CN113966394A - 产生遗传修饰的t细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种产生遗传修饰的T细胞的方法，包括以下步骤：a)提供包含T细胞的样品，b)通过离心制备所述样品，c)富集T细胞，d)使用调节剂激活T细胞，e)通过用慢病毒载体颗粒转导对T细胞进行遗传修饰，f)去除所述调节剂，从而产生遗传修饰的T细胞样品，其中所述方法在等于或少于144小时、少于120小时、少于96小时、少于72小时、少于48小时或少于24小时内进行。在本发明的一个实施方案中，所述T细胞富集通过使用磁性颗粒的磁性细胞分离进行，所述磁性颗粒直接或间接与对CD4和/或CD8特异性的抗体或其抗原结合片段偶联，其中所述磁性颗粒可在分离后从细胞中去除。

Description

产生遗传修饰的T细胞的方法
技术领域
本发明涉及产生遗传工程化T细胞的领域，特别是在短时间内且以目标群体中的低污染物质和/或不需要的细胞的浓度产生遗传工程化T细胞。
背景技术
遗传修饰的T细胞的临床制备是一个复杂的过程。患者的外周血单核细胞(PBMCs)通常富含T细胞，且在用病毒或非病毒载体进行遗传修饰前被激活。然后经修饰的T细胞扩增以达到治疗所需的细胞数量，之后在再输注前，最后将细胞配制和/或冷冻保存。细胞产品必须经过多项质量控制分析，并且必须符合所有发布的标准和良好生产规范(GMP)指南。迄今为止，使用遗传修饰T细胞的过继细胞移植(ACT)通常是由研究人员进行的，他们通过利用现有的设备和基础设施开发了用于小规模临床试验的制备工艺。同时，封闭系统中的自动化过程也是可用的(例如WO2015162211A1、WO2019046766A1)。WO2019032929A1中公开了一种T细胞的遗传工程化方法，其中包含T细胞的样品在刺激条件下孵育，并且其中至少在所述孵育的一部分期间内将核酸引入经刺激的T细胞中。
本领域需要用于产生遗传修饰的T细胞的改进方法，优选自动化过程，例如以降低所产生的T细胞的毒性和/或缩短处理时间，从而允许例如改进向需要的患者的施用。
发明内容
污染药物产品的残留的调节剂在输注时可能是有害的，因为它们可能导致体内T细胞不必要的激活。这可能导致促炎性细胞因子的快速释放，从而引发严重的细胞因子释放综合征、发热、低血压、器官衰竭和甚至死亡。此外，可溶形式和/或细胞结合形式的污染药物产品的残留慢病毒载体在输注时可能是有害的，因为它们可能引起不必要的免疫反应，例如补体激活、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性、诱导针对慢病毒载体递送的抗原的过继性免疫反应和/或体内非靶细胞的转导。非靶细胞的转导和转基因的后续表达可能诱导有害的副作用，例如诱导不必要的免疫反应、致肿瘤性、改变的存活率、增殖、生理状态和自然功能。
令人惊讶地发现，，本文公开的产生经修饰的T细胞的过程可从该过程开始(在该过程期间和/或结束时去除对患者潜在危险的分子、试剂作为清洁和额外的安全层时(即提供包含T细胞的样品))到包含遗传修饰的T细胞的样品减少至少于144小时、少于120小时、少于96小时、少于72小时、少于48小时或甚至少于24小时，，该包含遗传修饰的T细胞的样品随后可准备好(重新)输注给需要的患者。遗传修饰的T细胞可以是表达嵌合抗原受体的T细胞，并且该应用可用于治疗患者的癌症。
令人惊讶的是，无需在体外将工程化T细胞扩增至已知有效治疗患者所需的细胞数量，因为这些遗传修饰T细胞将在体内进一步扩增至细胞的治疗有效量。与过程开始时所提供样品的T细胞数量(量)相比，本文公开的所产生样品中遗传修饰的T细胞数量(量)的扩增可能小于10倍，优选小于5倍。这是可能的，因为通过本文公开的方法产生的遗传修饰的T细胞的组合物/样品具有高质量，即试剂、慢病毒载体和非工程化T细胞组分的低污染。
本发明成功地证实，在缺乏明确的扩增步骤的情况下，使用本文公开的方法在几天内(例如等于或少于3天(72小时))体外产生的CAR T细胞令人惊讶地在体外和体内促进强有力的抗肿瘤活性，这证明了体内扩增而非体外扩增对于功能性CAR T细胞的产生至关重要(参见实施例10)。
数据已经对于在3天内进行的方法证明，但不言而喻的是，在少于72小时(3天)内(例如48小时或24小时内)，所述方法产生的样品也将观察到体内效应，仅仅是所产生的细胞触发杀死癌细胞的体内效应的持续时间将被延迟。图9提供的数据表明制备时间可被缩短，甚至进一步仅具有基因转移效率的降低。
附图说明
图1：短时间期间内产生遗传修饰的T细胞的示意图。
提供了包含T细胞的样品，例如人的全血、白细胞单采样品(leukapheresis)、血沉棕黄层、PBMC、过度生长或分离的T细胞。任选地，样品包含含有抑制通过慢病毒载体的遗传修饰的物质的血清。为能够有效转导，通过洗涤去除血清。此外，T细胞用结合于CD3和CD28的调节剂多克隆激活，随后使用慢病毒载体遗传修饰。作为清理，去除调节剂以获得纯化的遗传工程化T细胞。
图2：去除调节激活剂的示意图。
T细胞用包含对CD3特异性的抗体或其抗原结合片段和对CD28特异性的抗体或其抗原结合片段的调节剂多克隆激活。两种抗体或其片段均直接或间接地与可生物降解的接头偶联。可通过洗涤或添加特异性降解接头的酶来去除调节激活剂，从而释放对CD3和CD28特异性的抗体或片段。此外，激活剂可通过化学破坏所述对CD3和CD28特异性的抗体或其抗原结合片段被去除。可通过一个或多个洗涤步骤从细胞中去除调节剂或其片段。
图3：去除磁性富集试剂的示意图。
CD4+和/或CD8+T细胞通过用磁性颗粒的磁性细胞分离(例如MACS)进行分离，该磁性颗粒使T细胞直接或间接接触偶联的对CD4和/或CD8特异性的抗体或其抗原结合片段。该抗体或其抗原结合片段通过可生物降解的接头偶联至磁性颗粒。偶联的磁性颗粒可通过洗涤或添加特异性降解接头的酶去除，从而从磁性颗粒释放对CD4和/或CD8特异性的抗体或片段。此外，可通过化学破坏去除磁性颗粒。磁性颗粒或其碎片的去除可通过一个或多个洗涤步骤进行。
图4：去除用于T细胞间接磁性标记的试剂的示意图。
T细胞可用磁性颗粒间接标记，该磁性颗粒使T细胞接触通过可生物降解的接头偶联的对CD4和/或CD8特异性的抗体或其抗原结合片段和磁性颗粒，该可生物降解的接头是生物素化的，并且磁性颗粒与对生物素特异性的抗体或其抗原结合片段偶联。磁性颗粒可通过添加特异性消化可生物降解的接头的酶和/或通过添加生物素(作为竞争剂)从所述T细胞释放。此外，间接偶联的磁性颗粒可通过洗涤和/或化学破坏去除。破坏的试剂或磁性颗粒的去除可通过一个或多个洗涤步骤进行。
图5：通过洗涤去除激活剂。
用T Cell TransActTM(Miltenyi Biotec)多克隆刺激富集的T细胞，T CellTransActTM(Miltenyi Biotec)是一种包含直接与可生物降解的接头偶联的对CD3特异性的抗体或其抗原结合片段和对CD28特异性的抗体或其抗原结合片段的调节剂。刺激20小时后，洗涤含有调节激活剂的T细胞，并在刺激后的几个时间点通过流式细胞术测量结合的可生物降解的接头的存在。洗涤有效地去除刺激剂，正如通过可生物降解的接头随着时间推移的降低水平检测到的。
图6：通过洗涤和酶促活性去除调节剂。
用T Cell TransActTM(Miltenyi Biotec)多克隆刺激富集的T细胞，T CellTransActTM(Miltenyi Biotec)是一种包含直接与可生物降解的接头偶联的对CD3特异性的抗体或其抗原结合片段和对CD28特异性的抗体或其抗原结合片段的调节剂。刺激20小时后，洗涤具有结合的调节激活剂的T细胞，并在24小时后通过流式细胞术测量可生物降解的接头的存在。刺激26小时后，加入对可生物降解的接头具有特异性的酶，并在刺激后的几个时间点测量可生物降解的接头随着时间的存在。洗涤和添加对可生物降解的接头具有特异性的酶有效去除刺激剂。
图7：对可生物降解的接头特异性的酶是无毒的。
用T Cell TransActTM(Miltenyi Biotec)多克隆刺激富集的T细胞，T CellTransActTM(Miltenyi Biotec)是一种包含直接与可生物降解的接头偶联的对CD3特异性的抗体或其抗原结合片段和对CD28特异性的抗体或其抗原结合片段的调节剂。刺激26小时后，将酶加入T细胞，并且在24小时后，使用流式细胞术通过PI染色测定存活力。对可生物降解的接头具有特异性的酶不会损害富集且激活的T细胞，因为使用或不使用对可生物降解的接头具有特异性的酶，可检测到相当的存活力。
图8：通过累积洗涤有效去除非细胞组分。
基于两种不同的洗涤方案计算非细胞组分的累积洗涤和去除的效率：每单个洗涤步骤稀释2.6倍或每单个洗涤步骤稀释5倍。计算的累积稀释效率相对于未稀释(即100％)被标准化。对于2.6倍逐级稀释，非细胞组分的比率在连续11个洗涤步骤后降至0.001％以下。对于5倍逐级稀释，非细胞组分的比率在连续7个洗涤步骤后降至0.001％以下。
图9：建立在3天内T细胞遗传工程的流程。
在第0天转导并在第1天与葡聚糖酶(一种对可生物降解的接头具有特异性的酶)孵育的T细胞显示出最低的转导效率水平，表明T细胞刺激不足。通过分析在第2天或第3天晚些时候添加而被刺激较长时间的T细胞以及与在第0天用酶孵育的T细胞相比可检测到更高的转导效率水平证实这一点。在第1天转导并在第2天或第3天与葡聚糖酶一起孵育的受刺激T细胞中观察到接近常规方案的更好的转导效率。
图10：用于3天内产生的遗传工程化T细胞的
Figure BDA0003369215670000051
Prodigy系统中的调节剂的有效去除。
在
Figure BDA0003369215670000052
Prodigy系统中自动处理具有高达le9CD4/CD8细胞的健康供体的的白细胞单采样本，以在3天内产生CAR T细胞。使用调节剂
Figure BDA0003369215670000053
GMP T CellTransActTM(Miltenyi Biotec)多克隆刺激4e8 T细胞，并用VSV-G假型慢病毒载体进行遗传修饰。在第2天，自动加入10ml含有葡聚糖酶的溶液，以特异性地降解可生物降解的接头，释放对CD3和CD28特异性的抗体或片段，并消除调节剂的活性。作为对照，在相同的条件和相同的供体材料下但不添加对可生物降解的接头具有特异性的酶，在
Figure BDA0003369215670000061
Prodigy系统中运行生产。
图10A：通过使用对可生物降解的接头特异性的抗体染色在配制的细胞上通过流式细胞术对
Figure BDA0003369215670000062
Prodigy系统中的T细胞工程化运行评估可生物降解的接头的存在。
图10B：与未添加酶的
Figure BDA0003369215670000063
Prodigy运行相比，在
Figure BDA0003369215670000064
Prodigy系统中的可生物降解的接头被有效去除，因为仅检测到少量接头阳性细胞。此外，当添加酶时，对于所有活细胞，可生物降解的接头的平均强度水平(MFI)处于背景水平。
图11：在第2天酶促去除激活剂时
Figure BDA0003369215670000065
Prodigy系统中的T细胞刺激水平。
去除调节剂对刺激水平的影响通过流式细胞术在对CD25和CD69进行染色后进行评估，CD25和CD69均被描述为可靠的T细胞激活标志物(CD25：REA570；CD69：REA824；Miltenyi Biotec)。对作为对照的从来自小规模培养物的同一供体处获得非刺激的T细胞和从使用或未使用酶处理的
Figure BDA0003369215670000066
Prodigy系统中获得的T细胞进行分析。
与非刺激的对照细胞相比，在使用或不使用葡聚糖酶处理的T细胞样品中检测到两种激活标志物的平均强度水平均显著升高，证实了直至第2天的刺激已经足以上调两种激活标志物。这也表明，在不影响刺激的情况下，可在第2天或更早时间去除调节剂。
图12：在3天内用于T细胞遗传工程的
Figure BDA0003369215670000067
Prodigy系统中刺激T细胞的增殖。
对于三次独立的制备运行，在第3天时未检测到T细胞扩增，表明T细胞被充分激活，但T细胞尚未开始增殖(另见图12)。因此，在3天内对T细胞进行遗传修饰的制备方案太短而无法支持T细胞的体外增殖。
图13：评估小规模的CAR表达动力学。
图13A：第5天后，转导效率达到18-22％的平稳水平，证实了稳定的转基因递送和转基因表达。
图13B：转导后2天，16％的T细胞已呈CAR阳性，但尚未检测到明显的CAR阳性群体。在随后的时间点，通过流式细胞术检测到明显的CAR表达群体。
图14：评估在
Figure BDA0003369215670000071
Prodigy系统中大规模生产的CAR表达动力学。
与小规模实验(见图13)相比，在早期时间点，
Figure BDA0003369215670000072
