcado con anticuerpos) y la separación de componentes marcados y no marcados. Los métodos de separación magnética normalmente incluyen hacer pasar la muestra a través de una columna de separación.
La separación magnética es un procedimiento para retener selectivamente materiales magnéticos en una cámara o columna dispuesta en un campo magnético. Una sustancia objetivo, incluidos los materiales biológicos, puede marcarse magnéticamente uniéndola a una partícula magnética por medio de un compañero de unión específico, que está conjugado con la partícula. A continuación, se aplica a la cámara una suspensión de la sustancia objetivo marcada. La sustancia objetivo se retiene en la cámara en presencia de un campo magnético. La sustancia objetivo retenida se puede eluir entonces cambiando la intensidad del campo magnético o eliminándolo.
Se puede colocar en la cámara una matriz de material de susceptibilidad magnética adecuada, de modo que cuando se aplique un campo magnético a la cámara, se induzca localmente un alto gradiente de campo magnético cerca de la superficie de la matriz. Esto permite la retención de partículas débilmente magnetizadas y la propuesta se conoce como separación magnética de alto gradiente (HGMS, por sus siglas en inglés).
El uso de HGMS en separaciones biológicas requiere que las condiciones proporcionen un alto rendimiento con una pureza sustancial. En consecuencia, sería deseable proporcionar separadores magnéticos de gradiente alto, dispositivos y métodos que sean relativamente fáciles de construir y usar, pero que proporcionen gradientes de campo magnético y características de flujo aumentados al máximo y uniformes durante el uso. Lo más ventajoso sería que tales separadores magnéticos, dispositivos y métodos pudieran usarse para realizar diversos procedimientos de clasificación o ensayo de células con la selección del miembro de unión específico apropiado mediante el cual se marcará magnéticamente la sustancia objetivo.
En muchos casos, las metodologías de separación deben realizarse en condiciones que aseguren la no contaminación de la muestra o que se mantenga la esterilidad. Por ejemplo, muchos sistemas clínicos actuales de separación de células deben funcionar en salas limpias de alta calidad para mantener la esterilidad de las muestras. A menudo, garantizar la no contaminación es engorroso, costoso y requiere instalaciones y personal separados, así como procedimientos complejos que requieren grandes esfuerzos para mantener la reproducibilidad y la esterilidad. Además, numerosas etapas de procesamiento y manipulación (por ejemplo, lavado, reducción de volumen, etc.) deben realizarse por separado de los sistemas de separación con la posterior introducción de las muestras procesadas, así como la unión de fluidos y reactivos a los sistemas, lo que complica aún más el cumplimiento de la esterilidad. Como tal, se necesitan mejores métodos y sistemas para garantizar la no contaminación de las muestras y/o reducir la complejidad y los gastos del procesamiento de las muestras.
Breve resumen de la invención
La presente invención proporciona un método que comprende un sistema de procesamiento y separación de muestras que incluye una unidad de procesamiento de muestras y una unidad de separación de muestras.
En una realización, la invención proporciona mejoras en dispositivos, aparatos y métodos de separación magnética de alto gradiente para la separación de materiales biológicos. Los dispositivos, los aparatos y los métodos en cuestión permiten una mayor especificidad y eficiencia en el aislamiento de células, proteínas, polisacáridos y otros materiales biológicos particulares, u otros materiales que sean magnéticos o puedan experimentar una interacción de unión específica con un miembro de unión marcado magnéticamente.
Se proporciona una columna de separación magnética que tiene una carcasa no magnética que define una cámara de separación, y una matriz permeable a los fluidos de, por ejemplo, esferas metálicas dentro de la cámara. Las esferas forman un enrejado estrechamente apilado, lo que crea canales sustancialmente uniformes para un flujo homogéneo durante las separaciones. En un dispositivo separador magnético se puede usar la columna de separación junto con un dispositivo de prefiltro. El dispositivo se puede usar en un instrumento que tenga un imán permanente o electroimán para usar durante las separaciones, con un brazo retráctil opcional para mover el imán, medios de bombeo para lavar y separar el material objetivo y un microprocesador para controlar el flujo del fluido de separación.
En una realización, el sistema comprende: a) una unidad de procesamiento de muestras que comprende un contenedor giratorio que tiene al menos una cámara de muestras para contener y procesar una muestra, en donde el contenedor giratorio comprende un medio para detectar el progreso de la separación de al menos un primer componente y un segundo componente de una muestra depositada en el contenedor giratorio, y un puerto de entrada y un puerto de salida acoplados al contenedor giratorio, en donde la unidad de procesamiento de muestras está configurada para girar el contenedor para aplicar una fuerza centrífuga a la muestra depositada en la cámara y separar al menos el primer componente y el segundo componente de la muestra depositada; y
b) una unidad de separación magnética de muestras acoplada al puerto de salida de la unidad de procesamiento de muestras, comprendiendo la unidad de separación de muestras un soporte de columna de separación, una bomba y una pluralidad de válvulas configuradas para controlar al menos parcialmente el flujo de fluido a través de un circuito de fluido, y una columna de separación colocada en el soporte, en donde la columna de separación está configurada para separar componentes marcados y no marcados magnéticamente de la muestra que fluye a través de la columna.
El contenedor giratorio comprende un medio para detectar el progreso de la separación del al menos el primer componente y el segundo componente de la muestra depositada en el contenedor giratorio.
Los medios para detectar el progreso de la separación están ubicados de manera que la luz de una fuente de luz pueda penetrar al menos parcialmente a través de al menos una parte de la muestra que se está separando, y la luz que pasa a través de al menos una parte de la muestra puede ser detectada por un detector de luz.
Preferiblemente, los medios para detectar el progreso de la separación se pueden ubicar en el contenedor giratorio, esencialmente perpendiculares a un eje de rotación del contenedor giratorio.
Se prefiere además que los medios para detectar el progreso de la separación se ubiquen en el contenedor giratorio alcanzando esencialmente desde un área adyacente al eje de rotación del contenedor giratorio hasta un área adyacente al perímetro del contenedor giratorio.
El medio para detectar el progreso de la separación en el contenedor giratorio es una ventana, un prisma o un espejo. La ventana, el prisma o el espejo se pueden colocar para cubrir un canal formado en la tapa o el fondo del contenedor giratorio, en donde el canal está configurado de manera que al menos una parte de la muestra pueda fluir hacia el canal durante la centrifugación. También se puede utilizar una ventana sin canal, es decir, la separación de la muestra se detecta entonces a través de una ventana en la tapa o en el fondo de la cámara giratoria.
Preferiblemente, el contenedor giratorio está configurado de tal manera que se puede usar para cultivar células. En ese caso, el contenedor giratorio comprende preferiblemente al menos una capa para el cultivo de células sobre el mismo. Al menos una capa se puede colocar perpendicular a un eje giratorio. Se prefiere disponer una pluralidad de capas para el cultivo de células sobre las mismas en el contenedor giratorio.
El contenedor giratorio se puede fabricar en una forma desechable. También se prefiere que el contenedor giratorio pueda esterilizarse para permitir el procesamiento de células sin contaminación.
En particular, el contenedor giratorio comprende, o puede estar hecho de, un material elegido del grupo que consiste en plástico, poliestireno, poli(cloruro de vinilo), policarbonato, vidrio, poliacrilato, poliacrilamida, polimetilmetacrilato (PMMA), polietilentereftalato (PET), politetrafluoretileno (PTFE), poliuretano termoplástico (TPU), silicona, polietileno (PE), colágeno, quitina, alginato, derivados del ácido hialurónico, poliactida (PLA), poliglicolida (PGA) y sus copolímeros, poliestereno, policarbonato, poliacrilato, cerámica, materiales de vidrio, como hidroxiapatita (HA) y fosfato de calcio, y composiciones que comprenden uno o más de los materiales mencionados anteriormente.
Los puertos de entrada y salida normalmente comprenden al menos un filtro estéril.
La invención se refiere a un método que comprende o contiene las siguientes etapas:
a) proporcionar un sistema como se describió anteriormente y en la presente memoria; b) realizar una primera etapa de procesamiento para separar al menos un primer componente y un segundo componente de una muestra; y c) realizar una etapa de separación de muestras en un componente procesado de la muestra, comprendiendo la separación separar los componentes marcados y no marcados del componente de la muestra procesado. La etapa de procesamiento también se puede realizar después de la etapa de separación.
En otras palabras, la invención se refiere a un método que comprende:
• proporcionar un sistema;
• realizar una etapa de procesamiento para separar al menos un primer componente y un segundo componente de una muestra; y
• realizar una etapa de separación de muestras a un componente procesado de la muestra, comprendiendo la separación separar los componentes marcados y no marcados magnéticamente del componente procesado de la muestra,
en donde el sistema comprende:
a) una unidad de procesamiento de muestras que comprende:
un contenedor giratorio que tiene al menos una cámara de muestras para contener y procesar una muestra, en donde el contenedor giratorio comprende un medio para detectar el progreso de la separación de al menos un primer componente y un segundo componente de una muestra depositada en el contenedor giratorio, y
un puerto de entrada y un puerto de salida acoplados al contenedor giratorio, en donde la unidad de procesamiento de muestras está configurada para
o girar el contenedor para aplicar una fuerza centrífuga a la muestra depositada en la cámara y separar al menos el primer componente y el segundo componente de la muestra depositada; y
b) una unidad de separación magnética de muestras acoplada al puerto de salida de la unidad de procesamiento de muestras, comprendiendo la unidad de separación de muestras:
o un soporte de columna de separación,
o una bomba, y
o una pluralidad de válvulas configuradas para controlar al menos parcialmente el flujo de fluido a través de un circuito de fluido, y
o una columna de separación colocada en el soporte,
en donde la columna de separación está configurada para separar los componentes marcados y no marcados magnéticamente de la muestra que fluye a través de la columna;
en donde el medio para detectar el progreso de la separación en el contenedor giratorio del sistema es una ventana, un prisma o un espejo, y
en donde los medios para detectar el progreso de la separación del sistema están ubicados de tal manera que
• la luz de una fuente de luz pueda penetrar al menos parcialmente a través de al menos una parte de la muestra que se está separando, y
• la luz que atraviesa al menos una parte de la muestra pueda ser detectada por un detector de luz.
Debido a la presencia de la cámara giratoria en el sistema como se describió anteriormente y en la presente memoria, se prefiere que el método comprenda detectar el progreso de la separación, en particular detectando la formación de capas de la muestra, el cambio del valor de pH y/o el cambio de temperatura.
El método puede realizarse preferiblemente cuando la muestra es una muestra biológica, en particular, sangre o médula ósea.
La invención se refiere además a un instrumento de procesamiento de células integrado que comprende una carcasa, al menos una unidad de imán para la cámara de separación magnética desechable, al menos un controlador para una cámara de cultivo / centrifugadora desechable, varias válvulas de pinza dispuestas de tal manera que se puedan montar en el instrumento diferentes disposiciones de un juego de tubos desechables. Además, el instrumento puede comprender una interfaz de usuario con monitor integrado y/o computadora para almacenar y realizar diferentes operaciones de procesamiento celular. Para este propósito, se puede hacer funcionar al menos un controlador de la bomba usando la computadora. Puede estar presente un sistema de detección óptica para una centrífuga para medir densidades ópticas en diferentes posiciones en la cámara. La cámara de centrífuga puede ser desechable y estar ubicada en un área de temperatura controlada. Pueden estar presentes medios para ajustar la temperatura del fluido que se mueve hacia la cámara (calentador, enfriador). Se puede colocar una cámara de cultivo celular en el contenedor giratorio, preferiblemente ubicada en el fondo, posiblemente con medios para ajustar el enfoque de la cámara.
Puede proporcionarse un juego de tubos estériles y desechables para el procesamiento de células estériles para su uso con el sistema de la invención. Normalmente, se proporciona una bolsa de muestras o un puerto de partida de las células. El tubo y/o el sistema pueden configurarse en un ejemplo que no forma parte de la invención, para permitir la transferencia directa de células del paciente a una bolsa de muestras. Además, lo siguiente puede ser parte de los tubos y/o del sistema: un puerto de entrada diferente para el medio de cultivo celular tamponado, al menos un puerto de entrada para el reactivo de marcado magnético, puertos de entrada, normalmente, con filtro(s) estéril(es), un puerto de salida para desechos, y/o un puerto de salida para las células. El puerto de salida se puede conectar directamente con bolsas de congelación de células. Además, un puerto de salida se puede conectar directamente con un contenedor para transfusión y/o inyección.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es un diagrama esquemático de un ejemplo de columna de separación o prefiltración.
La figura 2 representa columnas de separación y prefiltración, junto con la muestra y los contenedores de recogida, interconectados por una serie de vías de fluidos o circuitos de fluidos. La figura también muestra el posicionamiento de las válvulas y una bomba peristáltica que se utiliza en el sistema de separación.
La figura 3 representa una unidad controlada por computadora en la que se adjuntan columnas estériles, tubos desechables y contenedores de almacenamiento y recogida, como se ilustra en la figura 2. La unidad controlada por computadora puede contener un imán, válvulas y una bomba peristáltica.
La figura 4 representa el canal de flujo formado entre tres esferas conectadas.
Las figuras 5 a 7 ilustran un sistema.
La figura 8 ilustra una cámara de un sistema de procesamiento.
La figura 9 ilustra una cámara de un sistema de procesamiento.
La figura 9A ilustra una cámara de un sistema de procesamiento.
La figura 10 muestra una vista transversal de una cámara de procesamiento.
La figura 10A ilustra una vista en planta desde arriba de una cámara de procesamiento.
La figura 11 muestra una vista transversal de una cámara de procesamiento.
La figura 11A ilustra una vista enfocada de una parte de una cámara de procesamiento como se muestra en la figura 11.
La figura 12 muestra una vista transversal de una cámara de procesamiento.
La figura 12A muestra una vista del fondo de la cámara de procesamiento con una abertura para el suministro de gas y una membrana hidrofóbica unida.
La figura 12B muestra el fondo de la cámara con canales en espiral para la aireación a través de una membrana unida al fondo de la cámara.
La figura 13 ilustra un sistema.
Las figuras 14A a 14N ilustran un método de procesamiento de muestras ejemplar.
La figura 15 ilustra un dispositivo de aireación que puede ser parte del sistema.
La figura 16A muestra una cámara de mezcla de gases que puede ser parte del sistema.
La figura 16B muestra la parte inferior de la cámara de mezcla de gases que puede formar parte del sistema.
La figura 17 muestra una vista del interior de una tapa para cámara giratoria con un canal o espacio por donde fluye la muestra durante la centrifugación, con un medio para detectar el progreso de separación de la muestra en forma de prisma.
La figura 18 muestra la trayectoria de la luz a través de la muestra por medio de un prisma. El prisma (doble prisma) está configurado de tal manera que la luz de una fuente de luz pueda penetrar al menos parcialmente a través de al menos una parte de la muestra que se está separando mediante centrifugación, y la luz que pasa a través de al menos una parte de la muestra puede detectarse mediante un detector de luz.
La figura 19 muestra un doble prisma que forma parte de una nervadura situada en la tapa de la cámara giratoria. Las figuras 20 a 29 muestran los resultados de los experimentos realizados con un método según la presente invención.
La figura 20 muestra médula ósea (A, C) sin procesar y células (B, D) seleccionadas CD133.
La figura 21 muestra el producto (A, B) de aféresis sin procesar y el producto (C, D) enriquecido con CD14.
La figura 22 muestra recogida de aféresis sin procesar (izquierda) y PDC enriquecidas (derecha).
La figura 23 muestra la selección de CD4 usando la presente invención, capa leucocitaria sin procesar (izquierda), células objetivo enriquecidas en CD4 (derecha).
La figura 24 muestra las células de la capa leucocitaria antes (izquierda) y después (derecha) del empobrecimiento en CD8 utilizando la presente invención.
La figura 25 muestra el crecimiento de la línea celular K562 en la cámara de centrífuga.
La figura 26 muestra médula ósea sin procesar (izquierda) y células seleccionadas de CD34 o CD133 después de la elución directa en 20 ml (derecha).
La figura 27 muestra médula ósea sin procesar (izquierda) y células seleccionadas de CD34 o CD133 después de la elución directa en un pequeño volumen de 6 ml (derecha).
La figura 28 muestra médula ósea sin procesar (izquierda) y células seleccionadas de CD34 o CD133 después de la reducción del volumen final mediante filtro (derecha).
La figura 29 muestra médula ósea sin procesar (izquierda), células seleccionadas de CD34 o CD133 después de la elución directa en 20 ml (centro) y después de la reducción final del volumen mediante la columna AutoMACS. Descripción detallada de la invención
La presente invención comprende un método que comprende un sistema que proporciona un sistema y realiza una etapa de procesamiento para separar al menos un primer componente y un segundo componente de una muestra; y realizar una etapa de separación de muestras en un componente procesado de la muestra, comprendiendo la separación separar componentes marcados y no marcados magnéticamente del componente de muestra procesado, en donde el sistema se define adicionalmente en las reivindicaciones.
