JP2002535983A - Ｃｄ８６分子を発現するヒトエフェクターｔリンパ球およびその治療的使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、機能的なＣＤ８６分子を発現するＴ細胞、該Ｔ細胞のほぼ均一な集団の調製方法、ならびに治療および診断におけるその適用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、機能的なＣＤ８６分子を発現するリンパ球、これらのリンパ球の実
質的に均一な集団を調製するための方法、ならびに治療および診断におけるその
使用に関する。

【０００２】 Ｔリンパ球は、免疫応答を調節するにあたり重要な役割を果たし、そしてまた
、記憶免疫応答の維持においても重要な役割を果たす。Ｔリンパ球が産生する可
溶性メディエーターならびにＴリンパ球が発現する表面分子の特徴によって、そ
れらは多くのエフェクター免疫細胞、例えば、Ｂリンパ球、単球、マクロファー
ジ、および樹状細胞（イニシエーターおよびレギュレーターとしての役割）など
の活性化状態を制御し、そして外的病原因子（例えば、ウイルスおよび細菌など
）または腫瘍細胞（直接的なエフェクターの役割）の破壊に直接貢献する。Ｔリ
ンパ球は、機能特性を獲得するために活性化される必要がある（Ｓｗａｉｎ Ｓ
Ｌら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．（１９９６）１５０，１４３−６７）。

【０００３】 細胞免疫治療とは、自己細胞がインビボでは獲得できない特定の生理学的特性
をそれらに与えるために、エキソビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）で改変された自己細胞
を患者に再注入することからなる治療である。例えば、癌または免疫抑制に罹患
した個体は、効果的なエフェクター応答を示さない。従来の細胞免疫治療のアプ
ローチは、リンパ球の増殖を誘発するため、ならびにＴリンパ球に細胞傷害特性
を与えるために、血液単核細胞（ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｔｅｄ ｃ
ｅｌｌ）（ＭＮＣ）の除去、ならびにインビトロでＭＮＣを刺激することからな
る。それらを再注入する前に、エキソビボでＭＮＣを刺激する利点によって、Ｔ
リンパ球アクチベータの全身注入に関連した毒性を回避することが可能となる。

【０００４】 細胞免疫治療に使用され得るエフェクターＴ細胞をエキソビボでつくり出すた
めの種々の方法が報告されている。この種のアプローチにおいて従来的に使用さ
れるサイトカインの一つはインターロイキン２（ＩＬ−２）であり、これは、Ｔ
リンパ球の増殖を促進すること、およびＴリンパ球に細胞傷害特性を獲得せしめ
ることで作用する（Ｍｕｌｅ ＪＪら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８４）２２５，１
４８７−９および特許ＷＯ ９１／４４４４）。他のＴリンパ球刺激剤、例えば
、サイトカイン類（例えば、ＩＬ−４またはＩＬ−７）、または表面分子に向け
られた活性化抗体（例えば、ＣＤ３分子（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ Ｕら、Ｅｕｒ
Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８４）１４、３２５−８）、ＣＤ２（Ｖａｎ Ｌｉ
ｅｒ ＲＡら、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８８）１８，１６７−７２
および欧州特許４０ ９６ ５５）および／またはＣＤ２８分子（Ｇｒｅｅｎｆ
ｉｅｌｄ ＥＡ、ら、Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９８）１８、
３８９−４１８）は、これらの細胞をつくり出すために、単独か、または組み合
わせて使用される。

【０００５】 しかし、インビトロでのＭＮＣの活性化は、Ｔリンパ球の均一な集団（すべて
が十分に決定された表現型および機能を有する）の拡大を生じるのではなく、活
性化、表現型および機能特性の程度が異なる集団のセットを生じる。その産生に
再現性があり、その表現型の特徴が公知であり、容易に同定可能であり、そして
同時に幾つかのエフェクター機能（すなわち、細胞傷害特性以外の、免疫抑制と
いう事象において有益な免疫学的特性）を有するであろう均一な集団をつくりだ
すことは、かなりの進歩を構成する。これによって、（ｉ）エキソビボでの刺激
手順を最適化し、（ｉｉ）調製物の組成を個体に対してエキソビボで評価し、（
ｉｉｉ）目的の細胞のみを患者に注入し、そしてそれによって、（ｉｖ）治療の
有効性を増大させることが可能となる。

【０００６】 最近まで、Ｔリンパ球の分集団の機能特性と表現型との間の関係は、完全に解
明されていなかった。ＣＤ４型Ｔリンパ球は、クラスＩＩの主要組織適合性複合
体（ＭＨＣ ＩＩ）と一緒になって抗原提示細胞（ＡｇＰＣ）により提示された
抗原フラグメントを認識し、そして「ヘルパー」特性（すなわち、Ｂリンパ球お
よび細胞傷害性Ｔリンパ球がその機能特性を獲得することを補助し得る特性）を
有すると考えられる。ＣＤ８型リンパ球は、ＭＨＣ Ｉと一緒になってＡｇＰＣ
により提示された抗原フラグメントを認識し、そして一般的に、細胞傷害特性を
有すると考えられる。さらに、幾つかの分子、例えば、ＣＤ２５およびＣＤ５４
分子などの増加した発現が、活性化されたＴリンパ球を特徴付けることが明確に
立証されている（Ｓｗａｉｎ ＳＬら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ（１９９６）１
５０、１４３−６７）。抗原に遭遇していない、その抗原に対して特異的である
Ｔリンパ球は、ナイーブＴリンパ球と呼ばれ、そしてＣＤ４５ＲＡ分子の発現に
よって特徴付けられる。抗原とすでに遭遇した、その抗原に対して特異的である
Ｔリンパ球は、記憶Ｔリンパ球と呼ばれ、そしてＣＤ４５ＲＯ分子を発現する（
Ｓｗａｉｎ ＳＬら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．（１９９６）１５０、１４３−
６７）。

【０００７】 Ｔリンパ球を活性化するために必要なシグナルの強度および性質は、Ｔリンパ
球がナイーブＴリンパ球であるかまたは記憶Ｔリンパ球であるかによって変化す
る。正確に活性化され、そしてエフェクター細胞へと分化させるために、ナイー
ブＴリンパ球は、記憶Ｔリンパ球よりも多くの共刺激シグナルを受容しなければ
ならない。これらの共刺激シグナルはＡｇＰＣによって提供され、特に樹状細胞
によって提供される。共刺激シグナルの非存在下でこのリンパ球が抗原と遭遇す
ると、リンパ球はアネルギー性もしくは寛容となるか、あるいはアポトーシスに
よって死滅する。つまり、（組換え可溶性リガンドまたはこのリガンドを発現す
る細胞トランスフェクタントを用いて）Ｔリンパ球が発現する共刺激分子を介し
てＴリンパ球を活性化することに関する処置は、従って、例えば、癌において遭
遇した寛容の現象および非認識（ｉｇｎｏｒａｎｃｅ）の現象を処置するため（
Ｍｅｌｅｒｏ Ｉら、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．（１９９７）６０、２０３５−４１）
だけでなく、外的病原因子に対する免疫応答の効果を増加させるため（Ｋａｙｅ
ＰＭ、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ（１９９５）１６、４２３−７）の治療的
アプローチとして提案されている。

【０００８】 多くの公知の共刺激分子の中でも、ＣＤ８６分子は非常に強力な共刺激特性を
有する。ＣＤ８６分子は、多くのＡｇＰＣの表面において構成的に発現される（
Ｌｅｎｓｃｈｏｗ ＤＪら、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９６）１
４、２３３−５８）。ＣＤ８６分子は、２つのリガンドを有する：（１）ＣＤ２
８分子、これはＴリンパ球によって構成的に発現され、そしてＣＤ８６分子（ま
たはＣＤ８０分子）にライゲーションした後、Ｔリンパ球に対して強力な活性化
シグナルを発生する、ならびに（２）ＣＴＬＡ−４分子、これは活性化されたＴ
リンパ球によってのみ発現され、そしてＣＤ８６分子（またはＣＤ８０分子）に
ライゲーションした後、阻害シグナルを発生する。従って、Ｔリンパ球の機能活
性は、それぞれＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４分子により媒介される活性化シグナ
ルならびに阻害シグナルによって部分的に調節される。最近、ＣＤ８６分子の発
現および役割がＴリンパ球の表面において例証された。Ｔリンパ球でのその発現
の調節はよく理解されていないままであり、そしてヒトおよびマウスにおいて異
なるようである。ネズミＴリンパ球は、自然発生的に機能型のＣＤ８６を発現す
る（Ｈａｋａｍａｄａ−Ｔａｇｕｃｈｉ Ｒら、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．
（１９９８）２８、８６５−７３）のに対して、血液から新たに単離したヒトＴ
リンパ球はこれを発現しない。その生物学的活性は評価されていないが、ＣＤ８
６分子は、インビトロでのＭＮＣの活性化の後のヒトＴリンパ球において記載さ
れている（Ａｚｕｍａ Ｍら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９３）３６６、７６−９）。
ＣＤ８６分子の生物学的活性をヒトＴ細胞において評価した唯一の研究は、ヒト
Ｔリンパ球クローンが使用するものであり、そして、これらの細胞によって発現
されたＣＤ８６分子が（ＡｇＰＣによって発現されたＣＤ８６分子と比較して）
低グリコシル化されていて、そして不活性であることが報告されている（Ｈｏｌ
ｌｓｂｅｒｇ Ｐら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９７）１５９、４７９９−８
０５）。

【０００９】 本発明は、機能的なＣＤ８６分子の発現によって、また、細胞傷害特性および
免疫刺激特性ならびに特に共刺激特性によっても特徴付けられる、ポリクローナ
ルヒトＴリンパ球の新規で実質的に均一な集団に関する。

【００１０】 共刺激特性は、ＣＤ８６分子の発現によって部分的にのみ媒介され、多くの他
の共刺激分子は、これらの細胞上で非常に有意なレベルで、または選択的に発現
される。

【００１１】 現在、免疫治療において、特に、癌科学（ｃａｎｃｅｒｏｌｏｇｙ）において
、共刺激分子が担い得る必須な役割に次第に大きく関心が寄せられるようになっ
ている。それ故、任意のトランスフェクションまたは改変の非存在下で、多くの
共刺激分子、特に機能的なＣＤ８６分子を構成的に発現するこれらのＴリンパ球
の使用は、極めて重要な寄与であるようである。

【００１２】 本質的に、インビトロでのＭＮＣの刺激の後に共通して生じる細胞傷害特性に
加えて、本発明において特許請求されるようなＴリンパ球は、共刺激特性および
免疫刺激特性をともに示し、これらは、ＡｇＰＣによって一般的に導入されない
特性である。これが、機能的なＣＤ８６分子によって部分的に媒介された共刺激
特性を有するヒトＴリンパ球が記載された最初である。

【００１３】 この集団は、癌、感染疾患および免疫不全の治療において、ならびにワクチン
学（ｖａｃｃｉｎｏｌｏｇｙ）の分野における細胞免疫治療で特に使用され得る
。

【００１４】 本発明はまた、免疫応答に関与する新規なリンパ球分子の供給源としての、Ｃ
Ｄ８６分子を発現するＴリンパ球に関する。

【００１５】 本発明はまた、血液または組織内で、特に抗ＣＤ８６抗体を使用し、機能的な
ＣＤ８６分子を発現するＴリンパ球を検出することによって免疫異常を診断する
ための方法に関する。この診断によって、例えば、先天的な原因の深刻な免疫不
全（例えば、オーエン症候群（Ｏｗｅｎ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ））、（関節炎
型の）自己免疫疾患、ウイルス感染（ＣＭＶおよびＨＩＶ）または潜在的な細菌
感染が明らかとなるであろう。

【００１６】 本発明は、また、治療的組成物に関し、これらの組成物は、機能的なＣＤ８６
分子を発現する、Ｔリンパ球、または実質的に均一なヒトＴリンパ球の集団を少
なくとも含むことを特徴とする。

【００１７】 得られたリンパ球または細胞集団は、先天性、後天性、または病気に起因する
免疫不全の治療を特に意図した医薬品を調製するために使用され得る。これは、
例えば、腫瘍または病原体に対する免疫応答が存在しないか、あるいは欠失して
いる患者の治療に特に関し得る。本発明において特許請求されるような産物は、
特に、以下の治療を意図した医薬品を調製するために使用され得る： − 微生物疾患（移植に関する特定の問題を含むウイルス、細菌、寄生生物
、酵母）および、 − 癌、特に、ＨＩＶ−陽性および／または、骨髄腫、リンパ腫、白血病、
黒色腫あるいは例えば、腎臓、脳、前立腺、直腸、すい臓、卵巣、または肺の癌
に罹患した個体。

【００１８】 本発明において特許請求されるようなＣＤ８６＋ Ｔリンパ球、およびＣＤ８
６＋ Ｔリンパ球の集団はまた、ワクチン学においてアジュバントまたは免疫賦
活剤としても使用され得、これは治療ワクチンを製造するために、免疫抗原およ
び／または、例えば、細菌型、ウイルス型またはＤＮＡ型の他の化合物と組み合
わされる。

