CN102816734A - 一种肿瘤抗原特异性t细胞的获取方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种肿瘤抗原特异性T细胞的获取方法，包括产生和扩增方法，所述产生方法是将含有抗原提呈细胞（APC）的第一群细胞与包被有抗原的界面接触，让APC摄取包被在界面上的抗原；再将含有T细胞的第二群细胞与摄取了抗原的第一群细胞共培养，产生抗原特异性T细胞。一种能产生大量反应性极高的抗原特异性T细胞的方法，获得的T细胞无论是细胞表面受体表达还是细胞因子的分泌都是现有其它培养系统无法比拟的。用此方法无需知道特殊抗原（当然已知的抗原也可以应用），经1-2次扩增就能达到治疗量，包含CD4和CD8系列的抗原特异性T细胞，而且可以根据需要分选CD4或CD8细胞。

Description

一种肿瘤抗原特异性T细胞的获取方法

技术领域

本发明涉及特异性T细胞的产生和扩增方法，特别涉及肿瘤抗原特异性T细胞的生产和扩增方法。

背景技术

体外生成和扩增具有辨认各种抗原能力的T细胞已成功地用于治疗恶性肿瘤和病毒感染性疾病。这种特异性过继免疫治疗策略的诱人之处在于它能诱导只针对疾病细胞的特异性免疫效应，而不伤及正常细胞，无副作用。因此，常规、可重复的体外扩增抗原特异性T细胞的方法是实现肿瘤过继免疫治疗的关键。如今，体外培养产生有肿瘤治疗效果的抗原特异性T细胞技术还远未成熟，需要进一步完善，在提高其抗肿瘤功能的同时简化抗原特异性T细胞的产出程序，使其得到广泛应用。

目前扩增T细胞的方法主要依靠人类白细胞相容抗原（MHC）配对的抗原提呈细胞（APC）和外源性生长因子，如白介素2（IL-2）联合CD3抗体用于刺激T细胞分裂，扩增的T细胞主要是CD8阳性T细胞亚群。然而，由于APC存活期相当短，长期培养T细胞时要不断收集和补充死亡的APC。当疾病影响到免疫系统，如免疫缺陷，病毒感染等，APC的来源更是无法解决。

另外，获得临床治疗量的抗原特异性T细胞往往需要在培养过程中多次活化和扩增，需投入大量人力，既耗时，成本又高，且重复性差，又难标准化。

因此，改进抗原特异性T细胞克隆的扩增方法是非常必要的。在改善抗原特异性T细胞的抗肿瘤功能的同时简化抗原特异性T细胞的产出程序无论是提高临床治疗的效果还是细胞产出的标准化都具有重要的意义。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种能产生大量反应性极高的抗原特异性T细胞的方法，获得的T细胞无论是细胞表面受体表达还是细胞因子的分泌都是现有其它培养系统无法比拟的。用此方法无需知道特殊抗原（当然已知的抗原也可以应用），经1-2次扩增就能达到治疗量，包含CD4和CD8系列的抗原特异性T细胞，而且可以根据需要分选CD4或CD8细胞。

鉴于此，本发明提供的技术方案是，提供一种肿瘤抗原特异性T细胞的获取方法，包括产生和扩增方法，所述产生方法是将含有抗原提呈细胞（APC）的第一群细胞与包被有抗原的界面接触，让APC摄取包被在界面上的抗原；再将含有T细胞的第二群细胞与摄取了抗原的第一群细胞共培养，产生抗原特异性T细胞。可以采用不同的方法巧妙地把抗原包被、黏附、偶联或结合到某些物体的表面，例如交叉链接，也可以通过共价或非共价，静电或疏水基团结合的方式，或利用各种黏附方法来完成，包括化学，力学，酶学，静电等方法，最终目的是让这些包被有抗原的界面能刺激T细胞。例如，通过抗生物素蛋白或链霉亲和素使抗体与生物素化的抗原在界面结合；抗体与配体通过特异性结合到界面。另一种办法是用其它非特异性抗体结合分子，如A蛋白或G蛋白包被的界面结合抗体。化学交叉偶联法包被抗原可用Pierce,Rockford III或其它方法，抗原也可以共价结合的方式结合到界面。另外一种方法是用甲苯磺酰基激活的或环氧树脂结合的DYNABEAD^TM按厂家的操作步骤与多肽抗原，在磷酸缓冲液的pH 4-9.5之间，温度4-37℃之间共培养。

进一步地，所述APC直接与抗原特异性T细胞接触，与抗原特异性T细胞直接接触的APC是用磁场分离。

进一步地，所述扩增方法是将抗原特异性T细胞植入包被有第一试剂的培养界面扩增，再转入包被有第二试剂的培养界面；所述第一试剂和第二试剂是相同或者不同的抗体或抗体片段；所述界面为磁珠、脂质或细胞。抗原特异性T细胞先和包被有第一试剂的界面培养，然后转入包被有第二试剂的培养界面，目的是让T细胞表面相应部位与不同试剂结合，促进抗原特异性T细胞的分蘖（扩增）。

进一步地，界面的空间与T细胞的比例选择1：2，1：2.5，1：5，1：25，1：50，1：75，1：100。需要说明的是，上述界面的空间与T细胞的比例是优选方案，对于本领域技术人员来说，界面的空间与T细胞的比例介于1：2至1：100均可以选择的。

所述第一试剂是CD3或CD2抗体或其片段，所述第二试剂用CD28抗体或其片段。CD3抗体与CD28抗体的比例为1：1至1：100。抗原特异性T细胞可以用针对T细胞活化标记的抗体分离，可供选择的抗体还包括CD25，CD54，CD69，CD38，CD45RO，CD49d，CD40L，CD137，CD62L以及CD134等抗体。

T细胞的扩增时加入促细胞分裂素、白介素15、天然CD137蛋白、CD137抗体、NKG2D抗体或/和天然NKG2D蛋白。

优选地，所述促细胞分裂素选用植物血球凝集素（PHA），豆蔻酸-佛波醇-乙酸酯（PMA）和离子素，脂多糖（LPS），以及超级抗原。

所述抗原为抗体/抗原复合物、肿瘤或病毒感染的细胞、固定的肿瘤或病毒感染的细胞、高温灭活的肿瘤或病毒感染的细胞、肿瘤细胞裂解物、不溶解的细胞碎片、细胞凋亡体、坏死细胞、灭活的肿瘤细胞、放射灭活的异体细胞、天然或合成的碳水化合物、脂蛋白、脂多糖、以及基因改造的细胞。对于蛋白类，糖蛋白类，多肽这些抗原亦可用于本发明所述的方法。抗原的获取方法有：非转化细胞用3000-3600rad强度的γ射线照射；淋巴母细胞或肿瘤细胞用6000-10000rad强度的γ射线照射；用理化或生物学的方法获得坏死和凋亡细胞，如用冻-溶的方法获得坏死细胞，而用紫外线照射的方法获得凋亡细胞。

APC来源于外周血单个核细胞采集，淋巴结，扁桃体，活检组织，肿瘤组织，脾脏，骨髓，脐血，CD34+细胞或单核细胞。优选地，APC来源于CD34+细胞。

抗原是通过抗体/配体的相互作用吸附或者通过化学反应的方法包被到载体的界面上。选择的抗体与相对应的配体有MART1抗体/MART1，WT-1抗体/WT-1，PR1抗体/PR1，PR3抗体/PR3，络氨酸酶抗体/络氨酸酶，MAGE-1抗体/MAGE-1，MUC-1抗体/MUC-1，甲胎蛋白抗体/甲胎蛋白，Her2Neu抗体/Her2Neu，HIVgp120抗体/HIVgp120，流感HA抗体/流感HA抗原，CMVpp65抗体/CMVpp65，C型肝炎病毒抗体/C型肝炎病毒蛋白，EB病毒EBNA 3B抗体/EB病毒EBNA 3B抗原，以及人免疫球蛋白重链和轻链抗体/来自骨髓瘤或慢性淋巴细胞性白血病患者的免疫球蛋白。用化学的方法把抗原黏附到界面上，如利用生物素-亲和素的作用。