Los sistemas de procesamiento de muestras descritos en la presente memoria integran tanto sistemas de separación de muestras como técnicas de procesamiento de muestras. Los sistemas o unidades de procesamiento de muestras pueden proporcionar procesamiento de muestras tales como cultivo celular, lavado, preparación, incubación, marcado y similares. Además, los sistemas/unidades de procesamiento de muestras pueden incluir técnicas de separación basadas en centrifugación, en las que se aplica una fuerza centrífuga a una muestra para separar al menos un primer componente y un segundo componente de una muestra.
Por lo tanto, un sistema de la presente invención incluirá tanto una unidad de procesamiento de muestras como una unidad de separación de muestras. El sistema también puede comprender o contener una pluralidad de unidades de procesamiento de muestras y/o una pluralidad de unidades de separación de muestras. El sistema combinado de procesamiento/separación de la invención puede incluir un sistema cerrado que se puede programar para realizar automáticamente diversas etapas complejas de procesamiento de células, que incluyen separaciones basadas en la densidad, separación por inmunoafinidad, separaciones magnéticas, incluidas separaciones inmunomagnéticas, cultivo/estimulación/activación de células, lavado o etapas de formulación final. Para este fin, el sistema puede estar controlado por un programa informático que pueda ejecutarse en una computadora. Las etapas de procesamiento celular también pueden incluir el suministro de ciertas sustancias a las células, incluidas las citocinas, materiales genéticos como ADN, ARN, virus, factores de transcripción, antígenos u otras sustancias químicas.
La invención proporciona un sistema que minimiza los errores del usuario, mantiene la esterilidad, realiza etapas complejas de procesamiento de células con poca o ninguna interacción manual requerida y minimiza la exposición del operador al procesar material infeccioso. Es posible el procesamiento junto a una cama o en un quirófano. El dispositivo puede funcionar en un ejemplo que no forma parte de la invención, mientras está conectado a un paciente del que se está obteniendo una muestra o al que se administra una muestra procesada o fracciones de esta. Por ejemplo, la médula ósea obtenida de un paciente puede procesarse directamente en una bolsa de entrada del juego de tubos. A partir de ahí, por ejemplo, la médula ósea puede ser procesada, es decir, separada en al menos dos componentes. Al menos uno de estos componentes puede administrarse al paciente, posiblemente después de procesar el componente de forma adecuada.
Procedimientos de separación basados en la densidad realizados con la unidad de procesamiento de muestras del sistema de la invención incluidos, entre otros, lavado de células, generación de capa leucocitaria, separación basada en la densidad utilizando medios de densidad, por ejemplo, Ficoll™, Percoll™ (GE Healthcare), separación basada en el marcado de densidad (por ejemplo, Rosettesep (tecnologías de células precursoras) u otros procedimientos de marcado de densidad), separación debido a la velocidad de sedimentación, por ejemplo, eliminación de trombocitos, elutriación, adhesión celular y similares. Las etapas/técnicas de procesamiento adicionales que se pueden realizar con una unidad de procesamiento de muestras del sistema inventivo incluyen cultivo celular incluyendo expansión, estimulación, diferenciación, rediferenciación, carga de antígeno, transfección, transducción, cultivo, cultivo adherente o en suspensión, multicapa o mixto de tipo multicelular, cultivo en reposo o con fuerzas de cizallamiento o mezclando. Los materiales de entrada incluyen, entre otros, sangre, leucoféresis, médula ósea, liposucción, leche, cualquier fluido corporal, células de tejido, por ejemplo, células de varios órganos, células tumorales, células individuales, grupos de células, agregados de células, tejido diseccionado mecánicamente o en combinación con enzimas.
Como se indicó anteriormente, un sistema de la invención incluirá una unidad/sistema de procesamiento de muestras y una unidad/sistema de separación de muestras. Los sistemas de separación de muestras incluirán sistemas de separación magnéticos. Un sistema de separación de muestras de base magnética que puede incluirse en el sistema de la presente invención incluye sistemas/procedimientos de separación magnética descritos, por ejemplo, en la red mundial en el hipervínculo «MiltenyiBiotec.com», y puede usarse para casi cualquier tipo de célula. Los sistemas ejemplares de separación magnética, que se describen en parte a continuación, también se describen, por ejemplo, en la Solicitud de Patente Europea e P 0869838 B1 y en la Patente de EE. UU. número 5,691,208.
Se proporcionan mejores separadores magnéticos, dispositivos y métodos para los procedimientos de separación magnética y se describen en el documento EP 0 869 838 B1, que puede incluirse en un sistema de la presente invención. Las matrices de los separadores magnéticos proporcionan poros o canales uniformes que reducen el atrapamiento de aire o sustancias no objetivo, disminuyen la pérdida de sustancias objetivo debido a la ruptura mecánica.
Las sustancias biológicas, como las células objetivo de diversos sistemas y órganos, se marcan magnéticamente con un elemento de unión específico adecuado y se aíslan usando los dispositivos y métodos de la presente invención. El aislamiento de células multipotenciales tales como células precursoras o progenitoras hematopoyéticas es de particular interés. Aunque la separación de células hematopoyéticas se utiliza en la presente memoria para proporcionar ejemplos de procedimientos de separación de células, la presente invención se puede aplicar a una amplia gama de tipos de células u otras sustancias biológicas.
Las células procesadas utilizando la presente invención se pueden utilizar para diversos fines, por ejemplo, en el tratamiento de enfermedades, utilizando su potencial para proliferar y diferenciarse, así como su(s) función(es) biológica(s) en entidades vivas, por ejemplo, sangre o tejido.
Las aplicaciones de las células que pueden procesarse usando la presente invención incluyen, entre otras:
• ingeniería de injertos, por ejemplo, junto con para el trasplante de células precursoras;
• transplante de órganos;
• tratamiento del cáncer incluyendo, entre otros, leucemia, incluida la leucemia mieloide aguda, la leucemia mieloide crónica y tumores sólidos como el carcinoma de células renales, el cáncer de mama, el melanoma y el cáncer de páncreas;
• tratamiento de enfermedades autoinmunitarias resistentes al tratamiento como el lupus eritematoso sistémico o la esclerodermia generalizada, la diabetes tipo 1, la esclerosis múltiple;
• terapia celular incluyendo, entre otros, la utilización directa de células efectoras;
• tratamiento de enfermedades infecciosas;
• regeneración de tejidos, incluidos, entre otros, el infarto de miocardio, el daño hepático o las enfermedades neurodegenerativas, e
• inducción de tolerancia incluyendo, entre otros, el trasplante o la enfermedad autoinmunitaria.
Los métodos de procesamiento en que se usa la presente invención pueden ser una combinación de varias operaciones básicas, incluido el lavado celular, el intercambio de medios, la concentración celular, la incubación de células con diversas sustancias (incluidos anticuerpos, citocinas, reactivos de separación magnética, medios), la separación celular magnética, la filtración y el cultivo celular.
Los métodos de separación magnética de células pueden comprender tanto procedimientos de enriquecimiento como de empobrecimiento (Bosio et al. en Engineering of Stem Cells, Springer, 03/2009). Si las células objetivo pueden identificarse en función de las proteínas de superficie, las células objetivo pueden enriquecerse hasta alcanzar una pureza elevada. En algunas situaciones, las células no objetivo pueden identificarse en función de sus características funcionales no deseadas dentro de un contexto clínico específico. Estas células no objetivo pueden eliminarse del producto celular, dando como resultado una mezcla heterogénea de diferentes células objetivo.
Los productos celulares procesados por la presente invención para propuestas de ingeniería de injertos pueden enriquecerse en CD34, CD133 o empobrecerse en CD3, CD3 y CD19, CD6, CD4 y CD8, receptor de linfocitos T alfa/beta (TCR alfa/beta) o CD3/CD19/CD16/CD14, lo que da como resultado preparaciones de células precursoras enriquecidas o células precursoras complementadas con otras células inmunitarias, como los linfocitos T citolíticos naturales y las células dendríticas.
Los productos celulares procesados por la presente invención para propuestas de terapia celular pueden enriquecerse, por ejemplo, en CD14 (monocitos), CD56 (linfocitos T citolíticos naturales), CD335 (NKp46, linfocitos T citolíticos naturales), CD4 (linfocitos T cooperadores), CD8 (linfocitos T citotóxicos), CD1c (BDCA-1, subconjunto de células dendríticas de una muestra de sangre), CD303 (BDCA-2), CD304 (BDCA-4, subconjunto de células dendríticas de una muestra de sangre), NKp80 (linfocitos T citolíticos naturales, linfocitos T gamma/delta, linfocitos T efectores / de memoria), «6B11» (Va24/Vb11; linfocitos T citolíticos naturales invariantes), CD137 (linfocitos T activados), CD25 (linfocitos T reguladores) o empobrecidos en CD138 (células plasmáticas), CD4, CD8, CD19, CD25, CD45RA, CD45RO. Los linfocitos T citolíticos naturales, los linfocitos T citolíticos naturales, los linfocitos T y sus subconjuntos se pueden utilizar como células efectoras en propuestas de perfusión de linfocitos de donantes para eliminar células infectadas por virus, células tumorales o bacterias. Las células dendríticas, generadas a partir de monocitos en cultivo celular o aisladas directamente, pueden usarse para «vacunar» a pacientes para promover la inmunidad natural y específica contra el antígeno frente a células infectadas por virus, células tumorales, bacterias y/u hongos.
Ventajosamente, la presente invención permite la fabricación de productos celulares mediante la clasificación de dos o más parámetros que se pueden realizar en un solo juego de tubos sin requisitos para transferir la suspensión celular de un juego de tubos de un solo uso a otro, evitándose así posibles daños al producto celular (infección, contaminación, aumento de temperatura). Dos aplicaciones de clasificación de parámetros incluyen la generación de linfocitos T reguladores altamente enriquecidos (el producto celular primero se empobrece en CD8 y/o CD19 y/o CD49d y luego se enriquece en CD25), de linfocitos T citolíticos naturales muy enriquecidos (empobrecido en CD3, enriquecido en CD56) y de subconjuntos de células dendríticas de una muestra de sangre muy enriquecidos (empobrecidos en CD19, enriquecidos en CD1c).
En las propuestas de regeneración tisular se suelen utilizar células progenitoras de sangre, médula ósea o tejido para (re)vascularizar tejido, promover la generación de tejido nuevo o proporcionar directamente tejido generado in vitro. Las células utilizadas pueden incluir productos celulares enriquecidos en CD133, CD34, CD271 (LNGFR; células precursoras mesenquimales), anti-MSCA-1 (W8B2; células precursoras mesenquimales), CD144 (células endoteliales).
Es una caracterización específica y novedosa de la presente invención que la fabricación de productos celulares por separación y cultivo de células se pueda realizar en un único juego de tubos sin necesidad de transferir la suspensión celular de un juego de tubos de un solo uso a otro. En particular, la presente invención se puede utilizar para obtener células precursoras, linfocitos T, células dendríticas, células NK, células B, monocitos, células positivas para un marcador particular, como CD133, CD34, CD3, CD4, 8, 56, 19, 14, CD141 (BDCA-3), CD303 (BDCA-2), CD304 (BDCA-4), CD144, CD1c (BDCA-1), NKp46, NKp80, CD45RO, CD45RA, CD137, CD25 o CD138.
Composición/formulación
Es una caracterización específica y novedosa de la presente invención que los productos celulares fabricados mediante operaciones básicas como las descritas anteriormente puedan constituirse para uso clínico directo. Los métodos conocidos en la técnica requieren un procesamiento posterior manual de los productos de células manipuladas para adaptarlo a los requisitos clínicos. Con el sistema de la presente invención, el producto celular puede formularse directamente para uso inmediato. Las etapas de formulación incluyen: ajuste a un volumen deseado o a una concentración celular deseada, intercambio de líquidos de procesamiento por líquidos inyectables, adición de estabilizadores (como plasma o suero autólogo, albúminas séricas, otras proteínas o polímeros sintéticos) o adyuvantes, complementación con agentes crioprotectores como DMSO para almacenamiento posterior, extracción de muestras retenidas para control de calidad, suministro a combinaciones de bolsas o jeringas para perfusión. Algunos componentes de la formulación final, por ejemplo, el plasma, las plaquetas o los componentes de las plaquetas pueden derivarse de la muestra original.
El sistema de separación magnética se puede utilizar para marcar magnéticamente y aislar cualquier sustancia objetivo deseada. De particular interés es la separación de un componente específico de una mezcla compleja. El sistema de separación tiene una gran versatilidad, ya que casi cualquier sustancia objetivo puede separarse una vez que se dispone de un elemento de unión específico. La sustancia objetivo o analito puede ser cualquier elemento de un par de unión específico o una sustancia asociada con un elemento de un par de unión específico. Como ejemplo, se puede usar un par de unión antígeno-anticuerpo de la superficie celular para aislar el propio antígeno, las células que expresan el antígeno, un orgánulo particular implicado en el procesamiento del antígeno, etc. Los métodos de la presente invención también se aplican ventajosamente a técnicas de diagnóstico que implican la unión de un receptor y un ligando, tales como inmunoensayos y similares.
En su forma más simple, un sistema de separación celular tiene dos componentes principales: un separador magnético y un reactivo de separación celular. En la figura 1 se muestra un diagrama esquemático de un dispositivo separador magnético. El diagrama muestra la construcción general del separador y el paso de fluido uniforme que resulta del uso de una matriz de esferas metálicas. La figura 2 muestra un dispositivo de separación más complejo, incluidas las posiciones generales de los conductos de los fluidos, los contenedores de recogida y almacenamiento y la columna de separación. El circuito de fluido puede construirse con válvulas integradas, o las válvulas pueden aplicarse externamente a las vías de fluido.
Un tercer componente opcional del sistema de separación celular es un instrumento de separación celular. La figura 3 representa un instrumento de separación celular, preferiblemente controlado por computadora, que puede incorporar las válvulas junto con un imán, una bomba y un teclado de control. Un dispositivo similar al de la figura 2, construido sin válvulas, puede montarse directamente en el instrumento de la figura 3 para su uso en la separación automatizada de células objetivo.
El reactivo de separación celular, que también puede denominarse conjugado, anticuerpo / reactivo de partículas magnéticas o marcador magnético, incluye un material magnéticamente sensible unido a un elemento de unión específico. Hay muchos materiales magnéticamente sensibles bien conocidos que se utilizan en los métodos de separación magnética. La presente invención implica el uso de partículas o micropartículas magnéticamente sensibles. Las partículas magnéticas adecuadas se describen en la Patente de EE. UU. número 4,452,773, de Molday, y en la Solicitud de Patente Europea EP 452342 B. Las partículas de tamaño coloidal, como las descritas en la Patente de EE. UU. número 4,795,698, de Owen, y la Patente de EE. UU. número 5,200,084 de Liberti et al., también son adecuadas.
El término «elemento de unión específico», como se usa en la presente memoria, se refiere a un miembro de un par de unión específico, es decir, dos moléculas, generalmente dos moléculas diferentes, donde una de las moléculas se une específicamente a la otra molécula por medios químicos o físicos. Los elementos complementarios de un par de unión específico a veces se denominan ligando y receptor. Además de los pares de unión específicos de antígeno y anticuerpo, los pares de péptido-antígeno MHC y receptor de linfocitos T; pares de unión específicos alternativos de interés incluyen biotina y avidina o estreptavidina; carbohidratos y lectinas; secuencias de nucleótidos complementarias (incluyendo secuencias de ácidos nucleicos utilizadas como sondas y agentes de captura en ensayos de hibridación de ADN); ligandos peptídicos y receptor; moléculas efectoras y receptoras; hormonas y proteína fijadora de hormonas; cofactores enzimáticos y enzimas; inhibidores de enzimas y enzimas; marcadores de secreción, como se describe en la Solicitud Internacional PCT/US93/10126; anticuerpos monoclonales autólogos, y similares. Los pares de unión específicos pueden incluir análogos, derivados y fragmentos del elemento de unión específico original. Por ejemplo, un anticuerpo dirigido a un antígeno proteico también puede reconocer fragmentos peptídicos, peptidomiméticos sintetizados químicamente, proteína marcada, proteína derivatizada, etc. siempre que esté presente un epítopo.
Los pares de unión específicos inmunológicos incluyen antígenos y anticuerpos específicos de antígenos o receptores de antígenos de linfocitos T. Los antígenos adecuados pueden ser haptenos, proteínas, péptidos, carbohidratos, etc. Se pueden usar métodos de ADN recombinante o síntesis de péptidos para producir análogos quiméricos, truncados o de cadena simple de cualquier elemento del par de unión, donde las proteínas quiméricas pueden proporcionar mezcla(s) o fragmento(s) del mismo, o una mezcla de un anticuerpo y otros elementos de unión específicos. Los anticuerpos y los receptores de linfocitos T pueden ser monoclonales o policlonales, y pueden ser producidos por animales transgénicos, animales inmunizados, células B humanas o animales inmortalizadas, células transfectadas con vectores de ADN que codifican el anticuerpo o el receptor de linfocitos T, etc. Los detalles de la preparación de anticuerpos y su idoneidad para su uso como elementos de unión específicos son bien conocidos por los expertos en la técnica.