【００１９】 本発明において特許請求されるような、ＣＤ８６＋ リンパ球、およびＣＤ８
６＋ Ｔリンパ球を含む集団は、さらに、敗血症性ショックを治療する場合に使
用され得る。

【００２０】 本発明において特許請求されるような方法を使用し、ＣＤ８６＋ Ｔリンパ球
のこれらの集団が自己注入において使用され得ることに注目することは重要であ
る。すなわち、患者からの細胞、ＭＮＣまたはリンパ球単離物から出発し、本方
法を実施し、次いで、それらを刺激後に再注入することが可能である。これは、
勿論、あり得る汚染および抗原性の任意の現象に関連したいかなる危険をも除外
するという非常に大きな利点を示す。

【００２１】 勿論、本発明で特許請求されるような治療的組成物は、特定の病状を治療する
際に有用な他の要素を包含し得る：これらは、例えば、化学的分子、医薬品、あ
るいは生物学的分子、細菌またはウイルスの遺伝的に改変された生物であっても
良く、その遺伝子または抗原の使用が所望され得る。

【００２２】 本発明において特許請求されるようなＴリンパ球またはＴリンパ球の集団を使
用することもまた可能であり、それらが生物学的抽出物または生物学的誘導体に
よってパルスされていることを特徴とする：この場合、これは、細胞または微生
物、あるいは、例えば、ペプチド、タンパク質、糖脂質、グリコペプチドおよび
リポペプチド型の誘導体、ならびに、特に、混合物、抗原の混合物もまた含み得
；この場合、抗原提示プロセスの間に必要とされる共刺激特性を有する、本発明
において特許請求されるようなリンパ球の特性が特に使用される。

【００２３】 最後に、本発明において特許請求されるようなＴリンパ球の集団は、例えば、
幾つかのこれらの産物の発現および／またはスクリーニングを促進するために、
ＤＮＡあるいは化学的または免疫学的な分子とともにか、あるいはそれに結合さ
せてトランスフェクトされ得る。

【００２４】 本発明において特許請求されるような集団の特性は、本明細書中で以下、実施
例の前に分析されるであろう。

【００２５】 （１．産生方法） 本発明は、また、機能的なＣＤ８６分子を発現するヒトＴリンパ球の実質的に
均一な集団を産生するための方法に関し、ヒトＴリンパ球を含むサンプルを用い
て、上記リンパ球の少なくとも２回の連続的な刺激が実施されることを特徴とす
る。「機能的なＣＤ８６分子を発現するヒトＴリンパ球の実質的に均一な集団」
との表現は、７０％より多く、好ましくは９０％より多くのＣＤ８６＋ Ｔ細胞
を含む集団を意味することを意図する。

【００２６】 確実にＴリンパ球を増殖するアクチベーターおよび化合物を使用し、刺激を実
施する。アクチベーターは、抗ＣＤ２、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８活性化抗体お
よびマイトジェンまたはこれらの化合物の混合物から好ましくは選択され；また
、Ｔリンパ球増殖を刺激する化合物、特に、例えば、インターロイキンＩＬ−２
（Ｍｉｅｒ ＪＷら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８
０）７７、６１３４−６１３８）；Ｎｏｒｔｈｏｆｆら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
（１９８０）１２５、１８２３−１８２８；Ｍｉｅｒ ＪＷら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．（１９８２）１２８，１１２２−７）、ＩＬ−４、ＩＬ−７が使用される
。

【００２７】 好ましい刺激混合物において以下のものが挙げられる： − 抗ＣＤ３抗体およびＩＬ−２の混合物、ならびに − 抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ３抗体、およびＩＬ−２の混合物。

【００２８】 「連続的な刺激」とう用語は、少なくとも４日間、そして好ましくは少なくと
も７日間の間隔を空けて、新たな培地中で細胞培養物に与えられる２回の刺激を
意味することを意図する；一般に、この間隔は約１〜３週間であり、そしてこれ
は、特に、刺激の強度に依存する。

【００２９】 本発明は、従って、２回の刺激の間隔が少なくとも４日間、好ましくは７日
間であることを特徴とする方法に関する。

【００３０】 各刺激の後、Ｔリンパ球増殖を刺激するサイトカインを、好ましくは、定期的
に、例えば、２日毎に添加する。

【００３１】 同様に、第二の刺激の後、好ましくは、数日間（例えば４日より長く、一般的
には７日より長く）を経て、ＣＤ８６分子を発現するＴリンパ球の実質的に均一
な集団が産生されるであろう。

【００３２】 Ｔリンパ球は、当業者に公知の任意の適切な培地を用いて培養され得る；この
ような培地の例であるＲＰＭＩ１６４０タイプを、特に、実施例で用いる。仔ウ
シ血清を、自己ヒト血清、または動物もしくはヒト起源のタンパク質を含まない
適切な培地と交換しても良い。

【００３３】 使用される刺激剤の量は、使用される薬剤に依存して変化する；例えば、抗体
は、１０〜１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、１０〜５００ｎｇ／ｍｌの濃度で
好ましく使用されるであろうし、；サイトカインに関しては、これらは１０〜１
０００Ｕ／ｍｌ、特に、１００〜５００Ｕ／ｍｌのオーダーの濃度で使用される
。

【００３４】 本発明において特許請求されるような方法では、Ｔリンパ球を含むサンプルは
、好ましくは、血液単核細胞（ＭＮＣ）サンプルまたはＭＮＣ由来のＴリンパ球
単離物のいずれかである。

【００３５】 ＣＤ−８６陽性Ｔリンパ球の実質的に均一な集団をすみやかにつくり出すため
に、以下の２つのプロトコールのうち１つが使用されるであろう： − 血球を白血球搬出法によって末梢血から移出し、そしてＭＮＣをＦｉｃ
ｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ勾配上の遠心分離によって単離する（実施例１に詳述さ
れる通り）。ＭＮＣ（１０⁶細胞／ｍｌ）を実施例１に記載される培養培地（仔
ウシ血清が自己ヒト血清あるいは動物またはヒト起源のタンパク質を含まない適
切な培地と交換され得ることが知られている）中で、例えば、２００ｎｇ／ｍｌ
の抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体ＯＫＴ３（Ｋｕｎｇ Ｐら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
（１９７９）２０６，３４７−３４９；Ｔａｘ，ＷＭＪＭら、Ｎａｔｕｒｅ（１
９８３）３０４，４４５−４４７） ＋ ２００Ｕ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−２
の量で刺激する。２日毎に、組換えヒトＩＬ２を例えば２００Ｕ／ｍｌ添加する
。７日目から（実施例１に記載されるように、２１日目においても）、例えば、
２００ｎｇ／ｍｌ 抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体ＯＫＴ３ ＋ ２００Ｕ／
ｍｌ ＩＬ−２の量で第二の刺激を実施する。２日毎に、組換えヒトＩＬ−２を
例えば２００Ｕ／ｍｌ添加する。

【００３６】 − 血球を白血球搬出法によって末梢血から移出し、そしてＭＮＣをＦｉｃ
ｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ勾配上の遠心分離によって単離する（実施例１に詳述さ
れる通り）。Ｔリンパ球をＭＮＣから、ヒツジ赤血球とのロゼッティング（ｒｏ
ｓｅｔｔｉｎｇ）の技術を使用して単離する（実施例３に詳述される通り）。Ｔ
リンパ球（１０⁶細胞／ｍｌ）を、例えば、２００ｎｇ／ｍｌの量のＯＫＴ３抗
体 ＋ ２００Ｕ／ｍｌの量の組換えヒトＩＬ−２の存在下で、抗ヒトＣＤ２８
モノクローナル抗体（２０μｇ／ｍｌの濃度で培養表面上に予め吸着させておく
）（Ｍａｒｔｉｎ ＰＪら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８６）１３６，３２８
２−７；Ｎｕｎｅｓ Ｊら、Ｉｎｔ．Ｉｍｕｎｏｌ．（１９９３）５，３１１−
５）を含む、実施例１に記載される培養培地（仔ウシ血清は自己ヒト血清、ある
いは動物またはヒト起源のタンパク質を含まない適切な培地で置換し得るとの知
見により）中で刺激する。２日毎に、組換えヒトＩＬ−２を、例えば２００Ｕ／
ｍｌ添加する。７日目から、例えば、２００ｎｇ／ｍｌの量のＯＫＴ３抗体 ＋
２００Ｕ／ｍｌの量のＩＬ―２を用いて第二の刺激を実施する。２日毎に、組
換えヒトＩＬ−２を、例えば２００Ｕ／ｍｌ添加する。

【００３７】 一般的に、第二の刺激がＣＤ８６＋ Ｔリンパ球を本質的に含む均一な集団を
得るために常に必要であることに留意すべきである。詳細には、ＣＤ８６＋ リ
ンパ球の割合は、経時的に変化する：第一の刺激の後、これらの細胞が出現し、
増殖し、次いで、再刺激の非存在下では消滅する。実施例１に示されるデータは
、ＩＬ−２の存在下で活性化抗ＣＤ３抗体を用いてＭＮＣを刺激した後、Ｔリン
パ球上のＣＤ８６分子の発生、およびＣＤ８６分子の発現の動態（ｋｉｎｅｔｉ
ｃｓ）を示す（図１）。

【００３８】 プロトコール１または２のいずれを使用しても、本発明において特許請求され
るような生物学的特性を有するＣＤ８６＋ Ｔ細胞を単離するための２つのアプ
ローチが、提案され得る。

【００３９】 従って、上記のようなプロトコール１および２を実施することが可能である。
大多数の個体で、全てのリンパ球が第二の刺激の１週間後にＣＤ８６分子を発現
する。もしそうでなければ、細胞を、例えば、２００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２ととも
にさらに２〜４日間培養してＣＤ８６分子を完全に発現するＴ細胞の集団を得る
。

【００４０】 本発明は、一般的に、ＣＤ８６＋ Ｔリンパ球に関し、このＣＤ８６＋ Ｔリ
ンパ球が、特に、不完全な方法でプロトコール１および２を実施することによっ
て、すなわち、（抗ＣＤ２８抗体の存在下または非存在下で）抗ＣＤ３抗体 ＋
ＩＬ−２を用いた第一の刺激のみを実施することによって、得られ得ることを
想起すべきである。この場合、少なくとも７日間培養した後に、全ての細胞がＣ
Ｄ８６分子を発現しているわけではないので、ＣＤ８６＋ 細胞は、細胞選別フ
ローサイトメーター（ｃｅｌｌ−ｓｏｒｔｉｎｇ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅ
ｒ）を使用して精製され得る。ＣＤ８６陰性細胞およびＣＤ８６陽性細胞は、Ｈ
ＬＡ−Ｄｒ分子の発現レベルに基づいて単離される。ＨＬＡ−Ｄｒ分子の発現レ
ベルは、ＣＤ８６＋細胞上よりも、ＣＤ８６−細胞上の方が低い（実施例３、表
Ｉおよび図３を参照のこと）。この過程の場合、ＣＤ８６＋ Ｔリンパ球の均一
な集団の産生は、より労力を要するであろうが、達成され得る。

【００４１】 使用されるプロトコールは、例えば、抗ＣＤ３抗体およびインターロイキン２
（実施例１および図１）または抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ３抗体およびインターロ
イキン２などの性質の異なる少なくとも２つの刺激剤を共同して用いる少なくと
も２回の一連の刺激の後にのみ、ヒトＣＤ８６＋ Ｔリンパ球からなる実質的に
均一な集団がつくり出されることを示す。

【００４２】 本発明はまた、ヒトＣＤ８６＋ Ｔリンパ球の実質的に均一な集団に関し、例
えば、これらは特に上記の方法を使用して得られ得るが、他の方法を使用しても
、特に単回刺激および細胞選別後に得られ得る。

【００４３】 （２．ＣＤ８６＋ Ｔリンパ球によって発現される表面分子） 本発明において特許請求されるようなリンパ球は、以下の分子のうち少なくと
も一つ：ＣＤ２５、ＣＤ５４およびＣＤ８０を安定な様式で発現し、以下の分子
のうち少なくとも一つ：ＣＤ３０、ＣＤ４０−ＬおよびＣＤ７０を一時的な様式
で発現する。ＣＤ８６分子は、記憶ヒトＴリンパ球およびエフェクターヒトＴリ
ンパ球のこの新規な集団を特徴付けるための参照マーカーを構成する。

【００４４】 発生したＴリンパ球の集団のフローサイトメトリーによる表現型の分析は、こ
れらの細胞が記憶エフェクター細胞の表現型を有することを示す（Ｓｗａｉｎ
ＳＬら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ（１９９６）１５０，１４３−６７）（実施例
２および図２）。本発明において特許請求されるようなＴリンパ球は、ＣＤ２、
ＣＤ３、ＣＤ４またはＣＤ８分子、ならびに、特筆すべきは、ＣＤ８６分子を発
現する。これらは、特に、以下の膜結合分子を発現する：ＣＤ２５（インターロ
イキン２レセプターのα鎖）、ＣＤ４５ＲＯ（記憶Ｔリンパ球によって選択的に
発現される分子）（実施例２および図２）、クラスＩの主要な組織適合性複合体
（ＭＨＣ Ｉ）、ＭＨＣ ＩＩ、ＣＤ５４およびＣＤ８０（実施例３および表Ｉ
）。これらは、一時的にではあるが、選択的に、ＣＤ３０分子、ＣＤ４０分子に
対するリガンド（ＣＤ４０−Ｌ）およびＣＤ７０分子を発現する（実施例３およ
び図３）。