利用上述方法获得的肿瘤抗原特异性T细胞，与哺乳类癌细胞接触，能够有效地抑制肿瘤细胞生长。这些肿瘤细胞有：黑色素瘤，非霍奇金氏淋巴瘤，霍奇金氏病，白血病，浆细胞瘤，肉瘤，胶质瘤，胸腺瘤，乳腺癌，前列腺癌，结肠直肠癌，肾细胞癌，胰腺癌，食道癌，脑癌，肺癌，卵巢癌，宫颈癌，多发性骨髓瘤，肝癌，急性淋巴母细胞性白血病，急性骨髓性白血病，慢性骨髓性白血病，以及慢性淋巴细胞性白血病。

相关术语解释。

术语“生物兼容”指的是对活细胞无明显毒性作用的特征。

术语“刺激”指的是细胞表面的某些部位连接后的第一反应。例如，就受体而言，“刺激”需要细胞表面的受体与相应的信号传导系统连接来完成。有关T细胞的刺激，这样的刺激在一种情况下指的是T细胞表面部位的连接诱导信号转导的发生，例如TCR/CD3复合物的形成。刺激的发生可能激活一个细胞上调或下调一个分子的表达或分泌，例如，下调TGF-β。因此，细胞表面某些部位的连接，即使没有直接的信号转导发生，也可能导致细胞结构的重组，提高、调节或改变后续的细胞反应。

术语“活化”指的是细胞表面部位充分连接导致明显的生化或形态改变的状态。T细胞而言，这样的活化指的是T细胞充分刺激后导致细胞增殖的状态。T细胞活化也可能诱导合成细胞因子，产生调节或溶解细胞效应。对其它细胞而言，这个术语有上调或下调一个特定的理-化作用的意思。

术语“靶细胞”在这里指的是受到刺激的细胞。

术语“抗体”包括单克隆和多克隆抗体；人源化，鼠源，鼠-人，鼠-灵长类和嵌合抗体；可以是完整的分子或片段（如scFv，Fv，Fd，Fab，Fab’以及F(ab)’sub.2片段），或是多聚体，聚合物；通过免疫，合成或基因工程的方法获得。“抗体片段”指的是相应抗体的衍生物，分子小，能结合相应抗原，易于摄取和清除（例如，与半乳糖残渣结合）。它们包括F(ab)，F(ab)’sub2，scFv，轻链易变区（V.sub.L），重链易变区（V.sub.H）以及它们的结合。

术语“蛋白”指的是蛋白，多肽和肽；可以是完整的氨基酸序列，片段或多聚体或完整分子与片段的混合。可以是天然的或通过合成（化学和/或酶联）或基因工程获得。

术语“试剂”，“配体”，或“与细胞表面结合的试剂”指的是与限定细胞结合的一种分子。试剂可能可以结合到任何细胞的表面，如一种受体，一种抗原决定族，或靶细胞的其它结合部位。试剂可以是蛋白，肽，抗体和抗体片段，融合蛋白，合成的分子，一种有机分子（如小分子）等。T细胞刺激中用规范的抗体。

术语“与细胞表面结合的试剂”和“细胞表面结合部位”指的是一对抗体与相对应的配体。它们应该是互补的、特异性结合，通常有相当高的亲和力（亲和力常数，K_a大约是10⁶L/mol或更高）。

术语“抗原提呈细胞（APC）”指的是正常情况下使原始和/或T细胞对抗原作出反应的启动细胞。在这个意义上，指所有能提呈抗原的细胞。APC除了树突状细胞，单核细胞，巨噬细胞和B细胞，还包括人造抗原提呈细胞，APC高表达MHC II型分子，ICAM-1和B7-2分子。

术语“共刺激信号”指的是与第一信号，如TCR/CD3结合，相互作用，导致T细胞增殖的信号。

术语“配体抗体/配体”指的是一对互补的，具特异性结合的，通常有相当高的亲和力（亲和力常数，Ka至少10⁶L/mol）的分子。分子间的亲和力是相对的，视选用的对子有高有低，例如，生物素/链酶亲和素，链酶亲和素的结合率与单体生物素相当，而它的解离率只有单体生物素的1/7。酶/酶抑制剂，半抗原/抗体，植物凝血素/碳水化合物，受体/配体以及生物素/抗生物素蛋白或链酶亲和素都是配体/抗配体对子。此发明内，受体以及其它的细胞表位是配体抗体，而与其作用的试剂，如抗体和抗体片段被认为是配体。

术语“分离”指的是用任何方法，如过滤，磁场，提纯一种细胞成分。

术语“静息”指的是处于无增殖状态的细胞。

术语“界面”指的是结合了试剂的表面，材料可以是金属，玻璃，塑料，共聚合体，胶体，脂质，细胞表面以及类似物。这些表面必须是可以维持试剂黏附。此发明内这种表面的典型例子是一种颗粒。因此，术语“界面”与“颗粒”是可以互换的。

术语“免疫反应或反应”指的是免疫细胞（包括但不限于T细胞）的活化，诱导产生特殊的效应细胞。效应细胞的功能包括，但不限于，增殖，分泌细胞因子，分泌抗体，调节和/或黏附分子的表达以及溶解细胞的能力。

术语“刺激免疫反应”指的是任何能活化、诱导免疫系统的效应细胞功能的刺激。

术语“免疫反应异常”指的是免疫细胞异常的活化和/或增殖或缺乏，和/或异常分泌或缺乏细胞因子，和/或免疫系统其它细胞的异常诱导或不足，如调节，黏附和/或归源受体的表达，以及诱导细胞溶解。

术语“防止”或“抑制”一种癌或癌细胞的发展指的是预防癌症的发生或延缓癌症复发。

术语“治疗”或“减少癌或癌细胞的出现”指的是用肿瘤体积或恶性细胞的数量反应癌生长的方法。肿瘤体积用已知的不同方法测量，例如，用带表卡尺测定肿块的两个长径，计算肿瘤大小。

术语“预防或抑制感染性疾病的发生”指的是防止感染性疾病的发生或延缓感染性疾病的发作，或逆转感染性疾病的扩散。

术语“改善”指的是使好转。

术语“颗粒”指的是胶质颗粒，微球，纳米颗粒，微粒等。一般情况，可以用市场提供的微粒或其它颗粒，提供这些颗粒表面的公司有：Miltenyi Biotec,Germany;Pharmacia Fine Chemicals,Sweden;Dynal Inc.,Oslo,Norway;Prometic Biosciences;Immunicon,Huntingdon Valley,Pa.USA;BangsLaboratories,Inc.,Fishers,Ind.USA。

术语“常磁性颗粒”指的是能在磁场内聚集的磁性颗粒。

术语“抗原”指的是任何分子1）能被特异性的单克隆抗体或衍生物辨识，并在其特定分子区域（抗原结合区）结合；2）结合MHC的相关多肽序列能特异性地与同源T细胞抗原受体结合。

术语APC“加载”抗原指的是APC与抗原或抗原肽接触一段时间，APC摄取，处理抗原并结合MHC分子后提呈抗原给T细胞。一些情况下，抗原，特别是抗原肽，结合MHC分子后直接提呈给T细胞，无需APC的参与。

术语“动物”或“哺乳动物”指的是全部的哺乳类，包括人。这个专利申请中，更多的是指人体。

术语“接触”指的是使进入立即或直接的接触状态。

术语“溶解产物”指的是细胞溶解后的上清液和不溶解的细胞碎片。有多种细胞溶解方法和溶解液可供选用（参考Current Protocols in Immunology,JohnWiley & Sons,New York.N.Y.）。溶解细胞也可以用冻-溶的方法或其它方法，如超声降解。

