FR2789089A1 - Lymphocytes t humains effecteurs exprimant la molecule cd86 et possedant des proprietes immunodulatrices, costimulatrices et cytotoxiques, leurs procedes d'obtention et leurs applications - Google Patents
Lymphocytes t humains effecteurs exprimant la molecule cd86 et possedant des proprietes immunodulatrices, costimulatrices et cytotoxiques, leurs procedes d'obtention et leurs applications Download PDFInfo
- Publication number
- FR2789089A1 FR2789089A1 FR9901187A FR9901187A FR2789089A1 FR 2789089 A1 FR2789089 A1 FR 2789089A1 FR 9901187 A FR9901187 A FR 9901187A FR 9901187 A FR9901187 A FR 9901187A FR 2789089 A1 FR2789089 A1 FR 2789089A1
- Authority
- FR
- France
- Prior art keywords
- cells
- lymphocytes
- molecule
- human
- population
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 101000946850 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD86 Proteins 0.000 title claims abstract description 76
- 102100034924 T-lymphocyte activation antigen CD86 Human genes 0.000 title claims abstract description 76
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 44
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 title claims description 48
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 title claims description 29
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 title description 3
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 254
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 claims description 45
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 42
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 29
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 claims description 29
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 19
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 claims description 18
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 17
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 16
- 102100025221 CD70 antigen Human genes 0.000 claims description 15
- 101000934356 Homo sapiens CD70 antigen Proteins 0.000 claims description 15
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 claims description 14
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 13
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 13
- 101000599852 Homo sapiens Intercellular adhesion molecule 1 Proteins 0.000 claims description 12
- 102100037877 Intercellular adhesion molecule 1 Human genes 0.000 claims description 12
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 11
- 101000851376 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Proteins 0.000 claims description 10
- 102100036857 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Human genes 0.000 claims description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 10
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 claims description 9
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 claims description 9
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 9
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 8
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 claims description 8
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 claims description 7
- 239000012190 activator Substances 0.000 claims description 6
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 5
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 claims description 4
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 claims description 4
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 claims description 4
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 claims description 4
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 claims description 4
- 108010029697 CD40 Ligand Proteins 0.000 claims description 3
- 102100032937 CD40 ligand Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 claims description 3
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 claims description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 3
- 108010028921 Lipopeptides Proteins 0.000 claims description 2
- 206010040070 Septic Shock Diseases 0.000 claims description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 2
- 229960001438 immunostimulant agent Drugs 0.000 claims description 2
- 239000003022 immunostimulating agent Substances 0.000 claims description 2
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 claims description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 claims description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 2
- 230000036303 septic shock Effects 0.000 claims description 2
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 claims 2
- 206010021450 Immunodeficiency congenital Diseases 0.000 claims 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 claims 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 146
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 29
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 19
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 18
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 18
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 description 17
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 14
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 12
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 210000004296 naive t lymphocyte Anatomy 0.000 description 11
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 10
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 10
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 10
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 10
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 10
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 10
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 10
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 10
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 10
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 9
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 9
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 9
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 9
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 8
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 8
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 8
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 8
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 8
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 102100027268 Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Human genes 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 230000004044 response Effects 0.000 description 7
- DSIFMINXCSHZPQ-UHFFFAOYSA-M FUN-1 Chemical compound [I-].S1C2=CC=CC=C2[N+](C)=C1C=C(C1=CC=CC=C11)C=C(Cl)N1C1=CC=CC=C1 DSIFMINXCSHZPQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 6
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 6
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 6
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 6
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 5
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 5
- 210000003071 memory t lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 4
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 4
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 4
- 101710180188 T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 4
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 4
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 230000004940 costimulation Effects 0.000 description 4
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 4
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 238000007799 mixed lymphocyte reaction assay Methods 0.000 description 4
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 3
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 3
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 244000309466 calf Species 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 230000007402 cytotoxic response Effects 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- PGHMRUGBZOYCAA-UHFFFAOYSA-N ionomycin Natural products O1C(CC(O)C(C)C(O)C(C)C=CCC(C)CC(C)C(O)=CC(=O)C(C)CC(C)CC(CCC(O)=O)C)CCC1(C)C1OC(C)(C(C)O)CC1 PGHMRUGBZOYCAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PGHMRUGBZOYCAA-ADZNBVRBSA-N ionomycin Chemical compound O1[C@H](C[C@H](O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)/C=C/C[C@@H](C)C[C@@H](C)C(/O)=C/C(=O)[C@@H](C)C[C@@H](C)C[C@@H](CCC(O)=O)C)CC[C@@]1(C)[C@@H]1O[C@](C)([C@@H](C)O)CC1 PGHMRUGBZOYCAA-ADZNBVRBSA-N 0.000 description 3
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N phorbol 13-acetate 12-myristate Chemical compound C([C@]1(O)C(=O)C(C)=C[C@H]1[C@@]1(O)[C@H](C)[C@H]2OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)C(CO)=C[C@H]1[C@H]1[C@]2(OC(C)=O)C1(C)C PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 102100027207 CD27 antigen Human genes 0.000 description 2
- 108010021064 CTLA-4 Antigen Proteins 0.000 description 2
- 229940045513 CTLA4 antagonist Drugs 0.000 description 2
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 2
- 102100039498 Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Human genes 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 101000914511 Homo sapiens CD27 antigen Proteins 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 2
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 2
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 2
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- KQNZDYYTLMIZCT-KQPMLPITSA-N brefeldin A Chemical compound O[C@@H]1\C=C\C(=O)O[C@@H](C)CCC\C=C\[C@@H]2C[C@H](O)C[C@H]21 KQNZDYYTLMIZCT-KQPMLPITSA-N 0.000 description 2
- JUMGSHROWPPKFX-UHFFFAOYSA-N brefeldin-A Natural products CC1CCCC=CC2(C)CC(O)CC2(C)C(O)C=CC(=O)O1 JUMGSHROWPPKFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 102000055277 human IL2 Human genes 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 210000003810 lymphokine-activated killer cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N silver(1+) nitrate Chemical compound [Ag+].[O-]N(=O)=O SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- DQJCDTNMLBYVAY-ZXXIYAEKSA-N (2S,5R,10R,13R)-16-{[(2R,3S,4R,5R)-3-{[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy}-5-(ethylamino)-6-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy}-5-(4-aminobutyl)-10-carbamoyl-2,13-dimethyl-4,7,12,15-tetraoxo-3,6,11,14-tetraazaheptadecan-1-oic acid Chemical compound NCCCC[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@@H](C)NC(=O)C(C)O[C@@H]1[C@@H](NCC)C(O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 DQJCDTNMLBYVAY-ZXXIYAEKSA-N 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-OFKYTIFKSA-N 1-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(tritiooxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO[3H])O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(C)=C1 IQFYYKKMVGJFEH-OFKYTIFKSA-N 0.000 description 1
- BHNQPLPANNDEGL-UHFFFAOYSA-N 2-(4-octylphenoxy)ethanol Chemical compound CCCCCCCCC1=CC=C(OCCO)C=C1 BHNQPLPANNDEGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 3-[3-[3,5-dihydroxy-6-methyl-4-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]oxydecanoyloxy]decanoic acid;hydrate Chemical compound O.OC1C(OC(CC(=O)OC(CCCCCCC)CC(O)=O)CCCCCCC)OC(C)C(O)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(C)O1 HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 102100035793 CD83 antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010052382 CD83 antigen Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 1
- 108010015899 Glycopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000002068 Glycopeptides Human genes 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 102100022339 Integrin alpha-L Human genes 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 1
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 1
- 108010032774 Interleukin-2 Receptor alpha Subunit Proteins 0.000 description 1
- 102000007351 Interleukin-2 Receptor alpha Subunit Human genes 0.000 description 1
- 239000007760 Iscove's Modified Dulbecco's Medium Substances 0.000 description 1
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010064548 Lymphocyte Function-Associated Antigen-1 Proteins 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 1
- 108700012920 TNF Proteins 0.000 description 1
- 241000223997 Toxoplasma gondii Species 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002269 analeptic agent Substances 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000006023 anti-tumor response Effects 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005975 antitumor immune response Effects 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002619 cancer immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000008614 cellular interaction Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 235000003869 genetically modified organism Nutrition 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 230000009390 immune abnormality Effects 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000000207 lymphocyte subset Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 1
- 230000021821 regulation of B cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 206010040560 shock Diseases 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 229910001961 silver nitrate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N subtilin Chemical compound CC1SCC(NC2=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(=C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O)CSC(C)C2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C1NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C2NC(=O)CNC(=O)C3CCCN3C(=O)C(NC(=O)C3NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CC=4C5=CC=CC=C5NC=4)CSC3)C(C)SC2)C(C)C)C(C)SC1)CC1=CC=CC=C1 WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 229940021747 therapeutic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
- A61K39/4637—Other peptides or polypeptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/464499—Undefined tumor antigens, e.g. tumor lysate or antigens targeted by cells isolated from tumor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K2035/124—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells the cells being hematopoietic, bone marrow derived or blood cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
- C12N2501/515—CD3, T-cell receptor complex
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Neurology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
L'invention concerne des lymphocytes exprimant la molécule CD86 fonctionnelle, des procédés pour préparer une population pratiquement homogène de ces lymphocytes et leur application en thérapeutique et en diagnostique.
Description
<Desc/Clms Page number 1>
Lymphocytes T humains effecteurs exprimant la molécule CD86 et possédant des propriétés immunodulatriccs, costimulatriccs et cytotoxiqucs, leurs procédés d'obtention et leurs applications
La présente invention concerne des lymphocytes exprimant la molécule CD86 fonctionnelle, des procédés pour préparer une population pratiquement homogène de ces lymphocytes et leur application en thérapeutique et en diagnostique.
La présente invention concerne des lymphocytes exprimant la molécule CD86 fonctionnelle, des procédés pour préparer une population pratiquement homogène de ces lymphocytes et leur application en thérapeutique et en diagnostique.
Les lymphocytes T jouent un rôle essentiel dans la régulation d'une réponse immune ainsi que dans le maintien d'une réponse immune mémoire. De part les médiateurs solubles qu'ils produisent et les molécules de surface qu'ils expriment, ils contrôlent l'état d'activation de nombreuses cellules immunitaires effectrices comme les lymphocytes B, les monocytes, les macrophages et les cellules dendritiques (rôle d'initiateurs et de régulateurs) et participent directement à la destruction des agents exogènes pathogènes (tels que les virus et les bactéries) ou les cellules tumorales (rôle effecteur direct). Une activation des lymphocytes T est nécessaire pour qu'ils acquièrent des propriétés fonctionnelles (Swain SL et al, Immunol Rev. (1996) 150, 143-67).
L'immunothérapie cellulaire est un traitement qui consiste à réinjecter chez un patient des cellules autologues qui ont été modifiées ex vivo afin de leur conférer des propriétés physiologiques particulières, qu'elles ne peuvent pas acquérir in vivo. Par exemple, les sujets atteints de cancer ou d'immunosuppression ne développent pas de réponse effectrice efficace. Une approche classique en immunothérapie cellulaire consiste à prélever des cellules mononucléées sanguines (CMN), à les stimuler in vitro afin d'induire la prolifération et de conférer des propriétés cytotoxiques aux lymphocytes T. L'intérêt de stimuler les CMN ex vivo avant de les réinjecter permet d'éviter la toxicité liée à l'injection systémique d'activateurs lymphocytaires T.
Différentes méthodes ont été rapportées pour générer ex vivo des cellules T effectrices utilisables en immunothérapie cellulaire. Une cytokine classiquement utilisée dans ce type d'approche est l'interleukine 2 (IL-2) (Mule JJ et al, Science (1984) 225,1487-9 & brevet WO 91/4444) qui agit en favorisant la prolifération des lymphocytes T et en leur permettant d'acquérir des propriétés cytotoxiques. D'autres
<Desc/Clms Page number 2>
stimuli des lymphocytes T comme des cytokines (telles que l'IL-4 ou l'IL-7) ou des anticorps activateurs dirigés contre des molécules de surface (telles que les molécules CD3 (Landegren U et al, Eur J Immunol. (1984) 14, 325-8), CD2 (Van Lier RA et al, Eur J Immunol. (1988) 18,167-72 & Brevet Européen 40 96 55) et/ou CD28 (Greenfield EA, et al, Crit Rev Immunol. (1998) 18, 389-418)) sont utilisés seuls ou en association afin de générer ces cellules.
Néanmoins, l'activation de CMN in vitro ne conduit pas à l'expansion d'une population homogène de lymphocytes T ayant tous un phénotype et une fonction bien déterminés mais à un ensemble de populations présentant des degrés d'activation, des phénotypes et des propriétés fonctionnelles différents. La génération d'une population homogène, dont la production serait reproductible, dont les caractéristiques phénotypiques seraient connues, qui serait facilement identifiable et présenterait simultanément plusieurs fonctions effectrices (c'est-à-dire, outre des propriétés cytotoxiques, des propriétés immunologiques bénéfiques en cas d'immunosuppression), constituerait une avancée considérable. Ceci permettrait : (i) d'optimiser les procédures de stimulation ex vivo, (ii) d'évaluer ex vivo pour chaque sujet la composition de la préparation, (iii) de n'injecter au patient que les cellules d'intérêt et donc (iv) d'augmenter l'efficacité du traitement.
Jusqu'à présent, la relation entre les propriétés fonctionnelles et le phénotype des sous populations lymphocytaires T n'est pas complètement élucidée. Les lymphocytes T de type CD4 reconnaissent des fragments d'antigènes présentés par les cellules présentatrices d'antigène (CPAg) en association avec le complexe majeur d'histocompatibilité de classe II (CMH II) et sont considérés comme ayant des propriétés "helper" (c'est-à-dire capables d'aider les lymphocytes B et les lymphocytes T cytotoxiques à acquérir leurs propriétés fonctionnelles). Les lymphocytes de type CD8 reconnaissent des fragments d'antigènes présentés par les
CPAg en association avec le CMH 1 et sont généralement considérés comme possédant des propriétés cytotoxiques. De plus, il est clairement établi qu'une expression accrue d'un certain nombre de molécules telles que les molécules CD25 et
CD54 caractérisent les lymphocytes T activés (Swain SL et al, Immunol. Rev. (1996)
150,143-67). Les lymphocytes T n'ayant jamais rencontré l'antigène vis-à-vis duquel
CPAg en association avec le CMH 1 et sont généralement considérés comme possédant des propriétés cytotoxiques. De plus, il est clairement établi qu'une expression accrue d'un certain nombre de molécules telles que les molécules CD25 et
CD54 caractérisent les lymphocytes T activés (Swain SL et al, Immunol. Rev. (1996)
150,143-67). Les lymphocytes T n'ayant jamais rencontré l'antigène vis-à-vis duquel
<Desc/Clms Page number 3>
ils sont spécifiques sont appelés lymphocytes T naïfs et sont caractérisés par l'expression de la molécule CD45RA. Les lymphocytes T ayant déjà rencontré l'antigène vis-à-vis duquel ils sont spécifiques sont appelés lymphocytes T mémoires et expriment la molécule CD45RO (Swain SL et al, Immunol. Rev. (1996) 150, 143- 67).