Prodigy系统中CAR表达未达到平稳水平。转导后2天，19％的T细胞为CAR阳性。在后期的时间点，转导效率升高至75％，表明CAR在转导后2天仍未充分表达。
图15：优化
Figure BDA0003369215670000073
Prodigy系统中的CAR T细胞制备参数。
用2.5ml编码用于1e8 T细胞的慢病毒载体的VSV-G假型CD20/CD19串联CAR(参见图15：条件I)，同时使用相同体积的慢病毒载体遗传修饰4e8 T细胞(参见图15：条件II)对分离和刺激的T细胞进行遗传修饰。条件II还通过增加体积和实施早期摇动步骤支持更高细胞密度的培养。第2天，将相同体积的葡聚糖酶应用于两种T细胞制备条件。第3天，多次洗涤制备的T细胞，收获并通过细胞计数确定T细胞总数。将两种CAR T细胞制备条件的洗涤和收获的细胞样品在培养箱中24孔中再培养8天，以使得在通常观察到CAR表达的稳定状态时能够可靠地评估转导效率。
图15A：条件II的转导效率为32％，而条件I的转导效率仅为20％。重要的是，对条件I应用了更高的每细胞LV剂量(MOI)。
图15B：对于条件II，不仅确定了更高的转导效率，而且转导了4倍多的T细胞(即4e8)。与条件I相比，条件II的CAR转导T细胞的产量增加了近7倍。
图16：3天内产生的CAR T细胞的细胞因子表达水平刺激的、CD20-CAR转导以及葡聚糖酶处理的T细胞(3天内在
Figure BDA0003369215670000081
Prodigy系统中制备)在不同效应-靶比率(E:T)下与CD20、GFP表达的Raji细胞共培养，并在24小时后使用MACSPlex细胞因子检测试剂盒(Miltenyi Biotec)评估炎性细胞因子(如γ-干扰素(IFN-g)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和IL-2)的存在。对于在3天内产生的CD20 CAR转导的T细胞，IFN-g、GM-CSF和IL-2水平可以高水平被检测，甚至超过以E:T依赖方式定量的水平。相反，非刺激的T细胞和未被转导的受刺激T细胞中均未检测到细胞因子。这证实了3天内制备的CAR转导T细胞的肿瘤抗原特异性反应。
图17：3天内产生的CAR T细胞的细胞毒性活性。
在3天内制备的CAR T细胞和Raji-GFP细胞共培养另外2天，其中50％的细胞通过流式细胞术进行分析以量化剩余肿瘤细胞的数量及因此CAR T细胞的细胞溶解潜力(第1轮；左侧)。向剩余50％的共培养物中另外加入20,000个Raji-GFP肿瘤细胞，以评估在连续第二轮共培养中加入额外的肿瘤细胞时的CAR T细胞的效力，并在对CAR T细胞挑战的条件下评估细胞毒性活性(第二轮：右)。72小时后，进行流式细胞术以量化第二轮共培养的剩余肿瘤细胞的数量。对于高E:T比率(即1.25:1)，在第一轮和第二轮中几乎100％的Raji细胞被裂解。相比之下，未转导对照中仅检测到50％和40％的剩余靶细胞。对于0.425:1的E:T比率，功能上与1.25:1时相当，但总体水平较低：在第一轮和第二轮共培养中，60％的肿瘤细胞在CAR转导T细胞存在下被裂解。相比之下，在第一轮中只有40％的肿瘤细胞在未转导的CAR T细胞存在的情况下被裂解，而在第二轮中未检测到杀伤。当未转导的T细胞与CAR转导T细胞相比时，在E:T比率为0.15:1时的第一轮中未检测到特异性杀伤。综上所述，与未转导的对照相比，连续两轮共培养后检测到的肿瘤细胞较少，因此3天内制备的CAR转导T细胞的功能性在体外得到了证实。
图18：3天内产生的CAR T细胞的体内功能。
在6-8周大的NOD scid gamma(NSG)(NOD.Cg-PrkdcscidI12rgtmlWjl/SzJ)小鼠中证实了3天内产生的CAR转导T细胞的体内功能。所有实验均按照“欧洲议会和理事会2010年9月22日关于保护用于科学目的的动物的第2010/63/EU号指令”和德国动物保护法的规定进行。
简而言之，在
Figure BDA0003369215670000094
Prodigy系统中自动处理健康捐献者的白细胞单采样品，以在3天内产生CAR T细胞(见图18顶图)。在第0天，通过焊接将包含白细胞单采样品的袋无菌连接至CliniMACS
Figure BDA0003369215670000095
Tubing Set 520。细胞被自动洗涤并用CD4和CD8CliniMACS试剂标记以富集T细胞。将2e8 T细胞在含IL-7/IL-15的培养基中转移至培养室，并在200ml培养体积中使用
Figure BDA0003369215670000096
GMP T Cell TransActTM(Miltenyi Biotec)进行多克隆刺激。第1天，用VSV-G假型慢病毒载体对分离且受刺激的T细胞进行遗传修饰，以诱导CD22/CD19串联CAR的表达。将含有10ml慢病毒载体的袋无菌连接至管组并自动转移至含有T细胞的室。第2天，将10ml含有葡聚糖酶的溶液无菌连接至管组，并自动添加至含有T细胞的室以特异性降解接头，从而释放对CD3和CD28特异性的抗体或片段并抑制调节剂的活性。多次洗涤后，通过流式细胞术分析细胞产物以确定每一步的转导效率、活力和细胞组成(见图19)。每只小鼠在收获日被注射来自CAR转导组的3e6或6e6总T细胞(见图18底图)。已在4天前通过静脉内接种5e5 Firefly荧光素酶表达的Raji细胞建立肿瘤(见图17)。每组7只小鼠接受处理。另外两组作为阴性对照：一组接受肿瘤细胞但不接受T细胞(n＝7；仅肿瘤)，一组接受小规模平行培养的来自同一供体的肿瘤细胞和3e6未转导T细胞(n＝7)。使用体内成像系统(IVIS Lumina III)频繁监测肿瘤生长和抗肿瘤反应。为此，静脉注射100μlXenoLight Rediject D-Luciferin Ultra，随后使用异氟醚XGI-8麻醉系统对小鼠进行麻醉。在底物注射六分钟后进行测量。实验结束时，制备脾脏、骨髓和血液并通过流式细胞术进行分析，以确定肿瘤细胞和T细胞亚群的频率。
图19：细胞组成。
通过CD45h、CD3、CD4、CD8、CD16/CD56、7-AAD、CD19、CD14的染色使用流式细胞术对富集前、富集后和收获后的样品测定细胞组成，从而确定细胞产品的质量。配制后的细胞组成为67％的CD4 T细胞、18％的CD8 T细胞和7％的NKT细胞。NK细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、B细胞或单核细胞的频率处于背景水平，证实了富集后T细胞的纯度。
图20：选定组的代表性体内成像数据。
通过体内成像频繁监测CAR T细胞的肿瘤负荷以及抗肿瘤活性。所有小鼠均显示为包含已接受3e6活性T细胞(转导和未转导)的小鼠的群组。7只中3只代表性小鼠显示为仅肿瘤组。接受未转导T细胞或仅接受肿瘤细胞群组中小鼠的肿瘤负荷迅速增加。必须在T细胞注射后的第14天处死两个对照组的小鼠，因为达到肿瘤负荷的临界水平。相反，与对照组相比，在T细胞注射后3天和7天，已接受CAR转导T细胞的小鼠在早期时间点以剂量依赖方式表现出减速的升高。CAR转导T细胞组的肿瘤负荷水平在T细胞注射后第7天达到峰值，随后肿瘤负荷稳步降低至实验开始时测得的水平。
图21：所有组的体内成像数据。
显示了所有组的所有小鼠的随时间以p/s测量的平均肿瘤负荷+/-SEM。包含6E6CAR转导T细胞组(n＝7)的数据。用6E6 T细胞处理的小鼠显示出比3E6组更快的抗肿瘤反应。在注射T细胞后第14天，两种T细胞剂量的肿瘤负荷均显著降低至相当低的水平。对照组(即仅肿瘤和未转导T细胞)不能控制肿瘤生长和介导有效的抗肿瘤活性。
图22：骨髓中T细胞的丰度。
在进行CD45h、CD4、CD8、CD20、CD22、7-AAD、CD 19CAR检测(均Miltenyi Biotec)染色时，通过流式细胞术对随机选择的3只小鼠的骨髓中人T细胞的丰度进行定量。显示了每只小鼠的编号。对于对照组，对在第14天取样的骨髓进行分析。对于3e6 CAR转导T细胞组，在第18天对3只随机选择的小鼠进行分析。正如预期，仅肿瘤组中未发现T细胞。在未转导群组中检测到高达20％的T细胞。相比之下，在包含被输注CAR转导T细胞的小鼠的群组中，人类T细胞的频率最高(高达75％)，表明CAR T细胞归巢至该小生境并在体内增殖。
图23：骨髓中肿瘤和T细胞的丰度。
对人细胞区室进行更详细的研究以确定人Raji肿瘤细胞和人T细胞的频率。因此，所有人细胞的频率被设定为100％。显示了每只小鼠的编号。正如预期，在仅肿瘤组中未发现人类T细胞，而仅发现Raji细胞。骨髓是Raji肿瘤细胞的优选小生境。相比之下，对于CAR转导T细胞组，在该器官中仅检测到一小部分Raji细胞。这与存在于这些代表性小鼠器官中约50％人CD4和-50％人CD8 T细胞一致。对于CD4与CD8 T细胞的比率为2:1至3:1的未转导T细胞组，20-60％的人细胞为Raji细胞。
图24：脾脏中T细胞亚群的丰度。
在对于CD45h、CD4、CD8、CD20、CD22、7-AAD、CD19 CAR检测(均为Miltenyi Biotec)染色时，通过流式细胞术对随机选择的3只小鼠的脾脏中T细胞的丰度进行定量。显示了每只小鼠的编号。对于对照组，对在第14天取样的脾脏进行分析。对于3e6 CAR转导T细胞组，在第18天对3只随机选择的小鼠进行分析。正如预期，仅肿瘤组中未发现T细胞。在未转导群组中检测到高达10％的T细胞。相比之下，在包含被输注CAR转导T细胞小鼠的群组中，人类T细胞的频率最高(高达40％)。
图25：血液中T细胞亚群的丰度。
在对于CD45h、CD4、CD8、CD20、CD22、7-AAD、CD19 CAR检测(均为Miltenyi Biotec)染色时，通过流式细胞术对3只随机选择的小鼠的血液中循环的T细胞的丰度进行定量。显示了每只小鼠的编号。对于对照组，对在第14天取样的脾脏进行分析。对于3e6CAR转导T细胞组，在第18天对3只随机选择的小鼠进行分析。仅肿瘤组中未发现T细胞且在包含具有未转导T细胞的小鼠的群组中仅发现少量T细胞。相比之下，在包含被输注CAR转导T细胞小鼠的群组中，血液中循环的人T细胞的频率最高(高达25％)。
具体实施方式
在本发明的一个方面，提供了一种产生遗传修饰的T细胞的方法，其包括以下步骤：
a)提供的样品，所述样品包含T细胞，
b)通过离心制备所述样品，
c)富集步骤b的T细胞(从制备的样品中富集T细胞)，
d)使用调节剂激活富集的T细胞，
e)通过用慢病毒载体颗粒转导对激活的T细胞进行遗传修饰，
f)去除所述调节剂，
从而产生遗传修饰的T细胞的样品，
其中所述方法在等于或少于144小时、少于120小时、少于96小时、少于72小时、少于48小时或少于24小时内进行。
迄今为止，输注CAR T细胞后最常见的不良反应是免疫激活的发作，称为细胞因子释放综合征(CRS)。这是一种全身性炎性反应，其在输注后不久由输注的CAR T细胞释放的细胞因子引起，识别出表达CAR抗原的肿瘤细胞的潜在高负荷。在短时间内的CAR T细胞制备可至少部分降低这种毒性，因为并非所有CAR T细胞都在这一早期时间点表达CAR，随后CAR表达水平稳定但缓慢提高(参见实施例10)。
例如，本文公开的用于T细胞富集的调节剂和/或磁性颗粒的去除与本文公开的方法在等于或少于144小时、少于120小时、少于96小时、少于72小时(3天)、少于48小时或少于24小时内的性能的结合成功地允许应用于对患有例如癌症的患者进行体内治疗，其中所述方法的所述产生的样品中T细胞的数量比所述提供样品中T细胞的数量高少于10倍或少于5倍。
提供的包含T细胞的样品(或提供样品)可由受试者(例如人)提供(包含受试者提供的T细胞的样品)。所述提供的样品可以是人的全血、受试者的白细胞单采样品、血沉棕黄层、PBMC、过度生长或分离的T细胞。
所述样品的制备可导致体积减少、再缓冲、血清去除、红细胞减少、血小板去除和/或洗涤。
或者，所述方法可以从步骤a开始：提供包含T细胞的样品。
或者，所述方法可以从步骤b开始：通过离心制备包含T细胞的样品。该可选步骤b之后可以是步骤c至f。
所述方法，其中步骤a)的所述样品包含人血清，并且其中通过步骤b)去除所述血清。
所述人血清可包含降低慢病毒载体颗粒向细胞的转导效率的组分。可降低所述转导效率的所述人血清的组分可以是受试者的补体系统的组分，或可以是中和性抗体(参见例如DePolo et al,2000,Molecular Therapy,2:218-222)。
人血清的去除可通过由所述离心实现的洗涤(洗涤步骤)进行。洗涤步骤可通过一系列培养基/缓冲液交换(至少两次交换)进行，从而从T细胞中去除人血清和/或其组分。
所述方法，其中所述T细胞在少于2小时、优选少于1小时内制备和富集。
所述方法，其中使用所述调节剂在少于72小时、优选少于48小时、更优选少于24小时内激活(刺激)所述T细胞，即所述调节剂的添加和所述调节剂的去除发生在所述小时的期间内。