术语“凋亡小体”指的是来自凋亡细胞的，有完整包膜的小片段。

术语“增殖”指的是新细胞的倍数增长。

术语“感染性疾病”指的是由感染性微生物引发的疾病。感染性微生物包括：病毒类有RNA病毒，DNA病毒，人类免疫缺陷病毒（HIV），A，B,C型肝炎病毒，单纯疱疹病毒（HSV），巨细胞病毒（CMV），埃-巴病毒（EBV），人类乳头状病毒（HPV）；寄生虫包括原生和后生病原体，如疟原虫，利什曼虫，血吸虫，锥虫；细菌主要是分支杆菌属，如结核杆菌，沙门氏菌，链球菌，大肠杆菌，葡萄球菌；霉菌包括假丝酵母菌，曲霉菌；以及肺囊虫和朊病毒（传染性疯牛病的病原体，侵犯牛羊的神经系统，导致海绵状脑病）。已知4种朊病毒可传染人1）苦鲁病；2）痉挛性假硬化；3）Gerstmann-Straussler-Scheinker病（GSS）；4）致命性家族性失眠症。这里包括全部由朊病毒引起的疾病。

附图说明

图1CD8⁺T淋巴细胞表达中央记忆性T细胞标记。(A）未培养的CD4⁺和CD8⁺淋巴细胞的记忆性标记表达;（B）培养后的抗原特异性CD4⁺和CD8⁺淋巴细胞的记忆性标记表达。

图2肿瘤抗原特异性T细胞对肿瘤细胞的体外杀伤作用。（A）肿瘤细胞CNE，PANC-1和QGY-7701培养24小时后的观察（上图），加入未培养的淋巴细胞24小时后的观察（下图）（B）肿瘤细胞CNE，PANC-1和QGY-7701培养24小时后的观察（上图），加入抗原特异性T淋巴细胞24小时后的观察（下图）。

图3利用本发明所述方法获得的特异性T细胞对非小细胞肺癌病人治疗前后的EGFR特异性T细胞的观察。

图4利用本发明所述方法获得的特异性T细胞对非小细胞肺癌病人治疗前后的X光胸侧位片的观察。

图5利用本发明所述方法获得的特异性T细胞对非小细胞肺癌病人细胞治疗后的血浆CEA水平的观察。

具体实施方式

以下结合附图进行说明。

1、T细胞的来源

T细胞来源是多方面的，包括自体或异体的外周血单个核细胞，骨髓，胸腺，活检组织，肿瘤，淋巴结组织，临近淋巴组织的黏膜，脾脏或任何其它淋巴组织。T细胞也有来自异种，如小鼠，大鼠，非人类灵长目动物和猪。

外周血淋巴细胞最好通过单项采集获得。单项采集获得的细胞包含T细胞，单核细胞，粒细胞，B细胞和其它一些有核白细胞、红细胞和血小板。可以通过洗涤、分离去除血浆成分，然后置入适当的缓冲液，如磷酸缓冲盐水（PBS）备用。有时用去除二价离子，如钙镁的洗涤液。根据实验室经验可以选择不同的方法分离淋巴细胞，例如用半自动流通离心机，按产家的操作步骤分离(Cobe 2991cell processor，Baxter）。洗涤后的细胞悬浮于生物相容性缓冲液，如去Ca⁺⁺和Mg⁺⁺的PBS。或者，去除不需要的成分后把细胞直接悬浮在细胞培养液。

另外一种方法是通过红细胞裂解和PERCOLL^TM梯度离心从外周血提取T细胞。特殊的T细胞亚群，如CD28⁺，CD4⁺，CD8⁺，CD45RA⁺，CD45RO⁺的T细胞，可以用不同技术分选，例如，CD3⁺，CD28⁺的T细胞可以用CD3/CD28接合的磁珠（DYNABEADS）做阳性分选。也可以针对细胞表面某些特殊标记，利用联合抗体阴性分选达到提高某种T细胞亚群数量的目的。最好的方法是利用针对细胞表面标记的混合单克隆抗体，用免疫磁附技术或流式细胞技术阴性分选所需的T细胞，例如，阴性分选CD4⁺细胞通常选择CD14，CD20，CD11b，CD16，HLA-DR和CD8混合单克隆抗体。

备制T细胞也可以用洗涤后冻存的方法，不需要另外步骤去除单核细胞，因为经冻存后复苏的细胞基本可以除去粒细胞和部分单核细胞。洗涤去除血浆和血小板后，把细胞悬浮于冻存液。冻存液是用培养液1：1稀释的含20%DMSO和8%人血清白蛋白（HSA）的PBS，DMSO和HSA的终末溶度分别是10%和4%。细胞以每分钟下降1°C的冻存速率下降至-80°C后储存在液氮罐内的蒸发相。

2、抗原提呈细胞（APC）的来源

组织来源的抗原提呈细胞（APC）或APC前体细胞在抗原和/或必须的细胞因子的环境中能增殖和成熟成为专职抗原提呈细胞（pAPC）。术语“专职抗原提呈细胞”或“抗原提呈细胞”指的是正常情况下使原始和/或记忆性T细胞对抗原作出反应的启动细胞。pAPC包括，但不限于，树突状细胞，单核细胞，巨噬细胞，B细胞以及人造抗原提呈细胞。pAPC高表达MHCII型分子，ICAM-1和B7-2分子。APC前体细胞在体外培养成为成熟的树突状细胞（DC）。APC可以来自很多组织，如脾，胸腺，活检组织，肿瘤组织，淋巴结，输入淋巴，骨髓，外周血。外周血和骨髓是首选来源。含有丰富生长因子的胚胎组织和脐带血都是APC和/或APC前体细胞的来源。优秀的前体细胞可能是胚胎干细胞，CD34⁺细胞，单核细胞祖细胞和B细胞的祖细胞。

本发明优选使用：APC从单核细胞或CD34+细胞的前体细胞获得。

APC和/或APC前体来源于外周血白细胞采集。单项细胞采集技术是本领域众所周知的（参考：Bishop et al.,Blood,Vol.83,No.2,pp.610-616,1994）例如，用Haemonetics Model V50细胞单采机（Haemonetics,Braintree,Mass.USA）。采集的淋巴细胞包含T细胞，单核细胞，粒细胞，B细胞以及其他有核白细胞，红细胞和血小板。经洗涤去除血浆，把细胞悬浮于适当的缓冲液或培养液备用。洗涤液用没有二价离子的溶液。洗涤步骤按本领域技术员熟知的方法进行。例如用半自动流通离心机，按厂家的操作步骤分离（Cobe 2991 cell processor，Baxter）。洗涤后的细胞可再悬浮于不同的生物相容性缓冲液中，如去Ca⁺⁺和Mg⁺⁺的PBS。或者，去除不需要的成分后把细胞直接悬浮在细胞培养液。

如果APC来自全血，用常规的方法提取APC。血液用无抗凝剂的RPMI培养液以体积1：1稀释，混匀，分装到50毫升已加了12.5ml淋巴细胞分离液（Ficoll）的离心管中。700G，室温离心20分钟。提取白膜细胞层加入装有RPMI1640的离心管中。其它用于细胞培养的溶液也可以用来分离淋巴细胞，如PBS，Hanks缓冲液，或含细胞生长因子的培养液，如DMEM，MEM，HAMS F-12，X-Vivo15，X-Vivo20。APC和/或APC前体细胞还可以用Beckman J6ME离心设备配备J5.0转子和40ml净化腔纯化。