L'intensité et la nature des signaux nécessaires à l'activation des lymphocytes T varient selon qu'il s'agit de lymphocytes T naïfs ou mémoires. Les lymphocytes T naïfs doivent recevoir plus de signaux de costimulation que les lymphocytes T mémoires pour être correctement activés et se différencier en cellules effectrices. Ces signaux de costimulation sont fournis par les CPAg et en particulier par les cellules dendritiques. Si les lymphocytes rencontrent l'antigène en l'absence de signaux de costimulation, ils deviennent anergiques, tolérants ou meurent par apoptose. Ainsi, des traitements visant à activer les lymphocytes T via les molécules de costimulation qu'ils expriment (à l'aide de ligands solubles recombinants ou de transfectants cellulaires exprimant ce ligand) sont donc proposés comme approche thérapeutique pour le traitement des phénomènes de tolérance et d'ignorance rencontrés par exemple dans les cancers (Melero 1 et al, Life Sci. (1997) 60,2035-41) mais également pour augmenter l'efficacité d'une réponse immune dirigée contre des agents exogènes pathogènes (Kaye PM, Immunol Today (1995) 16, 423-7).
Parmi les nombreuses molécules de costimulation connues, la molécule CD86 possède des propriétés de costimulation très puissantes. La molécule CD86 est exprimée constitutivement à la surface de nombreuses CPAg (Lenschow DJ et al, Annu Rev Immunol (1996) 14,233-58). Elle possède deux ligands : (1) la molécule CD28, exprimée constitutivement par les lymphocytes T, qui génère, après ligation à la molécule CD86 (ou à la molécule CD80), un puissant signal d'activation des lymphocytes T et (2) la molécule CTLA-4, exprimée uniquement par les lymphocytes T activés et qui génère, après ligation à la molécule CD86 (ou à la molécule CD80), un signal d'inhibition. L'activité fonctionnelle des lymphocytes T est donc régulée en partie par les signaux activateurs et inhibiteurs médiés par les molécules CD28 et
CTLA-4, respectivement. Récemment, l'expression et le rôle de la molécule CD86 ont été mis en évidence à la surface des lymphocytes T. La régulation de son
CTLA-4, respectivement. Récemment, l'expression et le rôle de la molécule CD86 ont été mis en évidence à la surface des lymphocytes T. La régulation de son
<Desc/Clms Page number 4>
expression sur les lymphocytes T reste mal connue et semble être différente chez l'homme et la souris. Les lymphocytes T murins expriment spontanément une forme fonctionnelle du CD86 (Hakamada-Taguchi R et al, Eur J Immunol. (1998) 28, 865- 73) alors que les lymphocytes T humains fraîchement isolés du sang ne l'expriment pas. Bien que son activité biologique n'ait pas été évaluée, la molécule CD86 a été décrite sur les lymphocytes T humains après activation des CMN in vitro (Azuma M et al, Nature (1993) 366,76-9). La seule étude qui a évalué l'activité biologique de la molécule CD86 sur les cellules T humaines a utilisé des clones lymphocytaires T humains et rapporte que la molécule CD86 exprimée par ces cellules est hypoglycosylée (comparativement à la molécule CD86 exprimée par les CPAg) et inactive (Hollsberg P et al, J. Immunol. (1997) 159, 4799-805).
La présente invention concerne une nouvelle population pratiquement homogène de lymphocytes T humains polyclonaux, caractérisée par l'expression de la molécule CD86 fonctionnelle et en outre par des propriétés cytotoxiques, immunostimulantes et surtout des propriétés costimulatrices.
Les propriétés costimulatrices ne sont qu'en partie médiées par l'expression de la molécule CD86, de nombreuses autres molécules de costimulation étant exprimées à des niveaux très importants ou de manière sélective sur ces cellules.
Un intérêt croissant est manifesté actuellement sur le rôle essentiel que peuvent jouer les molécules de costimulation en immunothérapie et en particulier en cancérologie. De ce fait, l'utilisation de ces lymphocytes T qui, en l'absence de toute transfection ou modification, expriment de façon constitutive de nombreuses molécules de costimulation, et en particulier la molécule CD86 fonctionnelle, apparaît un apport essentiel.
De manière exceptionnelle, en plus des propriétés cytotoxiques couramment générées après stimulation des CMN in vitro, les lymphocytes T selon la présente invention expriment de manière concomitante des propriétés de costimulation et d'immunostimulation, propriétés qui ne sont en général apportées par les CPAg. C'est la première fois que l'on décrit des lymphocytes T humains ayant des propriétés costimulatrices en partie médiées par la molécule CD86 fonctionnelle.
<Desc/Clms Page number 5>
Cette population peut être utilisée notamment en immunothérapie cellulaire dans le traitement des cancers, des maladies infectieuses, des déficits immunitaires et dans le domaine de la vaccinologie.
L'invention concerne également les lymphocytes T exprimant la molécule CD86 comme une source de nouvelles molécules lymphocytaires impliquées dans la réponse immune.
La présente invention concerne également un procédé de diagnostique d'anomalies immunitaires par la mise en évidence dans le sang ou les tissus de lymphocytes T exprimant la molécule CD86 fonctionnelle en utilisant notamment des anticorps anti-CD86. Ce diagnostique permettra, par exemple, de mettre en évidence des déficits immunitaires gravesd'origine congénitale (syndrome de Owen par exemple), des maladies auto-immunes (type arthrite), des infections virales (CMV et HIV) ou des infections bactériennes latentes.
L'invention concerne également des compositions thérapeutiques caractérisées en ce qu'elles comportent au moins des lymphocytes T ou une population de lymphocytes T humains pratiquement homogène exprimant la molécule CD86 fonctionnelle.
Les lymphocytes ou les populations de cellules obtenus peuvent être utilisés pour la réalisation d'un médicament destiné plus particulièrement au traitement des immunodéficiences congénitales, acquises ou d'origine pathologique. Il peut s'agir notamment du traitement des patients ayant une réponse immune absente ou déficiente vis-à-vis par exemple d'une tumeur ou d'un pathogène. Les produits selon l'invention pourront être utilisés notamment pour la réalisation d'un médicament destiné au traitement : - des affections microbiennes (virus, bactérie, parasite, levure, incluant notamment les problèmes liés aux transplantations) et, - des cancers, en particulier sujets HIV positifs et/ou atteints de myélome, lymphome, leucémie, mélanome, carcinome du rein, du cerveau, de la prostate, du rectum, du pancréas, des ovaires, du poumon, par exemple.
Les lymphocytes et les populations de lymphocytes T CD86+ selon la présente invention peuvent également être utilisés en tant qu'adjuvant ou immunostimulant en vaccinologie et ce en combinaison avec des antigènes vaccinants et/ou d'autres
<Desc/Clms Page number 6>
composés de type bactérien, viral ou ADN par exemple, afin de produire des vaccins thérapeutiques.
Les lymphocytes CD86+ et les populations contenant des lymphocytes T CD86+ selon la présente invention peuvent également être utilisés dans le cas de traitements des chocs septiques.
Il est important de remarquer que, grâce au procédé selon la présente invention, ces populations de lymphocytes T CD86+ peuvent être utilisées en injection autologue, c'est-à-dire qu'il est possible de partir des cellules du patient, CMN ou isolat de lymphocytes, de mettre en #uvre le procédé, puis de les réinjecter après stimulation. Ceci représente bien entendu l'énorme avantage d'écarter tout risque lié à des contaminations éventuelles et à tout phénomène d'antigénicité.
Bien entendu, les compositions thérapeutiques selon la présente invention pourront comprendre d'autres éléments utiles dans le traitement de pathologies particulières, il pourra s'agir de molécules chimiques, médicaments par exemple, ou biologiques, organismes génétiquement modifiés, bactérien ou viral, dont on voudra utiliser les gènes ou les antigènes.
Il sera possible également d'utiliser des lymphocytes ou des populations de lymphocytes T selon la présente invention caractérisés en ce qu'ils ont été pulsés avec un extrait biologique ou des dérivés biologiques, il peut s'agir dans ce cas de cellules ou de microbes ou de dérivés de type peptide, protéine, glycolipide, glycopeptide et lipopeptide par exemple ainsi que des mélanges, notamment d'antigènes, dans ce cas on utilise notamment la propriété des lymphocytes selon la présente invention à posséder des propriétés costimulatrices nécessaires lors du processus de présentation de l'antigène.
Enfin, la population de lymphocytes T selon la présente invention peut être transfectée ou couplée avec de l'ADN ou des molécules chimiques ou immuno- logiques, afin de favoriser par exemple l'expression et/ou le ciblage de certains de ces produits.
Les propriétés des populations selon la présente invention seront analysées ci- après avant les exemples.
<Desc/Clms Page number 7>
1. Procédé d'obtention
La présente invention concerne également un procédé d'obtention d'une population pratiquement homogène de lymphocytes T humains exprimant la molécule CD86 fonctionnelle, caractérisé en ce que, à partir d'un échantillon contenant des lymphocytes T humains, on effectue au moins deux stimulations séquentielles desdits lymphocytes. Par "population pratiquement homogène de lymphocytes T humains exprimant la molécule CD86 fonctionnelle" on entend désigner une population contenant plus de 70 %, de préférence plus de 90 %, de cellules T CD86+.
La présente invention concerne également un procédé d'obtention d'une population pratiquement homogène de lymphocytes T humains exprimant la molécule CD86 fonctionnelle, caractérisé en ce que, à partir d'un échantillon contenant des lymphocytes T humains, on effectue au moins deux stimulations séquentielles desdits lymphocytes. Par "population pratiquement homogène de lymphocytes T humains exprimant la molécule CD86 fonctionnelle" on entend désigner une population contenant plus de 70 %, de préférence plus de 90 %, de cellules T CD86+.
La stimulation est effectuée l'aide d'activateurs et de composés assurant la prolifération des lymphocytes T. Les activateurs sont choisis de préférence parmi les anticorps activateurs anti-CD2, anti-CD3 et anti-CD28 et les mitogènes ou des mélanges de ces composés ; on utilisera également des composés stimulant la prolifération des lymphocytes T, notamment les interleukines IL-2 (Mier JW et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 6134-6138 ; Northoff et al, J. Immunol.
(1980) 125, 1823-1828 ; Mier JW et al J. Immunol. (1982) 128, 1122-7), IL-4, IL-7 par exemple.
Parmi les mélanges de stimulations préférés, il faut citer : - les mélanges anticorps anti-CD3 et IL-2, et - les mélanges anticorps anti-CD28 et anticorps anti-CD3 et IL-2.
Par "stimulation séquentielle", on entend désigner deux stimulations effectuées sur culture de cellules en milieu neuf à au moins 4 jours d'intervalle, et de préférence à au moins 7 jours, en général cet intervalle sera de l'ordre de 1 à 3 semaines, il dépendra, en particulier, de l'intensité de la stimulation.
La présente invention concerne donc un procédé caractérisé en ce que la durée entre deux stimulations est d'au moins 4 jours, de préférence 7 jours.
Après chaque stimulation, on ajoute de préférence régulièrement, par exemple tous les 2 jours, une cytokine stimulant la prolifération des lymphocytes T.
Après la deuxième stimulation, de même, on attendra de préférence quelques jours, par exemple plus de 4 jours, en général plus de 7 jours, avant d'obtenir une population pratiquement homogène de lymphocytes T exprimant la molécule CD86.
Les lymphocytes T peuvent être cultivés avec tous les milieux appropriés, lesquels sont connus de l'homme de métier, des exemples de tels milieux de type
<Desc/Clms Page number 8>
RPMI 1640 seront explicités notamment dans les exemples. Le sérum de veau pourra être remplacé par du sérum humain autologue ou par un milieu adapté sans protéine d'origine animale ou humaine.
Les quantités d'agents stimulants utilisées varient en fonction de l'agent utilisé, par exemple les anticorps seront utilisés de préférence à des concentrations de 10 à 1 000 ng/ml, de préférence de 10 à 500 ng/ml, quant aux cytokines elles sont utilisées à des concentrations de l'ordre de 10 à 1 000 U/ml, notamment de 100à 500 U/ml.
Dans le procédé selon la présente invention, l'échantillon contenant des lymphocytes T est de préférence soit un prélèvement de cellules mononucléées sanguines (CMN), soit un isolat de lymphocytes T provenant de CMN.
Afin de générer rapidement une population pratiquement homogène de lymphocytes T CD86 positifs, on utilisera l'un des deux protocoles suivants : - Les cellules du sang sont prélevées du sang périphérique par leucophérèse et les CMN sont isolées par centrifugation sur un gradient de Ficoll-Hypaque (comme détaillé dans l'exemple 1). Une stimulation des CMN (106 cellules/ml) est réalisée dans le milieu de culture décrit dans l'exemple 1 (sachant que le sérum de veau pourra être remplacé par du sérum humain autologue ou par un milieu adapté sans protéine d'origine animale ou humaine) avec une quantité par exemple de 200 ng/ml d'anticorps monoclonal anti-CD3 humain OKT3 (Kung P et al, Science (1979) 206, 347-349 ; Tax, WMJM et al, Nature (1983) 304, 445-447) plus 200 U/ml d'IL-2 humaine recombinante. Tous les deux jours, de l'IL-2 humaine recombinante sera ajouté, par exemple 200 U/ml. A partir de 7 jours (et jusqu'à 21 jours comme décrit dans l'exemple 1), une seconde stimulation avec une quantité par exemple de 200 ng/ml d'anticorps monoclonal anti-CD3 humain OKT3 plus 200 U/ml d'IL-2 sera réalisée. Tous les deux jours, de l'IL-2 humaine recombinante sera ajoutée, par exemple 200 U/ml.
