ES2301494T3 - Celulas dendriticas activadas en presencia de hormonas glucocorticoides capaces de suprimir las respuestas de las celulas t especificas a un antigeno. - Google Patents

Abstract

Método para preparar una composición farmacéutica para modificar funcionalmente una célula T específica de un antígeno de un huésped, comprendiendo cultivar monocitos de sangre periférica de dicho huésped para diferenciar las células dendríticas, activar dichas células dendríticas en presencia de una hormona glucocorticoide y cargar dichas células dendríticas en presencia de dicha hormona glucocorticoide con un antígeno para el que dicha célula T debe ser específica.

Description

Células dendríticas activadas en presencia de hormonas glucocorticoides capaces de suprimir las respuestas de las células T específicas a un antígeno.

La invención se refiere al campo de medicina. Más particularmente la invención se refiere al campo de la inmunoterapia.

Antecedentes de la invención

Las propiedades destacables de los inmunoestimuladores de las DC (células dendríticas) residen en su capacidad de transportar antígenos de tejidos periféricos a los órganos linfoides donde presentan estos antígenos a las células T en un contexto coestimulador óptimo (1). Para conseguir esta secuencia compleja de eventos, las DC existen en diferentes estadios funcionales. Las DC inmaduras se comportan como centinelas en los tejidos periféricos donde capturan eficazmente antígenos. Tras una invasión patógena, la inducción de respuestas de células T protectoras requiere la activación de DC inmaduras en células inmunoestimuladoras maduras. La activación de las DC es desencadenada en los tejidos inflamados por citoquinas tales como IL-1 y TNF-a y por componentes bacterianos tales como LPS (2, 3). Las DC activadas migran hacia áreas de células T en los ganglios linfáticos mientras regulan por incremento sus capacidades coestimuladores y optimizan sus funciones presentando antígenos. Tras la interacción con células T específicas de los antígenos, la activación de las DC es posteriormente completada a través del acoplamiento del par receptor-ligando (L) CD40-CD40L, conduciendo a la producción de IL-12 (4, 5, 6), una citoquina clave para el cebado (7) del linfocito T colaborador (Th) tipo 1 y T citotóxico (CTL).

Una activación de las APC a través de las interacciones de CD40-CD40L representa una fase inmunorreguladora importante para el establecimiento de la inmunidad de las células T protectoras contra los agentes patógenos y tumores (8, 9, 10). Este proceso también juega un papel clave en la aparición de enfermedades destructivas mediadas por células T tales como enfermedades autoinmunológicas, rechazo de aloinjertos y enfermedad de injerto contra huésped (11, 12, 13). El tratamiento actual de estas enfermedades reside mayoritariamente en la administración de glucocorticoides (GC), que ejercen potentes efectos antiinflamatorios e inmunosupresores. Dado que los GC interfieren negativamente en muchos aspectos de la activación de las células T tales como la proliferación inducida por el factor IL-2 y la producción de citoquinas inflamatorias (reseñado en 14), las células T activadas han sido consideradas desde hace mucho tiempo los objetivos principales de la acción de los GC. Diferentes líneas de evidencia sugieren ahora un papel de las DC en la supresión inmunológica inducida por GC. Moser et al (15) descubrió que los GC evitaban la activación espontánea de DC murinas reduciendo de ese modo su potencial estimulador de células T. Kitajima et al (16) demostró que los GC podían obstaculizar la activación mediada por células T de una línea de DC murina. Viera et al informó que las DC humanas expuestas a GC producían poco IL-12 tras la estimulación de LPS (17). Estas conclusiones sólo se refieren a la pérdida de características típicas de las DC favoreciendo en consecuencia un papel inhibitorio simple de los GC en la activación de las DC. No se ha tenido en cuenta una acción inmunorreguladora más compleja en el sistema DC.

La presente invención fue un producto de un análisis detallado del impacto de los GC en la activación mediada por CD40 de las DC derivadas de monocitos. Estas DC se desarrollan después del cultivo con GM-CSF y

IL-4 (2, 18) o después de la transmigración a través de células endoteliales (19) y se sabe que maduran en las APC humanas más potentes que inducen las Th1 tras el ligado con CD40 (5, 20). Además, estas APC puede fácilmente ser generadas en grandes cantidades y son por ello las células de elección para la modulación basada en las DC de la inmunidad de las células T (21, 22). A diferencia de estudios anteriores, la presente invención demuestra que los GC tales como la dexametasona (DEX) no solo evitan la activación de las DC, sino que convierte la ligadura de CD40 en las DC derivadas de monocitos humanos en una vía de activación alternativa. La DEX afecta profundamente la maduración dependiente de CD40 de las DC derivadas de monocitos humanos, no sólo evitando la regulación por incremento de las moléculas de adhesión coestimuladoras y de superficie del MHC, sino también haciendo que estas células segreguen el mediador antiinflamatorio IL-10 en vez de la citoquina IL-12 estimuladora de las Th1. Según estos cambios fenotípicos y funcionales, las DC activadas a través de CD40 en presencia de DEX son estimuladoras deficientes de respuestas tipo Th1. Lo más importante es que la presente invención muestra que tales DC son capaces de inducir un estado de hiposensibilidad en las células Th1, lo que indica que estas células son capaces de suprimir de forma activa la inmunidad tipo Th1.

