FR2796961A1 - Procede d'obtention de cellules dentritiques, les cellules dentritiques ainsi obtenues et leurs utilisations a des fins cliniques - Google Patents
Procede d'obtention de cellules dentritiques, les cellules dentritiques ainsi obtenues et leurs utilisations a des fins cliniques Download PDFInfo
- Publication number
- FR2796961A1 FR2796961A1 FR9909836A FR9909836A FR2796961A1 FR 2796961 A1 FR2796961 A1 FR 2796961A1 FR 9909836 A FR9909836 A FR 9909836A FR 9909836 A FR9909836 A FR 9909836A FR 2796961 A1 FR2796961 A1 FR 2796961A1
- Authority
- FR
- France
- Prior art keywords
- sep
- cells
- tnf
- dcs
- dendritic cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 30
- 230000008569 process Effects 0.000 title description 6
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 claims abstract description 158
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims abstract description 40
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims abstract description 10
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 claims abstract description 8
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 claims abstract description 8
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 claims abstract description 4
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 claims description 62
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 claims description 62
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 claims description 62
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 claims description 49
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 claims description 38
- XEYBRNLFEZDVAW-ARSRFYASSA-N dinoprostone Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\[C@H]1[C@H](O)CC(=O)[C@@H]1C\C=C/CCCC(O)=O XEYBRNLFEZDVAW-ARSRFYASSA-N 0.000 claims description 35
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 35
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 34
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 claims description 34
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 claims description 23
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 claims description 16
- 102100035875 C-C chemokine receptor type 5 Human genes 0.000 claims description 10
- 101710149870 C-C chemokine receptor type 5 Proteins 0.000 claims description 10
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 10
- 102100036301 C-C chemokine receptor type 7 Human genes 0.000 claims description 8
- 101000716065 Homo sapiens C-C chemokine receptor type 7 Proteins 0.000 claims description 8
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 claims description 8
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 claims description 6
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 6
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 claims description 5
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000037361 pathway Effects 0.000 claims description 5
- 102000003816 Interleukin-13 Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 claims description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 4
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 claims description 4
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims description 2
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 81
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract description 5
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 abstract 2
- GOZMBJCYMQQACI-UHFFFAOYSA-N 6,7-dimethyl-3-[[methyl-[2-[methyl-[[1-[3-(trifluoromethyl)phenyl]indol-3-yl]methyl]amino]ethyl]amino]methyl]chromen-4-one;dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.C=1OC2=CC(C)=C(C)C=C2C(=O)C=1CN(C)CCN(C)CC(C1=CC=CC=C11)=CN1C1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 GOZMBJCYMQQACI-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 62
- 229960002986 dinoprostone Drugs 0.000 description 33
- XEYBRNLFEZDVAW-UHFFFAOYSA-N prostaglandin E2 Natural products CCCCCC(O)C=CC1C(O)CC(=O)C1CC=CCCCC(O)=O XEYBRNLFEZDVAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 33
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 26
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 18
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 18
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 18
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 18
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 16
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 16
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 15
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 15
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 14
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 14
- YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N cycloheximide Chemical compound C1[C@@H](C)C[C@H](C)C(=O)[C@@H]1[C@H](O)CC1CC(=O)NC(=O)C1 YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N 0.000 description 14
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 13
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 13
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 13
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 12
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 12
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 12
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 description 11
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 description 11
- 102100036850 C-C motif chemokine 23 Human genes 0.000 description 10
- 101000713081 Homo sapiens C-C motif chemokine 23 Proteins 0.000 description 10
- 108010031099 Mannose Receptor Proteins 0.000 description 10
- 102000049320 CD36 Human genes 0.000 description 9
- 108010045374 CD36 Antigens Proteins 0.000 description 9
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 9
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 9
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 9
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 9
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 9
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 9
- 102100035793 CD83 antigen Human genes 0.000 description 8
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 8
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 8
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 8
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 8
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 8
- 101000946856 Homo sapiens CD83 antigen Proteins 0.000 description 7
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 7
- 230000000242 pagocytic effect Effects 0.000 description 7
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 230000004044 response Effects 0.000 description 7
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 7
- 102000009410 Chemokine receptor Human genes 0.000 description 6
- 108050000299 Chemokine receptor Proteins 0.000 description 6
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 6
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 6
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 6
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 6
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 6
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 6
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 5
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 108090000672 Annexin A5 Proteins 0.000 description 4
- 102000004121 Annexin A5 Human genes 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 4
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 4
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 4
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 4
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 4
- 102000004274 CCR5 Receptors Human genes 0.000 description 3
- 108010017088 CCR5 Receptors Proteins 0.000 description 3
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010029961 Filgrastim Proteins 0.000 description 3
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 description 3
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 description 3
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 3
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 description 3
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 3
- 230000002121 endocytic effect Effects 0.000 description 3
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 3
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 3
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 101000605172 Aspergillus niger (strain CBS 513.88 / FGSC A1513) Probable endopolygalacturonase E Proteins 0.000 description 2
- 101000605171 Aspergillus niger Endopolygalacturonase E Proteins 0.000 description 2
- 101000941281 Bos taurus Gastric triacylglycerol lipase Proteins 0.000 description 2
- 102100032367 C-C motif chemokine 5 Human genes 0.000 description 2
- 102100032528 C-type lectin domain family 11 member A Human genes 0.000 description 2
- 101710167766 C-type lectin domain family 11 member A Proteins 0.000 description 2
- 108010052382 CD83 antigen Proteins 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 108010082161 Chemokine CCL19 Proteins 0.000 description 2
- 102000003805 Chemokine CCL19 Human genes 0.000 description 2
- 108010055166 Chemokine CCL5 Proteins 0.000 description 2
- 102000007644 Colony-Stimulating Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 2
- 108010040476 FITC-annexin A5 Proteins 0.000 description 2
- 102100039619 Granulocyte colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 2
- 102100039064 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 2
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 2
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 2
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 2
- 230000003127 anti-melanomic effect Effects 0.000 description 2
- 230000005809 anti-tumor immunity Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 229940047120 colony stimulating factors Drugs 0.000 description 2
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000004041 dendritic cell maturation Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 2
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 230000031261 interleukin-10 production Effects 0.000 description 2
- 229940117681 interleukin-12 Drugs 0.000 description 2
- 230000019734 interleukin-12 production Effects 0.000 description 2
- 210000001821 langerhans cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000011325 microbead Substances 0.000 description 2
- 108010032806 molgramostim Proteins 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-OFKYTIFKSA-N 1-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(tritiooxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO[3H])O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(C)=C1 IQFYYKKMVGJFEH-OFKYTIFKSA-N 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 1
- 102100031172 C-C chemokine receptor type 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710149814 C-C chemokine receptor type 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000004500 CCR1 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010017319 CCR1 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010017158 CCR7 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000004428 CCR7 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010029697 CD40 Ligand Proteins 0.000 description 1
- 102100032937 CD40 ligand Human genes 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010055165 Chemokine CCL4 Proteins 0.000 description 1
- 102000001326 Chemokine CCL4 Human genes 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- 102100041003 Glutamate carboxypeptidase 2 Human genes 0.000 description 1
- 108010088729 HLA-A*02:01 antigen Proteins 0.000 description 1
- -1 HLADR Proteins 0.000 description 1
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 1
- 101000892862 Homo sapiens Glutamate carboxypeptidase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000746367 Homo sapiens Granulocyte colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 1
- 101001046677 Homo sapiens Integrin alpha-V Proteins 0.000 description 1
- 101000599940 Homo sapiens Interferon gamma Proteins 0.000 description 1
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 1
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 description 1
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100022337 Integrin alpha-V Human genes 0.000 description 1
- 108010062867 Lenograstim Proteins 0.000 description 1
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 1
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101710151805 Mitochondrial intermediate peptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 229930192392 Mitomycin Natural products 0.000 description 1
- 108010008707 Mucin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100034256 Mucin-1 Human genes 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 1
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 1
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 1
- 210000000447 Th1 cell Anatomy 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002730 additional effect Effects 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000005208 blood dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 238000002619 cancer immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 230000035605 chemotaxis Effects 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000003292 diminished effect Effects 0.000 description 1
- 238000012137 double-staining Methods 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 235000020774 essential nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000011124 ex vivo culture Methods 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 229960004177 filgrastim Drugs 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 210000000609 ganglia Anatomy 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000006882 induction of apoptosis Effects 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 210000003535 interstitial dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 210000001365 lymphatic vessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000005210 lymphoid organ Anatomy 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 230000001617 migratory effect Effects 0.000 description 1
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000004296 naive t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 229940029345 neupogen Drugs 0.000 description 1
- 230000004987 nonapoptotic effect Effects 0.000 description 1
- 229940094443 oxytocics prostaglandins Drugs 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108010011613 phagocytosis receptor Proteins 0.000 description 1
- 238000009520 phase I clinical trial Methods 0.000 description 1
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000010287 polarization Effects 0.000 description 1
- 229920001481 poly(stearyl methacrylate) Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 210000005212 secondary lymphoid organ Anatomy 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 230000009107 upstream regulation Effects 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 239000012130 whole-cell lysate Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0639—Dendritic cells, e.g. Langherhans cells in the epidermis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4615—Dendritic cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
- A61K39/4622—Antigen presenting cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/464499—Undefined tumor antigens, e.g. tumor lysate or antigens targeted by cells isolated from tumor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K2035/122—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells for inducing tolerance or supression of immune responses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/02—Compounds of the arachidonic acid pathway, e.g. prostaglandins, leukotrienes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/22—Colony stimulating factors (G-CSF, GM-CSF)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/25—Tumour necrosing factors [TNF]
Abstract
La présente invention a pour objet un procédé pour l'obtention de cellules dendritiques qui consiste : 1) à cultiver, pendant 4 à 6 jours, de préférence 5 jours, des cellules mononucléées issues de cytaphérèse après mobilisation, dans un milieu exempt de sérum complémenté avec de l'albumine humaine en présence d'un facteur stimulant les colonies de granulocytes-macrophages (GM-CSF) et d'une interleukine (IL) bloquant la différentiation vers la voie macrophagique;2) à ajouter au milieu de culture du TNF-alpha et éventuellement un médiateur inflammatoire et à poursuivre la culture pendant environ 1 à 4 jours, de préférence 2 jours supplémentaires; 3) à récupérer les cellules dendritiques ainsi formées.Application : agents d'immunothérapie.
Description
<Desc/Clms Page number 1>
La présente invention concerne le domaine de l'immunothérapie et plus particulièrement celui des cellules dendritiques et de leur utilisation à titre d'agent d'immunothérapie.
Les cellules dendritiques (DC) jouent un rôle clé dans l'initiation de la réponse immunitaire primaire et des études cliniques pilotes ont mis en évidence leur capacité à induire une immunité anti-tumorale efficace.
Les cellules dendritiques, qui sont présentent dans la peau (cellules de Langerhans), dans les muqueuses, le sang périphérique et la moelle osseuse, sont les cellules présentant des antigènes (Antigen-presenting cells ou APC) les plus puissantes dans le système immunitaire. Elles sont caractérisées par une morphologie unique et un phénotype de surface spécifique.
En particulier, elles expriment l'antigène CD83 et sont capables d'exprimer des quantités importantes de MHC classes 1 et II et d'initier des réactions mixtes avec les leucocytes (MLR). En revanche, elles sont dépourvues de certains marqueurs myéloides, notamment du marqueur CD14.
Etant donné leurs propriétés spécifiques, ces cellules ont été proposées comme éléments essentiels dans les thérapies cellulaires qui nécessitent la présentation d'antigènes aux lymphocytes T.
Les cellules dendritiques (DC) ont un mode de différenciation spécifique qui comprend deux stades importants, le stade immature et le stade mature, selon un ensemble de caractéristiques phénotypiques et fonctionnelles (1,2). Les DC immatures obtenues in vitro à partir de monocytes par culture avec un facteur stimulant les colonies de granulocytes-macrophages (GM-CSF) et une interleukine bloquant la différentiation vers la voie macrophagique (IL-4 ou IL-13) sont analogues aux DC du tissu périphérique, c'est-à-dire aux cellules de Langerhans et aux cellules dendritiques interstitielles. Ces DC immatures sont capables de capturer les antigènes avec une grande efficacité en utilisant des récepteurs spécialisés, tels que les récepteurs pour le fragment Fc des immunoglobulines (FcR) (3,4), le récepteur au mannose (MR) (5) et les récepteurs phagocytaires, en particulier CD36 et l'intégrine [alpha]vss5 (6). Elles peuvent ainsi internaliser les protéines, les lysats de cellules entières, l'ARN et les cellules apoptotiques. En revanche, elles expriment seulement de faibles taux de molécules costimulatrices nécessaires pour l'activation des lymphocytes T.
