WO2001009288A1 - Procede d'obtention de cellules dendritiques, les cellules dendritiques ainsi obtenues et leurs utilisations a des fins cliniques - Google Patents

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WO2001009288A1
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dendritic cells
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Bernard Klein
Karin Tarte
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Centre Hospitalier Universitaire
Cellgen Sarl
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    • C12N2501/25—Tumour necrosing factors [TNF]

Definitions

  • the present invention relates to the field of immunotherapy and more particularly that of dendritic cells and their use as an immunotherapy agent.
  • DC Dendritic cells
  • the dendritic cells which are present in the skin (Langerhans cells), in the mucous membranes, peripheral blood and bone marrow, are the cells with the most powerful antigens (Antigen-presentmg cells or APC) in the immune system. are characterized by a unique morphology and a specific surface phenotype.
  • CD83 antigen express the CD83 antigen and are capable of expressing significant quantities of MHC classes I and II and of initiating mixed reactions with leukocytes (MLR).
  • MLR leukocytes
  • they are devoid of certain myeloid markers, in particular of the CD14 marker
  • DC Dendritic cells
  • 1.2 phenotypic and functional characteristics
  • Immature DCs obtained in vitro from monocytes by culture with a factor stimulating colonies of granulocytes-macrophages (GM-CSF) and an interleukin blocking differentiation towards the macrophagic pathway (IL-4 or IL-13) are analogous to DCs of peripheral tissue, i.e. cells of
  • Mature DCs have decreased expression of CCR1 and CCR5, which are receptors for inflammatory chemokines, inflammatory macrophage proteins MIP-1 ⁇ , MIP-1 ⁇ and RANTES, and concomitantly, they have increased expression for CCR7, which is the receptor for the ligand E1 B (ELC) / MIP-3 ⁇ , which is expressed constitutively in the secondary lymphoid organs (7-9)
  • CCR1 and CCR5 which are receptors for inflammatory chemokines, inflammatory macrophage proteins MIP-1 ⁇ , MIP-1 ⁇ and RANTES, and concomitantly, they have increased expression for CCR7, which is the receptor for the ligand E1 B (ELC) / MIP-3 ⁇ , which is expressed constitutively in the secondary lymphoid organs (7-9)
  • ELC E1 B
  • 7-9 secondary lymphoid organs
  • dendritic cells for immunotherapy purposes requires several million cells repeatedly. In addition, these cells must be able to circulate in the human body selectively to the lymph nodes for treatment to be effective. It is also important to have cells irreversibly engaged in the dendritic differentiation pathway, that is to say mature cells which are not liable to transform in the organism into macrophages
  • FCS fetal calf serum
  • xenogenic antigens can be immunodominant and may interfere with the development of specific anti-tumor immunity
  • International applications WO98 / 23728, WO98 / 06823 and WO98 / 06826 also describe methods for obtaining dendritic cells in serum-free media.
  • International application WO98 / 06826 describes, among other things, the use of a serum-free medium, X-VIVO 15 medium supplemented with 1% human albumin (HA) It is specified in this application that the use of 1% HA does not significantly improve cell growth, their phenotype or their stimulating capacity In addition, the expression of CD86 is increased after 14 days of culture in such a medium.
  • HA human albumin
  • the method of the invention consists 1) in cultivating for 4 to 6 days, preferably 5 days, mononuclear cells derived from cytapheresis after mobilization in a free environment serum supplemented with human albumin in the presence of a factor stimulating granulocyte-macrophage colonies (GM-CSF) and an interleukma (IL) blocking differentiation towards the macrophagic pathway,
  • PGE2 prostaglandin E2
  • serum-free culture medium any culture medium commonly used for the culture of cells for clinical purposes, which contains the essential nutrients for the growth of hematopoietic cells, in particular a source of carbon, nitrogen, transfernne.
  • serum-free culture media suitable for the purposes of the invention are described for example in WO95 / 00632 and US5,405,772
  • Such media are the X-VIVO 10 or X-VIVO 15 media sold by the company Biowhittaker, Walkersville, MD, USA
  • the X-VIVO 15 medium is particularly preferred for the implementation of the invention
  • the culture medium must be supplemented with human albumin at a rate of 1 to 2% (weight / volume), preferably 2%.
  • mononuclear cells we mean mononuclear cells (MNC) from the peripheral blood of normal subjects or patients presenting with cancer or any other disease in which the immune system is involved, such as infectious, viral or parasitic diseases, for example AIDS or dysimmune diseases, such as for example rheumatoid arthritis, lupus etc.
  • the mononuclear cells (MNC) used as starting material in the process according to the invention are mononuclear cells obtained by cytapheresis after mobilization by chemotherapy and / or by at least one cell growth factor.
  • the mononuclear cells used in the process of the invention comes either from normal subjects or from cancer patients who have have been subjected to chemotherapy, i.e. specific treatment with a chemotherapeutic agent and possibly a cell growth factor, either from patients with an infectious, viral or parasitic disease who have been treated with a cell growth, such as cytokmes, including hematopoietic growth factors
  • growth factor which can be used for the mobilization of mononuclear cells
  • G-CSF granulocyte colonies
  • GM-CSF granulocyte-macrophage colonies
  • LEUCOMAX from Schering Plow
  • SCF stem cell growth factor
  • the mobilized mononuclear cells which are used according to the invention include in particular monocytes, lymphocytes, hematopoietic stem cells
  • the mobilization by chemotherapy is carried out using the chemotherapeutic agent appropriate to the type of cancer presented by the patient, donor of the cells to be used in the process of the invention.
  • Any chemotherapeutic agent such as for example the cyclophosphamide
  • GM-CSF, interleukin, TNF- ⁇ and PGE2 are those which are usually used for cell cultures
  • GM-CSF can be used at a rate of 1 ng / ml to 1000 ng / ml, preferably 50 to 500 ng / ml, advantageously 100 ng / ml of medium.
  • Interleukin is generally used in amounts ranging from 1 ng / ml to
  • TNF- ⁇ can also be used at a rate of 1 ng / ml to 1000 ng / ml and PGE2 at a rate of 10 ng / ml at 10 ⁇ g / ml, advantageously from 20 ng / ml to 1 ⁇ g / ml
  • the culture of dendritic cell precursor cells is carried out in plastic containers commonly used in this field, such as flasks or cell culture bags allowing the adhesion of the cells.
  • the culture is advantageously carried out in incubators under normal cell culture conditions (sterility, C0 2 approximately 5%, humidity approximately 95% and temperature approximately 37 ° C)
  • the invention relates to dendritic cells which are ⁇ v ⁇ 3 " , ⁇ v ⁇ s + , CCR5 “ and CCR7 + , that is to say that they are devoid of the receptors ⁇ v ⁇ 3 " and CCR5 and provided ⁇ v ⁇ s and CCR7 receptors
  • dendritic cells which can be obtained by the process defined above, are irreversible mature cells. They can be used as an immunotherapy agent in all cellular therapies, such as for example the treatment of cancers or infectious, viral or parasitic diseases.
  • the subject of the invention is also the use of the dendritic cells ⁇ v ⁇ 3 " , ⁇ v ⁇ s + , CCR5 “ and CCR7 + for the manufacture of an immunotherapy agent useful for the treatment of any disease involving the immune system
  • the dendritic cells according to the invention are capable of capturing tumor antigens in vivo either by protein endocytosis or by phagocytosis of apoptotic cells
  • DCs are capable of migrating to the lymph nodes in order to present the peptides derived from antigens directed against T lymphocytes They are also capable of producing ⁇ nterleuk ⁇ ne-12 promoting a differentiation of naive CD8 + cells into cytotoxic T lymphocytes They exhibit a stable phenotype after withdrawal of cytokines used in ex vivo cultures
  • the method of the invention makes it possible to obtain immature dendritic cells and mature dendritic cells In the presence of GM-CSF and an interleukme, immature dendritic cells CD83 " CD14 weak are obtained
  • immature dendritic cells CD83 " CD14 weak are obtained
  • These DCs express HLA-DR, CD80 and CD86 as well as endocytic and phagocytic receptors, namely MR, CD36 and ⁇ v ⁇ 5
  • these immature DCs are able to phagocyte apoptotic tumor cells by the phagocytosis of apoptotic monocytes.
  • these mature DCs also express endocytic receptors such as the mannose receptors or the phagocytosis receptors of the ⁇ v ⁇ and CD36 type. These mature DCs however have a weaker capacity for endocyte dextran or phagocyte apoptotic tumor cells than immature DCs from which they come.
  • the response to chemokines for DCs obtained according to the invention was modulated similarly to that of DCs obtained in medium containing FCS
  • the immature DCs obtained according to the invention expressed CCR5 and did not respond to MIP-3 ⁇
  • these cells should preferably be trapped in inflammatory sites where MIP-1 ⁇ , MIP-1 ⁇ or RANTES are produced (25)
  • DC according to l invention lost expression of CCR5 and acquired the ability to respond to MIP-3 ⁇ It is believed that a high proportion of these mature DCs will be able to be trapped in areas of T cell lymph nodes where MIP -3 ⁇ is produced and initiate an effective immune response
  • the subject of the invention is also a method of immunotherapeutic treatment which consists in taking from a patient to be treated mononuclear cells by cytapheresis after mobilization by chemotherapy and / or with a cell growth factor and optionally freezing / thawing, in treating said cells according to the method defined above and to activate them during step 2) of said method (maturation step) with specific antigens according to the usual procedures well known to those skilled in the art, for example by endocytosis and then to be reinjected DC cells obtained from said patient
  • these dendritic cells can be frozen after the maturation / activation step according to the usual techniques without substantial modification of their properties.