所述方法，其中所述激活的T细胞的转导在所述使用调节剂的T细胞刺激后2天开始，优选在所述刺激后1天开始，更优选与所述刺激同时开始。
所述方法，可在向T细胞中添加所述调节剂(步骤d)后少于2小时、优选少于1小时、更优选少于30分钟内去除所述调节激活剂(步骤f)。
所述方法，其中通过用慢病毒载体颗粒转导对所述T细胞进行的所述遗传修饰(步骤e)可在少于2天内，优选在少于1天内，更优选在少于12小时内进行。
所述方法，其中提供的样品的T细胞可在所述T细胞的遗传修饰之前通过使用CD4和/或CD8作为正向选择标记对CD4阳性和/或CD8阳性进行富集，和/或其中提供的样品的T细胞可通过使用肿瘤相关抗原(TAA)作为负向选择标记耗减污染包含T细胞的样品的癌细胞。TAA可选自例如CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD70、IgK、IL-lRap、Lewis-Y、NKG2D配体、ROR1、CAIX、CD133、CEA、c-MET、EGFR、EGFRvIII、EpCam、EphA2、ErbB2/Her2、FAP、FR-a、GD2、GPC3、IF-13Ra2、FI-CAM、间皮素、MUC1、PD-F1、PSCA、PSMA、VEGFR-2、BCMA、CD123和CD16V中的一种或多种标志物。
所述CD4+和/或CD8+T细胞的富集和/或所提供样品中癌细胞的耗减可通过分离步骤进行。所述分离可通过流式细胞术方法(荧光激活细胞分选)如FACSorting、磁性细胞分离如MACS或通过基于微型芯片的细胞分选如
Figure BDA0003369215670000141
进行。优选使用磁性细胞分离步骤。
所述方法，其中所述CD4和/或CD8阳性T细胞的富集通过磁性细胞分离步骤进行，其包括:
i)使T细胞与磁性颗粒接触，所述磁性颗粒直接或间接与对CD4和/或CD8特异性的抗体或其抗原结合片段偶联，其中所述磁性颗粒和与之偶联的所述抗体或其抗原结合片段可被去除，
ii)在磁场中分离CD4和/或CD8 T细胞，
iii)分离后从富集的T细胞中去除所述磁性颗粒。
所述方法，其中所述CD4和/或CD8阳性T细胞的富集通过磁性细胞分离步骤进行，其包括:
i)使T细胞与磁性颗粒接触，所述磁性颗粒直接或间接与对CD4和/或CD8特异性的抗体或其抗原结合片段偶联，其中所述磁性颗粒和与之偶联的所述抗体或其抗原结合片段可通过洗涤去除，
ii)在磁场中分离CD4和/或CD8 T细胞，
iii)在分离步骤后通过洗涤从富集的T细胞中去除所述磁性颗粒。
所述方法，其中所述CD4和/或CD8阳性T细胞的富集通过磁性细胞分离步骤进行，其包括:
i)使T细胞与磁性颗粒接触，所述磁性颗粒直接或间接与对CD4和/或CD8特异性的抗体或其抗原结合片段偶联，其中所述磁性颗粒和与之偶联的所述抗体或其抗原结合片段可被化学和/或酶促破坏，ii)在磁场中分离CD4和/或CD8 T细胞，
iii)在分离步骤后，通过化学和/或酶促破坏所述磁性颗粒和与之偶联的所述抗体或其抗原结合片段，从富集的T细胞中去除所述磁性颗粒。
在分离步骤后，所述通过化学和/或酶促破坏从富集的T细胞中去除所述磁性颗粒可在磁场内或在移除磁场后进行。
用于从细胞中去除已经直接或间接结合到所述细胞的磁性颗粒的方法和系统是本领域中是已知的。
本文列出了一些用磁性颗粒可逆标记细胞的示例性的方法和系统，其导致细胞中磁性颗粒的破坏。
一种策略利用非共价结合相互作用的特定竞争。US20080255004公开了一种可逆结合固体支持物(例如磁性颗粒)的方法，该方法使用识别与修饰的生物素(例如去硫生物素)、修饰的链霉亲和素或结合到固体支持物的亲和素缀合的靶部分的抗体。与生物素和链霉亲和素之间的强特异性结合相比，经修饰的结合配偶体的结合相互作用较弱，因此在这些竞争者存在的情况下促进解离。EP2725359B1描述了一种用于可逆磁性细胞分离的系统，该系统基于识别靶部分的配体-PEO-生物素-缀合物的非共价相互作用和可通过加入竞争分子生物素、链霉亲和素或辅助试剂释放的破坏磁性颗粒的抗-生物素-抗体。
所述方法，其中所述CD4和/或CD8阳性T细胞的富集通过磁性细胞分离步骤进行，其包括:
i)使T细胞与磁性颗粒接触，所述磁性颗粒通过接头间接与对CD4和/或CD8特异性的抗体或其抗原结合片段偶联，其中所述磁性颗粒和与之偶联的所述抗体或抗原结合片段可通过添加竞争试剂去除，所述竞争试剂与所述接头竞争结合至所述抗体或其抗原结合片段，
ii)在磁场中分离CD4和/或CD8 T细胞，
iii)在分离步骤后，通过加入竞争试剂从富集的T细胞中去除所述磁性颗粒。
所述方法，其中所述竞争试剂为生物素、链霉亲和素或辅助试剂。
除了这些竞争性释放机制外，还提到了通过机械搅拌、可化学裂解或可酶促降解的接头去除标记。WO 96/31776描述了一种通过颗粒涂层的部分或涂层和抗原识别部分之间的连接基团中存在的部分的酶促裂解从靶细胞中分离后释放的方法。一个示例是涂覆有葡聚糖和/或通过葡聚糖连接到抗原识别部分的磁性颗粒的应用。随后，分离的靶细胞从磁性颗粒的裂解通过添加葡聚糖降解酶葡聚糖酶开始。EP3037821中的相关方法公开了利用具有可酶促降解间隔物的缀合物根据例如荧光信号检测和分离靶部分。
最近，人们对利用抗原识别部分的技术越来越感兴趣，该部分与靶部分的结合具有低亲和力常数的特征。为了确保用这些低亲和力的抗原识别部分进行特定且稳定的标记，标记缀合物的结构必须包含提供高亲合力的抗原识别部分的多聚化。在多聚化被破坏后，低亲和力抗原识别部分可与靶部分解离，因此提供了从靶部分释放其最佳检测部分和抗原识别部分的机会。
这种可逆的多聚体染色首次分别在US7776562和US8298782中被描述，其中多聚化是通过非共价结合相互作用建立的。示例性的，具有StreptagII的低亲和力肽/MHC单体与链球菌素多聚化，并且该多聚化在加入竞争分子生物素后是可逆的。
US9023604分别针对抗原识别部分和受体结合试剂的特性对该方法进行了修订，以实现可逆标记。特征在于结合配偶体C的约0.5x10-4 sec-1或更高的解离速率常数的受体结合试剂通过与具有至少两个可逆地、非共价地与结合配偶体C相互作用的多聚化试剂多聚化，以提供对靶抗原具有高亲合力的复合物。可检测标记与多价结合复合物结合。多聚的可逆性在当结合配偶体C和多聚化试剂的结合位点Z之间的结合被破坏后开始。例如，在Fab-StreptagII/Streptactin的多聚体中，多聚化可被竞争剂生物素逆转。
EP0819250B1中提供了一种通过亲和试剂(例如抗体或其抗原结合片段)释放结合于细胞表面的磁性颗粒的方法。磁性颗粒通过存在于(a)颗粒涂层和(b)涂层和亲和试剂之间的连接基团中的至少一个中的对糖苷键特异性的糖苷酶的作用被释放。
EP3336546A1中公开了一种用于检测生物标本的样品中靶部分的方法，其包括：
a)提供至少一种具有通式(I)的缀合物
An-P-Bm-Cq-Xo(I)
其中，A：抗原识别部分；
P：酶促降解间隔基；
b：第一结合部分
c：第二结合部分
x：检测部分；
n,m,q,o：1到100之间的整数，
其中B和C相互非共价结合，A和B共价结合至P，
b)用至少一种缀合物标记由抗原识别部分A识别的靶部分，
c)通过检测部分X检测经标记的靶部分，
d)通过破坏Bm和Cq之间的非共价键使Cq-Xo从经标记的靶部分切割，
e)通过酶促降解间隔基P使结合部分Bm从经标记的靶部分切割。
EP3336546A1的方法不仅可用于检测靶部分，即表达这些靶部分的靶细胞，还可用于从生物标本的样品中分离靶细胞。分离程序利用检测靶部分。例如，通过荧光检测靶部分可用于触发在FACS或TYTO分离系统上进行的适当分离过程。在EP3336546A1的方法中，众所周知的磁性细胞分离过程也可用作检测和分离过程，其中通过磁场检测磁性颗粒。
在本发明的一个优选实施方案中，直接与对CD4和/或CD8特异性的抗体或其抗原结合片段偶联的所述磁性颗粒通过可生物降解的接头偶联，其中所述可生物降解的接头通过添加(特异性)消化可生物降解的接头的酶被降解。所述可生物降解的接头可以是或可包含多糖，并且所述特异性消化糖苷键的酶是水解酶。所述可生物降解的接头可以是或可包含葡聚糖，并且(特异性)消化葡聚糖的所述酶可以是葡聚糖酶。
在本发明的另一个优选实施方案中，所述间接与对CD4和/或CD8特异性的抗体或其抗原结合片段(例如Fab)偶联的磁性颗粒通过两种组分偶联：
i)接头(例如葡聚糖)，其可偶联至标记(例如PEO-生物素)，或偶联至标记(例如PEO-生物素)的对CD4和/或CD8特异性的所述Fabs，
ii)与对所述标记(例如生物素)特异性的抗体或其抗原结合片段偶联的磁性颗粒，其中在组分i和ii组合后以及在T细胞与所述间接偶联的磁性颗粒接触后，可通过添加与所述标记(例如生物素(作为竞争剂))竞争的竞争试剂破坏(去除)磁性颗粒。
在本发明的另一个优选实施方案中，所述间接与对CD4和/或CD8特异性的抗体或其抗原结合片段(例如Fabs)偶联的磁性颗粒通过两种组分偶联：
i)可生物降解的接头，例如葡聚糖，其与标记(例如PEO-生物素)偶联，
ii)与对所述标记(例如生物素)特异性的抗体或其抗原结合片段偶联的磁性颗粒，其中在将组分i和ii组合后以及在T细胞与所述间接偶联的磁性颗粒接触后，通过添加特异性消化可生物降解的接头的酶(例如葡聚糖酶)和/或通过添加与所述标记(例如生物素)(作为竞争剂)竞争的竞争试剂，可破坏所述T细胞中的磁性颗粒。
所述方法，其中所述竞争试剂为生物素、链霉亲和素或辅助试剂。
图4中阐明了关于释放/破坏的原理的本发明的该实施方案的原理。
所述方法，其中所述调节剂包含通过接头直接或间接偶联的对CD3特异性的抗体或其抗原结合片段和/或对CD28特异性的抗体或其抗原结合片段，其中所述对CD3和CD28特异性的抗体或其抗原结合片段可被去除。
所述从细胞中去除调节剂可通过一个或多个洗涤步骤进一步进行。
所述方法，其中所述调节剂包含通过接头直接或间接偶联的对CD3特异性的抗体或其抗原结合片段和/或对CD28特异性的抗体或其抗原结合片段，其中所述对CD3和CD28特异性的抗体或其抗原结合片段可被化学和/或酶促破坏，并且其中所述调节剂通过对所述对CD3和CD28特异性的抗体或其抗原结合片段的化学和/或酶促破坏被去除。从细胞中去除被破坏的调节剂可进一步通过一个或多个洗涤步骤进行。
上述用于从细胞中去除已直接或间接结合至所述细胞的磁性颗粒的方法和系统也可是合适的，可转移至和/或可用于去除所述调节剂，所述调节剂包含通过接头直接或间接偶联的对CD3特异性的抗体或其抗原结合片段和对CD28特异性的抗体或其抗原结合片段。
所述方法，其中所述对CD3和/或CD28特异性的抗体或其抗原结合片段的所述调节剂的所述去除通过以下方式进行：
a)竞争反应，其包括添加与标记(例如生物素(作为竞争试剂))竞争的竞争试剂的步骤，如果所述调节剂包含通过两种组分间接偶联的对CD3和/或CD28特异性的抗体或其抗原结合片段，例如Fabs，其中所述两种组分可以是：
i)对CD3和/或CD28特异性的抗体或其抗原结合片段(例如Fabs)偶联至所述标记(例如PEO-生物素)，或通过偶联至所述标记(例如PEO-生物素)的接头(例如葡聚糖)偶联的对CD3和/或CD28特异性的抗体或其抗原结合片段，例如Fabs，并且
ii)抗体或其抗原结合片段，例如Fabs，其对标记(例如生物素)具有特异性，并且其中所述组分i)和ii)已经组合并与所述细胞接触，和/或
b)酶促破坏，其包括添加生物降解所述接头的酶的步骤，如果接头是可生物降解的接头(即两种抗体或其抗原结合片段通过接头间接或直接连接)。
在本发明的另一个优选实施方案中，所述调节剂包含通过两种组分间接偶联的对CD3和/或CD28特异性的抗体或其抗原结合片段，例如Fabs：
i)对CD3和/或CD28特异性的抗体或其抗原结合片段(例如Fabs)与标记(例如PEO-生物素)，或通过与标记(例如PEO-生物素)偶联的接头(例如葡聚糖)偶联的对CD3和/或CD28特异性的抗体或其抗原结合片段(例如Fabs)偶联，
ii)对标记(例如生物素)特异性的抗体或其抗原结合片段，例如Fabs，其中在组分i和ii组合后以及在T细胞与所述结合组分接触后，所述结合组分可通过添加与所述标记(例如生物素(作为竞争物))竞争的竞争试剂破坏(去除)。
所述可生物降解的接头可以是或可包含多糖，并且所述特异性消化糖苷键的酶可以是水解酶。
所述可生物降解的接头可以是或可包含葡聚糖，并且所述特异性消化葡聚糖的酶可以是葡聚糖酶。
在本发明的一个优选实施方案中，所述调节剂包含通过可生物降解的接头直接偶联的对CD3特异性的抗体或其抗原结合片段和/或对CD28特异性的抗体或其抗原结合片段，其中所述可生物降解的接头通过添加特异性消化可生物降解的接头的酶降解。所述可生物降解的接头可以是或可包含多糖，并且所述特异性消化糖苷键的酶是水解酶。