<Desc/Clms Page number 2>
Lorsqu'elles sont exposées à des signaux de maturation, donnés principalement par les antigènes, les cytokines inflammatoires ou les produits bactériens, les DC perdent leurs capacités phagocytaires et endocytaires (5,6) mais accroissent l'expression du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) de classe I, du CMH de classe II, l'expression de CD80 et CD86 et deviennent de très puissantes cellules présentant des antigènes (APC). Le passage du stade immature au stade mature est associé à l'expression des récepteurs des chémokines. Les DC matures ont une expression diminuée de CCR1 et CCR5, qui sont les récepteurs des chémokines inflammatoires, les protéines inflammatoires de macrophages MIP-1a, MIP-1ss et RANTES, et de façon concomitante, elles ont une expression augmentée de CCR7, qui est le récepteur pour le ligand E1B (ELC)/MIP-3, lequel est exprimé de façon constitutive dans les organes lymphoïdes secondaires (7-9). Ces changements dans l'expression des récepteurs des chémokines sont importants pour la circulation in vivo des DC. Les DC immatures sont recrutées par les chémokines inflammatoires dans les sites d'entrée des antigènes. Après activation par les antigènes et stimuli inflammatoires, elles perdent les récepteurs CCR1 et CCR5 et acquièrent l'expression de CCR7. Les DC matures peuvent ensuite entrer dans les vaisseaux lymphatiques et migrer vers les ganglions lymphatiques afférents où elles présentent des épitopes dérivés d'antigènes pour les lymphocytes naïfs et les lymphocytes mémoires présents dans ces ganglions.
Ainsi, on a déjà proposé de les utiliser en tant que vecteurs pour des vaccinations anti-tumorales (10). Récemment, Nestle et al. ont montré que l'injection intralymphatique de DC immatures activées avec des peptides tumoraux ou des lysats cellulaires tumoraux ont pu provoquer une réponse immunitaire anti-mélanome (11).
L'utilisation de cellules dendritiques à des fins d'immunothérapie nécessite plusieurs millions de cellules à plusieurs reprises. De plus, ces cellules doivent être capables de circuler dans le corps humain de manière sélective vers les ganglions pour que le traitement soit efficace. Il importe également de disposer de cellules engagées de façon irréversible dans la voie de différentiation dendritique, c'est-à-dire de cellules matures qui ne soient pas susceptibles de se transformer dans l'organisme en macrophages.
Plusieurs études concernant la modulation des récepteurs des chémokines ont été réalisées avec des DC obtenues par culture dans un milieu contenant du sérum de veau fétal (FCS). Or, les antigènes xénogènes peuvent être
<Desc/Clms Page number 3>
immunodominants et peuvent gêner le développement de l'immunité antitumorale spécifique.
Différentes équipes de chercheurs se sont donc concentrées sur la production de DC dérivées de monocytes dans des milieux exempts de FCS en utilisant des milieux complémentés avec 1 à 10 % de plasma autologue (12-17), de sérum autologue (18) ou d'un pool de sérums humains AB (13,19-22,31). Toutefois, même le sérum autologue peut poser un problème puisqu'il contient de nombreuses protéines, en particulier des anticorps (23) qui peuvent modifier la voie de fixation et de modification intracellulaire des antigènes. De plus, certains antigènes tumoraux de type MUC-1 dans plusieurs cancers ou l'immunoglobuline monoclonale dans le myélome multiple, sont présents dans le sérum à des taux élevés et variables, ce qui peut affecter une présentation reproductible par les DC.
Pour toutes ces raisons, des procédés d'obtention de DC capables d'activer les lymphocytes T dans des milieux exempts de sérum ont été proposés (24-26).
Les demandes internationales W098/23728, W098/06823 et W098/06826 décrivent également des procédés d'obtention des cellules dendritiques dans des milieux exempts de sérum. La demande internationale W098/06826 décrit entre autre l'utilisation d'un milieu exempt de sérum, le milieu X-VIVO 15 complémenté avec 1% d'albumine humaine (HA). Il est précisé dans cette demande que l'utilisation de 1% de HA n'améliore pas de façon significative la croissance des cellules, leur phénotype ou leur capacité stimulante. De plus, l'expression de CD86 est augmentée au bout de 14 jours de culture dans un tel milieu.
On a maintenant trouvé, de façon surprenante, que l'on peut obtenir des quantités importantes de cellules dendritiques, qui peuvent être utilisées en immunothérapie par culture de cellules mononuclées particulières dans un milieu exempt de sérum convenablement complémenté avec de l'albumine humaine en présence d'un facteur stimulant la formation de colonies de granulocytes macrophages (GM-CSF) et d'une cytokine, en particulier l'interleukine-4 (IL-4) ou l'interleukine-13 (IL-13) puis en présence d'au moins un médiateur inflammatoire, tel que par exemple le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-a).
Ainsi le procédé de l'invention consiste : 1) à cultiver pendant 4 à 6 jours, de préférence 5 jours des cellules mononuclées issues de cytaphérèse après mobilisation dans un milieu exempt
<Desc/Clms Page number 4>
de sérum complémenté avec de l'albumine humaine en présence d'un facteur stimulant les colonies de granulocyte-macrophage (GM-CSF) et d'une interleukine (IL) bloquant la différentiation vers la voie macrophagique ;
2) à ajouter au milieu de culture du TNF-a et éventuellement un médiateur inflammatoire et à poursuivre la culture pendant environ 1 à 4 jours, de préférence 2 jours supplémentaires ;
3) à récupérer les cellules dendritiques ainsi formées.
2) à ajouter au milieu de culture du TNF-a et éventuellement un médiateur inflammatoire et à poursuivre la culture pendant environ 1 à 4 jours, de préférence 2 jours supplémentaires ;
3) à récupérer les cellules dendritiques ainsi formées.
Avantageusement, on peut ajouter au milieu de culture, les deuxième et quatrième jours, du milieu frais contenant du GM-CSF et une interleukine.
Selon une variante de mise en oeuvre du procédé de l'invention, on peut utiliser de la prostaglandine E2 (PGE2) conjointement avec le TNF-a.
Par "milieu de culture sans sérum" on désigne tout milieu de culture couramment utilisé pour la culture des cellules à des fins cliniques, qui contient les substances nutritives essentielles pour la croissance des cellules hématopoïétiques notamment une source de carbone, d'azote, de la transferrine.
Ces milieux sont exempts de sérum humain ou de sérum animal.
Des exemples de milieux de culture exempts de sérum appropriés aux fins de l'invention sont décrits par exemple dans W095/00632 et US5 405 772.
Des exemples particuliers de tels milieux sont les milieux X-VIVO 10 ou X-VIVO 15 commercialisés par la société Biowhittaker, Walkersville, MD, USA.
Le milieu X-VIVO 15 est particulièrement préféré pour la mise en #uvre de l'invention.
Le milieu de culture doit être complémenté avec de l'albumine humaine à raison de 1 à 2 % (poids/volume), de préférence 2 %.
Par "cellules mononuclées" on désigne les cellules mononuclées (MNC) provenant du sang périphérique de sujets normaux ou de patients présentant un cancer ou toute autre maladie dans laquelle le système immunitaire est impliqué, telle que les maladies infectieuses, virales ou parasitaires, par exemple le Sida ou les maladies dysimmunitaires, telles que par exemple la polyarthrite rhumatoïde, le lupus, etc.
Les cellules mononuclées (MNC) utilisées comme produit de départ dans le procédé selon l'invention sont des cellules mononuclées obtenues par cytaphérèse après mobilisation par chimiothérapie et/ou par au moins un facteur de croissance cellulaire.
Ainsi, les cellules mononuclées utilisées dans le procédé de l'invention proviennent soit de sujets normaux ou de patients présentant un cancer qui ont
<Desc/Clms Page number 5>
été soumis à une chimiothérapie, à savoir à un traitement spécifique à l'aide d'un agent chimiothérapeutique et éventuellement d'un facteur de croissance cellulaire, soit de patients présentant une maladie infectieuse, virale ou parasitaire qui ont été traités avec un facteur de croissance cellulaire, tel que les cytokines, y compris les facteurs de croissance hématopoïétiques.
A titre d'exemple de facteur de croissance qui peuvent être utilisés pour la mobilisation des cellules mononuclées, on peut citer : - les facteurs stimulants les colonies de granulocytes (G-CSF), tels que les produits connus sous les dénominations commerciales filgrastim NEUPOGEN de Amgen-Roche, Lenograstim GRANOCYTE de RhônePoulenc/Chugai ; - les facteurs stimulant les colonies de granulocytes-macrophages (GMCSF), tel que les produits connus sous les dénominations commerciales LEUCOMAX de Schering Plough ou le facteur de croissance des cellules souches (SCF) de Amgen.
Les cellules mononuclées mobilisées qui sont mises en #uvre selon l'invention comprennent notamment les monocytes, les lymphocytes, les cellules souches hématopoïétiques.
La mobilisation par chimiothérapie est réalisée à l'aide de l'agent chimiothérapeutique approprié au type de cancer présenté par le patient, donneur des cellules à utiliser dans le procédé de l'invention. On peut utiliser un agent chimiothérapeutique quelconque, tel que par exemple le cyclophosphamide.
Les quantités de GM-CSF, d'interleukine, de TNF-a et de PGE2 à utiliser dans le procédé de l'invention sont celles qui sont habituellement utilisées pour les cultures cellulaires.
On précisera que le GM-CSF peut être utilisé à raison de 1 ng/ml à 1 000 ng/ml, de préférence 50 à 500 ng/ml, avantageusement 100 ng/ml de milieu.
L'interleukine est généralement utilisée en des quantités allant de 1 ng/ml à 1 000 ng/ml, de préférence 10 à 50 ng/ml, avantageusement 25 ng/ml de milieu.
On peut également utiliser le TNF-a à raison de 1 ng/ml à 1 000 ng/ml et la PGE2 à raison de 10 ng/ml à 10 g/ml, avantageusement de 20 ng/ml à 1 g/ml
<Desc/Clms Page number 6>
La culture des cellules précurseurs de cellules dendritiques est réalisée dans des récipients en plastique couramment utilisées dans ce domaine, tels que les flacons ou sacs de cultures cellulaires permettant l'adhérence des cellules.
La culture est avantageusement réalisée dans des incubateurs dans les conditions normales de culture de cellules (stérilité ; CO2 environ 5 % ; humidité environ 95 % et température environ 37 C).
Selon un autre aspect, l'invention a pour objet des cellules dendritiques qui sont [alpha]vss3-; [alpha]vss5+; CCR5- et CCR7+, c'est-à-dire qu'elles sont dépourvues des récepteurs [alpha]vss3- et CCR5 et pourvues des récepteurs [alpha]vss5 et CCR7.
Ces cellules dendritiques, qui peuvent être obtenues par le procédé défini précédemment, sont des cellules matures irréversibles. Elles sont utilisables comme agent d'immunothérapie dans toutes les thérapies cellulaires, telles que par exemple le traitement des cancers ou des maladies infectieuses, virales ou parasitaires.
Ainsi l'invention a également pour objet l'utilisation des cellules dendritiques [alpha]vss3-; av5+ ; CCR5- et CCR7+ pour la fabrication d'un agent d'immunothérapie utile pour le traitement de toute maladie impliquant le système immunitaire.
En effet, avec les cellules dendritiques selon l'invention on peut réduire l'internalisation et la présentation de protéines xénogènes, allogènes ou autologues non identifiées et limiter ainsi les réponses immunitaires qui ne sont pas spécifiques aux antigènes tumoraux.
Les DC selon l'invention sont capables de capturer in vivo des antigènes tumoraux soit par endocytose des protéines soit par phagocytose des cellules apoptotiques.
Ces DC sont capables de migrer vers les ganglions lymphatiques afin de présenter les peptides dérivés d'antigènes dirigés contre les lymphocytes T.
Elles sont également capables de produire l'interleukine-12 favorisant une différenciation des cellules CD8+ naïves en des lymphocytes T cytotoxiques.