Como se ha mencionado anteriormente arriba, el impacto de los GC en las DC ha sido el tema de diferentes estudios precedentes realizados por otros. No obstante, a diferencia de la presente invención, estos estudios sólo destacaban los efectos inhibitorios de los GC en el sistema DC. Se descubrió que la DEX bloquea la regulación por incremento de las moléculas CD80, CD86 y MHC clase II tras la activación de las DC de bazo murinas (15, 16), mientras que se demostró muy recientemente que la DEX también evita la diferenciación de las DC de precursores de monocitos (28). En estos estudios, la incapacidad de las DC de adquirir expresión alta de moléculas coestimuladoras y MHC estaba acompañada de una reducción en su potencial estimulador de células T, pero no se investigó el efecto de los GC en la producción de IL-12. Por otro lado, Viera et al descubrió que el efecto de los GC en la activación de las DC inducida por LPS consistía en una reducción de 4 veces la síntesis de IL-12p70 (17). Este efecto parcial en la secreción de IL- 12 contrasta con la supresión completa de la producción de IL-12p70 que es el tema de la presente invención, y puede explicarse por el hecho de que sus DC inmaduras tratadas con GC fueron extensivamente lavadas antes de la estimulación con LPS. De hecho descubrimos que tras retirar los GC, los efectos de estos fármacos fueron rápidamente reversibles en las DC inmaduras. La presencia continua de GC durante la activación por CD40 de las DC fue claramente preferida para modular estable y completamente la activación de DC (datos no mostrados). Tomado en su conjunto, los descubrimientos anteriores indicaron que el impacto de los GC en el sistema DC debería ser meramente interpretado como un evento inhibitorio. Hay que resaltar que la presente invención demuestra claramente que los GC tales como la DEX simplemente no suprime la activación de las DC sino que más bien redirige este proceso hacia un programa funcional distinto.

La activación de las DC a través del acoplamiento de CD40-CD40L es un evento estimulador clave para la generación de respuestas efectivas CTL dependientes de Th1 y CD4 in vivo (10, 36, 37, 38). Esta vía no obstante está también implicada en el desarrollo de respuestas indeseadas de células T conduciendo a enfermedades autoinmunológicas o rechazo de un transplante de órgano (II, 12, 13). Hasta ahora, el tratamiento de pacientes que padecen enfermedades de este tipo reside mayoritariamente en la administración sistémica de hormonas GC. Este tratamiento no solo suprime las respuestas de las células T patógenas sino que también induce un estado general de inmunosupresión y efectos secundarios metabólicos y endocrinos. La presente invención demuestra que la activación de las DC derivadas de monocitos humanos a través de CD40, en presencia de GC tal como DEX, genera una APC productora de IL-10 que es un estimulador pobre de respuestas tipo Th1 y que puede incluso conferir hiposensibilidad a las células Th1. La presente invención en consecuencia indica que tales DC cargadas con antígenos apropiados pueden ser aprovechadas como un procedimiento nuevo para regular por decremento específicamente las respuestas de las células T in vivo.

Las células dentríticas de la invención poseen capacidades diferentes a aquellas previamente proporcionadas para las células dendríticas. En consecuencia se puede considerar que estas células forman parte de una clase de células diferente de la clase formada por las células dendríticas "clásicas". Las células dendríticas de la invención pueden ser usadas de una forma diferente a las células dendríticas tradicionales. Las células dendríticas de la invención pueden por ejemplo ser usadas para suprimir, al menos en parte, una respuesta inmunitaria indeseada en un huésped. Consecuentemente, en un aspecto, la invención provee un método para preparar una composición farmacéutica para reducir una respuesta indeseada de células T en un huésped, comprendiendo cultivar monocitos de sangre periférica de dicho huésped para diferenciar las células dendríticas, activar dichas células dendríticas en presencia de una hormona glucocorticoide y cargar dichas células dendríticas activadas con un antígeno contra el cual se debe reducir dicha respuesta de las células T. Una respuesta indeseada de las células T puede ser cualquier tipo de respuesta de las células T. Por ejemplo, pero sin limitarse a ellas, una respuesta de células T asociada a una enfermedad autoinmunológica o una enfermedad por transplante tal como una enfermedad de injerto contra huésped o una enfermedad de huésped contra injerto. Una composición farmacéutica de la invención normalmente comprende una célula dendrítica de la invención suspendida en un líquido adecuado para conservar la función de dicha célula dendrítica en dicho líquido y/o adecuado para la administración a un huésped. El huésped es preferiblemente un humano. Preferiblemente dicho huésped corre el riesgo de desarrollar o está padeciendo una enfermedad autoinmunológica o alergia. Preferiblemente, dicho huésped padece o corre el riesgo de padecer una enfermedad de huésped contra injerto y/o una enfermedad de injerto contra huésped. Con el término en riesgo se entiende que se espera que dicho huésped pueda desarrollar dicha enfermedad, por ejemplo pero sin limitarse a un huésped receptor de un transplante. Tal huésped es considerado que corre el riesgo de desarrollar una enfermedad de huésped contra injerto. Un antígeno normalmente es un péptido capaz de unirse a una molécula de un complejo principal de histocompatibilidad I y/o II. Tales péptidos son conocidos en la técnica y un experto en la materia puede determinar si un péptido dado comprende un antígeno o no. Un antígeno puede ser derivado de una proteína de origen natural. Un antígeno puede también ser un péptido sintético o equivalente del mismo, preferiblemente con una secuencia de aminoácidos equivalente a un péptido derivado de una proteína.