所述可生物降解的接头可以是或可包含葡聚糖，并且所述特异性消化葡聚糖的酶可以是葡聚糖酶。
所述方法，其中通过用慢病毒载体颗粒转导对T细胞进行遗传修饰后，残留慢病毒载体颗粒被去除。
所述残留慢病毒载体颗粒的去除可在所述调节剂的去除和/或所述磁性颗粒的去除之前、紧接其后或之后进行。
所述残留慢病毒载体颗粒的去除可通过洗涤进行，其中洗涤导致包含遗传修饰的T细胞的样品中残留载体颗粒减少至少10倍，优选100倍。
洗涤步骤可通过一系列培养基/缓冲液交换(至少两次交换)进行，从而从包含所述遗传修饰的T细胞的所述样品中去除所述残留慢病毒载体颗粒。交换可通过离心、沉淀、附着或过滤分离细胞和培养基/缓冲液及随后的培养基/缓冲液的交换进行。
通过洗涤使包含遗传修饰的T细胞的样品中的残留载体颗粒减少至少10倍，优选100倍，其可通过例如以下方式实现：
i)分离细胞和培养基/缓冲液，
ii)移除90％，优选99％体积的培养基/缓冲液，
iii)向原始体积中添加新的培养基/缓冲液，
iv)在培养基/缓冲液中再悬浮细胞。
洗涤步骤可以连续的方式进行，这可能导致慢病毒载体的累积减少(即两个洗涤步骤，每一步减少10倍，导致累积减少100倍)。
所述残留慢病毒载体颗粒的去除可通过与灭活慢病毒载体颗粒和/或降低其稳定性的物质一起孵育进行。灭活慢病毒载体颗粒和/或降低其稳定性的物质可在所述孵育后洗掉，其中所述孵育不超过3小时，优选不超过1小时。
灭活慢病毒载体颗粒和/或降低其稳定性的这类物质可以是例如肝素、抗逆转录病毒剂、人体血液的补体因子、人血液中包含的中和抗体或温和的碱性缓冲液。
所述抗逆转录病毒剂可以是例如齐多夫定(zidothymidin，AZT)或雷特格韦(Raltegravir)的病毒酶的抑制剂。
血液(例如人体血液)中包含的补体因子和/或中和抗体可通过本领域众所周知的方法分离。
温和的碱性缓冲液可具有约7至9的pH值，足够温和而不会损害样品的T细胞。例如Holic等描述了这种缓冲液(Hum Gene Ther Clin Dev.2014Sep；25(3):178-85)。
所述方法，可将本文公开的经去除的人血清或从中分离的物质(例如抑制慢病毒载体颗粒向T细胞的增殖转导的补体因子和/或中和抗体)添加至遗传修饰的T细胞，从而去除和/或中和残留慢病毒载体颗粒。
本文公开的方法，其中所述方法是自动化方法，优选在封闭系统中执行。
本文公开的方法可完全作为自动化过程实施，优选在GMP条件下的封闭系统中实施。
这样的封闭系统允许在GMP或GMP样条件(“无菌”)下操作，从而产生临床适用的细胞组合物。在此示例性地将CliniMACS
Figure BDA0003369215670000221
(Miltenyi Biotec GmbH，德国)用作封闭系统。W02009/072003中公开该系统。但并不旨在将本发明方法的使用限制于
Figure BDA0003369215670000222
Prodigy。
CliniMACS
Figure BDA0003369215670000223
系统被设计为自动化且标准化完整细胞产品制备过程。它将
Figure BDA0003369215670000224
分离技术(德国Miltenyi Biotec GmbH)与广泛的传感器控制、细胞处理能力相结合。该设备的突出特点包括：
·能够标准化细胞处理和培养的一次性CentriCultTM室，
·细胞富集和耗减能力，单独或与
Figure BDA0003369215670000231
Reagents(Miltenyi Bio tecGmbH)组合，
·由于温度和受控的CO2气体交换的细胞培养和细胞扩增能力，
·预定义培养基和体积中的最终产品制剂，
·使用Flexible Programming Suite(FPS)和GAMP5兼容编程语言对设备进行编程以定制细胞处理的可能性，
·为各种应用量身定制的管组。
离心室和培养室可以相同。离心室和培养室可在各种条件中使用：例如，对于分离或转导，可施加高旋转速度(即高g力)，而例如，培养步骤可在缓慢旋转或甚至怠速状态下进行。在本发明的另一变形中，室以震荡方式改变旋转方向，从而导致室的振动并维持细胞的悬浮状态。因此，在本发明的方法中，T细胞刺激、基因修饰和/或培养步骤可在离心或培养室的稳定或振动条件下进行。
所述方法，其中所产生的样品中T细胞数量比所述提供的样品中T细胞数量高可少于10倍，优选少于5倍。
所述方法，其中产生的T细胞经历少于4次，优选少于3次细胞分裂。
由于这些遗传修饰T细胞进一步扩增至细胞的治疗有效量将在体内发生，因此无需在体外将工程化T细胞扩增至已知患者治疗所需的有效细胞数量(参见，例如Ghassemiet al,2018,Cancer Immunol Res 6:1100-1109)。这是可能的，因为通过本文公开的方法产生的遗传修饰的T细胞的组合物/样品质量高，即非工程化T细胞组分和有毒物质的污染低。
省略遗传修饰的T细胞的体外扩增/增殖至更大的细胞数量，使得制备包含经修饰的T细胞的临床适用组合物所需的时间减少。
所述经遗传修饰的T细胞可经遗传修饰以在其细胞表面上表达嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)或任何辅助分子。
对于最终制剂，可通过离心和用适合后续应用(例如向患者输注产生的细胞组合物)的缓冲液替换培养基洗涤遗传修饰的T细胞。
当需要时，可从未修饰的T细胞中分离遗传修饰的T细胞，例如再次使用磁分离技术。
在本发明的一个方面，提供了通过本文公开的方法获得的细胞组合物。
在本发明的一个实施方案中，所述细胞组合物是任选地包含药用载体的药物细胞组合物。
本发明的方法可包括本发明的任何实施方案和/或以任何顺序和/或组合包括本文所述的步骤，从而产生如本文公开的用于产生遗传修饰的T细胞的功能性方法。
除了上述本发明的应用和实施方案以外，下文中还描述了本发明的其他实施方案，但本发明不限于这些实施方案。
实施方案
在本发明的一个优选实施方案中，T细胞在封闭系统中以自动化过程进行遗传修饰，例如通过使用
Figure BDA0003369215670000241
Prodigy(Miltenyi Biotec GmbH)，以表达嵌合抗原受体。
可提供来源于人类(例如患有癌症的人)的包含T细胞的样品。可通过离心步骤洗掉所提供的包含T细胞的样品中的人血清。
CD4+和/或CD8+T细胞可通过磁性分离步骤富集，该磁性分离步骤使用通过葡聚糖与磁性颗粒偶联的抗-CD4和/或抗-CD8抗体或其抗原结合片段。在磁场中从包含T细胞的样品中分离出CD4+和/或CD8+T细胞后，通过添加葡聚糖酶从富集的细胞中去除磁性颗粒，该葡聚糖酶通过葡聚糖链的裂解破坏抗体或其片段与磁性颗粒的结合。
富集的CD4+和/或CD8+T细胞可使用通过接头偶联的对CD3特异性的抗体或其抗原结合片段和对CD28特异性的抗体或其抗原结合片段激活24小时，所述接头包含作为调节剂的葡聚糖。
可将包含编码CAR的核酸的慢病毒载体颗粒加入包含激活的CD4+和/或CD8+T细胞的样品中。可在刺激期间或刺激24小时后进行转导。
将慢病毒颗粒转导入CD4+和/或CD8+T细胞后，通过添加葡聚糖酶洗掉或去除调节剂，该葡聚糖酶通过葡聚糖链的裂解破坏抗体或其片段彼此的结合。通过反复洗涤，含有遗传修饰的T细胞的样品中残留慢病毒载体颗粒减少至少10倍，优选至少100倍。结果，包含遗传修饰的T细胞的纯样品在等于或少于144小时、少于120小时、少于96小时、少于72小时、少于48小时或少于24小时内获得，并且与最初提供的包含T细胞的样品的T细胞数量相比，产生的样品中遗传修饰的T细胞的扩增小于10倍，优选小于5倍。包含遗传修饰的T细胞的样品或组合物可用于所述人，并且所述遗传修饰的T细胞可表达识别所述人的TAA的CAR。
定义
除非另有定义，本文所用的科技术语的含义与本发明所属领域的本领域内技术人员通常理解的含义相同。
本文所用术语“包含(comprising)”或“含有(comprises)”是指对方法或组合物至关重要的组合物、方法及其各自的组分，但也可包含未指明的元素，无论其是否重要。
本文所用术语“调节剂”、“激活剂”和“刺激剂”可以互换使用。
调节剂可选自激动性抗体或其抗原结合片段、细胞因子、重组共刺激分子和小药物抑制剂。所述调节剂是与珠或纳米结构偶联的抗CD3和抗CD28抗体或其片段。调节剂可以是纳米基质，纳米基质包括：a)可移动聚合物链的基质，和b)附接至所述可移动聚合物链的基质的抗CD3和抗CD28抗体或其片段，其中纳米基质的尺寸为1至500nm。抗CD3和抗CD28抗体或其片段可附接至相同的或分离的可移动聚合物链基质。如果抗CD3和抗CD28抗体或其片段附接至单独的可移动聚合物链基质，微调纳米基质刺激T细胞是可能的。纳米基质是可生物降解的。纳米基质可以是胶原、纯化蛋白质、纯化多肽、多糖、糖胺聚糖或细胞外基质组合物。多糖可包括例如纤维素醚、淀粉、阿拉伯胶、琼脂糖、葡聚糖、壳聚糖、透明质酸、果胶、黄原胶、瓜耳胶或藻酸盐。降解酶试剂的选择取决于糖苷键。当大分子涂层是多糖时，将选择具有哺乳动物细胞内不常见的糖苷键的多糖。识别特定糖苷结构的水解酶可用作酶，例如葡聚糖和葡聚糖酶，其在α(l→6)键处裂解；纤维素和纤维素酶，其在β(1→4)键处裂解；直链淀粉和淀粉酶；果胶和果胶酶；几丁质和几丁质酶等。
此外，如例如WO2014/048920A1中所描述，所述小纳米基质的无菌过滤是可能的，这是在符合严格的GMP标准的条件下(即在封闭系统中)T细胞激活的重要特征。
本文所用术语“耗减”指分离所需细胞与不需要的细胞(本文中通常为癌细胞)的负向选择过程，所述细胞通过与固相(例如颗粒、荧光团或半抗原)偶联的抗体或其抗原结合片段被标记。
本文所用术语“颗粒”指固相，例如胶态颗粒、微球、纳米颗粒或珠。用于生产这种颗粒的方法在本领域是众所周知的。颗粒可以是磁性颗粒。在用于本发明之前，颗粒可以处于溶液或悬浮液中，或者可以处于冷冻干燥状态。然后在接触本发明的待处理样品前，冷冻干燥的颗粒在可方便的缓冲液中重构。
本文所用“磁性颗粒”中的术语“磁性”指可通过本领域技术人员熟知的方法制备的所有亚型的磁性颗粒，尤其是铁磁颗粒、超顺磁性颗粒和顺磁性颗粒。“铁磁性”材料对磁场非常敏感且在去除磁场时能够保持磁性。“顺磁性”材料仅具有弱磁化率，当去除磁场时，其弱磁性很快消失。“超顺磁性”材料具有高度的磁性敏感性，即当置于磁场中时，它们会变得具有很强的磁性，但与顺磁性材料一样，会迅速失去磁性。
抗体(或其抗原结合片段)和颗粒之间的连接可以是共价或非共价的。共价键可以是例如连接到聚苯乙烯珠上的羧基，或连接到改性珠上的NH2或SH2基团。非共价连接例如通过生物素-亲和素或与抗荧光团抗体连接的荧光团偶联颗粒。用于将抗体偶联至颗粒、荧光团、半抗原(如生物素)或较大表面(如培养皿)的方法为本领域技术人员所熟知。
对于富集、分离或选择，原则上可以使用任何分选技术。这包括例如亲和层析或本领域已知的任何其他抗体依赖分离技术。本领域已知的任何配体依赖分离技术均可与依赖于细胞物理性质的正向和负向分离技术结合使用。一种特别有效的分选技术是磁性细胞分选。磁性分离细胞的方法可商购的，例如从Invitrogen,Stem cell Technologies,Cellpro,Seattle或Advanced Magnetics,Boston获得。例如，单克隆抗体可直接与磁性聚苯乙烯颗粒(如Dynal M 450或类似磁性颗粒)偶联，并用于例如细胞分离。Dynabeads技术不是基于柱的，而是这些具有附接的细胞的磁珠在样品管中符合液相动力学，并且通过将样品管放置在磁架上分离细胞。然而，在根据本发明从包含T细胞的样品中富集CD4+和/或CD8+T细胞的优选实施方案中，单克隆抗体或其抗原结合片段通过例如多糖与具有有机涂层的胶态超顺磁性微粒结合使用(磁激活细胞分选(MACS)技术(Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，德国))。这些颗粒(纳米珠或微珠)可以直接与单克隆抗体缀合，也可以与抗免疫球蛋白、亲和素或抗半抗原特异性微珠结合使用。MACS技术允许通过将细胞与涂有针对特定表面抗原的抗体的磁性纳米颗粒孵育来分离细胞。这导致表达该抗原的细胞附着在磁性纳米颗粒上。之后，将细胞溶液转移到置于强磁场中的柱上。在该步骤中，附着于纳米颗粒上的细胞(表达抗原)停留在柱上，而其他细胞(不表达抗原)则流动通过。通过这种方法，细胞可通过特定的抗原/标记物进行正向或负向分离。
在正向选择的情况下，在将磁性柱从磁场中移除后，附着于磁性柱上的表达所需抗原的细胞被冲洗至单独的容器中。
在负向选择的情况下，所用抗体针对已知存在于不需要的细胞上的表面抗原。在将细胞/磁性纳米颗粒溶液施加到柱上后，表达这些抗原的细胞结合到柱上，并收集通过的部分，因为其包含所需的细胞。由于这些细胞未被与纳米颗粒偶联的抗体标记，因此它们“未受影响”。