另一种分离APC和/或APC前体细胞的方法是全血或单采的细胞与结合了抗体的顺磁磁珠（4x10⁹磁珠大约可用于5x10⁸到2x10¹⁰细胞）在22-37°C条件下孵育大约30分钟到2小时，然后在磁场中去除与磁珠结合的细胞。整个过程可以按照厂家提供的操作步骤来完成，如DYNAL.RTM.Magnetic ParticleConcentrator。提取出来的细胞质量可用这个领域的已知技术鉴定，包括细胞分离前后流式细胞分析技术。

组织来源的APC通过细胞原代培养获得。本发明对此作出如下改进：培养基中通常加入1-2种细胞因子，如人粒细胞-巨噬细胞生长因子和人白介素-4，在组织相容培养皿内培养，如各种培养袋（Lifecell culture bags），培养瓶，多孔培养板，皮氏培养平皿等。表面用胶原或poly-L-lysine处理，促进细胞贴壁。一些特殊细胞类型需要特异性抗体协助。培养皿也可用化学处理的方法，如离子化。植入细胞密度大约10^5-7/cm²。

优选地，原代细胞在标准的细胞培养条件下培养直到可以把贴壁和非贴壁细胞分开为止。血液中一些未成熟的APC，特别是未成熟的DC细胞，开始是不贴壁的，单核细胞则相反，因此，24小时内就能把前体细胞分离。一般认为大多数贴壁细胞是单核细胞和纤维母细胞，通常在培养30分钟到24小时内贴壁。非贴壁细胞一般在1-16小时就可以从贴壁细胞中分离出来。分离非贴壁细胞时，无论用震荡还是用移液的方法，注意维持贴壁细胞的贴壁状态，尽量不要把太多的贴壁细胞混入非贴壁细胞。通常选用移液的方法。

把分离的包含APC前体细胞的贴壁细胞在标准的细胞培养条件下培养成未成熟APC，依本发明，一般需要4小时到7天时间。这里用的术语“未成熟APC”指的是APC向成熟分化的一个中间状态，在这个状态的APC具有内吞或吞噬抗原，异物，坏死和/或凋亡组织和/或细胞的功能。视前体细胞的来源，未成熟APC可以是CD14⁺或CD14^-细胞。它也可以表达CD1a，CD40，CD86，CD54以及中度水平的MHC II型分子（用流式细胞分析技术与MHC II型分子表达阳性/阴性的细胞对比）。典型的未成熟APC不表达CCR7。

其实，T细胞没有必要从APC中分离出来。例如，包含APC和T细胞的PBMC如描述的那样与抗原接触，获得的抗原特异性T细胞再按本发明的方法进一步扩增。

这里描述的APC或T细胞并不一定都要来自自体，也可以来自配对或不配对的异体供者，细胞系，或其它体外培养的细胞，或来自异种，如小鼠，大鼠，非人灵长动物和猪的APC和T细胞。基因配对的方法是已知的。

3、抗原的来源

根据发明，抗原可以是，但不限于，蛋白，包括糖蛋白，肽（包括相互交叉的组合肽），超级抗原（如SEA，SEB，TSST-1），抗原/抗体复合物，肿瘤溶解物，病毒溶解物（如CMV溶解物），不溶解的细胞碎片，凋亡小体，坏死细胞，活的、固定的、辐射过的、高温灭活的、或其它方法备制的全细胞，灭活的、来自肿瘤组织或细胞系的肿瘤全细胞，灭活的异体细胞，辐射过的肿瘤细胞和异体细胞，天然或合成的碳水化合物，脂蛋白，脂多糖，RNA或RNA翻译产物，以及DNA或DNA编码的多肽。非转化细胞用3000-3600rad强度的γ射线照射。淋巴母细胞或肿瘤细胞用6000-10000rad强度的γ射线照射。用理化或生物学的方法获得坏死和凋亡细胞。如用冻-溶的方法获得坏死细胞，而用紫外线照射的方法获得凋亡细胞。（参阅Current Protocols in Molecular Biology or Current Protocolsin Immunology,John Wiley & Sons,New York.N.Y.）。

抗原也包括非转化的细胞，转化的细胞，转染的细胞，或转导的细胞或细胞系。可以应用已知的以逆转录酶病毒为载体的转化，转染或转导技术使宿主细胞表达重组抗原分子。具体的操作步骤可参考Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley & Sons,New York.N.Y.试剂盒供应商:Invitrogen LifeTechnologies,Carlsbad,Calif.USA.表达牛痘疫苗载体的细胞是其中抗原之一。重组抗原可以包括以下描述的任何数量的抗原。

采用的抗原有病毒抗原，如CMV pp65，HIV pg120之类的抗原。优选地，所述抗原为：肿瘤特殊抗原，如黑色素瘤Melan-A抗原（也称T细胞或MART-1识别的黑色素瘤抗原），黑色素瘤抗原基因1，2，3编码的抗原（MAGE-1,-2,-3），黑色素瘤GP-100抗原，癌胚抗原（CEA），乳腺癌抗原，Her-2/Neu，血清前列腺特异性抗原（PSA），维尔姆斯氏瘤抗原（WT-1），PR1，PR3（慢性粒细胞性白血病中移植物抗白血病的抗原），粘蛋白抗原，MUC-1，-2，-3，-4，B型细胞淋巴瘤特异性抗原等。在这个领域的技术人员可以根据需要选择不同的肿瘤抗原。

4、抗原特异性T细胞的活化

发明的其中一个惊人的发现是抗原特异性T细胞的扩增取决于细胞与磁珠的比例。选择细胞与磁珠的比例就能调节记忆性抗原特异性细胞的数量。因此，选择适当的磁珠与细胞的比例，选择性地扩增抗原特异性T细胞。如来自单采的PBMC，血液或肿瘤活检组织的T细胞与上述包被了第一和第二试剂的磁珠接触后，第一试剂和第二试剂分别与T细胞表面相应部位结合，诱发抗原特异性T细胞增殖（扩增）。

抗原特异性T细胞致敏后受到刺激，诱发增殖。因此，刺激T细胞的信号强弱是关键，“弱”信号刺激记忆性抗原特异性T细胞的扩增，而“强”信号则相反。信号强弱取决于与配体结合的CD3/TCR和CD28受体的量。因此，磁珠与细胞的比例越高，刺激T细胞的信号就越强，引起抗原特异性T细胞的过刺激而死亡。降低磁珠与细胞的比例，适当的刺激信号将诱导抗原特异性T细胞的增殖。

改进之一：上述方法提取的T细胞用负载抗原的APC激活生成抗原特异性T细胞。

另一改进：APC与足够量的上述抗原在培养皿内孵育足够长的时间（一般需要1-4天），让APC有足够的时间结合和/或摄入抗原。但是，不同抗原或来源不同的抗原，所需的时间也不相同。特殊改进：孵育时间36，48或72小时。进一步改进：抗原孵育时间2.5，3，3.5，或4天。一些优化：抗原孵育时间4天以上，从4.5，5，5.5，6，6.5，7，7.5，8，8.5，9，9.5到10天不等。APC摄取抗原的量和必须的孵育时间根据抗原的来源和类型有所不同，可以用本领域常规的免疫检测方法检测。也可以用检测APC表面MHC抗原复合物的方法检测。

另一改进：单采获得的外周血单个核细胞（PBMC）直接按如上所述的方法与承载抗原的APC共培养，刺激并活化PBMC的里的T细胞，生成抗原特异性T细胞。操作步骤：收集一个人的PBMC，加入抗原，如肿瘤抗原，或病毒溶解物等。这时，PBMC里的APC摄取抗原后提呈给PBMC里的T细胞。另一改进：用肽-MHC四聚物刺激抗原特异性T细胞（参阅Altman et al.,Science 1998 Jun.19;280(5371):1821）。