- Les cellules du sang sont prélevées du sang périphérique par leucophérèse et les CMN sont isolées par centrifugation sur un gradient de Ficoll-Hypaque (comme détaillé dans l'exemple 1). Les lymphocytes T sont isolés des CMN par la technique des rosettes avec des érythrocytes de mouton (comme détaillé dans l'exemple 3). Une stimulation des lymphocytes T (106 cellules/ml) est réalisée dans le milieu de culture
<Desc/Clms Page number 9>
décrit dans l'exemple 1 (sachant que le sérum de veau pourra être remplacé par du sérum humain autologue ou par un milieu adapté sans protéine d'origine animale ou humaine) avec un anticorps monoclonal anti-CD28 humain (préalablement adsorbé sur la surface de culture à la concentration de 20 g/ml) (Martin PJ et al, J. Immunol. (1986) 136,3282-7 ; Nunes J et al, Int. Immunol. (1993) 5,311-5) en présence d'une quantité par exemple de 200 ng/ml d'anticorps OKT3 plus 200 U/ml d'IL-2 humaine recombinante. Tous les deux jours, de l'IL-2 humaine recombinante sera ajoutée, par exemple 200 U/ml. A partir de J7, une seconde stimulation avec une quantité par exemple de 200 ng/ml d'anticorps OKT3 plus 200 U/ml d'IL-2 sera réalisée. Tous les deux jours, de l'IL-2 humaine recombinante sera ajoutée, par exemple 200 U/ml.
De façon générale, il faut noter qu'une seconde stimulation est toujours nécessaire afin d'obtenir une population homogène contenant essentiellement des lymphocytes T CD86+. En effet, le pourcentage de lymphocytes CD86+ varie dans le temps : consécutivement à une première stimulation, ces cellules apparaissent, prolifèrent puis disparaissent en l'absence de restimulation. Les données présentées dans l'exemple 1 décrivent la génération et la cinétique d'expression de la molécule CD86 sur les lymphocytes T après stimulation des CMN par un anticorps anti-CD3 activateur en présence d'IL-2 (Figure 1).
Que le protocole 1 ou 2 soit utilisé, deux approches peuvent être proposées afin d'isoler les cellules T CD86+ possédant les propriétés biologiques selon la présente invention.
On peut ainsi mettre en oeuvre les protocoles 1 et 2 comme décrits ci-dessus.
Pour la majorité des sujets, tous les lymphocytes expriment la molécule CD86 une semaine après la seconde stimulation. Si ce n'est pas le cas, les cellules seront cultivées de 2 à 4 jours supplémentaires avec par exemple 200 U/ml d'IL-2 pour obtenir une population de cellules T exprimant toutes la molécule CD86.
Il convient de rappeler que la présente invention concerne de façon générale les lymphocytes T CD86+, lesquels peuvent être obtenus notamment en mettant en oeuvre les protocoles 1 et 2 de façon incomplète, c'est-à-dire en ne faisant que la première stimulation avec l'anticorps anti-CD3 plus l'IL-2 (en présence ou non de l'anticorps anti-CD28). Dans ce cas, la totalité des cellules n'exprimant pas la
<Desc/Clms Page number 10>
molécule CD86 après au moins 7 jours de culture, les cellules CD86+ pourront être purifiées à l'aide d'un cytofluoromètre trieur de cellules. Les cellules CD86 négatives et positives seront isolées sur la base du niveau d'expression de la molécule IILA-Dr qui est plus faible sur les cellules CD86- que sur les cellules CD86+ (voir Exemple 3, Tableau 1 et Figure 3). Dans ce cas bien sûr, l'obtention d'une population homogène de lymphocytes T CD86+ peut être plus laborieuse mais peut être réalisée.
Le protocole utilisé montre qu'une population pratiquement homogène constituée de lymphocytes T humains CD86+ n'est générée qu'après une série d'au moins deux stimulations impliquant conjointement au moins deux stimuli de nature différente comme par exemple un anticorps anti-CD3 et de l'interleukine 2 (Exemple 1 et Figure 1) ou un anticorps anti-CD28, un anticorps anti-CD3 et de l'interleukine 2.
La présente invention concerne également une population pratiquement homogène de lymphocytes T humains CD86+ tels qu'ils peuvent être obtenus notamment par le procédé décrit précédemment mais qui peuvent être obtenus par d'autres procédés, notamment après une seule stimulation et un tri cellulaire.
2. Molécules de surface exprimées par les lymphocytes T CD86+
Les lymphocytes selon l'invention expriment au moins l'une des molécules suivantes de façon stable : CD25, CD54 et CD80, et de façon transitoire : CD30, CD40-L et CD70. La molécule CD86 constitue le marqueur de référence pour caractériser cette nouvelle population de lymphocytes T humains mémoires et effecteurs.
Les lymphocytes selon l'invention expriment au moins l'une des molécules suivantes de façon stable : CD25, CD54 et CD80, et de façon transitoire : CD30, CD40-L et CD70. La molécule CD86 constitue le marqueur de référence pour caractériser cette nouvelle population de lymphocytes T humains mémoires et effecteurs.
L'analyse phénotypique par cytofluorométrie de la population de lymphocytes T générés montre que ces cellules présentent un phénotype de cellules effectrices mémoires (Swain SL et al, Immunol Rev (1996) 150, 143-67) (Exemple 2 et Figure 2). Les lymphocytes T selon la présente invention expriment les molécules CD2,
CD3, CD4 ou CD8 et de façon remarquable, la molécule CD86. Ils expriment entre autres les molécules membranaires suivantes : CD25 (chaîne alpha du récepteur à l'interleukine 2), CD45RO (molécule exprimée de manière sélective par les lymphocytes T mémoires) (Exemple 2 et Figure 2), complexe majeur d'histocompatibilité de classe 1 (CMH I), CMH II, CD54 et CD80 (Exemple 3 et
CD3, CD4 ou CD8 et de façon remarquable, la molécule CD86. Ils expriment entre autres les molécules membranaires suivantes : CD25 (chaîne alpha du récepteur à l'interleukine 2), CD45RO (molécule exprimée de manière sélective par les lymphocytes T mémoires) (Exemple 2 et Figure 2), complexe majeur d'histocompatibilité de classe 1 (CMH I), CMH II, CD54 et CD80 (Exemple 3 et
<Desc/Clms Page number 11>
Tableau I). Ils expriment sélectivement, bien que de manière transitoire, la molécule CD30, le ligand de la molécule CD40 (CD40-L) et la molécule CD70 (Exemple 3 et Figure 3).
L'expression de nombreuses molécules membranaires diffère sur les lymphocytes T CD86+ et CD86- contenus dans une même population hétérogène (générée après seulement une stimulation, (voir Exemple 1)).
- La molécule CD86 n'apparaît que sur les lymphocytes T exprimant la molécule CD45RO (voir Exemple 2, Figure 2) ; la molécule CD45RO caractérise les cellules mémoires (Swain SL et al, Immunol. Rev. (1996) 150,143-67).
- Les molécules CD25, CD54, CD80 et HLA-Dr sont invariablement exprimées de façon plus importante sur les lymphocytes T CD86+ que sur les lymphocytes T CD86- (voir Exemple 3, Figure 3 et Tableau I) ; l'expression accrue des molécules CD25, CD54 et HLA-Dr sur les cellules CD86+ montrent qu'elles sont dans un état d'activation important (Swain SL et al, Immunol. Rev. (1996) 150, 143-67).
- L'expression membranaire des molécules CD30, CD40-L et CD70 est pratiquement restreinte aux lymphocytes T CD86+ (Exemple 3, Figure 3 et Tableau I).
2.1. Molécules de surface conférant des propriétés costimulatrices aux lymphocytes T CD86+.
Les molécules de costimulation CD54, CD70, CD80, et CD86 sont exprimées de façon accrue sur les lymphocytes T CD86+.
L'utilisation des molécules de costimulation apparaît actuellement comme une nouvelle approche thérapeutique de choix et est proposée notamment : (i) en immunothérapie anticancéreuse (Liebowitz DN et al, Curr Opin Oncol (1998) 10,
533-41) ; (ii) pour faciliter l'établissement d'une réponse lymphocytaire T efficace vis- à-vis d'agents exogènes microbiens (Kaye PM, Immunol Today (1995) 16, 423-7) ; et(iii) en tant qu'adjuvant en vaccinologie (Chamberlain RS et al, Cancer Res. (1996)
56,2832-6).
533-41) ; (ii) pour faciliter l'établissement d'une réponse lymphocytaire T efficace vis- à-vis d'agents exogènes microbiens (Kaye PM, Immunol Today (1995) 16, 423-7) ; et(iii) en tant qu'adjuvant en vaccinologie (Chamberlain RS et al, Cancer Res. (1996)
56,2832-6).
Ces molécules sont généralement exprimées de façon constitutive et à des taux élevés par les CPAg. Leur rôle principal est de fournir des cosignaux d'activation aux
<Desc/Clms Page number 12>
lymphocytes T lors de l'interaction CPAg-lymphocytes T. Ces interactions sont nécessaires à l'éducation et à l'activation des lymphocytes T lors de la présentation antigénique.
- La molécule CD54 se lie à la molécule LFA-1 qui transduit un puissant signal de costimulation aux lymphocytes T (Van Seventer GA et al, J. Immunol (1990) 144, 4579-86).
- De même, lorsque les molécules CD80 et CD86 se lient à leur ligand CD28 exprimé par les lymphocytes T, un signal de costimulation médié par le CD28 permet une activation efficace des lymphocytes T, objectivée par une augmentation de la prolifération et une production d'IL-2.
- La ligation de la molécule CD27, exprimée par les lymphocytes T non activés, par son ligand qui est la molécule CD70, induit la génération d'un signal de costimulation qui favorise la production de lymphokines et la prolifération cellulaire (Kobata T et al, J. Immunol. (1994) 153, 5422-32).
2.2. Molécules de surface conférant des propriétés cytotoxiques aux lymphocytes T CD86+.
Les molécules CD40-L, CD70, CD80 et CD86 sont exprimées par les cellules CD86+. Elles permettent aux lymphocytes T CD86+ d'acquérir des propriétés cytotoxiques. En effet : - L'activation des cellules Natural Killer (NK) via le CD27 (qui a pour ligand la molécule CD70) augmente leur activité cytotoxique (Yang FC et al, Immunology (1996) 88, 289-93).
- La molécule CD40-L va également favoriser le développement d'une réponse cytotoxique et ce par deux mécanismes : a. en se liant à la molécule CD40 exprimée par les CPAg, elle conduit à une activation des CPAg (et en particulier des cellules dendritiques) si puissante que ces cellules vont pouvoir conférer une activité cytotoxique à des lymphocytes T naïfs, en l'absence de lymphocyte T "helper" (Bennet SR et al., Nature (1988) 393,478-
83), b. en se liant à la molécule CD40 présente à la surface de certaines cellules tumorales, elle favorise le rejet de ces cellules par les lymphocytes cytotoxiques en augmentant
83), b. en se liant à la molécule CD40 présente à la surface de certaines cellules tumorales, elle favorise le rejet de ces cellules par les lymphocytes cytotoxiques en augmentant
<Desc/Clms Page number 13>
la sensibilité des cellules tumorales à la mort par apoptose et/ou en favorisant l'expression par des cellules tumorales de molécules de costimulation qui vont faciliter la génération d'une réponse cytotoxique spécifique (Dilloo D et al., Blood (1997) 80, 1927-33).
- Les molécules CD80 et CD86 sont essentielles dans la génération de réponses cytotoxiques antivirales et antitumorales. Cette activité particulière a été rapportée de nombreuses fois dans la littérature, en particulier dans des modèles de vaccination puisqu'elles favorisent l'induction d'une réponse lymphocytaire T cytotoxique spécifique. La molécule CD80 augmente les propriétés cytotoxiques des cellules NK (Yeh KY et al., Cell Immunol (1995) 165, 217-24) ainsi que la génération de lymphocytes T cytotoxiques mémoires (Flynn K & Mullbacher A, Eur J Immmunol (1997) 27,456-62). La transfection de cellules avec un gène codant pour la molécule CD80 augmente la fréquence de lymphocytes T cytotoxiques générés ainsi que leur activité fonctionnelle vis-à-vis de cellules infectées par un virus (He XS et al., Proc Natl Acad Sci USA (1996) 93,7274-8 ; Rao JB et al., J Immunol (1996) 156, 3357- 65 ; Tsuji T et al., Eur J Immunol (1997) 27, 782-7) ou vis-à-vis de cellules tumorales (Pützer BM et al., Proc Natl Acad Sci USA (1997) 94,10889-94 ; Imro MA et al., Hum Gene Ther (1998) 9,1335-44 ; Leong CC et al., Eur J Immunol (1997) 71, 476- 82). De la même manière, un signal via la molécule CD28, consécutif à l'interaction avec les molécules CD80 et/ou CD86, est requise pour générer des lymphocytes T cytotoxiques (Azuma M et al., J Immunol (1993) 150, 2091-101 ; Lanier LL et al., J Immunol (1995) 154,97-105). L'interaction des molécules CD80 et/ou CD86 avec leur ligand CD28 a également été impliquée dans la génération d'une réponse efficace vis-à-vis du parasite Toxoplasma gondii (Hunter CA et al, J Immunol (1997) 158, 2285-93).