  • the DCs according to the invention are particularly suitable for allograft or autograft treatments
  • FIG. 1 shows the effect of the maturation of the DCs on the endocytosis of FITC-dextran A) with DCs obtained by culture on X-VIVO medium 15-2% HA in the presence of GM-CSF and IL-4,
  • the dotted curves correspond to the incubation time of DCs with FITC-dextran of 7 minutes, the solid lines curves for incubation for 15 minutes and the bold lines curves for incubation for 30 minutes, on the axis abscissas are indicated the fluorescence intensity and on the ordinate axis the number of events,
  • FIG. 2 shows the apoptosis of XG-1 cells by cycloheximide (CHX) by measuring the fluorescence of cells stained with Annex ⁇ n-V FITC and with propidium iodide (PI),
  • CHX cycloheximide
  • FIG. 3 shows the phagocytosis of apoptotic tumor cells by immature DCs and the absence of phagocytosis by mature DCs
  • Cytapheresis (CA) cells were collected from four patients with different cancers during the mobilization of hematopoietic precursors with cyclophosphamide and the human factor stimulating granulocyte colonies (G-CSF, filgrastim, NEUPOGEN, Amgen-Roche, Neuilly -sur-Seme, France) Each batch of collected AC cells was frozen in liquid nitrogen, then thawed and washed twice in the presence of a calcium and magnesium chelator.
  • G-CSF human factor stimulating granulocyte colonies
  • X-VIVO 15 medium supplemented with 2% human albumin (X-VIVO-2% HA)
  • X-VIVO-2% HA human albumin
  • the cells were eliminated which did not adhere and the cells which adhered were cultured in the presence of 100 ng / ml of GM-CSF (Leucomax, Sandoz, Basel, Switzerland) and 25 ng / ml of IL-4 (R&D Systems, Minneapolis, MN) for 7 days in X-VIVO 15 medium supplemented with 2% HA
  • cells were also grown which adhered in the presence of 100 ng / ml of GM-CSF and 25 ng / ml of IL-4 either in RPMI 1640 medium supplemented with 10% FCS (reference medium), either in X-VIVO 15 medium alone or in X-VIVO 15 medium supplemented with 5% BSA, 5% autologous serum or
  • TNF- ⁇ R&D Systems
  • TNF- ⁇ R&D Systems
  • PGE2 Sigma Chemical, St Louis, MO
  • the AB serum, the autologous plasma and the autologous serum were less active than HA for obtaining in vitro mature DC Since a 5 hour cytapheresis generally allows
  • X-VIVO 15 medium alone was carried out using cytapheresis cells from 8 donors mobilized by hematopoietic growth factor (G-CSF) or by cyclophosphamide and hematopoietic growth factor
  • G-CSF hematopoietic growth factor
  • IL-4 hematopoietic growth factor
  • the cells cultured in X-VIVO 15 medium in the presence of GM-CSF and IL-4 for 7 days had a viability of less than 65% which did not allow their phenotype and their functions to be analyzed unlike the cells of the same donors cultivated in the presence of X-VIVO 15-2% human albumin, GM-CSF and IL-4 for 7 days
  • the medium X-VIVO 15 alone does not allow reproducible generation of immature dendritic cells L ' addition of 2% human albumin allowed in all cases a generation of perfectly viable and functional and irreversible dendritic cells
  • the percentage of cells expressing CD14, HLADR, CD83, CD80 and CD86 was determined by flow cytometry (FACS) using the following monoclonal antibodies CD1 a-PE, CD14- PE, CD36-FITC, CD80-PE, CD83-PE, HLA-DR-FITC (Immunotech, Marseille, France), monoclonal antibodies CCR5-PE, CD51 / CD61-FITC, CD86-FITC, MR-PE (Pharmingen, San Diego, CA) and IgG mu ⁇ ns antibodies paired according to the isotype (Immunotech)
  • the total phenotype of the DCs obtained according to Example 1 is similar to that of the immature DCs obtained by culture in the RPMI medium in the presence of FCS (Table I)
  • the percentage of CD14 + cells was greatly increased (up to 80% in X-VIVO 15-AB serum) and the resulting cells expressed a lower density of HLA class II and of costimulatory molecules.
  • CP83 a specific marker for mature PCs, could be detected after 24 h of culture in the presence of TNF- ⁇ and reached maximum expression in 48 h
  • PGE2 also cooperated with TNF- ⁇ for the upstream regulation of CD80 and CP86 on PCs ( table I and table II)
  • the percentage of CP14 + cells obtained in the presence of GM-CSF + IL-4 + PGE2 was higher than that obtained in the presence of GM-CSF and IL-4 alone, which suggests that PGE2, when used without TNF - ⁇ induces the reversion of at least some immature PCs into macrophage-type cells although GM-CSF and IL-4 were continuously present in the culture medium
  • XG-1 is a multiple myeloma cell line whose characteristics have been described in detail by Zhang et al (28) XG-1 cells (2.5 ⁇ 10 5 / ml) were incubated with 4 ⁇ m / ml of cycloheximide (CHX) in RPMI 1640 medium -10% FCS supplemented with 3 ng / ml of IL-6 at 37 ° C.
  • CHX cycloheximide
  • Phagocytosis of apoptotic cells Phagocytosis of apoptic cells constitutes another mode of entry of antigens and plays a major role in the phenomenon of cross-priming
  • MCM medium conditioned for monocytes
  • Immature and mature PCs were stained green using PKH67-GL (Sigma) and cultured for 2 h to allow release of unbound dye XG-1 cells were stained red using PKH26- GL (Sigma) according to the manufacturer's instructions before their induction to undergo apoptosis by CHX for 6 to 8 h Then, the red-tinted XG-1 cells were cocultured with immature or mature green-tinted PCs in a ratio of 1 1 in X-VIVO 15-2% HA according to the protocol described by Albert et al (6) After 90 mm at 37 ° C., the green and red fluorescences were analyzed with a FACScan device. In the blocking experiments, we co-mcubated XG-1 cells and DC at 4 ° C
  • CD36, ⁇ v ⁇ 3 and ⁇ v ⁇ 5 markers were determined according to the method by labeling with monoclonal antibodies and flow cytometry
  • the cells were first incubated with a primary mAb antibody ⁇ v ⁇ 5 (Chemicon Int, Temecula, CA), then with a goat anti-mouse Ig antibody conjugated to FITC (Immunotech). analyzes with a FACScan device (Becton Pickmson)
  • the monoclonal antibody ant ⁇ -CCR5 (Pharmingen, San Piego, CA, USA) was used to detect the CCR5 receptor which is a receptor for inflammatory chemokines. Incubated mature or immature PC cells were incubated in the medium.
  • the immature and mature PCs obtained were harvested after 7 days of culture in X-VIVO 15-2% HA, washed and spread out at the rate of 4 ⁇ 10 5 / ml in RPMI 1640-5. % of FCS with or without L cells transfected with 10 5 / ml of CP40L, (supplied by Pondel Se Saeland, Schering-Plow, Pardilly, France) When indicated, recombinant human IFN- ⁇ was added ( 1000 U / ml, R&D Systems) We collected the supernatants 24 h to 30 h after stimulation and they were stored at -70 ° C. The quantities of IL-0 and p70 IL-12 were measured by ELISA according to the manufacturer's operating method (R&P Systems)
  • Pendntic cells use macropinocytosis and the mannose receptor to concentrate macromolecules m the major histocompatibility complex class II compartment downregulation by cytokmes and bactenal products [see comments] J Exp Med 182 389
  • Prostaglandm E2 induces the final maturation of IL-12-def ⁇ c ⁇ ent CD1a + CD83 + dendritic cells the levels of IL-12 are determmed dunng the final dendritic cell maturation and are resistant to further modulation
  • GM / IL-4 / TNF 14 90 25 (69) 100 (224) 25 (40) 95 (60) 85 (50)
  • XV-HA medium X-VIVO 15 - 2% HA

Abstract

La présente invention a pour objet un procédé pour l'obtention de cellules dendritiques qui consiste: 1) à cultiver, pendant 4 à 6 jours, de préférence 5 jours, des cellules mononuclées issues de cytaphérèse aprés mobilisation, dans un milieu exempt de sérum complémenté avec de l'albumine humaine en présence d'un facteur stimulant les colonies de granulocytes-macrophages (GM-CSF) et d'une interleukine (IL) bloquant la différentiation vers la voie macrophagique; 2) à ajouter au milieu de culture du TNF-α et éventuellement un médiateur inflammatoire et à poursuivre la culture pendant environ 1 à 4 jours, de préférence 2 jours supplémentaires; 3) à récupérer les cellules dendritiques ainsi formées. Applications : agents d'immunothérapie.