Elles présentent un phénotype stable après retrait des cytokines utilisées lors des cultures ex vivo.
Le procédé de l'invention permet d'obtenir des cellules dendritiques immatures et des cellules dendritiques matures.
En présence de GM-CSF et d'une interleukine, on obtient des cellules dendritiques immatures CD83- CD14faible. Ces DC expriment HLA-DR, CD80 et
<Desc/Clms Page number 7>
CD86 ainsi que des récepteurs endocytaires et phagocytaires, à savoir MR, CD36 et [alpha]vss5.
De plus, ces DC immatures sont capables de phagocyter des cellules tumorales apoptotiques par la phagocytose des monocytes apoptotiques. Une stimulation de ces DC immatures avec du TNF-a plus GM-CSF et IL-4 pendant 2 jours supplémentaires conduit à l'obtention de cellules correspondant de façon phénotypique et fonctionnelle à des cellules dendritiques matures. Ces cellules matures ont exprimé CD83 et des quantités plus élevées de HLA-DR, CD80 et CD86 par rapport aux DC immatures GM/IL-4.
Elles sont capables d'activer les lymphocytes T allogènes avec la même efficacité que les DC matures obtenues en présence de FCS.
De plus, ces DC matures expriment également des récepteurs endocytaires comme les récepteurs au mannose ou les récepteurs à la phagocytose de type av5 et CD36. Ces DC matures ont toutefois une capacité pour endocyter le dextrane ou phagocyter les cellules tumorales apoptotiques plus faibles que les DC immatures dont elles sont issues.
La réponse aux chémokines pour les DC obtenues selon l'invention, a été modulée de façon similaire à celle des DC obtenues dans du milieu contenant du FCS. En fait, les DC immatures obtenues selon l'invention ont exprimé CCR5 et n'ont pas répondu à MIP-3. Ainsi, après injection in vivo, ces cellules devraient être piégées de préférence dans des sites inflammatoires où MIP-1 a, MIP-1 ou RANTES sont produits (25). Après traitement avec du TNF-a, les DC selon l'invention ont perdu l'expression de CCR5 et ont acquis la capacité de répondre à MIP-3. On peut penser qu'une proportion élevée de ces DC matures sera capable d'être piégée dans des zones de ganglions lymphatiques de cellules T où le MIP-3 est produit et d'initier une réponse immunitaire efficace.
De plus, on a montré que la PGE2 qui est connue pour accroître la maturation des DC dans des milieux sans FCS (14,21), peut jouer un rôle sur la migration des DC. Dans les conditions de culture selon l'invention, la PGE2 n'a pas largement modifié le phénotype des DC produites avec GM/IL-4 et TNF, à l'exception d'un accroissement de l'expression de CD83, et n'a pas d'effet additif supplémentaire avec TNF-a pour l'activation des cellules T. Toutefois, la PGE2 a accru la migration des DC en réponse à MIP-3. La migration des DC dans les organes lymphoïdes peut donc être sélective.
Afin d'induire la production des cellules T cytotoxiques anti-tumorales, les DC doivent être capables de diriger la différenciation des cellules T naïves vis-à-
<Desc/Clms Page number 8>
vis du sous-ensemble de type 1 exprimant IFN-y et IL-2. L'IL-12 constitue la cytokine principale impliquée dans la polarisation de cellules TCD4+ vis-à-vis des cellules Th1. Dans le modèle de réponse des cellules T anti-EBV, il a été mis en évidence que l'expression de IL-10 par des lignées cellulaires lymphoblastoïdes est associée avec l'émergence des cellules T CD8+ de type 2 (32) qui produisent IL-4 et IL-10 et qui ne sont pas cytotoxiques (33). Au contraire, les cellules CD8+ de type 1 produisent de l'IFN-y et de l'IL-2 et sont cytotoxiques. Ainsi, des DC produites in vitro à des fins de vaccination anti-tumorale doivent idéalement produire IL-12 et non IL-10. En effet, IL-10 possède un effet nocif supplémentaire sur la maturation des DC. En fait, les DC traitées avec IL-10 pendant la phase de maturation induisent l'anergie spécifique aux antigènes des cellules T CD4+ et CD8+ (25,34). Les DC obtenues selon l'invention, différentes de celles obtenues en présence de FCS (35,36), ont produit uniquement de faibles quantités de IL-12 mais des quantités importantes de IL-10 en réponse à la ligature à CD40, en accord avec les études montrant que les DC myéloïdes étaient capables de produire IL-10, en particulier en suivant la stimulation par CD40 (37,38).
Toutefois, on a montré que la maturation des DC induites par TNF-a a entraîné l'induction de la production de IL-12 et une inhibition dramatique de la synthèse de IL-10 après activation par CD40. Ainsi, les DC matures selon l'invention sont capables de déclencher la différenciation des lymphocytes T naïfs en lymphocytes T de type 1. L'addition de PGE2 a de plus inhibé la production de IL-10 mais également la production de IL-12 matures obtenues.
L'invention a également pour objet un procédé de traitement immunothérapeutique qui consiste à prélever à un patient à traiter des cellules mononuclées par cytaphérèse après mobilisation par chimiothérapie et/ou un facteur de croissance cellulaire et éventuellement congélation/décongélation, à traiter lesdites cellules selon le procédé défini ci-dessus et ensuite à réinjecter les cellules DC obtenues audit patient.
Les DC selon l'invention conviennent en particulier pour les traitements par allogreffes ou autogreffes.
L'invention va être illustrée plus en détail par les exemples ci-après donnés à titre non limitatifs et par les figures qui représentent ci-après : - la Figure 1 montre l'effet de la maturation des DC sur l'endocytose de FITC-dextran :
<Desc/Clms Page number 9>
A) avec des DC obtenues par culture sur milieu X-VIVO 15-2 % HA en présence de GM-CSF et IL-4 ;
B) avec des DC obtenues par culture sur milieu X-VIVO 15-2 % HA en présence de GM-CSF, IL-4 et TNF-a ;
C) avec des DC obtenues par culture sur milieu X-VIVO 15-2 % HA en présence de GM-CSF, IL-4 et PGE 2.
B) avec des DC obtenues par culture sur milieu X-VIVO 15-2 % HA en présence de GM-CSF, IL-4 et TNF-a ;
C) avec des DC obtenues par culture sur milieu X-VIVO 15-2 % HA en présence de GM-CSF, IL-4 et PGE 2.
Les courbes en pointillés correspondent au temps d'incubation des DC avec FITC-dextran de 7 minutes, les courbes en traits pleins à l'incubation pendant 15 minutes et les courbes en traits gras à l'incubation pendant 30 minutes ; sur l'axe des abscisses sont indiquées l'intensité de fluorescence et sur l'axe des ordonnées le nombre d'évènements ; - la Figure 2 montre l'apoptose de cellules XG-1 par le cycloheximide (CHX) par mesure de la fluorescence des cellules colorées par l'Annexin-V FITC et par l'iodure de propidium (PI) ; - la Figure 3 montre la phagocytose des cellules tumorales apoptotiques par les DC immatures et l'absence de phagocytose par les DC matures ; - la Figure 4 montre l'effet de la maturation des DC sur l'expression de CCR5.
- la Figure 5 montre la migration des DC matures et la non-migration des cellules immatures en réponse à (ELC)/MIP-3.
- la Figure 6 montre l'activation des cellules T allogènes par les DC matures.
EXEMPLE 1 : Production des cellules dendritiques (DC)
On a recueilli des cellules de cytaphérèse (AC) provenant de quatre patients présentant différents cancers pendant la mobilisation des précurseurs hématopoïétiques avec le cyclophosphamide et le facteur humain de stimulation des colonies de granulocytes (G-CSF, filgrastim ; NEUPOGEN, Amgen-Roche, Neuilly-sur-Seine, France). Chaque lot de cellules AC recueillies a été congelé dans de l'azote liquide puis décongelé et lavé à deux reprises en présence d'un chélateur du calcium et du magnésium. Chaque lot de cellules a ensuite été mis
On a recueilli des cellules de cytaphérèse (AC) provenant de quatre patients présentant différents cancers pendant la mobilisation des précurseurs hématopoïétiques avec le cyclophosphamide et le facteur humain de stimulation des colonies de granulocytes (G-CSF, filgrastim ; NEUPOGEN, Amgen-Roche, Neuilly-sur-Seine, France). Chaque lot de cellules AC recueillies a été congelé dans de l'azote liquide puis décongelé et lavé à deux reprises en présence d'un chélateur du calcium et du magnésium. Chaque lot de cellules a ensuite été mis
<Desc/Clms Page number 10>
dans un flacon de culture cellulaire contenant du milieu X-VIVO 15 complémenté avec 2 % d'albumine humaine (X-VIVO-2% HA) et on a laissé les cellules adhérer sur la surface du flacon de culture pendant 2 h. On a éliminé les cellules qui n'ont pas adhéré et on a cultivé les cellules qui ont adhéré en présence de 100 ng/ml de GM-CSF (Leucomax, Sandoz, Basel, Suisse) et 25 ng/ml de IL-4 (R&D Systems, Minneapolis, MN) pendant 7 jours dans du milieu X-VIVO 15 complémenté avec 2 % de HA. A des fins de comparaison, on a également cultivé des cellules qui ont adhéré en présence de 100 ng/ml de GM-CSF et 25 ng/ml de IL-4 soit dans du milieu RPMI 1640 complémenté avec 10 % de FCS (milieu de référence), soit dans du milieu X-VIVO 15 seul ou dans du milieu XVIVO 15 complémenté avec 5 % de SAB, 5 % de sérum autologue ou 5 % de plasma autologue. Dans chaque cas, on a ajouté les deuxième et quatrième jours du milieu frais contenant GM-CSF et IL-4. Après 5 jours de culture, on a ajouté du milieu contenant GM-CSF et IL-4 avec du TNF-a (R&D Systems) à 20 ng/ml ou du TNF-a à 20 ng/ml et du PGE2 (Sigma Chemical, St Louis, MO) à 1 g/ml. Après 48 h, on a recueilli les cellules et on les a comptées. Le rendement en cellules est donné dans le tableau 1 où on constate que le rendement en cellules obtenu en présence de GM-CSF et de IL-4 a atteint 12 % avec du sérum AB, 18 % avec du plasma autologue, 22 % avec du sérum autologue et 16 % avec du HA. Le milieu X-VIVO 15-2 % de HA complémenté avec GM-CSF et IL-4 est le milieu le plus efficace pour obtenir des DC immatures de qualité clinique CD14-/faible CD83- HLA-DR+' exprimant de grandes quantités de CD80 et CD86.
Comme le montrent également les résultats du tableau I, le sérum AB, le plasma autologue et le sérum autologue ont été moins actifs que HA pour l'obtention in vitro des DC matures.
Etant donné qu'une cytaphérèse de 5 heures permet en général de récupérer 40 à 50 x 109 cellules mononuclées, on a donc pu obtenir dans les conditions opératoires de l'invention 6 à 8 x 109 DC de façon reproductible.
Cette quantité de cellules est suffisante pour permettre au moins 6 vaccinations avec 109 DC.
La culture de cellules sur milieu X-VIVO 15 seul a été réalisée à partir des cellules de cytaphérèse de 8 donneurs mobilisées par le facteur de croissance hématopoïétique (G-CSF) ou par le cyclophosphamide et le facteur de croissance hématopoïétique.
<Desc/Clms Page number 11>
Pour 5 des 8 donneurs, les cellules cultivées en milieu X-VIVO 15 en présence de GM-CSF et d'IL-4 pendant 7 jours avaient une viabilité inférieure à 65% ce qui n'a pas permis d'analyser leur phénotype et leurs fonctions contrairement aux cellules des mêmes donneurs cultivées en présence de XVIVO 15-2% d'albumine humaine, GM-CSF et IL-4 pendant 7 jours.
Le milieu X-VIVO 15 seul ne permet pas de générer de façon reproductible des cellules dendritiques immatures. L'addition de 2% d'albumine humaine a permis dans tous les cas une génération de cellules dendritiques parfaitement viables et fonctionnelles et irréversibles.