【００４５】 多くの膜結合分子の発現は、（一回のみの刺激後に生ずる（実施例１を参照の
こと））同じ不均一な集団に含まれるＣＤ８６＋ Ｔリンパ球上とＣＤ８６−
Ｔリンパ球上とで異なる。

【００４６】 − ＣＤ８６分子は、ＣＤ４５ＲＯ分子を発現するＴリンパ球上にのみ出現
し（実施例２、図２を参照のこと）；ＣＤ４５ＲＯ分子は、記憶細胞を特徴付け
る（Ｓｗａｉｎ ＳＬら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．（１９９６）１５０，１４
３−６７）。

【００４７】 − ＣＤ２５、ＣＤ５４、ＣＤ８０およびＨＬＡ−Ｄｒ分子は、ＣＤ８６−
Ｔリンパ球上よりも、ＣＤ８６＋ Ｔリンパ球上で常により多く発現され（実
施例３、図３および表Ｉを参照のこと）；ＣＤ８６＋ 細胞上のＣＤ２５、Ｃ
Ｄ５４およびＨＬＡ−Ｄｒ分子の増大した発現は、それらがかなりの活性化状態
にあることを示す（Ｓｗａｉｎ ＳＬら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．（１９９６
）１５０，１４３−６７）。

【００４８】 − ＣＤ３０、ＣＤ４０−ＬおよびＣＤ７０分子の膜結合した発現は、実質
的に、ＣＤ８６＋ Ｔリンパ球に制限される（実施例３、図３および表Ｉ）。

【００４９】 （２．１．ＣＤ８６＋ Ｔリンパ球に共刺激特性を与える表面分子。） ＣＤ５４、ＣＤ７０、ＣＤ８０およびＣＤ８６共刺激分子は、ＣＤ８６＋ Ｔ
リンパ球上で増加した量で発現される。

【００５０】 共刺激分子の使用は、現在、一般に好まれる新規な治療アプローチであるらし
く、そして特に、（ｉ）抗癌免疫治療における使用（Ｌｉｅｂｏｗｉｔｚ ＤＮ
ら、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｏｎｃｏｌ（１９９８）１０，５３３−４１）；（ｉ
ｉ）外因性微生物病原体に対する有効なＴリンパ球応答の確立を促進するための
使用（Ｋａｙｅ ＰＭ，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ（１９９５）１６，４２３
−７）；そして（ｉｉｉ）ワクチン学におけるアジュバントとしての使用（Ｃｈ
ａｍｂｅｒｌａｉｎ ＲＳら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９９６）５６，２８
３２−６）が提案されている。

【００５１】 これらの分子は、一般的に、ＡｇＰＣによって構成的に且つ高いレベルで発現
される。これらの主な役割は、ＡｇＰＣ−Ｔリンパ球の相互作用中に活性化共シ
グナル（ｃｏｓｉｇｎａｌ）をＴリンパ球に提供することである。これらの相互
作用は、抗原提示中のＴリンパ球の教育および活性化に必要である。

【００５２】 − ＣＤ５４分子は、強力な共刺激シグナルをＴリンパ球に形質導入するＬ
ＦＡ−１分子と結合する（Ｖａｎ Ｓｅｖｅｎｔｅｒ ＧＡら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ（１９９０）１４４，４５７９−８６）。

【００５３】 − 同様に、ＣＤ８０およびＣＤ８６分子が、Ｔリンパ球によって発現され
たそれらのリガンドＣＤ２８に結合すると、ＣＤ２８−媒介共刺激シグナルによ
って、Ｔリンパ球の効果的な活性化（増殖における増加によって具現化される）
およびＩＬ−２産生が可能となる。

【００５４】 − ＣＤ２７分子（これは不活性Ｔリンパ球によって発現される）のそのリ
ガンド（これはＣＤ７０分子である）による結合は、リンフォカイン産生および
細胞増殖を促進する共刺激シグナルの発生を誘発する（Ｋｏｂａｔａ Ｔ、ら、
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５３，５４２２−３２）。

【００５５】 （２．２．ＣＤ８６＋ Ｔリンパ球に細胞傷害特性を与える表面分子） ＣＤ４０−Ｌ、ＣＤ７０、ＣＤ８０およびＣＤ８６分子は、ＣＤ８６＋ 細胞
によって発現される。これらによって、ＣＤ８６＋ Ｔリンパ球が細胞傷害特性
を獲得することが可能となる。詳細には、 − ＣＤ２７（そのリガンドは、ＣＤ７０分子である）を介したナチュラル
キラー（ＮＫ）細胞の活性化は、それらの細胞傷害活性を増加させる（Ｙａｎｇ
ＦＣら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９６）８８，２８９−９３）。 − ＣＤ４０−Ｌ分子もまた、細胞傷害応答の発達を促進し、これは、以下
の２つの機構を経由する： ａ．ＡｇＰＣによって発現されるＣＤ４０分子に結合すると、ＣＤ４０−Ｌ分
子は、ＡｇＰＣ（特に、樹状細胞に対して）を非常に強力に活性化するので、こ
れらの細胞は、ヘルパーＴリンパ球の非存在下で、ナイーブＴリンパ球に細胞傷
害活性を与え得る（Ｂｅｎｎｅｔ ＳＲら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８８）３９３，
４７８−８３）、 ｂ．ある特定の腫瘍細胞の表面に存在するＣＤ４０分子に結合すると、ＣＤ４
０−Ｌ分子は、アポトーシス死に対する腫瘍細胞の感受性を増大させることによ
って、および／または腫瘍細胞が特異的な細胞傷害性応答の発生を促進する共刺
激分子を発現するのを促進することによって、細胞傷害性リンパ球によるこれら
の細胞の拒絶を促進する（Ｄｉｌｌｏｏ Ｄら、Ｂｌｏｏｄ（１９９７）８０，
１９２７−３３）。

【００５６】 ＣＤ８０およびＣＤ８６分子は、細胞傷害性の抗ウイルス応答および抗腫瘍応
答を生じさせるのに不可欠である。この特定の活性は文献に何回も報告されてお
り、特に、免疫感作モデル−これらは特定の細胞傷害性Ｔリンパ球応答の誘発を
促進するので−において報告されている。ＣＤ８０分子は、ＮＫ細胞の細胞傷害
特性を増加させ（Ｙｅｈ ＫＹら、Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９５）１６
５，２１７−２４）、さらに、記憶細胞傷害性Ｔリンパ球の発生を増加させる（
Ｆｌｙｎｎ ＫおよびＭｕｌｌｂａｃｈｅｒ Ａ，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ
（１９９７）２７，４５６−６２）。ＣＤ８０分子をコードする遺伝子で細胞を
トランスフェクトすると、細胞傷害性Ｔリンパ球を生じる頻度が増加し、そして
また、ウイルスに感染した細胞に対する（Ｈｅ ＸＳら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ
Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９６）９３，７２７４−８：Ｒａｏ ＪＢら、
Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９６）１５６，３３５７−６５；Ｔｓｕｊｉ Ｔら、
Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９７）２７，７８２−７）、あるいは腫瘍細
胞に対する（Ｐｕｅｔｚｅｒ ＢＭら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ
ＵＳＡ（１９９７）９４，１０８８９−９４；Ｉｍｕｒｏ ＭＡら、Ｈｕｍ
Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ（１９９８）９，１３３５−４４；Ｌｅｏｎｇ ＣＣら、Ｅ
ｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９７）７１，４７６−８２）それらの機能活性
も増加する。同様にして、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６分子との間の相互作
用の後、ＣＤ２８分子を介するシグナルが、細胞傷害性Ｔリンパ球を生じさせる
ために必要である（Ａｚｕｍａ Ｍら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９３）１５０
，２０９１−１０１）；Ｌａｎｉｅｒ ＬＬら、Ｊ Ｉｍｕｎｏｌ（１９９５）
１５４，９７−１０５。ＣＤ８０および／またはＣＤ８６分子と、そのリガンド
ＣＤ２８との相互作用はまた、トキソプラズマ ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍ
ａ ｇｏｎｄｉｉ）寄生生物に対する有効な応答を生じるのにも関与している（
Ｈｕｎｔｅｒ ＣＡら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９７）１５８，２２８５−９
３）。

【００５７】 （２．３．ＣＤ８６＋ Ｔリンパ球に免疫刺激特性を与える表面分子。） ＣＤ４０−Ｌ分子は、それを発現する細胞に免疫刺激特性を与える。ＣＤ４０
分子に結合した後、ＣＤ４０−Ｌ分子は、単球の活性化を誘発し（Ｌａｍａｎ
ＪＤら、Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９６）１６，５９−１０８
）、また、樹状細胞の成熟（ＣＤ８３分子の発現の誘発）および樹状細胞の活性
化（ＩＬ−１２産生）をも誘発する。ＣＤ４０−Ｌ分子をコードするＤＮＡを注
入すると、免疫（体液性および細胞性）応答の有効性が増加し、そして感染性の
病原体に対して、または腫瘍チャレンジに対して防御免疫を誘導する（Ｇｕｒｕ
ｎａｔｈａｎら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９８）１６１，４５６３−７１）
。ＣＤ４０−ＬおよびＣＤ７０分子は、それらを発現する細胞にＢリンパ球を刺
激する能力（Ｂリンパ球についての「ヘルパー」特性）を与える。ＣＤ４０−Ｌ
は、そのリガンド、ＣＤ４０分子に結合すると、アイソタイプ交換（ｉｓｏｔｙ
ｐｉｃ ｃｏｍｍｕｔａｔｉｏｎ）のプロセス、免疫グロブリン産生のプロセス
、ならびにＢリンパ球の生存および増殖のプロセスに寄与する（Ｌａｍａｎ Ｊ
Ｄら、Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９６）１６，５９−１０８）
。同様のやり方で、ＣＤ７０分子は、Ｂ細胞の増殖、ＩｇＧおよびＩｇＭ産生な
らびに形質細胞への分化の調節に関与する（Ａｇｅｍａｔｓｕ Ｋら、Ｅｕｒ
Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９５）２５，２８２５−２９）。

【００５８】 （３．ＣＤ８６＋ Ｔリンパ球によって産生される分子） 本発明は、サイトカイン、ならびに、特に、上記のＣＤ８６＋ Ｔリンパ球の
集団によって産生されるリンフォカインに関し、ならびに本発明において特許請
求されるようなリンフォカインから得られた精製リンフォカインにも関する。

【００５９】 ＣＤ８６＋ Ｔ細胞によって産生されるサイトカインのプロファイルは、ＣＤ
８６− Ｔ細胞のプロファイルとは異なる（実施例４、図４ａおよび４ｂ）： − γインターフェロン（γＩＦＮ）などの幾つかのサイトカインは、ＣＤ８６
− Ｔリンパ球によってよりも、ＣＤ８６＋ Ｔリンパ球によって、かなり多く
の量で産生される（図４ａ）。γＩＦＮを産生する細胞の頻度は、ＣＤ８６−
Ｔリンパ球においてよりも、ＣＤ８６＋ Ｔリンパ球において高い（図４ｂ）；
− ＴＮＦαなどの他のサイトカインは、（１０〜１００ｎｇ／ｍｌのオーダー
の）ＣＤ８６＋ Ｔリンパ球だけでなく、ＣＤ８６− 細胞によっても非常に多
量に産生される（図４ｂ）。

【００６０】 これら２つのサイトカインは、ＣＤ８６＋ Ｔリンパ球の細胞傷害、免疫刺激
、および共刺激の活性に寄与する。

【００６１】 γＩＦＮは、病原体に対する抵抗性において、および抗腫瘍応答においてきわ
めて重要な役割を果たす。さらに、これは、強力な抗ウイルス特性を有し、マク
ロファージの殺菌活性を増大させ、そしてＭＨＣ ＩおよびＭＨＣ ＩＩ分子の
発現、従って、抗菌および抗腫瘍免疫応答の発達を促進する（Ｂｏｅｈｍ Ｕ，
Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９７）１５，７４９−９５）。γＩＦＮ
は、癌（例えば、腎臓癌）の治療において臨床的に使用されている。

【００６２】 ＴＮＦαは、そのレセプターの一つを発現する腫瘍細胞の死を誘発する（Ｈｉ
ｅｂｅｒ ＵおよびＨｅｉｍ ＭＥ、Ｏｎｏｃｏｌｏｇｙ（１９９４）５１，１
４２−５３）。これはまた、多くの細胞パートナー、例えば、内皮細胞、上皮細
胞および炎症反応のエフェクター細胞（例えば、単球、好中球および好酸球）な
どを活性化することで、炎症フェーズを開始する際に重要な役割を果たす。これ
らの細胞を活性化すると、ＴＮＦαは、また、抗菌応答のエフェクターフェーズ
にも寄与する（Ｃａｍｕｓｓｉ Ｇら、Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９９１
）２０２，３−１４）。