Description

PROCEDE D 'OBTENTION DE CELLULES DENTRITIQUES , LES CELLULES DENTRITIQUES AINSI OBTENUES ET LEURS UTILISATIONS A DES FINS CLINIQUES
La présente invention concerne le domaine de l'immunothérapie et plus particulièrement celui des cellules dendritiques et de leur utilisation à titre d'agent d'immunothérapie
Les cellules dendritiques (DC) jouent un rôle clé dans l'initiation de la réponse immunitaire primaire et des études cliniques pilotes ont mis en évidence leur capacité à induire une immunité anti-tumorale efficace
Les cellules dendritiques, qui sont présentent dans la peau (cellules de Langerhans), dans les muqueuses, le sang périphérique et la moelle osseuse, sont les cellules présentant des antigènes (Antigen-presentmg cells ou APC) les plus puissantes dans le système immunitaire Elles sont caractérisées par une morphologie unique et un phénotype de surface spécifique.
En particulier, elles expriment l'antigène CD83 et sont capables d'exprimer des quantités importantes de MHC classes I et II et d'initier des réactions mixtes avec les leucocytes (MLR) En revanche, elles sont dépourvues de certains marqueurs myéloides, notamment du marqueur CD14
Etant donné leurs propriétés spécifiques, ces cellules ont été proposées comme éléments essentiels dans les thérapies cellulaires qui nécessitent la présentation d'antigènes aux lymphocytes T
Les cellules dendritiques (DC) ont un mode de différenciation spécifique qui comprend deux stades importants, le stade immature et le stade mature, selon un ensemble de caractéristiques phenotypiques et fonctionnelles (1.2) Les
DC immatures obtenues in vitro a partir de monocytes par culture avec un facteur stimulant les colonies de granulocytes-macrophages (GM-CSF) et une interleukine bloquant la différentiation vers la voie macrophagique (IL-4 ou IL-13) sont analogues aux DC du tissu périphérique, c'est-à-dire aux cellules de
Langerhans et aux cellules dendritiques interstitielles Ces DC immatures sont capables de capturer les antigènes avec une grande efficacité en utilisant des récepteurs spécialisés, tels que les récepteurs pour le fragment Fc des immunoglobulines (FcR) (3,4), le récepteur au mannose (MR) (5) et les récepteurs phagocytaires, en particulier CD36 et l'intégπne αvβ5 (6) Elles peuvent ainsi iπternaliser les protéines, les lysats de cellules entières, l'ARN et les cellules apoptotiques En revanche, elles expriment seulement de faibles taux de molécules costimulatπces nécessaires pour l'activation des lymphocytes T Lorsqu'elles sont exposées à des signaux de maturation, donnés principalement par les antigènes, les cytokines inflammatoires ou les produits bactériens, les DC perdent leurs capacités phagocytaires et endocytaires (5,6) mais accroissent l'expression du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) de classe I, du CMH de classe II, l'expression de CD80 et CD86 et deviennent de très puissantes cellules présentant des antigènes (APC) Le passage du stade immature au stade mature est associé à l'expression des récepteurs des chémokines Les DC matures ont une expression diminuée de CCR1 et CCR5, qui sont les récepteurs des chémokines inflammatoires, les protéines inflammatoires de macrophages MIP-1α, MIP-1 β et RANTES, et de façon concomitante, elles ont une expression augmentée de CCR7, qui est le récepteur pour le ligand E1 B (ELC)/MIP-3β, lequel est exprimé de façon constitutive dans les organes lymphoides secondaires (7-9) Ces changements dans l'expression des récepteurs des chémokines sont importants pour la circulation in vivo des DC Les DC immatures sont recrutées par les chémokines inflammatoires dans les sites d'entrée des antigènes Après activation par les antigènes et stimuh inflammatoires, elles perdent les récepteurs CCR1 et CCR5 et acquièrent l'expression de CCR7 Les DC matures peuvent ensuite entrer dans les vaisseaux lymphatiques et migrer vers les ganglions lymphatiques afférents où elles présentent des épitopes dérivés d'antigènes pour les lymphocytes naïfs et les lymphocytes mémoires présents dans ces ganglions
Ainsi, on a déjà proposé de les utiliser en tant que vecteurs pour des vaccinations anti-tumorales (10) Récemment Nestlé et al ont montré que l'injection intralymphatique de DC immatures activées avec des peptides tumoraux ou des lysats cellulaires tumoraux ont pu provoquer une réponse immunitaire anti-mélanome (11 )
L'utilisation de cellules dendritiques à des fins d'immunothérapie nécessite plusieurs millions de cellules à plusieurs reprises De plus, ces cellules doivent être capables de circuler dans le corps humain de manière sélective vers les ganglions pour que le traitement soit efficace II importe également de disposer de cellules engagées de façon irréversible dans la voie de différentiation dendritique, c'est-à-dire de cellules matures qui ne soient pas susceptibles de se transformer dans l'organisme en macrophages
Plusieurs études concernant la modulation des récepteurs des chémokines ont été réalisées avec des DC obtenues par culture dans un milieu contenant du sérum de veau fétal (FCS) Or, les antigènes xénogènes peuvent être immunodominants et peuvent gêner le développement de l'immunité anti- tumorale spécifique
Différentes équipes de chercheurs se sont donc concentrées sur la production de DC dérivées de monocytes dans des milieux exempts de FCS en utilisant des milieux complémentés avec 1 à 10 % de plasma autologue (12-17), de sérum autologue (18) ou d'un pool de sérums humains AB (13, 19-22,31) Toutefois, même le sérum autologue peut poser un problème puisqu'il contient de nombreuses protéines, en particulier des anticorps (23) qui peuvent modifier la voie de fixation et de modification intracellulaire des antigènes De plus, certains antigènes tumoraux de type MUC-1 dans plusieurs cancers ou l'immunoglobuline monoclonale dans le myélome multiple, sont présents dans le sérum à des taux élevés et variables, ce qui peut affecter une présentation reproductible par les DC
Pour toutes ces raisons, des procédés d'obtention de DC capables d'activer les lymphocytes T dans des milieux exempts de sérum ont été proposés (24-26)
Les demandes internationales W098/23728, WO98/06823 et WO98/06826 décrivent également des procédés d'obtention des cellules dendritiques dans des milieux exempts de sérum La demande internationale WO98/06826 décrit entre autre l'utilisation d'un milieu exempt de sérum, le milieu X-VIVO 15 complémenté avec 1 % d'albumine humaine (HA) Il est précisé dans cette demande que l'utilisation de 1 % de HA n'améliore pas de façon significative la croissance des cellules, leur phénotype ou leur capacité stimulante De plus, l'expression de CD86 est augmentée au bout de 14 jours de culture dans un tel milieu
On a maintenant trouvé, de façon surprenante, que l'on peut obtenir des quantités importantes de cellules dendritiques, qui peuvent être utilisées en immunothérapie par culture de cellules mononuclées particulières dans un milieu exempt de sérum convenablement complémenté avec de l'albumine humaine en présence d'un facteur stimulant la formation de colonies de granulocytes macrophages (GM-CSF) et d'une cytokine, en particulier l'ιnterleukιne-4 (IL-4) ou l'ιnterleukιne-13 (IL-13) puis en présence d'au moins un médiateur inflammatoire, tel que par exemple le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α) Ainsi le procédé de l'invention consiste 1) à cultiver pendant 4 à 6 jours, de préférence 5 jours des cellules mononuclées issues de cytaphérèse après mobilisation dans un milieu exempt de sérum complémenté avec de l'albumine humaine en présence d'un facteur stimulant les colonies de granulocyte-macrophage (GM-CSF) et d'une interleukme (IL) bloquant la différentiation vers la voie macrophagique ,
2) à ajouter au milieu de culture du TNF-α et éventuellement un médiateur inflammatoire et à poursuivre la culture pendant environ 1 à 4 jours, de préférence 2 jours supplémentaires ,
3) à récupérer les cellules dendritiques ainsi formées Avantageusement, on peut ajouter au milieu de culture, les deuxième et quatrième jours, du milieu frais contenant du GM-CSF et une interleukme Selon une variante de mise en œuvre du procédé de l'invention, on peut utiliser de la prostaglandine E2 (PGE2) conjointement avec le TNF-α.
Par "milieu de culture sans sérum" on désigne tout milieu de culture couramment utilisé pour la culture des cellules à des fins cliniques, qui contient les substances nutritives essentielles pour la croissance des cellules hematopoietiques notamment une source de carbone, d'azote, de la transfernne.