该程序可使用直接磁性标记或间接磁性标记进行。对于直接标记，特定的抗体直接与磁性颗粒偶联。当直接磁性标记不可能或不需要时，间接标记是一种方便的替代方法。针对任何细胞表面标志物的一级抗体、特定单克隆或多克隆抗体、一级抗体的组合可用于该标记策略。一级抗体可以是未缀合的、生物素化的或荧光团缀合的。然后用抗免疫球蛋白微珠、抗生物素微珠或抗荧光团微珠实现磁性标记。
本文所用术语“破坏”，在磁性颗粒的破坏或用于激活的调节剂的语境中，可指去除
通过单独洗涤和/或
通过添加竞争试剂并随后洗涤和/或
通过化学破坏，即通过添加断裂共价键的物质(非蛋白质的，化学化合物)和/或
通过酶促破坏和随后洗涤，和/或
通过输入断裂共价键的能量(物理破坏)。
本文所用的术语“竞争性反应”在破坏的语境下是指包含两种非共价连接的组分的磁性颗粒或用于激活的调节剂，其中一种组分通过对CD3、CD28、CD4和/或CD28特异性的抗体或抗原结合片段与所述细胞结合且包含标记，和与所述标记结合的第二组分，并且其中所述与所述标记的结合可通过加入竞争剂而被溶解。竞争剂可以竞争和/或替换一种组分、所述磁性颗粒、所述调节剂或所述抗体或其抗原结合片段，例如，相比于与对CD3、CD28、CD4和/或CD8特异性的抗体或其抗原结合片段间接偶联的磁性颗粒或调节剂的浓度，由于对各组分的更高的亲和力，或由于竞争剂分子的更高浓度。
本文所用术语“酶促破坏”，在磁性颗粒或调节剂的破坏的语境下，是指通过可生物降解的接头直接或间接连接的对CD3、CD28、CD4或CD8特异性的抗体或其抗原结合片段，并且其中所述可生物降解的接头可通过所述酶的活性被特异性生物降解、消化或裂解，从而将所述磁性颗粒或调节剂分裂成至少两个单独的分子。释放的单个抗体或其抗原结合片段，例如对CD3或CD28特异性的Fab，不会进一步影响与其结合的T细胞的激活。此外，如果所述抗体或其抗原结合片段(例如所述Fab)具有低亲和力和/或高k(off)速率，则所述抗体或其抗原结合片段(例如所述Fab)将从与其结合的细胞中去除。
本文所用术语“化学破坏”，在磁性颗粒或调节剂破坏的语境下，是指通过可化学降解接头直接或间接连接的对CD3、CD28、CD4或CD8特异性的抗体或其抗原结合片段，并且其中所述可化学降解的接头可通过添加在生理条件下破坏共价键的非蛋白、化学物质被特异性降解或裂解，从而将所述磁性颗粒或调节剂分裂成至少两个单独的分子。在生理条件下进行化学破坏的合适反应的示例可以是还原反应，例如用还原剂还原二硫键或用连二亚硫酸盐还原重氮键，或氧化反应，例如用高碘酸盐裂解二醇残基。
释放的单个抗体或其抗原结合片段，例如对CD3或CD28特异性的Fab，不会进一步影响与其结合的T细胞的激活。此外，如果所述抗体或其抗原结合片段(例如所述Fab)具有低亲和力和/或高k(off)速率，则所述抗体或其抗原结合片段(例如所述Fab)将从所结合的细胞中去除。
本文所用术语“物理破坏”，在磁性颗粒或调节剂的破坏的语境下，是指通过物理可破坏的接头直接或间接连接的对CD3、CD28、CD4或CD8特异性的抗体或其抗原结合片段，并且其中所述物理可破坏的接头可通过在生理条件下破坏共价键的能量输入特异性降解或裂解，从而将所述磁性颗粒或调节剂分裂成至少两个独立分子。在生理条件下进行物理破坏的合适反应的示例可以是光反应，例如通过UV或可见光的光敏接头的光裂解，作为示例，通过近UV光(300-365纳米)裂解邻硝基苄基衍生物。释放的单个抗体或其抗原结合片段，例如对CD3或CD28特异性的Fab，不会进一步影响与其结合的T细胞的激活。此外，如果所述抗体或其抗原结合片段(例如所述Fab)具有低亲和力和/或高k(off)速率，则所述抗体或其抗原结合片段(例如所述Fab)将从所结合的细胞中去除。
本文所用术语“标志物”指特定细胞类型特异性表达的细胞抗原。优选地，标志物是细胞表面标志物，从而可进行活细胞的富集、分离和/或检测。标志物可以是正向选择标志物，例如CD4、CD8和/或CD62F，也可以是负向选择标志物(例如表达CD14、CD 16、CD19、CD25、CD56的细胞的耗减)。
本文所用术语“表达”定义为细胞中由其启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
本文所用术语“抗原结合分子”指优选结合细胞的所需靶分子(即抗原)或对其具有特异性的任何分子。术语“抗原结合分子”包括例如抗体或其抗原结合片段。本文所用术语“抗体”指多克隆或单克隆抗体，其可以通过本领域技术人员熟知的方法产生。该抗体可以是任何种类，例如小鼠、大鼠、羊、人。出于治疗目的，如果使用非人类抗原结合片段，这些片段可以通过本领域已知的任何方法进行人源化。抗体也可以是经修饰的抗体(例如低聚体、还原的、氧化的和标记的抗体)。
术语“抗体”包括完整分子和抗原结合片段，例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv和单链抗体。此外，术语“抗原结合片段”包括除抗体或抗体片段以外的任何优先结合细胞所需靶分子的分子。合适的分子包括但不限于结合于所需靶分子、糖类、凝集素或任何其他抗原结合蛋白(例如受体-配体相互作用)的称为适体的寡核苷酸。抗体与颗粒或纳米结构之间的连接(偶联)可以是共价或非共价的。共价键可以是例如连接到聚苯乙烯珠上的羧基，或连接到改性珠上的NH2或SH2基团。非共价连接例如通过生物素-亲和素或与抗荧光团抗体连接的荧光团偶联颗粒。
关于抗原结合分子(例如抗体或其片段)的术语“特异性结合”或“对…特异性的”，指识别并结合样品中特定抗原(例如CD4)但基本上不识别或结合所述样品中其他抗原的抗原结合分子(在抗体或其片段与抗原结合域结合的情况下)。与一个物种的抗原特异性结合的抗体或其片段的抗原结合域也可以与另一个物种的抗原结合。这种跨物种反应性并不违反本文所用的“对…特异性”的定义。特异性结合抗原(例如CD4抗原)的抗体或其片段的抗原结合域也基本上可结合所述抗原的不同变体(等位基因变体、拼接变体、同种型等)。这种交叉反应性并不违反对抗原(例如CD4)特异性的抗原结合域的定义。
术语“遗传修饰的T细胞”或“工程化T细胞”可互换使用，是指包含和/或表达能够修饰细胞或其子代的基因型或表型的外来基因或核酸序列。特别是，该术语是指，可通过本领域熟知的重组方法进行处理细胞，以稳定或短暂地表达多肽或蛋白质，例如这些细胞在自然状态下不表达的CARs。细胞的遗传修饰可包括但不限于利用逆转录病毒载体、慢病毒载体、非整合逆转录病毒或慢病毒载体、转座子、设计的核酸酶(其包含锌指核酸酶)、TALENs或CRISPR/Cas的转染、电穿孔、核转染、转导。
通过本文公开的方法获得的遗传修饰的T细胞可用于后续步骤，例如本领域技术人员已知的研究、诊断、药物或临床应用。
遗传修饰的T细胞也可用作治疗(例如细胞治疗)或疾病预防中的药物组合物。该药物组合物可被移植至动物或人，优选人类患者。药物组合物可用于哺乳动物(特别是人类)疾病的治疗和/或预防，可能包括向哺乳动物施用药物有效量的药物组合物。本公开的药物组合物可以适合待治疗(或预防)疾病的方式施用。虽然合适的剂量可通过临床试验确定，但施用的数量和频率将由患者的状况、患者疾病的类型和严重程度等因素决定。
术语“治疗有效量”指为患者提供治疗益处的量。
通过本发明的方法获得的遗传修饰的T细胞的组合物可单独施用，或与稀释剂和/或其他组分(例如细胞因子或细胞群)作为药物组合物联合给药。简而言之，本发明的药物组合物可包含本发明的遗传修饰的T细胞与一种或多种药学上或生理上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的组合。这类组合物可包含缓冲液，例如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；糖类，例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，例如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，如EDTA或谷胱甘肽；助剂(例如氢氧化铝)；和防腐剂。
本文所用术语“激活”指诱导细胞发生生理变化，以提升靶细胞的功能、增殖和/或分化。
术语“转导”指将遗传物质从病毒剂(例如慢病毒载体颗粒)转移至真核细胞(例如T细胞)。
本文所用的肿瘤相关抗原(TAA)指在肿瘤细胞中产生的抗原物质。肿瘤相关抗原是通过诊断测试识别肿瘤/癌细胞中有用的肿瘤或癌症标志物，并且是用于癌症治疗的潜在候选物。优选地，TAA可在肿瘤/癌细胞的细胞表面上表达。
本文所用术语“调节剂的去除”指从T细胞中调节剂的物理去除和/或灭活调节剂，使其不再影响T细胞的活性。
慢病毒是逆转录病毒科的一个属，其可在人类和其他哺乳动物物种中引起以长潜伏期为特征的慢性和致命疾病。最著名的慢病毒是人类免疫缺陷病毒HIV，其能够有效地感染未分裂细胞，因此慢病毒衍生的逆转录病毒载体是最有效的基因递送方法之一。
为了产生逆转录病毒载体，例如慢病毒载体，通过包装细胞系(例如HEK 293T)的方式反式提供组装载体颗粒所需的gag/pol和env蛋白。这通常通过使用具有一种或多种包含gag/pol和env基因的质粒的包装细胞系的转染实现。
本文所用术语“残留慢病毒载体颗粒的去除”指从T细胞中残留慢病毒载体颗粒的物理去除和/或使残留慢病毒载体颗粒的失活，使其不再对T细胞进行遗传修饰。本文所用术语“残留慢病毒载体颗粒”指包含T细胞的样品中未转导T细胞的部分慢病毒载体颗粒。术语“该方法在等于或少于144小时、少于120小时、少于96小时、少于72小时、少于48小时或少于24小时的时间内进行”指本文公开的方法从该过程开始(即，提供包含T细胞的样品)至随后可准备(重新)向有此需要的患者输注包含遗传修饰的T细胞的样品的持续时间不超过相应时间范围。
在血液中，血清是一种既不是血细胞(血清不含白血球或红血球)也不是凝血因子的成分；它是一种不含纤维蛋白原的血浆。血清包含所有不用于血液凝结的蛋白质以及所有电解质、抗体、抗原、激素和任何外源性物质。人血清是来自人类的血清。
本文所用术语“受试者”指动物。优选地，受试者为哺乳动物，例如小鼠、大鼠、牛、猪、山羊、鸡、犬、猴或人。更优选地，个体是人类。受试者可能是患有疾病(例如癌症)的受试者(患者)，也可能是健康受试者。
本文所用术语“封闭系统”指在进行培养过程(例如通过例如转导引入新材料)和进行细胞培养步骤(例如细胞的增殖、分化、激活和/或分离)时，降低细胞培养污染风险的任何封闭系统。该系统允许在GMP或GMP样条件(“无菌”)下操作，从而产生临床适用的细胞组合物。在此示例性地将CliniMACS
Figure BDA0003369215670000333
(Miltenyi Biotec GmbH，德国)用作封闭系统。W02009/072003中公开该系统。但并不旨在将本发明方法的使用限制于
Figure BDA0003369215670000334
Prodigy。
本发明的方法可以在封闭系统(封闭细胞样品处理系统)中进行，该封闭系统包括离心室，该离心室包括通过圆筒、泵、阀门、磁性细胞分离柱和管组连接的底板和盖板。血液样本或包含T细胞的其他来源可通过无菌对接或无菌焊接被转移至管组和从管组转移。W02009/072003公开了一种合适的系统。
封闭系统可包括多个管组(TS)，其中细胞通过无菌对接或无菌焊接在TS间转移。
该方法的不同模块可通过无菌方式将一个管组中产生的一个模块的产品(细胞)转移至另一个管组，以在不同功能封闭的TS中进行。例如，T细胞可由Miltenyi BiotecGmbH在第一管组(TS)TS100中进行磁性富集，并且含有富集的T细胞的阳性部分通过Miltenyi Biotec GmbH从TS 100上焊接下来并焊接到第二管组TS 730上，用于进一步激活、修饰、培养和洗涤。
这里使用的术语“自动化方法”或“自动化处理”指通过使用设备和/或计算机和计算机软件实现自动化的任何过程。自动化的方法(流程)需要较少的人工干预和较少的人工时间。在某些情况下，如果本方法的至少一个步骤在没有任何人工支持或干预的情况下执行，则本发明的方法是自动化的。优选地，如果除了将新的试剂连接至系统之外，本文公开方法的所有步骤均在没有人工支持或干预的情况下进行，则本发明的方法是自动化的。优选地，自动化流程在封闭系统(例如本文公开的CliniMACS
Figure BDA0003369215670000341
)上实施。
该封闭系统可包括：a)样品处理单元，其包括偶联至具有至少一个样品室的(或离心室)的输入端口和输出端口，其中样品处理单元被配置为向样品或向旋转容器提供第一处理步骤，以便向沉积在室中的样品施加离心力，并分离沉积样品的至少第一组分和第二组分；和b)偶联至样品处理单元的输出端口的样品分离单元，该样品分离单元包括分离柱支架、泵和多个阀，该多个阀被配置为通过流体回路和位于支架中的分离柱至少部分控制流体流动，其中该分离柱被配置为分离流过该柱的样品的标记组分和未标记组分。