Para abreviar, el sistema de separación se describirá principalmente en términos de su capacidad para seleccionar y separar específicamente una población definida de células (células objetivo) de una población celular mixta, como sangre periférica, médula ósea, sangre del cordón umbilical o placenta, sangre fetal o un producto de leucoaféresis. También se apreciará que algunos tejidos pueden romperse en una sola célula o suspensión monodispersa para permitir el aislamiento de un subconjunto de células particular, como la separación de linfocitos que se infiltran en el tumor de una masa tumoral, la separación de las células de los islotes del tejido renal, etc. Por ejemplo, se pueden marcar diferentes tipos de células con un anticuerpo específico para permitir la purga de células y/o el enriquecimiento de células. La población de células objetivo generalmente se identifica mediante un elemento de unión específico, como se describió anteriormente, que se une selectivamente a un antígeno de la superficie celular presente en las células objetivo. Debe entenderse, sin embargo, que el aparato y el método en cuestión no se limitan a dichos usos.
Para simplificar, el elemento de unión específico se ejemplificará en la presente memoria mediante un anticuerpo. El anticuerpo puede unirse directa o indirectamente a una partícula magnética. Si el anticuerpo se une directamente a la partícula magnética, la población de células objetivo se marca magnéticamente cuando el anticuerpo se une al antígeno de la superficie celular. Si el anticuerpo se une indirectamente a la partícula magnética, la población de células objetivo es susceptible de marcado magnético cuando el anticuerpo se une a las células objetivo. La población celular unida al anticuerpo en realidad se marca poniendo en contacto adicionalmente las células con un elemento de unión específico para el anticuerpo, donde ese elemento de unión específico se une a una partícula magnética. Las células objetivo, identificadas por dicho marcado magnético, se separan luego de otras células por medio de un campo magnético. Por ejemplo, un elemento de unión específico como la avidina se puede conjugar con una partícula magnética donde la avidina se une a un anticuerpo biotinilado, que, a su vez, se une específicamente a las células objetivo.
El elemento de unión específico puede unirse directamente a la partícula magnética. Esto puede lograrse por medio de grupos reactivos en el elemento de unión específica y la propia partícula magnética. Alternativamente, el elemento de unión específica y la partícula magnética pueden unirse por medio de un agente de acoplamiento o conector. Los términos «agente de acoplamiento» o «conector», tal como se utilizan en la presente memoria, incluyen diversos agentes de acoplamiento o de reticulación bifuncionales, es decir, moléculas que contienen dos grupos reactivos o «extremos», que pueden estar separados por un espaciador.
Las matrices de separación magnética de alto gradiente convencionales se preparan normalmente a partir de materiales como alambres, fibra recubierta de metal o lana de acero. En el dispositivo de separación magnética mejorado de la presente invención, la matriz intensificadora de gradiente del separador magnético de alto gradiente se forma a partir de pequeñas esferas de material magnéticamente susceptible o ferromagnético. Dichos materiales incluyen, entre otros, hierro, acero, cobalto-níquel y otros metales de tierras raras ferromagnéticos o aleaciones de los mismos. Por ejemplo, el material de la matriz puede incluir esferas de metal ferromagnético, como esferas de hierro (por ejemplo, MARABU Balls, Kugelfabrik Schulte & Co., Wermelskirchen, Alemania). Se conocen muchos métodos diferentes de fabricación de esferas. Por lo general, las esferas tienen un diámetro medio de aproximadamente 0,2 mm a 1,5 mm para la separación de células grandes o complejos celulares, y aproximadamente de 0,05 mm a 0,2 mm de diámetro para material subcelular. Preferiblemente, las esferas tienen un diámetro medio de aproximadamente 0,2 mm a 0,5 mm, y lo más preferiblemente, las esferas se seleccionan para que tengan un diámetro medio de aproximadamente 0,2 mm a 0,3 mm. Es deseable que el tamaño de las esferas sea relativamente homogéneo, variando normalmente no más de aproximadamente un 15 % del tamaño medio, más normalmente no más de aproximadamente un 10 % y preferiblemente no más de aproximadamente un 5 %.
La forma esférica sustancialmente simétrica y el tamaño sustancialmente uniforme de las esferas son deseables para la construcción de una matriz de separador magnético, ya que las esferas pueden adoptar una configuración reticular en donde los espacios entre las esferas forman canales regulares o poros en la matriz. La configuración reticular es un marco modelado de esferas que forma canales de tamaño regular entre esferas adyacentes y en toda la matriz. Tras la aplicación de un campo magnético al separador, se crean gradientes de campo magnético en los espacios entre las esferas. El tamaño uniforme, y, por lo tanto, el espaciamiento, de las esferas proporciona un gradiente magnético sustancialmente uniforme en toda la matriz y características de flujo de fluido sustancialmente uniformes. En la figura 4 se representa un canal de flujo. Las dimensiones del canal se pueden describir por el tamaño máximo de bola o partícula que cabría entre las esferas de la matriz. Con referencia a la figura 4, la relación geométrica es r = aproximadamente 0,155 R. Se apreciará a partir de las explicaciones de la presente invención que el tamaño del canal se puede ajustar a un diámetro medio óptimo para el procedimiento de separación deseado variando el tamaño de las esferas que se utilizan para formar la matriz.
La forma esférica proporciona la formación de una estructura de matriz sustancialmente estable cuando las esferas se empaquetan dentro de una carcasa que define una cámara de separación. Como se describe en detalle a continuación, la matriz también está recubierta con un material sustancialmente impermeable a los fluidos, tal como un polímero plástico. Con la aplicación de un recubrimiento de polímero plástico, los estrechos espacios entre las esferas están cerrados, lo que da como resultado una matriz hidrodinámicamente optimizada. La matriz ferromagnética resultante ocupará normalmente de manera aproximada del 60 % al 75 % del volumen total de la cámara de separación y será permeable a los fluidos. El recubrimiento impermeable ocupará aproximadamente del 1 % al 5 % del volumen total. El volumen libre será de aproximadamente el 20 % al 40 % del volumen total de la cámara de separación. En una realización preferida, la matriz total ocupará aproximadamente del 75 % al 80 % del volumen total de la cámara de separación.
La figura 1 presenta un esquema de una columna de separación ejemplar. Las esferas no están representadas a escala, sino para representar mejor la formación de una matriz 6 tridimensional permeable a fluidos. Las esferas están empaquetadas en una carcasa 4 que está hecha de un material no magnético. La carcasa del separador magnético sirve como cuerpo de la columna de separación, y el interior de la carcasa define una cámara de separación. Las carcasas de varias longitudes, formas y diámetros se hacen ventajosamente de plástico. Los materiales no magnéticos adecuados para la construcción de una carcasa de separador magnético incluyen acero inoxidable, vidrio, plástico, etc.
En una realización preferida, la carcasa del separador magnético es un plástico al que se adherirá el recubrimiento de la matriz, lo que permite mejores propiedades hidrodinámicas en el límite de la matriz y la carcasa. Se apreciará que el material de recubrimiento y el material de la carcasa se seleccionarán por su compatibilidad entre sí, por ejemplo, se debe seleccionar un recubrimiento de laca que no dé lugar a la acumulación de desechos plásticos no adherentes en la columna. Se conocen varios mecanismos por los que los materiales se adhieren entre sí, y pueden aprovecharse para este fin. Convenientemente, la selección de compatibilidad se puede hacer en base al disolvente usado junto con la laca. El disolvente será ligeramente reactivo con la carcasa de plástico, de modo que se adherirá la laca en el disolvente, pero no será tan reactivo como para que la integridad estructural de la columna se vea comprometida durante el procedimiento de curado de la laca. Por ejemplo, el material de recubrimiento se puede seleccionar para incluir un disolvente que provoque una ligera disolución del interior de la carcasa de plástico. T ras el curado, el plástico vuelve a endurecerse uniendo o sellando el material de recubrimiento y el material de la carcasa entre sí. Un experto en la técnica apreciará que la información relativa a tal reactividad está generalmente disponible. Un ejemplo de una combinación adecuada de disolvente y carcasa es la metil etil cetona y el plástico ULTEM® (General Electric).
Preferiblemente, cada uno de los materiales seleccionados para la construcción de la columna 2 de separación también será compatible con los procedimientos de esterilización. Preferiblemente, la carcasa tiene forma cilíndrica para facilitar el flujo de la muestra a través de la cámara de separación, así como la formación de la matriz 6 tridimensional dentro de la carcasa. Las paredes de la carcasa tienen preferiblemente un espesor de aproximadamente 1 mm a 3 mm. La columna de separación tiene puertos de entrada 12 y salida 14 para la introducción y descarga de fluidos. Generalmente, los puertos de entrada y salida son estructuras estrechas en relación con el cuerpo principal de la carcasa. Esto facilita la unión del separador a otros circuitos de fluidos en un sistema de separación y mantiene ventajosamente el dispositivo como un sistema cerrado. Los puertos de entrada y salida pueden colocarse en sitios diferentes a los que se muestran en la figura 1, pero se apreciará que la estructura general del separador preferiblemente proporcionará una cámara de separación que tenga la menor cantidad de curvas o esquinas que, de lo contrario, podrían ralentizar el flujo de fluido o crear espacios donde la muestra pueda acumularse.
En la entrada y salida de la columna, la columna está construida para tener un mecanismo de alimentación que garantice una distribución y flujo homogéneos óptimos a través de la matriz. El mecanismo de distribución está compuesto por el volumen frente a la capa 8 de tapadera y la capa de tapadera misma, que sirve como resistencia de flujo. El volumen de distribución (en mililitros) se puede definir en relación con el ancho de la columna (en milímetros), normalmente con una relación de aproximadamente 0,1 a 10. El volumen de la cámara frente a la capa 10 base, así como la propia capa base, también sirve como mecanismo de alimentación para los fluidos que pasan a la cámara a través del puerto de salida.
Es preferible tener dimensiones de columna en las que la relación entre el diámetro y la longitud sea de al menos 0,2 a 1. Las dimensiones reales de la columna dependerán del material que se esté separando y del caudal deseado para la separación. Las dimensiones de la columna proporcionarán una cámara que aceptará una matriz que tenga un área adecuada para crear suficientes gradientes de campo magnético en la cámara de separación y que permita una retención eficiente del material marcado magnéticamente. El volumen necesario para una separación determinada puede determinarse empíricamente y variará con el tamaño, la densidad del antígeno en la superficie celular, la afinidad del anticuerpo, etc. Como ejemplo, un área de sección de 3 cm2 permite un caudal de 5 ml/min a 40 ml/min. La capacidad de unión de una matriz de 2 cm x 4 cm es de aproximadamente 109 células marcadas.
Para facilitar la fabricación de la columna de separación, la capa 10 base de material poroso no magnético se coloca en la carcasa de manera que cuando las esferas ferromagnéticas se colocan en la cámara no pasan por el puerto 14 de salida. Materiales porosos adecuados para la formación de la capa base incluyen, entre otros, plástico poroso, metales sinterizados o vidrio, rejillas, etc. Por ejemplo, pueden usarse diversas fritas porosas disponibles de Porex Singwitz, Alemania. Normalmente, el material poroso tendrá un tamaño de poro de aproximadamente 20 pm a 200 pm, preferiblemente de 50 pm a 150 pm. Se seleccionará un tamaño de poro adecuado según las dimensiones de la sustancia objetivo y la composición del material de muestra. Además, el tamaño de los poros no será tan grande como para permitir que las esferas llenen las aberturas porosas del material de la capa. Después de la inserción de las esferas en la cámara, la carcasa se puede sacudir o hacer vibrar para facilitar el asentamiento de las esferas en una configuración más uniforme. Opcionalmente, la capa 8 de tapadera de material poroso no magnético se coloca en la carcasa sobre la matriz para mantener la configuración uniforme de la matriz durante el almacenamiento, la manipulación y el uso. También se puede aplicar presión a la capa 8 de tapadera para empaquetar más firmemente las esferas dentro de la cámara. La porción 16 superior de la columna de separación, que incluye el puerto 12 de entrada en esta realización, se coloca luego en la parte superior de la carcasa 4 y se une a la carcasa. Por ejemplo, cuando se utilizan materiales plásticos, la parte 16 superior puede pegarse o soldarse ultrasónicamente a la carcasa 4 para completar la formación de la columna de separación. Tras la finalización de la carcasa, se recubre la matriz.
Con referencia a la figura 1, se aplica un recubrimiento a la matriz permeable a fluidos descrita anteriormente. El recubrimiento se selecciona para que sea sustancialmente impermeable a los iones y, por lo tanto, protege el material de la matriz metálica de la corrosión y también inhibe el escape de cationes de la matriz, lo que podría dañar las células. Además de la formación de una capa protectora impermeable sobre el material de la matriz, un recubrimiento completo de la matriz cierra los espacios entre las esferas, proporcionando estabilidad mecánica a la matriz y una matriz hidrodinámicamente optimizada. Tal estabilidad mecánica es particularmente ventajosa cuando la matriz se forma a partir de pequeñas esferas de metal sensible o susceptible magnéticamente, como se ha descrito anteriormente. Un material de recubrimiento tal como un recubrimiento de laca puede fluir al puerto 12 de entrada de la columna de separación. La laca fluye a través de la capa 8 de tapadera, la matriz 6 y la capa 10 base, recubriendo así la superficie porosa de cada componente. Se permite que pase el exceso de laca desde el puerto 14 de salida de la cámara. La columna de separación recubierta puede centrifugarse para expulsar más el exceso de material de recubrimiento de la cámara. A continuación, se deja secar el recubrimiento. La columna de separación se puede calentar para promover aún más el secado del recubrimiento. Por ejemplo, la columna de separación recubierta se puede colocar en un horno a 110 °C durante cuatro o cinco horas, seguido de un secado continuo a temperatura ambiente durante tres a siete días.
Al secarse, el recubrimiento se endurece, proporcionando así soporte mecánico a la matriz. Este soporte mecánico no solo ayuda a mantener la integridad de la matriz durante el almacenamiento y la manipulación de la columna de separación, sino que también proporciona a la matriz una estructura rígida que no muestra una elasticidad significativa. Esta rigidez es ventajosa porque, de lo contrario, la matriz podría deformarse con la aplicación de un campo magnético externo a la columna de separación. La intensidad del campo magnético aplicado de los medios magnéticos externos está normalmente dentro de un intervalo de aproximadamente 0,1 tesla a aproximadamente 1,5 tesla, y más preferiblemente entre aproximadamente 0,2 tesla y aproximadamente 0,8 tesla. El campo debe ser lo suficientemente grande y la distancia entre el imán y la columna de separación debe ser lo suficientemente pequeña para inducir gradientes de campo magnético intensificados dentro de la matriz. Para mantener gradientes magnéticos uniformes en el separador, el material de la matriz debe moverse o desplazarse en la cámara tras la aplicación del campo magnético. Los componentes metálicos esféricos, la carcasa y el recubrimiento se combinan ventajosamente para proporcionar una matriz mejorada con suficiente rigidez para resistir una deformación sustancial cuando la columna de separación se coloca dentro de un campo magnético.
Es preferible recubrir la matriz mientras los componentes metálicos esféricos están dentro de la carcasa de la columna de separación. Recubrir la matriz dentro de la carcasa evita que se rompa la matriz después de que se haya aplicado el recubrimiento. Además, la matriz dentro de la carcasa sirve para llenar o sellar pequeños espacios vacíos, grietas intersticiales formadas cerca de los puntos de contacto entre las esferas, así como entre las esferas y la carcasa, al tiempo que proporciona una superficie uniforme a los canales o formados por los puntos separados de las esferas. Estos canales o poros dan como resultado la permeabilidad de la matriz. Al sellar los espacios vacíos, hay una disminución en las áreas donde las células u otros componentes sólidos de la muestra podrían acuñarse o quedar atrapados físicamente, incluso en ausencia de un campo magnético.
En la columna de separación completa, la selección de los materiales de recubrimiento de la matriz dará como resultado preferiblemente canales o vías a través de la matriz permeable con un diámetro medio de 20 gm a 60 gm y una ocupación de aproximadamente el 60 % al 80 % del volumen total de la cámara de separación. Por ejemplo, una columna de separación para la separación de glóbulos sanguíneos puede tener un promedio de tamaño de canal recubierto final de 20 gm, ocupando la matriz aproximadamente el 80 % del volumen total de la cámara.
Después de la preparación del recubrimiento sustancialmente impermeable, la matriz y otras superficies interiores de la cámara de separación se tratan preferiblemente mediante la adición de un material hidrofílico tal como polividona (BASF, Ludwigshafen, Alemania). Otros materiales de recubrimiento hidrofílicos adecuados incluyen, entre otros, polivinilpirrolidina, polietilenglicol, hidroxietilalmidón y recubrimientos hidrofílicos, como acrilamidas, tensioactivos o agentes humectantes de tipo detergente, y material biológico que incluye, entre otros, heparina y albúmina de suero humano. La superficie interior de la cámara de separación también se puede hacer hidrófila mediante grabado con plasma o corona de la superficie. El recubrimiento hidrófilo proporciona al interior de la columna de separación y a la matriz permeable a los fluidos una superficie fácilmente humectable. Al mejorar la humectabilidad de estas superficies, la introducción de fluido en la columna de separación producirá un frente de fluido uniforme a medida que pase a través de la cámara. Esto facilita la eliminación de burbujas de aire de la matriz permeable y otros espacios vacíos en la cámara de separación. Es deseable mantener la columna de separación y otros componentes del dispositivo como un sistema cerrado sustancialmente exento de aire durante el procedimiento de separación. La presencia de aire en el sistema durante la separación de las células objetivo afecta las tensiones superficiales interiores y las áreas sin ventilación, lo que puede conducir a la destrucción de las células.