Ces milieux sont exempts de sérum humain ou de sérum animal
Des exemples de milieux de culture exempts de sérum appropriés aux fins de l'invention sont décrits par exemple dans WO95/00632 et US5 405 772
Des exemples particuliers de tels milieux sont les milieux X-VIVO 10 ou X-VIVO 15 commercialisés par la société Biowhittaker, Walkersville, MD, USA
Le milieu X-VIVO 15 est particulièrement préféré pour la mise en œuvre de l'invention
Le milieu de culture doit être complémenté avec de l'albumine humaine à raison de 1 à 2 % (poids/volume), de préférence 2 % Par "cellules mononuclées" on désigne les cellules mononuclées (MNC) provenant du sang périphérique de sujets normaux ou de patients présentant un cancer ou toute autre maladie dans laquelle le système immunitaire est impliqué, telle que les maladies infectieuses, virales ou parasitaires, par exemple le Sida ou les maladies dysimmumtaires, telles que par exemple la polyarthrite rhumatoide, le lupus etc
Les cellules mononuclées (MNC) utilisées comme produit de départ dans le procédé selon l'invention sont des cellules mononuclées obtenues par cytaphérèse après mobilisation par chimiothérapie et/ou par au moins un facteur de croissance cellulaire Ainsi, les cellules mononuclées utilisées dans le procédé de l'invention proviennent soit de sujets normaux ou de patients présentant un cancer qui ont été soumis à une chimiothérapie, à savoir à un traitement spécifique à l'aide d'un agent chimiotherapeutique et éventuellement d'un facteur de croissance cellulaire, soit de patients présentant une maladie infectieuse, virale ou parasitaire qui ont été traités avec un facteur de croissance cellulaire, tel que les cytokmes, y compris les facteurs de croissance hematopoietiques
A titre d'exemple de facteur de croissance qui peuvent être utilisés pour la mobilisation des cellules mononuclées, on peut citer
- les facteurs stimulants les colonies de granulocytes (G-CSF), tels que les produits connus sous les dénominations commerciales « filgrastim NEUPOGEN » de Amgen-Roche, « Lenograstim GRANOCYTE» de Rhône- Poulenc/Chugai ,
- les facteurs stimulant les colonies de granulocytes-macrophages (GM- CSF), tel que les produits connus sous les dénominations commerciales LEUCOMAX de Schering Plough ou le facteur de croissance des cellules souches (SCF) de Amgen
Les cellules mononuclées mobilisées qui sont mises en œuvre selon l'invention comprennent notamment les monocytes, les lymphocytes, les cellules souches hematopoietiques
La mobilisation par chimiothérapie est réalisée à l'aide de l'agent chimiotherapeutique approprié au type de cancer présenté par le patient, donneur des cellules à utiliser dans le procédé de l'invention On peut utiliser un agent chimiotherapeutique quelconque, tel que par exemple le cyclophosphamide
Les quantités de GM-CSF, d'interleukine, de TNF-α et de PGE2 à utiliser dans le procédé de l'invention sont celles qui sont habituellement utilisées pour les cultures cellulaires
On précisera que le GM-CSF peut être utilisé à raison de 1 ng/ml à 1 000 ng/ml, de préférence 50 à 500 ng/ml, avantageusement 100 ng/ml de milieu L'interleukine est généralement utilisée en des quantités allant de 1 ng/ml à
1 000 ng/ml, de préférence 10 à 50 ng/ml, avantageusement 25 ng/ml de milieu
On peut également utiliser le TNF-α à raison de 1 ng/ml à 1 000 ng/ml et la PGE2 à raison de 10 ng/ml à 10 μg/ml, avantageusement de 20 ng/ml à 1 μg/ml La culture des cellules précurseurs de cellules dendritiques est réalisée dans des récipients en plastique couramment utilisées dans ce domaine, tels que les flacons ou sacs de cultures cellulaires permettant l'adhérence des cellules
La culture est avantageusement réalisée dans des incubateurs dans les conditions normales de culture de cellules (stérilité , C02 environ 5 % , humidité environ 95 % et température environ 37°C)
Selon un autre aspect, l'invention a pour objet des cellules dendritiques qui sont αvβ3 " , αvβs+ , CCR5" et CCR7+, c'est-à-dire qu'elles sont dépourvues des récepteurs αvβ3 " et CCR5 et pourvues des récepteurs αvβs et CCR7
Ces cellules dendritiques, qui peuvent être obtenues par le procédé défini précédemment, sont des cellules matures irréversibles Elles sont utilisables comme agent d'immunothérapie dans toutes les thérapies cellulaires, telles que par exemple le traitement des cancers ou des maladies infectieuses, virales ou parasitaires
Ainsi l'invention a également pour objet l'utilisation des cellules dendritiques αvβ3 " , αvβs+ , CCR5" et CCR7+ pour la fabrication d'un agent d'immunothérapie utile pour le traitement de toute maladie impliquant le système immunitaire
En effet, avec les cellules dendritiques selon l'invention on peut réduire l'internalisation et la présentation de protéines xénogènes, allogènes ou autologues non identifiées et limiter ainsi les réponses immunitaires qui ne sont pas spécifiques aux antigènes tumoraux Les DC selon l'invention sont capables de capturer in vivo des antigènes tumoraux soit par endocytose des protéines soit par phagocytose des cellules apoptotiques
Ces DC sont capables de migrer vers les ganglions lymphatiques afin de présenter les peptides dérivés d'antigènes dirigés contre les lymphocytes T Elles sont également capables de produire l'ιnterleukιne-12 favorisant une différenciation des cellules CD8+ naïves en des lymphocytes T cytotoxiques Elles présentent un phénotype stable après retrait des cytokines utilisées lors des cultures ex vivo
Le procédé de l'invention permet d'obtenir des cellules dendritiques immatures et des cellules dendritiques matures En présence de GM-CSF et d'une interleukme, on obtient des cellules dendritiques immatures CD83" CD14faιble Ces DC expriment HLA-DR, CD80 et CD86 ainsi que des récepteurs endocytaires et phagocytaires, à savoir MR, CD36 et αvβ5 De plus, ces DC immatures sont capables de phagocyter des cellules tumorales apoptotiques par la phagocytose des monocytes apoptotiques Une stimulation de ces DC immatures avec du TNF-α plus GM-CSF et IL-4 pendant 2 jours supplémentaires conduit à l'obtention de cellules correspondant de façon phénotypique et fonctionnelle à des cellules dendritiques matures Ces cellules matures ont exprimé CD83 et des quantités plus élevées de HLA-DR, CD80 et CD86 par rapport aux DC immatures GM/IL-4
Elles sont capables d'activer les lymphocytes T allogènes avec la même efficacité que les DC matures obtenues en présence de FCS
De plus, ces DC matures expriment également des récepteurs endocytaires comme les récepteurs au mannose ou les récepteurs à la phagocytose de type αvβδ et CD36 Ces DC matures ont toutefois une capacité pour endocyter le dextrane ou phagocyter les cellules tumorales apoptotiques plus faibles que les DC immatures dont elles sont issues
La réponse aux chémokines pour les DC obtenues selon l'invention, a été modulée de façon similaire à celle des DC obtenues dans du milieu contenant du FCS En fait, les DC immatures obtenues selon l'invention ont exprimé CCR5 et n'ont pas répondu à MIP-3β Ainsi, après injection in vivo, ces cellules devraient être piégées de préférence dans des sites inflammatoires où MIP-1 α, MIP-1 β ou RANTES sont produits (25) Après traitement avec du TNF-α les DC selon l'invention ont perdu l'expression de CCR5 et ont acquis la capacité de répondre à MIP-3β On peut penser qu'une proportion élevée de ces DC matures sera capable d'être piégée dans des zones de ganglions lymphatiques de cellules T où le MIP-3β est produit et d'initier une réponse immunitaire efficace