【００６３】 顕著に、ＣＤ８６＋ Ｔリンパ球が、エフェクター細胞（例えば、細胞傷害性
細胞）だけでなく、ＡｇＰＣによっても発現される一連の表面分子またはサイト
カインを付随的に提示することに注目することは重要である。このことがＣＤ８
６＋ Ｔリンパ球に、免疫応答を開始し、実施し（エフェクターフェーズ）、そ
して制御する能力を与える。これらの特性を以下に例示する。

【００６４】 （４．ＣＤ８６分子を発現するＴリンパ球の機能特性） 本発明は、ＣＤ８６分子を発現し、そして同時に以下の効果または機能を有す
るヒトＴリンパ球の実質的に均一な集団の創製を特許請求する：共刺激（すなわ
ち、このＴリンパ球は、ナイーブリンパ球応答の発生を促進する）、細胞傷害性
（すなわち、このＴリンパ球は、腫瘍細胞および／または病原性微生物の破壊を
確実にする）ならびに免疫刺激。ＣＤ８６＋ Ｔリンパ球のエフェクター特性を
、ＣＤ８６− Ｔ細胞の特性と比較した。

【００６５】 （４．１．ＣＤ８６＋ Ｔリンパ球は強力な共刺激特性を有する。） （ＣＤ４５ＲＡ分子を発現する）ナイーブＴリンパ球の活性化（増殖およびサ
イトカイン産生）には、少なくとも２つのシグナル：抗ＣＤ３抗体で擬態され得
る、Ｔレセプターを介する第一のシグナル、ならびに、ＣＤ２８分子などの共刺
激分子を介した第二のシグナルが必要である。２種類の実験を用いて、ＣＤ８６
＋ Ｔリンパ球の共刺激特性を具現化した。これらの２種類の実験において、ナ
イーブＴリンパ球を応答細胞として使用した。なぜなら、Ｔリンパ球が活性化さ
れるために最も多くの共刺激シグナルを受容する必要があるのは、活性化のこの
状態においてだからである。使用されるアッセイは以下の通りである： − 準最適用量の抗ＣＤ３活性化抗体（ＯＫＴ３）で刺激したナイーブＴリンパ
球の活性化。ナイーブＴリンパ球の活性化は、増殖の誘発（実施例５、図５ａ）
およびγＩＦＮの産生の誘発（実施例５、図５ｂ）によって具現化される。 − 異種ＣＤ８６＋ Ｔリンパ球の存在下でのナイーブＴリンパ球の活性化。こ
のアッセイ（混合リンパ球反応）においては、ナイーブＴリンパ球の増殖を測定
する（実施例５、図５ｃ）。

【００６６】 これらの結果は、ＣＤ８６＋ Ｔリンパ球がナイーブＴリンパ球を活性化し得
ることを示す。抗ＣＤ８６中和抗体を使用することにより、ヒトＴリンパ球によ
って発現されるＣＤ８６分子が生物学的に活性であり、そして、少なくとも部分
的に、共刺激活性に寄与することが明らかとなる。一方、ＣＤ８６− Ｔリンパ
球、あるいはまた、新たに単離したＴリンパ球は、共刺激活性を殆ど示さないか
、または全く示さない（実施例５、図５ａ、５ｂおよび５ｃ）。

【００６７】 ヒトＴリンパ球によって発現されたＣＤ８６分子の機能活性についてのこの実
証は、Ｔリンパ球によって発現されたＣＤ８６分子が、（ｉ）文献に報告された
ヌクレオチド配列と等しいヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋデータバンクにお
ける登録番号Ｕ０４３４３）を有し、さらに（ｉｉ）ＡｇＰＣによって発現され
るＣＤ８６分子のグリコシル化と同程度のグリコシル化をも有すること（Ａｚｕ
ｍａ Ｍら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９３）３６６、７６−９）を示す、相補的な実
験によって支持される（実施例６、図６）。

【００６８】 （４．２．ＣＤ８６＋ Ｔリンパ球は細胞傷害特性を有する。） ＩＬ−２でＴ−リンパ球を刺激すると、強力な細胞傷害特性を自発的に有する
キラーＴリンパ球（「リンフォカイン活性化キラー細胞」またはＬＡＫとも呼ば
れる）が生じる。細胞傷害性細胞をつくり出すための技術の大半は、インビトロ
でＴリンパ球を刺激し、その後それらを患者に再注入することにその本位がある
。〜これらのプロトコールは、刺激がＴリンパ球の増殖を誘発するだけでなく、
それらに細胞傷害特性を与えるという事実を利用する。実際、活性化しなければ
、ナイーブＴリンパ球、あるいはまた記憶リンパ球は、殆どまたは全く細胞傷害
特性を有さない。

【００６９】 我々は、ＣＤ８６＋ Ｔリンパ球が、腫瘍細胞に対する細胞傷害活性を自発的
に有することを報告する（実施例７、図７）。この細胞傷害活性は、ＣＤ８６＋
リンパ球およびＣＤ８６− リンパ球を含む混合集団によっても、また、ＣＤ
８６− Ｔリンパ球によっても生じる。一方、新たに単離された、活性化されて
いないＴリンパ球は、腫瘍細胞を死滅させない。

【００７０】 Ｋ５６２腫瘍株を標的細胞として使用した例を実施例７に示す（図７）。

【００７１】 (図の説明) 図１：ＩＬ−２の存在下に抗ＣＤ３抗体で末梢血由来のＭＮＣを刺激すること による、ＣＤ８６分子を発現するＴリンパ球の集団のインビトロでの発生。 末梢
血由来のヒトＭＮＣを、（実施例１に記載される通り）抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３お
よびＩＬ−２で刺激し（Ｄ０）、（実施例１に記載される通り）Ｄ２１に抗ＣＤ
３抗体ＯＫＴ３およびインターロイキン２で二回目の刺激を行った（□）か、ま
たは行わなかった（■）。インターロイキン２を、２日毎に培養液に添加する。
ＣＤ３＋ Ｔリンパ球上におけるＣＤ８６分子の発現を、キネティックフローサ
イトメトリーを用い、二重標識によって、６週間かけて評価する。その結果を、
ＣＤ８６分子を発現するＴ細胞の割合として表す。これらは、１０回の実験のう
ちの１つを表す。

【００７２】 図２：ヒトＣＤ８６＋ Ｔリンパ球はＣＤ４５ＲＯ分子を発現する。ヒトＭＮ
Ｃを、実施例１に記載したように抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３およびインターロイキン
２で刺激した。１５日間培養後、ＣＤ８６＋およびＣＤ８６− Ｔリンパ球によ
るＣＤ４５ＲＯ分子の発現を、フローサイトメトリーを使用して二重標識によっ
て評価した。結果は、１０回の実験うちの１つを示す。

【００７３】 図３：ＣＤ８６＋ Ｔリンパ球上におけるＣＤ３０、ＣＤ４０リガンドおよび ＣＤ７０分子の優先的発現。 実施例１に記載したように、ヒトＭＮＣをＯＫＴ３
抗体およびインターロイキン２で刺激した。１５日間の培養後、ＣＤ８６＋およ
びＣＤ８６− Ｔリンパ球上におけるＨＬＡ−Ｄｒ、ＣＤ３０、ＣＤ４０−Ｌお
よびＣＤ７０分子の発現を、フローサイトメトリーを用いて、二重標識によって
評価した。結果は、１０回の実験のうちの１つを示す。

【００７４】 図４ａおよび４ｂ：ＣＤ８６＋およびＣＤ８６− Ｔリンパ球による、γＩＦ Ｎ産生の比較。 図４ａ：実施例１に記載したようにＭＮＣを刺激した。２週間培養した後、Ｃ
Ｄ８６＋およびＣＤ８６− Ｔリンパ球を細胞選別フローサイトメーター使用し
て選別し、そしてＰＭＡ ＋ イオノマイシンで６時間刺激した。また、抗ＣＤ
８６中和抗体（ＩＴ２．２）と共にインキュベートした後またはインキュベート
せずに、全集団を「同様の方法で処理した」。上清中のγＩＦＮをＥＬＩＳＡに
よってアッセイした。結果は、ｐｇ／ｍｌ（平均±ＳＤ）で表し、３回の実験の
うちの１つを示している。

【００７５】 図４ｂ：ＭＮＣを実施例１に記載されるとおりに刺激した。３週間の培養の後
、細胞をブレフェルジンＡの存在下ＰＭＡ ＋ イオノマイシンで６時間刺激し
た。次いで、細胞を抗Ｃ８６抗体で標識し、固定し、膜透過し、次いで、抗γＩ
ＦＮ抗体で標識した。結果は、３回の実験のうち、１回の実験を示す。

【００７６】 図５ａ、５ｂおよび５ｃ：ＣＤ８６＋ Ｔリンパ球は、ナイーブＴリンパ球を 活性化するに必要な共刺激シグナルを提供する。

【００７７】 図５ａおよび５ｂ：抗ＣＤ３抗体の存在下でのナイーブＴ細胞の共刺激に関す
るアッセイ。実施例１に記載したようにして作出し、精製したＣＤ８６＋ Ｔ細
胞をパラホルムアルデヒドで固定し、次いで、抗ＣＤ８６中和抗体（ＩＴ２．２
またはＦＵＮ−１クローン）もしくはコントロールアイソトープモノクローナル
抗体の存在下または非存在下に、抗ＣＤ３抗体で刺激したナイーブＴリンパ球と
共に培養した。Ｔリンパ球の活性化を増殖の誘発（ｎ＝５）（図５ａ）およびγ
ＩＦＮの産生（ｎ＝３）（図５ｂ）によって具現化した。結果を平均±ＳＤ、ｎ
＝３として示す。

【００７８】 図５ｃ：混合リンパ球反応アッセイ。ＣＤ８６＋およびＣＤ８６− Ｔリンパ
球を実施例１に記載したようにして作出し、精製した。細胞をパラホルムアルデ
ヒドで固定し、次いで、抗ＣＤ８６中和抗体（ＩＴ２．２またはＦＵＮ−１クロ
ーン）、あるいはコントロールアソタイプモノクローナル抗体の存在下に、同種
ナイーブＴリンパ球と共に培養した。５日間インキュベーションした後、ナイー
ブＴリンパ球の増殖を³Ｈ−Ｔｈｙの取り込みによって測定した。実験を５回１
組で実施し、そして結果を平均±ＳＤ、ｎ＝３として示す。

【００７９】 図６：ヒトのＢリンパ球およびＴリンパ球によって発現されたＣＤ８６分子は 、７０ｋＤａの類似の分子量を有する。 還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより
、ＤａｕｄｉヒトＢ株由来、ＣＤ８６＋ Ｔ細胞（実施例１に記載したように得
られる）由来およびＪｕｒｋａｔ Ｔ株由来の膜結合タンパク質および可溶性タ
ンパク質の抽出物をその分子量に従って分離した。抗ヒトＣＤ８６ポリクローナ
ル抗体を使用したウエスタンブロット法によってＣＤ８６分子の発現を評価した
。

【００８０】 図７：ＣＤ８６＋ Ｔリンパ球は、Ｋ５６２腫瘍株に対する自発的な細胞傷害 活性を有する。 ＣＤ８６＋ Ｔリンパ球の実質的に均一な集団を産生させた。実
施例１に記載される通り、ＭＮＣによる第一刺激の１５日後にＣＤ８６＋ Ｔ細
胞およびＣＤ８６− Ｔ細胞を含む細胞の集団を得た。ＣＤ８６− Ｔ細胞およ
びＣＤ８６＋細胞を、実施例４に記載したように、セルソーターを使用して精製
した。活性化されていないＴ細胞を実施例３に記載されるようなロゼッティング
技術を使用して得た。⁵¹Ｃｒで標識したＫ５６２標的細胞を以下のエフェクター
細胞と共にインキュベートした（５０：１のエフェクター細胞：標的細胞の比に
より）：新たに単離された刺激されていないＴリンパ球、ＣＤ８６＋ 細胞およ
びＣＤ８６− Ｔ細胞を含む細胞の集団、精製したＣＤ８６＋ Ｔリンパ球およ
び精製したＣＤ８６− Ｔリンパ球。細胞毒性活性を⁵¹Ｃｒ放出によって３回１
組で測定し、実施例７に規定されるような細胞傷害率として表す（平均±ＳＤ、
ｎ＝３）。

【００８１】 （実施例１：ＩＬ−２の存在下に抗ＣＤ３抗体で末梢血から単離したヒト単核
細胞を刺激した後の、ＣＤ８６分子を発現するヒトＴリンパ球の均一な集団の発
生。） 本実施例では、我々は、ＣＤ８６陽性Ｔリンパ球の作出方法、さらにＴリンパ
球上でのＣＤ８６分子出現の動態研究（ｋｉｎｅｔｉｃ ｓｔｕｄｙ）を例示す
る（図１を参照のこと）。