Haciendo referencia a la figura 2, que representa un dispositivo de separación, la columna 40 de separación puede estar precedida por un dispositivo de prefiltración. La figura representa el dispositivo de prefiltración como una columna 30, sin embargo, se entenderá que pueden resultar útiles otras configuraciones, como un prefiltro. La columna de prefiltración es generalmente una estructura tridimensional que puede ser sustancialmente idéntica a la columna de separación en términos de su composición estructural. Sin embargo, la columna de prefiltración puede tener diferentes dimensiones, la matriz puede estar hecha de esferas con una composición diferente, por ejemplo, un material no ferromagnético, o la matriz puede estar hecha de esferas con un diámetro diferente del de las utilizadas en la columna de separación, proporcionando así un tamaño de poro o canal diferente al que se encuentra en la columna de separación. En una realización, la columna de prefiltración es idéntica a la columna de separación. El paso de la muestra a través de la columna de prefiltración sirve para atrapar y eliminar los componentes del fluido que no se desean en el producto de separación final. Por ejemplo, en separaciones de células sanguíneas, las células «pegajosas» tales como monocitos, granulocitos y plaquetas pueden eliminarse de la suspensión celular mediante la columna de prefiltración. Alternativamente, la columna de prefiltración puede construirse para tener un tamaño de poro medio que sea más pequeño que el que se encuentra en la columna de separación. Por ejemplo, el tamaño de poro de la matriz permeable se puede seleccionar para eliminar las células tumorales grandes de la muestra antes del paso del fluido a través de la columna de separación. El paso de la muestra de fluido a través de la columna de prefiltración también puede servir para romper agregados, tales como agregados celulares, que puedan existir en el fluido. Además, debido a que la columna de prefiltración contiene materiales sustancialmente idénticos a los de la columna de separación, aquellos componentes de la muestra que podrían unirse de manera no específica a la columna de separación son atrapados ventajosamente por la columna de prefiltración. Por lo tanto, la columna de prefiltración reduce la posibilidad de ensuciar la columna de separación durante el procedimiento de separación y reduce la acumulación de células o componentes fluidos no deseados en el producto de separación final.
Con referencia a la figura 2, se representa una realización preferida del dispositivo 25 de separación. El contenedor 81 de muestra está conectado a un filtro 35 de suspensión opcional. El filtro de suspensión puede usarse para eliminar componentes en forma de partículas no deseados de la muestra de fluido y se selecciona para tener un tamaño de poro suficiente para eliminar los materiales en forma de partículas por encima de un cierto tamaño. Por ejemplo, el filtro de suspensión puede ser un filtro Pall (Pall SQ40S; Pall Biomedical, Inc., Puerto Rico) con un tamaño de poro seleccionado para eliminar materiales en forma de partículas mayores de 40 pm, como coágulos celulares y grumos en muestras de células hematopoyéticas. El filtro de suspensión está conectado por la vía de fluido dos 12 al puerto 32 de entrada de la columna 30 de prefiltración.
El puerto 34 de salida de la columna 30 de prefiltración está conectado por la vía de fluido cinco 15 al puerto 42 de entrada de la columna 40 de separación al que se aplicará el campo magnético en el curso del procedimiento de separación. El puerto 44 de salida de la columna de separación está conectado por la vía de fluido ocho 18 al canal 88 de distribución que conduce al contenedor 83 de recogida de producto, al contenedor 84 de residuos de lavado final y al contenedor 85 de muestra sin etiquetar. Las vías de fluido separadas nueve 19, diez 20 y once 21 conducen a estos contenedores, respectivamente.
Este dispositivo de separación incluye, además, un contenedor 80 de lavado o tampón y un contenedor 82 de residuos de lavado inicial, que están conectados por las rutas de fluido uno 16 y tres 17, respectivamente, a la ruta de fluido dos 12. El contenedor 80 de tampón también está conectado a través de una línea 90 de lavado o tampón (vía de fluido seis) al canal 88 de distribución. La línea de tampón está conectada, además, a la vía de fluido cinco 15 por medio de la vía de fluido cuatro 14. Las vías de fluido, los contenedores, los filtros y las columnas pueden acoplarse entre sí mediante cualquier medio adecuado como puntas comunes, cierres Luer, conectores macho-hembra, conectores en T, conectores en Y y conectores de 4 vías u otros accesorios que se usan comúnmente en equipos de suministro de solución intravenosa.
El flujo de fluido a través del circuito de fluido del dispositivo de separación puede controlarse por medio de válvulas colocadas dentro de la(s) vía(s) de fluido. Las vías de fluido del uno al once están asociadas con las válvulas correspondientes del uno al once (1 -11). Las válvulas pueden estar dentro de las propias vías o pueden ser externas a las vías. El flujo de fluido también puede ser controlado por una bomba. Por ejemplo, cuando los conductos de fluidos están hechos de un material flexible, como un tubo flexible, las válvulas adecuadas para el control del transporte de fluidos incluyen válvulas de manguito. Las válvulas de manguito cierran la vía del fluido presionando las paredes del tubo una contra la otra. Los expertos en la técnica apreciarán que tales válvulas de manguito se seleccionarán para acomodar el tamaño del tubo elegido para su uso como vía de fluido. Además, la fuerza de compresión de la válvula de manguito se seleccionará para lograr la compresión del tubo elegido y, por lo tanto, afectar el cierre de la vía del fluido. Las especificaciones de la válvula, por lo tanto, coincidirán con las especificaciones de debilidad o dureza (durómetro) del tubo seleccionado.
Una realización del dispositivo de separación incluye, además, el circuito 92 de recirculación (vía de fluido siete) de modo que el fluido que ya ha pasado a través de la columna 40 de separación pueda recircularse a través de la columna de separación. Normalmente, se conectará una bomba 64 al circuito de recirculación para facilitar el reciclaje de fluido a través de la columna de separación, así como para controlar el flujo a través de la columna. Los expertos en la técnica apreciarán que se pueden utilizar diversas bombas. Un ejemplo de bomba es una bomba peristáltica que puede controlar el paso de fluido a través del circuito de recirculación en cualquier dirección y a velocidades variables. El dispositivo de separación que tiene un circuito de recirculación permite separaciones secuenciales en una columna, mediante un procedimiento de unión y elución, seguido de una segunda unión y elución. Las separaciones secuenciales proporcionan una mayor pureza en la población objetivo final.
La figura 2 representa esquemáticamente una realización preferida de un dispositivo de separación. Sin embargo, se apreciará que se puede lograr un procedimiento de separación utilizando los componentes básicos del sistema, es decir, el separador magnético mejorado y los contenedores de recogida.
Los expertos en la técnica apreciarán que los medios de recirculación y las vías de flujo de fluido también son adecuados para su uso en sistemas de separación alternativos. Por ejemplo, los medios de recirculación pueden utilizarse ventajosamente en un sistema en donde los medios de separación impliquen técnicas centrífugas, columnas de absorción o medios químicos como alternativas a los medios de separación magnéticos o electromagnéticos.
En un procedimiento ejemplar de separación de células, las rutas de fluido y las columnas se ceban permitiendo que un líquido de lavado fluya a través de todas las rutas y columnas de fluido, preferiblemente a velocidades y presiones de flujo variables. El líquido de lavado puede contener materiales como una proteína fisiológicamente aceptable, como la albúmina de suero humano (HSA, por sus siglas en inglés), que impide que las células se adhieran a las superficies interiores de los componentes de plástico del dispositivo. El líquido de lavado también puede contener pequeñas cantidades de tensioactivos o detergentes fisiológicamente aceptables, para mejorar la humectación de las superficies interiores.
Se encuentra que las burbujas de aire grandes en las vías de fluido son perjudiciales para la recuperación de células viables. Los métodos para eliminar las burbujas de aire de las vías de los fluidos son conocidos en la técnica y pueden emplearse para este fin. Un método de particular interés aprovecha la observación de que una frita permeable como las utilizadas en la capa de tapadera y/o la capa base no permitirá el paso de burbujas de aire a caudales de fluido menores que aproximadamente 400 ml/min. Se puede limpiar una columna de burbujas de aire haciendo circular líquido de lavado a través de un circuito de recirculación a velocidades de flujo menores que aproximadamente 400 ml/min. Las burbujas de aire luego se acumulan fuera de la columna en las capas base y/o de tapadera. A continuación, se invierte la dirección del flujo y las burbujas se eliminan del sistema por lavado en una bolsa de residuos adecuada. Preferiblemente, la secuencia se repite para asegurar la eliminación de todas las burbujas. Las burbujas existentes pueden agrandarse intencionalmente mediante la generación de presión negativa.
En tal procedimiento ejemplar, se pueden usar anticuerpos conjugados magnéticamente para dirigirse específicamente a las células deseadas en una población de células mixtas. El reactivo magnético se incuba con la población de células mixtas, luego las partículas no unidas se eliminan por lavado por cualquier medio conveniente, por ejemplo, centrifugación, etc. Cuando se desea la esterilidad celular, las incubaciones y lavados de anticuerpos se pueden realizar en un procedimiento en recipiente cerrado, donde los anticuerpos y los líquidos de lavado se añaden a un contenedor estéril por medio de una jeringa estéril o un dispositivo similar. De esta forma, se minimiza la contaminación de las células deseadas por microorganismos transportados por el aire. En un sistema cerrado de este tipo, particularmente cuando el contenedor es una bolsa flexible, la mezcla de células y anticuerpos puede mejorarse inyectando una pequeña cantidad de aire estéril, en una proporción de aproximadamente 0,5 a 2 de aire a líquido, en el contenedor.
La suspensión de células incubadas, que ahora contiene células objetivo marcadas magnéticamente, se hace pasar a través del dispositivo de separación. El sistema transporta las células a través de un separador magnético que se coloca dentro de un campo magnético o se encuentra junto a un campo magnético. La fuente del campo magnético puede ser un imán permanente o un electroimán. La columna de separación se construye preferiblemente para incluir una matriz ferromagnética de esferas ferromagnéticas apiladas, como se ha descrito anteriormente. Opcionalmente, la muestra se hace pasar a través de una columna de prefiltración, también construida como se describió anteriormente, antes del paso a través de la columna de separación. Si la columna de separación contiene una matriz compuesta por esferas distintas a las ferromagnéticas, entonces la muestra se puede hacer pasar primero a través de una columna de prefiltración que sea sustancialmente idéntica a esa columna de separación.
Las células marcadas magnéticamente se acumulan en la columna de separación en respuesta al campo magnético. Las células no marcadas y otros componentes de la suspensión pasan a través de la columna de separación hacia un contenedor de muestras no marcadas y/o contenedor de desechos. A continuación, las células marcadas o purificadas se pueden eluir de la columna de separación retirando la columna de separación del campo magnético o retirando el campo magnético de la columna de separación. Se pasa una solución de lavado, como un líquido tamponado, a través de la columna de separación para lavar las células marcadas de la columna de separación y en un contenedor de recogida de productos. El contenedor de recogida se puede utilizar para el procesamiento posterior de las células objetivo o la crioconservación de las células objetivo.
En realizaciones preferidas, la columna de separación es una columna de separación magnética de alto gradiente construida a partir de esferas ferromagnéticas, como se describió anteriormente. Los contenedores a los que se hace referencia en la presente memoria son normalmente bolsas de plástico, como las que se utilizan para el almacenamiento y suministro de fluidos intravenosos, pero se puede utilizar cualquier contenedor adecuado. Los contenedores se seleccionarán por su volumen necesario de almacenamiento o recogida, su capacidad de esterilización y su capacidad para usarse en un sistema cerrado, es decir, un sistema de separación del cual se puede eliminar sustancialmente todo el aire antes del uso.
En otra realización, las células marcadas magnéticamente se recirculan a través de la columna de separación para mejorar la selección de las células objetivo y la eliminación de células no deseadas u otros componentes de la suspensión. Algunas realizaciones preferidas también incluyen el uso de una columna de prefiltración. La columna de prefiltración, sin embargo, no está sometida a un campo magnético. En cambio, el paso preliminar de la suspensión celular a través de la columna de prefiltración da como resultado la captura de componentes o materiales de la suspensión que, de lo contrario, podrían unirse de forma no específica a la columna de separación. Tal unión no específica puede causar el bloqueo o la obstrucción de la columna de separación, lo que a su vez podría inhibir o reducir la separación y recogida de la población de células marcadas.
Las vías de fluido, los contenedores de recogida, el filtro de suspensión, la columna de prefiltración y la columna de separación pueden construirse, interconectarse y suministrarse como un dispositivo de separación desechable. Las células objetivo se recogen preferiblemente en un contenedor de transferencia de sangre estéril desde el que se pueden trasplantar las células al paciente o en el que las células se pueden almacenar o someter a un procesamiento adicional. El dispositivo completo de separación de células se puede empaquetar previamente en contenedores adecuados. El dispositivo preempaquetado se puede esterilizar y proporcionar listo para usar en el procedimiento de separación magnética mejorado. Los reactivos necesarios para el procedimiento de separación deseado también se pueden proporcionar en forma de equipo. Por ejemplo, un conjugado específico para la población de células objetivo u otro analito puede proporcionarse por separado o con el dispositivo. El equipo también puede incluir soluciones de lavado, por ejemplo, solución salina estéril común y/u otros líquidos tamponados, como solución salina tamponada con fosfato, EDTA 1 mmol/l y albúmina de suero humano al 0,5 %. Estos reactivos u otras soluciones se pueden proporcionar en contenedores como bolsas de plástico que se pueden conectar a los conductos de fluido apropiados del dispositivo de separación de células.
El sistema de separación mejorado puede estar totalmente automatizado. En el sistema automatizado, una computadora controla el flujo de fluidos a través del circuito de fluidos y la columna de separación, controla la intensidad del campo magnético o la ubicación del imán y/o la columna de separación para proporcionar la retención y liberación de las células objetivo o analitos marcados magnéticamente, y dirige los productos finales de recogida a los contenedores apropiados.
Una realización de un instrumento de separación celular automatizado, como se representa en la figura 3, incluye componentes mecánicos, electromecánicos y magnéticos. Los componentes mecánicos pueden incluir: una cubierta o carcasa 15 exterior del instrumento; soporte 21 de contenedor ajustable; bomba 64 peristáltica; soporte 32 de columna de prefiltración y soporte 42 de columna de separación. Los componentes electromecánicos pueden incluir: válvulas 1-11 de manguito de solenoide; un motor interno (no mostrado) para accionar la bomba 64 peristáltica; un motor interno (no mostrado) para mover el soporte 42 de la columna de separación (y, por lo tanto, mover la columna 40 de separación) dentro, o fuera, del campo magnético, o para mover el imán 50; y un detector 65 de burbujas (sensor ultrasónico), que se usa para detectar la presencia de fluido en el circuito de fluido. Los medios magnéticos pueden incluir imanes permanentes y electroimanes. Se apreciará que estos componentes individuales se pueden seleccionar de una serie de alternativas fácilmente disponibles y se pueden combinar en diversas configuraciones sin apartarse de la descripción general del sistema de separación magnética mejorado.
En una realización preferida del dispositivo de separación, las vías de fluido, los contenedores de solución y recogida, el filtro de suspensión, la columna de prefiltración, la columna de separación y los conectores se proporcionan como un componente desechable preensamblado para el sistema de separación. El dispositivo de separación está montado en el instrumento de separación para la realización del procedimiento de separación. Una vez finalizado el procedimiento de separación, se puede retirar el contenedor de recogida del producto y desechar los componentes restantes del dispositivo de separación.
Preferiblemente, un microprocesador incorporado (no mostrado) controla todos los componentes electromecánicos del instrumento, y el software dirige el sistema para realizar las operaciones apropiadas en una secuencia común. Una pantalla 62 y un teclado 60 de operador permiten al operador monitorear el funcionamiento del sistema automático y controlar el funcionamiento del instrumento en un modo manual. Se puede conectar una impresora (no mostrada) al microprocesador para imprimir información del procedimiento, marcas, etc.
La figura 3 muestra un instrumento de separación y un dispositivo de separación montado. En esta realización, el dispositivo de separación se monta o instala sobre el instrumento colocando el tubo de las vías de fluido en sus respectivas válvulas 1-11 de manguito externas, como se ha descrito anteriormente. La columna 30 de prefiltración se coloca dentro del soporte 32 de columna de prefiltración. La columna 40 de separación se coloca dentro del soporte 42 de la columna de separación que se mueve en relación con el imán 50 por medio del brazo 44 retráctil. La abrazadera 20 ajustable se usa para asegurar el brazo 21 de suspensión en una posición elevada. Hay monturas o clavijas 22 en el brazo de suspensión sobre las que colocar el contenedor 82 de residuos de lavado inicial y los contenedores de tampón y muestra (no mostrados) según corresponda. El aparato puede incluir, además, un compartimento 70 de almacenamiento para separar el contenedor de residuos final y el contenedor de muestras sin marcar del contenedor de recogida del producto (no mostrado).