En otro aspecto la invención provee una composición farmacéutica para reducir una respuesta indeseada de células T en un huésped, dicha composición siendo obtenida cultivando monocitos de sangre periférica de dicho huésped para diferenciar las células dendríticas, activar dichas células dendríticas en presencia de una hormona glucocorticoide y cargar dichas células dendríticas activadas con un antígeno contra el cual dicha respuesta de las células T debe ser reducida. En una forma de realización se provee un método para reducir una respuesta indeseada de células T en un huésped, comprendiendo la administración de una composición de la invención a dicho huésped.

La invención también provee un método para reducir una respuesta indeseada de células T en un huésped comprendiendo cultivar monocitos de sangre periférica de dicho huésped para diferenciar las células dendríticas, activar dichas células dendríticas y/o sus precursores en presencia de una hormona glucocorticoide y cargar dichas células dendríticas activadas con un antígeno contra el cual debe reducirse dicha respuesta de las células T y administrar dicha composición a dicho huésped.

En una forma de realización de la invención dicha activación es hecha a través de un receptor CD40. La activación de las DC a través de la activación del receptor CD40 puede implicar bien incubación con una proteína de fusión CD8-CD40L, un trimérico de CD40L consistente en moléculas de CD40L a las que se ha unido una cremallera de leucina modificada, anticuerpos anti-CD40 o células que expresan CD40L. Otras señales que pueden ser empleadas para la activación de las DC como se describe en la presente invención incluyen lipopolisacáridos (LPS) y polil/C.

En otro aspecto la invención provee un método para obtener una célula dendrítica capaz de tolerar células T para un antígeno comprendiendo el suministro a dicha célula dendrítica de una hormona glucocorticoide, la activación de dicha célula dendrítica y el suministro a dicha célula dendrítica con dicho antígeno. Con el término tolerar se entiende que dicha célula dendrítica tiene un efecto inmunosupresor sobre dicha célula T. Una célula T tolerada esencialmente no responde con división celular cuando es expuesta a una célula que presenta un antígeno, dicha célula T respondería con división celular en estado de no toleración. Una célula T tolerada esencialmente no responde matando a una célula que presente un antígeno, dicha célula T respondería matando células en estado de no toleración.

En una forma de realización dicha célula dendrítica y/o precursor de la misma es provista de dicha hormona glucocorticoide in vitro. Una célula T es preferiblemente una célula T específica de un antígeno, preferiblemente una célula T citotóxica o una célula Th.

En otro aspecto la invención provee una célula dendrítica aislada capaz de modificar la función de una célula T específica de un antígeno, que de lo contrario intensificaría una respuesta inmunitaria dada, dando como resultado una célula T que es capaz de reducir esa respuesta inmunitaria. En una forma de realización la invención provee un método para modificar una célula T específica de un antígeno, comprendiendo proveer una célula dendrítica según la invención con dicho antígeno y cultivar juntas dicha célula T y dicha célula dendrítica. Preferiblemente, dicho cultivo conjunto es realizado in vitro. Dicho método puede además comprender multiplicar dichas células T funcionalmente modificadas.

También se describe una célula T funcionalmente modificada aislada obtenible por un método según la invención.

En otro aspecto la invención provee el uso de una hormona glucocorticoide para obtener una célula dendrítica capaz de modificar funcionalmente una célula T.

La invención también provee una composición farmacéutica que comprende una célula dendrítica y/o una célula T funcionalmente modificada según la invención. La invención también provee el uso de una célula dendrítica y/o una célula T funcionalmente modificada según la invención para la preparación de un medicamento.

La invención también provee un método para el tratamiento de un individuo que padece o corre el riesgo de padecer una enfermedad asociada a al menos parte del sistema inmunitario de dicho individuo comprendiendo la administración a dicho individuo de una célula dendrítica y/o una célula T funcionalmente modificada según la invención. Preferiblemente, dicha célula dendrítica y/o dicha célula T funcionalmente modificada, o precursores de las mismas son derivadas de un donante HLA-compatible. Preferiblemente, dicho donante HLA-compatible es dicho individuo.

Los métodos de tratamiento de la invención son preferiblemente usados para el tratamiento de un individuo que padece una enfermedad autoinmunológica, una alergia, una enfermedad de injerto contra huésped y/o una enfermedad de huésped contra injerto.

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Ejemplos Ejemplo 1 Afectación de cambios fenotípicos mediados por CD40-CD40 por DEX

Exploramos el impacto de la DEX en los cambios fenotípicos inducidos por ligadura de CD40 en DC derivadas de monocitos inmaduras. En ausencia de DEX, la proteína de fusión CD8-CD40L indujo una fuerte regulación por incremento de las moléculas coestimuladoras CD80, CD86 y CD40, de las moléculas de MHC clase I y II, de los marcadores de adhesión CD54 y CD58 y del marcador de maduración de DC CD83 (Fig 1). En presencia de DEX, estos cambios fenotípicos inducidos por CD8-CD40L fueron considerablemente afectados: la regulación por incremento de las moléculas CD80, CD86, CD40, CD54, CD58 y del MHC clase I y II fue ampliamente inhibida y CD83 no fue expresado (Fig 1). Es importante destacar que las DC tratadas con DEX no revirtieron a un estadio monocito/macrófago como se demostró por la falta de expresión de CD14 (Fig 1). La titulación de DEX mostró una inhibición completa de los cambios fenotípicos mediados por CD40 a 10^{-6} M y 10^{-7} M, un bloqueo parcial a 10^{-8} M y ningún efecto a 10^{-9} M y 10^{-10} (datos no mostrados). Además, la acción de DEX dependió de la unión al receptor de GC, puesto que fue suprimida por la adición simultánea del antagonista del receptor de GC RU486 (datos no mostrados). En experimentos realizados con LPS o TNF-a como agentes de activación se obtuvieron resultados similares. No obstante, la combinación de DEX y TNF-alfa indujo una muerte celular masiva (recuperación de células viables 5-10% de los cultivos de control), un fenómeno que no fue observado cuando las DC tratadas con DEX fueron estimuladas con LPS o CD40 (recuperación de células viables 60 a 100% de los cultivos de control) (no mostrado).