2.3. Molécules de surface conférant des propriétés immunostimulatrices aux lymphocytes T CD86 + .
La molécule CD40-L confère aux cellules qui l'expriment des propriétés immunostimulantes. Après ligation à la molécule CD40, elle induit l'activation des monocytes (Laman JD et al., Crit Rev Immunol. (1996) 16,59-108) ainsi que la maturation (induction de l'expression de la molécule CD83) et l'activation (production
<Desc/Clms Page number 14>
d'IL-12) des cellules dendritiques. L'injection d'ADN codant pour la molécule CD40- L augmente l'efficacité d'une réponse immune (humorale et cellulaire) et induit une immunité protectrice contre des agents infectieux ou contre un challenge tumoral (Gurunathan et al., J Immunol. (1998) 161, 4563-71), Les molécules CD40-L et CD70 confèrent aux cellules qui les expriment la capacité de stimuler les lymphocytes B (propriété "helper" pour les lymphocytes B). En se fixantson ligand la molécule CD40, le CD40-L participe aux processus de commutation isotypique, de production d'immunoglobulines, de survie et de prolifération des lymphocytes B (Laman JD et al., Crit Rev Immunol. (1996) 16, 59-108). De la même manière, la molécule CD70 est impliquée dans la régulation de la prolifération des cellules B, de la production d'IgG et d'IgM et de la différentiation en plasmocytes (Agematsu K et al., Eur J Immunol. (1995) 25,2825-29).
3. Molécules produites par les lymphocytes T CD86+
La présente invention concerne les cytokines et notamment les lymphokines produites par une population de lymphocytes T CD86+ tels que décrits précédemment ainsi qu'une lymphokine purifiée obtenue à partir des lymphokines selon l'invention.
La présente invention concerne les cytokines et notamment les lymphokines produites par une population de lymphocytes T CD86+ tels que décrits précédemment ainsi qu'une lymphokine purifiée obtenue à partir des lymphokines selon l'invention.
Le profil de cytokines produites par les cellules T CD86+ est différent des cellules CD86-(Exemple 4, Figures 4a et 4b) : - certaines cytokines, comme l'interferon gamma (IFNy), sont produites en quantité beaucoup plus importante par les lymphocytes T CD86+ que par les lymphocytes T CD86- (Figure 4a). La fréquence de cellules produisant de l'IFNy est plus élevée dans les lymphocytes T CD86+ que dans les lymphocytes T CD86- (Figure 4b) ; - d'autres cytokines comme le TNFa sont produites en quantité très importante par les lymphocytes T CD86+ (de l'ordre de 10 à 100 ng/ml) mais également par les cellules CD86- (Figure 4b).
Ces deux cytokines participent aux activités cytotoxiques, immunostimulantes et costimulatrices des lymphocytes T CD86+.
L'IFNy joue un rôle crucial dans la résistance vis-à-vis des pathogènes et dans la réponse antitumorale. De plus, il possède des puissantes propriétés antivirales, augmente l'activité bactéricide des macrophages et favorise l'expression des molécules
<Desc/Clms Page number 15>
CMH 1 et CMH II et donc le développement des réponses immunes antimicrobiennes et antitumorales (Boehm U, Ann Rev Immunol (1997) 15,749-95). L'IFNy est utilisé en clinique dans le traitement des cancers (ex : cancer du rein).
Le TNFa induit la mort des cellules tumorales qui expriment l'un de ses récepteurs (Hieber U & Heim ME, Oncology (1994) 51, 142-53). Il joue également un rôle clé dans l'initiation de la phase inflammatoire en activant de nombreux partenaires cellulaires comme les cellules endothéliales, les cellules épithéliales et les cellules effectrices de la réaction inflammatoire comme les monocytes, les neutrophiles et les éosinophiles. En activant ces cellules, il participe également à la phase effectrice de la réponse antimicrobienne (Camussi G et al., Eur J Biochem (1991) 202,3-14).
Il est essentiel de noter que, de manière remarquable, les lymphocytes T CD86+ présentent de façon concomitante un ensemble de molécules de surface ou de cytokines exprimées par les cellules effectrices (comme les cellules cytotoxiques) mais également par les CPAg. Ceci leur confère la capacité d'initier, de réaliser (phase effectrice) et de contrôler une réponse immune. Ces propriétés sont exemplifiées cidessous.
4. Propriétés fonctionnelles des lymphocytes T exprimant la molécule CD86
L'invention revendique la génération d'une population pratiquement homogène de lymphocytes T humains exprimant la molécule CD86 et présentant de manière simultanée les fonctions effectrices suivantes : costimulation (c'est-à-dire qu'elles favorisent la génération d'une réponse lymphocytaire naïve), cytotoxicité (c'est-à-dire qu'elles assurent la destruction de cellules tumorales et/ou de micro-organismes pathogènes) et immunostimulation. Les propriétés effectrices des lymphocytes T
CD86+ ont été comparées à celles des cellules T CD86-.
L'invention revendique la génération d'une population pratiquement homogène de lymphocytes T humains exprimant la molécule CD86 et présentant de manière simultanée les fonctions effectrices suivantes : costimulation (c'est-à-dire qu'elles favorisent la génération d'une réponse lymphocytaire naïve), cytotoxicité (c'est-à-dire qu'elles assurent la destruction de cellules tumorales et/ou de micro-organismes pathogènes) et immunostimulation. Les propriétés effectrices des lymphocytes T
CD86+ ont été comparées à celles des cellules T CD86-.
4.1. Les lymphocytes T CD86+ possèdent de puissantes propriétés costimulatrices.
L'activation (prolifération et production de cytokines) des lymphocytes T naïfs (exprimant la molécule CD45RA) requiert au moins deux signaux : un premier signal via le récepteur T, qui peut être mimé par un anticorps anti-CD3, et un deuxième
<Desc/Clms Page number 16>
signal via des molécules de costimulation telles la molécule CD28. Deux types d'expériences ont été utilisés pour objectiver les propriétés costimulatrices des lymphocytes T CD86+. Dans ces deux types d'expériences des lymphocytes T naïfs ont été utilisés comme cellules répondeuses car c'est dans cet état d'activation que les lymphocytes T nécessitent de recevoir le plus de signaux de costimulation pour être activés. Les tests utilisés sont les suivants : - activation de lymphocytes T naïfs stimulés avec une dose suboptimale d'anticorps activateur anti-CD3 (OKT3). L'activation des lymphocytes T naïfs est objectivée par une induction de la prolifération (Exemple 5, Figure 5a) et de la production d'IFNy (Exemple 5, Figure 5b), - activation de lymphocytes T naïfs en présence de lymphocytes T CD86+ hétérologues. Dans ce test (réaction lymphocytaire mixte) est mesurée la prolifération des lymphocytes T naïfs (Exemple 5, Figure 5c).
Les résultats montrent que les lymphocytes T CD86+ sont capables d'activer les lymphocytes T naïfs. L'utilisation d'anticorps neutralisants anti-CD86 montre que la molécule CD86 exprimée par les lymphocytes T humains est biologiquement active et participe, au moins en partie, à l'activité de costimulation. Au contraire, les lymphocytes T CD86- ainsi que des lymphocytes T fraîchement isolés ne présentent pas ou peu d'activité de costimulation (Exemple 5, Figures 5a, 5b et 5c).
Cette mise en évidence d'une activité fonctionnelle de la molécule CD86 exprimée par les lymphocytes T humains est confortée par des expériences complémentaires montrant que la molécule CD86 exprimée par les lymphocytes T présente (i) une séquence nucléotidique équivalante à celle reportée dans la littérature (numéro d'accession U04343 dans la banque de données GenBank) ainsi que (ii) un degré de glycosylation similaire à celui de la molécule CD86 exprimée par les CPAg (Azuma M et al., Nature (1993) 366,76-9) (Exemple 6, Figure 6).
4.2. Les lymphocytes T CD86+ présentent des propriétés cytotoxiques.
La stimulation des lymphocytes T par l'IL-2 conduit à la génération de lymphocytes T tueurs (également appelés "lymphokine activated killer cells" ou LAK) possédant spontanément de puissantes propriétés cytotoxiques. La majorité des techniques de génération de cellules cytotoxiques consiste à stimuler des lymphocytes
<Desc/Clms Page number 17>
T in vitro avant de les réinjecter chez les patients. Ces protocoles exploitent le fait que la stimulation va non seulement induire une prolifération des lymphocytes T mais également leur conférer des propriétés cytotoxiques. En effet, en l'absence d'activation, les lymphocytes T naïfs ainsi que les lymphocytes mémoires n'ont pas ou peu de propriété cytotoxique.
Nous rapportons que les lymphocytes T CD86+ présentent spontanément une activité cytotoxique vis-à-vis de cellules tumorales (Exemple 7, Figure 7). Cette activité cytotoxique est également portée par une population mixte contenant des lymphocytes CD86+ et des lymphocytes CD86- et par les lymphocytes T CD86-. Par contre, les lymphocytes T fraîchement isolés et non activés ne tuent pas les cellules tumorales.
Un exemple utilisant comme cellule cible la lignée tumorale K562 est présenté dans l'exemple 7 (Figure 7).
Légendes des Figures : Figure 1 : Génération in vitro d'une population de lymphocytes T exprimant la molécule CD86 par stimulation de CMN issues du sang périphérique avec un anticorps anti-CD3 en présence d'IL-2. Des CMN humaines issues du sang périphérique ont été stimulées (à JO) avec l'anticorps anti-CD3 OKT3 et de l'IL-2 (comme décrit dans l'exemple 1) et ont été (0) ou non (#) stimulées une deuxième fois à J21 avec l'anticorps anti-CD3 OKT3 et de l'interleukine 2 (comme décrit dans l'exemple 1). De l'interleukine 2 est ajoutée tous les deux jours à la culture.
L'expression de la molécule CD86 sur les lymphocytes T CD3+ est évaluée en cytofluorométrie de façon cinétique sur 6 semaines par double marquage. Les résultats sont exprimés en pourcentage de cellules T exprimant la molécule CD86. Ils sont représentatifs d'une expérience parmi 10.
Figure 2 : Les lymphocytes T humains CD86+ expriment la molécule CD45RO. Des
CMN humaines ont été stimulées par l'anticorps anti-CD3 OKT3 et de l'interleukine 2 comme décrit dans l'exemple 1. L'expression de la molécule CD45RO par les lymphocytes T CD86+ et CD86- a été évaluée par double marquage en
CMN humaines ont été stimulées par l'anticorps anti-CD3 OKT3 et de l'interleukine 2 comme décrit dans l'exemple 1. L'expression de la molécule CD45RO par les lymphocytes T CD86+ et CD86- a été évaluée par double marquage en
<Desc/Clms Page number 18>
cytofluorométrie après 15 jours de culture. Les résultats sont représentatifs d'une expérience parmi 10.
Figure 3 : Expression préférentielle des molécules CD30, CD40 ligand et CD70 sur les lymphocytes T CD86+. Des CMN humaines ont été stimulées par l'anticorps OKT3 et de l'interleukine 2 comme décrit dans l'exemple 1. L'expression des molécules HLA-Dr, CD30, CD40-L et CD70 sur les lymphocytes T CD86+ et CD86- a été évaluée par double marquage en cytofluorométrie après 15 jours de culture. Les résultats sont représentatifs d'une expérience parmi 10.
Figures 4a et 4b : Comparaison de la production d'IFNv par les lymphocytes T CD86+ et CD86-.
Figure 4a : Des CMN ont été stimulées comme décrit dans l'exemple 1. Après 2 semaines de culture, les lymphocytes T CD86+ et CD86- ont été triés à l'aide d'un cytofluoromètre trieur de cellules et stimulés avec de la PMA plus de la ionomycine pendant 6 heures. La population totale a également été traitée de la même façon après ou non incubation avec l'anticorps neutralisant anti-CD86 (IT2.2). L'IFNy a été dosé dans les surnageants par ELISA. Les résultats, exprimés en pg/ml (moyenne ~ SD) sont représentatifs d'une expérience parmi 3.
Figure 4b : Des CMN ont été stimulées comme décrit dans l'exemple 1. Après 3 semaines de culture, les cellules ont été stimulées pendant 6 heures avec de la PMA plus ionomycine en présence de brefeldine A. Les cellules ont alors été marquées avec un anticorps anti-CD86, fixées, perméabilisées puis marquées avec un anticorps antiIFNy. Les résultats sont représentatifs d'une expérience parmi 3.
Figures 5a. 5b et 5c : Les lymphocytes T CD86+ fournissent les signaux de costimulation nécessaires à l'activation des lymphocytes T naïfs.
Figures 5a et 5b : Test de costimulation de cellules T naïves en présence d'un anticorps anti-CD3. Les cellules T CD86+, générées et purifiées comme décrit dans l'exemple 1, ont été fixées à la paraformaldéhyde puis cultivées avec des lymphocytes T naïfs stimulés avec un anticorps anti-CD3 en présence ou non d'anticorps neutralisants anti-CD86 (clones IT2. 2 ou FUN-1) ou d'un anticorps monoclonal d'isotype contrôle. L'activation des lymphocytes T est objectivée par une induction de
<Desc/Clms Page number 19>
la prolifération (n=5) (figure 5a) et de la production d'IFNy (n=3) (figure 5b). Les résultats sont exprimés en moyenne SD, n=3.
Figure 5 : Test de réaction lymphocytaire mixte. Les lymphocytes T CD86+ et CD86- ont été générés et purifiés comme décrit dans l'exemple 1. Les cellules ont été fixéesà la paraformaldéhyde puis cultivées avec des lymphocytes T naïfs allogéniques en présence d'anticorps neutralisants anti-CD86 (clones IT2.2 ou FUN-1) ou d'un anticorps monoclonal d'isotype contrôle. La prolifération des lymphocytes T naïfs a été mesurée après 5 jours d'incubation par incorporation de 'H-Thy. Les expériences ont été réalisées en quintuplicate, les résultats sont exprimés en moyenne SD, n=3.
Figure 6 : La molécule CD86 exprimée par les lymphocytes B et T humains présente un poids moléculaire similaire de 70 kDa. Des extraits de protéines membranaires et solubles de la lignée B humaine Daudi, de cellules T CD86+ (obtenues comme décrit dans l'exemple 1) et de la lignée T Jurkat ont été séparés selon leur poids moléculaire en SDS-PAGE en condition réduite. L'expression de la molécule CD86 a été évaluée par Wertern Blotting en utilisant un anticorps polyclonal anti-CD86 humain.