De plus, on a montré que la PGE2 qui est connue pour accroître la maturation des DC dans des milieux sans FCS (14,21 ), peut jouer un rôle sur la migration des DC Dans les conditions de culture selon l'invention, la PGE2 n'a pas largement modifie le phénotype des DC produites avec GM/IL-4 et TNF, à l'exception d'un accroissement de l'expression de CD83, et n'a pas d'effet additif supplémentaire avec TNF-α pour l'activation des cellules T Toutefois, la PGE2 a accru la migration des DC en réponse a MIP-3β La migration des DC dans les organes lymphoides peut donc être sélective Afin d'induire la production des cellules T cytotoxiques anti-tumorales, les DC doivent être capables de diriger la différenciation des cellules T naïves vis-à- vis du sous-ensemble de type 1 exprimant IFN-γ et IL-2 L'IL-12 constitue la cytokine principale impliquée dans la polarisation de cellules TCD4+ vis-à-vis des cellules Th1 Dans le modèle de réponse des cellules T anti-EBV, il a été mis en évidence que l'expression de IL-10 par des lignées cellulaires lymphoblastoides est associée avec l'émergence des cellules T CD8+ de type 2 (32) qui produisent IL-4 et IL-10 et qui ne sont pas cytotoxiques (33) Au contraire, les cellules CD8+ de type 1 produisent de l'IFN-γ et de l'IL-2 et sont cytotoxiques Ainsi, des DC produites in vitro à des fins de vaccination anti-tumorale doivent idéalement produire IL-12 et non IL-10 En effet, IL-10 possède un effet nocif supplémentaire sur la maturation des DC En fait, les DC traitées avec IL-10 pendant la phase de maturation induisent l'anergie spécifique aux antigènes des cellules T CD4+ et CD8+ (25,34) Les DC obtenues selon l'invention, différentes de celles obtenues en présence de FCS (35,36), ont produit uniquement de faibles quantités de IL-12 mais des quantités importantes de IL-10 en réponse à la ligature à CD40 en accord avec les études montrant que les DC myéloides étaient capables de produire IL-10, en particulier en suivant la stimulation par CD40 (37,38) Toutefois, on a montré que la maturation des DC induites par TNF-α a entraîné l'induction de la production de IL-12 et une inhibition dramatique de la synthèse de IL-10 après activation par CD40 Ainsi, les DC matures selon l'invention sont capables de déclencher la différenciation des lymphocytes T naïfs en lymphocytes T de type 1 L'addition de PGE2 a de plus inhibé la production de IL-10 mais également la production de IL-12 matures obtenues
L'invention a également pour objet un procédé de traitement immunothérapeutique qui consiste a prélever à un patient à traiter des cellules mononuclées par cytaphérèse après mobilisation par chimiothérapie et/ou avec un facteur de croissance cellulaire et éventuellement congélation/décongélation, à traiter lesdites cellules selon le procédé défini ci-dessus et à les activer au cours de l'étape 2) dudit procédé (étape de maturation) par des antigènes spécifiques selon les procédures habituelles bien connues de l'homme de métier, par exemple par endocytose et ensuite à reinjecter les cellules DC obtenues audit patient Avantageusement, ces cellules dendritiques peuvent être congelées après l'étape de maturation/activation selon les techniques habituelles sans modification substantielle de leurs propriétés
Les DC selon l'invention conviennent en particulier pour les traitements par allogreffes ou autogreffes
L'invention va être illustrée plus en détail par les exemples ci-après donnés à titre non limitatifs et par les figures qui représentent ci-après
- la Figure 1 montre l'effet de la maturation des DC sur l'endocytose de FITC-dextran A) avec des DC obtenues par culture sur milieu X-VIVO 15-2 % HA en présence de GM-CSF et IL-4 ,
B) avec des DC obtenues par culture sur milieu X-VIVO 15-2 % HA en présence de GM-CSF, IL-4 et TNF-α ,
C) avec des DC obtenues par culture sur milieu X-VIVO 15-2 % HA en présence de GM-CSF, IL-4 et PGE 2
Les courbes en pointillés correspondent au temps d'incubation des DC avec FITC-dextran de 7 minutes, les courbes en traits pleins à l'incubation pendant 15 minutes et les courbes en traits gras à l'incubation pendant 30 minutes , sur l'axe des abscisses sont indiquées l'intensité de fluorescence et sur l'axe des ordonnées le nombre d'événements ,
- la Figure 2 montre l'apoptose de cellules XG-1 par le cycloheximide (CHX) par mesure de la fluorescence des cellules colorées par l'Annexιn-V FITC et par l'iodure de propidium (PI) ,
- la Figure 3 montre la phagocytose des cellules tumorales apoptotiques par les DC immatures et l'absence de phagocytose par les DC matures ,
- la Figure 4 montre l'effet de la maturation des DC sur l'expression de CCR5
- la Figure 5 montre la migration des DC matures et la non-migration des cellules immatures en réponse à (ELC)/MIP-3β
- la Figure 6 montre l'activation des cellules T allogènes par les DC matures EXEMPLE 1 Production des cellules dendritiques (PC)
On a recueilli des cellules de cytaphérèse (AC) provenant de quatre patients présentant différents cancers pendant la mobilisation des précurseurs hematopoietiques avec le cyclophosphamide et le facteur humain de stimulation des colonies de granulocytes (G-CSF, filgrastim , NEUPOGEN, Amgen-Roche, Neuilly-sur-Seme, France) Chaque lot de cellules AC recueillies a été congelé dans de l'azote liquide puis décongelé et lavé à deux reprises en présence d'un chélateur du calcium et du magnésium Chaque lot de cellules a ensuite été mis dans un flacon de culture cellulaire contenant du milieu X-VIVO 15 complémenté avec 2 % d'albumine humaine (X-VIVO-2% HA) et on a laissé les cellules adhérer sur la surface du flacon de culture pendant 2 h On a éliminé les cellules qui n'ont pas adhéré et on a cultivé les cellules qui ont adhéré en présence de 100 ng/ml de GM-CSF (Leucomax, Sandoz, Basel, Suisse) et 25 ng/ml de IL-4 (R&D Systems, Minneapolis, MN) pendant 7 jours dans du milieu X-VIVO 15 complémenté avec 2 % de HA A des fins de comparaison, on a également cultivé des cellules qui ont adhéré en présence de 100 ng/ml de GM-CSF et 25 ng/ml de IL-4 soit dans du milieu RPMI 1640 complémenté avec 10 % de FCS (milieu de référence), soit dans du milieu X-VIVO 15 seul ou dans du milieu X- VIVO 15 complémenté avec 5 % de SAB, 5 % de sérum autologue ou 5 % de plasma autologue Dans chaque cas, on a ajouté les deuxième et quatrième jours du milieu frais contenant GM-CSF et IL-4 Après 5 jours de culture, on a ajouté du milieu contenant GM-CSF et IL-4 avec du TNF-α (R&D Systems) à 20 ng/ml ou du TNF-α à 20 ng/ml et du PGE2 (Sigma Chemical, St Louis, MO) à 1 μg/ml Après 48 h, on a recueilli les cellules et on les a comptées Le rendement en cellules est donné dans le tableau I où on constate que le rendement en cellules obtenu en présence de GM-CSF et de IL-4 a atteint 12 % avec du sérum AB, 18 % avec du plasma autologue, 22 % avec du sérum autologue et 16 % avec du HA Le milieu X-VIVO 15-2 % de HA complémenté avec GM-CSF et IL-4 est le milieu le plus efficace pour obtenir des DC immatures de qualité clinique CD14"/faι le CD83 HLA-DR++ exprimant de grandes quantités de CD80 et CD86
Comme le montrent également les résultats du tableau I, le sérum AB, le plasma autologue et le sérum autologue ont été moins actifs que HA pour l'obtention in vitro des DC matures Etant donné qu'une cytaphérèse de 5 heures permet en général de
Q récupérer 40 à 50 x 10 cellules mononuclées, on a donc pu obtenir dans les conditions opératoires de l'invention 6 à 8 x 10 DC de façon reproductible Cette quantité de cellules est suffisante pour permettre au moins 6 vaccinations avec 109 DC
La culture de cellules sur milieu X-VIVO 15 seul a été réalisée à partir des cellules de cytaphérèse de 8 donneurs mobilisées par le facteur de croissance hématopoiétique (G-CSF) ou par le cyclophosphamide et le facteur de croissance hématopoiétique Pour 5 des 8 donneurs, les cellules cultivées en milieu X-VIVO 15 en présence de GM-CSF et d'IL-4 pendant 7 jours avaient une viabilité inférieure à 65% ce qui n'a pas permis d'analyser leur phénotype et leurs fonctions contrairement aux cellules des mêmes donneurs cultivées en présence de X- VIVO 15-2% d'albumine humaine, GM-CSF et IL-4 pendant 7 jours Le milieu X-VIVO 15 seul ne permet pas de générer de façon reproductible des cellules dendritiques immatures L'addition de 2% d'albumine humaine a permis dans tous les cas une génération de cellules dendritiques parfaitement viables et fonctionnelles et irréversibles
EXEMPLE 2 Analyse phénotypique par cvtométrie de flux des cellules PC
Pour caractériser le phénotype des DC obtenues selon l'exemple 1 , on a déterminé le pourcentage de cellules exprimant CD14, HLADR, CD83, CD80 et CD86 par cytométπe de flux (FACS) en utilisant les anticorps monoclonaux suivants CD1 a-PE, CD14-PE, CD36-FITC, CD80-PE, CD83-PE, HLA-DR-FITC (Immunotech, Marseille, France) , les anticorps monoclonaux CCR5-PE, CD51/CD61-FITC, CD86-FITC, MR-PE (Pharmingen, San Diego, CA) et les anticorps muπns IgG appariés suivant l'isotype (Immunotech)