Como se mencionó anteriormente, los sistemas de separación descritos anteriormente pueden integrarse, además, con varios sistemas de procesamiento de muestras/células para llevar a cabo las etapas de preparación de muestras antes de la separación de los componentes de la muestra mediante las técnicas de separación de base magnética descritas. La figura 5 ilustra un sistema. Como se describió anteriormente, un sistema puede incluir varios componentes mecánicos, electromecánicos y magnéticos. El sistema 100 incluye una unidad 106 de separación y una unidad 104 de procesamiento integradas en un solo sistema que contiene una cubierta exterior o carcasa 105. El sistema 100 puede incluir un sistema o unidad de separación magnética similar a los descritos anteriormente. El sistema 100 incluye una unidad 106 de separación magnética que incluye una carcasa para colocar una columna de separación (por ejemplo, columna de separación magnética como se describió anteriormente, figura 1) en la unidad 106 de separación magnética. El sistema 100 incluye, además, una bomba 108 y una pluralidad de medios o válvulas de control de flujo de fluidos, como se ilustra con la válvula 110. Se observa que, mientras que solo la válvula 110 se identifica específicamente por número, el sistema 100, como se muestra en la figura 5, ilustra una serie de válvulas que se pueden identificar por tener una estructura ilustrada idéntica a la de la válvula 110. Se reconocerá, además, que mientras que cada uno de la pluralidad de medios/válvulas de control de flujo son idénticos en la figura 5 con fines ilustrativos, los medios de control de flujo pueden adoptar diversas realizaciones y pueden incluir uno o más tipos diferentes de medios/válvulas en un solo sistema. Los componentes del sistema 100 (por ejemplo, válvulas, bomba, unidad de separación, etc.) pueden acoplarse o conectarse mediante una o más vías de flujo para formar una serie de vías de fluido o circuitos de fluido similares a los discutidos anteriormente. El sistema incluye, además, un sistema o unidad 112 de control por computadora que proporciona supervisión y/o control de uno o más aspectos del sistema 100.
El sistema 112 informático, como se ha descrito anteriormente, puede incluir uno o más dispositivos de entrada y/o salida, pantallas gráficas, interfaces de usuario y puede permitir el control manual y/o automatizado del funcionamiento y las funciones del sistema 100. El sistema 112 de control por computadora puede incluir un módulo o sistema para procesar información (por ejemplo, información de flujo, etc.) dentro del sistema 100 y puede incluir una gran variedad de computadoras, componentes o dispositivos electrónicos patentados y/o disponibles comercialmente que tienen una o más estructuras de procesamiento y similares, comprendiendo dichos sistemas a menudo hardware y/o software de procesamiento de datos configurados para implementar cualquiera de las etapas del método, o una combinación de ellas, como se describe en la presente memoria. El software generalmente comprenderá un código legible por máquina de instrucciones de programación incorporadas en un medio tangible como una memoria, un medio de grabación digital u óptico, señales de telemetría óptica, eléctrica o inalámbrica, o similares, y también se pueden usar una o más de estas estructuras para generar o transmitir datos, señales o información entre componentes del sistema en cualquiera de una gran variedad de arquitecturas de procesamiento de señales.
El sistema puede incluir, además, varios soportes, sensores, carcasas, etc. para varios componentes que pueden acoplarse con el presente sistema para realizar los métodos descritos en la presente memoria. El sistema 100 incluye, además, una o más estructuras 114 de soporte configuradas para sostener y/o soportar varios fluidos, reactivos, muestras de depósitos de fluidos, filtros y similares que se pueden utilizar con el sistema 100. Las estructuras de soporte pueden incluir varios ganchos o colgadores, o configuraciones de portafiltros (por ejemplo, portafiltros o carcasa) y no se limitan a ningún diseño en particular. Los fluidos, tampones, reactivos, etc. colocados en un soporte 114 se pueden acoplar a una vía o tubo de fluido, que, a su vez, se puede conectar a más o más componentes del sistema 100. El sistema 100 puede incluir sensores para monitorear y/o controlar aún más el flujo de fluido a través del sistema. Los sensores pueden incluir, por ejemplo, sensores de líquidos, que pueden incluir detectores de burbujas (detector ultrasónico), sensores de presión y similares. Se muestran el detector 116 de burbujas y los sensores 118 de presión. Se muestra un soporte 120, que puede configurarse para albergar un filtro o unidad de reducción de volumen. El área 122 de recogida puede albergar contenedores de recogida, reactivos, etc.
El sistema 100 se ilustra adicionalmente con referencia a la figura 6. La unidad 104 de procesamiento puede incluir un alojamiento o cubierta 124, que puede moverse (por ejemplo, retirarse) alrededor de una o más bisagras. La cubierta 124 define, al menos parcialmente, un área 126 de procesamiento que puede controlarse por temperatura y acoplarse a componentes de control y monitoreo de temperatura que pueden alojarse dentro de la carcasa 105 del sistema 100. La unidad 104 de procesamiento incluye una cámara 128 de muestra configurada para contener y procesar (por ejemplo, centrifugación, cultivo, separación de componentes de la muestra, etc.) una muestra. La cámara 128 de muestra que se presenta es una cámara giratoria mantenida en posición alrededor de un eje que puede incluir un bloqueo 130 antirrotación. La unidad 104 de procesamiento puede incluir uno o más sistemas de detección, como un detector 132 óptico colocado dentro de la cubierta 124 y configurado para detectar o monitorear el procesamiento de una muestra en la cámara 128. Una o más líneas de entrada/salida de fluido pueden acoplarse a la cámara 128 y pueden mantenerse en posición mediante un soporte 134.
La figura 7 ilustra una vista posterior del sistema 100. La unidad 112 de control de la computadora se muestra con un componente acoplado a la carcasa 105 del sistema sobre un pivote giratorio, y la unidad 112 tiene una ranura 138 de entrada de medios de almacenamiento (por ejemplo, tarjeta de programa). Se muestra el colgador 140, que puede proporcionar soporte para componentes externos, equipos de recogida, etc. El sistema 100 incluye conexión de alimentación e interruptor 142 y varias conexiones 144 de interfaz (por ejemplo, conexión de lector de código de barras, conexión de impresora, conexión de red, etc.); respiradero 146; y disipador 148 de calor que proporciona un componente de los sistemas de control de temperatura internos.
Los componentes de una unidad de procesamiento, incluida una cámara de muestra, se describen con más detalle con referencia a las figuras 8 a 12. Con referencia a la figura 8, la cámara 150 de procesamiento se ilustra con una parte 152 superior y una parte 154 de base inferior. La parte 152 superior puede incluir una estructura 156 de refuerzo o soporte. La cámara 150 incluye, además, un eje 158 alrededor del cual gira la cámara 150, teniendo el eje 158 un bloqueo giratorio y extendiéndose el eje 158 a través de aproximadamente el centro de la cámara 150 y extendiéndose hacia afuera de la parte 152 superior. El medio de rotación o cojinete 160 proporciona movimiento de rotación de la cámara 150 alrededor del eje 158. La cámara 150 incluye, además, puertos de fluido o conexiones de línea 162, 164 acoplados a una estructura de carcasa que rodea el eje 158, y puertos 162, 164 conectados de forma fluida a uno o más compartimentos internos de la cámara 150 de procesamiento.
Uno de los puertos puede usarse como respiradero para intercambiar gases.
Se describe una cámara de procesamiento con referencia a la figura 9. La cámara 170 incluye una parte 172 superior y una parte 174 inferior, con un eje 176 de rotación y puertos 178, 180 configurados de manera similar a la descrita anteriormente. La parte 172 superior incluye una estructura 182 de soporte, así como una estructura 184 que incluye un canal 186 que puede incluir al menos una parte visible a través de una ventana o un prisma 188. El canal 186 puede acoplarse de forma fluida a un compartimiento de contención de muestras en la cámara 170 y configurarse para monitoreo externo o detección de procesamiento de muestras. Por ejemplo, un componente (por ejemplo, células) en fluido en el canal 186 puede separarse visiblemente durante las etapas de procesamiento, lo que indica la separación de células o componentes de muestra en uno o más compartimentos internos de la cámara.
La cámara 170 puede comprender, además, al menos un respiradero, que preferiblemente comprende una membrana o tampón hidrofóbico estéril. Preferiblemente, estas membranas o tampones pueden ubicarse en la parte superior o inferior de la cámara. Al menos el respiradero en la cámara tiene la ventaja particular de que el volumen en la cámara se puede cambiar fácilmente sin cambiar la presión en la cámara o proporcionar puertos de entrada y/o salida adicionales para el intercambio de aire o gas.
Las centrífugas permiten una centrifugación tanto por lotes como continua: muestras, medios, gases y otros materiales pueden entrar y salir del sistema, por ejemplo, a través de los puertos de entrada y salida (por ejemplo, 178 y 180 en la figura 1) sin necesidad de detener la rotación de la cámara de centrifugado y volver a llenar la centrífuga (centrifugación por lotes). Esto permite una concentración continua de la muestra y el producto puede ser removido una sola vez al final de la centrifugación, evitándose, así, la posible contaminación por manipulación adicional.
En la figura 9a, se muestra un contenedor giratorio o cámara 500 de centrifugación. En la parte inferior de la cámara 500 giratoria se coloca un área 505 de enfoque del microscopio que comprende al menos una almohadilla 504 sensora. Debajo de la cámara 500 giratoria, se ubica un módulo 503 de cámara del microscopio que comprende una óptica 501 del microscopio y un motor 502 de accionamiento del microscopio para enfocar la óptica. La óptica 501 del microscopio está configurada de manera que pueda enfocarse automáticamente para detectar la muestra que se está separando en al menos dos componentes durante la centrifugación. Por lo tanto, el módulo 503 de la cámara del microscopio puede usarse para detectar diferentes capas formadas por la muestra separada en la cámara 500 debido a las fuerzas centrífugas. Además, se puede medir el valor de pH de los componentes de la muestra. Para este propósito, se usa un indicador en la cámara 500 que cambia su color dependiendo del valor de pH que esté presente. Además, es posible que la temperatura de la muestra en la cámara se mida usando cristales líquidos que se colocan en la cámara de manera que su posición se pueda detectar con un módulo 503 de cámara de microscopio desde el exterior. De ese modo, se puede determinar la temperatura en la cámara 500.
El módulo 503 de la cámara del microscopio se puede montar de forma móvil, de modo que el módulo 503 se pueda dirigir con su óptica 501 de microscopio a diferentes almohadillas 504 sensoras ubicadas en la pared de la cámara 500. Esto facilita la detección de varias capas formadas en el cámara 500 o la detección del pH o la temperatura en diferentes posiciones dentro de la cámara 500.
La figura 10 ilustra una vista en sección transversal de una cámara de procesamiento de muestras según una realización de la presente invención. La cámara 190 incluye una parte 192 superior y una parte 194 de base y uno o más compartimentos internos. La cámara 190 está configurada para girar alrededor de un eje para aplicar una fuerza centrífuga a una muestra dispuesta en uno o más compartimentos de la cámara, separando así al menos dos componentes de la muestra. La cámara incluye una línea 196 central conectada de forma fluida a al menos un compartimento de la cámara. Los componentes de la cámara 190 incluyen, además, línea 198 exterior; cojinete 200 giratorio, sellos 202, 204, 206 giratorios; línea de entrada exterior a la cámara 205; canal 208 radial inferior; entrada 210 de línea interior a un compartimento de cámara; inclinación 212 y deflector 214. El retenedor 216 de cámara está incluido y configurado para un posicionamiento/acoplamiento seguro de la cámara 190 con otros componentes de un sistema.
La cámara 190 de centrifugación comprende preferiblemente un sello giratorio, opcionalmente con dos líneas de fluido, preferiblemente con dos líneas de fluido. Las líneas de fluido pueden entrar en la cámara 190 en diferentes posiciones. Por ejemplo, es posible colocar una primera línea de fluido en el perímetro exterior de la parte 192 superior (tapa).
Una segunda línea de fluido podría colocarse más hacia adentro, por ejemplo, 2 mm a 20 mm más hacia el centro de la cámara 190. Opcionalmente, se puede ubicar un respiradero en la parte 192 superior, por ejemplo, en forma de membrana.
En general, la posición de las aberturas, como los orificios o las entradas de las líneas en la cámara de centrifugación se puede configurar de manera que se adapten mejor a la centrifugación de una muestra particular. Dependiendo de los componentes de una muestra particular y del volumen relativo de cada componente en la muestra, las aberturas se pueden colocar de modo que se pueda lograr la extracción y/o detección de un componente particular.
La figura 10A ilustra una vista en planta desde arriba de una cámara 201. La cámara 201 incluye una línea 203 interior, un canal 205 radial inferior, una entrada 207 de la línea interior a la cámara, opcionalmente un deflector 209, una inclinación 211 y un paso 209 de luz.
La figura 11 ilustra una vista en sección transversal de una cámara. La cámara 220 incluye un eje alrededor del cual gira la cámara, un conector 222 de línea central y un conector 224 de línea exterior, y uno o más compartimentos internos. También se ilustran el cojinete 226 giratorio, así como los sellos 228, 230, 232 giratorios; canal 234 interno, canal 236 de detección óptica (similar al descrito anteriormente); entrada 238 de línea interior a la cámara; la línea 240 interior y el canal 242 radial inferior. La cámara incluye, además, un refuerzo 246 interior y un retenedor 248 de cámara. La figura 11A ilustra una vista enfocada de una parte de una cámara 220 descrita anteriormente. Se muestran un canal 236 de detección óptica, un prisma 237 y un paso 239 de luz (indicado además por flechas).
El fondo de la cámara puede tener una o más aberturas (figura 12A, 291) cubiertas con una membrana 292 hidrofóbica. Estas aberturas pueden usarse para que los gases entren o se eliminen de la cámara, por ejemplo, para procedimientos de cultivo celular. La membrana se puede pegar térmicamente, por ultrasonidos o por otros medios al fondo de la cámara de forma que se asegure una conexión estéril con la cámara.
La cámara (figura 12B) puede poseer un sistema de canales para el flujo de gas, por ejemplo, canales ensamblados como un sistema 293 en espiral, que asegura una gran área de contacto entre los gases y una membrana unida sobre los canales (no mostrada). Estos canales pueden estar ubicados en la parte inferior o superior de la cámara. El sistema de canales posee al menos una entrada (apertura) 294 y una salida 295 opcional (apertura) para los gases.
Las entradas o puertos de los canales de las figuras 8-11A pueden variar en número y ubicación dentro del canal.
La figura 12 ilustra una vista en sección transversal de una cámara. La construcción de la cámara 250 es similar en muchos aspectos a las cámaras descritas anteriormente, pero además incluye una pluralidad de estructuras 252 en capas. Las estructuras 252 en capas pueden configurarse para proporcionar estructuras o capas de cultivo celular. En uso, la muestra que incluye células puede introducirse en la cámara y fluir sobre las capas 252. El procesamiento de separación puede incluir la rotación de la cámara de manera que las células que se adhieren a las capas se separan de aquellas con menor afinidad por las capas. La rotación intermitente y/o la ruptura durante la rotación pueden desconectar aún más las células cultivadas de la superficie de las estructuras 252 en capas para el procesamiento de separación. Sorprendentemente, se descubrió que este procedimiento intermitente también puede resuspender material biológico agrupado o adherido, como células después del cultivo. La cámara incluye, además, la línea 251 central ilustrada, la línea 253 exterior, el cojinete 255, los sellos 257 giratorios, la entrada 259 de la línea exterior a la cámara, la parte 261 superior, el canal 263 interior, la parte 265 de base, el retenedor 267, el canal 269 radial inferior y la línea 271 de entrada interior a la cámara.
La cámara puede comprender o puede estar hecha de varios materiales. En una realización preferida, se utilizan materiales transparentes como plásticos, poliestirol (PS), poliestereno, poli(cloruro de vinilo), policarbonato, vidrio, poliacrilato, poliacrilamida, polimetilmetacrilato (PMMA) y/o polietilentereftalato (PET). Politetrafluoretileno (PTFE) y/o poliuretano termoplástico (TPU), silicona o composiciones que comprenden uno o más de los materiales antes mencionados. La cámara también puede ser de polietileno (PE). En una realización preferida, las capas en la cámara comprenden o están hechas de derivados de colágeno, quitina, alginato y/o ácido hialurónico. También son posibles la poliactida (PLA), la oliglicolida (PGA) y sus copolímeros, que son biodegradables. Alternativamente, se pueden utilizar materiales no biodegradables, como poliestirol (PS), poliestereno, policarbonato, poliacrilato, polietileno (PE), polimetilmetacrilato (PMMA) y/o polietilentereftalato (PET). También se puede utilizar politetrafluoretileno (PTFE) y/o poliuretano termoplástico (TPU). Otras alternativas incluyen materiales cerámicos y de vidrio, como la hidroxiapatita (HA) o el fosfato de calcio. Las capas en la cámara pueden ser de material sólido o poroso.