APC可以用基因改良的方法负载抗原，包括用已知的方法转染RNA或DNA，如电穿孔法（如用the Gene Pulser II,BioRad,Richmond,Calif.USA）,各种阳离子脂质（LIPOFECTAMINE^TM,Life Technology,Carisbad,Calif.USA）或其它技术，如Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,New York.N.Y.里的方法磷酸钙转染。例如，500μl含5-50μg RNA或DNA的Opti-MEM室温与10-100μg/ml混合20-30分钟。其它脂质包括LIPOFECTIN^TM,LIPOFECTAMINE^TM。产生的核酸-脂质复合物加入1-3x10⁶（首选2x10⁶）抗原提呈细胞，液体（如Opti-MEM）总体积大约2毫升，37°C孵育2-4小时。APC也可以用下面描述的病毒转导方法。

另一改进：把抗原黏附、包被或用其它办法固定在颗粒的表面负载给APC。市场销售的各种微球或颗粒都可以用作这样的抗原载体，如Miltenyi颗粒（Miltenyi Biotec.,Germany）；Sepharose微粒（Pharmacia Fine Chemicals,Sweden）；DYNABEADS^TM（DynalInc.,New York，USA）。其中改进：应用市场销售的顺磁颗粒或微粒。例如，Dynal AS生产的商标名为Dynabeads^TM的常用磁珠有M-280，M-450和M-500。一个改进：活的、固定的、辐射后的、高温、或其它方法灭活的整个细胞用抗体/配体特异性结合或其它方法固定在可被摄取的微粒的表面。肿瘤细胞或病毒感染的细胞溶解物，或其它抗原都可以用相似的方法固定在微粒的表面。这些抗原/细胞/溶解物包被或黏附的微粒与动物或人的PBMC共培养时，其中的APC就能摄取携带抗原的微粒，处理其中的抗原并把相关抗原信息提呈给PBMC里的T细胞。巨噬细胞摄取颗粒/微粒，处理相关抗原，并提呈给PBMC里的T细胞。只有抗原特异性的T细胞才会与相应APC相互作用。带有磁珠的APC可以通过磁场与抗原特异性T细胞分离。

一个特殊改进：细胞也可以用作抗原载体。在这种情况下，抗原通过与细胞表面特异性受体结合或通过基因改造的方法把抗原吸附在细胞表面。CurrentProtocol in Molecular Biology,John Wiley & Sons,New York.N.Y.里的各种基因转染、转导、或细胞转化技术都可以应用，其中的试剂盒也都有商家提供。一种较好的转染技术是电穿孔技术，可应用于不同的细胞类型，包括哺乳动物细胞，真菌和细菌。通过实验确定对特定细胞类型的理想电穿孔条件，包括电压，电阻和脉冲的波长。厂家也会提供这方面的一般准则。不同的细胞类型可选择不同的转染技术，如真菌用醋酸锂的方法。细胞转染后维持在适当的环境中促进转染基因的表达，条件的设定取决于细胞类型和基因表达系统的应用。

抗原可以通过抗体/配体特异性结合方法结合到微粒上。适合的抗体/配体对包括，但不限于，MART-1抗体/MART-1，WT-1抗体/WT-1，PR1抗体/PR1，PR3抗体/PR3，络氨酸酶抗体/络氨酸，MAGE-1抗体/MAGE-1，MUC-1抗体/MUC-1，甲胎蛋白抗体/甲胎蛋白，Her2Neu抗体/Ner2Neu，HIV gp120抗体/HIVgp120，流感HA抗体/流感HA，CMVpp65抗体/CMVpp65，C型肝炎抗体/C型肝炎蛋白，EB病毒EBNA 3B抗体/EB病毒EBNA3B抗原，以及来自肿瘤病人的人免疫球蛋白重链和轻链抗体/人免疫球蛋白抗原。也可以通过蛋白/蛋白之间的相互作用，如受体/配体，把抗原结合到微球上。一些改进：抗原/蛋白用化学的方法吸附到微球上。只要抗原与微球孵育一定时间，利用抗原/蛋白与微球非共价结合的方式，或通过生物素/亲和素或链酶亲和素的相互作用把抗原结合到微球上。进一步改进：利用甲苯磺酰基与微球表面裸露的疏水基团的反应，24小时内通过氨基（NH₂）和巯基（SH）的共价连接把蛋白吸附在微球上。连接反应可以在中性pH的环境中完成，然而，37℃碱性环境能加速共价结合。

承载抗原的APC用如上所述的方法刺激从组织分离获得的T细胞，孵育时间大约从数小时到0.5，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，或20天不等。

一个改进：T细胞与上述抗原或抗原承载的APC在活体内接触。为了在活体内激活T细胞，上述抗原或承载抗原的APC可以注射到体内，然后在体内或体外扩增抗原特异性T细胞，体外扩增，如上所述，用CD3/CD28抗体微球。注射的量和次数视疾病的严重程度而定，也可以通过临床试验确定。如果抗原或承载抗原的APC在疾病发生前或在疾病开始治疗前注射，然后从外周血中分离产生的抗原特异性T细胞，体外扩增备用。

一个改进：利用磁场把结合了抗原磁珠的APC的抗原特异性T细胞分离出来。分离方法：应用标准的DYNAL Magnetic Particle Concentrator(DYNAL）或MACS（Miltenyi Biotec,Germany）提供的操作步骤。此时，只有抗原特异性T细胞与APC充分作用，携带抗原特异性T细胞的抗原磁珠-APC通过磁场分离出来。然后，可以用各种方法活化/扩增分离出来的抗原特异性T细胞，如XCELLERATE技术。

另一个改进：抗原特异性T细胞阳性分选。这个步骤可用于分离PBMC里的T细胞或已经与抗原或承载抗原的APC结合的T细胞。Current Protocols inImmunology,John Wiley & Songs,New York.N.Y.里描述的各种免疫分选的方法都可以应用。用于阳性分选的标记包括，但不限于，CD25，CD54，CD69，CD38，CD45RO，CD49d，CD40L，CD137，CD62L，以及CD134。另外，荧光活化细胞分选法可用于分选理想的抗原特异性T细胞，也可以利用肽-MHC四聚体分选抗原特异性T细胞（参阅Atlman，et al.Science 1998 Jun.19;280(5371):1821）。

进一步改进：抗原特异性T细胞的基因改造。基因改造包括用常规的RNA或DNA转染技术，例如电穿孔法(the Gene Pulser II，BioRad,Richmond,Calif.），各种阳离子脂质（LIPOFECTAMINE^TM,Life Technologies，Carlsbad，Calif.），或其他技术，例如Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,New York,N.Y.描述的磷酸钙转染技术。500毫升含5-50μg RNA或DNA的Opti-MEM与10-100μg溶度的阳离子脂质，如LIPOFECTIN^TM或LIPOFECTAMINW^TM,室温下孵育20-30分钟。产生的核酸-脂质复合物与1-3x10⁶（首选2x10⁶）APC细胞在总体积大约2毫升的Opti-MEM，37°C，孵育2-4小时。APC基因改造也可以用下面描述的病毒转导法。

抗原特异性T细胞的基因改造也可以用逆转录病毒转导技术。逆转录病毒载体可以是双向逆转录病毒载体，最好有一个长末端重复序列（LTR），例如来自莫洛尼鼠白血病病毒（MoMLV），骨髓增生性肉瘤病毒（MPSV），鼠胚胎干细胞病毒（MESV），鼠干细胞病毒（MSCV），形成脾病灶病毒（SFFV），或腺相关病毒（AAV）。大多数逆转录病毒来源于鼠逆转录病毒。来源于鸟类和哺乳类细胞的逆转录病毒都适用于本发明。这些逆转录病毒最好是双向性的，能感染包括人在内的多种宿主细胞。一种方法是把逆转录病毒gag，pol和/或eny序列换成要表达的基因。逆转录病毒系统的选用可参考Miller and Rosman(1989)BioTechniques7:980-990;Miller,A.D.(1990)Human Gene Therapy 1:5-14;Scarpa et al.(1991)Virology 180:849-852;Burns et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:8033-8037;and Boris-Lawrie and Temin(1993)Cur.Opin.Genet.Develop.3:102-109。

另一方面，基因改造的抗原特异性T细胞可以用常规的免疫分选法，选用特异性抗体，受体/配体或针对转染基因表达的蛋白的抗体分选，方法可参考Current Protocols in Immunology,Hohn Wiley & Sons,New York.N.Y.