EXEMPLE 2 : Analyse phénotypique par cvtométrie de flux des cellules DC
Pour caractériser le phénotype des DC obtenues selon l'exemple 1, on a déterminé le pourcentage de cellules exprimant CD14, HLADR, CD83, CD80 et CD86 par cytométrie de flux (FACS) en utilisant les anticorps monoclonaux suivants : CD1 a-PE, CD14-PE, CD36-FITC, CD80-PE, CD83-PE, HLA-DR-FITC (Immunotech, Marseille, France) ; les anticorps monoclonaux CCR5-PE, CD51/CD61-FITC, CD86-FITC, MR-PE (Pharmingen, San Diego, CA) et les anticorps murins IgG appariés suivant l'isotype (Immunotech).
Pour caractériser le phénotype des DC obtenues selon l'exemple 1, on a déterminé le pourcentage de cellules exprimant CD14, HLADR, CD83, CD80 et CD86 par cytométrie de flux (FACS) en utilisant les anticorps monoclonaux suivants : CD1 a-PE, CD14-PE, CD36-FITC, CD80-PE, CD83-PE, HLA-DR-FITC (Immunotech, Marseille, France) ; les anticorps monoclonaux CCR5-PE, CD51/CD61-FITC, CD86-FITC, MR-PE (Pharmingen, San Diego, CA) et les anticorps murins IgG appariés suivant l'isotype (Immunotech).
Le phénotype total des DC obtenus selon l'exemple 1 est similaire à celui des DC immatures obtenues par culture dans le milieu RPMI en présence de FCS (tableau 1). En utilisant le milieu X-VIVO 15 complémenté avec du sérum AB, du plasma autologue ou du sérum autologue, le pourcentage des cellules CD14+ a été grandement augmenté (jusqu'à 80 % dans du X-VIVO 15-sérum AB) et les cellules résultantes ont exprimé une densité plus faible de HLA classe Il et de molécules costimulatrices. En revanche, selon le procédé de l'invention, c'est-à-dire avec le milieu X-VIVO 15-2 % de HA, on a pu obtenir un nombre élevé de DC (CD14-, HLA-DR++, CD80++, CD86++) sans addition de protéines xénogènes, de protéines allogènes, d'anticorps humains ou d'antigènes tumoraux autologues non identifiés.
Des résultats similaires ont été obtenus avec des AC provenant de quinze donneurs, cultivées dans les conditions opératoires de l'invention, c'est-à-dire dans un milieu X-VIVO 15 complémenté avec 2 % d'albumine humaine en présence de GM-CSF, IL-4 et TNF-a avec ou sans PGE2. Ces résultats figurent dans le tableau II.
Le CD83, marqueur spécifique des DC matures, a pu être détecté après 24 h de culture en présence de TNF-a et a atteint un maximum
<Desc/Clms Page number 12>
d'expression en 48 h. La combinaison de PGE2 et TNF-a a induit l'expression de CD83 jusqu'à 83 % de cellules par rapport à 64 % avec du TNF-a seul (p = 0,007) (tableau Il). Les PGE2 ont également coopéré avec le TNF-a pour la régulation en amont de CD80 et CD86 sur les DC (tableau 1 et tableau Il).
Dans une autre série d'expériences, on a opéré dans les mêmes conditions que ci-dessus sauf que le cinquième jour, on a ajouté la PGE2 sans TNF-a.
Le pourcentage des cellules CD14+ obtenues en présence de GM-CSF + IL-4 + PGE2 était supérieur à celui obtenu en présence de GM-CSF et IL-4 seuls, ce qui suggère que le PGE2, lorsqu'il est utilisé sans TNF-a induit la réversion d'au moins certaines DC immatures en cellules de type macrophage bien que le GM-CSF et IL-4 étaient continuellement présents dans le milieu de la culture.
De la même façon, quand les DC immatures, obtenues dans du X-VIVO 15-2 % de HA complémenté avec GM-CSF et IL-4, ont été récoltées le septième jour, lavées de façon extensive et cultivées dans le milieu de culture sans cytokine pendant 3 jours supplémentaires, elles ont de nouveau adhéré au sac de culture et ont exprimé CD14. Il s'agit là d'une réversion de ces DC immatures en cellules de type macrophage. En revanche, la morphologie cellulaire et le phénotype cellulaire des DC matures, produites par addition de TNF-a seul ou de TNF-a + PGE2, n'ont pas été affectés de façon marquée après retrait des cytokines, ce qui indique que la maturation a eu lieu de manière irréversible.
EXEMPLE 3 : Endocvtose par MR
On a étudié l'endocytose au niveau cellulaire des DC obtenues par culture de cellules AC mobilisées selon le traitement indiqué dans l'exemple 1 dans du milieu X-VIVO 15 - 2 % HA en présence de GM-CSF et d'IL-4 pendant cinq jours. Le cinquième jour, on a ajouté du milieu frais contenant GM-CSF et IL-4, ou GM-CSF, IL-4 et TNF-a ou GM-CSF et IL-4, TNF-a et PGE2. Le septième jour, on a déterminé l'expression de MR, CD36, av3 et av5 par la méthode d'analyse FACS.
On a étudié l'endocytose au niveau cellulaire des DC obtenues par culture de cellules AC mobilisées selon le traitement indiqué dans l'exemple 1 dans du milieu X-VIVO 15 - 2 % HA en présence de GM-CSF et d'IL-4 pendant cinq jours. Le cinquième jour, on a ajouté du milieu frais contenant GM-CSF et IL-4, ou GM-CSF, IL-4 et TNF-a ou GM-CSF et IL-4, TNF-a et PGE2. Le septième jour, on a déterminé l'expression de MR, CD36, av3 et av5 par la méthode d'analyse FACS.
Pour déterminer l'expression du marqueur MR on a opéré selon la méthode décrite par Tarte et al. (27) en utilisant du FITC-dextran pouvant fixer la lysine, MM = 40 000 (Molecular Probes Inc., Eugene, OR). On a recueilli les DC immatures et matures le septième jour et on les incubées à 37 C pendant 7, 15 et 30 min ou à 4 C pendant 30 min (fixation de fond) avec 1 mg/ml de FITC-
<Desc/Clms Page number 13>
dextran. On a ensuite lavé les DC avec du PBS froid complémenté avec 1 % de FCS et 0,02 de NaN3 et on a analysé la fluorescence avec un appareil FACScan.
La moyenne du pourcentage de cellules positives obtenues par culture des AC de six donneurs est indiquée dans le tableau III.
Ces résultats montrent que les DC immatures obtenues dans du XVIVO 15-2 % de HA par culture de 7 jours avec GM-CSF et IL-4 ont largement exprimé des MR et cette expression a significativement diminué de plus de 50 % lors de la maturation des DC induite soit par TNF-a seul (p = 0,03), soit par TNFa + PGE2 (p = 0,03).
L'endocytose du FITC-dextran par les cellules matures obtenues selon l'invention avec du TNF-a ou du TNF-a + PGE 2 a profondément diminué par rapport aux DC immatures comme cela est montré par la Figure 1.
EXEMPLE 4 : Induction de l'apoptose dans les cellules plasmatiques malignes
Pour tester le potentiel phagocytaire des DC obtenues selon le procédé de l'invention, on a utilisé des cellules tumorales apoptotiques.
Pour tester le potentiel phagocytaire des DC obtenues selon le procédé de l'invention, on a utilisé des cellules tumorales apoptotiques.
XG-1 est une lignée cellulaire de myélome multiple dont les caractéristiques ont été décrites en détail par Zhang et al. (28). On a incubé des cellules XG-1 (2,5 # 105/ml) avec 4 m/ml de cycloheximide (CHX) dans du milieu RPMI 1640-10 % de FCS complémenté avec 3 ng/ml de IL-6 à 37 C. On a enregistré la cinétique de l'apoptose cellulaire en utilisant une double coloration avec le colorant connu sous la dénomination Annexin-V FITC (Boehringer Mannheim, Meylan, France) et de l'iodure de propidium (PI) (Sigma). Dans un premier temps, les cellules apoptotiques ont été colorées uniquement par l'Annexin-V (Annexin-V+/PI-) tandis que dans un deuxième temps, les cellules nécrotiques ont incorporé également du PI en raison d'une perte de l'intégrité de leur membrane (Annexin-V+/PI+). Après traitement avec le CHX, on a lavé les cellules tumorales à trois reprises dans du X-VIVO 15-2 % de HA avant de les mettre en coculture avec des DC obtenues selon le mode opératoire décrit à l'exemple 1.
Les résultats obtenus sont reportés sur la figure 2. Ces résultats montrent qu'après 6 h de culture avec 4 g/ml de CHX, 60 % des cellules de myélome XG-1 ont montré des caractéristiques de mort cellulaire apoptotique précoce, c'est-à-dire une liaison de Annexin-V mais une non-incorporation de PI.
<Desc/Clms Page number 14>
EXEMPLE 5 : Phagocytose des cellules apoptotiques
La phagocytose des cellules apoptiques constitue un autre mode d'entrée des antigènes et joue un rôle majeur dans le phénomène d'amorçage croisé.
La phagocytose des cellules apoptiques constitue un autre mode d'entrée des antigènes et joue un rôle majeur dans le phénomène d'amorçage croisé.
Récemment, plusieurs récepteurs phagocytaires ont été identifiés sur les DC obtenues en présence des sérums humains et il a été montré qu'un milieu conditionné pour des monocytes (MCM), qui conduit à une maturation des DC irréversible, régule en aval leur expression (6).
On a teinté en vert les DC immatures et matures en utilisant du PKH67-GL (Sigma) et on les a cultivées pendant 2 h pour permettre la libération du colorant non lié. On a teinté en rouge des cellules XG-1 en utilisant du PKH26-GL (Sigma) selon les instructions du fabricant avant leur induction pour subir l'apoptose par CHX pendant 6 à 8 h. Ensuite, on a cocultivé les cellules XG-1 teintées en rouge avec des DC immatures ou matures teintées en vert dans un rapport de 1:1 dans du X-VIVO 15-2 % de HA selon le protocole décrit par Albert et al. (6) . Après 90 min à 37 C, on a analysé les fluorescences vertes et rouges avec un appareil FACScan. Dans les expériences de blocage, on a co-incubé les cellules XG-1 et les DC à 4 C.
Les marqueurs CD36, [alpha]vss3 et [alpha]vss5 ont été déterminés selon la méthode par marquage par anticorps monoclonaux et cytométrie de flux.
Pour la coloration de [alpha]vss5, on a tout d'abord incubé les cellules avec un anticorps mAb primaire av5 (Chemicon Int, Temecula, CA), puis avec un anticorps de chèvre anti-Ig de souris conjugué à FITC (Immunotech). On a réalisé les analyses avec un appareil FACScan (Becton Dickinson).
Les données provenant d'une expérience représentative parmi 3 sont représentées sur la figure 3. Plus d'un tiers des DC immatures ont englouti des XG-1 apoptotiques après 90 min de coculture. Seuls 10 à 12 % des DC immatures ont été teintées deux fois après coculture avec des cellules XG-1 non-apoptotiques. La phacocytose des cellules tumorales par des DC immatures a été confirmée visuellement sur des cytospines de cocultures teintées. La phagocytose a été complètement bloquée à basse température (figure 3).
L'induction de la maturation des DC a produit une diminution de l'activité phagocytaire. En effet, seuls 12 % des DC matures obtenues après addition de TNF-a ont internalisé les XG-1 apoptotiques après 90 min de coculture (figure 3). Une même diminution de la phagocytose a été obtenue avec des DC matures obtenues avec TNF-a + PGE2 (figure 3).
<Desc/Clms Page number 15>
Dans les conditions de l'invention, les DC immatures ont exprimé des quantités élevées de CD36 et d'intégrine avp5; en revanche l'intégrine av3 n'a pas été détectée comme le montrent les résultats consignés dans le tableau III. Ces résultats montrent également qu'en présence de TNF-a, les expressions de CD36 et [alpha]vss5 ont été significativement diminuées respectivement de plus d'un demi (p - 0,002) et de 20-35 % (p = 0,03). Le PGE2 n'a pas eu d'effet supplémentaire avec le TNF-a pour la diminution de l'expression des récepteurs phagocytaires.
EXEMPLE 6 : Réponse aux chémokines des DC
On a répété l'opération avec six donneurs différents et on a mesuré l'intensité moyenne de fluorescence (MFI). Les résultats obtenus figurent dans le tableau 4.
On a répété l'opération avec six donneurs différents et on a mesuré l'intensité moyenne de fluorescence (MFI). Les résultats obtenus figurent dans le tableau 4.
