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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Medizin. Im
Spezielleren bezieht sich die Erfindung auf das Gebiet der Immuntherapie.
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Hintergrund der Erfindung
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Die
hemerkenswerten immunstimulierenden Eigenschaften von DC, also dendritischen
Zellen, liegen in ihrer Fähigkeit,
Antigene aus peripheren Geweben zu lymphoiden Organen zu transportieren,
wo sie diese Antigene T-Zellen in einem optimalen kostimulierenden
Kontext präsentieren
(1). Um diese komplexe Abfolge von Vorgängen zu erzielen, kommen DC
in verschiedenen funktionalen Stadien vor. Unreife DC verhalten
sich in peripheren Geweben, wo sie wirksam Antigene einfangen, wie
Wachposten. Nach einer Pathogeninvasion macht eine Induktion von
T-Helferzellenreaktionen die Aktivierung unreifer DC zu reifen immunstimulierenden
Zellen erforderlich. Eine DC-Aktivierung wird in entzündeten Geweben
durch Zytokine wie etwa IL-1 und TNF-a und durch bakterielle Komponenten
wie etwa LPS (2, 3) ausgelöst.
Aktivierte DC wandern zu T-Zellenbereichen in den Lymphknoten, wobei
sie ihre kostimulierenden Eigenschaften hinaufregulieren und ihre
Antigenpräsentierungsfunktionen
optimieren. Infolge einer Interaktion mit antigenspezifischen T-Zellen,
wird eine DC-Aktivierung durch Eingriff des Rezeptor-Liganden-(L)-Paars
CD40-CD40L weiter komplettiert, was zur Produktion von IL-12 (4,
5, 6), einem Schlüssel-Zytokin
für T-Helfer
(Th) Typ 1, und zytotoxischem T-Lymphozyten-(CTL)-Priming führt (7).
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Eine
APC-Aktivierung durch CD40-CD40L-Interaktionen stellt einen wichtigen
immunregulierenden Schritt für
die Herstellung schützender
T-Zellen-Immunität
gegen Pathogene und Tumoren dar (8, 9, 10). Dieser Prozess spielt
auch eine Schlüsselrolle
beim Einsetzen destruktiver, durch T-Zellen vermittelter Störungen wie
Autoimmunkrankheiten, Allotransplantatabstoßung und Transplantat-versus-Wirt-Reaktion
(11, 12, 13). Die ge genwärtige
Behandlung dieser Störungen
beruht größtenteils
auf der Verabreichung von Glucocorticoiden (GC), die starke entzündungshemmende
und immunsuppressive Wirkungen entfalten. Weil GC vielen Aspekten
der T-Zellenaktivierung, wie etwa IL2-gesteuerter Proliferation und Entzündungszytokinproduktion
negativ im Wege stehen (nachgelesen in 14), wurden aktivierte T-Zellen
lange als die Hauptziele für
eine GC-Wirkung
angesehen. Verschiedene Nachweisreihen legen nun eine Rolle für DC in GC-induzierter Immunsuppression
nahe. Moser et al. (15) fand heraus, dass GC die Spontanaktivierung von
Mäuse-DC
verhinderte, wodurch deren T-Zellenstimulationspotential gesenkt
wurde. Kitajima et al. (16) wies nach, dass GC die durch T-Zellen
vermittelte Aktivierung einer DC-Linie von Mäusen hemmen kann. Viera et
al. berichtete, dass menschliche DC, die GC ausgesetzt wurden, nach
LPS-Stimulation schlechte Produzenten von IL-12 waren (17). Diese Feststellungen
betreffen nur einen Verlust typischer DC-Merkmale und begünstigen
deshalb eine einfache hemmende Rolle von GC auf die DC-Aktivierung. Eine
komplexere immunregulierende Wirkung auf das DC-System wurde nicht
in Betracht gezogen.
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Die
vorliegende Erfindung ergab sich aus einer detaillierten Analyse
des Einflusses von GC auf die CD40-vermittelte Aktivierung von DC,
die von Monozyten stammten. Diese DC entwickeln sich nach einer
Kultur mit GM-CSF und IL-4 (2, 18) oder nach einer Transmigration
durch Endothelzellen (19) und sind dafür bekannt, nach CD40-Ligation
zu den stärksten
menschlichen Th1-Typ induzierenden APC heranzureifen (5, 20). Darüber hinaus
können
diese APC in großen
Anzahlen erzeugt werden und sind dadurch die Zellen der Wahl für eine auf
DC basierende Modulation von T-Zellenimmunität (21, 22). Im Gegensatz zu
früheren
Studien zeigt die vorliegende Erfindung, dass GC, wie etwa Dexamethason
(DEX), nicht nur eine DC-Aktivierung unterbinden, sondern, da sie
eine CD40-Bindung an menschliche, von Monozyten stammenden DC umwandelt,
sich zu einem alternativen Aktivierungsweg wandelt. DEX beeinflusst
die CD40-abhängige
Reifung menschlicher, von Monozyten stammender DC nicht nur dadurch zutiefst,
dass es die Hinaufregulierung kostimulierender Adhäsions- und
MHC-Oberflächenmoleküle verhindert,
sondern auch bewirkt, dass diese Zellen den entzündungshemmenden Mediator IL-10 anstelle des Th1-stimulierenden
Zytokins IL-12 sezernieren. In Übereinstimmung
mit diesen phänotypischen
und funktionalen Veränderungen,
sind DC, getriggert durch CD40 im Beisein von DEX, schlechte Stimulatoren
von Antworten des Th1-Typs. Vor allem zeigt die vorliegende Erfindung,
dass solche DC in der Lage sind, einen Zustand von Hyporeaktivität in Th1-Zellen
zu induzieren, was anzeigt, dass diese Zellen zu einer aktiven Suppression
der Immunität des
Th1-Typs in der Lage sind.