一个特殊改进：抗原特异性T细胞通过转基因技术表达自杀基因，如单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）（Bonini，et al.Science,276(5319):1719-24）和/或其它细胞表面标记，例如，用截断神经生长因子受体dNGFR跟踪和/或控制输入的抗原特异性T细胞，或表达靶向肿瘤组织的蛋白。

细胞分离和培养可以用常规组织细胞培养的无菌环境和容器，包括各种培养袋（如Lifecell Culture bags），培养皿，转瓶，生物反应器CellCube或CELL-PHARM（CD-Medical，Inc.of Hialeah,Fla.）,皮氏培养皿以及多孔培养板，或其它容器。改进：用生物反应器培养细胞，例如，本专利技术可结合现有的细胞培养设备培养T细胞。

用于培养APC和抗原特异性T细胞的培养基有RPMI 1640，DMEM，alpha-MEM,AIM-V,HAMS F-12,X-Vivo 15,或X-Vivo 20.培养基含有的细胞因子包括IL-12，IFN-γ，IL-4，GM-CSF，IL-10，IL-12，TGFβ以及TNF-α和维生素。除此之外，培养基还包含细胞表面活化剂，如抗体，人血浆蛋白或还原剂（如N-乙酰半胱氨酸，2-巯基乙醇）。本专利应用的细胞培养系统的每一个步骤都保证APC和抗原特异性T细胞的生长。按照本专利培养细胞的方法，应用的细胞生长培养基均加入适当的细胞因子，血清，抗生素，维生素，氨基酸以及其它的添加剂。细胞因子包括，但不限于，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和白介素4（IL-4）或白介素13（IL-13）。其它可以加入的细胞因子和生长因子还有，但不限于，白介素1alpha（IL-1α）和白介素1beta（IL-1β），IL-2，肿瘤坏死因子alpha（TNF-α），白介素3（IL-3），单核细胞集落刺激因子（M-CSF），粒细胞集落刺激因子（G-CSF），干细胞因子（SCF），白介素6（IL-6），白介素15（IL-15），以及Flt3配体。首选含有氨基酸和维生素，无/有适当量的血清/血浆或良定集合的激素，和足以支持抗原特异性T细胞扩增的RPMI1640，AIM-V，DMEM，MEM，alpha-MEM，F-12，X-Vivo15，和X-Vivo20。其中一种培养基的组成是，1升X-Vivo15（BioWhittaker）加50ml热灭活的人血清，20ml 1M Hepes，10ml 200mML-谷氨酸，加也可以不加100，000I.U.IL-2。有时还需要加脂质和/或蛋白，如加入1-5%人AB血清或混合的细胞因子。细胞也会适应其它的生长培养环境，如胎牛血清（FCS/FBS），不同浓度的血清或无血清培养液。例如无血清培养基加激素也适合培养APC前体细胞。培养基不一定要加入抗菌素来防止细菌的生长。常用抗菌素是青霉素，链霉素和庆大霉素单用或联用。培养过程中要定时添加新鲜培养液，给细胞提供足够的营养，包括GM-CSF，IL-4，IL-13，IL-15以及其它细胞因子。

5、抗原特异性T细胞的扩增

抗原特异性T细胞通过细胞表位的结合来重新刺激抗原特异性T细胞的增殖。一个改进：与抗原承载的APC接触后先用上述的方法分离抗原特异性T细胞。另外一个改进：抗原特异性T与抗原承载的APC共培养后，直接在APC存在的情况下扩增，无需分离。

一个特殊改进：用XCELLERATE^TM活化和扩增抗原特异性T细胞，而无需加入抗原或携带抗原的颗粒。相关技术是，提供活体内已受过刺激或激活的抗原特异性T细胞（记忆性T细胞）活化的第一信号，如CD3抗体，以及共刺激信号，如CD28抗体，把这两种试剂携带在同一界面，如顺磁微球。细胞培养过程中调整微球与细胞的比例，低比例有利于抗原特异性T细胞的扩增。微球与细胞的比例，如1：200，1：150，1：125，1：100，1：75，1：50，1：25，1：20，1：15，1：10，1：5或1：2.5都可以用于抗原特异性T细胞的扩增。这个技术的好处在于扩增抗原特异性T细胞时无需抗原的参与。

抗原特异性T细胞的扩增通常除了刺激信号，同时，细胞表面的一种辅助分子与相对应的配体结合。

一般来说，细胞表位的结合完成再刺激，如通过T细胞受体（TCR）/CD3复合体或CD2表面蛋白达到。市场有数种CD3单克隆抗体供选择，如BC3（XR-CD3；Fred Hutchinson Cancer Research Center，Seattle，Wash.），美国模式培养库（ATCC）提供的来自杂交瘤细胞的OKT3，以及单克隆抗体G19-4。通过CD2表面蛋白刺激需要使用至少2种CD2抗体，这2种抗体的选择包括T11.3抗体配合T11.1或者T11.2抗体（Meuer et al.Cell 36:897-906,1984）,9.6抗体配合9.1抗体（Yang et al.J.Immunol.137:1097-1100,1986）可以结合上述相同表位的其它抗体也可以应用。抗原，肽，蛋白，肽-MHC四聚体也可以达到再刺激的目的（参阅Altman,et al.Science 1996Oct.4;274(5284):94-96）,超级抗原，如葡萄球菌肠毒素A（SEA），葡萄球菌肠毒素B（SEB），中毒性休克毒素1（TSST-1），内毒素，以及不同的促细胞分裂素，包括但不仅限于植物血球凝集素（PHA），醋酸佛波豆蔻酯（PMA）以及离子霉素，脂多糖，促T细胞分裂素和IL-2。

固定在一个界面上的CD3抗体或CD2抗体，或结合了钙离子载体的蛋白激酶C激活物（如苔藓抑素）也可以刺激或再刺激抗原特异性T细胞。T细胞表面的共刺激辅助分子要与相对应的配体作用。例如，适当的培养条件下，CD3和CD28抗体刺激CD4⁺细胞增殖；CD3抗体和CD28抗体B-T3，XR-CD28(Diaclone,Besancon,France)刺激CD28⁺细胞增殖。（参阅Berg et al.,Transplant Proc.30(8):3975-3977,1998;Haanen et al.,J.Exp.Med.190(9):1319-1328,1999;Garland et al.,J.Immunol.Meth.227(1-2):53-63,1999)。

要进一步再刺激抗原特异性T细胞，就要用相对应的配体刺激T细胞表面的共刺激分子，如CD28。常用的配体有CD28抗体或能与CD28交联的片段，或天然CD28配体。本专利使用的配体包括单克隆抗体9.3（IgG2_a）（Bristol-MyersSquibb，Princeton，N.J.），KOLT-2（IgG1），15E8（IgG1），248.23.2（IgM），克隆B-T3（XR-CD28）（Diaclone，Besancon，France）以及EX5.3D10（IgG2_a）（ATCC HB11373）。天然配体包括B7蛋白家族，如B7-1（CD80）和B7-2（CD86）（Freedman et al.,J.Immunol.137:3260-3267,1987;Freeman et al.,J.Immunol.143:2714-2722,1989;Freeman et al.,J.Exp.Med.174:625-631,1991;Freeman et al.,Science 262:909-911,1993;Azuma et al.,Nature366:76-79,1993;Freeman et al,J.Exp.Med.178:2185-2192,1993）。