Después analizamos si las DC activadas podrían seguir siendo afectadas por DEX. Las DC incubadas con CD8-CD40L durante 48 h y adicionalmente expuestas a DEX mantuvieron un fenotipo activado estable (Fig 2).

Concluimos que la DEX evita los cambios fenotípicos inducidos por señales de CD40 en las DC inmaduras y que las DC ya activadas eran resistentes a la acción de la DEX.

Ejemplo 2 DEX no interfiere en la regulación de la maquinaria de aceptación del antígeno de DC

A diferencia de las DC activadas, las DC inmaduras interiorizan eficazmente los antígenos a través de macropinocitosis y endocitosis mediado por receptores de manosa (2, 3, 25, 26). Analizamos si la DEX podría afectar la captura del antígeno de DC y su regulación por decremento tras una reticulación con CD40. Como se muestra en la Fig 3, la incorporación de FITC-BSA y FITC-BSA manosilado por DC inmaduras y por DC inmaduras tratadas con DEX fue comparable. Tras la activación con CD40 se observó una disminución de la aceptación similar de FITC-BSA y FITC-BSA manosilado tanto por DC tratadas con DEX como no tratadas (Fig 3). Estos resultados fueron los primeros en indicarnos que la DEX no bloquea todos los aspectos de activación de las DC, puesto que no interfiere en la regulación por decremento de la maquinaria de aceptación de antígenos de DC.

Ejemplo 3 DC activadas con CD40 tratadas con DEX segregan IL-10 en vez de IL-12

Una característica clave de las DC activadas con CD40 para iniciar la inmunidad de las células T reside en su capacidad para producir la citoquina proinflamatoria IL-12 (5, 6, 27). Investigamos si la DEX influía en la producción de IL-12 por DC estimuladas a través de CD40, y exploramos la posibilidad de que DEX pudiera promover la secreción de la citoquina antiinflamatoria IL- 10. Como se muestra en la Fig 4, la activación con CD40 de las DC indujo fuertemente la secreción de IL-12p40 y IL-12p70 (hasta 120 ng/ml y 170 pg/ml respectivamente) pero sólo estimuló deficientemente la producción de IL-10 (hasta 68 pg/ml). Por el contrario, la activación con CD40 de las DC tratadas con DEX produjo una producción considerablemente reducida de IL-12p40 (hasta 100 veces) y la supresión completa de secreción de IL-12p70, mientras que se mejoró mucho la producción de IL-10 (hasta 50 veces) (Fig 4). Las DC inmaduras y sus equivalentes tratadas con DEX no segregaron cantidades detectables de IL-12 e IL-10 (Fig 4). En consecuencia, la ligadura con CD40 de las DC en presencia de DEX activa la secreción de altos niveles de la citoquina antiinflamatoria IL-10 en vez de IL-12.

Ejemplo 4 Las DC activadas con CD40 tratadas con DEX pueden suprimir la inmunidad tipo Th1

La respuesta sorprendentemente modificada de las DC a la ligadura con CD40 en presencia de DEX nos llevó a comparar el potencial estimulador de células T de estas células con aquel de sus equivalentes no tratadas con DEX. En un MLR alogeneico, las DC activadas con CD40 indujeron una respuesta muy proliferativa de células T mientras que la adición de DEX antes de la activación con CD40 redujo su capacidad estimuladora de células T a aquella de las DC inmaduras (Fig 5). Cuando se evaluó su capacidad para estimular un clon específico de hsp65 CD4^{+} Th1, se descubrió que las DC activadas con CD40 pulsadas con la proteína hsp65 o con el epitopo de péptido específico p3-13 eran potentes inductoras de tanto la proliferación de células T como la producción de IFN-g dependiente de las células T (Fig 5). Por el contrario, en presencia de DC activadas con CD40 tratadas con DEX y pulsadas con Ag, se redujo significantemente la proliferación de células T y la producción de IFN-g (p<0,001 y p<0,01 respectivamente) (Fig 5). Después investigamos si las DC activadas con CD40 tratadas con DEX fueron simplemente estimuladores deficientes de células Th1 o si podrían ejercer efectos supresores en estas células T. En consecuencia evaluamos la capacidad de las células T específicas de hsp65 estimuladas con DC activadas con CD40 tratadas con DEX pulsadas con p3-13 para responder a un segundo desafío antigénico potente. La Fig 6 muestra que el cultivo previo de células T con DC activadas con CD40 produjo una fuerte proliferación de células T y producción de IFN-gamma tras una segunda reestimulación específica de un antígeno. Por el contrario, el cultivo previo con DC activadas con CD40 tratadas con DEX produjo una capacidad proliferativa y de producción de IFN-gamma de células Th1 considerablemente reducida. Así, la activación con CD40 de las DC en presencia de DEX produce APC que no son meras inductoras deficientes de respuestas de células T sino que también inducen un estado de hiposensibilidad en las células Th1.