Le phénotype total des DC obtenus selon l'exemple 1 est similaire à celui des DC immatures obtenues par culture dans le milieu RPMI en présence de FCS (tableau I) En utilisant le milieu X-VIVO 15 complémenté avec du sérum AB, du plasma autologue ou du sérum autologue, le pourcentage des cellules CD14+ a été grandement augmenté (jusqu'à 80 % dans du X-VIVO 15-sérum AB) et les cellules résultantes ont exprimé une densité plus faible de HLA classe Il et de molécules costimulatπces En revanche, selon le procédé de l'invention, c'est-à-dire avec le milieu X-VIVO 15-2 % de HA, on a pu obtenir un nombre élevé de PC (CPU , HLA-PR++, CP80++, CP86++) sans addition de protéines xénogènes, de protéines allogènes, d'anticorps humains ou d'antigènes tumoraux autologues non identifiés
Des résultats similaires ont été obtenus avec des AC provenant de quinze donneurs, cultivées dans les conditions opératoires de l'invention, c'est-à-dire dans un milieu X-VIVO 15 complémenté avec 2 % d'albumine humaine en présence de GM-CSF IL-4 et TNF-α avec ou sans PGE2 Ces résultats figurent dans le tableau II
Le CP83, marqueur spécifique des PC matures, a pu être détecté après 24 h de culture en présence de TNF-α et a atteint un maximum d'expression en 48 h La combinaison de PGE2 et TNF-α a induit l'expression de CP83 jusqu'à 83 % de cellules par rapport à 64 % avec du TNF-α seul (p = 0,007) (tableau II) Les PGE2 ont également coopéré avec le TNF-α pour la régulation en amont de CD80 et CP86 sur les PC (tableau I et tableau II)
Pans une autre série d'expériences, on a opéré dans les mêmes conditions que ci-dessus sauf que le cinquième jour, on a ajouté la PGE2 sans TNF-α
Le pourcentage des cellules CP14+ obtenues en présence de GM-CSF + IL-4 + PGE2 était supérieur à celui obtenu en présence de GM-CSF et IL-4 seuls, ce qui suggère que le PGE2, lorsqu'il est utilisé sans TNF-α induit la réversion d'au moins certaines PC immatures en cellules de type macrophage bien que le GM-CSF et IL-4 étaient continuellement présents dans le milieu de la culture
Pe la même façon, quand les PC immatures, obtenues dans du X-VIVO 15-2 % de HA complémenté avec GM-CSF et IL-4, ont été récoltées le septième jour, lavées de façon extensive et cultivées dans le milieu de culture sans cytokine pendant 3 jours supplémentaires, elles ont de nouveau adhéré au sac de culture et ont exprimé CP14 II s'agit là d'une réversion de ces DC immatures en cellules de type macrophage En revanche, la morphologie cellulaire et le phénotype cellulaire des PC matures, produites par addition de TNF-α seul ou de TNF-α + PGE2, n'ont pas été affectés de façon marquée après retrait des cytokmes, ce qui indique que la maturation a eu lieu de manière irréversible
EXEMPLE 3 Endocytose par MR
On a étudié l'endocytose au niveau cellulaire des PC obtenues par culture de cellules AC mobilisées selon le traitement indiqué dans l'exemple 1 dans du milieu X-VIVO 15 - 2 % HA en présence de GM-CSF et d'IL-4 pendant cinq jours Le cinquième jour, on a ajouté du milieu frais contenant GM-CSF et IL-4, ou GM-CSF, IL-4 et TNF-α ou GM-CSF et IL-4, TNF-α et PGE2 Le septième jour, on a déterminé l'expression de MR, CP36, αvβ3 et αvβ5 par la méthode d'analyse FACS Pour déterminer I expression du marqueur MR on a opéré selon la méthode décrite par Tarte et al (27) en utilisant du FITC-dextran pouvant fixer la lysine, MM = 40 000 (Molecular Probes Inc , Eugène, OR) On a recueilli les PC immatures et matures le septième jour et on les incubées à 37°C pendant 7, 15 et 30 mm ou à 4°C pendant 30 mm (fixation de fond) avec 1 mg/ml de FITC- dextran On a ensuite lavé les PC avec du PBS froid complémenté avec 1 % de FCS et 0 02 de NaN3 et on a analysé la fluorescence avec un appareil FACScan La moyenne du pourcentage de cellules positives obtenues par culture des AC de six donneurs est indiquée dans le tableau III
Ces résultats montrent que les PC immatures obtenues dans du X- VIVO 15-2 % de HA par culture de 7 jours avec GM-CSF et IL-4 ont largement exprimé des MR et cette expression a significativement diminué de plus de 50 % lors de la maturation des PC induite soit par TNF-α seul (p = 0,03), soit par TNF- α + PGE2 (p = 0,03)
L'endocytose du FITC-dextran par les cellules matures obtenues selon l'invention avec du TNF-α ou du TNF-α + PGE 2 a profondément diminué par rapport aux PC immatures comme cela est montré par la Figure 1
EXEMPLE 4 Induction de l'apoptose dans les cellules plasmatiques malignes Pour tester le potentiel phagocytaire des PC obtenues selon le procédé de l'invention, on a utilisé des cellules tumorales apoptotiques
XG-1 est une lignée cellulaire de myélome multiple dont les caractéristiques ont été décrites en détail par Zhang et al (28) On a incubé des cellules XG-1 (2,5 x 105/ml) avec 4 μm/ml de cycloheximide (CHX) dans du milieu RPMI 1640-10 % de FCS complémenté avec 3 ng/ml de IL-6 à 37°C On a enregistré la cinétique de l'apoptose cellulaire en utilisant une double coloration avec le colorant connu sous la dénomination Annexm-V FITC (Boehπnger Mannheim, Meylan, France) et de l'iodure de propidium (PI) (Sigma) Pans un premier temps, les cellules apoptotiques ont été colorées uniquement par l'Annexιn-V (Annexιn-V+/PI ) tandis que dans un deuxième temps, les cellules nécrotiques ont incorporé également du PI en raison d'une perte de l'intégrité de leur membrane (Annexιn-V7Pf) Apres traitement avec le CHX, on a lavé les cellules tumorales à trois reprises dans du X-VIVO 15-2 % de HA avant de les mettre en coculture avec des PC obtenues selon le mode opératoire décrit à l'exemple 1
Les résultats obtenus sont reportés sur la figure 2 Ces résultats montrent qu'après 6 h de culture avec 4 μg/ml de CHX, 60 % des cellules de myélome XG-1 ont montré des caractéristiques de mort cellulaire apoptotique précoce, c'est-à-dire une liaison de Annexm-V mais une non-incorporation de PI
EXEMPLE 5 Phagocytose des cellules apoptotiques La phagocytose des cellules apoptiques constitue un autre mode d'entrée des antigènes et joue un rôle majeur dans le phénomène d'amorçage croisé Récemment, plusieurs récepteurs phagocytaires ont été identifiés sur les PC obtenues en présence des sérums humains et il a été montré qu'un milieu conditionné pour des monocytes (MCM), qui conduit à une maturation des PC irréversible, régule en aval leur expression (6)
On a teinté en vert les PC immatures et matures en utilisant du PKH67-GL (Sigma) et on les a cultivées pendant 2 h pour permettre la libération du colorant non lié On a teinté en rouge des cellules XG-1 en utilisant du PKH26-GL (Sigma) selon les instructions du fabricant avant leur induction pour subir l'apoptose par CHX pendant 6 à 8 h Ensuite, on a cocultive les cellules XG-1 teintées en rouge avec des PC immatures ou matures teintées en vert dans un rapport de 1 1 dans du X-VIVO 15-2 % de HA selon le protocole décrit par Albert et al (6) Après 90 mm à 37°C, on a analyse les fluorescences vertes et rouges avec un appareil FACScan Pans les expériences de blocage, on a co-mcubé les cellules XG-1 et les DC a 4°C
Les marqueurs CD36, αvβ3 et αvβ5 ont été déterminés selon la méthode par marquage par anticorps monoclonaux et cytométrie de flux
Pour la coloration de αvβ5, on a tout d'abord incubé les cellules avec un anticorps mAb primaire αvβ5 (Chemicon Int, Temecula, CA), puis avec un anticorps de chèvre anti-lg de souris conjugue à FITC (Immunotech) On a réalisé les analyses avec un appareil FACScan (Becton Pickmson)
Les données provenant d'une expérience représentative parmi 3 sont représentées sur la figure 3 Plus d'un tiers des PC immatures ont englouti des XG-1 apoptotiques après 90 mm de coculture Seuls 10 à 12 % des PC immatures ont été teintées deux fois après coculture avec des cellules XG-1 non-apoptotiques La phacocytose des cellules tumorales par des PC immatures a été confirmée visuellement sur des cytospines de cocultures teintées La phagocytose a été complètement bloquée à basse température (figure 3) L'induction de la maturation des PC a produit une diminution de l'activité phagocytaire En effet, seuls 12 % des PC matures obtenues après addition de TNF-α ont internalise les XG-1 apoptotiques après 90 mm de coculture (figure 3) Une même diminution de la phagocytose a été obtenue avec des PC matures obtenues avec TNF-α + PGE2 (figure 3)