进一步改进：通过刺激T细胞的其它结构蛋白促进T细胞的活化，例如，天然配体ICAM-1与T细胞整合素LFA-1结合；很晚期抗原4（VLA-4）与另外一个可作为共刺激因子的细胞表面分子VCAM-1结合（CD106）结合增进T细胞的活化。活化的T细胞表面表达的共刺激受体4-1BB（CD137）与NKG2D结合扩展T细胞介导的免疫反应。特别需要提的是，同时刺激两个以上（任何两个）这些共刺激因子有助于实现T细胞扩增的预期目标。

另外，其它的无论是天然的还是用化学或基因重组技术合成的配体还包括，但不仅限于，其它抗体或片段，肽，多肽，生长因子，细胞因子，趋化因子，糖肽，可溶性受体，糖皮质激素，激素，促细胞分裂剂，如PHA，或其它超级抗原。

可以用不同的方法提供T细胞激活的初始信号和共刺激信号。例如，提供信号的每个试剂可以溶解在液体中或链接在一个界面上。如果是链接在界面上，初始信号和共刺激信号刺激剂就需要以不同的方式（顺式和反式）链接在同一界面。或一个试剂溶解在液体中，另一个链接在界面。一个改进：共刺激信号结合在细胞表面，而初始信号试剂溶于液体中或链接在界面。另外改进：两种试剂在液体中，另外改进：可溶性试剂溶解在液体中，然后交联到一个界面，如表达Fc受体的细胞或可与其结合的抗体或其它因子。优先改进：把两种试剂固定在微球表面，或是同一微珠（cis）或不同微珠（trans）。例如，提供初始活化信号的试剂用CD3抗体，提供共刺激信号的试剂是CD28抗体；两种试剂以相同的分子量固定在一个界面，如微球表面。一个改进：两个抗体以1：1的比例结合在微球表面用于扩增和培养CD4⁺细胞。

本专利的重要发现之一：降低微球上CD3抗体与CD28抗体的比例增进T细胞，包括抗原特异性T细胞在内的扩增。结合在微球上的CD3：CD28抗体的最佳的比例是通过一系列不同比例与1：1比较它们的扩增效率后得出来的。特殊改进：与1：1比较，扩增数量增加0.5至大约3倍，结合微球的CD3:CD28抗体比例从100：1至1：100之间比较。进一步地：微球上的CD28抗体多于CD3抗体，即CD3:CD28小于1；进一步地：微球上的CD28抗体与CD3抗体的比例大于2：1。优选地：微球上的CD3抗体与CD28抗体的比例是1：100；更优选地：微球上CD3抗体与CD28抗体的比例分别是1：75，1：50，1：30，1：10，1：3以及3：1。

用于刺激T细胞的微球与细胞的比例从1：500至500：1不等，根据微球大小与靶细胞的关系而定。因为微球小结合的细胞数量就少，微球大结合细胞的数量就多。进一步地：微球与细胞的比例从1：100到100：1之间。优选地：选择1：9到9：1之间用于刺激T细胞。如上所述，能刺激T细胞扩增的连接在微球表面的CD3与CD28抗体的比例可以不同，但是，改进后的比例是1：150或更低。优先考虑的比例是：1：150，1：100，1：75，1：50，1：40，1：30，1：25，1：20，1：15，1：20，1：15，1：10，1：9，1：8，1：7，1：6，1：5，1：4，1：3，1：2.5，1：2，1：1，2：1，3：1，4：1，5：1，6：1，7：1，8：1，9：1，10：1，15：1和20：1。一个改进：微球与细胞的比例是1：1或以下。一个特别改进：首选1：2.5或1：5。进一步改进：微球与细胞的比例在刺激过程中的不同时间调整，例如，其中一个改进：第一天微球与细胞的比例从1：5，1：2.5，1：1至10：1，接着根据细胞计数每天或每隔一天加入微球，使微球与细胞的终比例从1：1，1：5，1：20，1：25，1：50或1：100。特殊一个改进：第一天刺激的微球与细胞的比例是1：2.5，1：5或1：1，第三天和第五天调整为1：5。进一步改进：第一天微球与细胞的比例是1：2.5，1：5，或1：1，第五、七、九天调整到1：10，1：20，1：25，1：50或1：100。另一个改进：第一天，微球以1：1的比例加入细胞内，第三和第五天以1：5的比例加入。另一个改进：第一天微球与细胞的比例是2：1，第三和第五天调整到1：10。另一个改进：每天或隔天加入微球使第一天微球与细胞的比例是1：1，第三和第五天的比例是1：10。

专利的一个重大发现：微球与细胞的比例不同导致抗原特异性T细胞的扩增结果也不一样。特别是，改变微球与细胞的比例可以选择性扩增或抑制抗原特异性T细胞。一个改进：选择微球与细胞的特殊比例抑制抗原特异性T细胞增殖。另一个改进：选择微球与细胞的特殊比例促进抗原特异性T细胞的扩增。例如，选择微球与细胞的比例1：100，1：50，1：25，1：5或1：2.5用于扩增抗原特异性T细胞。而且，在细胞培养的不同时间（如第五、七、九天）加入很低比例的微球（1：10，1：25，1：50，1：100）可以提高甚至促进记忆性细胞的扩增。微球与细胞开始时的比例是1：5或1：2.5，第五和第七天把比例调至1：10，1：25直至1：50和1：100似乎保留和加强记忆性细胞的进一步扩增，这种现象在单一刺激的时候是看不到的。因此，这里描述的微球与细胞比例和方法可以用来选择性地扩增或去除不同T细胞，应用于不同的免疫治疗。

注意：这里描述的微球与细胞比例适用于携带各种比例抗体的微球。例如，CD3抗体与CD28抗体以1：5至1：10的比例结合的微球可以用于微球与细胞比例介于1：5至1：10之间，而1：1的CD3与CD28比例的微球也可以用于1：5微球与细胞比例。因此，CD3与CD28抗体的比例从100：1至1：100之间的微球适用于任何微球与细胞比例在1：500至500：1之间。

T细胞激活12-14天后把它们分离出来，维持它们的激活状态。定期（如每天）检测T细胞的增殖率，例如观察T细胞的大小或用库尔特计数器测量T细胞的体积。静息T细胞平均直径大约是6.8μM，在刺激因子存在的情况下，第四天平均直径可以增加至12μM以上，大约第六天开始缩小。当T细胞的直径减小到大约8μM时，可以再一次刺激诱导进一步增殖。除此之外，还可以根据T细胞表面的活化分子表达，如CD154，CD54，CD25，CD137，CD134等监测T细胞的增殖率和确定再刺激的时间。

一个改进：用包被有CD3和CD28抗体的微球（CD28微球3倍于CD3微球）充分刺激（大约8-14天）使T细胞回到静息状态（低或无增殖状态）。去除微球后，洗涤T细胞，然后回输入患者体内。这样的T细胞表现记忆性，能及时对抗原作出反应，处于极佳的可诱导状态。无论是体外再刺激还是回输后体内对抗原的反应，活化的T细胞都稳定表达CD154，并增加细胞因子的合成。

进一步改进：细胞，如T细胞与包被试剂的微球结合，然后分离，接着培养细胞。或者：培养前，没有分离试剂包被的微球，而是与细胞一起培养。进一步改进：用外力使细胞和微球集中浓缩在一起，促使细胞表位结合，刺激细胞。