Ejemplo 5 Las DC activadas tratadas con DEX suprimen la inmunidad antitransplante in vivo

En un primer intento de probar si las DC tratadas con DEX podrían suprimir una inmunidad indeseada, se preparó un modelo de transplante de piel en ratones. Se sabe que los transplantes de piel de ratones C57B1/6, cuando son injertados en ratones receptores completamente alogeneicos Balb/C, son rápidamente rechazados como resultado de una respuesta inmunitaria de las células T antitransplante muy alorreactiva. Se realizaron experimentos para analizar si el tratamiento previo de los ratones receptores con DC tratadas con DEX producía la supresión de esta respuesta de huésped contra injerto. Se usó una línea celular de DC murina establecida de origen C57B1/6, llamada D1, que muestra un fenotipo inmaduro estable in vitro a menos que éstas reciban una señal activante a través de anticuerpos agonístico anti-CD40 o LPS. Esta activación produce DC completamente maduradas que son altamente capaces de cebar CTL tanto in vitro como in vivo (39,40). La maduración de D1 implica una fuerte regulación por incremento de la expresión de la superficie celular de la molécula coestimuladora CD86 (B7.2), el receptor de CD40 y el MHC Clase II (Fig. 7). Como en nuestras observaciones en DC humanas, la maduración de D1 en presencia de DEX evitó considerablemente la regulación por incremento de estas moléculas en la superficie celular (Fig. 7). Esto sugirió que las células D1 tratadas con DEX podrían ser aprovechadas para suprimir la inmunidad de células T in vivo. En consecuencia se inyectó a los ratones Balb/C células D1 que habían sido activadas en ausencia o presencia de DEX. Una semana después de la inmunización, la respuesta alorreactiva de los esplenocitos de estos ratones, al igual que de los ratones de control, fue evaluada in vitro. Los ratones tratados previamente con células D1 inmaduras que habían sido cultivadas en presencia o ausencia de DEX no exhibieron una inmunidad alorreactiva tipo Th1 significativamente alterada en comparación con los ratones de control (Fig. 8). Esto concuerda con nuestras observaciones con DC humanas, que también mostraron que las DC inmaduras tratadas con DEX no exhibían propiedades diferentes a las DC inmaduras normales. Como se esperaba, los ratones inmunizados con D1 completamente maduradas mostraron una capacidad de respuesta mejorada. Es importante destacar que los ratones tratados previamente con D1 activadas en presencia de DEX mostraron una inmunidad alorreactiva tipo Th1 muy reducida (Fig. 8).

Posteriormente se evaluó si la reducción de alo-respuestas en este último grupo de ratones, medida in vitro, reflejaría una inmunidad alorreactiva disminuida in vivo. Se inmunizaron grupos de ratones Balb/C con células D1 maduradas en ausencia o presencia de DEX. Se injertaron transplantes de piel de origen C57B1/6 en estos ratones una semana más tarde, y se controló la supervivencia al injerto. Los injertos fueron rápidamente rechazados en los ratones de control y los ratones inmunizados con células D1 maduradas normales (Fig. 9). No se intensificó el rechazo en este último grupo a pesar de las respuestas alorreactivas más grandes en estos ratones (Fig. 8). Muy probablemente, la respuesta en los ratones de control es ya suficiente para el rechazo máximo. Cabe destacar que el rechazo del injerto es significativamente retardado (p < 0,05) en ratones tratado previamente con D1 maduradas en presencia de DEX (Fig. 9). Este resultado corresponde con la alorreactividad inmensamente reducida en estos ratones determinada in vitro (Fig. 8).

En conclusión, los experimentos de injertos de piel en ratones demuestran que las DC maduradas en presencia de DEX pueden ser empleadas efectivamente para suprimir la inmunidad indeseada tal como contra transplantes. Aunque en los experimentos mostrados los transplantes son finalmente rechazados, hay que tener en cuenta que el donante y el receptor mostraban grandes diferencias respecto a los antígenos del transplante. En seres humanos, donantes y receptores son lo más compatible posible para estos antígenos. Los experimentos marinos que aprovechen mejor la compatibilidad entre donante y receptor están en vías de ejecución. Los datos en Fig. 8 y 9 muestran que el tratamiento previo con DC maduras tratadas con DEX producirá efectos mucho más profundos en esta situación.

Materiales y métodos Generación de DC

Se generaron DC inmaduras de precursores de monocitos de sangre periférica. PBMC humanas de donantes sanos, aisladas a través de un centrifugado de densidad Ficoll-Hypaque fueron colocadas en placas a 1,5x10^{7} por pocillo en placas de 6 pocillos (Costar Corp., Cambridge, MA) en RPMI 1640 (Life Technologies, Paisley, Escocia) complementado con 2 mM de glutamina, 100 Ul/ml de penicilina y 10% FCS. Después de 2 h a 37ºC, se eliminaron las células no adherentes y se cultivaron las células adherentes en un medio conteniendo 500 U/ml IL-4 (Pepro Tech Inc. Rocky Hill, NJ) y 800 U/ml de GM-CSF (gentilmente proporcionado por Dr S. Osanto, LUMC, Leiden, NL) durante un total de 7 días.