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Wie
bereits zuvor erwähnt
wurde, war der Einfluss von GC auf DC der Gegenstand verschiedener
früherer,
durch andere durchgeführte
Studien. In Gegenüberstellung
zur vorliegenden Erfindung, hoben diese Studien jedoch nur die hemmenden
Effekte von GC auf das DC-System hervor. Man fand heraus, dass DEX
die Hinaufregulierung von CD80, CD86 und Molekülen der MHC Klasse II nach
Aktivierung von Mäusemilz-DC
blockierte (15, 16), wohingegen erst kürzlich nachgewiesen wurde,
dass DEX auch die Differenzierung von DC zu Monozytenvorläufern verhindert
(28). In diesen Studien ging die Unfähigkeit von DC, eine hohe Expression
von kostimulierenden und MHC-Molekülen anzunehmen, mit einer Abnahme
in ihrem T-Zellen stimulierenden Potential einher, aber die Wirkung
von GC auf die IL-12-Produktion wurde nicht untersucht. Hingegen fand
Viera et al. heraus, dass die Wirkung von GC auf eine LPS-induzierte
DC-Aktivierung in einer 4-fachen Senkung der IL-12p70-Synthese bestand
(17). Diese Teilwirkung auf die IL-12-Sezernierung steht im Gegensatz zur
kompletten Unterdrückung
der IL-12p70-Produktion, welche der Gegenstand der vorliegenden
Erfindung ist, und kann dadurch erklärt werden, dass ihre GC-behandelten
unreifen DC vor der LPS-Stimulierung extensiv gewaschen worden waren.
Wir fanden tatsächlich
heraus, dass nach einer Beseitigung von GC, die Wirkungen dieser
Arzneimittel auf DC rasch ins Gegenteil umschlagen konnten. Die
kontinuierliche Präsenz
von GC während
der CD40-Triggerung von DC wurde klar bevorzugt, um die DC-Aktivierung
stabil und vollständig
zu modulieren (Daten nicht gezeigt). Alles in allem gaben die früheren Feststellungen
an, dass der Einfluss von GC auf das DC-System lediglich als ein
hemmender Vorgang gedeutet werden sollte. Wichtig ist, dass die
vorliegende Erfindung klar nachweist, dass GC, wie etwa DEX, die
DC-Aktivierung nicht einfach nur unterdrückt, sondern diesen Prozess
vielmehr auf ein eigenständiges
funktionales Programm neu ausrichtet.
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Eine
DC-Aktivierung durch Eingriff von CD40-CD40L ist ein stimulierender
Schlüsselvorgang
zur Generierung effektiver Th1- und CD4-abhängiger CTL-Antworten in vivo
(10, 36, 37, 38). Allerdings ist dieser Weg auch mit der Entwicklung
ungewollter T-Zellenreaktionen
verbunden, die zu einer Autoimmunkrankheit oder einer Organtrans plantatabstoßung führen (11,
12, 13). Bis heute beruht eine Therapie von Patienten, die an solchen
Störungen leiden,
größtenteils
auf der systemischen Verabreichung von GC-Hormonen. Diese Behandlung unterdrückt nicht
nur Reaktionen pathogener T-Zellen, sondern induziert auch einen
allgemeinen Immunsuppressionszustand und metabolische und endokrine
Nebenwirkungen. Die vorliegende Erfindung zeigt, dass eine Aktivierung
menschlicher, von Monozyten stammenden DC durch CD40 im Beisein
von GC, wie etwa DEX, zu einer IL-10 produzierenden APC führt, die
ein schlechter Stimulator für
Antworten des Th1-Typs ist, und die den Th1-Zellen sogar eine Hyporeaktivität verleihen
kann. Die vorliegende Erfindung gibt an, dass solche mit geeigneten
Antigenen beschickten DC als neuartiger Lösungsweg genutzt werden können, um
ungewollte T-Zellenreaktionen in vivo spezifisch herunterzuregulieren.
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Die
dendritischen Zellen der Erfindung besitzen andere Fähigkeiten
als vormals für
dendritische Zellen berichtet wurde. Man kann deshalb davon ausgehen,
dass diese Zellen Teil einer Klasse von Zellen sind, die sich von
der durch die "klassischen" dendritischen Zellen
gebildeten Klasse unterscheiden. Die dendritischen Zellen der Erfindung
können auf
eine andere Weise verwendet werden als die klassischen dendritischen
Zellen. Die dendritischen Zellen der Erfindung können zum Beispiel dazu verwendet
werden, zumindest zum Teil eine ungewünschten Immunreaktion in einem
Wirt zu unterdrücken.
In einem Aspekt stellt die Erfindung deshalb ein Verfahren zur Herstellung
einer pharmazeutischen Zusammensetzung zum Reduzieren einer ungewollten
T-Zellenreaktion in einem Wirt bereit, das umfasst, Monozyten im
peripheren Blut des Wirts zur Differenzierung in dendritische Zellen
zu kultivieren, die dendritischen Zellen im Beisein eines Glucocorticoid-Hormons
zu aktivieren, und die aktivierten dendritischen Zellen mit einem
Antigen zu beschicken, gegen das die T-Zellenreaktion reduziert
werden soll. Bei einer ungewollten T-Zellenreaktion kann es sich um
irgendeine Art von T-Zellenreaktion handeln. Zum Beispiel, aber
nicht darauf beschränkt,
kann es sich um eine T-Zellenreaktion handeln, die mit einer Autoimmunkrankheit
oder einer Transplantatreaktion wie etwa einer Transplantat-versus-Wirt-
oder einer Wirt-versus-Transplantat-Reaktion zusammenhängt. Eine
pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung umfasst typischerweise
eine dendritische Zelle der Erfindung, die in einer Flüssigkeit
suspendiert ist, die sich dazu eignet, die Funktion der dendritischen
Zelle in der Flüssigkeit
zu erhalten und/oder sich zur Verabreichung an einen Wirt eignet.