Figure 7 : Les lymphocytes T CD86+ présentent ne activité cytotoxique spontanée vis-à-vis de la lignée tumorale K562. Une population pratiquement homogène de lymphocytes T CD86+ a été obtenue. La population cellulaire contenant des cellules T CD86+ et des cellules T CD86- a été obtenue 15 jours après la première stimulation de CMN comme décrit dans l'exemple 1. Les cellules T CD86- et les cellules CD86+ ont été purifiées à l'aide d'un trieur de cellules comme décrit dans l'exemple 4. Les cellules T non activées ont été obtenues par la technique des rosettes comme décrit dans l'exemple 3. Les cellules cibles K562 marquées au 51Cr ont été incubées avec les cellules effectrices suivantes (selon un rapport cellules effectrices : cellules cibles de 50:1) : des lymphocytes T fraîchement isolés et non stimulés, la population cellulaire contenant des cellules CD86+ et des cellules T CD86-, des lymphocytes T CD86+ purifiés et des lymphocytes T CD86- purifiés est mesurée en triplicate par le relargage de 51Cr et est exprimée en pourcentage de cytotoxicité comme défini dans l'exemple 7 (moyenne SD, n=3).
<Desc/Clms Page number 20>
Exemple 1 : Génération d'une population homogène de lymphocytes T humains exprimant la molécule CD86 après stimulation de cellules mononucléécs humaines isolées du sang périphérique avec un anticorps anti-CD3 en présence d'IL-2.
Nous exemplifions ici une méthode permettant de générer des lymphocytes T CD86 positifs ainsi qu'une étude cinétique d'apparition de la molécule CD86 sur les lymphocytes T (voir Figure 1). a. Méthodologie . Génération de lymphocytes T humains exprimant la molécule CD86.
Les lymphocytes T CD86 positifs (CD86+) sont générés à partir de sang périphérique humain. Le sang est prélevé par leucophérèse (en présence d'anticoagulant comme par exemple l'héparinate de lithium). Les cellules mononucléées (CMN) (contenant les lymphocytes T, les lymphocytes B et les monocytes) sont isolées par centrifugation sur un gradient de Ficoll-Hypaque (densité =1,077) (Pharmacia, Uppsala, Suède). Brièvement, les cellules du sang sont centrifugées à 1500 rpm pendant 30 minutes à température ambiante. Les CMN, localisées à l'interface Ficoll-plasma, sont récupérées et lavées deux fois en présence de milieu RPMI 1640 (Life technologies). Les CMN sont ensuite mises en culture à la concentration de 1x106 cellules/ml dans le milieu suivant (dénommé par la suite milieu de culture complet) : 1640 supplémenté de 10 % de sérum de veau foetal décomplémenté (chauffage à 56 C pendant 30 minutes), 2 mM L- glutamine. Les CMN sont activées avec une concentration minimale de 200 ng/ml d'anticorps monoclonal anti-CD3 humain clone OKT3 en présence d' interleukine 2 (IL-2) humaine recombinante à la concentration de 200 U/ml. De l'IL-2 humaine est ajoutée à la culture tous les deux jours. Une deuxième stimulation des cellules à J21 va permettre de générer une population homogène de lymphocytes T humains exprimant tous la molécule CD86. Brièvement, les lymphocytes sont collectés à J21, lavés deux fois en milieu RPMI 1640 puis remis en culture dans du milieu de culture complet à la concentration de 1x106 cellules/ml. Les cellules sont activées avec 200 ng/ml d'anticorps anti-CD3 et 200 U/ml d'IL-2 recombinante. De l'IL-2 (200 U/ml) est ajoutée tous les deux jours.
<Desc/Clms Page number 21>
L'anticorps anti-CD3 humain (clone OKT3) est produit par le myélome CRL- 8001 obtenu auprès de l'American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Le myélome est cultivé en milieu Dulbecco modifiée selon Iscove (Life technologies) supplémenté de 20 % de sérum de veau foetal décomplémenté, 2 mM de L-glutamine, 100 U/ml de pénicilline et 100 g/ml de streptomycine. L'anticorps est purifié par fixation sur une colonne de protéine A couplée à de la Sépharose (Pierce). Ils sont ensuite détachés de la résine en présence d'une solution Tris-HCl 10 mM pH 4. Le pH de la fraction éluée est ensuite ramené à pH 7,0. La fraction éluée est concentrée puis quantifiée (réactif de colorimétrie des protéines BCA, Pierce). La pureté des anticorps anti-CD3 est vérifiée par électrophorèse en gel de polyacrylamide en condition réduite et non réduite avant coloration au nitrate d'argent. La pureté est > 95 %. La stérilité de la solution d'anticorps anti-CD3 est assurée par filtration sur 0,22 m.
L'interleukine 2 humaine recombinante (produite en système procaryotique) est obtenue auprès de R & D Systems (Abingdon, Royaume Uni). b. Méthodologie : Analyse par cytofluorométrie de l'expression de la molécule CD86 sur les lymphocytes T par double marquage.
A différents temps, un échantillon de la culture cellulaire est prélevé pour analyser l'expression de la molécule CD86 sur les lymphocytes T par double marquage en cytométrie en flux (cytofluorimètre de type FACS Vantage ; Becton Dickinson, Erembodegem, Belgique). Les cellules sont lavées dans du tampon FACS (tampon phosphate 10 mM, pH 7,4 contenant 1 % de sérum albumine bovine et 0,01 % d'azide de sodium) avant d'être réparties dans des puits d'une plaque de culture 96 puits à fond conique (Nunc, Roskilde, Danemark) à raison de 2x10-5 cellules dans un volume de 50 fil de tampon FACS. Dans chaque puits est ajouté soit un anticorps anti-CD3 humain marqué à la phycoerythrine (anti-CD3 PE) (Becton Dickinson) soit un anticorps isotypique contrôle marqué à la phycoerythrine (Becton Dickinson). Dans chacune de ces conditions est ajouté soit un anticorps anti-CD86 humain marqué à la biotine (clone IT2.2 ; soit un anticorps contrôle.
Après 20 minutes d'incubation à 4 C, les cellules sont lavées 2 fois avec 200 (il de tampon FACS avant d'être incubées en présence de streptavidine marquée au
Cychrome (Pharmingen) à la concentration de 10 g/ml pour détecter l'anticorps anti-
Cychrome (Pharmingen) à la concentration de 10 g/ml pour détecter l'anticorps anti-
<Desc/Clms Page number 22>
CD86. Après 20 minutes d'incubation à 4 C, les cellules sont lavées 3 fois avec 200 ni de tampon FACS puis sont remises en suspension dans 200 l de ce même tampon. L'analyse de l'expression de CD86 à la surface des lymphocytes T (CD3+) est analysée par FACS. c. Résultats : les résultats présentés dans la Figure 1 montrent que : - La molécule CD86 n'est pas exprimée par les lymphocytes T humains fraîchement isolés du sang périphérique.
- Des cellules T CD86+ sont détectées dès J3 après la première stimulation.
- Le pourcentage de lymphocytes T CD86+ varie avec le temps.
- Deux à trois semaines après la stimulation, la culture contient classiquement 50 10 % de lymphocytes T CD86+ (résultat obtenu sur 20 expériences).
- Le pourcentage de cellules CD86+ décroît après 4 à 5 semaines en l'absence de restimulation.
- En réponse à une deuxième stimulation à J21, le pourcentage de lymphocytes T CD86+ continue d'augmenter jusqu'à obtention d'une population homogène de lymphocytes qui expriment tous la molécule CD86.
Exemple 2 : de la molécule CD86 est restreinte aux lymphocytes T exprimant la molécule CD45RO (lymphocytes mémoires).
On montre que l'expression de la molécule CD86 est restreinte aux lymphocytes T mémoires (exprimant la molécule CD45RO) (voir Figure 2). a. Méthodologie : Des CMN humaines ont été stimulées par l'anticorps antiCD3 OKT3 et de l'IL-2 comme décrit dans l'exemple 1. L'expression de la molécule CD45RO sur les lymphocytes T CD86+ et CD86- a été évaluée par cytofluorométrie en double marquage après 15 jours de culture. En effet, nous avons observé qu'après 7 jours de culture la totalité des cellules de la population est constituée de lymphocytes T CD3+. 2x105 cellules sont lavées dans du tampon FACS, remises en suspension dans du tampon FACS et réparties dans une plaque de culture 96 puits à fond conique à raison de 50 l/puits. Dans chaque puits est ajouté soit un anticorps anti-CD45RO humain FITC (Becton Dickinson), soit un anticorps isotypique contrôle (Becton
Dickinson). L'expression de CD86 est évaluée à l'aide d'un anticorps anti-CD86
Dickinson). L'expression de CD86 est évaluée à l'aide d'un anticorps anti-CD86
<Desc/Clms Page number 23>
humain marqué à la biotine. Après incubation à 4 C, les cellules sont lavées 2 fois avec 200 l de tampon FACS avant d'être incubées en présence de streptavidine marquée au Cychrome à la concentration de 10 g/ml pour détecter l'anticorps antiCD86. Après 20 minutes d'incubation à 4 C, les cellules sont lavées 3 fois avec 200 l de tampon FACS puis sont resuspendues dans 200 l de ce même tampon. b. Résultats : Les résultats présentés dans la Figure 2 montrent que tous les lymphocytes T CD86+ présentent un phénotype de cellule mémoire puisqu'ils expriment la molécule CD45RO.
Exemple 3 : aux lymphocytes T CD86-, les lymphocytes T CD86+ expriment des taux plus importants de molécules de costimulation et d'activation et expriment sélectivement certaines molécules jouant un rôle crucial dans la réponse immune.
On compare l'expression des molécules de surface présentes sur les lymphocytes T CD86+ et CD86- issus d'une même population hétérogène obtenue deux semaines après la première stimulation. Les résultats sont présentés dans le tableau 1 et certains exemples sont détaillés dans la figure 3. a. Méthodologie : Les CMN ont été stimulées avec l'anticorps anti-CD3 OKT3 et de l'IL-2 pendant 15 jours comme décrit dans l'exemple 1. Le phénotype des lymphocytes T CD86+ et CD86- a été analysé par FACS en double marquage. Le phénotype est comparé à celui des lymphocytes T fraîchement isolés du sang qui ont été purifiés par la technique des rosettes avec des érythrocytes de mouton.
Brièvement, les CMN sont remises en suspension à la concentration de 200x106 cellules/ml et mélangées avec 1 ml d'une solution à 50 % d'érythrocytes de mouton (BioMérieux, Marcy l'Etoile, France). La suspension cellulaire est incubée à 4 C pendant une nuit. Après une remise en suspension douce, les cellules T sont isolées par centrifugation sur un gradient de Ficoll-Hypaque (1500 rpm pendant 30 minutes à température ambiante). Les complexes érythrocytes de mouton-lymphocytes T sont collectés au fond du tube. Les globules rouges sont lysés par deux chocs hypotoniques successifs. La pureté des cellules T ainsi isolées, évaluée grâce à un marquage avec un anticorps anti-CD3 FITC, est > 95 %.
<Desc/Clms Page number 24>
Le marquage cellulaire avec les anticorps est réalisé comme décrit dans l'exemple 1 : les cellules sont lavées dans du tampon FACS avant remise en suspension dans du tampon FACS à raison de 2x106 cellules/ml. Les cellules sont ensuite réparties dans les puits d'une plaque de culture 96 puits à fond conique à raison de 50 1/puits. Dans chacune des conditions sont ajoutés soit un anticorps antiCD54 FITC, soit un anticorps anti-CD80 FITC, soit un anticorps anti-HLA-Dr FITC (tous provenant de Becton Dickinson), soit un anticorps anti-CD70 FITC (Pharmingen, San Diego, CA), soit un anticorps anti-CD30 FITC (Dako, Glostrup, Danemark), soit un anticorps anti-CD40-L FITC (Ancell, Bayport, MN), soit les anticorps contrôles correspondant à chaque isotype (Becton Dickinson). L'expression de la molécule CD86 est évaluée à l'aide d'un anticorps anti-CD86 humain marqué à la biotine (clone IT2. 2) (Pharmingen). Après 20 minutes d'incubation à 4 C, les cellules sont lavées 3 fois avec 200 l de tampon FACS avant d'être incubées en présence de streptavidine marquée au Cychrome (Pharmingen) à la concentration de 10 g/ml pour détecter les anticorps anti-CD86. Après 20 minutes d'incubation à 4 C, les cellules sont lavées 3 fois avec 200 /il de tampon FACS avant d'être resuspendues dans 200 l de ce même tampon pour l'analyse au cytofluoromètre. L'expression des molécules CD54, CD80, HLA-Dr, CD70, CD30 et CD40-L est comparée sur les lymphocytes T fraîchement isolés, les lymphocytes T CD86- et les lymphocytes T CD86+. b. Résultats : Comme présenté dans le tableau 1 et la figure 3, les résultats montrent que : - Les lymphocytes T fraîchement isolés expriment les molécules d'activation à des taux faiblement détectables et n'expriment pas les molécules de costimulation CD80 et CD86.
- Les lymphocytes T CD86+ expriment des taux plus élevés de marqueurs d'activation CD25 et HLA-Dr que les lymphocytes T CD86-.
- Les lymphocytes T CD86+ expriment des taux plus élevés des molécules de costimulation CD54 et CD80 que les lymphocytes CD86-.
- La molécule CD30 n'est pas exprimée par des lymphocytes T fraîchement purifiés.
<Desc/Clms Page number 25>
- La molécule CD30 est exprimée uniquement par les lymphocytes CD86+.
- Les molécules de la famille du TNFa comme les molécules CD40-L et CD70 ne sont pas exprimées par des lymphocytes T fraîchement purifiés, sont peu exprimées sur les cellules CD86- mais sont essentiellement exprimées par les lymphocytes CD86+.
Le tableau 1 ci-après présente les résultats obtenus après comparaison des molécules de surface exprimées par des lymphocytes T humains CD86+ et des lymphocytes T CD86-. Des CMN humaines ont été stimulées avec l'anticorps antiCD3 OKT3 et de l'IL-2 comme décrit dans l'exemple 1. L'expression de différentes molécules de surface sur les lymphocytes T CD86+ et CD86- est réalisée par double marquage en cytofluorométrie (FACScan, Becton Dickinson) après deux semaines de culture. Les résultats présentés résument les données obtenues avec les cellules provenant de 5 sujets différents. Le symbole* représente le pourcentage de cellules positives (moyenne SD, n=5).
Tableau I. Caractérisation phénotypique des lymphocytes T exprimant la molécule CD86 et des lymphocytes T n'exprimant pas la molécule CD86 (les valeurs entre parenthèses correspondent au pourcentage de cellules exprimant la molécule).