所述旋转容器也可用作温度控制的细胞培养和培养室(CentriCult Unit＝CCU)。该室可能充满由附连的气体混合装置提供的确定的气体混合(例如使用压缩空气/N2/二氧化碳或N2/CO2/O2)。
所有试剂均可在流程启动前连接至封闭系统。这包括用于在封闭系统内洗涤、转移、悬浮、培养、收获细胞或免疫磁性细胞分选的所有缓冲液、溶液、培养基和补充剂、磁珠。或者，这类试剂可在流程中的任何时间通过无菌方式焊接或连接。
包含T细胞的细胞样品可提供在转移袋或其他合适的容器中，该容器可通过无菌方式连接至封闭系统。
术语“提供的包含T细胞的(细胞)样品”指提供细胞样品，优选血液系统来源的人细胞样品。通常，细胞样品可由来自供体或患者的血液细胞组成。这种血液制品可以是全血、血沉棕黄层、白细胞单采、PBMCs或任何血液制品临床取样的形式。它可能新鲜或冷冻来源。
术语“洗涤”指例如更换保存细胞的培养基或缓冲液。上层清液的更换可以是部分更换(例如，去除50％的培养基，加入50％的新培养基)，其通常用于稀释或给料目的，或全部更换。可将多个清洗步骤组合，以便对保存细胞的原始培养基进行更完全的更换。洗涤步骤通常涉及通过离心力并去除上层清液将细胞沉淀。在本发明的方法中，可通过以例如300xg旋转室使细胞沉淀，并且在室旋转过程中去除上层清液。可在旋转过程中或稳定状态下添加培养基。
通常，洗涤或洗涤步骤可进行一次，或通过一系列培养基/缓冲液交换(至少两次交换，例如2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次或10次交换)，从而去除拟从T细胞中去除的物质，例如人血清和/或其组分、磁性颗粒或残留的慢病毒载体颗粒。交换可通过离心、沉淀、附着或过滤和随后的培养基/缓冲液交换进行的细胞和培养基/缓冲液的分离进行。
通常，CAR可包含含有抗原结合域的胞外结构域(细胞外部分)、跨膜结构域和胞质信号区域(细胞内信号区域)。胞外结构域可通过接头或间隔区与跨膜结构域连接。胞外结构域也可包含信号肽。在本发明的一些实施方案中，CAR的抗原结合域与偶联于多肽的标记或半抗原(“半抗原化的”或“标记的”多肽)结合，其中所述多肽可结合至疾病相关抗原，例如可在癌细胞表面表达的肿瘤相关抗原(TAA)。
如US9233125B2所描述，这类CAR也可被命名为“抗标记”CAR或“适配子CAR”或“通用CAR”。
半抗原或标记可直接或间接与多肽(标记的多肽)偶联，其中多肽可结合至在目标(细胞)表面表达的所述疾病相关抗原。
“信号肽”指肽序列，其指导蛋白质在细胞内转运和定位至例如特定的细胞器(例如内质网)和/或细胞表面。
通常，“抗原结合域”指CAR中与抗原(例如肿瘤相关抗原(TAA)或肿瘤特异性抗原(TSA))特异性结合的区域。本发明的CARs可包含一个或多个抗原结合域(例如串联CAR)。通常，CAR上的靶向区域位于细胞外。抗原结合域可包含抗体或其抗原结合片段。抗原结合域可包含例如全长重链、Fab片段、单链Fv(scFv)片段、二价单链抗体或双抗体。任何与特定抗原(例如来自天然存在受体的亲和体或配体结合域)特异性结合的分子均可用作抗原结合域。抗原结合域通常为scFv。通常在单链抗体中，免疫球蛋白重链和轻链的可变区通过柔性接头融合形成scFv。该接头可以是例如“(G4/S)3-接头”。
在某些情况下，将源自同一物种的抗原结合域用于CAR是有益的。例如，当计划将其用于人类治疗时，CAR的抗原结合域包含人类或人源化抗体或其抗原结合片段可能是有益的。人类或人源化抗体或其抗原结合片段可通过本领域众所周知的多种方法制备。
本文所用“间隔区”或“铰链”指位于抗原结合域和跨膜结构域之间的亲水区域。本发明的CARs可包含细胞外间隔区，但也可能省略该间隔区。间隔区可包括例如抗体或其片段的Fc片段、抗体或其片段的铰链区域、抗体的CH2或CH3区域、辅助蛋白、人工间隔区序列或其组合。一个著名的间隔区的示例是CD8alpha铰链。
CAR的跨膜结构域可以是源自该结构域的任何所需天然或合成来源。当来源是天然的时，该结构域可来源于任何膜结合或跨膜蛋白。跨膜结构域可源自例如CD8α或CD28。当关键信号和抗原识别模块(区域)位于两个(甚至更多)多肽上时，CAR可能具有两个(或更多)跨膜结构域。由于CAR的每个多肽中的小分子依赖的异二聚化结构域，分裂关键信号和抗原识别模块能够实现对CAR细胞表达的小分子依赖、可滴定和可逆控制(例如WO2014127261A1)。
CAR的胞质信号域(或胞内信号域)负责激活表达CAR的免疫细胞中的至少一种正常效应子功能。“效应子功能”指细胞的特殊功能，例如T细胞中，效应子功能可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。细胞内信号域指的是蛋白质的一部分，它能转换效应子功能信号并指导表达CAR的细胞执行特定功能。细胞内信号域可包括给定蛋白质的细胞内信号域的任何完整的、突变的或截短的部分，其足以转导启动或阻断免疫细胞效应子功能的信号。
用于CARs细胞内信号域的著名示例包括T细胞受体(TCR)的胞质信号序列和在抗原受体衔接后启动信号转导的共受体。
通常，T细胞激活可由两类不同的胞质信号序列介导，第一类通过TCR(初级胞质信号序列，初级胞质信号域)启动抗原依赖性初级激活，第二类以不依赖抗原的方式提供二级或共刺激信号(二级胞质信号序列、共刺激信号域)发挥作用。因此，CAR的胞内信号域可包含一个或多个初级胞质信号域和/或一个或多个二级胞质信号域。
以刺激方式起作用的初级胞质信号域可包含ITAMs(基于免疫受体酪氨酸的激活基序)。
常用于CAR的包含的初级胞质信号域的ITAM示例源自TCRζ(CD3ζ)、FcRgamma、FcRbeta、CD3gamma、CD3delta、CD3epsilon、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。最著名的是衍生自CD3ζ的序列。
CAR的胞质结构域可被设计成单独包含CD3ζ自身或与任何其他所需的胞质结构域结合。CAR的胞质区域可包含CD3ζ链部分和共刺激信号区(域)。共刺激信号区指包含共刺激分子的胞内区域的CAR的一部分。共刺激分子是淋巴细胞对抗原作出有效反应所需的细胞表面分子，抗原受体或其配体除外。共刺激分子的示例为CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(FFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3。
CAR的胞质信号部分中的胞质信号序列可以在接头存在或不存在的情况下以随机或特定顺序相互连接。优选长度在2至10个氨基酸之间的寡核苷酸-或多肽接头可形成连接。著名的接头是甘氨酸-丝氨酸双联体。
例如，胞质结构域可包括CD3ζ的信号域和CD28的信号域。在另一个示例子中，胞质结构域可包括CD3ζ的信号域和CD137的信号域。在另一个示例中，胞质结构域可包括CD3ζ的信号域、CD28的信号域和CD137的信号域。
如上所述，CAR的细胞外部分或跨膜结构或胞质结构域也可包含异二聚化结构域，目的是分裂CAR的关键信号和抗原识别模块。
CAR可被进一步修饰以在编码CAR的核酸水平上包含一种或多种操作元件，从而通过自杀开关的功效消除表达CAR的免疫细胞。自杀开关可包括例如细胞凋亡诱导信号级联或诱导细胞死亡的药物。在一个实施方案中，表达和编码CAR的核酸可被进一步修饰以表达酶，例如胸苷激酶(TK)或胞嘧啶脱氨酶(CD)。
在一些实施方案中，内域可包含初级胞质信号域或共刺激区域，但不同时包含两者。在这些实施方案中，如果其他包含缺失区域的CAR也与其各自抗原结合时，包含公开的CAR的免疫效应细胞仅被激活。
在本发明的一些实施方案中，CAR可以是“SUPRA”(分裂的、通用的和可编程的)CAR，其中“zipCAR”域可以连接细胞内共刺激域和细胞外亮氨酸拉链(WO2017/091546)。该拉链可以与融合的互补拉链靶向于例如单链抗体区域，以使SUPRA CAR T细胞肿瘤具有特异性。该方法尤其适用于为各种肿瘤生成通用CAR T细胞；适配子分子可针对肿瘤特异性设计，并可为改变特异性过继后转移提供选择，这对于选择压力和抗原逃避的情况是关键的。
可在通过本文公开的方法获得的遗传修饰的T细胞中表达的CARs可被设计成以任何顺序和/或组合包含本文所描述的上述区域的任何部分或局部，从而产生功能性CAR，即介导表达本文所述表达CAR的免疫效应细胞的免疫效应子反应。
实施例
实施例1：短时间内遗传工程化T细胞的人工生产。
提供分离血沉棕黄层和PBMC的含有T细胞的样品。以1:2或1:3的比例将血液制品于
Figure BDA0003369215670000391
缓冲液中稀释，并将30mL血液制品分层置于15mL Pancoll human的垫上。室温下，450xg中等制动下离心试管30分钟。离心后，小心吸出界面处的细胞，并用50mL
Figure BDA0003369215670000392
缓冲液洗涤三次，以去除血小板和残留的Pancoll。根据制造商的说明书，使用CD4和CD8特异性微珠(Miltenyi Biotec)分离T细胞。将T细胞接种到24孔平板中，每孔含2mL T细胞悬液，浓度为1x106细胞/mL，使用含有人AB血清(10％(v/v)GemCell)、IL-7(10ng/mL)和IL-15(5ng/mL)的TexMACS培养基。为激活T细胞，将T细胞TransActTM添加至1:100的最终稀释度。在37℃，5-10％CO2的培养箱中培养24小时后，以MOI 2添加编码治疗性CARs的慢病毒载体。转导后24小时，在37℃下加入1:100的酶葡聚糖酶1h，该酶特异性降解T细胞TransActTM和微珠中存在的可生物降解的接头，并且从T细胞中释放两种试剂。通过以450xg离心10分钟，非细胞组分(例如残留的慢病毒载体、T细胞TransActTM和微珠的的降解组分)与转导的T细胞分离。移除上层清液，并添加新鲜培养基至相同体积。重复3次洗涤程序以减少杂质。通过流式细胞术分析转导的T细胞以确定转导效率，并进行功能性分析，例如与表达CAR抗原的肿瘤靶细胞共培养的杀灭分析。
实施例2：在短期内遗传修饰的T细胞的自动产生
源自供体的白细胞单采的袋中提供T细胞样品。该袋通过无菌焊接连接至安装在
Figure BDA0003369215670000393
Prodigy设备上的管组。CliniMACS缓冲液、CliniMACS CD4和CD8试剂(Miltenyi Biotec GmbH)以及激活剂也连接至同一管组。在全自动流程中，启动富集步骤，总共需要30分钟至2小时。具体而言，管组自动加满缓冲液，然后将白细胞单采产品转移至管组的室，并用CliniMACS缓冲液清洗3次，以去除血清和血小板。使用CliniMACS CD4和CD8试剂磁性标记细胞，并将其捕获在置于磁场中的柱上。捕获在柱上的标记细胞被冲洗几次，并被洗脱入靶细胞级分袋。通过无菌焊接连接将部分富集细胞转移至CentriCultTM室，并在添加IL-7/IL-15(均为Miltenyi Biotec GmbH)的MACS GMP TexMACS培养基中配制。自动化流程中的激活步骤开始，激活剂
Figure BDA0003369215670000401
GMP TransAct被自动添加到培养物中。富集后长达24小时，将含有慢病毒载体的袋无菌焊接到管组上，并将慢病毒载体悬液转移到含有激活T细胞的CentriCultTM室中。24小时至48小时，通过添加葡聚糖酶降解激活剂和磁性颗粒，该葡聚糖酶对存在于激活剂和磁性颗粒中的可生物降解的接头具有特异性的。1小时后，通过洗涤去除非细胞组分，例如残留的慢病毒载体、降解酶及激活剂和CliniMACS CD4和CD8试剂的降解组分。遗传修饰的T细胞被自动配制在适合人类输注的溶液中。
实施例3：具有额外清除步骤的CAR T细胞的施用
CAR T细胞疗法被提供给例如患有复发或难治性CD 19阳性B细胞恶性肿瘤的儿童和成年患者。制备基因工程化T细胞的临床方法基于实施例2，其中将患者细胞(源自BM、血液或白细胞单采)连接至CliniMACS
Figure BDA0003369215670000402
装置并快速处理(即优选少于24小时)并再次输注患者体内。可以调整该过程的持续时间以匹配患者所需的预备方案(例如，淋巴耗减的化学治疗)的时间，满足医疗需求和临床适用性(例如，临床方案、患者健康状况、医生的反应性、住院时间)。所述发明的优点是能够实现快速治疗和患者护理，以及能够实现药物产品的“床侧”制备。本发明描述了一种用于这种快速细胞制备的方案，从而在输注前去除潜在有害物质，例如病毒载体和激活剂。例如，污染药品的残留激活剂在输注时可能是有害的，因为它们可导致体内T细胞的激活。这可导致促炎细胞因子的快速释放，从而引发严重的细胞因子释放综合征、发热、低血压、器官衰竭和甚至死亡。