Beim Wirt handelt es sich vorzugsweise um einen Men schen. Vorzugsweise
ist der Wirt gefährdet,
eine Autoimmunkrankheit oder Allergie zu entwickeln oder leidet
bereits daran. Vorzugsweise leidet der Wirt an einer Wirt-versus-Transplantat-Reaktion
und/oder Transplantat-versus-Wirt-Reaktion oder ist gefährdet, an
einer solchen zu erkranken. Mit dem Begriff "gefährdet" ist gemeint, dass
zu erwarten ist, dass der Wirt – zum
Beispiel ein Wirt, der ein Transplanat erhält, aber nicht darauf beschränkt, – die Krankheit entwickeln
kann. Ein solcher Wirt wird als gefährdet erachtet, eine Wirt-versus-Transplantat-Reaktion
zu entwickeln. Ein Antigen ist typischerweise ein Peptid, das in
der Lage ist, sich an ein Molekül
des Histokompatibilitätskomplexes
(major histocompatibility complex) I und/oder II zu binden. Solche
Peptide sind auf dem Gebiet bekannt, und ein Fachmann auf dem Gebiet
ist in der Lage zu bestimmen, ob ein bestimmtes Peptid ein Antigen
enthält
oder nicht. Ein Antigen kann aus einem natürlich vor kommenden Protein
abgeleitet sein. Ein Antigen kann auch als ein synthetisches Protein
oder eine Entsprechung von diesem, vorzugsweise mit einer Aminosäuresequenz
vorliegen, die gleichwertig einem Peptid ist, das von einem Protein
stammt.
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In
einem anderen Aspekt stellt die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung
zum Reduzieren einer ungewollten T-Zellenreaktion in einem Wirt
bereit, wobei die Zusammensetzung dadurch erhalten wird, dass Monozyten
im peripheren Blut des Wirts zur Differenzierung in dendritische
Zellen kultiviert werden, die dendritischen Zellen im Beisein eines
Glucocorticoid-Hormons aktiviert werden, und die aktivierten dendritischen
Zellen mit einem Antigen beschickt werden, gegen das die T-Zellenreaktion
reduziert werden soll. In einer Ausführungsform wird ein Verfahren
zum Reduzieren einer ungewollten T-Zellenreaktion in einem Wirt
bereitgestellt, das umfasst, dem Wirt eine Zusammensetzung der Erfindung
zu verabreichen.
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Die
Erfindung stellt darüber
hinaus ein Verfahren zum Reduzieren einer ungewollten T-Zellenreaktion in
einem Wirt bereit, das umfasst, Monozyten im peripheren Blut des
Wirts zur Differenzierung in dendritische Zellen zu kultivieren,
die dendritischen Zellen und/oder ihre Vorläufer im Beisein eines Glucocorticoid-Hormons
zu aktivieren, und die aktivierten dendritischen Zellen mit einem
Antigen zu beschicken, gegen das die T-Zellenreaktion reduziert werden soll,
und die Zusammensetzung dem Wirt zu verabreichen.
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In
einer Ausführungsform
der Erfindung erfolgt die Aktivierung durch einen CD40-Rezeptor. Die DC-Aktivierung
durch Triggerung des CD40-Rezeptors kann entweder eine Inkubation
mit einem CD8-CD40L-Fusionsprotein, einem Trimer aus CD40L, das
aus CD40L-Molekülen
besteht, an die ein modifizierter Leucin-Zipper angehängt wurde,
Anti-CD40-Antikörpern
oder Zellen, die CD40L exprimieren, mit sich bringen. Andere Signale,
die für
die DC-Aktivierung verwendet werden können, wie sie in der vorliegenden
Erfindung beschrieben ist, umfassen Lipopolysaccharid (LPS) und
Polyl/C.
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In
einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Gewinnen
einer dendritischen Zelle bereit, die in der Lage ist, eine T-Zelle
für ein
Antigen zu tolerisieren, wobei das Verfahren umfasst, die dendritische
Zelle mit einem Glucocorticoid-Hormon zu versehen, die dendritische
Zelle zu aktivieren, und die dendritische Zelle mit dem Antigen
zu versehen. Mit dem Begriff "tolerisieren" ist gemeint, dass
die dendritische Zelle eine immunsuppresssive Wirkung auf die T-Zelle
hat. Eine tolerisierte T-Zelle wird im Wesentlichen nicht mit Zellteilung
reagieren, wenn sie einer Zelle ausgesetzt wird, die ein Antigen übergibt,
die T-Zelle würde
jedoch im untolerisierten Zustand darauf mit Zellteilung reagieren.
Eine tolerisierte T-Zelle wird im Wesentlichen nicht mit der Tötung einer
Zelle reagieren, die ein Antigen übergibt, die T-Zelle würde jedoch
im untolerisierten Zustand darauf mit Zelltötung reagieren.
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In
einer Ausführungsform
wird die dendritische Zelle und/oder ein Vorläufer von dieser in vitro mit
dem Glucocorticoid-Hormon versehen. Eine T-Zelle ist vorzugsweise
eine antigenspezifische T-Zelle, vorzugsweise eine zytotoxische
T-Zelle oder eine Th-Zelle.
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In
einem anderen Aspekt stellt die Erfindung eine isolierte dendritische
Zelle bereit, die in der Lage ist, die Funktion einer antigenspezifischen
Th-Zelle zu modifizieren, die andernfalls eine bestimmte Immunreaktion
verstärken
würde,
was zu einer T-Zelle führt,
die in der Lage ist, diese Immunreaktion zu reduzieren. In einer
Ausführungsform
stellt die Erfindung ein Verfahren zum Modifizieren einer antigenspezifischen
T-Zelle bereit, das umfasst, eine dendritische Zelle nach der Erfindung
mit dem Antigen zu versehen und die T-Zelle und die dendritische
Zelle gemeinsam zu kultivieren. Vorzugsweise erfolgt die gemeinsame
Kultivierung in vitro. Das Verfahren kann darüber hinaus umfassen, die funktional
modifizierte T-Zelle zu multiplizieren.
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Es
wird auch eine isolierte, funktional modifizierte T-Zelle offenbart,
die sich durch ein Verfahren nach der Erfindung erhalten lässt. In
einem anderen Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung eines Glucocorticoid-Hormons
zum Erhalt einer dendritischen Zelle bereit, die in der Lage ist,
eine T-Zelle funktional zu modifizieren.
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Die
Erfindung stellt auch eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit,
die eine dendritische Zelle und/oder eine funktional modifizierte
T-Zelle nach der Erfindung umfasst. Die Erfindung stellt darüber hinaus
die Verwendung einer dendritischen Zelle und/oder einer funktional
modifizierten T-Zelle nach der Erfindung zur Herstellung eines Medikaments
bereit.