En una realización preferida, la cámara tiene un tamaño de 2 cm a 50 cm de diámetro y una altura de 5 mm a 50 cm. La centrifugación se realiza preferiblemente hasta 1000 x g.
El número de las capas y la distancia entre las capas es variable.
En una realización preferida, la cámara se puede calentar y enfriar para proporcionar una temperatura apropiada para la muestra que se va a centrifugar. Para este propósito, se ubican medios de calentamiento y/o enfriamiento en el sistema.
Como se muestra en la figura 17, la cámara de centrífuga de forma cilíndrica puede estar limitada en su lado superior por una tapa 800, que puede llevar una o más nervaduras 805 estabilizadoras en la superficie superior plana. Al menos una de estas nervaduras 805 radiales puede cubrir un estrecho espacio o canal 801, abierto al volumen interior de la centrífuga cuando la tapa 800 está unida a la cámara de la centrífuga. El espacio 801 se extiende en dirección axial desde la superficie interior de la tapa pasando la tapa 800 unos milímetros dentro de la nervadura 805. Por lo tanto, puede ser visible desde el exterior dentro de la nervadura 805 cuando se usa material transparente. En extensión radial, el espacio 801 llega desde cerca del centro hasta la pared cilíndrica de la centrífuga (figura 17).
Durante la centrifugación, en el espacio 801 actúan las mismas fuerzas que en toda la cámara de centrífuga. Las capas de suspensión contiguas en forma de anillo se extienden paralelas al espacio 801 y se muestran como áreas delgadas contiguas axiales, como un corte transversal de capas delgadas, bien detectables por sensores ópticos externos.
El ancho del espacio 801 se puede determinar libremente, también lo suficientemente pequeño para un análisis de luz transmitida de todas las áreas asociadas a la capa en el espacio. De este modo, es posible cuantificar las densidades ópticas y los colores de todas las capas de la suspensión en la cámara de centrífuga de manera «sin contacto» desde el exterior a través de mediciones de transmisión óptica.
Para permitir una iluminación vertical y una posición del sensor para observar los movimientos de las capas en el espacio, se puede añadir una ventana, un espejo o preferiblemente un prisma en ambos lados de las nervaduras, que preferiblemente puede estar preformado por el propio material transparente de la carcasa.
El prisma 810 refracta el haz de iluminación vertical generado a través del espacio (horizontal) y de vuelta a la parte superior, vertical de nuevo (figura 18). Durante la centrifugación, una fuente de iluminación electrónica activada por posición síncrona puede transmitir luz a un lado del prisma 810, por ejemplo, el prisma izquierdo, iluminando el espacio por refracción. El resultado de la transmisión es refractado por el otro lado del prisma 810, por ejemplo, el prisma derecho, de regreso a un sensor o cámara montado verticalmente, posiblemente cerca de la fuente de iluminación superior en la parte superior. La unidad de sensor óptico resultante es fácil de manejar como un sensor réflex, pero al mismo tiempo permite realizar mediciones de transmisión a gran escala.
La disposición de los ángulos del prisma asegura la «reflexión total» en la superficie interior del prisma para los haces de la fuente de iluminación y evita reflexiones directas en sus superficies exteriores entre la fuente de luz y la cámara. Por lo tanto, no hay necesidad de recubrimientos del espejo y se pueden usar tecnologías de moldeo por inyección sin que se requiera volver a trabajar en las instalaciones (figura 19).
Como se ilustra en la figura 13, un sistema de procesamiento que incluye varios componentes acoplados, canales de flujo, tampones, reactivos, etc. Se reconocerá que están disponibles numerosas configuraciones y que la configuración actual se proporciona con fines ilustrativos. Con referencia a la figura 13, los componentes incluyen un tampón 300 del sistema, puerto 301 de adición, filtro 302 estéril, bolsa 303 de plasma / en curso, contenedor 304 de reactivo de marcado magnético, puerto 305 de adición, filtro 306 estéril de reactivo magnético, filtro 307 estéril, bolsa 308 de tampón/medios, puerto de medios de cultivo celular, puerto 309 auxiliar, válvula de dirección única hacia abajo 310 posiblemente incluyendo un filtro, válvula de dirección única hacia arriba 311, bolsa 312 de muestra, conector 313 de bolsa de muestra, filtro 314 de muestra, puerto 315 de muestra, filtro 316, filtro 320 de preseparación, bolsa 321 de almacenamiento en curso, columna 322 de separación magnética, bolsa 323 de residuos, unidad 324 de reducción de volumen, bolsa 325 de fracción positiva, bolsa 326 de fracción negativa, filtro 327 de aire estéril, bomba 328, filtro 329 de aire a sensor 1 de presión, filtro 330 de aire al sensor 2 de presión, unidad 332 de procesamiento de muestras/células.
Un uso típico de un sistema como el ilustrado en la figura 13 y descrito anteriormente se analiza con referencia a las figuras 14A a 14N. Se puede seleccionar la activación de varios componentes del sistema para dirigir el flujo a lo largo de una ruta deseada. El flujo seleccionado se ilustra con referencia a las figuras 14A a 14N y se muestra mediante trayectorias de flujo oscurecidas y flechas de dirección de flujo. La figura 14A ilustra la carga de muestras en una cámara giratoria / de procesamiento de la unidad de procesamiento de muestras. La muestra fluye desde la fuente de muestras a través de las válvulas 5, 9, 16 abiertas y a través de la bomba hasta la unidad de procesamiento. La figura 14B ilustra el enjuague de las líneas/componentes del sistema, con tampón fluyendo a través de las válvulas 1,9, 16 abiertas, la bomba y hacia la unidad de procesamiento. La muestra y el tampón se pueden hacer fluir como se ilustra, la muestra en la unidad de procesamiento se puede centrifugar para separar los componentes y repetir el procedimiento de enjuague. La figura 14C ilustra la reducción y eliminación de glóbulos rojos de la muestra. Como se indicó anteriormente, la muestra en la unidad de procesamiento se puede centrifugar para la separación de componentes, incluida la formación de una capa leucocitaria para la separación de glóbulos rojos. A continuación, el componente de glóbulos rojos puede retirarse de la unidad de procesamiento y fluir a través del sistema a través de las válvulas 17, 12 abiertas y al contenedor de desechos. La figura 14D ilustra la eliminación de plasma de la cámara en la unidad de procesamiento, donde el componente/enjuague de plasma fluye a través del sistema a través de las válvulas 16, 12 abiertas y hacia el contenedor de desechos. La figura 14E ilustra la recogida de plasma a medida que el plasma se extrae de la unidad de procesamiento, fluye a través del sistema con las válvulas 16, 9, 4 abiertas y hacia un contenedor de recogida de plasma. La figura 14F ilustra la carga del reactivo en la cámara y el marcado de las células. El reactivo (por ejemplo, marca magnética) fluye a través del sistema en las válvulas 2, 9, 16 abiertas y dentro de la cámara. Las células se pueden procesar (por ejemplo, agitar, reconstituir, mezclar con reactivo, etc.) para incubarlas con reactivo marcador. La figura 14G ilustra la adición de plasma a la cámara. El plasma del contenedor de plasma fluye a través del sistema a través de las válvulas 4, 9, 16 abiertas y hacia la cámara. Se pueden realizar etapas adicionales de procesamiento, enjuague, etc. (por ejemplo, como se ilustra en la figura 14B). La figura 14H ilustra la separación magnética de los componentes marcados y no marcados de la muestra. La muestra / células marcadas resuspendidas fluyen a través del sistema a través de válvulas 16 abiertas, a través de un filtro o (pre)columna (por ejemplo, filtro de separación basado en el tamaño para eliminar las células agrupadas), válvulas 7, 11 abiertas, a través de la columna magnética donde las células marcadas se unen, y las células principalmente sin marcar fluyen a través de la válvula 19 abierta y hacia el interior del contenedor de células negativas / sin marcar. La figura 14I ilustra el enjuague de la columna donde el tampón fluye a través del sistema en las válvulas 1, 15, 7, 11, 19 abiertas y hacia el contenedor de células. Las etapas de enjuague se seleccionan para lavar las células no marcadas del sistema / columna de separación magnética. La figura 14J ilustra la elución de células de la columna y la reaplicación. La aplicación magnética se apaga y el fluido fluye como se ilustra a través de las válvulas 11, 10, 14 abiertas, por ejemplo, a altas velocidades, para lavar las células de la columna. A continuación, se vuelve a activar la aplicación de campo magnético para volver a adherir las células marcadas a la columna de separación magnética. La figura 14K ilustra el enjuagado de la columna con un tampón de elución. El tampón fluye como se ilustra para lavar preferiblemente las células no marcadas de la columna de separación y en el contenedor de desechos. La figura 14L ilustra la descarga de la columna para eliminar las células marcadas de la columna y colocarlas en la bolsa de reaplicación. Como se muestra, el campo magnético se apaga para liberar las células marcadas de la columna. La figura 14M ilustra las etapas de reducción de volumen. La solución que contiene células se hace fluir como se ilustra para hacer pasar la solución a través del filtro F7. El filtro incluye un filtro de membrana que recoge las células a medida que fluye la solución. La figura 14N ilustra la elución final y la recogida del producto en el contenedor de recogida. El plasma fluye como se ilustra a través de las válvulas 4, 9, 14, 18 abiertas, pasando el fluido a través del filtro F7 para lavar las células del filtro y en el contenedor de recogida positiva.
El juego de tubos se puede utilizar para el suministro de medio nutritivo, citocinas, factores de crecimiento, suero y otras sustancias necesarias para el cultivo de células, o para extraer muestras de la cámara de cultivo. El medio nutritivo puede suministrarse continua o periódicamente a la cámara o extraerse de la cámara a través de los puertos 222 y 224 (figura 11) utilizando la bomba 328 (figura 13) o utilizando jeringas adicionales conectadas al juego de tubos. El medio puede intercambiarse total o parcialmente con medio fresco durante el procedimiento de cultivo celular. El medio se puede enriquecer con O2, CO2, N2, aire u otros gases necesarios para el crecimiento de las células. El enriquecimiento del medio se puede hacer por inyección directa de los gases en la cámara de cultivo a través de los puertos 222 o 224 (figura 11), a través de una abertura adicional en el fondo de la cámara de cultivo cubierta con una membrana hidrofóbica (figuras 12A y 12B) y/o mediante el uso de un dispositivo de aireación, colocado fuera de la cámara de cultivo (figura 15).
En la figura 15 se muestra un ejemplo de un dispositivo de aireación de este tipo. Consta de dos partes (415 y 416) hechas, por ejemplo, de policarbonato (PC) o polimetilmetacrilato (PMMA) con canales grabados en un lado. Ambas partes se juntan formando un espacio hueco entre ellas, separadas en dos o más compartimentos por al menos una membrana (417). La membrana se puede unir a una de las partes o se pueden unir varias membranas en ambas partes. Los compartimentos contienen al menos un puerto (418) de entrada y uno (419) de salida para la conexión con el juego de tubos. El primer compartimento se utiliza para la mezcla de gases. El segundo compartimento se utiliza para el medio nutritivo, que debe enriquecerse con los componentes de la mezcla de gases. La membrana colocada entre ambos compartimentos es permeable a los gases y no permeable a los líquidos. Preferiblemente, esta es una membrana hidrofóbica, por ejemplo, una membrana hidrofóbica de nailon. Preferiblemente, los poros de la membrana hidrófoba son menores que 0,2 gm, lo que asegura una conexión estéril entre el medio nutritivo y la mezcla de gases. En otra realización del dispositivo de aireación, se pueden unir una o más membranas adicionales a cualquiera de las partes representadas en la figura 15, de manera que el gas fluya entre los compartimentos que contienen el medio. En este caso, la superficie de contacto entre el medio y la mezcla de gases es mucho mayor dependiendo del número de membranas utilizadas.
Las membranas en el dispositivo de aireación se pueden unir a las partes por medio de unión térmica, unión ultrasónica o pegado, u otro procedimiento de unión adecuado, que permita una conexión estéril entre las piezas de plástico y la membrana.
El dispositivo de aireación se puede esterilizar por medio de irradiación (por ejemplo, radiación gamma, beta), plasma (por ejemplo, peróxido de hidrógeno), vapor caliente / vaho (por ejemplo, autoclave) o esterilización con óxido de etileno (EtO). Preferiblemente, el dispositivo de aireación se utiliza como parte del juego de tubos desechables.
La composición de gas utilizada para el dispositivo de aireación se compone preferiblemente mediante el uso de una cámara de mezcla de gases. Una realización preferida de la cámara de mezcla de gas se muestra en la figura 16 A. Consta de dos partes (421 y 422), preferiblemente hechas de material plástico, por ejemplo, POM (polioximetileno), que están conectadas con pernos, pegadas, unidas entre sí térmicamente o por ultrasonidos de manera para formar un espacio hueco entre ellas. Preferiblemente, una de las piezas contiene un canal para un anillo de estanqueidad, que asegura la estanqueidad entre ambas piezas (433, figura 16B). La cámara de mezcla de gases posee al menos un puerto de entrada y al menos un puerto (423) de salida. Comprende un puerto (430) para la conexión de un dispositivo sensor de presión para medir la presión dentro de la cámara. La cámara de mezcla de gases contiene opcionalmente otro puerto (432, figura 16b) para la conexión con una válvula de seguridad, que se abre automáticamente, cuando la presión en la cámara supera un cierto valor. La cámara de mezcla de gases posee entradas y salidas (435) para conexión con al menos una válvula de entrada y al menos una válvula de salida, así como perforaciones con roscas (436) para conexión de las válvulas de entrada y salida a las paredes de la cámara de mezcla de gases.
Para la reducción de los caudales de los gases que entran y/o salen de la cámara de mezcla de gases, se pueden incluir opcionalmente mezclas en las paredes.
Principio de funcionamiento de la cámara de mezcla de gases: los puertos de entrada de la cámara de mezcla de gases están conectados con un suministro de gas. El suministro de los gases de entrada debe tener una presión mayor que la presión atmosférica, por ejemplo, 0,2 MPa (2 bar). El operador debe dar el contenido de la composición de gas deseada mediante el uso de un programa de software de medición y automatización. El contenido de cada uno de los gases de la composición deseada se da como la presión parcial de ese gas en la mezcla de gases. El procedimiento de composición del gas comienza con el primer componente de la mezcla de gases, que está controlado por la válvula 424 de entrada (figura 16A). La válvula de entrada se abre durante un período de tiempo, generalmente entre 50 ms y 200 ms, y luego se cierra y se lee el sensor de presión. La presión medida en la cámara es Pm. Si la presión Pm < P1, donde P1 es la presión dada por el operador, la válvula de entrada se abre de nuevo. El procedimiento se repite hasta Pm >= P1. Luego, la válvula 425 de entrada se abre y la composición del segundo componente de gas tiene lugar como se describe en el caso con la válvula 424 de entrada. Cuando todos los gases de entrada están integrados en la cámara de mezcla, la válvula 427 de salida se abre hasta que la presión en la cámara de mezcla de gases alcanza un valor Pafuera, preliminarmente dado por el operador. Pafuera siempre es igual a la presión atmosférica o mayor. El operador también puede indicar el tiempo y la frecuencia de abertura de la válvula de salida. Luego, el procedimiento de composición del gas comienza de nuevo con la abertura de la primera válvula (424) de entrada. Las válvulas 428 y 429 de salida se pueden usar opcionalmente para la aireación de otras cámaras de cultivo celular, bolsas u otros recipientes.
La cámara de muestras permite realizar una amplia gama de métodos de cultivo celular, como el cultivo de células, la separación, el lavado, el enriquecimiento de las células o diferentes tipos de células, u otros. El sistema también se puede utilizar para formular fármacos.
La fabricación de preparaciones celulares requeridas para la terapia celular puede incluir varias combinaciones de operaciones básicas para obtener un producto celular definido con características definidas. Es exclusivo de la invención que todas estas operaciones básicas se puedan realizar en un único juego de tubos cerrados, lo que elimina la necesidad de las etapas de transferencia manual de muestras que de otro modo se requerirían.
Las condiciones de cultivo celular para los ejemplos son conocidas en la técnica.
Las características descritas en la presente memoria pueden ser relevantes para la realización de la presente invención en cualquier combinación.
Ejemplos
Ejemplo 1. Fabricación de células precursoras e injertos progenitores a partir de sangre del cordón umbilical
La sangre del cordón umbilical humano se diluye con el tampón PBS/EDTA CliniMACS, se ajusta al volumen de marcado definido mediante centrifugación, se añade el reactivo de CD34 o CD133 CliniMACS y se deja incubar con la muestra de células durante el tiempo de marcado especificado, el reactivo de acceso se elimina lavando en la cámara de centrífuga, las células positivas para CD34 o CD133 se enriquecen a partir de la suspensión celular y se eluyen de la columna MACS directamente con medio de cultivo celular y se transfieren a la cámara de cultivo celular. Los suplementos de medios (albúmina de suero humano, citocinas) se añaden automáticamente desde el vial conectado al juego de tubos. Las células precursoras enriquecidas o aisladas se cultivan hasta por tres semanas. Se añade intermitentemente medio de cultivo celular complementado. Las células de sangre del cordón umbilical expandidas se lavan mediante centrifugación para eliminar el medio de cultivo celular y las células se resuspenden en una solución de perfusión (solución salina) complementada con albúmina de suero humano y se transfieren al contenedor del producto final (bolsa de perfusión o jeringa).