Activación de DC inmaduras con una proteína de fusión CD8-CD40L

La activación de DC con CD40 fue realizada con una proteína de fusión compuesta por el dominio extracelular humano CD40L y la cadena murina CD8a (CD8-CD40L). El ADNc de CD8-CD40L descrito por Garrone et al (23) fue transferido en un vector de expresión eucanótico conteniendo el gen de resistencia a la higromicina, y usado para la generación de células de ovario de hámster chino (CHO) transfectadas de forma estable. Los sobrenadantes del cultivo conteniendo la proteína de fusión CD8-CD40L fueron concentrados con un sistema celular agitado presurizado (Amicon, Inc., Beverly, MA), controlando su unión a CD40 y evaluando las condiciones de activación de las DC óptimas (no mostrado). Las DC fueron incubadas a 5 X 10^{5}/ml/pocillo en una placa de 24 pocillos (Costar Corp., Cambridge, MA) y activadas en presencia de sobrenadante 1/10 CD8-CD40L. Se analizaron las células y sobrenadantes después de 48 h. Hay que tener en cuenta que los sobrenadantes de control obtenidos de células de CHO no modificadas o de células de CHO modificadas con el ADNc de CD8a carecían de funciones activantes de DC y fueron similares al medio de cultivo.

Tratamiento de DC con DEX y RU486

DC inmaduras de siete días fueron tratadas con 10^{-6} M de DEX (Sigma, St Louis, MO) en presencia de GM-CSF y IL-4 o GM-CSF solo. Después de 24 h se analizaron las DC o fueron adicionalmente estimuladas con CD40 añadiendo la proteína de fusión CD8-CD40L a los cultivos como se ha descrito anteriormente. En algunos experimentos se usó el antagonista receptor de glucocorticoide RU485 (Roussel-UCLAF, Romainville, Francia) con una concentración final de 10 mM, solo o en combinación con DEX.

Análisis del fenotipo de superficie de las DC por citometría de flujo

Las células fueron coloreadas en hielo con anticuerpos monoclonales de ratón conjugadas con PE o FITC (MoAb) durante 30 min en PBS 1% FCS y fueron analizados en un FACScan® (Becton Dickinson, San Jose, CA). Se usaron los siguientes MoAb: FITC-anti-CD80 (BB1), PE-anti-CD86 (FUN-1), FITC-anti-CD40 (5C3), PE-anti-CD54 (HA 58) y PE-anti-CD58 (1C3) (Pharmingen, San Diego, CA), PE-anti-CD14 (L243) y PE-anti-HLA-DR (Mf-P9) (Becton Dickinson), PE-anti-CD83 (HB15A) (Immunotech, Marsella, Francia) y PE-anti-HLA clase I (Tu 149) (Caltag Laboratories, Burlingame, CA).

Experimentos de aceptación de antígenos

Las DC fueron resuspendidas en un medio tamponado con 25 mM de HEPES. Se añadió FITC-BSA y FITC-BSA manosilado (ambos de Sigma) a una concentración final de 1 mg/ml y las células fueron incubadas a 37ºC o a 0ºC para determinar la aceptación residual. Después de 1 h, se lavaron las DC extensivamente con PBS enfriado en hielo y se analizaron por FACS® usando yoduro de propidio para eliminar las células muertas.

Detección de citoquina por ELISA

Se analizaron los sobrenadantes del cultivo en disoluciones dos veces en serie y por duplicado. Se detectó IL-12p70 usando un kit ELISA de sándwich de fase sólida (Diaclone Research, Besancon, France) (sensibilidad 3 pg/ml). Para la detección de IL-12p40 y IFN-g, se obtuvo la aceptación de MoAb y la detección policlonal marcada con biotina Ab de Peter van de Meijde (BPRC, Rijswijk, NL) (sensibilidad 10 pg/ml). Se detectó IL-10 usando el kit de ELISA de IL-10 compacto humano Pelikine (CLB, Amsterdam, NL) (sensibilidad 3 pg/ml).

Reacción de linfocitos mezclados alogeneicos (MLR)

Se cultivaron PBMC adultas alogeneicas no adherentes de un individuo no relacionado en placas de 96 pocillos de fondo plano (Costar Corp., Cambridge, MA) a una densidad de 1,5 x 10^{5}/pocillo con varios números de DC irradiadas con rayos g (3,000 rads), por triplicado. Se evaluó la proliferación en el día 5 por aceptación de [^{3}H]timidina (0,5 mCi/pocillo, actividad específica 5 Ci/mMol, Amersham Life Science, Buckinghamshire, UK) durante un pulso de 16 h.

Ensayos de estimulación de Th1

El clon Rp15 1- 1 de CD4+Th1 restringido con HLA-DR3 específico de hsp65 de Mycobacterium tuberculosis y M. leprae usado en este estudio reconoce un péptido hsp65 determinante correspondiente a los residuos peptídicos 3 a 13 (p3-13) (24). Las DC inmaduras tratadas con DEX y compatibles con HLA-DR y sus equivalentes no tratadas con DEX fueron pulsadas con 10 mg/ml de p3-13 o con 10 mg/ml de hsp65 durante 2 h, lavadas extensivamente y estimuladas a través de CD40 como se ha descrito anteriormente. Para las DC inmaduras tratadas con DEX pulsadas con Ag, la activación con CD40 fue realizada en presencia de DEX. Se cultivaron células T específicas de hsp65 (104) con diferentes números de DC irradiadas con rayos g (3,000 rads) en placas de 96 pocillos de fondo plano (Costar Corp.) por triplicado durante 3 días. Se midió la incorporación de [^{3}H]timidina el día 3 después de un pulso de 16 h. Antes de añadir [^{3}H]timidina, se recogieron 50 ml de sobrenadantes de cada pocillo y los sobrenadantes de pocillos triples fueron agrupados para medir la producción de IFN-g. Para probar la respuesta de las células T específicas de hsp65 a un segundo desafío potente antigénico, se cultivaron 10^{4} células T primero durante 48 h con 5 x 10^{3} de DC pulsadas con el péptido preparadas como se ha indicado arriba, luego se cosecharon y dejaron reposar en un medio conteniendo 5 U/ml de IL-2. Tres días más tarde, las células T 10^{4} viables fueron reestimuladas con 5 x 10^{3} de DC pulsadas con el péptido generadas del mismo donante usado para el primer cultivo y se probó su capacidad para proliferar y para producir IFN-g tal y como se ha descrito anteriormente.