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Die
Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Behandlung einer Einzelperson
bereit, die an einer Krankheit leidet, oder gefährdet ist, daran zu erkranken,
die zumindest zum Teil mit dem Immunsystem der Einzelperson verbunden
ist, wobei das Verfahren umfasst, die Einzelperson mit einer dendritischen Zelle
und/oder funktional modifizierten T-Zelle nach der Erfindung zu
versorgen. Vorzugsweise stammt/stammen die dendritische Zelle und/oder
die funktional modifizierte T-Zelle, oder Vorläufer von diesen, von einem
HLA-angepassten Spender. Vorzugsweise handelt es sich bei dem HLA-angepassten
Spender um die Einzelperson.
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Bei
Behandlungsverfahren der Erfindung handelt es sich vorzugsweise
um eine Verwendung zur Behandlung einer Einzelperson, die an einer
Autoimmunkrankheit, einer Allergie, einer Transplantat-versus-Wirt-Reaktion
und/oder einer Wirt-versus-Transplantat-Reaktion leidet.
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Beispiele
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Beispiel 1
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Beeinträchtigung von CD40-CD40L-vermittelten
phänotypischen
Veränderungen
durch DEX
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Wir
erforschten die Auswirkung von DEX auf die phänotypischen Veränderungen,
die durch eine CD40-Bindung an unreifen von Monozyten stammenden
DC induziert wurden. Bei Abwesenheit von DEX induzierte das Fusionsprotein
CD8-CD40L eine starke Hinaufregulierung der kostimulierenden Moleküle CD80,
CD86 und CD40, der Moleküle
der MHC Klasse I und II, der Adhäsiomsmarker
CD54 und CD58 und des CD-Reifungsmarkers CD83 (1). Im
Beisein von DEX waren diese CD8-CD40L-induzierten phänotypischen
Veränderungen
drastisch beeinträchtigt:
die Hinaufregulierung von CD80, CD86, CD40, CD64, CD58 und der Moleküle der MHC
Klasse I und II war größtenteils
gehemmt und CD83 war nicht exprimiert (1). Wichtig
ist, dass DEX-behandelte DC nicht zu einem Monozyten-/Makrophagenstadium
zurückkehrten,
wie durch das Fehlen einer Expression von CD14 gezeigt ist (1).
Eine DEX-Titrierung zeigte eine vollständige Hemmung von CD40 vermittelten
phänotypischen
Veränderungen
bei 10–6 M
und 10–7 M,
eine Teilblockade bei 10–8 M und keine Wirkung
bei 10–9 M
und 10–10 M
(Daten nicht gezeigt). Zudem hing die DEX-Wirkung von einer Bindung
an den GC-Rezeptor
ab, da sie durch gleichzeitige Zugabe des GC-Rezeptor-Antagonisten RU486
aufgehoben wurde (Daten nicht gezeigt). In Versuchen, die mit LPS
oder TNF-a als Aktivierungsmittel durchgeführt wurden, wurden ähnliche
Ergebnisse erzielt. Die Kombination von DEX und TNF-alpha induzierte
jedoch einen massiven Zelltod (Rückgewinnung
lebensfähiger
Zellen 5–10%
der Kontrollkulturen), ein Phänomen,
das nicht festgestellt wurde, als DEX-behandelte DC mit LPS oder
durch CD40 stimuliert wurden (Rückgewinnung
lebensfähiger
Zellen 60–100%
der Kontrollkulturen) (Daten nicht gezeigt). Als Nächstes analysierten
wir, ob aktivierte DC durch DEX immer noch beeinträchtigt werden
konnten. DC, die 48 Stunden lang mit CD8-CD40L inkubiert und DEX
weiter ausgesetzt wurden, behielten einen stabilen aktivierten Phänotyp bei
(2).
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Wie
schließen
daraus, dass DEX die phänotypischen
Veränderungen
verhindert, die durch CD40-Signale an unreifen DC induziert werden,
und dass bereits aktivierte DC gegen eine DEX-Wirkung resistent
sind.
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Beispiel 2
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DEX stört
die Regulierung des DC Aufnahmemechanismus nicht
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Im
Gegensatz zu aktivierten DC internalisieren unreife DC wirksam Antigene
durch Makropinozytose- und Mannose-Rezeptor-vermittelte Endozytose
(2, 3, 25, 26). Wir untersuchten, ob DEX den DC-Antigeneinfangmechanismus
und seine Herunterregulierung nach einer CD40-Vernetzung beeinträchtigen
konnte. Wie in 3 gezeigt ist, war die Inkorporation
von FITC-BSA und FITC-mannosyliertem BSA durch unreife DC und durch
DEX-behandelte unreife DC vergleichbar. Nach einer CD40-Triggerung
wurde ein ähnlicher
Rüchgang
der Aufnahme von FITC-BSA und FITC-mannosyliertem BSA bei sowohl
DEX-behandelten als auch unbehandelten DC beobachtet (3).
Diese Ergebnisse waren die ersten, die uns anzeigten, dass DEX nicht
alle Aspekte einer DC-Aktivierung blockiert, da es die Herunterregulierung
des DC-Antigeneinfangmechanismus nicht stört.
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Beispiel 3
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DEX-behandelte CD-40 getriggerte DC sezernieren IL-10
anstelle von IL-12
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Ein
Schlüsselmerkmal
von CD40-getriggerten DC zum Einleiten von T-Zellimmunität liegt
in ihrer Fähigkeit,
das entzündungsfördernde
Zytokin IL-12 zu produzieren (5, 6, 27). Wir untersuchten, ob DEX
die IL-12-Produktion durch DC beeinträchtigt, die durch CD40 stimuliert
waren, und wir erforschten die Möglichkeit,
ob DEX die Sekretion des entzündungshemmenden
Zytokins IL-10 fördern
kann. Wie in 4 gezeigt ist, induzierte eine
CD40-Triggerung von DC eine starke Sekretion von IL-12p40 und IL-12p70
(bis zu 120 ng/ml bzw. 170 pg/ml), stimulierte die Produktion von
IL-10 aber nur schwach (bis zu 68 pg/ml). Im Gegensatz dazu führte eine
CD40-Triggerung von DEX-behandelten DC zu einer (bis zum 100-fachen)
drastisch gesenkten IL-12p40-Produktion und zur vollständigen Unterdrückung einer IL-12p70-Sekretion,
wohingegen die Produktion von IL-10 (bis zum 50-fachen) stark gesteigert
war (4). Unreife DC und ihre DEX-behandelten Pendants sezernierten keine
erfassbaren Mengen von IL-12 und IL-10 (4). Deshalb
löst eine
CD40-Bindung von DC im Beisein von DEX die Sekretion hoher Anteile
des entzündungshemmenden
Zytokins IL-10 anstatt von IL-12 aus.