另一个改进：调整刺激剂，如包被在微球上的CD3/CD28抗体，与T细胞的培养时间来获得理想的T细胞表型。调整培养条件可以获得想要的细胞群，如辅助性T细胞（T_h）扩增，通常是指CD4⁺细胞而不是CD8⁺细胞（细胞毒或抑制性细胞，T_c），T_h细胞扩增能诱发抗肿瘤、抗病毒、抗细菌的效应器功能。CD4⁺细胞分泌很重要的免疫调节因子，如粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），CD40L以及IL-2。需要CD4介导的免疫应答时，应用本专利描述的培养方法，提高CD4与CD8细胞的比例特别有帮助。一方面，提高输入细胞中分泌GM-CSF或IL-2细胞的量，因为这些因子主要是CD4细胞分泌的。相反，需要提高γ干扰素水平时，就需要增加CD8⁺细胞的数量，应用这里描述的活化T细胞的方法，先分选CD8⁺细胞，再刺激或培养扩增。有时根据需要使用T_h1/T_h2细胞比例，或它们的上清液。有时还需要用到调节性T细胞。

为了有效分离不同抗原特异性T细胞，细胞表位结合，诱导再次刺激的时间长短可能不同或有波动。例如，细胞的表达取决于扩增时间的长短和/或不同的刺激剂（如抗体或其片段，肽，多肽，MHC/肽多聚体，生长因子，细胞因子，趋化因子，糖肽，可溶性受体，糖皮质激素，激素，促细胞分裂素，如PHA，或其它超级抗原）。细胞表面标记的表达随时间而变，因此，控制培养时间和刺激剂的类型可以获得特殊的T细胞。根据细胞类型，应用相应的刺激剂和培养时间，从4周到1周不等，或更短的时间。改进：刺激和扩增6-2天，甚至更短的时间，如24小时或更短时间，最好4-6小时内完成。缩短刺激T细胞的时间，T细胞的数量可能不会大量增加，但这些健康且稳固的抗原特异性T细胞相当于活体T细胞池内的效应细胞能不断增殖。

一个改进：细胞混合培养数小时（大约3小时）至大约14天，或21天。另优选地：细胞与微球混合培养大约8天。更有选地：T细胞与微球共培养2-3天。细胞可能需要几次刺激，T细胞的培养时间可长达60天或更长。适当的T细胞培养系统应该是培养基（如基本必须培养基或RPMI 1640，X-vivo15（BioWhittaker））加上细胞活力和增殖因子，包括血清（胎牛或人血清），白介素-2（IL-2），胰岛素，γ-干扰素（INF-γ），IL-4，GM-CSF，IL-10，IL-12，TGF-β，TNF-α以及其它需要加入的细胞生长因子。其它细胞生长因子包括，但不限于，表面活性剂，人血浆蛋白和还原剂，如N-乙酰半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基包括RPMI1640，AIM-V，DMEM，MEM，α-MEM，F-12，X-Vivo15，和X-Vivo20加入氨基酸和维生素，无血清或适当量血清或血浆，或固定的几种激素和/或足以使T细胞生长和扩增的细胞因子。抗菌素只用于试验中的细胞培养，用于输入到体内的细胞培养不用抗菌素。细胞在37℃，100-120%的空气湿度以及5%CO₂的条件下培养。

一些改进：加入一定量的供给细胞加强活化和/或扩增抗原特异性T细胞的效果。供给细胞可以单用自体或异体的辐射后的外周血淋巴细胞或与EBV转化的B细胞系（自体或异体）同用，永生化或非永生化髓系单核细胞系，如巨噬细胞，树突状细胞，红细胞，B细胞，肿瘤细胞系，如U937，Jurkat，Daudi，MOLT-4，HUT，CEM，Colo205，HTB-13和HTB-70。供给细胞不一定用人源细胞，只要有供给功能的，例如能支持原代T细胞和后来的抗原特异性T细胞的存活和生长，就可以用。

6、有益效果

肿瘤抗原特异性T细胞表达中央记忆性T细胞标记

CMV溶解物与Dynabead M-450混和，室温孵育1-2小时后洗涤一次，加入PBMC；数小时后APC吞噬携带CMV抗原的微球；72小时内，CMVpp65特异性CD8⁺T细胞表达中央记忆性T细胞标记，如图1所示。

肿瘤抗原特异性T细胞（试验组）与相应肿瘤细胞共培养时白介素2（IL-2）和伽玛干扰素（IFN-γ）分泌明显增高（与对照组比较），提示其抗肿瘤活性（表1示）。

表1：

肿瘤抗原特异性T细胞的肿瘤细胞毒作用。肿瘤细胞培养24小时后加入相应肿瘤特异性T细胞，24小时后在标记区域观察肿瘤细胞的存活状态，如图2所示。

一个非小细胞肺癌病人治疗后的各免疫指标以及临床表现的观察，参见表二及图3至图5。

表二：治疗前后血浆白介素水平的变化

白细胞介素	治疗前(ng/ml)	治疗后(ng/ml)
			IFN-γ	18.2	117.1
IL-2	280	321
			IL-12	121.1	201.9
IL-4	71.9	51.8
			IL-10	10.3	2.2

Claims (10)

1.一种肿瘤抗原特异性T细胞的获取方法，包括产生和扩增方法，其特征在于，所述产生方法是将含有抗原提呈细胞（APC）的第一群细胞与包被有抗原的界面接触，让APC摄取包被在界面上的抗原；再将含有T细胞的第二群细胞与摄取了抗原的第一群细胞共培养，产生抗原特异性T细胞。

2.根据权利要求1所述的肿瘤抗原特异性T细胞的获取方法，其特征在于，所述APC直接与抗原特异性T细胞接触，与抗原特异性T细胞直接接触的APC是用磁场分离。

3.根据权利要求1或2所述的肿瘤抗原特异性T细胞的获取方法，其特征在于，所述扩增方法是将抗原特异性T细胞植入包被有第一试剂的培养界面扩增，再转入包被有第二试剂的培养界面；所述第一试剂和第二试剂是相同或者不同的抗体或抗体片段；所述界面为磁珠、脂质或细胞。

4.根据权利要求3所述的肿瘤抗原特异性T细胞的获取方法，其特征在于，界面的空间与T细胞的比例选择1：2，1：2.5，1：5，1：25，1：50，1：75，1：100。

5.根据权利要求4所述的肿瘤抗原特异性T细胞的获取方法，其特征在于，所述第一试剂是CD3或CD2抗体或其片段，所述第二试剂用CD28抗体或其片段。

6.根据权利要求5所述的肿瘤抗原特异性T细胞的获取方法，其特征在于，T细胞的扩增时加入促细胞分裂素、白介素15、天然CD137蛋白、CD137抗体、NKG2D抗体或/和天然NKG2D蛋白。

7.根据权利要求6所述的肿瘤抗原特异性T细胞的获取方法，其特征在于，所述促细胞分裂素选用植物血球凝集素（PHA），豆蔻酸-佛波醇-乙酸酯（PMA）和离子素，脂多糖（LPS），以及超级抗原。

8.根据权利要求1所述的肿瘤抗原特异性T细胞的获取方法，其特征在于，所述抗原为抗体/抗原复合物、肿瘤或病毒感染的细胞、固定的肿瘤或病毒感染的细胞、高温灭活的肿瘤或病毒感染的细胞、肿瘤细胞裂解物、不溶解的细胞碎片、细胞凋亡体、坏死细胞、灭活的肿瘤细胞、放射灭活的异体细胞、天然或合成的碳水化合物、脂蛋白、脂多糖、以及基因改造的细胞。

9.根据权利要求8所述的肿瘤抗原特异性T细胞的获取方法，其特征在于，APC来源于外周血单个核细胞采集，淋巴结，扁桃体，活检组织，肿瘤组织，脾脏，骨髓，脐血，CD34+细胞或单核细胞。

10.根据权利要求1所述的肿瘤抗原特异性T细胞的获取方法，其特征在于，抗原是通过抗体/配体的相互作用吸附或者通过化学反应的方法包被到载体的界面上。

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