<tb>
<tb>
<tb>
Cellules <SEP> T
<tb> fraîchement <SEP> CD86 <SEP> - <SEP> CD86 <SEP> +
<tb> isolées
<tb> HLA-Dr <SEP> +/- <SEP> (5% <SEP> 1) <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP>
<tb> CD25 <SEP> - <SEP> ++ <SEP> +++
<tb> CD30- <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> (40 <SEP> % <SEP> ~ <SEP> 12)
<tb> CD40-L- <SEP> + <SEP> (10 <SEP> % <SEP> ~ <SEP> 3)
<tb> CD54 <SEP> +/- <SEP> + <SEP> ++
<tb> CD70- <SEP> + <SEP> + <SEP> (39 <SEP> % <SEP> ~ <SEP> 8)
<tb> CD80- <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP>
<tb>
<tb> fraîchement <SEP> CD86 <SEP> - <SEP> CD86 <SEP> +
<tb> isolées
<tb> HLA-Dr <SEP> +/- <SEP> (5% <SEP> 1) <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP>
<tb> CD25 <SEP> - <SEP> ++ <SEP> +++
<tb> CD30- <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> (40 <SEP> % <SEP> ~ <SEP> 12)
<tb> CD40-L- <SEP> + <SEP> (10 <SEP> % <SEP> ~ <SEP> 3)
<tb> CD54 <SEP> +/- <SEP> + <SEP> ++
<tb> CD70- <SEP> + <SEP> + <SEP> (39 <SEP> % <SEP> ~ <SEP> 8)
<tb> CD80- <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP>
<tb>
<Desc/Clms Page number 26>
Exemple 4 : lymphocytes T CD86 positifs produisent de plus grandes quantités d'IFNy que les lymphocytes T CD86 négatifs.
On exemplifie ici le fait que les lymphocytes T humains CD86+ produisent plus d'IFNy que les lymphocytes T humains CD86-. Ceci a été objectivé par deux approches différentes. a. Méthodologie : Mesure de la production d'IFNy par ELISA.
Des CMN ont été stimulées comme décrit dans l'exemple 1. Après deux semaines de culture, les cellules CD86+ ont été séparées des cellules CD86- à l'aide d'un cytofluoromètre trieur de cellules (FACSVantage, Becton Dickinson).
Brièvement, les cellules ont été incubées avec un anticorps anti-CD86 FITC (clone IT2. 2, Pharmingen) (5 g d'anticorps pour 5x106 cellules/500 l) pendant 20 minutes à 4 C. Après trois lavages avec du milieu de culture complet, les cellules CD86+ sont séparées des cellules CD86- sur la base de l'expression de la molécule CD86. La pureté des deux populations lymphocytaires T, analysée par cytofluorométrie, est > 98 % . En tant que contrôle, les populations non séparées sont incubées ou non avec un anticorps neutralisant anti-CD86 (IT2.2, utilisé à 10 g/ml) ont également été utilisées.
Les cellules sont remises en suspension dans du milieu de culture complet à la concentration de 2x106 cellules/ml et activées ou non avec pendant 6 heures avec 10 ng/ml de phorbol myristate acétate (Sigma, Saint Louis, MO) plus 1 M de ionomycin (Calbiochem, San Diégo, CA). Les surnageants de culture sont collectés et centrifugés à 2500 rpm pendant 15 minutes à 4 C. Les taux d'IFNy sont quantifiés dans les surnageants en utilisant un kit ELISA commercial (R & D Systems, Abingdon, Royaume Uni). Les résultats, exprimés en ng/ml (moyenne SD, n=3), sont présentés dans la figure 4a. b. Méthodologie : Mesure de la fréquence de lymphocytes T producteurs IFNy parmi les lymphocytes T CD86+ et CD86-.
Dans ce cas, les lymphocytes T sont stimulés en présence de 2,5 g/ml de bréfeldine A (Molecular Probes, Eugene, OR). Après lavage, les cellules sont incubées dans une plaque de culture 96 puits à fond conique avec un anticorps antiCD86 marqué à la biotine. Après 20 minutes d'incubation à 4 C, les cellules sont
<Desc/Clms Page number 27>
lavées 3 fois avec 200 /il de tampon FACS avant d'être incubées en présence de streptavidine marquée au Cychrome comme décrit dans l'exemple 1. Après 20 minutes d'incubation à 4 C, les cellules sont lavées 3 fois avec 200 l de tampon FACS avant d'être fixées et perméabilisées en utilisant un kit commercial en respectant la procédure décrite (kit Cytowash/cytoperm, Pharmingen). Les cellules (2x10) sont incubées dans une plaque de culture 96 puits à fond conique avec un anticorps anti-IFNy FITC pendant 20 minutes à 4 C sous un volume de 50 /il. Après deux lavages dans du tampon FACS, les cellules sont analysées au cytofluoromètre.
Les résultats sont présentés dans la figure 4b. c. Résultats : les résultats présentés dans les Figures 4 a et 4b montrent que : - Consécutivement à une stimulation, la fréquence de cellules productrices d'IFNy est plus importante dans la population de lymphocytes CD86+ que dans la population de lymphocytes T CD86- (Figure 4a) - Les lymphocytes T CD86+ produisent plus d'IFNy que les lymphocytes T CD86- après activation (Figure 4b).
Exemple 5 : Les lymphocytes T humains CD86 positifs fournissent les signaux de costimulation nécessaires à la prolifération et à l'activation des lymphocytes T naïfs.
On exemplifie ici le fait que les lymphocytes T humains CD86+ mais pas les lymphocytes T CD86- fournissent les signaux de costimulation requis pour induire une activation efficace des lymphocytes T naïfs (mesurée par l'induction de prolifération et/ou de la production d'IFNy) (Figures 5 a, 5b et 5c). a. Méthodologie : Expériences de costimulation utilisant un anti-CD3.
Les lymphocytes T CD86+ ont été générés comme décrit dans l'exemple 1 et utilisés une semaine après la seconde stimulation (exemple 1, figure 1). Les lymphocytes T CD86- ont été isolés deux semaines après stimulation (comme décrit dans l'exemple 1) à l'aide d'un cytofluoromètre trieur de cellules (comme décrit dans l'exemple 4a). Les cellules sont ensuite fixées à l'aide d'une solution de paraformaldéhyde à 1 % préparée en tampon phosphate 10 mM, pH 7,4 pendant 10 minutes à 4 C. Après trois lavages en tampon phosphate, les cellules sont incubées
<Desc/Clms Page number 28>
avec une solution de neutralisation (200 mM L-lysine, Sigma). Après trois lavages en tampon phosphate, les cellules sont remises en suspension dans du milieu de culture complet à la concentration de 2x106 cellules/ml.
Les lymphocytes T naïfs (CD45RA positifs) sont isolés du sang périphérique.
Brièvement, les CMN sont isolées par centrifugation sur gradient de Ficoll-Hypaque comme décrit dans l'exemple 1 et les lymphocytes T sont purifiés par la technique des rosettes, comme décrit dans l'exemple 3. Après lavage, les cellules sont remises en suspension dans le milieu de culture complet et incubées avec un anticorps antiCD45RO pendant 20 minutes à 4 C (5 g d'anticorps pour 5x106 cellules/1 ml de suspension cellulaire). Après lavage, les cellules sont incubées avec des billes magnétiques portant des anticorps anti-immunoglobulines de souris (système Dynabeads, Dynal). Les lymphocytes T CD45RO+ sont retirés de la suspension cellulaire par action d'un champ magnétique. Après lavage, la population de cellules T CD45RA+ CD45RO- est remise en suspension dans du milieu de culture complet à la concentration de 2x106 cellules/ml. La pureté, déterminée par cytofluorométrie en utilisant un anticorps anti-CD45RA FITC comparativement à un anticorps isotypique contrôle, est >95 %.
Les lymphocytes T CD45RA positifs (2x105 cellules/ml, 100 11/puits) sont cultivés en plaque de culture 96 puits à fond rond (Nunc) et stimulés avec 10 ng/ml d'anticorps anti-CD3 OKT3 en l'absence ou en présence soit de lymphocytes T CD86+ soit de lymphocytes T CD86- à la concentration finale de 2xlOs cellules/puits.
Les expériences sont réalisées en présence ou en l'absence de 10 g/ml d'anticorps neutralisant anti-CD86 humain (clone IT2.2, Pharmingen ou clone FUN-1, Ancell).
Les différentes conditions expérimentales sont réalisées trois fois.
L'activation des cellules T CD45RA est mesurée par deux critères : - la prolifération des cellules est évaluée après 3 jours de culture par mesure de l'incorporation de thymidine tritiée (3H-Thy, Amersham, Amersham, Royaume Uni).
Brièvement, 0,25 Ci de 3H-Thy sont ajoutés dans chaque puits. L'incorporation de 3H-Thy est mesurée par un compteur à scintillantion (Packard, Australie). Les résultats, présentés dans la figue 5a, sont exprimés en cpm (moyenne sd, n=5),
<Desc/Clms Page number 29>
- la production d'IFNy est mesurée dans les surnageants de culture comme décrit dans l'exemple 4 après deux jours de culture. Les résultats, présentés dans la figue 5b, sont exprimés en ng/ml (moyenne sd, n=3). b. Méthodologie : Réactions lymphocytaires mixtes.
Les populations cellulaires CD86+ et CD86- provenant de deux donneurs différents sont générées comme décrit ci-dessus. Les lymphocytes T CD45RA+ (2x106 cellules/ml, 100 lxpuits) sont cultivés en plaque de culture 96 puits à fond rond (Nunc) en l'absence ou en présence soit de lymphocytes T CD86+ soit de lymphocytes T CD86- à la concentration finale de 2x105 cellules/puits. Les expériences sont réalisées en présence ou en l'absence de 10 g/ml d'anticorps neutralisant anti-CD86 (clone IT2.2 ou clone FUN-1). Les différentes conditions expérimentales sont réalisées trois fois. Après 5 jours de culture, la prolifération des cellules est évaluée par mesure de l'incorporation de 'H-Thy comme décrit dans cidessus. Les résultats sont présentés dans la figure 5c (moyenne SD, n=5). c. Résultats : Comme présenté dans les Figures Sa, 5b et 5c, les résultats montrent que : - Les lymphocytes T humains CD86+ fournissent un signal de costimulation nécessaire pour la prolifération (Figure Sa) et la production d'IFNy (Figure 5b) par les lymphocytes T humains naïfs (CD45RA) stimulés par une dose suboptimale d'anticorps anti-CD3.
- Cet effet de costimulation porté par les lymphocytes T CD86+ est partiellement inhibé par deux anticorps anti-CD86 neutralisants différents (clones IT2.2 et FUN-1) démontrant la fonctionnalité de la molécule CD86 exprimée par les lymphocytes T (Figures Sa et 5b).
- Les lymphocytes T CD86- ne sont pas capables de supporter cette activité de costimulation (Figures Sa et 5b).
- Les cellules CD86+ mais pas les cellules CD86- sont capables d'induire une réaction lymphocytaire mixte (Figure 5c).
- Le rôle de costimulation porté par les lymphocytes T CD86+ est inhibé par deux anticorps neutralisants anti-CD86 différents (clones IT2.2 et FUN-1) démontrant la fonctionnalité de la molécule CD86 exprimée par les lymphocytes T (Figure 5c).
<Desc/Clms Page number 30>
- Les lymphocytes T CD86- ne sont pas capables de supporter cette activité de costimulation (Figure 5c).
- Le fait que les anticorps anti-CD86 ne neutralisent que partiellement les propriétés costimulatrices des lymphocytes T CD86+ suggère que d'autres molécules de costimulation, également exprimées par les lymphocytes T CD86+, participent à l'activité de costimulation portée par ces cellules.
En conclusion, les résultats montrent que la molécule CD86 exprimée par les lymphocytes T humains est fonctionnelle. Le fait que les anticorps anti-CD86 ne neutralisent que partiellement les propriétés costimulatrices des lymphocytes T CD86+ suggère que d'autres molécules de costimulation, également exprimées par les lymphocytes T CD86+, participent à l'activité de costimulation portée par ces cellules.
Exemple 6 : Lamolécule CD86 exprimée par les lymphocytes T humains présente un poids moléculaire apparent de 70 kDa.
On exemplifie ici le fait que la molécule CD86 exprimée par les lymphocytes T humains présente un poids moléculaire apparent de 70 kDa similaire à la molécule CD86 exprimée par les CPAg. a. Méthodologie : Une population de lymphocytes T exprimant la molécule CD86 a été générée par deux stimulations successives comme décrit dans l'exemple 1.
La lignée lymphoide B humaine Daudi et la lignée lymphoide T humaine Jurkat ont été obtenues auprès de l'American Type Culture Collection. Ces cellules sont cultivées en milieu complet (milieu RPMI supplémenté de 2 mM de L-glutamine et de
10 % de sérum de veau foetal décomplémenté). Les cellules sont collectées et lavées trois fois avec du milieu RPMI puis lysées dans un tampon phosphate 10 mM, pH 7,4 contenant 0,5 % de Nonidet P40 et un cocktail d'inhibiteurs de protéases (Boehringer Mannheim, Mannheim, Allemagne) pendant 20 minutes à 4 C. Les lysats cellulaires sont ensuite centrifugés à 12 000 rpm pendant 10 minutes à 4 C pour enlever les noyaux. Le surnageant est repris dans un volume équivalent de tampon phosphate
10 mM contenant 0,1% de bleu de bromophénol, 5 % de glycérol et 0,1% de P- mercaptoéthanol. Les protéines sont ensuite séparées selon leur poids moléculaire par
10 % de sérum de veau foetal décomplémenté). Les cellules sont collectées et lavées trois fois avec du milieu RPMI puis lysées dans un tampon phosphate 10 mM, pH 7,4 contenant 0,5 % de Nonidet P40 et un cocktail d'inhibiteurs de protéases (Boehringer Mannheim, Mannheim, Allemagne) pendant 20 minutes à 4 C. Les lysats cellulaires sont ensuite centrifugés à 12 000 rpm pendant 10 minutes à 4 C pour enlever les noyaux. Le surnageant est repris dans un volume équivalent de tampon phosphate
10 mM contenant 0,1% de bleu de bromophénol, 5 % de glycérol et 0,1% de P- mercaptoéthanol. Les protéines sont ensuite séparées selon leur poids moléculaire par
<Desc/Clms Page number 31>
électrophorèse en gel de polyacrylamide (gel de concentration 5 % - gel de séparation 10 %). Une quantité de protéines correspondant à 5x106 cellules est déposée dans chaque ligne. Après migration, les protéines sont transférées par Western Blotting sur une membrane de nitrocellulose. Après saturation dans une solution phosphate contenant 10 % de lait écrémé, les membranes sont incubées pendant une nuit à 4 C sous agitation avec un anticorps anti-CD86 (clone IT2.2, Pharmingen) à la concentration de 10 g/ml. Après lavage avec un tampon phosphate contenant 10 % de lait écrémé, les membranes sont incubées avec un anticorps de chèvre antiimmunoglobulines de souris marqué à la péroxidase (Dako) pendant 2 heures à température ambiante sous agitation. Les membranes sont lavées en tampon phosphate. Les anticorps fixés sont détectés par chimioluminescence en utilisant le système ECL de Amersham. b. Résultat : le Western Blotting (Figure 6) montre que la molécule CD86 exprimée par les lymphocytes T humains présente un poids moléculaire apparent de 70 kDa (ligne 2). Ce poids moléculaire est le même que celui présenté par les cellules B humaines (lignée Daudi) (ligne 1). La molécule CD86 n'est pas exprimée par les cellules Jurkat (ligne 3). Nous avons confirmé que les cellules CD86- n'expriment pas de molécule CD86 (résultats non présentés).