【００８２】 ａ．方法論：ＣＤ８６分子を発現するヒトＴリンパ球の作出。 ＣＤ８６陽性（ＣＤ８６＋）Ｔリンパ球をヒト末梢血から作出する。この血液
を（例えば、リチウムヘパリネートなどの抗凝固剤の存在下）白血球搬出によっ
て除去する。単核細胞（ＭＮＣ）（Ｔリンパ球、Ｂリンパ球および単球を含む）
をＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ勾配（密度＝１．０７７）（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）上の遠心分離によって単離する。手短に言
えば、血球を室温、１５００ｒｐｍで３０分間遠心分離する。Ｆｉｃｏｌｌ−血
漿界面に位置するＭＮＣを回収し、ＲＰＭＩ １６４０培地（Ｌｉｆｅ ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の存在下で２回洗浄する。次いで、ＭＮＣを以下の培地（
本明細書では以下、完全培養培地という）中、１×１０⁶細胞／ｍｌの濃度で培
養する：１０％ 非働化（５６℃で３０分間加熱）胎仔ウシ血清および２ｍＭ
Ｌ−グルタミンを補充したＲＰＭＩ １６４０。２００Ｕ／ｍｌの濃度の組換え
ヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）の存在下、最小濃度である２００ｎｇ／ｍ
ｌの抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体クローンＯＫＴ３を用いてＭＮＣを活性化
する。ヒトＩＬ−２を２日毎に培養液に添加する。２１日目に細胞に第二の刺激
を与えることによって、全てがＣＤ８６分子を発現するヒトＴリンパ球の均一な
集団を生じさせることが可能となる。手短に言うと、リンパ球をＤ２１に回収し
、ＲＰＭＩ １６４０培地中で２回洗浄し、次いで、１×１０⁶細胞／ｍｌの濃
度で完全培養培地の培養液に詰め戻す。細胞を２００ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体
および２００Ｕ／ｍｌの組換えＩＬ−２を用いて活性化する。ＩＬ−２（２００
Ｕ／ｍｌ）を２日毎に添加する。

【００８３】 抗ヒトＣＤ３抗体（クローン ＯＫＴ３）はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃ
ｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）か
ら入手したＣＲＬ−８００１ 骨髄腫によって産生される。この骨髄腫を、２０
％ 非働化胎仔ウシ血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌ ペニシリ
ンおよび１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシンを補充した、イスコフの改変ダ
ルベッコ培地（Ｌｉｆｅ ｔｈｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で培養する。抗体をセ
ファロース結合プロテインＡカラム（Ｐｉｅｒｃｅ）に結合させて精製する。次
いで、これを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液、ｐＨ４の存在下で樹脂から分
離する。次いで、溶出したフラクションのｐＨをｐＨ７．０に戻す。溶出したフ
ラクションを濃縮し、次いで、定量する（ＢＣＡタンパク質比色定量試薬、Ｐｉ
ｅｒｃｅ）。抗ＣＤ３抗体の純度を、還元条件下および非還元条件下でポリアク
リルアミドゲル電気泳動した後、硝酸銀で染色することによって確認する。純度
は、＞９５％である。抗ＣＤ３抗体溶液を０．２２μｍのフィルターを通して無
菌化する。

【００８４】 （原核生物の系で産生された）組換えヒトインターロイキン２をＲ＆Ｄ Ｓｙ
ｓｔｅｍｓ（Ａｂｉｎｇｄｏｎ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）から入手する
。

【００８５】 ｂ．方法論：Ｔリンパ球上のＣＤ８６分子の発現の二重標識によるフローサイ
トメトリー分析。

【００８６】 フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅ型のフローサイトメトリー
；Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｅｒｅｍｂｏｄｅｇｅｍ、Ｂｅｌｇｉｕ
ｍ）を用い、二重標識によってＴリンパ球上でのＣＤ８６分子の発現を分析する
ために、様々な時間に細胞培養液からサンプルを移す。ＦＡＣＳ緩衝液（１％の
ウシ血清アルブミンおよび０．０１％アジ化ナトリウムを含む、１０ｍＭリン酸
緩衝液、ｐＨ７．４）中で細胞を洗浄した後、５０μｌ容量のＦＡＣＳ緩衝液中
に２×１０⁵個の細胞の割合で、コーン底型の９６−ウェル培養プレート（Ｎｕ
ｎｃ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、Ｄｎｍａｒｋ）のウェルに分配する。フィコエリトリ
ンで標識した抗ヒトＣＤ３抗体（抗ＣＤ３ ＰＥ）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉ
ｎｓｏｎ）またはフィコエリトリンで標識したコントロールアイソタイプ抗体（
Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）のいずれかを各ウェルに添加する。これら
の各条件に、ビオチンで標識した抗ヒトＣＤ８６抗体（ＩＴ２．２ クローン；
Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）またはコントロール抗体のいずれかを添加する。４℃で
２０分間インキュベーションした後、細胞を２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液で２回
洗浄し、その後、抗ＣＤ８６抗体を検出するために、Ｃｙｃｈｒｏｍｅで標識し
たストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）
の存在下、１０μｇの濃度でインキュベートする。４℃で２０分間インキュベー
ションした後、２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液で細胞を３回洗浄し、次いで、これ
と同一の緩衝液２００μｌ中に再懸濁する。Ｔリンパ球（ＣＤ３＋）の表面での
ＣＤ８６の発現を、ＦＡＣＳによって分析する。

【００８７】 ｃ．結果：図１に示される結果から以下のことが分かる： − ＣＤ８６分子は、末梢血から新たに単離したヒトＴリンパ球によっては
発現されない。 − ＣＤ８６＋ Ｔ細胞は、第一の刺激の３日後すぐに検出される。 − ＣＤ８６＋ Ｔリンパ球の割合は経時的に変化する。 − 刺激から２〜３週間後、培養液は、通常、５０±１０％のＣＤ８６＋
Ｔリンパ球を含む（２０回に渡る実験によって得られた結果）。 − ＣＤ８６＋細胞の割合は、再び刺激しない場合、４〜５週間後に減少す
る。 − Ｄ２１での第二の刺激に応答して、ＣＤ８６＋ Ｔリンパ球の割合は、
その全てがＣＤ８６分子を発現するリンパ球の均一な集団が産生されるまで、増
加し続ける。

【００８８】 （実施例２：ＣＤ８６分子の発現は、ＣＤ４５ＲＯ分子を発現するＴリンパ球
（記憶リンパ球）に制限される。） ＣＤ８６分子の発現が記憶Ｔリンパ球（ＣＤ４５ＲＯ分子を発現する）に制限
されることが示される（図２を参照のこと）。

【００８９】 ａ．方法論：実施例１に記載したように、抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３およびＩＬ−
２でヒトＭＮＣを刺激した。１５日間の培養後、ＣＤ８６＋およびＣＤ８６−
Ｔリンパ球上でのＣＤ４５ＲＯ分子の発現を、フローサイトメトリーを使用し、
二重標識によって評価した。詳細には、我々は、７日間の培養後に集団の細胞の
全てがＣＤ３＋ Ｔリンパ球からなることを観測した。２×１０⁵個の細胞をＦ
ＡＣＳ緩衝液中で洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、そして５０μｌ／ウェ
ルの割合で、コーン底型の９６−ウェル培養プレート中に分配する。各ウェルに
、ＦＩＴＣ抗ヒトＣＤ４５ＲＯ抗体（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）また
はコントロールアイソタイプ抗体（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）のいず
れかを添加する。ＣＤ８６の発現を、ビオチンで標識した抗ヒトＣＤ８６抗体を
使用して評価する。４℃でインキュベーションした後、細胞を２００μｌのＦＡ
ＣＳ緩衝液で２回洗浄し、その後、抗ＣＤ８６抗体を検出するために、１０μｇ
／ｍｌの濃度のＣｙｃｈｒｏｍｅ標識ストレプトアビジンの存在下でインキュベ
ートする。４℃で２０分間インキュベーションした後、細胞を２００μｌのＦＡ
ＣＳ緩衝液で３回洗浄し、次いで、これと同一の緩衝液２００μｌ中に再懸濁す
る。

【００９０】 ｂ．結果：図２に示された結果から、ＣＤ８６＋ Ｔリンパ球の全てがＣＤ４
５ＲＯ分子を発現するので、それらの全てが記憶細胞表現型を有することが分か
る。

【００９１】 （実施例３：ＣＤ８６− Ｔリンパ球と比較して、ＣＤ８６＋ Ｔリンパ球は
、より高いレベルの共刺激分子および活性化分子を発現し、そして免疫応答にお
いて極めて重要な役割を果たすある特定の分子を選択的に発現する。） 第一の刺激の２週間後に得た同一の不均一の集団から誘導されたＣＤ８６＋お
よびＣＤ８６− Ｔリンパ球上に存在する表面分子の発現を比較する。結果を表
Ｉに示し、若干の例を図３に詳述する。

【００９２】 ａ．方法論：実施例１に記載したように、抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３およびＩＬ−
２で１５日間ＭＮＣを刺激した。ＣＤ８６＋およびＣＤ８６− Ｔリンパ球の表
現型を、ＦＡＣＳを用いて、二重標識によって分析した。その表現型を、ヒツジ
赤血球とのロゼッティングの技術を使用して、精製された血液から新たに単離し
たＴリンパ球の表現型と比較する。手短に言うと、ＭＮＣを２００×１０⁶細胞
／ｍｌの濃度で再懸濁し、そして５０％ヒツジ赤血球溶液（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕ
ｘ、Ｍａｒｃｙ ｌ’Ｅｔｏｉｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）１ｍｌと混合する。細胞の
懸濁液を４℃で一晩インキュベートする。緩やかに再懸濁した後、Ｔ細胞をＦｉ
ｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ勾配上での遠心分離（１５００ｒｐｍ、室温で３０分
間）によって単離する。ヒツジ赤血球−Ｔリンパ球複合体をチューブの底に集め
る。赤血球を連続した２回の浸透圧ショックで溶解する。このように単離された
Ｔ細胞の純度は、ＦＩＴＣ抗ＣＤ３抗体で標識することによって評価され、＞９
５％である。

【００９３】 抗体による細胞標識を、実施例１に記載したように実施する：細胞をＦＡＣＳ
緩衝液中で洗浄した後、２×１０⁶細胞／ｍｌの割合でＦＡＣＳ緩衝液中に再懸
濁する。次いで、細胞をコーン底型の９６−ウェル培養プレートのウェルに５０
μｌ／ウェルの割合で分配する。各条件に、ＦＩＴＣ抗ＣＤ５４抗体、ＦＩＴＣ
抗ＣＤ８０抗体、ＦＩＴＣ抗ＨＬＡ−Ｄｒ抗体（全てＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉ
ｎｓｏｎから）、ＦＩＴＣ抗ＣＤ７０抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄ
ｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＦＩＴＣ抗ＣＤ３０抗体（Ｄａｋｏ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｄ
ｅｎｍａｒｋ）、ＦＩＴＣ抗ＣＤ４０−Ｌ抗体（Ａｎｃｅｌｌ、Ｂａｙｐｏｒｔ
、ＭＮ）、または各アイソタイプに対応するコントロール抗体（Ｂｅｃｔｏｎ
Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）のいずれかを添加する。ＣＤ８６分子の発現をビオチン標
識抗ヒトＣＤ８６抗体（ＩＴ２．２クローン）（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用
して評価する。４℃で２０分間インキュベーションした後、細胞を２００μｌの
ＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、その後、抗ＣＤ８６抗体を検出するために、１０
μｇ／ｍｌの濃度のＣｙｃｈｒｏｍｅ標識ストレプトアビジン（Ｐｈａｒｍｉｎ
ｇｅｎ）の存在下、インキュベートする。４℃で２０分間インキュベーションし
た後、細胞を２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、その後、フローサイト
メトリー分析のためにこれと同一の緩衝液２００μｌ中に再懸濁する。ＣＤ５４
、ＣＤ８０、ＨＬＡ−Ｄｒ、ＣＤ７０、ＣＤ３０およびＣＤ４０−Ｌ分子の発現
を、新たに単離したＴリンパ球、ＣＤ８６− Ｔリンパ球およびＣＤ８６＋ Ｔ
リンパ球において比較する。

【００９４】 ｂ．結果：表Ｉおよび図３に示されるように、結果から以下のことが分かる： − 新たに単離したＴリンパ球は、弱く検出可能なレベルで活性化分子を発
現するが、ＣＤ８０およびＣＤ８６共刺激分子を発現しない。 − ＣＤ８６＋ Ｔリンパ球は、ＣＤ８６− Ｔリンパ球よりも高レベルの
ＣＤ２５およびＨＬＡ−Ｄｒ活性化マーカーを発現する。 − ＣＤ８６＋ Ｔリンパ球は、ＣＤ８６−リンパ球よりも高レベルのＣＤ
５４およびＣＤ８０共刺激分子を発現する。 − ＣＤ３０分子は、新たに精製したＴリンパ球によって発現されない。 − ＣＤ３０分子はＣＤ８６＋ リンパ球によってのみ発現される。 − ＣＤ４０−ＬおよびＣＤ７０分子などのＴＮＦαファミリーの分子は、
新たに精製したＴリンパ球によって発現されず、ＣＤ８６− 細胞上でわずかに
発現されるが、ＣＤ８０＋ リンパ球によって本質的に発現される。