1) détection du récepteur CCR5
Dans ce test, on a utilisé l'anticorps monoclonal anti-CCR5 (Pharmingen, San Diego, CA, USA) pour détecter le récepteur CCR5 qui est un récepteur pour les chémokines inflammatoires.
Dans ce test, on a utilisé l'anticorps monoclonal anti-CCR5 (Pharmingen, San Diego, CA, USA) pour détecter le récepteur CCR5 qui est un récepteur pour les chémokines inflammatoires.
On a incubé les cellules DC matures ou immatures obtenues dans le milieu X-VIVO 15 - 2 % HA avec ledit anticorps marqué et on a mesuré l'expression de CCR5 pour un donneur. Les résultats sont rassemblés dans les figures 4a, 4b et 4c.
Dans cet exemple, on a recherché la présence du CCR5 sur les DC immatures et les DC matures produites dans du milieu X-VIVO 15 - 2 % HA.
Le CCR5, a été détectable sur les DC immatures produites dans du milieu X-VIVO 15-2 % HA mais son expression a été significativement réduite par une incubation de 48 h avec du TNF-a (p = 0,03). Le PGE2 n'a pas induit de diminution significative supplémentaire (figure 4) (p = 0,25).
2) détection du récepteur CCR7
Comme aucun anticorps monoclonal n'était disponible pour mesurer l'expression de CCR7, on a testé la réponse des DC à MIP-3 dans un essai de chimiotactisme.
Comme aucun anticorps monoclonal n'était disponible pour mesurer l'expression de CCR7, on a testé la réponse des DC à MIP-3 dans un essai de chimiotactisme.
On a introduit les DC immatures et matures (2 x 105 cellules) dans 100 l de RPMI-1 % de HA dans la chambre supérieure d'un dispositif de séparation de cellules constitué de deux chambres de culture cellulaire (une chambre inférieure et une chambre supérieure séparées par un filtre ayant des pores de 5 m permettant le passage des cellules migratrices (dispositif Transwell de Costar,
<Desc/Clms Page number 16>
Cambridge, MA). Dans la chambre inférieure, on a introduit 600 NI de ELC/MIP-3 dilués à 100 ng/ml dans le même milieu. Après une incubation de 4 h à 37 C, on a recueilli les cellules qui ont migré dans la chambre inférieure et on a comptées au microscope. On a exprimé les résultats par le pourcentage des cellules d'entrée qui ont migré dans la chambre inférieure (pourcentage des cellules migratrices). La migration des DC provenant d'un donneur en l'absence et en présence de MIP-3ss est représentée sur la figure 5A et les résultats obtenus avec les DC issues d'AC de 6 donneurs avec MIP-3 sont consignées sur la figure 5B. Les DC immatures cultivées avec GM-CSF et IL-4 n'ont pas répondu à MIP-3 (pourcentage moyen de cellules qui ont migré : 0,7 %, n=6).
L'addition de TNF-a au cinquième jour a accru significativement la réponse des DC (p = 0,002) avec une moyenne de 14,2 % de cellules en migration (n = 6). Le PGE2 a agi de façon synergique avec TNF-a puisque 31 à 67 % (moyenne : 48,8 %, n = 6) des DC maturées avec TNF-a + PGE2 ont migré jusqu'à la chambre inférieure du dispositif transwell pendant une durée d'incubation de 4 h à 37 C (p = 0,002) par rapport aux DC maturées avec du TNF-a. Ceci a été associé à une légère augmentation de la migration spontanée des DC (une moyenne de 7 % des DC d'entrée a été trouvée dans la chambre inférieure en l'absence de MIP-3ss).
EXEMPLE 7 : Analyse des cytokines
On a récolté les DC immatures et matures obtenues après 7 jours de culture dans du X-VIVO 15-2 % de HA, on les a lavées et on les a étalées à raison de 4 x 105/ml dans du RPMI 1640-5 % de FCS avec ou sans cellules L transfectées par 105/ml de CD40L, (fourni par le Docteur Sem Saeland, Schering-Plough, Dardilly, France). Lorsque cela était indiqué, on a ajouté de l'IFN-y humain recombinant (1000 U/ml, R&D Systems). On a recueilli les surnageants 24 h à 30 h après stimulation et on les a stockés à -70 C. On a mesuré les quantités de IL-10 et p70 IL-12 par ELISA selon le mode opératoire du fabricant (R&D Systems).
On a récolté les DC immatures et matures obtenues après 7 jours de culture dans du X-VIVO 15-2 % de HA, on les a lavées et on les a étalées à raison de 4 x 105/ml dans du RPMI 1640-5 % de FCS avec ou sans cellules L transfectées par 105/ml de CD40L, (fourni par le Docteur Sem Saeland, Schering-Plough, Dardilly, France). Lorsque cela était indiqué, on a ajouté de l'IFN-y humain recombinant (1000 U/ml, R&D Systems). On a recueilli les surnageants 24 h à 30 h après stimulation et on les a stockés à -70 C. On a mesuré les quantités de IL-10 et p70 IL-12 par ELISA selon le mode opératoire du fabricant (R&D Systems).
Les DC immatures obtenues avec du GM-CSF/IL-4 n'ont pas produit p70 IL-12 mais ont produit des quantités très élevées de IL-10 après déclenchement par CD40 (tableau 5). L'addition de IFN-y avec la stimulation par CD40 a entraîné une diminution de 30 fois de la production d'IL-10 par des DC immatures activées par CD40. L'induction de la maturation des DC avec du TNF-a a entraîné une diminution dramatique de la production de IL-10 induite
<Desc/Clms Page number 17>
par CD40 (réduction moyenne de 10 fois) en association avec l'induction de l'expression de IL-12. L'addition de IFN-y a encore inhibé la production de IL-10 par des DC matures. Ceci est en accord avec les rapports précédents montrant que l'IFN-y pouvait être un cofacteur pour la production de IL-12 induite par CD40 (29,30). Toutefois, pour l'échantillon testé des trois autres patients, l'IFN-y a réduit la production de IL-12 par DC obtenue en présence de GM-CSF/IL-4 et TNF-a. Enfin, l'induction d'une DC totalement mature avec du TNF-a et PGE2 a entraîné une production réduite de IL-10 et IL-12 après stimulation par CD40 par rapport à TNF-a seul.
EXEMPLE 8 : Réaction des lymphocytes mixtes allogènes (MLR)
On a purifié des lymphocytes T non activés (HLA DR-) à partir de sang périphérique de volontaires en bonne santé par deux cycles de sélection négative en utilisant des microbilles revêtues de CD14 et de CD19 (Dynal, Oslo, Norvège), suivi par un cocktail d'anticorps mAbs CD16, CD56 et HLA-DR (Immunotech) et de microbilles d'anti-lg de souris de chèvre (Dynal). La pureté des cellules T CD3+ était supérieure à 97 %. On a ajouté des nombres progressifs de DC traitées par de la mitomycine (50 g/ml) à 1,5 x 105 cellules T allogènes dans 200 NI de RPMI-5 % de SAB. Après 5 jours de culture, on a mesuré la prolifération des cellules T par incorporation de thymidine tritiée (1 pCi/puits) pendant les 12 dernières heures. On a exprimé les résultats par les coûts moyens par minute (cpm) l'écart type déterminé dans des puits de culture sextuplés.
On a purifié des lymphocytes T non activés (HLA DR-) à partir de sang périphérique de volontaires en bonne santé par deux cycles de sélection négative en utilisant des microbilles revêtues de CD14 et de CD19 (Dynal, Oslo, Norvège), suivi par un cocktail d'anticorps mAbs CD16, CD56 et HLA-DR (Immunotech) et de microbilles d'anti-lg de souris de chèvre (Dynal). La pureté des cellules T CD3+ était supérieure à 97 %. On a ajouté des nombres progressifs de DC traitées par de la mitomycine (50 g/ml) à 1,5 x 105 cellules T allogènes dans 200 NI de RPMI-5 % de SAB. Après 5 jours de culture, on a mesuré la prolifération des cellules T par incorporation de thymidine tritiée (1 pCi/puits) pendant les 12 dernières heures. On a exprimé les résultats par les coûts moyens par minute (cpm) l'écart type déterminé dans des puits de culture sextuplés.
Les résultats de la figure 6 montrent que la maturation des DC obtenues dans du X-VIVO 15-2 % de HA les a transformées en stimulateurs des cellules T allogèniques aussi puissants que les DC matures produites dans du RPMI-10 % de FCS. Le TNF-a seul a donné les mêmes résultats que l'association de TNF-a et PGE2.
<Desc/Clms Page number 18>
Références 1. Hart, D. N. J. 1998. Dendritic cells: unique leukocyte populations which control the primary immune response. Blood 90:3245.
2. Banchereau, J. and R. M. Steinman. 1998. Dendritic cells and the control of immunity. Nature 392:245.
3. Fanger, N. A., D. Voigtlaender, C. Liu, S. Swink, K. Wardwell, J. Fisher,
R. F. Graziano, L. C. Pfefferkorn, and P. M. Guyre. 1997. Characterization of expression, cytokine regulation, and effector function of the high affinity IgG receptor Fc gamma RI (CD64) expressed on human blood dendritic cells.
R. F. Graziano, L. C. Pfefferkorn, and P. M. Guyre. 1997. Characterization of expression, cytokine regulation, and effector function of the high affinity IgG receptor Fc gamma RI (CD64) expressed on human blood dendritic cells.
J. Immunol. 158:3090.
4. Fanger, N. A., K. Wardwell, L. Shen, T. F. Tedder, and P. M. Guyre. 1996.
Type I (CD64) and type Il (CD32) Fc gamma receptor-mediated phagocytosis by human blood dendritic cells. J. Immunol. 157:541.
5. Sallusto, F., M. Cella, C. Danieli, and A. Lanzavecchia. 1995. Dendritic cells use macropinocytosis and the mannose receptor to concentrate macromolecules in the major histocompatibility complex class Il compartment: downregulation by cytokines and bacterial products [see comments]. J Exp.
Med. 182:389.
6. Albert, M. L., S. F. A. Pearce, L. M. Francisco, B. Sauter, P. Roy,
R. L. Silverstein, and N. Bhardwaj. 1998. Immature dendritic cells phagocytose apoptotic cells via alphavbeta5 and CD36, and cross-present antigens to cytotoxic T lymphocytes [In Process Citation]. J. Exp. Med.
R. L. Silverstein, and N. Bhardwaj. 1998. Immature dendritic cells phagocytose apoptotic cells via alphavbeta5 and CD36, and cross-present antigens to cytotoxic T lymphocytes [In Process Citation]. J. Exp. Med.
188:1359.
7. Sozzani, S., P. Allavena, G. D'Amico, W. Luini, G. Bianchi, M. Kataura,
T. Imai, O. Yoshie, R. Bonecchi, and A. Mantovani. 1998. Differential regulation of chemokine receptors during dendritic cell maturation : a model for their trafficking properties. J. Immunol. 161:1083.
T. Imai, O. Yoshie, R. Bonecchi, and A. Mantovani. 1998. Differential regulation of chemokine receptors during dendritic cell maturation : a model for their trafficking properties. J. Immunol. 161:1083.
<Desc/Clms Page number 19>
8. Sallusto, F., P. Schaerli, P. Loetscher, C. Schaniel, D. Lenig, C. R. Mackay,
S. Qin, and A. Lanzavecchia. 1998. Rapid and coordinated switch in chemokine receptor expression during dendritic cell maturation. Eur. J.
S. Qin, and A. Lanzavecchia. 1998. Rapid and coordinated switch in chemokine receptor expression during dendritic cell maturation. Eur. J.
Immunol. 28:2760.
9. Lin, C. L., R. M. Suri, R. A. Rahdon, J. M. Austyn, and J. A. Roake. 1998.
Dendritic cell chemotaxis and transendothelial migration are induced by distinct chemokines and are regulated on maturation. Eur. J. Immunol.
28:4114.
10. Tarte, K. and B. Klein. 1999. Dendritic-based vaccine : a promising approach for cancer immunotherapy. Leukemia 13:653.
11. Nestle, F. O., S. Alijagic, M. Gilliet, Y. Sun, S. Grabbe, R. Dummer, G. Burg, and D. Schadendorf. 1998. Vaccination of melanoma patients with peptide- or tumor lysate-pulsed dendritic cells. Nat. Med. 4:328.
12. Romani, N., D. Reider, M. Heuer, S. Ebner, E. Kampgen, B. Eibl,
D. Niederwieser, and G. Schuler. 1996. Generation of mature dendritic cells from human blood. An improved method with special regard to clinical applicability. J. Immunol. Methods 196.137.