此外，可溶形式和/或细胞结合形式的污染药物产品的残留慢病毒载体在输注时可能是有害的，因为它们可能引起不必要的免疫反应，例如补体激活、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性、诱导针对慢病毒载体递送的抗原的过继性免疫反应和/或体内非靶细胞的转导。非靶细胞的转导和随后的转基因表达可诱导不希望的副作用，例如不必要的免疫反应的诱导、致瘤性、改变的存活、增殖、生理状态和自然功能。
实施例4：建立在3天内T细胞遗传工程化的方法
来自2名健康供体的未处理T细胞用Pan T细胞分离试剂盒，人(Miltenyi Biotec)富集，并在第0天用T细胞TransActTM(Miltenyi Biotec)进行多克隆刺激，T细胞TransActTM(Miltenyi Biotec)是一种调节剂，其包含直接或间接与可生物降解的接头偶联的对CD3特异性的抗体或其抗原结合片段和对CD28特异性的抗体或其抗原结合片段。同一天或第一天，在24孔中使用MOI为2的编码LV的VSV-G假型GFP将刺激的T细胞转导，，le6细胞/ml，使用包含IL-7/IL-15的TexMACS培养基。在第1天、第2天或第3天，加入特异性消化可生物降解接头的葡聚糖酶，并在第10天通过流式细胞术评估转导效率。在不添加葡聚糖酶的情况下，在第0天刺激并在第1天转导的T细胞作为遗传工程化T细胞的常规方案的对照。如图9所描绘，在第0天转导并与对可生物降解的接头特异性的酶一起孵育的T细胞表现出最低的转导效率水平，表明T细胞刺激不足。分析通过在第2天或第3天晚些时候添加刺激时间较长的T细胞证实了这一点，并且与在第0天用酶孵育的T细胞相比，检测到更高的转导效率水平。对于在第1天转导并在第2天或第3天与葡聚糖酶一起孵育的刺激T细胞，观察到接近常规方案的较高转导效率。
实施例5：用于3天内遗传T细胞工程化的
Figure BDA0003369215670000421
Prodigy系统中的调节 剂的去除并T细胞激活水平分析
在
Figure BDA0003369215670000422
Prodigy系统中自动处理健康供体的多达le9CD4/CD8细胞的白细胞单采样品，以在3天内产生CAR T细胞。第0天，通过焊接将包含白细胞单采样品的袋无菌连接至CliniMACS
Figure BDA0003369215670000423
Tubing Set 520。自动洗涤并用CD4和CD8CliniMACS试剂标记细胞以富集T细胞。将含IL-7/IL-15的培养基中的4e8 T细胞转移至离心和培养室，并在200ml培养体积中用调节剂
Figure BDA0003369215670000424
GMP T细胞TransActTM(Miltenyi Biotec)多克隆刺激。第1天，使用MOI为3的VSV-G假型慢病毒载体遗传修饰分离和激活的T细胞，以诱导CD20/CD19特异性串联CAR的表达。将包含10ml慢病毒载体的袋无菌连接至管组，并自动转移至包含T细胞的室中。在第2天，将10ml含有对可生物降解的接头具有特异性的酶的溶液无菌连接至管组并自动添加至含有T细胞的室中，以特异性降解接头，从而释放出对CD3和CD28特异性的抗体或片段并抑制调节剂的活性。作为对照，在相同的条件和相同的供体材料下进行了
Figure BDA0003369215670000425
Prodigy系统的运行，但不添加对可生物降解的接头具有特异性的酶。多次洗涤后，获得适合治疗应用的细胞产品。对通过使用可生物降解的接头特异性的抗体染色的配制的细胞，通过流式细胞术在
Figure BDA0003369215670000426
Prodigy系统中对T细胞工程化运行的可生物降解接头的存在进行评估。如图10A和图10B所描绘，在
Figure BDA0003369215670000427
Prodigy系统中的可生物降解的接头被有效去除，因为与未添加酶的
Figure BDA0003369215670000428
Prodigy运行相比，仅检测到一小部分接头阳性细胞。此外，当添加酶时，所有活细胞的可生物降解的接头的平均强度水平(MFI)处于背景水平(参见图10B)。相反，在不添加酶的情况下，
Figure BDA0003369215670000429
Prodigy运行存在高平均强度水平(MFI)。
在CD25和CD69染色时通过流式细胞术评估去除调节剂对刺激的影响，因为CD25和CD69均被描述为可靠的T细胞激活标志物(CD25：克隆REA570和CD69：REA824(均为MiltenyiBiotec)：CD69是早于CD25的激活标志物)。从来自同一供体的小规模培养物中获得的非刺激T细胞作为对照，并分析从经酶处理或不经酶处理的
Figure BDA0003369215670000431
Prodigy系统中收获的T细胞。相比于未受刺激的对照细胞，在两种T细胞工程化条件下检测到两种激活标志物的平均强度水平均显著提高(参见图11)。这证实了直到第2天的刺激已经足以诱导两种激活标志物的上调。这也表明可在第2天去除调节剂且不会影响刺激。
实施例6：评估用于3天内T细胞遗传工程化的
Figure BDA0003369215670000432
Prodigy系统中受 刺激T细胞的扩增潜力。
在第2天添加葡聚糖酶的情况下，如实施例5所述使用受刺激的T细胞进行多次制备运行，但起始T细胞数量在1e8至4e8范围内变化。将第0天的输入T细胞数与第3天获得的输出T细胞数进行比较。第3天未检测到T细胞的扩增，表明T细胞被充分刺激，但增殖还未开始(另见图12)。因此，用于在3天内对T细胞进行的遗传修饰的制备方案太短，无法支持T细胞的体外增殖。数据还表明，通过增加起始细胞数量，可收获的CAR T细胞的产量得到有效提高。
实施例7：评估小规模和
Figure BDA0003369215670000433
Prodigy系统中的CAR表达动力学
当采用短制备工艺时，CAR表达动力学对CAR T细胞疗法的成功尤其重要。因无法识别肿瘤抗原，输注的表达治疗性CAR分子的CAR T细胞不能充分保持非功能。在此期间，患者体内的肿瘤进展可能会持续，使得CAR T细胞在更高肿瘤负荷中更具挑战性。迄今为止，输注CAR T细胞后最普遍的不良反应是免疫激活的发作，称为细胞因子释放综合征(CRS)。这是一种全身性炎性反应，输注后不久由输注的CAR T细胞释放的细胞因子引起，识别表达CAR抗原的肿瘤细胞的潜在高负荷。短期内制备CAR T细胞至少可以部分降低这种毒性，因为并非所有CAR T细胞都在这一早期时间点以高CAR表达水平表达CAR。
在小规模研究中，用T细胞TransActTM(Miltenyi Biotec)多克隆刺激来自2名健康供体的CD4/CD8富集的T细胞。第1天，用编码LV的CAR以MOI为9在24个孔中以1e6细胞/ml转导刺激的T细胞，并通过流式细胞术用包含直接或间接偶联至PE(例如CD19CAR抗体，抗人，130-115-965,Miltenyi Biotec)的CAR抗原肽的CAR检测试剂测定CAR表达的动力学直至第13天，作为诱导细胞的比率(即转导效率)。如图13所描绘，转导后2天，16％的T细胞为CAR阳性，但尚未检测到表达CAR的明显群体。在第5天，转导效率水平达到具有明显的CAR表达群体的18-22％的平稳水平。
对于
Figure BDA0003369215670000441
Prodigy系统的大规模研究，第0天，在100ml含IL-7/IL-15的培养基中，在培养室中用
Figure BDA0003369215670000442
GMP T Cell TransActTM(Miltenyi Biotec)多克隆刺激2e8 CD4、CD8富集的T细胞。第1天，通过将含LV的袋无菌连接至管组，用MOI为62.5的编码VSV-G假型CD19 CAR的慢病毒载体遗传修饰分离且受刺激的T细胞。
在第2天，将10ml含有对调节剂的可生物降解的接头具有特异性的葡聚糖酶的溶液无菌连接并自动添加至含有T细胞的室中。在第3天，细胞悬液样品经包含直接或间接偶联至PE(例如CD19 CAR抗体，抗人，130-115-965，Miltenyi Biotec)的CAR抗原肽的CAR检测试剂染色后，通过流式细胞术进行分析。如图14所描绘，转导后2天，19％的T细胞为CAR阳性。
Figure BDA0003369215670000443
Prodigy的培养过程被延长以能够在晚些时间点进行分析。转导效率在第10天提升至75％，表明转导后2天CAR仍未充分表达。
实施例8：优化
Figure BDA0003369215670000444
Prodigy系统中CAR T细胞的制备参数
CAR T细胞的制备过程是一个依赖于多个参数且供体变异程度高的复杂过程。优化基因转移效率和T细胞培养提供了减少所需慢病毒载体数量和获得更多(CAR)T细胞的可能性。在两次单独的T细胞工程化运行中，第0天，在
Figure BDA0003369215670000451
Prodigy系统的含IL-2的培养基中，用
Figure BDA0003369215670000452
GMP T细胞TransActTM(Miltenyi Biotec)多克隆刺激1e8或4e8CD4、CD8富集的T细胞。第1天，针对1e8T细胞(参见图15：条件I)和平等地相同体积的4e8 T细胞用2.5ml编码VSV-G假型CD20/CD19串联CAR的慢病毒载体对分离且受刺激的T细胞遗传修饰。就4E8 CAR T细胞制备运行而言，通过增加体积和直接在增加慢病毒载体量后实施早期振荡步骤(参见图15：条件II)，对工艺活性基质进行了额外修饰，以实现更高细胞密度的培养。在第2天，通过无菌连接和自动添加至培养室将相同体积的葡聚糖酶应用于两次T细胞制备运行。第3天，多次洗涤制备的T细胞，收获并通过细胞计数确定T细胞总数。在培养箱的24个孔中，将两次CAR T细胞制备运行中洗涤并收获的细胞样品再培养8天，以便能够在晚些时间点用CAR检测试剂可靠地评估转导效率，所述CAR检测试剂包含直接或间接与PE(例如CD19 CAR抗体，抗人，130-115-965，Miltenyi Biotec)偶联的CAR抗原肽。如图15A所描绘，条件II的转导效率为32％，而条件I的转导效率仅为20％，尽管条件I采用了更高的每细胞LV剂量(MOI)。这表明条件II的参数有利于CAR T细胞的更高频率，强调了优化CAR T细胞制备方案的潜力。对于条件II，不仅测定了更高的转导效率，而且转导了4e8T细胞。与条件I相比，条件II中CAR转导T细胞总数增加了近7倍。
实施例9：3天内产生的CAR T细胞的体外功能
与表达CAR抗原的肿瘤细胞共同培养后，通常在体外评估CAR T细胞的功能。短期内且与CAR抗原接触后，CAR T细胞释放炎性细胞因子，如γ-干扰素(IFN-g)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和IF-2。此外，释放颗粒酶B和穿孔素B并减少活的肿瘤细胞数量。进行这些功能性分析是为了表征3天内生产的CAR T细胞的功能性。来自2名健康供体的未处理T细胞用Pan T细胞分离试剂盒，人(Miltenyi Biotec)富集，并在第0天用T细胞TransActTM(Miltenyi Biotec)进行多克隆刺激，T细胞TransActTM(Miltenyi Biotec)是一种包含直接或间接与可生物降解的接头偶联的对CD3特异性的抗体或其抗原结合片段和对CD28特异性的抗体或其抗原结合片段的调节剂。在第1天，在24孔中用编码LV的VSV-G假型CD20 CAR转导刺激的T细胞至，MOI为10，1e6细胞/ml，使用含有IL-7/IL-5的TexMACS培养基。在第2天加入葡聚糖酶，并在第3天洗涤并收获转导的T细胞，以建立不同效应-靶比率(E:T)下的共培养。通过使用CAR特异性检测试剂的流式细胞术测得第3天的转导效率为70％。将50000、17000、6000或2000个总T细胞添加到40000个表达CD20的Raji细胞中，一式三份，置于含有RPMI/10％FCS/F-谷氨酰胺培养基的96孔平板中。表达GFP的转基因Raji细胞(Raji-GFP)用于通过流式细胞术识别和定量共培养物中的肿瘤细胞，以确定所制备的CAR T细胞的细胞毒性活性。作为对照，与Raji-GFP细胞的共培养被一式三份平行地用未刺激、未转导的T细胞建立。此外，肿瘤细胞与刺激但未转导的T细胞共培养。这种方式潜在非特异性的、细胞毒性活性易于检测。共培养24小时后，从每个孔中取出100μl的上清液，使用MACSPlex细胞因子试剂盒分析(Miltenyi Biotec)通过流式细胞术评估细胞因子表达水平。对于在3天内产生的CD20 CAR转导T细胞，IFN-g、GM-CSF和IL-2水平被检测为高水平，甚至超出E:T依赖方式的定量水平(见图16)。相反，未刺激的T细胞和刺激但未转导的T细胞均未检测到细胞因子。这证实了在3天内制备的CAR转导T细胞的特异性抗肿瘤反应。