【００９５】 本明細書の下記の表Ｉは、ヒトＣＤ８６＋ Ｔリンパ球およびＣＤ８６− Ｔ
リンパ球によって発現された表面分子を比較して得られた結果を示す。実施例１
に記載したように、抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３およびＩＬ−２を用いてヒトＭＮＣを
刺激した。２週間の培養の後、ＣＤ８６＋およびＣＤ８６− Ｔリンパ球上にお
ける様々な表面分子の発現の分析を、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳｃａｎ、
Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用し、二重標識によって実施する。示
された結果は、５つの異なる個体由来の細胞を用いて得たデータをまとめている
。符号^*は、陽性細胞の割合（平均±ＳＤ、ｎ＝５）を示す。

【００９６】

【表１】

【００９７】 実施例４：ＣＤ８６陽性Ｔリンパ球は、ＣＤ８６陰性Ｔリンパ球よりも多量の
γＩＦＮを産生する。 ヒトＣＤ８６＋ Ｔリンパ球が、ヒトＣＤ８６− Ｔリンパ球よりも多くのγ
ＩＦＮを産生したという事実をここに例証する。これは、２つの異なるアプロー
チを使用して具体化された。

【００９８】 ａ．方法論：ＥＬＩＳＡによるγＩＦＮの産生の測定。 ＭＮＣを実施例１に記載したように刺激した。２週間の培養後、細胞選別フロ
ーサイトメーター（ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏ
ｎ）を使用して、ＣＤ８６＋ 細胞をＣＤ８６− 細胞から分離した。手短に言
うと、ＦＩＴＣ抗ＣＤ８６抗体（ＩＴ２．２クローン、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）
（５×１０⁶細胞／５００μｌに対して５μｇの抗体）と共に、細胞を４℃で２
０分間インキュベートした。完全培養培地で３回洗浄した後、ＣＤ８６＋ 細胞
を、ＣＤ８６分子の発現に基づいてＣＤ８６− 細胞から分離する。フローサイ
トメトリーで分析された２つのＴリンパ球集団の純度は、＞９８％である。コン
トロールとして、抗ＣＤ８６中和抗体（ＩＴ２．２、１０μｇ／ｍｌとして使用
される）と共にインキュベートされた、またはインキュベートされていない、非
分離集団もまた、使用した。

【００９９】 細胞を、２×１０⁶細胞／ｍｌの濃度で、完全培養培地中に再懸濁し、１０ｎ
ｇ／ｍｌホルボールミリステートアセテート（Ｓｉｇｍａ、Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕ
ｉｓ、ＭＯ） ＋ １μＭ イオノマイシン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で６時間活性化するか、または活性化しない。培養上清を回
収し、４℃で１５分間２５００ｒｐｍで遠心分離する。上清中のγＩＦＮレベル
を市販のＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｂｉｎｇｄｏｎ、Ｕｎ
ｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）を使用して定量する。結果を、ｎｇ／ｍｌ（平均±
ＳＤ、ｎ＝３）で表し、図４ａに示す。

【０１００】 ｂ．方法論：ＣＤ８６＋およびＣＤ８６− Ｔリンパ球の中のγＩＦＮ−産生
Ｔリンパ球の頻度の測定。 この場合、２．５μｇ／ｍｌのブレフェルジンＡ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒ
ｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）の存在下でＴリンパ球を刺激する。洗浄後、細
胞を、ビオチンで標識した抗ＣＤ８６抗体と共に、コーン底型の９６−ウェル培
養プレート中でインキュベートする。４℃で２０分間インキュベートした後、細
胞を２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、その後、実施例１に記載したよ
うにＣｙｃｈｒｏｍｅで標識したストレプトアビジンの存在下でインキュベート
する。４℃で２０分間インキュベートした後、細胞を２００μｌのＦＡＣＳ緩衝
液で３回洗浄し、その後、市販のキット（Ｃｙｔｏｗａｓｈ／ｃｙｔｏｐｅｒｍ
キット、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用し、記載の手順に従って固定し、そして
膜透過する。細胞（２×１０⁵）を、５０μｌの容量で、４℃、２０分間、ＦＩ
ＴＣ抗γＩＦＮ抗体と共に、コーン底型の９６−ウェル培養プレート中でインキ
ュベートする。ＦＡＣＳ緩衝液中で２回洗浄した後、細胞をフローサイトメトリ
ーで分析する。結果を図４ｂに示す。

【０１０１】 ｃ．結果：図４ａおよび図４ｂに記載した結果から、以下のことが分かる： − 刺激後、γＩＦＮ−産生細胞の頻度は、ＣＤ８６− Ｔリンパ球の集団
においてよりも、ＣＤ８６＋ リンパ球の集団において高い（図４ａ）。 − ＣＤ８６＋ Ｔリンパ球は、活性化後、ＣＤ８６− Ｔリンパ球よりも
多くのγＩＦＮを産生する（図４ｂ）。

【０１０２】 （実施例５：ヒトＣＤ８６陽性Ｔリンパ球は、ナイーブＴリンパ球の増殖およ
び活性化に必要な共刺激シグナルを提供する。） ヒトのＣＤ８６＋ Ｔリンパ球は、ナイーブＴリンパ球の効果的な活性化を誘
発するために必要な共刺激シグナル（γＩＦＮの増殖および／または産生の誘発
によって測定される）を提供するが、ＣＤ８６− Ｔリンパ球はしないという事
実をここに例証する（図５ａ、５ｂおよび５ｃ）。

【０１０３】 ａ．方法論：抗ＣＤ３を用いた共刺激実験。 ＣＤ８６＋ Ｔリンパ球を実施例１に記載したようにして作出し、第二の刺激
の１週間後に使用した（実施例１、図１）。ＣＤ８６− Ｔリンパ球を、刺激（
実施例１に記載される通り）の２週間後に細胞選別フローサイトメーターを使用
して単離した（実施例４ａに記載される通り）。次いで、１０ｍＭのリン酸緩衝
液（ｐＨ７．４）中に調製した１％のパラホルムアルデヒド溶液を用い、４℃で
１０分間、細胞を固定する。リン酸緩衝液中で3回洗浄した後、細胞を中和溶液
（２００ｍＭ Ｌ−リシン、Ｓｉｇｍａ）と共にインキュベートする。リン酸緩
衝液中で３回洗浄した後、細胞を２×１０⁶細胞／ｍｌの濃度で完全培養培地中
に再懸濁する。

【０１０４】 ナイーブＴリンパ球（ＣＤ４５ＲＡ陽性）を抹消血から単離する。手短に言う
と、ＭＮＣを、実施例１に記載したように、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ勾配
上で遠心分離によって単離し、そしてＴリンパ球を実施例３に記載したように、
ロゼッティング技術を用いて精製する。洗浄後、細胞を完全培養培地中に再懸濁
し、抗ＣＤ４５ＲＯ抗体（５×１０⁶細胞／１ｍｌの細胞懸濁液に対して５μｇ
の抗体）と共に、４℃で２０分間インキュベートする。洗浄後、細胞を、抗マウ
ス免疫グロブリン抗体を担持する磁気ビーズと共にインキュベートする（Ｄｙｎ
ａｂｅａｄｓ ｓｙｓｔｅｍ、Ｄｙｎａｌ）。ＣＤ４５ＲＯ＋ Ｔリンパ球を磁
場の作用によって細胞懸濁液から除去する。洗浄後、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ４５
ＲＯ− Ｔ細胞の集団を２×１０⁶細胞／ｍｌの濃度で完全培養培地中に再懸濁
する。純度は＞９５％であり、これは、コントロールアイソタイプ抗体と比較し
たＦＩＴＣ抗ＣＤ４５ＲＡ抗体を用いたフローサイトメトリーによって決定され
る。

【０１０５】 ＣＤ４５ＲＡ陽性Ｔリンパ球（２×１０⁵細胞／ｍｌ、１００μｌ／ウェル）
を丸底９６−ウェル培養プレート（Ｎｕｎｃ）中で培養し、そしてＣＤ８６＋
Ｔリンパ球またはＣＤ８６− Ｔリンパ球のいずれかの存在下または非存在下に
、１０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３で刺激する（最終濃度２×１０⁵細胞
／ウェル）。実験を１０μｇ／ｍｌの抗ヒトＣＤ８６中和抗体（ＩＴ２．２クロ
ーン、ＰｈａｒｍｉｎｇｅｎまたはＦＵＮ−１クローン、Ａｎｃｅｌｌ）の存在
下または非存在下で実施する。様々な実験条件を３回実施する。

【０１０６】 ＣＤ４５ＲＡ Ｔ細胞の活性化を以下の２つの基準を使用して測定する： − ３日間の培養後に細胞の増殖を、トリチウム化したチミジン（³Ｈ−Ｔ
ｈｙ、Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）の取り込みを測定す
ることによって評価する。手短にいうと、０．２５μＣｉの³Ｈ−Ｔｈｙを各ウ
ェルに添加する。³Ｈ−Ｔｈｙの取り込みをシンチレーションカウンター（Ｐａ
ｃｋａｒｄ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を使用して測定する。図５ａに記載の結果は
、ｃｐｍ（平均±ｓｄ、ｎ＝５）で表している。 − ２日間の培養後、実施例４に記載したように、培養上清中のγＩＦＮの
産生を測定する。図５ｂに記載された結果は、ｎｇ／ｍｌ（平均±ｓｄ、ｎ＝３
）で表している。

【０１０７】 ｂ．方法論：混合リンパ球反応 ２つの異なるドナー由来のＣＤ８６＋およびＣＤ８６− 細胞の集団を上記の
ようにして作出する。ＣＤ４５ＲＡ＋ Ｔリンパ球（２×１０⁶細胞／ｍｌ、１
００μｌ／ウェル）を、ＣＤ８６＋ Ｔリンパ球もしくはＣＤ８６− Ｔリンパ
球の存在下または非存在下で、丸底９６−ウェル培養プレート（Ｎｕｎｃ）中、
最終濃度２×１０⁵細胞／ウェルで培養する。実験を１０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ８
６中和抗体（ＩＴ２．２クローンまたはＦＵＮ−１クローン）の存在下または非
存在下で実施する。種々の実験条件を３回実施する。５日間の培養後、細胞の増
殖を、上記のように³Ｈ−Ｔｈｙの取り込みを測定することによって評価する。
結果を図５ｃに示す（平均±ＳＤ、ｎ＝５）。

【０１０８】 ｃ．結果：図５ａ、５ｂおよび５ｃに記載したように、これらの結果から以下
のことが分かる： − ヒトＣＤ８６＋ Ｔリンパ球は、準最適用量の抗ＣＤ３抗体で刺激され
たヒトナイーブＴリンパ球（ＣＤ４５ＲＡ）による増殖（図５ａ）およびγＩＦ
Ｎの産生（図５ｂ）に必要な共刺激シグナルを提供する。 − ＣＤ８６＋ Ｔリンパ球によって生じるこの共刺激効果は、２つの異な
る抗ＣＤ８６中和抗体（ＩＴ２．２およびＦＵＮ−１クローン）によって部分的
に阻害され、Ｔリンパ球によって発現されるＣＤ８６分子が機能的であることを
例証する（図５ａおよび５ｂ）。 − ＣＤ８６− Ｔリンパ球は、この共刺激活性を支持することができない
（図５ａおよび５ｂ）。 − ＣＤ８６＋ 細胞は、混合リンパ球反応を誘発することができるが、Ｃ
Ｄ８６− 細胞はできない（図５ｃ）。 − ＣＤ８６＋ Ｔリンパ球によって生じる共刺激の役割は、２つの異なる
抗ＣＤ８６中和抗体（ＩＴ２．２およびＦＵＮ−１クローン）によって阻害され
、Ｔリンパ球によって発現されるＣＤ８６分子が機能的であることを例証する（
図５ｃ）。 − ＣＤ８６− Ｔリンパ球は、この共刺激活性を支持することができない
（図５ｃ）。 − 抗ＣＤ８６抗体がＣＤ８６＋ Ｔリンパ球の共刺激特性を部分的にしか
中和しないという事実は、（やはりＣＤ８６＋ Ｔリンパ球によって発現される
）他の共刺激分子がこれらの細胞によって生じる共刺激活性に寄与することを示
唆する。

【０１０９】 結論として、これらの結果は、ヒトＴリンパ球によって発現されるＣＤ８６分
子が機能的であることを示す。抗ＣＤ８６抗体がＣＤ８６＋ Ｔリンパ球の共刺
激特性を部分的にしか中和しないという事実は、（やはりＣＤ８６＋ Ｔリンパ
球によって発現される）他の共刺激分子がこれらの細胞によって生じる共刺激活
性に寄与することを示唆する。