Exemple 7 : lymphocytes T CD86+ présentent une activité cytotoxique spontanée vis-à-vis de la lignée cellule tumorale K562.
On exemplifie ici le fait que les lymphocytes T humains exprimant la molécule CD86 sont capables de tuer spontanément in vitro des cellules tumorales (Figure 7). a. Méthodologie : Une population mixte de lymphocytes T exprimant ou n'exprimant pas la molécule CD86 a été générée 14 jours après la stimulation, comme décrit dans l'exemple 1. Les lymphocytes CD86- et les lymphocytes T CD86+ ont été isolés à l'aide d'un cytofluoromètre trieur de cellules comme décrit dans l'exemple 4.
Les lymphocytes T humains issus du sang périphérique ont été isolés comme décrit dans l'exemple 3.
La cellule cible est la lignée K562 qui a été obtenue auprès de l'American Type
Culture Collection. Ces cellules sont cultivées en milieu complet (milieu RPMI
Culture Collection. Ces cellules sont cultivées en milieu complet (milieu RPMI
<Desc/Clms Page number 32>
supplémenté de 2 mM de L-glutamine et de 10 % de sérum de veau foetal décomplémenté). Ces cellules sont collectées et lavées deux fois avec du milieu RPMI. Elles sont ensuite incubées avec une solution de 51Cr (100 Ci/106 cellules) pendant 90 minutes à 37 C. Les cellules sont ensuite centrifugées et lavées trois fois avec du milieu de culture complet. Les cellules cibles sont ensuite réparties dans une plaque de culture 96 puits à fond rond (Nunc) raison de 1x105 cellules/puits. Les cellules effectrices (lymphocytes T du sang périphérique fraîchement isolés, lymphocytes T CD86+, lymphocytes T CD86- ou une population mixte (50/50) de lymphocytes T CD86+/ lymphocytes T CD86-) sont ajoutées à raison de 50 cellules effectrices pour une cellule cible pour un volume final de 200 /il. La plaque de culture est ensuite incubée dans une étuve à 37 C, 5 % de CO2 en atmosphère humide pendant 4 heures. 100 /il de surnageant sont prélevés et le relargage de "Cr est mesuré à l'aide d'un compteur de rayonnements y (Packard, Australie). Le relargage spontané est mesuré dans les surnageants de cellules cibles seules. Le relargage total de 51Cr est mesuré sur les puits de culture contenant uniquement des cellules cibles et traitées avec une solution de Tween 20 à 1 % dans du tampon phosphate 10 mM, pH 7,4.
L'activité cytotoxique des cellules effectrices est évaluée en pourcentage de lyse des cellules cibles calculé de la façon suivante : (relargage de 51Cr en présence des cellules effectrices - relargage spontané / relargage total - relargage spontané).
Résultats: Le test de cytotoxicité a montré que les lymphocytes T CD86+ tuent spontanément les cellules cibles K562 (Figure 7). Cette activité cytotoxique est également portée par les cellules CD86- ainsi que par une population cellulaire contenant des cellules CD86+ et des cellules CD86-. Par contre, les lymphocytes T fraîchement isolés ne sont pas capables de tuer les cellules K562.
<Desc/Clms Page number 33>
Bibliographie Agematsu, K., Kobata, T., Yang, F. C., Nakazawa, T., Fukushima, K., Kitahara, M., Mori, T., Sugita, K., Morimoto, C. and Komiyama, A., CD27/CD70 interaction directly drives B cell IgG and IgM synthesis. Eur. J. Immunol. (1995) 25, 2825-29.
Azuma, M., Cayabyab, M., Phillips, J. H. and Lanier, L.L. Requirements for CD28dependent T cell-mediated cytotoxicity. J. Immunol. (1993) 150, 2091-101.
Azuma, M., Ito, D., Yagita, H., Okumura, K., Phillips, J. H., Lanier, L. L. and Somoza, C., B70 antigen is a second ligand for CTLA-4 and CD28. Nature (1993) 366, 76-9.
Bennett, S.R., Carbone, F.R., Karamalis, F., Flavell, R.A., Miller, J.F., Heath, W. R. Help for cytotoxic-T-cell responses is mediated by CD40 signalling. Nature 1998 Jun 4 ; 393(6684), 478-80.
Boehm, U., Klamp, T., Groot, M. and Howard, J.C., Cellular responses to interferon-gamma. Ann. Rev. Immunol. (1997) 15, 749-95.
Camussi, G., Albano, E., Tetta, C. and Bussolino, F., The molecular action of tumor necrosis factor-alpha. Eur. J. Biochem. (1991) 202,3-14.
Chamberlain, R. S., Carroll, M.W., Bronte, V., Hwu, P., Warren, S., Yang, J. C., Nishimura, M., Moss, B., Rosenberg, S. A. and Restifo, N. P., Costimulation enhances the active immunotherapy effect of recombinant anticancer vaccines. Cancer Res. (1996) 56, 2832-6.
Dilloo, D., Brown, M., Roskrow, M., Zhong, W., Holladay, M., Holden, W. and
Brenner, M. CD40 ligand induces an antileukemia immune response in vivo. Blood 1997 Sep 1 ; 1927-33.
Brenner, M. CD40 ligand induces an antileukemia immune response in vivo. Blood 1997 Sep 1 ; 1927-33.
<Desc/Clms Page number 34>
Flynn, K. and Mullbacher, A., The generation of memory antigen-specific cytotoxic T ccll responses by CD28/CD80 interactions in the absence of antigen. Eur. J.
Immmunol. (1997) 27,456-62.
Greenfield, E. A., Nguyen, K. A. and Kuchroo, V. K. CD28/B7 costimulation: a review. Crit Rev Immunol. (1998) 18,389-418.
Gurunathan, S., Irvine, K. R., Wu, C.Y., Cohen, J.I., Thomas, E., Prussin, C., Restifo, N. P. and Seder, R. A. CD40 ligand/trimer DNA enhances both humoral and cellular immune responses and induces protective immunity to infectious and tumor challenge. J Immunol. (1998) Nov 1;161(9), 4563-71.
Hakamada-Taguchi, R., Kato, T., Ushijima, H., Murakami, M., Uede, T., Nariuchi, H., Expression and co-stimulatory function of B7-2 on murine CD4+ T cells. Eur. J.
Immunol. (1998) 28,865-73.
He, X. S., Chen, H.S., Chu, K., Rivkina, M. and Robinson, W.S. Costimulatory protein B7-1 enhances the cytotoxic T cell response and antibody response to hepatitis B surface antigen. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 1996 Jul 9 ; 93(14), 7274-8.
Hieber, U. and Heim, M. E., Tumor necrosis factor for the treatment of malignancies.
Oncology (1994) 51, 142-53.
Hollsberg, P., Scholz, C., Anderson, D. E., Greenfield, E.A., Kuchroo, V. K., Freeman, G.J. and Hafler, D. A., Expression of a hypoglycosylated form of CD86 (B7-2) on human T cells with altered binding properties to CD28 and CTLA-4. J.
Immunol. (1997) 159, 4799-805.
Hunter, C.A., Ellis-Neyer, L., Gabriel, K.E., Kennedy, M. K., Grabstein, K.H.,
Linsley, P.S.and Remington, J. S., The role of the CD28/B7 interaction in the
Linsley, P.S.and Remington, J. S., The role of the CD28/B7 interaction in the
<Desc/Clms Page number 35>
regulation of NK cell responses during infection with Toxoplasma gondii. J. Immunol.
(1997) 158, 2285-93.
Imro, M.A., Dellabona, P., Manici, S., Heltai, S., Consogno, G., Bellone, M., Rugarli, C. and Protti, M.P. Human melanoma cells transfccted with the B7-2 costimulatory molecule induce tumor-specific CD8+ cytotoxic T lymphocytes in vitro.
Hum. Gene Ther. (1998) 9,1335-44.
Kaye, P. Costimulation and the régulation of antimicrobial immunity. Immunol Today (1995) 16, 423-7.
Kobata, T., Agematsu, K., Kameoka, J., Schlossman, S.F., Morimoto. C., CD27 is a signal-transducing molécule involved in CD45RA+ naive T cell costimulation. J.
Immunol. (1994) 153,5422-32.
Kung, P., Goldstein, G., Reinherz, E. L. and Schlossman, S.F., Monoclonal antibodies defining distinctive human T cell surface antigens. Science (1979) 206, 347-9.
Laman, J. D., Claassen, E., Noelle, R. J., Functions of CD40 and its ligand, gp39 (CD40L). Crit. Rev. Immunol. (1996) 16, 59-108.
Landegren, U., Andersson, J. and Wigzell, H. Mechanism of T lymphocyte activation by OKT3 antibodies. A general model for T cell induction. Eur J Immunol. (1984)
14,325-8.
14,325-8.
Lanier, L.L., O'Fallon, S., Somoza, C., Phillips, J. H., Linsley, P.S., Okumura, K., Ito, D. and Azuma, M., CD80 (B7) and CD86 (B70) provide similar costimulatory signais for T cell proliferation, cytokine production, and generation of CTL. J.
Immunol. (1995) 154, 97-105.
<Desc/Clms Page number 36>
Lenschow, D.J. and Walunas, T.L., Bluestone JA CD28/B7 system of T cell costimulation. Annu. Rev. Immune!. (1996) 14, 233-58.
Leong, C. C., Marley, J.V., Loh, S., Milcch, N., Robinson, B.W. and Garlcpp, M. J., Transfection of the gene for B7-1 but not B7-2 can induce immunity to murine malignant mesothelioma. Int. J. Cancer 1997 May 2 ; 71(3), 476-82.
Liebowitz, D. N., Lee, K.P., June, C.H., Costimulatory approaches to adoptive immunotherapy Curr. Opin. Oncol. (1998) 10,533-41.
Martin, P.J., Ledbetter, J. A., Morishita, Y., June, C. H., Beatty, P. G. and Hansen, J. A., A 44 kilodalton cell surface homodimer regulates interleukin 2 production by activated human T lymphocytes. J. Immunol. (1986) 136,3282-7.
Melero, I., Bach, N., Chen, L., Costimulation, tolerance and ignorance of cytolytic T lymphocytes in immune responses to tumor antigens. Life Sci. (1997) 60,2035-41.
Mier, J. W. and Gallo, R. C., Purification and some characteristics of human T-cell growth factor from phytohemagglutinin-stimulated lymphocyte-conditioned media.
Proc Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 6134-8.
Mier, J.W., Gallo, R. C., The purification and properties of human T cell growth factor. J. Immunol. 1982, 128, 1122-7.
Mule, J.J., Shu, S., Schwarz, S. L. and Rosenberg, S. A., Adoptive immunotherapy of established pulmonary metastases with LAK cells and recombinant interleukin-2.
Science (1984) 225,1487-9 & brevet WO 91/4444).
Northoff, H., Carter, C., Oppenheim, J. J., Inhibition of concanavalin A-induced human lymphocyte mitogenic factor (Interleukin-2) production by suppressor T lymphocytes J. Immunol. 1980 125,1823-8.
<Desc/Clms Page number 37>
Nunes, J., Klasen, S., Ragueneau, M., Pavon, C., Couez, D., Mawas, C., Bagnasco, M. and Olive, D., CD28 mAbs with distinct binding properties differ in their ability to induce T cell activation : analysis of early and late activation events. Int. Immunol.
1993, 5, 311-5.
Piltzer, B.M., Hitt, M., Muller, W. J., Emtage, P., Gauldie, J. and Graham, F.L., Interleukin 12 and B7-1 costimulatory molécule expressed by an adenovirus vector act synergistically to facilitate tumor régression. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) 94, 10889-94.
Rao, J.B., Chamberlain, R. S., Bronte, V., Carroll, M. W., Irvine, K.R., Moss, B., Rosenberg, S. A. and Restifo, N. P., IL-12 is an effective adjuvant to recombinant vaccinia virus-based tumor vaccines : by simultaneous B7-1 expression.
J. Immunol. (1996) 156,3357-65.
Swain, S. L., Croft, M., Dubey, C., Haynes, L., Rogers, P., Zhang, X. and Bradley, L. M., From naive to memory T cells. Immunol Rev. (1996) 150, 143-67.
Tax, W. J., Willems, H. W., Reekers, P.P., Capel, P. J. and Koene, R.A.
Polymorphism in mitogenic effect of IgGl monoclonal antibodies against T3 antigen on human T cells. Nature (1983) Aug 4-10, 304(5925), 445-7.
Tsuji, T., Hamajima, K., Ishii, N., Aoki, I., Fukushima, J., Xin, K. Q., Kawamoto, S., Sasaki, S., Matsunaga, K., Ishigatsubo, Y., Tani, K., Okubo, T. and Okuda, K.
Immunomodulatory effects of a plasmid expressing B7-2 on human immunodeficiency virus- 1 -spécifie cell-mediated immunity induced by a plasmid encoding the viral antigen. Eur. J. Immunol. (1997) 27, 782-7.