D. Niederwieser, and G. Schuler. 1996. Generation of mature dendritic cells from human blood. An improved method with special regard to clinical applicability. J. Immunol. Methods 196.137.
13. Reddy, A., M. Sapp, M. Feldman, M. Subklewe, and N. Bhardwaj. 1997.
A monocyte conditioned medium is more effective than defined cytokines in mediating the terminal maturation of human dendritic cells. Blood 90:3640.
14. Jonuleit, H., U. Kuhn, G. Muller, K. Steinbrink, L. Paragnik, E. Schmitt,
J. Knop, and A. H. Enk. 1997. Pro-inflammatory cytokines and prostaglandins induce maturation of potent immunostimulatory dendritic cells under fetal calf serum-free conditions. Eur. J. Immunol. 27:3135.
J. Knop, and A. H. Enk. 1997. Pro-inflammatory cytokines and prostaglandins induce maturation of potent immunostimulatory dendritic cells under fetal calf serum-free conditions. Eur. J. Immunol. 27:3135.
15. Murphy, G., B. Tjoa, H. Ragde, G. Kenny, and A. Boynton. 1996. Phase I clinical trial: T-cell therapy for prostate cancer using autologous dendritic cells pulsed with HLA-A0201-specific peptides from prostate-specific membrane antigen. Prostate 29:371.
<Desc/Clms Page number 20>
16. Tjoa, B. A., S. J. Simmons, V. A. Bowes, H. Ragde, M. Rogers, A. Elgamal,
G. M. Kenny, O. E. Cobb, R. C. Ireton, M. J. Troychak, M. L. Salgaller,
A. L. Boynton, and G. P. Murphy. 1998. Evaluation of phase I/II clinical trials in prostate cancer with dendritic cells and PSMA peptides. Prostate 3639.
G. M. Kenny, O. E. Cobb, R. C. Ireton, M. J. Troychak, M. L. Salgaller,
A. L. Boynton, and G. P. Murphy. 1998. Evaluation of phase I/II clinical trials in prostate cancer with dendritic cells and PSMA peptides. Prostate 3639.
17. Thurner, B., C. Roder, D. Dieckmann, M. Heuer, M. Kruse, A. Glaser,
P. Keikavoussi, E. Kampgen, A. Bender, and G. Schuler. 1999. Generation of large number of fully mature and stable dendritic cells from leukapheresis products for clinical application. J. Immunol. Methods 223:1.
P. Keikavoussi, E. Kampgen, A. Bender, and G. Schuler. 1999. Generation of large number of fully mature and stable dendritic cells from leukapheresis products for clinical application. J. Immunol. Methods 223:1.
18. Soruri, A., A. Fayyazi, R. Gieseler, T. Schlott, T. M. Runger, C. Neumann, and J. H. Peters. 1998. Spécifie autologous anti-melanoma T cell response in vitro using monocyte-derived dendritic cells. lmmunobiology 198:527.
19. Anton, D., S. Dabadghao, K. Palucka, G. Holm, and Q. Yi. 1998. Generation of dendritic cells from peripheral blood adherent cells in medium with human serum. Scand. J. Immunol. 47:116.
20. Kim, C. J., T. Prevette, J. Cormier, W. Overwijk, M. Roden, N. P. Restifo,
S. A. Rosenberg, and F. M. Marincola. 1997. Dendritic cells infected with poxviruses encoding MART-1/Melan A sensitize T lymphocytes in vitro.
S. A. Rosenberg, and F. M. Marincola. 1997. Dendritic cells infected with poxviruses encoding MART-1/Melan A sensitize T lymphocytes in vitro.
J. Immunother. 20:276.
21. Rieser, C., G. Bock, H. Klocker, G. Bartsch, and M. Thurnher. 1997.
Prostaglandin E2 and tumor necrosis factor alpha cooperate to activate human dendritic cells: synergistic activation of interleukin 12 production.
J. Exp. Med. 186.1603.
22. Holtl, L., C. Rieser, C. Papesh, R. Ramoner, G. Bartsch, and M. Thurnher.
1998. CD83+ blood dendritic cells as a vaccine for immunotherapy of metastatic renal-cell cancer [letter] [In Process Citation]. Lancet 352:1358.
<Desc/Clms Page number 21>
23. Apostolopoulos, V., C. Osinski, and I. F. McKenzie. 1998. MUC1 cross- reactive Gai alpha(1,3)Gal antibodies in humans switch immune responses from cellular to humoral [see comments]. Nat Med. 4:315.
24. Abdel-Wahab, Z., P. DeMatos, D. Hester, X. D. Dong, and H. F. Seigler.
1998. Human dendritic cells, pulsed with either melanoma tumor cell lysates or the gp100 peptide(280-288), induce pairs of T-cell cultures with similar phenotype and lytic activity. Cell Immunol. 186.63.
25. Morse, M. A., R. E. Coleman, G. Akabani, N. Niehaus, D. Coleman, and
H. K. Lyerly. 1999. Migration of human dendritic cells after injection in patients with metastatic malignancies. Cancer Res 59:56.
H. K. Lyerly. 1999. Migration of human dendritic cells after injection in patients with metastatic malignancies. Cancer Res 59:56.
26. Tarte, K., S. J. Olsen, Z. Y. Lu, E. Legouffe, J. F. Rossi, Y. Chang, and
B. Klein. 1998. Clinical grade functional dendritic cells from patients with multiple myeloma are not infected with Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. Blood 91:1852.
B. Klein. 1998. Clinical grade functional dendritic cells from patients with multiple myeloma are not infected with Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. Blood 91:1852.
27. Tarte, K., Z. Y. Lu, G. Fiol, E. Legouffe, J. F. Rossi, and B. Klein. 1997.
Generation of virtually pure and potentially proliferating dendritic cells from non-CD34 apheresis cells from patients with multiple myeloma. Blood
90:3482.
90:3482.
28. Zhang, X. G., J. P. Gaillard, N. Robillard, Z. Y. Lu, Z. J. Gu, M. Jourdan,
J. M. Boiron, R. Bataille, and B. Klein. 1994. Reproducible obtaining of human myeloma cell lines as a model for tumor stem cell study in human multiple myeloma. Blood. 83:3654.
J. M. Boiron, R. Bataille, and B. Klein. 1994. Reproducible obtaining of human myeloma cell lines as a model for tumor stem cell study in human multiple myeloma. Blood. 83:3654.
29. Kalinski, P., J. H. N. Schuitemaker, C. M. U. Hilkens, E. A. Wierenga, and
M. L. Kapsenberg. 1999. Final maturation of dendritic cells is associated with impaired responsiveness to IFN-g and to bacterial IL-12 inducers : decreased ability of mature dendritic cells to produce IL-12 during the interaction with
Th cells. J. Immunol. 1623231.
M. L. Kapsenberg. 1999. Final maturation of dendritic cells is associated with impaired responsiveness to IFN-g and to bacterial IL-12 inducers : decreased ability of mature dendritic cells to produce IL-12 during the interaction with
Th cells. J. Immunol. 1623231.
<Desc/Clms Page number 22>
30. Snijders, A., P. Kalinski, C. M. U. Hilkens, and M. L. Kapsenberg. 1998. High- level IL-12 production by human dendritic cells requires 2 signais . Int.
Immunol. 10:1593.
31. Liu, P., M. Rowley, and B. Van Ness. 1996. Wildtype RB and p53 can suppress autocrine IL-6 production and proliferation of U266 myeloma cells.
Blood 88:389.
32. Nazaruk, R. A., R. Rochford, M. V. Hobbs, and M. J. Cannon. 1998.
Functional diversity of the CD8+ T-cell response to Epstein-Barr Virus (EBV) : Implication for the pathogenesis of EBV-associated lymphoproliferative disorders. Blood 91:3875.
33. Carter, L. and R. W. Dutton. 1996. Type 1 and type 2 : afundamental dichotomy for all T-cell subsets. Curr. Opin. Immunol. 8:336.
34. Steinbrink, K., H. Jonuleit, G. Muller, G. Schuler, J. Knop, and A. H. Enk.
1999. Interleukin-10-treated human dendritic cells induce a melanoma- antigen-specific anergy in CD8+ T cells resulting in a failure to lyse tumor cells. Blood 93: 1634.
35. Kalinski, P., J. H. N. Schuitemaker, C. M. U. Hilkens, and M. L. Kapsenberg.
1998. Prostaglandin E2 induces the final maturation of IL-12-deficient
CD1a+CD83+ dendritic cells: the levels of IL-12 are determined during the final dendritic cell maturation and are resistant to further modulation.
CD1a+CD83+ dendritic cells: the levels of IL-12 are determined during the final dendritic cell maturation and are resistant to further modulation.
J. Immunol. 161:2804.
36. Cella, M., D. Scheidegger, K. Palmer Lehmann, P. Lane, A. Lanzavecchia, and G. Alber. 1996. Ligation of CD40 on dendritic cells triggers production of high levels of interleukin-12 and enhances T cell stimulatory capacity : T-T help via APC activation. J. Exp. Med. 184:747.
<Desc/Clms Page number 23>
37. Rissoan, M-C., V. Soumelis, N. Kadowaki, G. Grouard, F. Briere, R. de Waal
Malefyt, and Y. J. Liu. 1999. Reciprocal control of T helper cell and dendritic cell différenciation. Science 283:1183.
Malefyt, and Y. J. Liu. 1999. Reciprocal control of T helper cell and dendritic cell différenciation. Science 283:1183.
38. Zhou, L. J. and T. F. Tedder. 1995. A distinct pattern of cytokine gene expression by human CD83+ blood dendritic cells. Blood 86:3295.