【０１１０】 （実施例６：ヒトＴリンパ球によって発現されたＣＤ８６分子は、７０ｋＤａ
の見かけ分子量を有する。） ヒトＴリンパ球によって発現されたＣＤ８６分子が、ＡｇＰＣによって発現さ
れたＣＤ８６分子と同様に、７０ｋＤａの見かけ分子量を有するという事実をこ
こに例証する。

【０１１１】 ａ．方法論：ＣＤ８６分子を発現するＴリンパ球の集団を、実施例１に記載し
たように、２回の連続的な刺激によって作出した。ＤａｕｄｉヒトＢリンパ系株
およびＪｕｒｋａｔヒトＴリンパ系株をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔ
ｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手した。これらの細胞を完全培地（２ｍＭ
Ｌ−グルタミンおよび１０％ 非働化胎仔ウシ血清を補充したＲＰＭＩ培地）
中で培養する。これらの細胞を回収し、そしてＲＰＭＩ培地で３回洗浄し、次い
で、０．５％のＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０、およびプロテアーゼインヒビターのカ
クテル（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒ
ｍａｎｙ）を含む、１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中、４℃で２０分間
、溶解する。次いで、核を除去するために細胞溶解液を、４℃で１０分間、１２
０００ｒｐｍで遠心分離する。その上清を、０．１％ ブロモフェノールブルー
、５％ グリセロールおよび０．１％ β−メルカプトエタノールを含む、１０
ｍＭ リン酸緩衝液（１当量）中にとる。次いで、ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（５％のスタッキングゲル−１０％の分離ゲル）により、タンパク質をその
分子量に従って分離する。５×１０⁶個の細胞に相当する量のタンパク質を各レ
ーンに充填する。移動後、タンパク質をニトロセルロース膜上にウエスタンブロ
ット法によって転写する。１０％の脱脂粉乳を含むリン酸溶液中で飽和させた後
、膜を、１０μｇ／ｍｌの濃度の抗ＣＤ８６抗体（ＩＴ２．２クローン、Ｐｈａ
ｒｍｉｎｇｅｎ）と共に、４℃で一晩、振盪しながらインキュベートする。１０
％の脱脂粉乳を含むリン酸緩衝液で洗浄した後、膜を、ペルオキシダーゼで標識
したヤギの抗マウス免疫グロブリン抗体（Ｄａｋｏ）と共に、室温で２時間、振
盪ながらインキュベートする。膜をリン酸緩衝液中で洗浄する。結合した抗体を
ＡｍｅｒｓｈａｍからのＥＣＬシステムを使用した化学発光によって検出する。

【０１１２】 ｂ．結果：ウエスタンブロット（図６）は、ヒトＴリンパ球によって発現され
たＣＤ８６分子が７０ｋＤａの見かけ分子量を有することを示す（レーン２）。
この分子量は、ヒトＢ細胞（Ｄａｕｄｉ株）によって示された分子量（レーン１
）と同一である。ＣＤ８６分子は、Ｊｕｒｋａｔ細胞によって発現されない（レ
ーン３）。我々は、ＣＤ８６− 細胞がいかなるＣＤ８６分子も発現しないこと
を確認した（結果は示さない）。

【０１１３】 （実施例７：ＣＤ８６＋ Ｔリンパ球は、Ｋ５６２腫瘍細胞株に対する自発的
な細胞傷害活性を有する。） ＣＤ８６分子を発現するヒトＴリンパ球がインビトロで腫瘍細胞を自発的に殺
し得るという事実をここに例証する（図７）。

【０１１４】 ａ．方法論：ＣＤ８６分子を発現するＴリンパ球または発現しないＴリンパ球
の混合集団を、実施例１に記載したように、刺激の１４日後に作出した。ＣＤ８
６− リンパ球およびＣＤ８６＋ Ｔリンパ球を、実施例４に記載したように、
細胞選別フローサイトメーター使用して単離した。末梢血由来のヒトＴリンパ球
を実施例３に記載したように単離した。

【０１１５】 標的細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔ
ｉｏｎから入手したＫ５６２株である。これらの細胞を完全培地（２ｍＭ Ｌ−
グルタミンおよび１０％非働化胎仔ウシ血清を補充したＲＰＭＩ培地）中で培養
する。これらの細胞を回収し、そしてＲＰＭＩ培地で２回洗浄する。次いで、こ
れらの細胞を、３７℃で９０分間、⁵¹Ｃｒの溶液（１００μＣｉ／１０⁶細胞）
と共にインキュベートする。次いで、細胞を遠心分離し、そして完全培養培地で
３回洗浄する。次いで、標的細胞を丸底９６−ウェル培養プレート（Ｎｕｎｃ）
に、１×１０⁵細胞／ウェルの割合で分配する。エフェクター細胞（末梢血から
新たに単離したＴリンパ球、ＣＤ８６＋ Ｔリンパ球、ＣＤ８６− Ｔリンパ球
、または、ＣＤ８６＋ Ｔリンパ球／ＣＤ８６− Ｔリンパ球の混合集団（５０
／５０））を、１個の標的細胞につき５０個のエフェクター細胞の割合で添加し
、最終容量を２００μｌとする。次いで、培養プレートを、３７℃、５％ ＣＯ ₂ の湿気のインキュベーター中で４時間インキュベートする。１００μｌの上清
を除去し、そして、⁵¹Ｃｒ放出をγ放射カウンター（Ｐａｃｋａｒｄ、Ａｕｓｔ
ｒａｌｉａ）を使用して測定する。標的細胞のみからの自発的な放出を上清中で
測定する。⁵¹Ｃｒの全放出を、標的細胞のみを含み、１０ｍＭ リン酸緩衝液（
ｐＨ７．４）中、１％ Ｔｗｅｅｎ２０溶液で処理した培養ウェル中で測定する
。

【０１１６】 エフェクター細胞の細胞傷害活性を、以下のようにして計算される標的細胞の
溶解率として、評価する： （エフェクター細胞の存在下での⁵¹Ｃｒ放出−自発放出／全放出−自発放出）
。

【０１１７】 結果：細胞傷害アッセイは、ＣＤ８６＋ Ｔリンパ球が自発的にＫ５６２標的
細胞を殺すことを示した（図７）。また、この細胞傷害活性は、ＣＤ８６− 細
胞によっても、さらにＣＤ８６＋ 細胞およびＣＤ８６− 細胞を含む細胞の集
団によっても生じる。他方、新たに単離したＴリンパ球はＫ５６２細胞を殺すこ
とは不可能である。

【０１１８】 （参考文献一覧）

【０１１９】 Agematsu, K., Kobata, T., Yang, F.C., Nakazawa, T., Fukushima, K., Kit
ahara, M., Mori, T., Sugita, K., Morimoto, C. および Komiyama, A., CD27/
CD70 interaction directly drives B cell IgG and IgM synthesis. Eur. J. I
mmunol. (1995) 25, 2825-29.

【０１２０】 Azuma, M., Cayabyab, M., Phillips, J. H.およびLanier, L. L. Requiremen
ts for CD28-dependent T cell-mediated cytotoxicity. J. Immunol. (1993)15
0, 2091-101.

【０１２１】 Azuma, M., Ito, D., Yagita, H., Okumura, K., Phillips, J.H., Lanier,
L.L.およびSomoza, C., B70 antigen is a second ligand for CTLA-4 and CD28
. Nature (1993) 366, 76-9.

【０１２２】 Bennett, S.R., Carbone, F.R., Karamalis, F., Flavell, R.A., Miller, J
.F., Heath, W.R. Help for cytotoxic-T-cell responses is mediated by CD4O
signalling. Nature 1998 Jun 4; 393 (6684), 478-80.

【０１２３】 Boehm, U., Klamp, T., Groot, M. および Howard, J.C., Cellular response
s to interferon-gamma. Ann. Rev. Immunol. (1997) 15, 749-95.

【０１２４】 Camussi, G., Albano, E., Tetta, C. および Bussolino, F., The molecular
action of tumor necrosis factor-alpha. Eur. J. Biochem. (1991) 202, 3-1
4.

【０１２５】 Chamberlain, R.S., Carroll, M.W., Bronte, V., Hwu, P., Warren, S., Yan
g, J.C., Nishimura, M., Moss, B., Rosenberg, S.A.および Restifo, N.P., C
ostimulation enhances the active immunotherapy effect of recombinant ant
icancer vaccines. Cancer Res. (1996) 56, 2832-6.

【０１２６】 Dilloo, D., Brown, M., Roskrow, M., Zhong, W., Holladay, M., Holden, W
. および Brenner, M. CD4O ligand induces an antileukemia immune respons
e in vivo. Blood 1997 Sep 1; 90(5), 1927-33.

【０１２７】 Flynn, K. および Mullbacher, A., The generation of memory antigen-spec
ific cytotoxic T cell responses by CD28/CD8O interactions in the absence
of antigen. Eur. J. Immunol. (1997) 27, 456-62.

【０１２８】 Greenfield, E.A., Nguyen, K.A. および Kuchroo, V.K. CD28/B7 costimulat
ion: a review. Crit Rev Immunol. (1998) 18, 389-418.

【０１２９】 Gurunathan, S., Irvine, K.R., Wu, C.Y., Cohen, J.I., Thomas, E., Pruss
in, C., Restifo, N.P. および Seder, R.A. CD4O ligand/trimer DNA enhances
both humoral and cellular immune responses and induces protective immu
nity to infectious and tumor challenge. J. Immunol. (1998) Nov 1; 161(9)
, 4563-71.

【０１３０】 Hakamada-Taguchi, R., Kato, T., Ushijima, H., Murakami, M., Uede, T.,
Nariuchi, H., Expression and co-stimulatory function of B7-2 on murine
CD4+ T cells. Eur. J. Immunol. (1998) 28, 865-73.

【０１３１】 He, X.S., Chen, H.S., Chu, K., Rivkina, M. および Robinson, W.S. Costi
mulatory protein B7-1 enhances the cytotoxic T cell response and antibod
y response to hepatitis B surface antigen. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 19
96 Jul 9; 93(14), 7274-8.

【０１３２】 Hieber, U. および Heim, M.E., Tumor necrosis factor for the treatment
of malignancies. Oncology (1994) 51, 142-53.

【０１３３】 Hollsberg, P., Scholz, C., Anderson, D.E., Greenfield, E.A., Kuchroo,
V.K., Freeman, G.J. および Hafler, D.A., Expression of a hypoglycosylat
ed form of CD86 (B7-2) on human T cells with altered binding properties
to CD28 and CTLA-4. J. Immunol. (1997) 159, 4799-805.

【０１３４】 Hunter, C.A., Ellis-Neyer, L., Gabriel, K.E., Kennedy, M.K., Grabstein
, K.H., Linsley, P.S. および Remington, J.S., The role of the CD28/B7 in
teraction in the regulation of NK cell responses during infection with T
oxoplasma gondii. J. Immunol. (1997) 158, 2285-93.

【０１３５】 Imro, M.A., Dellabona, P., Manici, S., Heltai, S., Consogno, G., Bello
ne, M., Rugarli, C. および Protti, M.P. Human melanoma cells transfected
with the B7-2 costimulatory molecule induce tumor-specific CD8+ cytotox
ic T lymphocytes in vitro. Hum. Gene Ther. (1998) 9, 1335-44.

【０１３６】 Kaye, P. Costimulation and the regulation of antimicrobial immunity. I
mmunol Today (1995) 16, 423-7.

【０１３７】 Kobata, T., Agematsu, K., Kameoka, J., Schlossman, S.F., Morimoto, C.
, CD27 is a signal- transducing molecule involved in CD45RA+ naieve T c
ell costimulation. J. Immunol. (1994) 153, 5422-32.

【０１３８】 Kung, P., Goldstein, G., Reinherz, E.L. および Schlossman, S.F., Monoc
lonal antibodies defining distinctive human T cell surface antigens
. Science (1979) 206, 347-9.

【０１３９】 Laman, J.D., Claassen, E., Noelle, R.J., Functions of CD4O and its lig
and, gp39 (CD4OL). Crit. Rev. Immunol. (1996) 16, 59-108.

【０１４０】 Landegren, U., Andersson, J. および Wigzell, H. Mechanism of T lymphoc
yte activation by OKT3 antibodies. A general model for T cell induction.
Eur J Immunol. (1984) 14, 325-8.

【０１４１】 Lanier, L.L., O'Fallon, S., Somoza, C., Phillips, J.H., Linsley, P.S.,
Okumura, K., Ito, D. および Azuma, M., CD8O (B7) and CD86 (B70) provide
similar costimulatory signals for T cell proliferation, cytokine produ
ction, and generation of CTL. J. Immunol. (1995) 154, 97-105.

【０１４２】 Lenschow, D.J. および Walunas, T.L., Bluestone, J.A. CD28/B7 system
of T cell costimulation. Annu. Rev. Immunol. (1996) 14, 233-58.

【０１４３】 Leong, C.C., Marley, J.V., Loh, S., Milech, N., Robinson, B.W. および
Garlepp, M.J., Transfection of the gene for B7-1 but not B7-2 can induce
immunity to murine malignant mesothelioma. Int. J. Cancer 1997 May 2; 7
1(3), 476-82.