共培养的T细胞和Raji-GFP细胞再培养2天，此时通过流式细胞术分析50％的细胞，以量化剩余肿瘤细胞的数量，从而量化CAR T细胞的效力(第1轮；左侧)。向剩余的50％共培养物中加入另外20,000个Raji-GFP肿瘤细胞，以评估当更多的肿瘤细胞呈现CAR T细胞的效力，类似于CAR T细胞挑战的条件。另外72小时后，进行流式细胞术以量化第二轮共培养的剩余肿瘤细胞的数量(第2轮：右侧)。对于1.25:1的高E:T比率，在第一轮和第二轮共培养中几乎100％的Raji细胞被杀灭(见图17)。相比之下，在第一次和第二次共培养中，未转导对照组中仅检测到50％和40％的靶细胞。对于0.425:1的E:T比率，可检测到与1.25:1类似的功能模式，但总体水平较低。在第一轮和第二轮共培养中，60％的肿瘤细胞在CAR转导T细胞的存在下被裂解。相比之下，未转导的对照组中，40％的肿瘤细胞在第一轮中被裂解，而第二轮中未检测到杀灭。对于0.15:1的E:T比率，T细胞的频率太低无法诱导针对Raji-GFP肿瘤细胞的细胞毒性活性。综上所述，3天内产生的CAR T细胞的功能性通过体外试验得到证实，该试验显示CAR转导T细胞的细胞因子释放和特异性杀灭。
实施例10：3天内产生的CAR T细胞的体内功能
在6-8周大的NOD scid gamma(NSG)(NOD.Cg-PrkdcscidI12rgtmlWjl/SzJ)小鼠中证实了3天内产生的CAR转导T细胞的体内功能。所有实验均按照“欧洲议会和理事会2010年9月22日关于保护用于科学目的的动物的第2010/63/EU号指令”和德国动物保护法的规定进行。
简而言之，在
Figure BDA0003369215670000471
Prodigy系统中自动处理健康捐献者的白细胞单采样品，以在3天内产生CAR T细胞(见图18顶图)。第0天，通过焊接将包含白细胞单采样品的袋无菌连接至CliniMACS
Figure BDA0003369215670000472
Tubing Set 520。自动洗涤并用CD4和CD8CliniMACS试剂标记细胞以富集T细胞。将2e8 T细胞在含IL-7/IL-15的培养基中转移至培养室，并在200ml培养体积中用
Figure BDA0003369215670000473
GMP T细胞TransAct(Miltenyi Biotec)进行多克隆刺激。第1天，用VSV-G假型慢病毒载体遗传修饰分离和激活的T细胞，以诱导CD22/CD19串联CAR的表达。将包含10ml慢病毒载体的袋无菌连接至管组，并自动转移至包含T细胞的室。在第2天，将10ml含有葡聚糖酶的溶液无菌连接至管组，并自动添加至含有T细胞的室，以特异性降解接头，从而释放出对CD3和CD28特异性的抗体或片段并抑制调节剂的活性。洗涤多次后，通过流式细胞术分析细胞产物以确定每一步的转导效率、存活力和细胞组成(见图19)。通过对CD45h、CD3、CD4、CD8、CD16/CD56、7-AAD、CD19、CD14染色确定细胞组成。配制后，检测到67％的CD4 T细胞、18％的CD8 T细胞和7％的NKT细胞。NK细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、B细胞或单核细胞的频率处于最低检测水平。使用CAR检测试剂通过流式细胞术测定转导效率，该CAR检测试剂包含直接或间接偶联至PE的CAR抗原肽(例如CD19 CAR抗体，抗人，130-115-965，Miltenyi Biotec)。收获当天的转导效率为21％。当达到稳定的CAR表达水平时，小规模扩大培养另外8天后分析，其上升至73％。在收获遗传工程化T细胞前4天，通过静脉接种5e5表达Firefly荧光素酶的Raji细胞建立了Raji肿瘤(见图17)。在收获日向每只小鼠注射CAR转导组的3e6或6e6总T细胞(见图18底图)，每组7只小鼠。另外两组作为阴性对照：一组接受5e5肿瘤细胞但不接受T细胞(n＝7；仅肿瘤)且一组接受来自小规模平行培养的同一供体的5e5肿瘤细胞和3e6未转导的T细胞(n＝7)。使用体内成像系统(IVISFumina III)频繁监测肿瘤生长和抗肿瘤反应。为此，腹腔注射100μlXenoFight RedijectD-Fuciferin Ultra，随后使用异氟醚XGI-8麻醉系统麻醉小鼠。在注射底物后六分钟测量。
显示了接受3e6未转导T细胞和3e6转导T细胞的组的所有小鼠(参见图20)。未接受T细胞的组(即仅肿瘤)显示了7只小鼠中的3只代表性小鼠。所有接受未转导T细胞或未接受T细胞的小鼠的肿瘤负荷迅速增加。两个对照组中肿瘤负荷随时间的升高是相当的。在达到临界肿瘤负荷水平之前，T细胞注射后第14天必须处死两对照组小鼠。相反，与对照组相比，接受3天内制备的CAR转导T细胞的组中的小鼠在T细胞注射后3天和7天的早期时间点以剂量依赖性方式表现出减速的增加。CAR转导T细胞组的肿瘤负荷水平在T细胞注射后第7天达到峰值。正如通过将所有小鼠的肿瘤负荷稳定且一致地降低至实验开始时最初测量的水平所检测到的，肿瘤进展完全逆转。显示了接受3e6 CAR转导T细胞和相同剂量未转导的T细胞的组中所有小鼠的代表性体内成像数据。仅肿瘤组显示了代表性小鼠。
肿瘤负荷被描绘为图21中所有组的平均值和SEM，包括每组小鼠(n＝7)接受最高剂量的6E6 CAR转导T细胞的组。正如预期，6e6组的抗肿瘤反应最快，但实验结束时的肿瘤负荷与3e6 CAR T细胞组相当。该数据证实3天内产生且无任何扩增的CAR T细胞介导有效的抗肿瘤反应。通过流式细胞术数据对脾脏、骨髓和血液中人肿瘤细胞和人T细胞亚群进行定量，证实了该结果。在第14天，“仅肿瘤”和“3E6未转导T细胞”对照组中随机选择3只小鼠处死，通过对CD45h、CD4、CD8、CD20、CD22、7-AAD、CD 19CAR检测(均为Miltenyi Biotec)染色量化这些器官中人细胞、Raji细胞和T细胞亚群的丰度。当随机选择7只小鼠中的3只并在第18天处死时，对CAR转导T细胞组中的小鼠进行类似分析。正如预期，仅肿瘤组未发现T细胞(见图22)。对于非转导群组，仅检测到最高20％的T细胞。相比之下，在包含输注CAR转导T细胞的小鼠的群组中，人类T细胞的频率最高(高达75％)。因此，相比于未转导T细胞的群组，在包含转导T细胞的群组中T细胞的丰度更高。这表明CAR T细胞能够扩增并持续存在。这与图21中显示的数据一致，表明CAR转导T细胞能够控制肿瘤，而非转导的T细胞的丰度相对较低且不能控制肿瘤生长。
图23进一步证明了与肿瘤细胞消失的转导组相反，未转导对肿瘤仍然存在影响，并且还显示了CD8的扩张更多。
通过确定仅人类细胞的细胞亚群的频率更详细地研究了人类细胞亚群的细胞组成(参见图23)。同样，在仅肿瘤组中未发现人T细胞。对于未转导T细胞组，20-60％的人细胞为剩余的Raji细胞，其CD4与CD8的比率为2:1至3:1。对于CAR转导T细胞组，其中发现约50％的人CD4和50％的人CD8 T细胞，并且对于CAR转导组中剩余的Raji细胞检测到接近背景水平的值。该数据表明，对于含CAR转导T细胞小鼠的群组，CD8 T细胞亚群在体内特异性扩增。
在分析脾脏时，对于仅肿瘤群组，在该淋巴细胞器官中未发现人T细胞(参见图24)。对于含有未转导T细胞的群组，T细胞频率最高可达10％。相比之下，CAR转导T细胞组的人T细胞频率高得多，根据体内成像数据测得其高达40％的人T细胞，由此证实T细胞的扩增和抗肿瘤活性。
总之，体内数据证实了体外功能数据，并表明未转导的T细胞无法控制Raji细胞的生长。相比之下，骨髓中发现的人T细胞比例最高(这是Raji植入和扩增的优选小生境)，表明3天扩增的CAR T细胞也能够在该小生境中生长并促进抗肿瘤活性。
因此，即使缺乏明确的扩增步骤，3天内产生的CAR T细胞在体外和体内令人惊讶地促进了强大的抗肿瘤活性，由此证明体内扩增而非体外扩增对于功能性CAR T细胞的产生至关重要。

Claims (15)

1.一种产生遗传修饰的T细胞的方法，其包括以下步骤：
a)提供样品，所述样品包含T细胞，
b)通过离心制备所述样品，
c)富集步骤b的所述T细胞，
d)使用调节剂激活所述富集的T细胞，
e)通过用慢病毒载体颗粒转导对所述激活的T细胞进行遗传修饰，
f)去除所述调节剂，
从而产生遗传修饰的T细胞样品，
其中所述方法在等于或少于144小时、少于120小时、少于96小时、少于72小时、少于48小时或少于24小时内进行。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤a)的所述样品包含人血清，并且其中所述血清在步骤b)中被去除。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述T细胞通过使用CD4和/或CD8作为正向选择标记，在步骤c)中针对CD4和/或CD8阳性T细胞富集，和/或通过使用肿瘤相关抗原(TAA)作为负向选择标记耗减癌细胞。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述CD4和/或CD8阳性T细胞的富集通过磁性细胞分离步骤进行，其包括:
i)使所述T细胞与磁性颗粒接触，所述磁性颗粒直接或间接地与对CD4和/或CD8特异性的抗体或其抗原结合片段偶联，其中所述磁性颗粒和与之偶联的所述抗体或其抗原结合片段可被去除，
ii)在磁场中分离所述CD4和/或CD8 T细胞，
iii)所述分离后从所述富集的T细胞中去除所述磁性颗粒。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述CD4和/或CD8阳性T细胞的富集通过磁性细胞分离步骤进行，其包括:
i)使所述T细胞与磁性颗粒接触，所述磁性颗粒直接或间接地与对CD4和/或CD8特异性的抗体或其抗原结合片段偶联，其中所述磁性颗粒和与之偶联的所述抗体或其抗原结合片段可被化学和/或酶促破坏，
ii)在磁场中分离所述CD4和/或CD8 T细胞，
iii)在所述分离步骤后，通过所述磁性颗粒和与之偶联的所述抗体或其抗原结合片段的化学和/或酶促破坏从所述富集的T细胞中去除所述磁性颗粒。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述调节剂包含通过接头直接或间接偶联的对CD3特异性的抗体或其抗原结合片段和/或对CD28特异性的抗体或其抗原结合片段，其中对CD3和CD28特异性的所述抗体或其抗原结合片段可被去除。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述调节剂包含通过接头直接或间接偶联的对CD3特异性的抗体或其抗原结合片段和/或对CD28特异性的抗体或其抗原结合片段，其中对CD3和CD28特异性的所述抗体或其抗原结合片段可被化学和/或酶促破坏，并且其中所述调节剂通过对CD3和CD28特异性的所述抗体或其抗原结合片段的化学和/或酶促破坏而被去除。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述调节剂包含通过可生物降解的接头直接偶联的对CD3特异性的抗体或其抗原结合片段和/或对CD28特异性的抗体或其抗原结合片段，其中所述可生物降解的接头通过添加特异性消化所述可生物降解的接头的糖苷键的酶而被降解。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述可生物降解的接头是或包含多糖，并且所述特异性消化糖苷键的酶是水解酶。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在通过用慢病毒载体颗粒转导对T细胞进行的所述遗传修饰后，残留慢病毒载体颗粒被去除。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述残留慢病毒载体颗粒的去除通过洗涤进行，其中所述洗涤导致包含所述遗传修饰的T细胞的样品中残留载体颗粒至少10倍，优选100倍的减少。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述残留慢病毒载体颗粒的去除通过与灭活慢病毒载体颗粒和/或降低其稳定性的物质孵育进行。
13.根据权利要求10所述的方法，其中将权利要求3的去除的人血清或从中分离的抑制慢病毒载体颗粒向T细胞的增殖性转导的物质添加到遗传修饰的T细胞中，从而去除和/或中和残留慢病毒载体颗粒。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法是在封闭系统中执行的自动化方法。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中与所述提供的样品中T细胞的数量相比，所述产生的样品中T细胞的数量高少于10倍。
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