<Desc/Clms Page number 24>
<tb> Milieu <SEP> Cytokines <SEP> Rendement <SEP> (%) <SEP> Moyenne <SEP> des <SEP> pourcentages <SEP> de <SEP> cellules <SEP> positives <SEP> (IMF)
<tb> CD14 <SEP> HLA-DR <SEP> CD83 <SEP> CD80 <SEP> CD86
<tb> RPMI-FCS <SEP> GM/IL-4 <SEP> 9 <SEP> 10 <SEP> (32) <SEP> 100 <SEP> (180) <SEP> 3 <SEP> 80(72) <SEP> 82(53)
<tb> GM/IL-4/TNF <SEP> 10 <SEP> 4 <SEP> 100 <SEP> (465) <SEP> 86(47) <SEP> 98 <SEP> (120) <SEP> 90 <SEP> (126) <SEP>
<tb> GM/IL-4/TNF/PGE2 <SEP> 10 <SEP> 3 <SEP> 100 <SEP> (417) <SEP> 94 <SEP> (65) <SEP> 98 <SEP> (190) <SEP> 100 <SEP> (188) <SEP>
<tb> XV-sérum <SEP> AB <SEP> GM/IL-4 <SEP> 12 <SEP> 80(52) <SEP> 100 <SEP> (115) <SEP> 0 <SEP> 77(32) <SEP> 90 <SEP> (22) <SEP>
<tb> GM/IL-4/TNF <SEP> 14 <SEP> 25(69) <SEP> 100 <SEP> (224) <SEP> 25(40) <SEP> 95(60) <SEP> 85(50)
<tb> GM/IL-4/TNF/PGE2 <SEP> 13 <SEP> 40 <SEP> (50) <SEP> 100 <SEP> (173) <SEP> 52 <SEP> (80) <SEP> 90 <SEP> (60) <SEP> 100 <SEP> (95) <SEP>
<tb> XV-plasma <SEP> autologue <SEP> GM/IL-4 <SEP> 18 <SEP> 40 <SEP> (35) <SEP> 100 <SEP> (90) <SEP> 0 <SEP> 25 <SEP> (30) <SEP> 90 <SEP> (65) <SEP>
<tb> GM/IL-4/TNF <SEP> 19 <SEP> 20 <SEP> (29) <SEP> 100 <SEP> (125) <SEP> 20(55) <SEP> 35(42) <SEP> 90 <SEP> (110) <SEP>
<tb> GM/IL-4/TNF/PGE2 <SEP> 23 <SEP> 12 <SEP> (60) <SEP> 100 <SEP> (145) <SEP> 80 <SEP> (65) <SEP> 80 <SEP> (58) <SEP> 110 <SEP> (160) <SEP>
<tb> XV-sérum <SEP> autologue <SEP> GM/IL-4 <SEP> 22 <SEP> 50(35) <SEP> 100 <SEP> (95) <SEP> 9 <SEP> (12) <SEP> 28(26) <SEP> 85(68)
<tb> GM/IL-4/TNF <SEP> 25 <SEP> 26 <SEP> (66) <SEP> 100 <SEP> (120) <SEP> 17 <SEP> (25) <SEP> 39(33) <SEP> 90(92)
<tb> GM/IL-4/TNF/PGE2 <SEP> 23 <SEP> 40 <SEP> (70) <SEP> 100 <SEP> (115) <SEP> 59 <SEP> (66) <SEP> 72 <SEP> (68) <SEP> 95 <SEP> (150) <SEP>
<tb> XV-HA <SEP> GM/IL-4 <SEP> 16 <SEP> 21 <SEP> (13) <SEP> 100 <SEP> (172) <SEP> 0 <SEP> 82(46) <SEP> 85(80)
<tb> GM/IL-4/TNF <SEP> 16 <SEP> 5 <SEP> 100 <SEP> (270) <SEP> 55(43) <SEP> 100 <SEP> (110) <SEP> 95(97)
<tb> GM/IL-4/TNF/PGE2 <SEP> 20 <SEP> 3 <SEP> 100 <SEP> (251) <SEP> 85(66) <SEP> 100 <SEP> (136) <SEP> 100 <SEP> (133) <SEP>
<tb>
XV-HA = milieu X-VIVO 15-2 % d'albumine humaine GM = facteur GM-CSF
<tb> CD14 <SEP> HLA-DR <SEP> CD83 <SEP> CD80 <SEP> CD86
<tb> RPMI-FCS <SEP> GM/IL-4 <SEP> 9 <SEP> 10 <SEP> (32) <SEP> 100 <SEP> (180) <SEP> 3 <SEP> 80(72) <SEP> 82(53)
<tb> GM/IL-4/TNF <SEP> 10 <SEP> 4 <SEP> 100 <SEP> (465) <SEP> 86(47) <SEP> 98 <SEP> (120) <SEP> 90 <SEP> (126) <SEP>
<tb> GM/IL-4/TNF/PGE2 <SEP> 10 <SEP> 3 <SEP> 100 <SEP> (417) <SEP> 94 <SEP> (65) <SEP> 98 <SEP> (190) <SEP> 100 <SEP> (188) <SEP>
<tb> XV-sérum <SEP> AB <SEP> GM/IL-4 <SEP> 12 <SEP> 80(52) <SEP> 100 <SEP> (115) <SEP> 0 <SEP> 77(32) <SEP> 90 <SEP> (22) <SEP>
<tb> GM/IL-4/TNF <SEP> 14 <SEP> 25(69) <SEP> 100 <SEP> (224) <SEP> 25(40) <SEP> 95(60) <SEP> 85(50)
<tb> GM/IL-4/TNF/PGE2 <SEP> 13 <SEP> 40 <SEP> (50) <SEP> 100 <SEP> (173) <SEP> 52 <SEP> (80) <SEP> 90 <SEP> (60) <SEP> 100 <SEP> (95) <SEP>
<tb> XV-plasma <SEP> autologue <SEP> GM/IL-4 <SEP> 18 <SEP> 40 <SEP> (35) <SEP> 100 <SEP> (90) <SEP> 0 <SEP> 25 <SEP> (30) <SEP> 90 <SEP> (65) <SEP>
<tb> GM/IL-4/TNF <SEP> 19 <SEP> 20 <SEP> (29) <SEP> 100 <SEP> (125) <SEP> 20(55) <SEP> 35(42) <SEP> 90 <SEP> (110) <SEP>
<tb> GM/IL-4/TNF/PGE2 <SEP> 23 <SEP> 12 <SEP> (60) <SEP> 100 <SEP> (145) <SEP> 80 <SEP> (65) <SEP> 80 <SEP> (58) <SEP> 110 <SEP> (160) <SEP>
<tb> XV-sérum <SEP> autologue <SEP> GM/IL-4 <SEP> 22 <SEP> 50(35) <SEP> 100 <SEP> (95) <SEP> 9 <SEP> (12) <SEP> 28(26) <SEP> 85(68)
<tb> GM/IL-4/TNF <SEP> 25 <SEP> 26 <SEP> (66) <SEP> 100 <SEP> (120) <SEP> 17 <SEP> (25) <SEP> 39(33) <SEP> 90(92)
<tb> GM/IL-4/TNF/PGE2 <SEP> 23 <SEP> 40 <SEP> (70) <SEP> 100 <SEP> (115) <SEP> 59 <SEP> (66) <SEP> 72 <SEP> (68) <SEP> 95 <SEP> (150) <SEP>
<tb> XV-HA <SEP> GM/IL-4 <SEP> 16 <SEP> 21 <SEP> (13) <SEP> 100 <SEP> (172) <SEP> 0 <SEP> 82(46) <SEP> 85(80)
<tb> GM/IL-4/TNF <SEP> 16 <SEP> 5 <SEP> 100 <SEP> (270) <SEP> 55(43) <SEP> 100 <SEP> (110) <SEP> 95(97)
<tb> GM/IL-4/TNF/PGE2 <SEP> 20 <SEP> 3 <SEP> 100 <SEP> (251) <SEP> 85(66) <SEP> 100 <SEP> (136) <SEP> 100 <SEP> (133) <SEP>
<tb>
XV-HA = milieu X-VIVO 15-2 % d'albumine humaine GM = facteur GM-CSF
<Desc/Clms Page number 25>
Tableau Il
Analyse phénolytique de DC obtenues par culture dans du milieu XV-HA complémenté avec GM-CSF, IL-4 et TNF-a avec ou sans PGE2
Analyse phénolytique de DC obtenues par culture dans du milieu XV-HA complémenté avec GM-CSF, IL-4 et TNF-a avec ou sans PGE2
<tb>
<tb> Cytokines <SEP> CD14 <SEP> HLA-DR <SEP> CD83 <SEP> CD80 <SEP> CD86
<tb> GM/IL-4/TNF <SEP> 2,6 <SEP> 8,2 <SEP> 100 <SEP> 64 <SEP> 19 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> Moyenne <SEP> des <SEP> %*** <SEP> SD <SEP> - <SEP> 299 <SEP> 183 <SEP> 44 <SEP> 7 <SEP> 140 <SEP> 49 <SEP> 251 <SEP> 211 <SEP>
<tb> GM/IL-4/TNF/PGE2 <SEP> 1,5 <SEP> 4 <SEP> 100 <SEP> 83 <SEP> 12** <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> Moyenne <SEP> des <SEP> %*** <SEP> SD <SEP> - <SEP> 265 <SEP> 124 <SEP> 61 <SEP> 25* <SEP> 190 <SEP> 85 <SEP> 345 <SEP> 271 <SEP>
<tb>
* p< 0,01 par comparaison aux cellules cultivées avec GM/IL-4/TNF ** p< 0,05 par comparaison aux cellules cultivées avec GM/IL-4/TNF *** moyenne des % = moyenne des % de cellules positives GM = facteur GM-CSF
<tb> Cytokines <SEP> CD14 <SEP> HLA-DR <SEP> CD83 <SEP> CD80 <SEP> CD86
<tb> GM/IL-4/TNF <SEP> 2,6 <SEP> 8,2 <SEP> 100 <SEP> 64 <SEP> 19 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> Moyenne <SEP> des <SEP> %*** <SEP> SD <SEP> - <SEP> 299 <SEP> 183 <SEP> 44 <SEP> 7 <SEP> 140 <SEP> 49 <SEP> 251 <SEP> 211 <SEP>
<tb> GM/IL-4/TNF/PGE2 <SEP> 1,5 <SEP> 4 <SEP> 100 <SEP> 83 <SEP> 12** <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> Moyenne <SEP> des <SEP> %*** <SEP> SD <SEP> - <SEP> 265 <SEP> 124 <SEP> 61 <SEP> 25* <SEP> 190 <SEP> 85 <SEP> 345 <SEP> 271 <SEP>
<tb>
* p< 0,01 par comparaison aux cellules cultivées avec GM/IL-4/TNF ** p< 0,05 par comparaison aux cellules cultivées avec GM/IL-4/TNF *** moyenne des % = moyenne des % de cellules positives GM = facteur GM-CSF
<Desc/Clms Page number 26>
<tb>
<tb> Conditions <SEP> de <SEP> culture <SEP> Moyenne <SEP> des <SEP> % <SEP> de <SEP> cellules <SEP> positives <SEP> (IFM)
<tb> MR <SEP> CD36 <SEP> [alpha]vb3 <SEP> avb5
<tb> XV-HA <SEP> GM/IL-4 <SEP> 98 <SEP> (233) <SEP> 88(89) <SEP> 0 <SEP> 87(43)
<tb> XV-HA <SEP> GM/IL-4/TNF <SEP> 80 <SEP> (95)* <SEP> 37 <SEP> (47)** <SEP> 0 <SEP> 68 <SEP> (32)* <SEP>
<tb> XV-HA <SEP> GM/IL-4/TNF <SEP> /PGE2 <SEP> 74 <SEP> (91)* <SEP> 25 <SEP> (33)** <SEP> 0 <SEP> 58 <SEP> (36)* <SEP>
<tb>
XV-HA = milieu X-VIVO 15 - 2 % HA * p < 0,01 par comparaison aux cellules cultivées avec GM/IL-4 ** p < 0,05 par comparaison aux cellules cultivées avec GM/IL-4
<tb> Conditions <SEP> de <SEP> culture <SEP> Moyenne <SEP> des <SEP> % <SEP> de <SEP> cellules <SEP> positives <SEP> (IFM)
<tb> MR <SEP> CD36 <SEP> [alpha]vb3 <SEP> avb5
<tb> XV-HA <SEP> GM/IL-4 <SEP> 98 <SEP> (233) <SEP> 88(89) <SEP> 0 <SEP> 87(43)
<tb> XV-HA <SEP> GM/IL-4/TNF <SEP> 80 <SEP> (95)* <SEP> 37 <SEP> (47)** <SEP> 0 <SEP> 68 <SEP> (32)* <SEP>
<tb> XV-HA <SEP> GM/IL-4/TNF <SEP> /PGE2 <SEP> 74 <SEP> (91)* <SEP> 25 <SEP> (33)** <SEP> 0 <SEP> 58 <SEP> (36)* <SEP>
<tb>
XV-HA = milieu X-VIVO 15 - 2 % HA * p < 0,01 par comparaison aux cellules cultivées avec GM/IL-4 ** p < 0,05 par comparaison aux cellules cultivées avec GM/IL-4
<Desc/Clms Page number 27>
<tb>
<tb> Conditions <SEP> de <SEP> culture <SEP> GM+IL-4 <SEP> GM+IL-4+TNF <SEP> GM+IL-4+TNF+PGE2
<tb> Donneur <SEP> 1 <SEP> 8 <SEP> 4 <SEP> 3
<tb> Donneur <SEP> 2 <SEP> 12 <SEP> 6 <SEP> 5
<tb> Donneur <SEP> 3 <SEP> 14 <SEP> 6 <SEP> 5
<tb> Donneur <SEP> 4 <SEP> 10 <SEP> 5 <SEP> 5
<tb> Donneur <SEP> 5 <SEP> 10 <SEP> 4 <SEP> 4
<tb> Donneur <SEP> 6 <SEP> 11 <SEP> 6 <SEP> 6
<tb> IFM <SEP> 10,8 <SEP> 5,2 <SEP> 4,7
<tb> p <SEP> = <SEP> 0,03 <SEP> p <SEP> = <SEP> 0,25
<tb>
<tb> Conditions <SEP> de <SEP> culture <SEP> GM+IL-4 <SEP> GM+IL-4+TNF <SEP> GM+IL-4+TNF+PGE2
<tb> Donneur <SEP> 1 <SEP> 8 <SEP> 4 <SEP> 3
<tb> Donneur <SEP> 2 <SEP> 12 <SEP> 6 <SEP> 5
<tb> Donneur <SEP> 3 <SEP> 14 <SEP> 6 <SEP> 5
<tb> Donneur <SEP> 4 <SEP> 10 <SEP> 5 <SEP> 5
<tb> Donneur <SEP> 5 <SEP> 10 <SEP> 4 <SEP> 4
<tb> Donneur <SEP> 6 <SEP> 11 <SEP> 6 <SEP> 6
<tb> IFM <SEP> 10,8 <SEP> 5,2 <SEP> 4,7
<tb> p <SEP> = <SEP> 0,03 <SEP> p <SEP> = <SEP> 0,25
<tb>
<Desc/Clms Page number 28>
<tb> Conditions <SEP> de <SEP> culture <SEP> Production <SEP> de <SEP> cytokines <SEP> (pg/ml)
<tb> sans <SEP> stimulation <SEP> stimulation <SEP> avec <SEP> CD40 <SEP> stimulation <SEP> avec <SEP> CD <SEP> 40 <SEP> + <SEP> IFN-y
<tb> IL-10 <SEP> IL-12 <SEP> IL-10 <SEP> IL-12 <SEP> IL-10 <SEP> IL-12
<tb> XV-HA <SEP> GM/IL-4 <SEP> 25 <SEP> 9 <SEP> 0 <SEP> 1619 <SEP> 529 <SEP> 5,5 <SEP> 6,3 <SEP> 50 <SEP> 57 <SEP> 158 <SEP> ~ <SEP> 274
<tb> (16-35) <SEP> (1105-2360) <SEP> (0-11) <SEP> (14-115) <SEP> (0-476)
<tb> XV-HA <SEP> GM/IL-4/TNF <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 137 <SEP> 104 <SEP> 84 <SEP> 23 <SEP> 7 <SEP> 7 <SEP> 299 <SEP> 518 <SEP>
<tb> (62-285) <SEP> (55-105) <SEP> (0-21) <SEP> (0-898)
<tb> XV-HA <SEP> GM/IL-4/TNF/PGE2 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 64 <SEP> 61 <SEP> 7,2 <SEP> ~ <SEP> 8,8 <SEP> 0 <SEP> 16 <SEP> ~ <SEP> 29
<tb> (0-145) <SEP> (0-18) <SEP> (0-50)
<tb>
<tb> sans <SEP> stimulation <SEP> stimulation <SEP> avec <SEP> CD40 <SEP> stimulation <SEP> avec <SEP> CD <SEP> 40 <SEP> + <SEP> IFN-y
<tb> IL-10 <SEP> IL-12 <SEP> IL-10 <SEP> IL-12 <SEP> IL-10 <SEP> IL-12
<tb> XV-HA <SEP> GM/IL-4 <SEP> 25 <SEP> 9 <SEP> 0 <SEP> 1619 <SEP> 529 <SEP> 5,5 <SEP> 6,3 <SEP> 50 <SEP> 57 <SEP> 158 <SEP> ~ <SEP> 274