【０１４４】 Liebowitz, D.N., Lee, K.P., June, C.H., Costimulatory approaches to ad
optive immunotherapy Curr. Opin. Oncol. (1998) 10, 533-41.

【０１４５】 Martin, P.J., Ledbetter, J.A., Morishita, Y., June, C.H., Beatty, P.G.
および Hansen, J.A., A 44 kilo- dalton cell surface homodimer regulates
interleukin 2 production by activated human T lymphocytes. J. Immunol.
(1986) 136, 3282-7.

【０１４６】 Melero, I., Bach, N., Chen, L., Costimulation, tolerance and ignorance
of cytolytic T lymphocytes in immune responses to tumor antigens. Life
Sci. (1997) 60, 2035-41.

【０１４７】 Mier, J.W. および Gallo, R.C., Purification and some characteristics o
f human T-cell growth factor from phytohemagglutinin-stimulated lymphocy
te-conditioned media. Proc Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 6134-8.

【０１４８】 Mier, J.W., Gallo, R.C., The purification and properties of human T ce
ll growth factor. J. Immunol. 1982, 128, 1122-7.

【０１４９】 Mule, J.J., Shu, S., Schwarz, S.L. および Rosenberg, S.A., Adoptive im
munotherapy of established pulmonary metastases with LAK cells and recom
binant interleukin-2. Science (1984) 225, 1487-9 & brevet WO 91/4444).

【０１５０】 Northoff, H., Carter, C., Oppenheim, J.J., Inhibition of concanavalin
A-induced human lymphocyte mitogenic factor (Interleukin-2) production b
y suppressor T lymphocytes. J. Immunol. 1980 125, 1823-8.

【０１５１】 Nunes, J., Klasen, S., Ragueneau, M., Pavon, C., Couez, D., Mawas, C.,
Bagnasco, M. および Olive, D., CD28 mAbs with distinct binding properti
es differ in their ability to induce T cell activation: analysis of earl
y and late activation events. Int. Immunol. 1993, 5, 311-5.

【０１５２】 Puetzer, B.M., Hitt, M., Muller, W.J., Emtage, P., Gauldie, J. および
Graham, F.L., Interleukin 12 and B7-l costimulatory molecule expressed b
y an adenovirus vector act synergistically to facilitate tumor regressio
n. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) 94, 10889-94.

【０１５３】 Rao, J.B., Chamberlain, R.S., Bronte, V., Carroll, M.W., Irvine, K.R.,
Moss, B., Rosenberg, S.A. および Restifo, N.P., Il-12 is an effective a
djuvant to recombinant vaccinia virus-based tumor vaccines: enhancement
by simultaneous B7-l expression. J. Immunol. (1996) 156, 3357-65.

【０１５４】 Swain, S.L., Croft, M., Dubey, C., Haynes, L., Rogers, P., Zhang, X.
および Bradley, L.M., From naieve to memory T cells. Immunol Rev. (1996)
150, 143-67.

【０１５５】 Tax, W.J., Willems, H.W., Reekers, P.P., Capel, P.J. および Koene, R.A
. Polymorphism in mitogenic effect of IgG1 monoclonal antibodies against
T3 antigen on human T cells. Nature (1983) Aug 4-10, 304 (5925), 445-7.

【０１５６】 Tsuji, T., Hamajima, K., Ishii, N., Aoki, I., Fukushima, J., Xin, K.Q.
, Kawamoto, S., Sasaki, S., Matsunaga, K., Ishigatsubo, Y., Tani, K., Ok
ubo, T. および Okuda, K. Immunomodulatory effects of a plasmid expressin
g B7-2 on human immunodeficiency virus-1- specific cell-mediated immunit
y induced by a plasmid encoding the viral antigen. Eur. J. Immunol. (199
7) 27, 782-7.

【０１５７】 Van Lier, R.A., Brouwer, M. および Aarden, L.A. Signals involved in T
cell activation. T cell proliferation induced through the synergistic
action of anti-CD28 and anti-CD2 monoclonal antibodies. Eur J. Immunol.
(1988) 18, 167-72 & Brevet Europeen 40 96 55.

【０１５８】 Van Seventer, G.A., Shimizu, Y., Horgan, K.J., Shaw, S., The LFA-1 lig
and ICAN-1 provides an important costimulatory signal for T cell recepto
r-mediated activation of resting T cells. J. Immunol. (1990) 144, 4579-
86.

【０１５９】 Yang, F.C., Agematsu, K., Nakazawa, T., Mori, T., Ito, S., Kobata, T.,
Morimoton, C. および Komiyama, A. CD27/CD7O interaction directly induce
s natural killer cell killing activity. Immunology (1996) 88(2) 289-93.

【０１６０】 Yeh, K.Y., Pulaski, B.A., Woods, M.L., McAdam, A.J., Gaspari, A.A., Fr
elinger, J.G. および Lord, E.M., B7-1 enhances natural killer cell-media
ted cytotoxicity and inhibits tumor growth of a poorly immunogenic murin
e carcinom. Cell Immunol. (1995) 165, 217-24.

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１：ＩＬ−２の存在下に抗ＣＤ３抗体で末梢血由来のＭＮＣを刺激すること
による、ＣＤ８６分子を発現するＴリンパ球の集団のインビトロでの発生。

【図２】 図２：ヒトＣＤ８６＋ Ｔリンパ球はＣＤ４５ＲＯ分子を発現する。ヒトＭＮ
Ｃを実施例１に記載したように、抗体ＯＫＴ３およびインターロイキン２を用い
て刺激した。

【図３】 図３：ＣＤ８６＋ Ｔリンパ球上におけるＣＤ３０、ＣＤ４０リガンドおよび
ＣＤ７０分子の優先的発現。

【図４】 図４ａおよび４ｂ：ＣＤ８６＋およびＣＤ８６− Ｔリンパ球による、γＩＦ
Ｎ産生の比較。

【図５】 図５ａ、５ｂおよび５ｃ：ＣＤ８６＋ Ｔリンパ球は、ナイーブＴリンパ球を
活性化するに必要な共刺激シグナルを提供する。

【図６】 図６：ヒトのＢリンパ球およびＴリンパ球によって発現されたＣＤ８６分子は
、７０ｋＤａの類似の分子量を有する。

【図７】 図７：ＣＤ８６＋ Ｔリンパ球は、Ｋ５６２腫瘍株に対する自発的な細胞傷害
活性を有する。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１３年４月２３日（２００１．４．２３）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 37/04 Ｃ０７Ｋ 14/57 Ｃ０７Ｋ 14/57 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｙ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｂ (72)発明者 ヴィットーリ、マルク フランス国、エフ−74160 ボーモントゥ、 アレ デュ グラン プレ 106 (72)発明者 ボンヌフォイ、ジャン−イヴ フランス国、エフ−74350 ル サペ、オ ノワイエール（番地なし) Ｆターム(参考） 4B065 AA94X AB01 AC14 AC20 BB19 BC01 BC50 CA24 CA44 4C085 AA03 CC12 DD23 EE01 4C087 AA01 AA02 AA03 BB37 DA20 ZB09 ZB26 ZB35 4H045 AA10 AA30 CA40 DA18 EA20 EA28 EA29 FA72

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 機能的なＣＤ８６分子を発現する、ヒトＴリンパ球。
2. 【請求項２】 共刺激性であり且つ細胞傷害性であることを特徴とする、請
   求項１に記載のヒトＴリンパ球。
3. 【請求項３】 以下の分子：ＣＤ５４、ＣＤ２５、ＣＤ８０、ＣＤ３０、Ｃ
   Ｄ４０−ＬおよびＣＤ７０のうち少なくとも１つを発現することを特徴とする、
   請求項１または２のいずれかに記載のヒトＴリンパ球。
4. 【請求項４】 請求項１〜３のうちの１項に記載された機能的なＣＤ８６分
   子を発現するヒトＴリンパ球の実質的に均一な集団を製造する方法であって、ヒ
   トＴリンパ球を含むサンプルを用いて、該リンパ球の少なくとも２回の連続的な
   刺激を実施することを特徴とする方法。
5. 【請求項５】 少なくとも１つのアクチベーター、およびヒトＴリンパ球の
   増殖を刺激する少なくとも１つのサイトカインを用いて各刺激を実施することを
   特徴とする、請求項４に記載の方法。
6. 【請求項６】 アクチベーターが抗ＣＤ２、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体
   ならびにマイトジェンから選択され、ヒトＴリンパ球の増殖を刺激するサイトカ
   インがＩＬ−２、ＩＬ−４およびＩＬ−７から選択されることを特徴とする、請
   求項５に記載の方法。
7. 【請求項７】 ヒトＴリンパ球を含むサンプルが、血液単核細胞（ＭＮＣ）
   のサンプルまたはＭＮＣ中に存在するＴリンパ球の単離物であることを特徴とす
   る、請求項４〜６のうちの１項に記載の方法。
8. 【請求項８】 以下の混合物： − 抗ＣＤ３抗体およびＩＬ−２、ならびに − 抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体およびＩＬ−２、 のうちの一方を用いて、刺激を実施することを特徴とする、請求項４〜７のうち
   の１項に記載の方法。
9. 【請求項９】 刺激の後、Ｔリンパ球の増殖を刺激するために、サイトカイ
   ンを定期的に添加することを特徴とする、請求項４〜８のうちの１項に記載の方
   法。
10. 【請求項１０】 ２回の刺激の間隔が少なくとも４日、好ましくは７日であ
    ることを特徴とする、請求項４〜９のうちの１項に記載の方法。
11. 【請求項１１】 第二の刺激後、好ましくは、４日よりも多くが経過した後
    に、実質的に均一な集団が産生され得ることを特徴とする、請求項４〜１０のう
    ちの1項に記載の方法。
12. 【請求項１２】 機能的なＣＤ８６分子を発現するヒトＴリンパ球の実質的
    に均一な集団であって、請求項４〜１１のうちの1項に記載される方法を用いて
    産生され得る集団。
13. 【請求項１３】 リンパ球が共刺激性、免疫刺激性、および細胞傷害性であ
    ることを特徴とする、請求項１２に記載の集団。
14. 【請求項１４】 請求項１２および１３のいずれかに記載の集団であって、
    リンパ球が、以下の分子： − ＣＤ５４、ＣＤ２５およびＣＤ８０、 のうちの１つをさらに発現することを特徴とする集団。
15. 【請求項１５】 請求項１２〜１４のうちの１項に記載の集団であって、リ
    ンパ球が、以下の分子： − ＣＤ３０、ＣＤ４０−ＬおよびＣＤ７０、 のうちの１つをさらに発現することを特徴とする集団。
16. 【請求項１６】 請求項１２〜１５のうちの１項に記載される、機能的なＣ
    Ｄ８６分子を発現するヒトＴリンパ球の実質的に均一な集団であって、該集団が
    、生物学的な抽出物、または生物学的な誘導体もしくはペプチドもしくはリポペ
    プチドでパルスされていることを特徴とする集団。
17. 【請求項１７】 請求項１２〜１６のうちの１項に記載の、機能的なＣＤ８
    ６分子を発現するヒトＴリンパ球の実質的に均一な集団であって、該集団がＤＮ
    Ａでトランスフェクトされているか、あるいは化学的分子または免疫学的分子に
    結合されていることを特徴とする集団。
18. 【請求項１８】 請求項１２〜１７のうちの１項に記載のＴリンパ球の集団
    によって産生されるリンフォカイン。
19. 【請求項１９】 請求項１８に記載のリンフォカインから得られる精製リン
    フォカイン。
20. 【請求項２０】 請求項１〜３のうちの１項に記載のヒトＴリンパ球、また
    は請求項１２〜１７のうちの１項に記載の集団、または請求項１８および１９の
    いずれかに記載のリンフォカインを少なくとも含むことを特徴とする治療的組成
    物。
21. 【請求項２１】 請求項１〜３のうちの１項に記載のリンパ球、あるいは請
    求項１２〜１７のうちの１項に記載の集団の使用であって、先天性、後天性、ま
    たは病気に起因する免疫不全の治療を意図した医薬品を調製するための使用。
22. 【請求項２２】 請求項１〜３のうちの１項に記載のリンパ球、あるいは請
    求項１２〜１７のうちの１項に記載の集団の使用であって、微生物疾患の治療を
    意図した医薬品を調製するための使用。
23. 【請求項２３】 請求項１〜３のうちの１項に記載のリンパ球、または請求
    項１２〜１７のうちの１項に記載の集団の使用であって、癌の治療を意図した医
    薬品を調製するための使用。
24. 【請求項２４】 請求項１〜３のうちの１項に記載のリンパ球、または請求
    項１２〜１７のうちの１項に記載の集団の使用であって、敗血性ショックの治療
    を意図した医薬品を調製するための使用。
25. 【請求項２５】 請求項１〜３のうちの１項に記載のリンパ球、または請求
    項１２〜１７のうちの１項に記載の集団を少なくとも含むことを特徴とするワク
    チン。
26. 【請求項２６】 機能的なＣＤ８６分子を発現するＴリンパ球を、血液また
    は組織サンプル中で検出することによる免疫不全の診断方法。