Análisis estadístico

Se usó el análisis de covarianza para comparar la proliferación de células T y la producción de IFN-g en función del número de DC, entre DC activadas con CD40 tratadas con DEX y DC activadas con CD40 no tratadas con DEX (Fig. 5).

Leyendas de las figuras

Fig. 1 El pretratamiento con DEX inhibe los cambios fenotípicos inducidos por la ligadura con CD40.

DC inmaduras de siete días fueron cultivadas durante 24 h en ausencia o presencia de 10-^{6} M DEX y activadas por CD40 con la proteína de fusión CD8-CD40L durante 48 h. Sólo se muestra la comparación con las DC inmaduras mantenidas en el medio. Los histogramas vacíos muestran la coloración de fondo con controles isotipos MoAb y los histogramas sólidos representan la coloración específica de los marcadores de superficie de las célula indicadas. Se indican las intensidades de fluorescencias medias epecíficas. Las intensidades de fluorescencia medias de los controles isotipos fueron entre 3 y 4. Los datos son representativos de 4 experimentos independientes.

Fig. 2 Las DC activadas a través de CD40 mantienen un fenotipo activado después de una exposición a DEX.

Las DC inmaduras fueron activadas con la proteína de fusión CD8-CD40L. Se añadió DEX (10-^{6} M) o medio de control 48 h más tarde y se analizaron las células después de 2 días adicionales de cultivo. Se muestra la comparación con las DC inmaduras mantenidar en medio solamente. Los histogramas vacíos muestran la coloración de fondo con controles isotipos MoAb y los histogramas sólidos representan la coloración específica de los marcadores de superficie de las células indicadas. Se indican las intensidades de fluorescencia medias específicas. Las intensidades de fluorescencia medias de los controles isotipos fueron entre 3 y 5. Los datos son representativos de 2 experimentos independientes.

Fig. 3 El pretratamiento con DEX no afecta la regulación de la maquinaria de aceptación de antígenos de DC.

Se incubaron DC inmaduras en ausencia o presencia de 10-^{6} M DEX durante 24 h y se activaron adicionalmente o no con CD40 con la proteína de fusión CD8-CD40L durante 48 h. Las células fueron pulsadas durante 1 h con un medio conteniendo bien 1 mg/ml de FITC-BSA o 1 mg/ml de FITC-BSA manosilado. Los histogramas vacíos muestran la autofluorescencia de fondo, los histogramas sólidos grises muestran la aceptación de fondo a 0ºC y los histogramas sólidos negros muestran la aceptación específica a 37ºC. Los datos son representativos de 3 experimentos independientes.

Fig. 4 El tratamiento previo con DEX altera el perfil de secreción de citoquina de las DC activadas con CD40.

Las DC inmaduras de control o expuestas a DEX fueron dejadas en cultivo sin más tratamiento o estimuladas con la proteína de fusión CD8-CD40L. Se cosecharon los sobrenadantes del cultivo 48 h más tarde y se analizó la secreción de IL-10, IL-12p40 y IL-12p70 por un ensayo ELISA específico. Los datos son representativos de 6 experimentos independientes.

Fig. 5 El pretratamiento con DEX afecta las capacidades estimuladoras de células T de las DC activadas con CD40 y conduce a un estado de hiposensibilidad de las células Th1.

MLR alogeneico: Se cultivaron PBMC alogeneicas no adherentes con diferentes números de DC activadas con CD40, DC activadas con CD40 tratadas con DEX o DC inmaduras. La respuesta proliferativa fue medida en el día 5.

Ensayos de estimulación Th1: Se cultivaron células T específicas de hsp65 con números diferentes de DC activadas con CD40 compatibles con HLA-DR o con DC activadas con CD40 tratadas con DEX pulsadas con la proteína hsp65 o con el epitopo peptídico específico p3-13. Se analizó la respuesta proliferativa y la producción de IFN-g dependiente de las célula T el día 3. Los datos son representativos de 4 experimentos independientes.

Fig. 6 Las DC activadas con CD40 tratadas con DEX inducen un estado de hiposensibilidad en las células Th1.

Se cosecharon células T específicas de hsp65 previamente cultivadas con DC activadas con CD40 tratadas con DEX pulsadas con el epitopo peptídico p3-13 después de 48 h, se dejaron reposar en presencia de 5 U/ml de IL2 durante 3 días, y se reestimularon con DC pulsadas con p3-13. La respuesta proliferativa y la producción de IFN-g fueron medidas en el día 3. Se obtuvieron resultados similares en 2 experimentos independientes.

Fig. 7 Las células D1 fueron dejadas sin tratar o cultivadas durante dos días en presencia de LPS (1 ug/ml) y/o DEX (10-6 M).

Se controló la expresión de superficie de CD86 (B7.2), el MHC Clase II y CD40 coloreando con el Ab marcado con FITC apropiado y posterior análisis FACS. Se obtuvieron resultados similares para las células D1 maduradas en presencia de CD40L murina (no mostrado).