<tb> (16-35) <SEP> (1105-2360) <SEP> (0-11) <SEP> (14-115) <SEP> (0-476)
<tb> XV-HA <SEP> GM/IL-4/TNF <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 137 <SEP> 104 <SEP> 84 <SEP> 23 <SEP> 7 <SEP> 7 <SEP> 299 <SEP> 518 <SEP>
<tb> (62-285) <SEP> (55-105) <SEP> (0-21) <SEP> (0-898)
<tb> XV-HA <SEP> GM/IL-4/TNF/PGE2 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 64 <SEP> 61 <SEP> 7,2 <SEP> ~ <SEP> 8,8 <SEP> 0 <SEP> 16 <SEP> ~ <SEP> 29
<tb> (0-145) <SEP> (0-18) <SEP> (0-50)
<tb>
Claims (8)
1) à cultiver, pendant 4 à 6 jours, de préférence 5 jours, des cellules mononuclées issues de cytaphérèse après mobilisation, dans un milieu exempt de sérum complémenté avec de l'albumine humaine en présence d'un facteur stimulant les colonies de granulocytes- macrophages (GM-CSF) et d'une interleukine (IL) bloquant la différentiation vers la voie macrophagique ;
2) à ajouter au milieu de culture du TNF-a et éventuellement un médiateur inflammatoire et à poursuivre la culture pendant environ 1 à 4 jours, de préférence 2 jours supplémentaires ;
3) à récupérer les cellules dendritiques ainsi formées.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'interleukine est l'interleukine-4 ou l'interleukine-13.
3. Procédé selon l'une des revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le médiateur inflammatoire est le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-a).
4 Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le médiateur inflammatoire est le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-a) et la prostaglandine E2 (PGE2).
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les cellules mononuclées sont des cellules mononuclées obtenues par cytaphérèse après mobilisation par chimiothérapie et/ou par au moins un facteur de croissance cellulaire.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le GM-CSF, l'interleukine et le TNF-a sont chacun utilisés à raison de 1 à 1000 ng/ml de milieu.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'albumine humaine est utilisée à raison de 1 à 2 % (poids/volume de milieu), de préférence 2 %.
8. Cellules dendritiques irréversibles caractérisées en ce qu'elles sont [alpha]vss3-, [alpha]vss5+, CCR5- et CCR7+.
<Desc/Clms Page number 30>
Utilisation des cellules dendritiques irréversibles [alpha]vss3-, avp5+, CCR5' et CCR7+ pour la préparation d'un agent d'immunothérapie utile pour le traitement de toute maladie impliquant le système immunitaire.
Priority Applications (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR9909836A FR2796961B1 (fr) | 1999-07-29 | 1999-07-29 | Procede d'obtention de cellules dentritiques, les cellules dentritiques ainsi obtenues et leurs utilisations a des fins cliniques |
AU70096/00A AU7009600A (en) | 1999-07-29 | 2000-07-28 | Method for obtaining dendritic cells, resulting dendritic cells and uses thereof for clinical purposes |
PCT/FR2000/002173 WO2001009288A1 (fr) | 1999-07-29 | 2000-07-28 | Procede d'obtention de cellules dendritiques, les cellules dendritiques ainsi obtenues et leurs utilisations a des fins cliniques |
EP00958640A EP1198558A1 (fr) | 1999-07-29 | 2000-07-28 | Procede d'obtention de cellules dendritiques, les cellules dendritiques ainsi obtenues et leurs utilisations a des fins cliniques |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR9909836A FR2796961B1 (fr) | 1999-07-29 | 1999-07-29 | Procede d'obtention de cellules dentritiques, les cellules dentritiques ainsi obtenues et leurs utilisations a des fins cliniques |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
FR2796961A1 true FR2796961A1 (fr) | 2001-02-02 |
FR2796961B1 FR2796961B1 (fr) | 2003-05-02 |
Family
ID=9548651
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
FR9909836A Expired - Fee Related FR2796961B1 (fr) | 1999-07-29 | 1999-07-29 | Procede d'obtention de cellules dentritiques, les cellules dentritiques ainsi obtenues et leurs utilisations a des fins cliniques |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP1198558A1 (fr) |
AU (1) | AU7009600A (fr) |
FR (1) | FR2796961B1 (fr) |
WO (1) | WO2001009288A1 (fr) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1484064A1 (fr) * | 2003-06-04 | 2004-12-08 | Gesellschaft für Biotechnologische Forschung | Composition thérapeutique contenant des cellules dendritiques et son utilisation |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
BRPI0312436A2 (pt) | 2002-06-19 | 2016-06-28 | Northwest Biotherapeutics Inc | dispositivo de filtragem de fluxo tangencial e métodos para enriquecimento em leucócito |
AT412145B (de) * | 2002-09-13 | 2004-10-25 | Forsch Krebskranke Kinder | Verfahren zur herstellung eines zellulären immuntherapeutikums auf basis von il-12-freisetzenden dendritischen zellen |
DE102007006736B4 (de) | 2007-02-07 | 2012-01-12 | Dagmar Briechle | In-vitro Testkit zur tierversuchsfreien Bestimmung des sensibilisierenden Potentials einer Substanz |
CN115433714A (zh) * | 2022-04-15 | 2022-12-06 | 广东汉氏干细胞生物科技有限公司 | 一种免疫细胞在治疗疾病中的应用及其制备方法 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1998053048A1 (fr) * | 1997-05-21 | 1998-11-26 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Procedes et compositions permettant d'obtenir des cellules dendritiques a partir de populations amplifiees de monocytes, et d'activer les cellules t |
-
1999
- 1999-07-29 FR FR9909836A patent/FR2796961B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
2000
- 2000-07-28 WO PCT/FR2000/002173 patent/WO2001009288A1/fr not_active Application Discontinuation
- 2000-07-28 AU AU70096/00A patent/AU7009600A/en not_active Abandoned
- 2000-07-28 EP EP00958640A patent/EP1198558A1/fr not_active Withdrawn
Non-Patent Citations (6)
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1484064A1 (fr) * | 2003-06-04 | 2004-12-08 | Gesellschaft für Biotechnologische Forschung | Composition thérapeutique contenant des cellules dendritiques et son utilisation |
WO2004108145A1 (fr) * | 2003-06-04 | 2004-12-16 | Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH | Composition therapeutique contenant des cellules dendritiques et son utilisation |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP1198558A1 (fr) | 2002-04-24 |
AU7009600A (en) | 2001-02-19 |
FR2796961B1 (fr) | 2003-05-02 |
WO2001009288A1 (fr) | 2001-02-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US6274378B1 (en) | Methods and compositions for obtaining mature dendritic cells | |
US7198948B2 (en) | Methods and compositions for obtaining mature dendritic cells | |
Mackensen et al. | Delineation of the dendritic cell lineage by generating large numbers of Birbeck granule-positive Langerhans cells from human peripheral blood progenitor cells in vitro | |
WO1997029182A9 (fr) | Methodes et compositions pour obtenir des cellules dendritiques matures | |
US11684671B2 (en) | Enhancing the T-cell stimulatory capacity of human antigen presenting cells in vitro and in vivo and its use in vaccination | |
Fujii et al. | Presentation of tumor antigens by phagocytic dendritic cell clusters generated from human CD34+ hematopoietic progenitor cells: induction of autologous cytotoxic T lymphocytes against leukemic cells in acute myelogenous leukemia patients | |
US20030134415A1 (en) | Th1 cell adoptive immunotherapy | |
Tarte et al. | Extensive characterization of dendritic cells generated in serum-free conditions: regulation of soluble antigen uptake, apoptotic tumor cell phagocytosis, chemotaxis and T cell activation during maturation in vitro | |
US20130108663A1 (en) | Enhancing the t-cell stimulatory capacity of human antigen presenting cells in vitro and in vivo and their use in vaccination | |
WO2003039232A2 (fr) | Facteur de croissance hematopoietique derive de cellules endotheliales | |
Goswami et al. | Neem leaf glycoprotein matures myeloid derived dendritic cells and optimizes anti-tumor T cell functions | |
Toujas et al. | Human monocyte‐derived macrophages and dendritic cells are comparably effective in vitro in presenting HLA class I‐restricted exogenous peptides | |
Gottfried et al. | Characterization of cells prepared by dendritic cell-tumor cell fusion | |
Chitta et al. | GMCSF in the absence of other cytokines sustains human dendritic cell precursors with T cell regulatory activity and capacity to differentiate into functional dendritic cells | |
US20040022761A1 (en) | Compositions and methods for producing antigen-presenting cells | |
JP2003511064A (ja) | ヒト末梢血単核細胞由来の樹状細胞の産生および特徴付け | |
US20030194395A1 (en) | Th1 cell adoptive immunotherapy | |
EP1470217A1 (fr) | Generation et utilisation de cellules dendritiques | |
FR2796961A1 (fr) | Procede d'obtention de cellules dentritiques, les cellules dentritiques ainsi obtenues et leurs utilisations a des fins cliniques | |
Vuckovic et al. | Growth factors, cytokines and dendritic cell development | |
JP3957746B2 (ja) | 骨髄始原細胞および/またはリンパ系始原細胞について富化される細胞集団、ならびに製造方法および使用方法 | |
EP1280889B1 (fr) | Compositions et procédés de production de cellules présentatrices d'antigènes | |
ES2301494T3 (es) | Celulas dendriticas activadas en presencia de hormonas glucocorticoides capaces de suprimir las respuestas de las celulas t especificas a un antigeno. | |
FR2891551A1 (fr) | Procede technique de preparation de cellules dentritiques a partir de progeniteurs hematopoietiques en deux etapes sans purification ou enrichissement prealable en cellules souches hematopoietiques. | |
Jankowska et al. | Phenotype of dendritic cells generated in the presence of non-small cell lung cancer antigens-preliminary report. |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
ST | Notification of lapse |
Effective date: 20090331 |