Ejemplo 2. Fabricación de una vacuna de células dendríticas
La sangre entera humana o la cosecha de aféresis se diluye con tampón PBS/EDTA CliniMACS, se ajusta al volumen de marcado definido por centrifugación, se añade reactivo de CD14 CliniMACS y se deja incubar con la muestra de células durante el tiempo de marcado especificado, el reactivo de acceso se elimina lavando en la cámara de centrífuga, los monocitos positivos para CD14 se enriquecen a partir de la suspensión celular y se eluyen de la columna MACS directamente con medio de cultivo celular y se transfieren a la cámara de cultivo celular. Los complementos de medios (albúmina de suero humano, citocinas) se añaden automáticamente desde el vial conectado al juego de tubos. Los monocitos enriquecidos o aislados se cultivan en células dendríticas derivadas de monocitos inmaduros. Los medios se intercambian por centrifugación y los complementos adicionales se añaden automáticamente desde el vial conectado al juego de tubos. Las células se cultivan y, al madurar, los antígenos (proteína recombinante, péptidos, lisados celulares, ADN) se añaden automáticamente desde el vial conectado al juego de tubos. Las células dendríticas derivadas de monocitos se cultivan para el procesamiento de antígenos. El medio de cultivo celular se elimina por centrifugación y las células se resuspenden en una solución de perfusión (solución salina) complementada con albúmina de suero humano y se transfieren al contenedor del producto final (bolsa de perfusión o jeringa).
Ejemplo 3. Fabricación de una vacuna de células dendríticas sanguíneas mDC y pDC
La cosecha de aféresis se diluye con tampón PBS/EDTA CliniMACS que se empobrece automáticamente en CD19 y luego se enriquece en CD304 (BDCA-4, CD1c, neuropilina-1) o CD1c (BDCA-1) a través de la columna MACS. Las
DC se eluyen de la columna MACS directamente con medio de cultivo celular y se transfieren a la cámara de cultivo celular. Los complementos de medios (albúmina de suero humano, citocinas, componentes activadores como proteína recombinante, péptidos, lisados celulares, ADN) se añaden automáticamente desde el vial conectado al juego de tubos y las células se cultivan durante 24 horas para lograr una maduración y activación óptimas. El medio de cultivo celular se elimina por centrifugación y las células se resuspenden en una solución de perfusión (solución salina) complementada opcionalmente con albúmina de suero humano y se transfieren al contenedor del producto final (bolsa de perfusión o jeringa). El contenedor del producto se retira del juego de tubos de la invención para su uso posterior.
Ejemplo 4. Fabricación de linfocitos T específicos de antígeno
La sangre entera humana o la cosecha de aféresis se lava y se diluye con medio de cultivo celular y se transfiere a la cámara de cultivo celular. El antígeno (proteína recombinante, combinación de péptidos o lisado de células tumorales) y complementos de medios (albúmina de suero humano, citocinas) se añaden automáticamente desde los viales conectados al juego de tubos. Las células y el antígeno se cultivan durante 3-16 horas para volver a estimular los linfocitos T específicos del antígeno. La suspensión de células se ajusta al volumen de marcado definido mediante centrifugación, se añade el reactivo IFN-gamma Catchmatrix CliniMACS y se deja incubar con la muestra de células durante el tiempo de marcado especificado, y el reactivo de acceso se elimina lavando en la cámara de centrífuga.
Las células se transfieren al contenedor de cultivo celular y se incuban para la liberación de citocinas. La suspensión celular se ajusta al volumen de marcado definido mediante centrifugación, se añade el reactivo de enriquecimiento de
IFN-gamma CliniMACS y se deja incubar con la muestra de células durante el tiempo de marcado especificado, se elimina el reactivo de acceso lavando en la cámara de centrífuga, las células específicas del antígeno se enriquecen magnéticamente a partir de la suspensión de células y se concentra a un pequeño volumen inyectable por elución directa de la columna MACS utilizando solución de perfusión complementada y se transfiere al contenedor del producto final (bolsa de perfusión o jeringa).
Ejemplo 5. Fabricación de linfocitos T citolíticos naturales activados
La sangre entera humana o la cosecha de aféresis se diluye con tampón PBS/EDTA CliniMACS, se ajusta al volumen de marcado definido por centrifugación, se añade reactivo CD3 CliniMACS y se deja incubar con la muestra de células durante el tiempo de marcado especificado, el reactivo de acceso se elimina lavando en la cámara de centrífuga, las células CD3 positivas se reducen a partir de la suspensión celular. Las células objetivo negativas para CD3 se ajustan al volumen de marcado, se añade el reactivo CD56 CliniMACS y se deja incubar con la muestra de células durante el tiempo de marcado especificado, el reactivo de acceso se elimina lavando en la cámara de centrífuga, las células positivas para CD56 se enriquecen y se eluyen de la columna MACS directamente con medio de cultivo celular y se transfieren a la cámara de cultivo celular. Los complementos de medios (albúmina de suero humano, citocinas como
IL-2 y/o IL-15) se añaden automáticamente desde el vial conectado al juego de tubos. Las células NK enriquecidas o aisladas se cultivan durante 8-48 horas. El medio de cultivo celular se elimina del producto celular mediante centrifugación y las células se resuspenden en una solución de perfusión (solución salina) complementada con albúmina de suero humano y se transfieren al contenedor del producto final (bolsa de perfusión o jeringa).
Ejemplo 6. Fabricación de linfocitos T citolíticos naturales expandidos
La sangre entera humana o la cosecha de aféresis se diluye con tampón PBS/EDTA CliniMACS, se ajusta al volumen de marcado definido por centrifugación, se añade reactivo de CD3 CliniMACS y se deja incubar con la muestra de células durante el tiempo de marcado especificado, el reactivo de acceso se elimina lavando en la cámara de centrífuga, las células CD3 positivas se reducen a partir de la suspensión celular. Las células objetivo negativas para CD3 se ajustan al volumen de marcado, se añade el reactivo de CD56 CliniMACS y se deja incubar con la muestra de células durante el tiempo de marcado especificado, el reactivo de acceso se elimina lavando en la cámara de centrífuga, las células positivas de CD56 se enriquecen y se eluyen de la columna MACS directamente con medio de cultivo celular y se transfieren a la cámara de cultivo celular. Los complementos de medios (albúmina de suero humano, citocinas) se añaden automáticamente desde el vial conectado al juego de tubos. Las microesferas de expansión celular cargadas con anticuerpos dirigidos contra CD2 y CD335 (NKp46) o CD314 (NKG2D) y CD335 (NKp46) se transfieren del vial al compartimento de cultivo celular. Las células NK enriquecidas o aisladas se cultivan durante una semana, comenzando el día 7, se añade medio de cultivo celular complementado cada 3 días en una proporción 1:1 y las células se cultivan hasta el día 14-21.
Las células NK expandidas se hacen pasar por la columna MACS para eliminar las microesferas de expansión celular.
Las células NK expandidas opcionalmente se purifican aún más mediante el empobrecimiento de CD3 o el enriquecimiento de CD56 (ver arriba). El medio de cultivo celular se elimina del producto celular mediante centrifugación y las células se resuspenden en una solución de perfusión (solución salina) complementada con albúmina de suero humano y se transfieren al contenedor del producto final (bolsa de perfusión o jeringa).
Ejemplo 7. Fabricación de linfocitos T cooperadores expandidos
La sangre entera humana o la cosecha de aféresis se diluye con tampón PBS/EDTA CliniMACS, se ajusta al volumen de marcado definido por centrifugación, se añade reactivo de CD4 CliniMACS y se deja incubar con la muestra de células durante el tiempo de marcado especificado, el reactivo de acceso se elimina lavando en la cámara de centrífuga, las células positivas de CD4 se enriquecen y se eluyen de la columna MACS directamente con medio de cultivo celular y se transfieren a la cámara de cultivo celular. Los complementos de medios (albúmina de suero humano, citocinas) se añaden automáticamente desde el vial conectado al juego de tubos. Las microesferas de expansión celular cargadas con anticuerpos dirigidos contra CD2, CD3 y CD28 o, alternativamente, CD3 y CD28 se transfieren del vial al compartimento de cultivo celular. Los linfocitos T cooperadores aislados se cultivan a partir del día 3, se añade medio de cultivo celular complementado cada 2 días en una proporción 1:1 y las células se cultivan hasta el día 14. Los linfocitos T expandidos se pasan por la columna MACS para eliminar las microesferas de expansión celular. El medio de cultivo celular se elimina del producto celular mediante centrifugación y las células se resuspenden en una solución de perfusión (solución salina) complementada opcionalmente con albúmina de suero humano y se transfieren al contenedor del producto final (bolsa de perfusión o jeringa). El contenedor del producto se retira del juego de tubos de la invención para su uso posterior.
Ejemplo 10. Selección de células precursoras positivas para CD133
El antígeno de CD133 es un marcador de células precursoras y se expresa específicamente en un subconjunto inmaduro de células CD34+, en células progenitoras endoteliales circulantes y en un subconjunto de células precursoras CD34- (De Wynter et al., 1998). Se han utilizado células CD133 positivas enriquecidas o aisladas con el sistema de CD133 CliniMACS para expansión ex vivo de células progenitoras hematopoyéticas a partir de la sangre del cordón umbilical y en trasplantes autólogos (Pasino et al., 2000) y alotrasplantes (Kohl et al., 2002).
Las células precursoras CD133+ se pueden utilizar en aplicaciones no hematológicas para la medicina regenerativa. Las células CD133 seleccionadas de la médula ósea se han convertido en el centro de atención, por ejemplo, en relación con el tratamiento de cardiopatías isquémicas (Stamm et al., 2003).
El enriquecimiento o aislamiento de células CD133+ da como resultado una eliminación de células no objetivo de más del 99,4 % (2,2 log). Ver tabla 1.
Tabla 1. Se han aislado células positivas para CD133 de la médula ósea utilizando la presente invención
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A modo de comparación, todos los productos de médula ósea también se procesaron con el sistema CD133 CliniMACS® con resultados similares.
Los diagramas de puntos de la figura 20 muestran las características de la muestra antes (izquierda) y después (derecha) del procesamiento automatizado utilizando la presente invención.
Ejemplo 11. Selección de células CD14 positivas
El antígeno de CD14 pertenece al complejo del receptor de LPS y los monocitos expresan fuertemente el antígeno. Los monocitos seleccionados de CD14 se pueden usar para la generación posterior de células dendríticas derivadas de monocitos humanos (MoDC; Campbell et al., 2005). Las células dendríticas tienen un gran potencial como vacunas celulares para diversas enfermedades, incluidos tumores sólidos, neoplasias malignas hematológicas, infecciones víricas y enfermedades autoinmunitarias.
Se han aislado monocitos de dos cosechas de leucoaféresis utilizando la presente invención y el reactivo de CD14 CliniMACS. Los monocitos se enriquecieron en una relación del 19,7 % / 31,8 % (cosecha sin procesar) al 98,2 % / 99,7 % (producto celular final) con un rendimiento del 58 % / 21 % (ver figura 21).
Las MoDC podrían generarse a partir de monocitos aislados usando la presente invención y mostraron características idénticas a las MoDC generadas a partir de monocitos aislados de CliniMACS.
Los monocitos también se aislaron de la capa leucocitaria de sangre entera humana utilizando la presente invención y se pudieron enriquecer desde un 9,8 % (capa leucocitaria sin procesar) hasta un 98,9 % de pureza (producto celular final) con un rendimiento de monocitos del 64 %.
Ejemplo 12. Selección de CD304
En sangre periférica, se expresa CD304 (BDCA-4, neuropilina-1) en células dendríticas plasmocitoides (PDC) humanas. Las PDC son las células productoras de interferón tipo I más potentes (Dzionek et al., 2002). Se puede usar CD304 para enriquecer o aislar directamente células dendríticas de sangre periférica sin un período de cultivo (como para MoDC).
El enriquecimiento o el aislamiento de células objetivo positivas para CD304 requiere etapas de lavado prolongado que requieren mucho tiempo utilizando el procedimiento de preparación de muestras CliniMACS en una centrífuga de bolsas de sangre. El procesamiento automatizado de muestras facilitará el uso de células aisladas de CD304 en ensayos de vacunación.
Las células positivas para CD304 se aislaron o enriquecieron a partir de dos cosechas de leucoaféresis utilizando la presente invención y el reactivo de CD304 CliniMACS. Las PDC se enriquecieron en un porcentaje del 0,29 % al 34,4 % con un rendimiento del 30 % y del 0,43 % al 80,5 % con un rendimiento del 39 %.
Las células dendríticas plasmocitoides del segundo procedimiento se cultivaron durante 24 h con CPG C (ODN2395) e IL-3 o IL-3 sola para la inducción de la maduración. Las células cultivadas se analizaron para los marcadores de maduración de CD40 y CD80 y el perfil del marcador fue idéntico al de las PDC positivas para CD304 aisladas utilizando el sistema de CD304 CliniMACS durante el cultivo.
Ejemplo 13. Selección de células CD4 positivas
CD4 es una molécula auxiliar en el reconocimiento de antígenos extraños en asociación con antígenos MHC de clase II por parte de los linfocitos T. Los linfocitos T cooperadores y, en menor medida, los monocitos y las células dendríticas expresan CD4.
Para ciertos entornos oncológicos, los datos preliminares sugieren que los linfocitos T en un injerto o como una perfusión de linfocitos de un donante pueden ser beneficiosos (Falkenburg et al., 1999). En estos entornos, se puede desear una selección de CD4 o un empobrecimiento de CD8 (ver el ejemplo 5) en el entorno de alotrasplante. Los linfocitos T cooperadores pueden generar respuestas antitumorales, reducir el riesgo de enfermedad de injerto contra huésped (Alyea et al. 1998) y reconstituir el sistema inmunitario del receptor (Bellucci et al., 2002).
Los linfocitos T cooperadores CD4 positivos también desempeñan un papel importante en la infección y progresión del VIH. Se pueden desear linfocitos T cooperadores seleccionados (potencialmente después de la modificación genética) para el tratamiento de las complicaciones del VIH.
Las células positivas para CD4 se aislaron o enriquecieron a partir de tres productos de capa leucocitaria de sangre entera humana utilizando la presente invención y el reactivo de CD4 CliniMACS. Los linfocitos T cooperadores se enriquecieron desde un 27 % / 8,6 % / 15,9 % hasta un 90 % / 80 % / 81,3 % de pureza con un rendimiento del 93 % / 98 % / 51 %. Estos resultados están dentro del intervalo de resultados obtenidos con el sistema de CD4 CliniMACS.
Ejemplo 14. Empobrecimiento de células CD8 positivas
El antígeno de CD8, un correceptor para las moléculas MHC de clase I, se expresa en los linfocitos T citotóxicos y débilmente en un subconjunto de células NK.
En el contexto del alotrasplante, los linfocitos T para CD8 pueden extraerse de una perfusión de linfocitos de un injerto o de un donante con el objetivo de prevenir la enfermedad del injerto contra el huésped mientras se mantienen los efectos del injerto contra la leucemia. Meyer et al. 2007).
Los linfocitos T citotóxicos positivos para CD8 se redujeron de tres productos de capa leucocitaria utilizando la presente invención y el reactivo de CD8 CliniMACS. Los linfocitos T citotóxicos se redujeron del 11,5 % / 8 % / 12 % al 0,005 % / 0,004 % / 0,002 %, respectivamente. Esto representa una eliminación >99,97 % (>3,5 log) de células no objetivo. Las células objetivo CD8 negativas se recuperaron casi por completo (85,1 % / 90,9 % / 94,4 %).
Ejemplo 15. Preparación de células mononucleares de sangre periférica por centrifugación en gradiente de densidad
Ficoll Paque™ es un medio de densidad estéril para el aislamiento de células mononucleares de la médula ósea, sangre periférica y sangre del cordón umbilical. Es una solución acuosa de 1,077 g/ml de densidad, compuesta por Ficoll PM400 (polisacárido hidrofílico de alta masa y muy ramificado), diatrizoato de sodio y EDTA cálcico disódico.
Los eritrocitos y granulocitos tienen una densidad mayor que 1,077 g/ml mientras que los linfocitos y monocitos tienen una densidad menor. Cuando la sangre humana se coloca en capas encima de Ficoll-Paque, los linfocitos y monocitos se pueden separar de los eritrocitos y granulocitos bajo la fuerza centrífuga.