Fig. 8 Se inmunizaron ratones Balb/C con 10-6 células D1 que fueron preparadas como se ha indicado. Una semana más tarde, se aislaron los esplenocitos y se evaluó su respuesta contra los esplenocitos C57BI/6 en un cultivo mixto de linfocitos. Después de 24 h, se evaluó el contenido de IFN-g de los sobrenadantes del cultivo en un ensayo ELISA específico.

Fig. 9 Se inmunizaron ratones Balb/C (5 por grupo) como se ha indicado. Una semana más tarde, se injertaron transplantes de piel de origen C57BI/6 y se controló la supervivencia al injerto.

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante fue recopilada exclusivamente para la información del lector y no forma parte del documento de patente europea. La misma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin embargo no asume responsabilidad alguna por eventuales errores u omisiones.

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\bulletSCHUURHUIS DH; LABAN S; TOES RE; RICCIARDI-CASTAGNOLI P; KLEIJMEER MJ; VAN DER VOORT El; REA D; OFFRINGA R; GEUZE HJ; MELIEF CJ: Immature dendritic cells acquire CD8(+) cytotoxic T lymphocyte priming capacity upon activation by T helper cell-independent or -dependent stimuli. J Exp Med, 03 July 2000, vol.192( 1), 145-50 [0041]

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Claims (19)

1. \global\parskip0.900000\baselineskip

   1. Método para preparar una composición farmacéutica para modificar funcionalmente una célula T específica de un antígeno de un huésped, comprendiendo cultivar monocitos de sangre periférica de dicho huésped para diferenciar las células dendríticas, activar dichas células dendríticas en presencia de una hormona glucocorticoide y cargar dichas células dendríticas en presencia de dicha hormona glucocorticoide con un antígeno para el que dicha célula T debe ser específica.
2. 2. Composición farmacéutica para modificar funcionalmente una célula T específica de un antígeno de un huésped, dicha composición siendo obtenida cultivando monocitos de sangre periférica de dicho huésped para diferenciar las células dendríticas, activar dichas células dendríticas en presencia de una hormona glucocorticoide y cargar dichas células dendríticas en presencia de dicha hormona glucocorticoide con un antígeno para el que dicha célula T debe ser específica.
3. 3. Método según la reivindicación 1, por el cual dicha activación es hecha a través de un receptor CD40.
4. 4. Método según la reivindicación 3 por el cual dicha activación implica incubar las células dendríticas con bien proteína de fusión CD8-CD40L, una forna trimérica de CD40L consistente en moléculas de CD40L a las que se ha unido una cremallera de leucina modificada, anticuerpos anti-CD40, o células que expresan CD40L.
5. 5. Método según la reivindicación 1, por el cual dicha activación implica incubar las células dendríticas con lipopolisacaridos (LPS) o polil/C.
6. 6. Método según la reivindicación 1, 3-5 por el cual dichas células dendríticas son infectadas con uno o más virus recombinantes que codifican el (los) antígeno(s) de interés antes de activar dichas células dendríticas en presencia de una hormona glucocorticoide.
7. 7. Método según la reivindicación 1, 3-6 por el cual dichas células dendríticas son incubadas con una o más proteínas recombinantes o grandes péptidos sintéticos (> 20 aminoácidos) que representan el (los) antígeno(s) de interés antes de activar dichas células dendríticas en presencia de una hormona glucocorticoide.
8. 8. Método según la reivindicación 1, 3-7 por el cual dichas células dendríticas son incubadas con células o un homogenado celular conteniendo el (los) antígeno(s) de interés antes de activar dichas células dendríticas en presencia de una hormona glucocorticoide.
9. 9. Método según la reivindicación 1, 3-8 por el cual dichas células dendríticas son cargadas con péptidos sintéticos que representan el (los) antígeno(s) de interés después de activar dichas células dendríticas en presencia de una hormona glucocorticoide.
10. 10. Método según la reivindicación 1, 3-9 por el cual dichas células dendríticas, después de la activación en presencia de una hormona glucocorticoide, segregan interleuquina-10.
11. 11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1, 3-10, donde dicha célula dendrítica y/o un precursor de la misma es provista con dicha hormona glucocorticoide in vitro.
12. 12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1, 3-11 donde dicha célula T es una célula T-colaboradora.
13. 13. Célula dendrítica aislada preparada según cualquiera de las reivindicaciones 3-12 capaz de modificar funcionalmente una célula T específica de un antígeno con respecto a la respuesta a dicho antígeno.
14. 14. Método para modificar funcionalmente una célula T específica de un antígeno comprendiendo suministrar una célula dendrítica según la reivindicación 13 con dicho antígeno y cultivar conjuntamente in vitro dicha célula T y dicha célula dendrítica.
15. 15. Método según la reivindicación 14, comprendiendo además multiplicar dicha célula T funcionalmente modificada.
16. 16. Uso de una hormona glucocorticoide para obtener una célula dendrítica capaz de modificar funcionalmente una célula T.
17. 17. Composición farmacéutica que comprende una célula dendrítica según la reivindicación 13.
18. 18. Uso de una célula dendrítica según la reivindicación 13 y/o una células T funcionalmente modificada obtenida en un método según la reivindicación 14 ó 15 para la preparación de un medicamento.
19. 19. Uso de una célula dendrítica según la reivindicación 13 y/o una célula T funcionalmente modificada obtenida en un método según la reivindicación 14 o 15 para la producción de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad autoinmunológica, alergia, una enfermedad de injerto contra huésped y/o una enfermedad de huésped contra injerto.