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Beispiel 4
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DEX-behandelte CD40 getriggerte DC sind
in der Lage, Immunität
des Th1-Typs Zu unterdrücken
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Die
auffallend modifizierte Reaktion von DC auf eine CD40-Bindung im
Beisein von DEX veranlasste uns dazu, das T-Zellen-Stimulationspotential dieser
Zellen mit demjenigen ihrer DEX-unbehandelten Pendants zu vergleichen.
In einer allogenetischen MLR induzierten CD40-getriggerte DC eine starke
proliferative T-Zellenantwort, wohingegen die Zugabe von DEX vor
der CD40-Triggerung ihre T-Zellen-Stimulationskapazität auf diejenige
unreifer DC senkte (5). Als sie auf ihre Fähigkeit
hin getestet wurden, einen hsp65-spezifischen CD4+ Th1-Klon
zu stimulieren, stellte sich heraus, dass CD40-getriggerte DC, die
mit dem hsp65-Protein oder mit dem spezifischen Peptid-Epitop p3-13
gepulst waren, starke Induktoren von sowohl T-Zellenproliferation
als auch T-Zellen abhängiger
IFN-g-Produktion waren (5). Im Gegensatz dazu waren
im Beisein von Aggepulsten, DEX-behandelten, CD40-getriggerten DC
die T-Zellenproliferation und die IFN-g-Pxoduktion signifikant gesenkt
(p < 0,001 bzw.
p < 0,01) (5).
Als Nächstes
untersuchten wir, ob DEX-behandelte, CD40-getriggerte DC einfach
nur schlechte Stimulatoren für
Th1-Zellen sind, oder ob sie suppressive Wirkungen auf diese T-Zellen
ausüben
können.
Wir testeten deshalb hsp65-spezifische T-Zellen, die mit p3-13-gepulsten, DEX-behandelten,
CD40-getriggerten DC stimuliert waren, auf ihre Fähigkeit
hin, auf eine zweite starke Antigenbelastung zu reagieren. 6 zeigt,
dass eine Vorkultivierung von T-Zellen mit CD40-getriggerten DC
nach der zweiten antigenspezifischen Neustimulation zu einer starken
T-Zellenproliferation und IFN-gamma-Pxoduktion führte. Hingegen ergab eine Vorkultur
mit DEX-behandelten, CD40-getriggerten DC eine drastisch gesenkte
proliferative und IFN-gamma-Produktionskapazität der Th1-Zellen. Somit führt eine
CD40-Triggerung von DC im Beisein von DEX zu APC, die nicht einfach
nur schlechte Induktoren von T-Zellenantworten sind, sondern in Th1-Zellen
auch einen Zustand von Hyporeaktivität induzieren.
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Beispiel 5
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DEX-behandelte, aktivierte DC unterdrücken Anti-Transplantat-Immunität in vivo
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In
einem ersten Versuch, zu testen, ob DEX-behandelte DC ungewollte
Immunität
unterdrücken
kann, wurde ein Hauttransplantatmodell bei Mäusen aufgebaut. Hauttransplantate
von C57B1/6-Mäusen
sind dafür
bekannt, dass sie, wenn sie auf eine vollkommen allogenetische Balb/c-Empfängermaus
transplantiert sind, schnell abgestoßen werden, und zwar als Ergebnis
einer sehr starken allo-reaktiven Anti-Transplantat-Immunantwort
der T-Zellen. Es wurden Versuche durchgeführt, um zu untersuchen, ob
eine Vorbehandlung der Empfängermäuse mit
DEX-behandelten DC zur Suppression dieser Wirt-versus-Transplantat-Reaktion
führt.
Wir nutzten dazu eine etablierte Mäuse-DC-Zelllinie mit B57B1/6-Ursprung,
D1 genannt, die in vitro einen stabilen unreifen Phänotyp aufweist,
es sei denn, sie erhalten ein Aktivierungssignal über agonistische
Anti-CD40-Antikörper
oder LPS. Dieser Auslöseimpuls führt zu vollständig ausgereiften
DC, die in hohem Maße
zu einem CTL-Priming in vitro sowie auch in vivo in der Lage sind
(39, 40). Die Reifung von D1 bringt eine starke Hinaufregulierung
der Zelloberflächenexpression
des kostimulierenden Moleküls CD86
(B7.2), des CD40-Rezeptors und der MHC Klasse II mit sich (7). Ähnlich unseren
Beobachtungen bei menschlichen DV verhinderte die Reifung von D1
im Beisein von DEX größtenteils
die Hinaufregulierung dieser Moleküle an den Zelloberflächen (7).
Dies ließ vermuten,
dass die DEX-behandelten D1-Zellen dazu genutzt werden könnten, T-Zellenimmunität in vivo
zu unterdrücken.
In Balb/c-Mäuse wurden
deshalb D1-Zellen injiziert, die in Ab- oder Anwesenheit von DEX
aktiviert worden waren. Eine Woche nach der Immunisierung wurde
die allo-reaktive Antwort von Splenozyten dieser Mäuse, wie
auch von Kontrollmäusen
in vitro getestet. Mäuse,
die mit unreifen D1-Zellen vorbehandelt waren, die in An- oder Abwesenheit
von DEX kultiviert worden waren, wiesen im Vergleich zu den Kontrollmäusen keine
signifikant veränderte
alloreaktive Immunität
des Th1-Typs auf (8). Dies stimmt mit unseren
Beobachtungen bei menschlichen DC überein, die auch zeigten, dass
DEX-behandelte unreife DC keine anderen Eigenschaften aufweisen
als normale unreife DC. Wie erwartet wurde, wiesen Mäuse, die
mit voll ausgereiften D1 immunisiert waren, eine verstärkte Reaktivität auf. Wichtig
ist, dass bei Mäusen,
die mit im Beisein von DEX aktivierten D1 vorbehandelt waren, die
allo-reaktive Immunität
des Th1-Typs stark abnahm (8).