La presente invención se ha utilizado para la preparación de células mononucleares de sangre periférica mediante centrifugación en gradiente de densidad. La capa leucocitaria de sangre total humana se colocó en capas sobre un anillo de Ficoll-Paque mientras giraba la cámara de centrifugación. La velocidad de rotación se había ajustado a 2900 rondas por minuto y se mantuvo durante 20 minutos. Se pudo detectar un anillo exterior de eritrocitos y granulocitos, un anillo de Ficoll-Paque, un anillo de células objetivo (células mononucleares de sangre periférica, es decir, linfocitos y monocitos) y un anillo interior de plaquetas que contenían plasma sanguíneo y tampón PBS. Las diferentes capas se retiraron de la cámara de centrifugación de la presente invención a través de los puertos luer y se analizó el contenido de diferentes células. El 70 % de las PBMC del producto sanguíneo original se recuperó de la capa de PBMC. Esta suspensión de células solo contenía el 1,1 % de los glóbulos rojos originales. Por tanto, la presente invención se puede utilizar para la preparación automatizada de células mononucleares de sangre periférica (segundo anillo) o plasma rico en plaquetas (anillo interior).
Ejemplo 16. Cultivo de células
La cámara de centrifugación de la presente invención se puede utilizar para el cultivo de células, de forma similar a los matraces o bolsas de cultivo celular. Se aplicaron 3,2E5/ml de la línea celular humana K562 a una cámara de centrifugación en un volumen de 30 ml de medio de cultivo celular RPMI1640 complementado con suero fetal bovino al 10 %. La cámara se colocó en una incubadora de CO2 al 5 % de CO2. Se extrajeron alícuotas del contenido de la cámara para el recuento celular y la evaluación de la viabilidad después de 24, 48 y 70 horas. Las células sembradas se expandieron a 4,1 E5/ml; 6,4E5/ml y 9,2E5/ml de células viables al 80 %, 95 % y 95 % de viabilidad.
Ejemplo 17. Método para la separación de células CD133+ utilizando un sistema de la presente invención Todo el procedimiento de separación de las células CD133+ consta de varias etapas con las siguientes tareas: 1. Cebado del juego de tubos con tampón.
2. Transferencia de la muestra de médula ósea a la cámara de centrifugación.
3. Preparación de la muestra de médula ósea en la cámara de centrifugación.
4. Separación magnética de células CD133+.
5. Reducción de volumen final.
A continuación, se describirán en detalle varias etapas.
1. Cebado del juego de tubos con tampón
En una primera etapa, el juego de tubos se cebó con PEB (solución salina tamponada con fosfato complementada con 2 mmol/l de EDTA; 0,5 % de HSA).
2. Transferencia de la muestra de médula ósea a la cámara de centrifugación
Después de cebar el juego de tubos, la muestra de médula ósea se transfirió de la bolsa 312 de muestras a la cámara 332 de centrifugación.
3. Preparación de la muestra de médula ósea en la cámara de centrifugación
La preparación de la muestra en la cámara de centrifugación incluye varias etapas en las que se elimina el sobrenadante de la cámara. Durante la eliminación del sobrenadante, solo debe transferirse el sobrenadante exento de células o el sobrenadante con plaquetas en el caso del lavado de plaquetas. El objetivo es evitar que los glóbulos blancos (los WBC, por sus siglas en inglés) y, por lo tanto, las células CD133+ se eliminen junto con el sobrenadante. La preparación de la muestra incluye las siguientes etapas:
• generación de plasma
• reducción de plaquetas
• incubación con microesferas de CD133 (Miltenyi Biotec, Alemania)
• eliminación de microesferas de CD133 no unidas
Generación de plasma
El plasma generado al comienzo del procedimiento de preparación de la muestra cumple las dos funciones siguientes:
1. Actuar como un reactivo de bloqueo que bloquea los receptores Fc de los monocitos e impide que la parte Fc de los anticuerpos CD133 unidos a las microesferas se adhiera a los monocitos. Esto conduciría a una reducción de la pureza del producto del procedimiento de separación inmunomagnética por parte de los monocitos.
2. Actuar como complemento del tampón en el que se suspende el producto celular final. Esto proporciona un entorno más fisiológico para el producto celular que el tampón usado solo. Para la generación y recogida de plasma, la muestra se centrifuga hasta que la mayoría de los componentes celulares del material como eritrocitos (los RBC), glóbulos blancos (los WBC) y plaquetas se sedimentan. El sobrenadante exento de células se transfiere a un contenedor (303) que actúa como depósito.
Para la generación de plasma, el material celular se centrifugó a 209 rad/s (2000 rpm) en la cámara de centrifugación hasta que se sedimentaron todos los componentes celulares del material como WBC, RBC y plaquetas. La generación de plasma requiere una centrifugación que conduce a un sobrenadante con concentraciones de células lo más bajas posible y, por lo tanto, a una sedimentación casi completa de todos los componentes celulares de la sangre. El tiempo de sedimentación depende del volumen de la muestra que se determina automáticamente durante la transferencia de la muestra a la cámara de centrifugación. El tiempo de sedimentación para diferentes volúmenes de muestra se presenta en la tabla 2.
Tabla 2
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Después de la centrifugación a 209 rad/s (2000 rpm), la velocidad de rotación se redujo suavemente a 105 rad/s (1000 rpm) con una tasa de desaceleración de 66 rad/s (632 rpm)/min. Luego se extrae el plasma con una velocidad de bombeo de 6 ml/min hasta que se bombea el aire fuera de la cámara. A continuación, el sobrenadante exento de células se transfiere a un contenedor que actúa como depósito. Posteriormente, el plasma se puede transferir del contenedor al sitio en el que se usa el flujo del procedimiento a través de un filtro de 0,2 pm para eliminar todas las células residuales que no se eliminaron durante la centrifugación.
Reducción de plaquetas
Como la generación de plasma elimina el sobrenadante completo en la cámara, queda un volumen residual de 70 ml en la cámara. Se añaden 150 ml de PEB para diluir la suspensión dando como resultado un volumen total de 220 ml. A continuación, el tambor se acelera a 209 rad/s (2000 rpm) y la sedimentación se ejecuta durante 100 segundos para sedimentar los glóbulos rojos y los glóbulos blancos antes de desacelerar el tambor a 105 rad/s (1000 rpm) con una velocidad de desaceleración de 66 rad/s (632 rpm)/min. Dentro de este tiempo de sedimentación, solo una pequeña porción de las plaquetas llega al sedimento cuando comienza la desaceleración de la cámara. Luego se retira el sobrenadante completo a una velocidad de 6 ml/min. El análisis de la muestra y del sobrenadante extraído mostró una eliminación de plaquetas determinada experimentalmente del 50,8 %. Las plaquetas restantes se eliminan utilizando un filtro (310).
Incubación con microesferas de CD133
Las microesferas de CD133 se proporcionan en viales de vidrio que tienen un tabique. Para asegurar condiciones asépticas, se integra un filtro con un tamaño de poro (306) de 0,2 pm en la rama del juego de tubos conectado al vial. El vial está conectado al juego de tubos mediante un adaptador (305) de vial ventilado. Cuando el reactivo se bombea a la cámara, se controla la presión dentro de la parte del juego de tubos frente al tambor. Cuando el vial se vacía, el aire se mueve hacia el filtro. A medida que el reactivo humedece el filtro, los poros todavía están llenos de líquido cuando el aire ingresa al filtro. Debido a las fuerzas capilares, el aire no puede atravesar la membrana del filtro. A medida que la bomba sigue funcionando, el sensor (329) de presión detecta la caída de presión y el software detiene la bomba. De esta forma, combinado con una etapa de enjuague para eliminar el reactivo residual, el reactivo se transfiere automáticamente a la suspensión celular en la cámara.
Después de la transferencia de plasma con fines de bloqueo, el volumen se ajusta al volumen marcado de 95 ml y comienza la incubación. En el procedimiento de preparación de muestras convencional, la bolsa de preparación de muestras debe colocarse en un agitador orbital e incubarse durante 30 minutos a temperatura ambiente. El procedimiento de incubación con el sistema de la presente invención se realiza de la siguiente manera:
1. El tambor se acelera a una velocidad de 31 rad/s (300 rpm). Esto hace que el líquido se desplace hacia la pared de la cámara.
2. La centrifugación se lleva a cabo durante 10 segundos.
3. Después de eso, el tambor se detiene. El líquido retrocede y tiene una superficie alineada horizontalmente.
4. La cámara continúa deteniéndose durante 50 segundos.
5. Los pasos 1-4 se repiten hasta que transcurre el tiempo de incubación de 30 min.
Este procedimiento conduce a una mezcla eficiente del líquido en la cámara.
Eliminación de microesferas anti-CD133 no unidas
El lavado de microesferas se realiza para eliminar el reactivo no unido después del marcado y la incubación. En el procedimiento de lavado se repiten tres veces las siguientes etapas:
1. El PEB se transfiere a la centrífuga para diluir la suspensión dando como resultado un volumen total de 230 ml.
2. La sedimentación de glóbulos rojos y glóbulos blancos se lleva a cabo a 209 rad/s (2000 rpm) durante 140 segundos.
3. La velocidad de la cámara se reduce de 209 rad/s (2000 rpm) a 105 rad/s (1000 rpm).
4. Se elimina completamente el sobrenadante a una velocidad de 20 ml/min.
El procedimiento de lavado de microesferas constará de tres etapas de lavado y se elimina al menos el 97,2 % del reactivo no unido.
4. Separación magnética de células CD133+
Después del procedimiento de lavado de microesferas, las células CD133+ se separan utilizando una columna de separación magnética (columna CliniMACS, Miltenyi Biotec GmbH, Alemania). Por lo tanto, la suspensión celular se transfiere a la columna de separación con una velocidad de carga de 5 ml/min. Las células marcadas magnéticamente se retienen en la columna magnetizada y se separan de las células no marcadas enjuagando la columna con PEB. Las células CD133+ retenidas se eluyen eliminando el campo magnético de la columna. Las células CD133+ se bombean a un circuito del juego de tubos y se vuelven a cargar en la columna de separación. Este procedimiento se repitió una vez más y después del tercer procedimiento de recarga, las células CD133+ finalmente se eluyeron en 20 ml de tampón de elución (ver tabla 3 y figura 26). La velocidad de elución fue de 600 ml/min.
5. Reducción de volumen final
Para la terapia con células precursoras cardíacas, las células CD133+ deben estar disponibles en un pequeño volumen final de 6 ml como máximo. Normalmente, las células CD133+ se eluyen finalmente de la columna CliniMACS en 20 ml de tampón de elución. Para la reducción del volumen final, son posibles tres métodos: el volumen final de células CD133+ aisladas o enriquecidas puede ser reducido por
1. elución de la columna en pequeño volumen;
2. filtración después de la separación magnética; o
3. utilizando la columna AutoMACS (Miltenyi Biotec GmbH, Alemania).
Elución de la columna en pequeño volumen
En lugar de eluir en 20 ml de tampón de elución, las células CD133+ se pueden eluir de la columna CliniMACS en 6 ml de tampón de elución. La velocidad de elución es de 600 ml/min. Este método se probó mediante el enriquecimiento de células CD133+ de la médula ósea. Las células enriquecidas se determinaron mediante análisis FACS (ver tabla 4 y figura 27).
Filtración tras separación magnética
Después de la elución de la columna de separación CliniMACS en 20 ml de tampón de elución, las células CD133+ se pueden transferir a un filtro (Pall IV-5; 0,2 gm o RoweFil 24; 1,2 gm) a una velocidad de 4 ml/min. Posteriormente, las células se eluyen en 2 ml del filtro. Este método se probó mediante el enriquecimiento de células CD133+ de la médula ósea. Las células enriquecidas se determinaron mediante análisis FACS (ver tabla 5 y figura 28).
Reducción de volumen final utilizando la columna AutoMACS
Después de la elución de la columna CliniMACS, las células CD133+ se pueden cargar en una columna autoMACS a una velocidad de 4 ml/min. Posteriormente, las células CD133+ retenidas se eluyen en 4 ml de la columna autoMACS. Este método se probó mediante el enriquecimiento de células CD133+ de la médula ósea. Las células enriquecidas se determinaron mediante análisis FACS (ver tabla 6 y figura 29).
Tabla 3. Elución directa de las células CD133+ en 20 ml.
Figure imgf000028_0001
Tabla 4. Elución directa de las células CD133+ en 6 ml
Figure imgf000028_0002
Tabla 5. Concentración de las células CD133+ por filtración tras separación magnética
Figure imgf000028_0003
Tabla 6. Concentración de las células CD133+ utilizando la columna AutoMACS
Figure imgf000028_0004

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Un método, que comprende:
- proporcionar un sistema (100);
- realizar una etapa de procesamiento para separar al menos un primer componente y un segundo componente de una muestra; y
- realizar una etapa de separación de muestras a un componente procesado de la muestra, comprendiendo la separación separar los componentes marcados y no marcados magnéticamente del componente de muestra procesado,
en donde el sistema (100) comprende:
a) una unidad (104, 332) de procesamiento de muestras que comprende:
un contenedor (500) giratorio que tiene al menos una cámara (128) de muestra para contener y procesar una muestra, en donde el contenedor (500) giratorio comprende un medio para detectar el progreso de la separación (188; 237; 810) de al menos un primer componente y un segundo componente de una muestra depositada en el contenedor (500) giratorio, y
un puerto de entrada y un puerto de salida acoplados al contenedor (500) giratorio, en donde la unidad (104, 332) de procesamiento de muestras está configurada para
- hacer girar el contenedor (500) para aplicar una fuerza centrífuga a la muestra depositada en la cámara (128) y separar al menos el primer componente y el segundo componente de la muestra depositada; y b) una unidad (106) de separación magnética de muestras
acoplada al puerto de salida de la unidad (104, 332) de procesamiento de muestras, comprendiendo la unidad (106) de separación de muestras:
- un soporte (42) de columna de separación,
- una bomba (64), y
- una pluralidad de válvulas (1-11; 12, 14, 15, 16; 17; 18; 19; 110; 310, 311; 424, 425; 427, 428, 429) configuradas para controlar al menos parcialmente el flujo de fluido a través de un circuito de fluidos y - una columna (2; 40; 322) de separación colocada en el soporte (42), en donde la columna (2; 40; 322) de separación está configurada para separar componentes marcados y no marcados magnéticamente de la muestra que fluye a través de la columna (2; 40; 322);
caracterizado por que el medio para detectar el progreso de la separación en el contenedor (500) giratorio del sistema (100) es una ventana, un prisma (188; 237; 810) o un espejo, y en donde el medio para detectar el progreso de la separación (188; 237; 810) del sistema (100) se ubica de manera que:
- la luz de una fuente de luz pueda penetrar al menos parcialmente a través de al menos una parte de la muestra que se está separando; y
- la luz que atraviesa al menos una parte de la muestra pueda ser detectada por un detector de luz (132).
2. El método según la reivindicación 1, que comprende, además:
detectar el progreso de la separación, en particular detectando la formación de capas de la muestra, el cambio de valor de pH y/o el cambio de temperatura.
3. El método según la reivindicación 1 ó 2, en donde
la muestra es una muestra biológica, en particular, sangre, médula ósea, células, componentes celulares, productos de leucoféresis, tumores o fragmentos de los mismos, tejido, microorganismos, bacterias, hongos o virus.
4. El método según las reivindicaciones 1 a 3, en donde
los medios para detectar el progreso de la separación (188; 237; 810) del sistema (100) están ubicados en el contenedor (500) giratorio esencialmente perpendicular a un eje de rotación del contenedor (500) giratorio.
5. El método según las reivindicaciones 1 a 4, en donde
el medio para detectar el progreso de la separación (188; 237; 810) del sistema (100) está ubicado en el contenedor (500) giratorio llegando esencialmente desde un área adyacente al eje de rotación del contenedor (500) giratorio a un área adyacente al perímetro del contenedor (500) giratorio.
6. El método según la reivindicación 1 a 5, en donde
el prisma (188; 237; 810) o espejo se coloca para cubrir un canal (186; 205; 236; 801) formado en la tapa (192; 800) del contenedor (500) giratorio, en donde el canal (186; 205 ; 236; 801) está configurado de tal manera que al menos una parte de la muestra puede fluir hacia él durante la centrifugación.
7. El método según las reivindicaciones 1 a 6, en donde
el contenedor (500) giratorio está configurado de tal manera que se puede utilizar para cultivar células.
8. El método según las reivindicaciones 1 a 7, en donde
el contenedor (500) giratorio comprende al menos una capa para el cultivo de células sobre el mismo.
9. El método según las reivindicaciones 1 a 8, en donde
el contenedor (500) giratorio es desechable y/o esterilizable.
10. El método según las reivindicaciones 1 a 9, en donde
el contenedor (500) giratorio del sistema (100) comprende un material elegido del grupo que consiste en plásticos, poliestireno, poli(cloruro de vinilo), policarbonato, vidrio, poliacrilato, poliacrilamida, polimetilmetacrilato, polietilentereftalato, politetrafluoretileno, poliuretano termoplástico, silicona, polietileno, colágeno, quitina, alginato, derivados del ácido hialurónico, poliácido, poliglicolida y sus copolímeros, cerámica, materiales de vidrio, como hidroxilapatita y fosfato de calcio, y composiciones que comprenden uno o más de los materiales mencionados anteriormente.
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