Pans les conditions de l'invention, les DC immatures ont exprimé des quantités élevées de CP36 et d'mtégrine αvβ5, en revanche l'intégrine αvβ3 n'a pas été détectée comme le montrent les résultats consignés dans le tableau III Ces résultats montrent également qu'en présence de TNF-α, les expressions de CP36 et αvβ5 ont été significativement diminuées respectivement de plus d'un demi (p - 0,002) et de 20-35 % (p = 0,03) Le PGE2 n'a pas eu d'effet supplémentaire avec le TNF-α pour la diminution de l'expression des récepteurs phagocytaires
EXEMPLE 6 Réponse aux chémokines des PC
On a répété l'opération avec six donneurs différents et on a mesuré l'intensité moyenne de fluorescence (MFI) Les résultats obtenus figurent dans le tableau 4
1 ) détection du récepteur CCR5
Pans ce test, on a utilisé l'anticorps monoclonal antι-CCR5 (Pharmingen, San Piego, CA, USA) pour détecter le récepteur CCR5 qui est un récepteur pour les chémokines inflammatoires On a incubé les cellules PC matures ou immatures obtenues dans le milieu
X-VIVO 15 - 2 % HA avec ledit anticorps marqué et on a mesuré l'expression de CCR5 pour un donneur Les résultats sont rassemblés dans les figures 4a, 4b et 4c
Pans cet exemple, on a recherché la présence du CCR5 sur les PC immatures et les PC matures produites dans du milieu X-VIVO 15 - 2 % HA
Le CCR5, a été détectable sur les PC immatures produites dans du milieu X-VIVO 15-2 % HA mais son expression a été significativement réduite par une incubation de 48 h avec du TNF-α (p = 0,03) Le PGE2 n'a pas induit de diminution significative supplémentaire (figure 4) (p = 0,25) 2) détection du récepteur CCR7
Comme aucun anticorps monoclonal n'était disponible pour mesurer l'expression de CCR7, on a testé la réponse des DC à MIP-3β dans un essai de chimiotactisme On a introduit les DC immatures et matures (2 x 105 cellules) dans 100 μl de RPMI-1 % de HA dans la chambre supérieure d'un dispositif de séparation de cellules constitué de deux chambres de culture cellulaire (une chambre inférieure et une chambre supérieure séparées par un filtre ayant des pores de 5 μm permettant le passage des cellules migratrices (dispositif Transwell de Costar, Cambridge, MA) Dans la chambre inférieure, on a introduit 600 μl de ELC/MIP-3β dilués à 100 ng/ml dans le même milieu Après une incubation de 4 h à 37°C, on a recueilli les cellules qui ont migre dans la chambre inférieure et on a comptées au microscope On a exprimé les résultats par le pourcentage des cellules d'entrée qui ont migré dans la chambre inférieure (pourcentage des cellules migratrices) La migration des DC provenant d'un donneur en l'absence et en présence de MIP-3β est représentée sur la figure 5A et les résultats obtenus avec les DC issues d'AC de 6 donneurs avec MIP-3β sont consignées sur la figure 5B Les DC immatures cultivées avec GM-CSF et IL-4 n'ont pas répondu à MIP-3β (pourcentage moyen de cellules qui ont migré 0,7 %, n=6). L'addition de TNF-α au cinquième jour a accru significativement la réponse des DC (p = 0,002) avec une moyenne de 14,2 % de cellules en migration (n = 6). Le PGE2 a agi de façon synergique avec TNF-α puisque 31 à 67 % (moyenne 48,8 %, n = 6) des DC maturees avec TNF-α + PGE2 ont migré jusqu'à la chambre inférieure du dispositif transwell pendant une durée d'incubation de 4 h à 37°C (p = 0,002) par rapport aux PC maturees avec du TNF-α Ceci a été associé à une légère augmentation de la migration spontanée des PC (une moyenne de 7 % des PC d'entrée a été trouvée dans la chambre inférieure en l'absence de MIP-3β)
EXEMPLE 7 Analyse des cytokmes
On a récolté les PC immatures et matures obtenues après 7 jours de culture dans du X-VIVO 15-2 % de HA, on les a lavées et on les a étalées à raison de 4 x 105/ml dans du RPMI 1640-5 % de FCS avec ou sans cellules L transfectées par 105/ml de CP40L, (fourni par le Pocteur Se Saeland, Schering-Plough, Pardilly, France) Lorsque cela était indiqué, on a ajouté de l'IFN-γ humain recombinant (1000 U/ml, R&D Systems) On a recueilli les surnageants 24 h à 30 h après stimulation et on les a stockés à -70°C On a mesuré les quantités de IL- 0 et p70 IL-12 par ELISA selon le mode opératoire du fabricant (R&P Systems)
Les PC immatures obtenues avec du GM-CSF/IL-4 n'ont pas produit p70 IL-12 mais ont produit des quantités très élevées de IL-10 après déclenchement par CP40 (tableau 5) L'addition de IFN-γ avec la stimulation par CP40 a entraîné une diminution de 30 fois de la production d'IL-10 par des PC immatures activées par CP40 L'induction de la maturation des PC avec du TNF-α a entraîné une diminution dramatique de la production de IL-10 induite par CP40 (réduction moyenne de 10 fois) en association avec l'induction de l'expression de IL-12 L'addition de IFN-γ a encore inhibé la production de IL-10 par des DC matures Ceci est en accord avec les rapports précédents montrant que l'IFN-γ pouvait être un cofacteur pour la production de IL-12 induite par CP40 (29,30) Toutefois, pour l'échantillon testé des trois autres patients, l'IFN-γ a réduit la production de IL-12 par PC obtenue en présence de GM-CSF/IL-4 et TNF-α Enfin, l'induction d'une PC totalement mature avec du TNF-α et PGE2 a entraîné une production réduite de IL-10 et IL-12 après stimulation par CP40 par rapport à TNF-α seul EXEMPLE 8 Réaction des lymphocytes mixtes allogènes (MLR) On a purifié des lymphocytes T non actives (HLA PR") à partir de sang périphérique de volontaires en bonne santé par deux cycles de sélection négative en utilisant des microbilles revêtues de CP14 et de CP19 (Pynal, Oslo, Norvège), suivi par un cocktail d'anticorps mAbs CP16, CP56 et HLA-PR (Immunotech) et de microbilles d'anti-lg de souris de chèvre (Pynal) La pureté des cellules T CP3+ était supérieure à 97 % On a ajouté des nombres progressifs de PC traitées par de la mitomycine (50 μg/ml) à 1 ,5 x 105 cellules T allogènes dans 200 μl de RPMI-5 % de SAB Après 5 jours de culture, on a mesuré la prolifération des cellules T par incorporation de thymidme tritiée (1 μCi/puits) pendant les 12 dernières heures On a exprime les résultats par les coûts moyens par minute (cpm) ± l'écart type déterminé dans des puits de culture sextuplés
Les résultats de la figure 6 montrent que la maturation des PC obtenues dans du X-VIVO 15-2 % de HA les a transformées en stimulateurs des cellules T allogèniques aussi puissants que les PC matures produites dans du RPMI-10 % de FCS Le TNF-α seul a donné les mêmes résultats que l'association de TNF-α et PGE2 Références
1 Hart, P N J 1998 Pendritic cells unique leukocyte populations which control the pnmary immune response Blood 90 3245
2 Banchereau, J and R M Stemman 1998 Pendritic cells and the control of immunity Nature 392 245
3 Fanger, N A , P Voigtlaender, C Liu S Swmk, K Wardwell, J Fisher, R F Graziano, L C Pfefferkorn and P M Guyre 1997 Charactenzation of expression, cytokine régulation, and effector fuπction of the high affmity IgG receptor Fc gamma RI (CP64) expressed on human blood dendritic cells J Immunol 58 3090
4 Fanger, N A , K Wardwell, L Shen, T F Tedder, and P M Guyre 1996 Type I (CP64) and type II (CP32) Fc gamma receptor-mediated phagocytosis by human blood dendritic cells J Immunol 157 541
5 Sallusto, F , M Cella, C Panieli, and A Lanzavecchia 1995 Pendntic cells use macropinocytosis and the mannose receptor to concentrate macromolecules m the major histocompatibility complex class II compartment downregulation by cytokmes and bactenal products [see comments] J Exp Med 182 389
6 Albert, M L , S F A Pearce, L M Francisco, B Sauter, P Roy, R L Silverstem, and N Bhardwaj 1998 Immature dendritic cells phagocytose apoptotic cells via alphavbetaδ and CP36, and cross-present antigens to cytotoxic T lymphocytes [In Process Citation] J Exp Med 788 1359