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Anschließend wurde
getestet, ob die Reduktion von Allo-Reaktionen in der letztgenannten
Mäusegruppe
in vitro gemessen eine gesenkte allo-reaktive Immunität in vivo
reflektie ren würde.
Gruppen von Balb/c-Mäusen
wurden mit D1-Zellen immunisiert, die in der An- oder Abwesenheit
von DEX gereift waren. Hauttransplantate mit C57B1/6-Ursprung wurden
eine Woche später
auf diese Mäuse
transplantiert, und das Überleben
der Transplantate wurde überwacht.
Die Transplantate wurden bei den Kontrollmäusen und Mäusen, die mit normal gereiften D1-Zellen
immunisiert waren, rasch abgestoßen (9). Die
Abstoßung
war in der letzteren Gruppe trotz der stärkeren allo-reaktiven Reaktionen
bei diesen Mäusen
nicht verstärkt
(8). Höchstwahrscheinlich
reicht die Reaktion bei den Kontrollmäusen bereits für eine maximale
Abstoßung
aus. Von Belang ist, dass eine Transplantatabstoßung bei Mäusen erheblich (p < 0,05) verzögert ist,
die mit im Beisein von DEX gereiften D1 vorbehandelt waren (9).
Dieses Ergebnis stimmt mit der größtenteils reduzierten Allo-Reaktivität bei diesen
Mäusen,
wie sie in vitro bestimmt wurde, überein (8). Als Schlussfolgerung
beweisen die Hauttransplantationsversuche bei Mäusen, dass DC, die im Beisein von
DEX herangereift waren, tatsächlich
dazu verwendet werden können,
eine ungewollte Immunität wie
etwa gegen Transplantate zu unterdrücken. Obwohl in den gezeigten
Versuchen die Transplantate schließlich abgestoßen werden,
wäre festzuhalten, dass
Spender und Empfänger
große
Unterschiede im Hinblick auf die Transplantationsantigene aufwiesen.
Bei Menschen werden Spender und Empfänger so eng wie möglich für diese
Antigene aufeinander abgestimmt. Mäuseversuche, die besser aufeinander abgestimmte
Spender- und Empfängerstämme nutzen,
sind am Laufen. Die Daten von 8 und 9 zeigen,
dass eine Vorbehandlung mit DEX-behandelten reifen DC zu tiefgreifenderen
Wirkungen in diesem Rahmen führen
werden.
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Materialien und Methoden
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Erzeugung von DC
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Unreife
DC wurden aus Monozytenvorläufern
peripheren Bluts erzeugt. Menschliche PBMC von gesunden Spendern,
die durch Ficoll-Hypaque-Dichtezentrifugation isoliert worden waren, wurden
bei 1,5 × 107 pro Mulde in 6-Muldenplatten (Costar Corp.,
Cambridge, MA) in RPMI 1640 (Life Technologies, Paisley, Schottland)
ergänzt
mit 2 mM Glutamin, 100 UI/ml Penizillin und 10% FCS aufgebracht.
Nach 2 Std. bei 37°C
wurden die nicht anhaftenden Zellen entfernt, und die anhaftenden
Zellen wurde in einem Medium, das 500 U/ml IL-4 (Pepro Tech Inc.
Rocky Hill, NJ) und 800 U/ml GM-CSF (freundlicherweise zur Verfügung gestellt
von Dr. S. Osanto, LUMC, Leiden, NL) enthielt, insgesamt 7 Tage
kultiviert.
-
Aktivierung unreifer DC mit einem CD8-CD40L-Fusionsprotein
-
Eine
Aktivierung von DC durch CD40 erfolgt mit einem Fusionsprotein,
das aus einem extrazellulären
Bereich menschlichen CD40L und der DC8a-Kette (CD8-CD40L) von Mäusen hergestellt war.
Die von Garrone et al. (23) beschriebene CD8-CD40L-cDNA wurde in
einen eukaryotischen Expressionsvektor transferiert, der das Hygromycin-Resistenzgen enthielt,
und zur Erzeugung von stabil transfizierten chinesischen Hamsterovarienzellen
(CHO-Zellen) verwendet. Kulturüberstände, die das
CD8-CD40L-Fusionsprotein
enthielten, wurden mit einem Druckührkammersystem (Amicon, Inc., Beverly,
MA) konzentriert, auf eine Bindung an CD40 hin überprüft, und auf optimale DC-Aktivierungsbedingungen
hin getestet (nicht gezeigt). Die DC wurden bei 5 × 105/ml/Mulde in einer 24-Muldenplatten (Costar
Corp., Cambridge, MA) inkubiert und im Beisein von 1/10 CD8-CD40L-Überstand
aktiviert. Die Zellen und Überstände wurden
nach 48 Std. analysiert. Festzuhalten ist, dass es Kontrollüberständen, die
von nicht transfizierten CHO-Zellen oder von CHO-Zellen gewonnen
worden waren, die mit der CD8a-cDNA transfiziert worden waren, an
DC-Aktivierungsfunktionen mangelte und sie ähnlich dem Kulturmedium waren.
-
DEX- und RU486-Behandlung von DC
-
Sieben
Tage alte, unreife DC wurden mit 10–6 M
DEX (Sigma, St. Louis, MO) im Beisein von GM-CSF und IL-4 oder GM-CSF
allein behandelt. Nach 24 Stunden wurden die DC analysiert, oder wurden
weiter über
CD40 stimuliert, indem den wie vorstehend beschriebenen Kulturen
das CD8-CD40L-Fusionsprotein zugesetzt wurde. In einigen Experimenten
wurde der Glucocorticoid-Rezeptor-Antagonist RU485 (Roussel-UCLAF,
Romainville, Frankreich) mit 10 mM Endkonzentration allen oder in
Kombination mit DEX verwendet.