Van Lier, R. A., Brouwer, M. and Aarden, L.A. Signais involved in T cell activation.
T cell proliferation induced through the synergistic action of anti-CD28 and anti-CD2
T cell proliferation induced through the synergistic action of anti-CD28 and anti-CD2
<Desc/Clms Page number 38>
monoclonal antibodies. Eur J Immunol. (1988) 18,167-72 & Brevet Européen 40 96 55.
Van Scvcnter, G.A., Shimizu, Y., IIorgan, K.J., Shaw, S., The LFA-1 ligand ICAM-
1 provides an important costimulatory signal for T cell receptor-mediated activation of resting T cells J. Immunol. (1990) 144, 4579-86.
1 provides an important costimulatory signal for T cell receptor-mediated activation of resting T cells J. Immunol. (1990) 144, 4579-86.
Yang, F.C., Agematsu, K., Nakazawa, T., Mori, T., Ito, S., Kobata, T., Morimoton C. and Komiyama, A. CD27/CD70 interaction directly induces natural killer cell killing activity. Immunology (1996) 88 (2) Yeh, K.Y., Pulaski, B.A., Woods, M. L., McAdam, A.J., Gaspari, A.A., Frelinger, J. G. and Lord, E. M., B7-1 enhances natural killer cell-mediated cytotoxicity and inhibits tumor growth of a poorly immunogenic murine carcinom. Cell Immunol.
(1995) 165,217-24.
Claims (26)
1) Lymphocyte T humain exprimant la molécule CD86 fonctionnelle.
2) Lymphocyte T humain selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est costimulant et cytotoxique.
3) Lymphocyte T humain selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'il exprime au moins l'une des molécules suivantes : CD54, CD25, CD80, CD30, CD40-L et CD70.
4) Procédé d'obtention d'une population pratiquement homogène de lymphocytes T humains exprimant la molécule CD86 fonctionnelle selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que, à partir d'un échantillon contenant des lymphocytes T humains, on effectue au moins deux stimulations séquentielles desdits lymphocytes.
5) Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que chaque stimulation est effectuée avec au moins un activateur et une cytokine stimulant la prolifération de lymphocytes T humains.
6) Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'activateur est choisi parmi les anticorps anti-CD2, anti-CD3 et anti-CD28 et les mitogènes, et les cytokines stimulant la prolifération des lymphocytes T humains sont choisies parmi IL-2, IL-4 et IL-7.
7) Procédé selon l'une des revendications 4 à 6, caractérisé en ce que l'échantillon contenant des lymphocytes T humains est un prélèvement de cellules mononucléées sanguines (CMN) ou un isolat de lymphocytes T présents dans les CMN.
8) Procédé selon l'une des revendications 4 à 7, caractérisé en ce que la stimulation est effectuée par l'un des mélanges suivants : - anticorps anti-CD3 et IL-2, et - anticorps anti-CD3, anticorps anti-CD28 et IL-2.
9) Procédé selon l'une des revendications 4 à 8, caractérisé en ce que après la stimulation on ajoute régulièrement une cytokine pour stimuler la prolifération des lymphocytes T.
<Desc/Clms Page number 40>
10) Procédé selon l'une des revendications 4 à 9, caractérisé en ce que la durée entre deux stimulations est d'au moins 4 jours, de préférence 7 jours.
11) Procédé selon l'une des revendications 4 à 10, caractérisé en ce que, après la deuxième stimulation, on attend de préférence plus de 4 jours avant d'obtenir la population pratiquement homogène.
12) Population pratiquement homogène de lymphocytes T humains exprimant la molécule CD86 fonctionnelle qui peut être obtenue par le procédé selon l'une des revendications 4 à 11.
13) Population selon la revendication 12, caractérisée en ce que les lymphocytes sont costimulants, immunostimulants et cytotoxiques.
14) Population selon l'une des revendications 12 et 13, caractérisée en ce que les lymphocytes expriment également l'une des molécules suivantes : - CD54, CD25 et CD80.
15) Population selon l'une des revendications 12 à 14, caractérisée en ce que les lymphocytes expriment également l'une des molécules suivantes : - CD30, CD40-L et CD70.
16) Population pratiquement homogène de lymphocytes T humains exprimant la molécule CD86 fonctionnelle selon l'une des revendications 12 à 15, caractérisée en ce qu'elle a été pulsée avec un extrait biologique ou des dérivés biologiques ou des peptides ou des lipopeptides.
17) Population pratiquement homogène de lymphocytes T humains exprimant la molécule CD86 fonctionnelle selon l'une des revendications 12 à 16, caractérisée en ce qu'elle a été transfectée par un ADN ou couplée à une molécule chimique ou immunologique.
18) Lymphokinc produite par une population de lymphocytes T selon t'une des revendications 12 à 17.
19) Lymphokine purifiée obtenue à partir des lymphokines scion la revendication 18.
20) Composition thérapeutique caractérisée en ce qu'elle comporte au moins des lymphocytes T humains selon l'une des revendications 1 à 3 ou une population selon l'une des revendications 12 à 17 ou une lymphokine selon l'une des revendications 18 et 19.
<Desc/Clms Page number 41>
21) Utilisation de lymphocytes selon l'une des revendications 1 à 3 ou d'une population selon l'une des revendications 12 à 17 pour la réalisation d'un médicament destiné au traitement d'immunodéficiences congénitales, acquises ou d'origine pathologique.
22) Utilisation de lymphocytes selon l'une des revendications 1 à 3 ou d'une population selon l'une des revendications 12 à 17 pour la réalisation d'un médicament destiné au traitement d'une affection microbienne.
23) Utilisation de lymphocytes selon l'une des revendications 1 a 3 ou d'une population selon l'une des revendications 12 à 17 pour la réalisation d'un médicament destiné au traitement d'un cancer.
24) Utilisation de lymphocytes selon l'une des revendications 1 à 3 ou d'une population selon l'une des revendications 12 à 17 pour la réalisation d'un médicament destiné au traitement des chocs septiques.
25) Vaccin caractérisé en ce qu'il comporte au moins des lymphocytes selon l'une des revendications 1 à 3 ou d'une population selon l'une des revendications 12 à
17.
26) Procédé de diagnostic d'un déficit immunitaire par mise en évidence dans un échantillon de sang ou de tissu de lymphocytes T exprimant la molécule CD86 fonctionnelle.
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9901187A FR2789089A1 (fr) | 1999-02-02 | 1999-02-02 | Lymphocytes t humains effecteurs exprimant la molecule cd86 et possedant des proprietes immunodulatrices, costimulatrices et cytotoxiques, leurs procedes d'obtention et leurs applications |
| AU23017/00A AU2301700A (en) | 1999-02-02 | 2000-02-02 | Human t cell effectors expressing cd86 molecule and therapeutic use thereof |
| EP00901698A EP1149159A1 (fr) | 1999-02-02 | 2000-02-02 | Lymphocytes t humains effecteurs exprimant la molecule cd86 et leur utilisation therapeutique |
| PCT/FR2000/000240 WO2000046352A1 (fr) | 1999-02-02 | 2000-02-02 | Lymphocytes t humains effecteurs exprimant la molecule cd86 et leur utilisation therapeutique |
| CA002360688A CA2360688A1 (fr) | 1999-02-02 | 2000-02-02 | Lymphocytes t humains effecteurs exprimant la molecule cd86 et leur utilisation therapeutique |
| JP2000597412A JP2002535983A (ja) | 1999-02-02 | 2000-02-02 | Ｃｄ８６分子を発現するヒトエフェクターｔリンパ球およびその治療的使用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9901187A FR2789089A1 (fr) | 1999-02-02 | 1999-02-02 | Lymphocytes t humains effecteurs exprimant la molecule cd86 et possedant des proprietes immunodulatrices, costimulatrices et cytotoxiques, leurs procedes d'obtention et leurs applications |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2789089A1 true FR2789089A1 (fr) | 2000-08-04 |
Family
ID=9541509
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR9901187A Withdrawn FR2789089A1 (fr) | 1999-02-02 | 1999-02-02 | Lymphocytes t humains effecteurs exprimant la molecule cd86 et possedant des proprietes immunodulatrices, costimulatrices et cytotoxiques, leurs procedes d'obtention et leurs applications |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1149159A1 (fr) |
| JP (1) | JP2002535983A (fr) |
| AU (1) | AU2301700A (fr) |
| CA (1) | CA2360688A1 (fr) |
| FR (1) | FR2789089A1 (fr) |
| WO (1) | WO2000046352A1 (fr) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998003670A1 (fr) * | 1996-07-23 | 1998-01-29 | Tanox Pharma B.V. | Induction de la tolerance aux lymphocytes t au moyen d'une molecule soluble pouvant bloquer simultanement deux mecanismes d'action costimulants |
| WO1998021314A2 (fr) * | 1996-11-12 | 1998-05-22 | Dana-Farber Cancer Institute | Procede servant a stimuler l'activation et la proliferation de lymphocytes b et a moduler des reactions immunitaires |
-
1999
- 1999-02-02 FR FR9901187A patent/FR2789089A1/fr not_active Withdrawn
-
2000
- 2000-02-02 JP JP2000597412A patent/JP2002535983A/ja active Pending
- 2000-02-02 EP EP00901698A patent/EP1149159A1/fr not_active Withdrawn
- 2000-02-02 CA CA002360688A patent/CA2360688A1/fr not_active Abandoned
- 2000-02-02 AU AU23017/00A patent/AU2301700A/en not_active Abandoned
- 2000-02-02 WO PCT/FR2000/000240 patent/WO2000046352A1/fr not_active Application Discontinuation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998003670A1 (fr) * | 1996-07-23 | 1998-01-29 | Tanox Pharma B.V. | Induction de la tolerance aux lymphocytes t au moyen d'une molecule soluble pouvant bloquer simultanement deux mecanismes d'action costimulants |
| WO1998021314A2 (fr) * | 1996-11-12 | 1998-05-22 | Dana-Farber Cancer Institute | Procede servant a stimuler l'activation et la proliferation de lymphocytes b et a moduler des reactions immunitaires |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| ABE K ET AL: "Expression of CD80 and CD86 on peripheral blood T lymphocytes in patients with systemic lupus erythematosus.", JOURNAL OF CLINICAL IMMUNOLOGY, (1999 JAN) 19 (1) 58-66., XP000857817 * |
| HAKAMADA-TAGUCHI R ET AL: "Expression and co-stimulatory function of B7-2 on murine CD4+ T cells.", EUROPEAN JOURNAL OF IMMUNOLOGY, (1998 MAR) 28 (3) 865-73., XP000857823 * |
| JEANNIN P ET AL: "CD86 (B7-2) on human B cells. A functional role in proliferation and selective differentiation into IgE- and IgG4-producing cells.", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, (1997 JUN 20) 272 (25) 15613-9., XP002126224 * |
| MOOSIG F ET AL: "Costimulatory molecules in Wegener's granulomatosis (WG): lack of expression of CD28 and preferential up-regulation of its ligands B7-1 (CD80) and B7-2 ( CD86 ) on T cells.", CLINICAL AND EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY, (1998 OCT) 114 (1) 113-8., XP000857821 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2301700A (en) | 2000-08-25 |
| EP1149159A1 (fr) | 2001-10-31 |
| WO2000046352A1 (fr) | 2000-08-10 |
| CA2360688A1 (fr) | 2000-08-10 |
| JP2002535983A (ja) | 2002-10-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2002257648B2 (en) | CD4+CD25+ regulatory T cells from human blood | |
| EP1390474B1 (fr) | Procede d'obtention de lymphocytes tr1 regulateurs specifiques d'antigene | |
| JP5184732B2 (ja) | Ｔ細胞亜集団に特異的なモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の組成物および使用方法 | |
| US20030134415A1 (en) | Th1 cell adoptive immunotherapy | |
| Gao et al. | CD40‐deficient dendritic cells producing interleukin‐10, but not interleukin‐12, induce T‐cell hyporesponsiveness in vitro and prevent acute allograft rejection | |
| JPH07505527A (ja) | ヒト樹状細胞のインビトロ発生およびそれらの用途 | |
| CN110404061B (zh) | 改进的t细胞治疗方法 | |
| US20120328563A1 (en) | Cd4+cd25+ regulatory t cells from human blood | |
| US20070184031A1 (en) | Uses of bispecific antibody coated dendritic cells pulsed with antigens and gm-csf in immune regulation | |
| US20030134341A1 (en) | Th1 cell adoptive immunotherapy | |
| Houtenbos et al. | Leukemia-specific T-cell reactivity induced by leukemic dendritic cells is augmented by 4-1BB targeting | |
| JPH10504194A (ja) | Ｔ細胞活性化 | |
| US20030194395A1 (en) | Th1 cell adoptive immunotherapy | |
| EP1537203B1 (fr) | Utilisation de cellules dendritiques (dc) exprimant l'interleukine 12 (il-12) | |
| EP3959235B1 (fr) | Récepteurs d'antigènes chimériques résistant au rituximab et leurs utilisations | |
| FR2789089A1 (fr) | Lymphocytes t humains effecteurs exprimant la molecule cd86 et possedant des proprietes immunodulatrices, costimulatrices et cytotoxiques, leurs procedes d'obtention et leurs applications | |
| FR2796961A1 (fr) | Procede d'obtention de cellules dentritiques, les cellules dentritiques ainsi obtenues et leurs utilisations a des fins cliniques | |
| WO2002032463A9 (fr) | Methodes de traitement des cancers par stimulation de cellules dendritiques ou de lymphomes avec certaines molecules tnf | |
| FR2789088A1 (fr) | Moyens pour induire ou augmenter l'immunogenicite de cellules de leucemies aigues myeloides | |
| BIOTECNOLOGICA | ANTIGEN PRESENTATION | |
| FOWLER et al. | National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA | |
| AU2007202851A1 (en) | Compositions and methods of monoclonal and polyclonal antibodies specific for T cell subpopulations | |
| Buckland et al. | Prospects for the Induction of Transplant Tolerance Using Dendritic Cells | |
| FR2782524A1 (fr) | Methodes d'activation de cellules tueuses naturelles (nk) et moyens de mise en oeuvre |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| ST | Notification of lapse |