-
Analyse des DC-Oberflächenphänotyps durch Durchflusszytometrie
-
Zellen
wurden auf Eis mit FITC oder PE-konjugierten monoklonalen Mäuse-Antikörpern (MoAb) 30
Minuten lang in PBS 1% FCS angefärbt
und in einem FACScan® analysiert (Becton Dickinson,
San Jose, CA). Die folgenden MoAb wurden verwendet: FITC-anti-CD80 (BB1), PE-anti-CD86
(FUN-1), FITC-anti-CD40 (5C3), PE-anti-CD54 (HA 58) und PE-anti-CD58
(1C3) (Pharmingen, San Diego, CA), PE-anti-CD14 (L243) und PE-anti-HLA-DR (Mf-P9) (Becton
Dickinson), PE-anti-CD83 (HB15A) (Immunotech, Marseille, Frankreich)
und PE-anti-HLA Klasse I (Tu 149) (Caltag Laboratories, Burlingame,
CA).
-
Versuche zur Antigenaufnahme
-
Die
DC wurden in mit 25 mM Hepes gepuffertem Medium resuspendiert. FITC-BSA
und FITC-mannosyliertes BSA (beide von Sigma) wurden mit 1 mg/ml
Endkonzentration zugesetzt, und die Zellen wurden bei 37°C inkubiert,
oder bei 0°C,
um die Hintergrundaufnahme zu bestimmen. Nach 1 Stunde wurden die
DC extensiv mit eiskaltem PBS gewaschen und durch FACS® unter
Verwendung von Propidium-Iodid gewaschen, um tote Zellen zu eliminieren.
-
Zytokinerfassung durch ELISA
-
Kulturüberstände wurden
in Serien-Zweifachverdünnungen
im Doppel analysiert. IL-12p70 wurde
unter Verwendung eines Festphasen-Sandwich-ELISA-Kits erfasst (Diaclone
Research, Besancon, Frankreich) (Empfindlichkeit 3 pg/ml). Zur IL-12p40-
und IFN-g-Erfassung,
Einfang-MoAb- und polyklonalen biotinylierten Erfassung wurden Ab
(Antikörper)
von Peter van de Meijde bezogen (BPRC, Rijswijk, NL) (Empfindlichkeit
10 pg/ml). IL-10 wurde unter Verwendung des Pelikine compact human IL-10-ELISA-Kits
erfasst (CLB, Amsterdam, NL) (Empfindlichkeit 3 pg/ml).
-
Allogene gemischte Lymphozytenreaktion
(MLR)
-
Nicht
adhärente
allogene adulte PBMC von einer nicht verwandten Einzelperson wurden
in Flachbodenplatten mit 96 Mulden (Costar Corp., Cambridge, MA)
mit einer Dichte von 1,5 × 105/Mulde mit verschiedenen Anzahlen von g-bestrahlten (3.000
rads) DC in Dreifachausfertigungen kultiviert. Die Proliferation
wurde am Tag 5 durch [3H]Thymidin-Aufnahme (0,5 mCi/Mulde,
spezifische Aktivität
5 Ci/mMol, Amersham Life Science, Buckinghamshire, UK) während eines
16 Stunden-Pulses ermittelt.
-
Tb1-Stimulationsassays
-
Der
Mycobacterium tuberculosis- und M. Leprae hsp65-spezifische. HLA-DR3-Restriktions-CD4+
Th1-Klon Rp15 1-1, der in dieser Studie verwendet wurde, erkennt
eine hsp65-Determinante, die Peptidresten 3 bis 13 (p3-13) entspricht
(24). HLA-DR-abgestimmte
DEX-behandelten unreifen DC und ihre DEX-unbehandelten Pendants
wurden 2 Stunden lang mit 10 mg/ml p3-13 oder mit 10 mg/ml hps65
gepulst, extensiv gewaschen und durch CD40 stimuliert, wie vorstehend
beschrieben wurde. Für Aggepulste
DEX-behandelte unreife DC erfolgte die CD40-Triggerung im Beisein
von DEX. Hsp65-spezifische T-Zellen (104)
wurden mit verschiedenen Anzahlen g-bestrahlter (3.000 rads) DC
in Flachbodenplatten mit 96 Mulden (Costar Corp.) in Dreifachausfertigungen
3 Tage lang kultiviert. Die [3H]Thymidin-Inkorporation
wurde am Tag 3 nach einem 16 Stunden-Puls gemessen. Vor der Zugabe
von [3H]Thymidin wurden 50 ml Überstände aus
jedem Napf abgezogen, und Überstände aus
dreifachen Mulden wurden gepoolt, um die IFN-g-Produktion zu messen.
Um die Reaktivität
hsp65-spezifischer T-Zellen
auf eine zweite starke Antigenbelastung zu testen, wurden 104 T-Zellen zuerst 48 Stunden lang mit 5 × 103 peptid-gepulsten DC kultiviert, die wie
vorstehend hergestellt waren, dann geerntet und in einem Medium
stehen gelassen, das 5 U/ml IL-2 enthielt. Drei Tage später wurden
104 lebensfähige T-Zellen erneut mit 5 × 103 peptid-gepulsten DC stimuliert, die vom
selben Spender gewonnen worden waren, der für die erste Kultur verwendet
wurde, und auf ihrer Fähigkeit
hin getestet, sich zu vermehren und IFN-g zu produzieren, wie zuvor
beschrieben wurde.
-
Statistische Analyse
-
Es
wurde eine Kovarianzanalyse verwendet, um die T-Zellenproliferation
und die IFN-g-Produktion als
Funktion der DC-Anzahl zwischen DEX-behandelten CD40-getriggerten
DC und DEX-unbehandelten CD40-getriggerten DC zu vergleichen (5).
-
Figurenbeschriftungen
-
1 Eine
Vorbehandlung mit DEX hemmt die phänotypischen Veränderungen,
die durch CD40-Ligation induziert werden.
-
Sieben
Tage alte, unreife DC wurden 24 Stunden lang in der Ab- oder Anwesenheit
von 10 M DEX kultiviert und 48 Stunden lang über CD40 mit dem CD8-CD40L-Fusionsprotein
aktiviert. Der Vergleich mit unreifen DC ist gezeigt, die in Medium
allein gehalten wurden. Leere Histogramme zeigen die Hintergrundeinfärbung mit
MoAb-Isotypkontrollen, und ausgefüllte Histogramme stellen eine
spezifische Einfärbung
der angegebenen Zelloberflächenmarker dar.
Es sind spezifische mittlere Fluoreszenzstärken angegeben. Die mittleren
Fluoreszenzstärken
der Isotypkontrollen lagen zwischen 3 und 4. Die Daten sind für 4 unabhängige Versuche
repräsentativ.
-
2 DC,
die durch CD40 getriggert werden, behalten nach einer anschließenden DEX-Einwirkung einen
aktivierten Phänotyp
bei.
-
Unreife
DC wurden mit dem CD8-CD40L-Fusionsprotein aktiviert. DEX (10–6 M)
oder eine Mediumkontrolle wurden 48 Stunden später zugesetzt, und die Zellen
wurden nach 2 zusätzlichen
Kulturtagen analysiert. Der Vergleich mit unreifen DC ist gezeigt,
die in Medium allein gehalten wurden. Leere Histogramme zeigen die
Hintergrundeinfärbung
mit MoAb-Isotypkontrollen, und ausgefüllte Histogramme stellen eine
spezifische Einfärbung
der angegebenen Zelloberflächenmarker
dar. Es sind spezifische mittlere Fluoreszenzstärken angegeben. Die mittleren
Fluoreszenzstärken
der Isotypkontrollen lagen zwischen 3 und 5. Die Daten sind für 2 unabhängige Versuche
repräsentativ.
-
3 Eine
Vorbehandlung mit DEX beeinträchtigt
die Regulierung des DC-Antigen-Aufnahmemechanismus
nicht.
-
Unreife
DC wurden 24 Stunden lang in der Ab- oder Anwesenheit von 10–6 M
inkubiert und 48 Stunden lang über
CD40 mit dem CD8-CD40L-Fusionsprotein weiter aktiviert oder nicht.
Die Zellen wurden 1 Stunde lang mit einem Medium gepulst, das entweder
1 mg/ml FITC-BSA oder 1 mg/ml FITC-mannosyliertes BSA enthielt.
Leere Histogramme zeigen die Hintergrund-Autofluoreszenz, grau gefüllte Histogramme
zeigen die Hinter grundaufnahme bei 0°C, und schwarz gefüllte Histogramme
zeigen die spezifische Aufnahme bei 37°C. Die Daten sind für 3 unabhängige Versuche
repräsentativ.
-
4 Eine
Vorbehandlung mit DEX verändert
das Zytokinsekretionsprofil von CD40-getriggerten DC.
-
DEX-exponierte
CD oder unreife Kontroll-CD wurden ohne weiter mit dem CD8-CD40L-Fusionsprotein
behandelt oder stimuliert zu werden, in Kultur belassen. Kulturüberstunde
wurden 48 Stunden später
geerntet, und die Sezernierung von IL-10, IL-12p40 und IL-12p70
wurde durch spezifische ELISA-Tests analysiert. Die Daten sind für 6 unabhängige Versuche
repräsentativ.
-
5 Eine
Vorbehandlung mit DEX beeinträchtigt
die T-Zellen-Stimulationsfähigkeiten
von über
CD40 aktivierten DC und führt
zu einem Zustand der Hyporeaktivität von Th1-Zellen.
-
Allogenetische
MLR: nicht adhärente
allogenetische PBMC wurden mit unterschiedlichen Anzahlen von CD40-getriggerten
DC, DEX-behandelten CD40-getriggerten DC oder unreifen DC kultiviert. Die
Proliferationsreaktion wurde am Tag 5 gemessen. Th1-Stimulationsassays:
hsp65-spezifische T-Zellen wurden mit unterschiedlichen Anzahlen
von HLA-DR-angepassten, CD40-getriggerten DC oder mit DEX-behandelten,
CD40-getriggerten DC kultiviert, die mit dem hps65-Protein oder
mit dem spezifischen p3-13-Peptid-Epitop gepulst waren. Die Proliferationsreaktion
und die T-Zellen-abhängige IFN-g-Produktion
wurden am Tag 3 analysiert. Die Daten sind für 4 unabhängige Versuche repräsentativ.
-
6 DEX-behandelte
DC, die durch CD40 getriggert wurden, induzieren einen Zustand der
Hyporeaktivität
in Th1-Zellen. Hsp65-spezifische T-Zellen, die mit CD40-getriggerten DC oder
mit DEX-behandelten CD40-getriggerten DC, die mit dem p3-13-Peptid-Epitop gepulst
waren, vorkultiviert wurden, wurden nach 48 Stunden geerntet, im
Beisein von 5 U/ml IL2 drei Tage lang stehen gelassen, und mit p3-13-gepulsten
DC erneut stimuliert. Die Proliferationsreaktion und die IFN-g-Produktion
wurden am Tag 3 gemessen. Ähnliche
Ergebnisse wurden in 2 unabhängigen
Versuchen erhalten.
-
7 D1-zellen
wurden unbehandelt belassen oder zwei Tage lang im Beisein von LPS
(1 μg/ml) und
oder DEX (10–6 M)
kultiviert. Die Oberflächenexpression
von CD86 (B7.2), MHC Klasse II und CD40 wurde durch Einfärbung mit
den geeigneten FITC-markierten
Ab und anschließender
FACS-Analyse überwacht. Ähnliche
Ergebnisse wurden für D1-Zellen
erhalten, die im Beisein von Mäuse-CD40L heranreiften
(nicht gezeigt).
-
8 Balb/c-Mäuse wurden
mit 10–6 D1-Zellen
immunisiert, die wie angegeben hergestellt wurden. Eine Woche später wurden
Splenozyten isoliert und auf ihre Reaktion gegen C57B1/6-Splenozyten
in einer gemischten Lymphozytenkultur hin getestet. Nach 24 Stunden
wurden die Kulturüberstände in einem
spezifischen ELISA-Assay auf den IFNg-Gehalt hin getestet.
-
9 Balb/c-Mäuse (5 pro
Gruppe) wurden wie angegeben immunisiert. Eine Woche später wurden
Hauttransplantate mit C57B1/6-Ursprung transplantiert und das Überleben
des Transplantats wurde überwacht.
-
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