7 Sozzani, S , P Allavena, G P'Amico, W Luini, G Blanchi, M Kataura, T Imai, O Yoshie, R Bonecchi, and A Mantovani 1998 Pifferential régulation of chemokme receptors dunng dendritic cell maturation a model for their trafficking properties J Immunol 767 1083 Sallusto, F P Schaerh, P Loetscher, C Schaniel, P Lenig, C R Mackay, S Qm, and A Lanzavecchia 1998 Rapid and coordmated switch in chemokine receptor expression dunng dendritic cell maturation Eur J Immunol 28 2760
Lin C L , R M Sun R A Rahdon, J M Austyn, and J A Roake 1998 Pendntic cell chemotaxis and transendothelial migration are mduced by distinct chémokines and are regulated on maturation Eur J Immunol 28 AΛ ΛA
Tarte, K and B Klein 1999 Pendntic-based vaccine a promismg approach for cancer immunotherapy Leukemia 13 653
Nestlé, F O , S Alijagic, M Gilliet, Y Sun, S Grabbe, R Pummer, G Burg, and P Schadendorf 1998 Vaccination of melanoma patients with peptide- or tumor lysate-pulsed dendritic cells Nat Med 4 328
Romani, N , P Reider, M Heuer, S Ebner, E Kampgen, B Eibl, P Niederwieser, and G Schuler 1996 Génération of mature dendritic cells from human blood An improved method with spécial regard to clmical appiicabihty J Immunol Methods 196 137
Reddy, A , M Sapp, M Feldman, M Subklewe, and N Bhardwaj 1997 A monocyte conditioned médium is more effective than defmed cytokmes m mediatmg the terminal maturation of human dendritic cells Blood 90 3640
Jonuleit, H , U Kuhn G Muller, K Stembrink, L Paragnik, E Schmitt, J Knop and A H Enk 1997 Pro-inflammatory cytokmes and prostaglandms induce maturation of potent immunostimulatory dendritic cells under fetal calf serum-free conditions Eur J Immunol 273135
Murphy, G , B Tjoa, H Ragde, G Kenny, and A Boynton 1996 Phase I clmical trial T-cell therapy for prostate cancer using autologous dendritic cells pulsed with HLA-A0201 -spécifie peptides from prostate-specific membrane antigen Prostate 29 371 Tjoa, B A , S J Simmons, V A Bowes, H Ragde, M Rogers, A Elgamal, G M Kenny, O E Cobb, R C Ireton, M J Troychak, M L Salgaller, A L Boynton, and G P Murphy 1998 Evaluation of phase l/ll clmical trials in prostate cancer with dendritic cells and PSMA peptides Prostate 36 39
Thurner, B C Roder, P Pieckmann, M Heuer, M Kruse, A Glaser, P Keikavoussi, E Kampgen, A Bender, and G Schuler 1999 Génération of large number of fully mature and stable dendritic cells from leukapheresis products for clmical application J Immunol Methods 223 1
Sorun, A , A Fayyazi, R Gieseler, T Schlott, T M Runger, C Neumann, and J H Peters 1998 Spécifie autologous anti-melanoma T cell response m vitro usmg monocyte-denved dendritic cells Immunobiology 198 527
Anton, P , S Pabadghao, K Palucka, G Holm, and Q Yi 1998 Génération of dendritic cells from peripheral blood adhèrent cells m médium with human sérum Scand J Immunol 47 1 16
Kim, C J , T Prevette, J Cormier, W Overwijk, M Roden, N P Restifo, S A Rosenberg, and F M Marincola 1997 Dendritic cells mfected with poxviruses encodmg MART-1/Melan A sensitize T lymphocytes m vitro J Immunother 20 276
Rieser, C , G Bock, H Klocker, G Bartsch, and M Thurnher 1997 Prostaglandm E2 and tumor necrosis factor alpha cooperate to activate human dendritic cells synergistic activation of mterleukm 12 production J Exp Med 786 1603
Holtl, L , C Rieser, C Papesh, R Ramoner G Bartsch, and M Thurnher 1998 CD83+ blood dendritic cells as a vaccine for immunotherapy of metastatic renal-cell cancer [letter] [In Process Citation] Lancet 352 1358 Apostolopoulos, V , C Osinski, and I F McKenzie 1998 MUC1 cross- reactive Gai alpha(1 ,3)Gal antibodies in humans switch immune responses from cellular to humoral [see comments] Nat Med 4 315
Abdel-Wahab, Z , P DeMatos, D Hester, X D Dong, and H F Seigler 1998 Human dendritic cells, pulsed with either melanoma tumor cell lysates or the gp100 peptιde(280-288), induce pairs of T-cell cultures with similar phénotype and lytic activity Cell Immunol 186 63
Morse, M A , R E Coleman, G Akabani, N Niehaus, D Coleman, and H K Lyerly 1999 Migration of human dendritic cells after injection m patients with metastatic malignancies Cancer Res 59 56
Tarte, K , S J OIsen, Z Y Lu, E Legouffe, J F Rossi, Y Chang, and B Klein 1998 Clmical grade functional dendritic cells from patients with multiple myeloma are not mfected with Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus Blood 91 1852
Tarte, K , Z Y Lu, G Fiol, E Legouffe, J F Rossi, and B Klein 1997 Génération of virtually pure and potentially proliferating dendritic cells from non-CD34 apheresis cells from patients with multiple myeloma Blood 90 3482
Zhang, X G., J P Gaillard, N Robillard, Z Y Lu, Z J Gu, M Jourdan, J M Boiron, R Bataille, and B Klein 1994 Reproducible obtammg of human myeloma cell lines as a model for tumor stem cell study m human multiple myeloma Blood 83 3654
Kalmski, P , J H N Schuitemaker, C M U Hilkens, E A Wierenga, and M L Kapsenberg 1999 Final maturation of dendritic cells is associated with impaired responsiveness to IFN-g and to bacteπal IL-12 mducers decreased ability of mature dendritic cells to produce IL-12 dunng the interaction with Th cells J Immunol 162 3231 Snijders, A , P Kalmski, C M U Hilkens, and M L Kapsenberg 1998 High- level IL-12 production by human dendritic cells requires 2 signais Int Immunol 10 1593
Liu, P , M Rowley and B Van Ness 1996 Wildtype RB and p53 can suppress autocπne IL-6 production and prolifération of U266 myeloma cells Blood 88 389
Nazaruk, R A , R Rochford, M V Hobbs, and M J Cannon 1998 Functional diversity of the CD8+ T-cell response to Epstem-Barr Virus
(EBV) Implication for the pathogenesis of EBV-associated lymphoprohferative disorders Blood 91 3875
Carter, L and R W Dutton 1996 Type 1 and type 2 a fundamental dichotomy for ail T-cell subsets Curr Opin Immunol 8 336
Stembrink, K , H Jonuleit, G Muller, G Schuler, J Knop, and A H Enk 1999 lnterleukιn-10-treated human dendritic cells induce a melanoma- antigen-specific anergy m CD8+ T cells resulting m a failure to lyse tumor cells Blood 93 1634
Kalmski, P , J H N Schuitemaker C M U Hilkens, and M L Kapsenberg 1998 Prostaglandm E2 induces the final maturation of IL-12-defιcιent CD1a+CD83+ dendritic cells the levels of IL-12 are determmed dunng the final dendritic cell maturation and are résistant to further modulation
J Immunol 161 2804
Cella, M , D Scheidegger K Palmer Lehmann, P Lane, A Lanzavecchia, and G Alber 1996 Ligation of CD40 on dendritic cells triggers production of high levels of ιnterleukιn-12 and enhances T cell stimulatory capacity T-T help via APC activation J Exp Med 184 747 Rissoan, M-C , V Soumelis, N Kadowaki, G Grouard, F Bnere, R de Waal Malefyt and Y J Liu 1999 Reciprocal control of T helper cell and dendritic cell différenciation Science 283 1183
Zhou, L J and T F Tedder 1995 A distinct pattern of cytokine gène expression by human CD83+ blood dendritic cells Blood 86 3295
Tableau I Analyse phénotypique des DC
Milieu Cytokines Rendement Viabilité Moyenne des pourcentages de cellules positives (IMF)
(%) (%)
CD14 HLA-DR CD83 CP80 CD86
RPMI-FCS GM/IL-4 9 93 10(32) 100(180) 3 80 (72) 82 (53)
GM/IL-4/TNF 10 94 4 100(465) 86 (47) 98(120) 90(126)
GM/IL-4/TNF/PGE2 10 95 3 100(417) 94 (65) 98(190) 100(188)
XV-sérum AB GM/IL-4 12 92 80 (52) 100(115) 0 77 (32) 90 (22)
GM/IL-4/TNF 14 90 25 (69) 100(224) 25 (40) 95 (60) 85 (50)
GM/IL-4/TNF/PGE2 13 86 40 (50) 100(173) 52 (80) 90 (60) 100(95)
XV-plasma autologue GM/IL-4 18 90 40 (35) 100(90) 0 25 (30) 90 (65)
GM/IL-4/TNF 19 95 20 (29) 100(125) 20 (55) 35 (42) 90(110)
GM/IL-4/TNF/PGE2 23 92 12(60) 100(145) 80 (65) 80 (58) 110(160)
XV-sérum autologue GM/IL-4 22 89 50 (35) 100(95) 9(12) 28 (26) 85 (68)
GM/IL-4/TNF 25 90 26 (66) 100(120) 17(25) 39 (33) 90 (92)
GM/IL-4/TNF/PGE2 23 93 40 (70) 100(115) 59 (66) 72 (68) 95(150)
XV-HA GM/IL-4 16 89 21 (13) 100(172) 0 82 (46) 85 (80)
GM/IL-4/TNF 16 94 5 100(270) 55 (43) 100(110) 95 (97)
GM/IL-4/TNF/PGE2 20 90 3 100(251) 85 (66) 100(136) 100(133)
XV-HA = milieu X-VIVO 15-2 % d'albumine humaine GM = facteur GM-CSF
Tableau II
Analyse phénolytique de DC obtenues par culture dans du milieu
XV-HA complémenté avec GM-CSF, IL-4 et TNF-α avec ou sans PGE2
Cytokines CP14 HLA-PR CP83 CP80 CD86
GM/IL-4/TNF 2,6 ± 8,2 100 64 ± 19 100 100
Moyenne des %*** ± SP 299 ± 183 44 ±7 140 ±49 251 ±211
GM/IL-4/TNF/PGE2 1 ,5 ± 4 100 83 ±12** 100 100
Moyenne des %*** ± SP 265 + 124 61 ± 25* 190 ±85 345 ± 271
* p< 0,01 par comparaison aux cellules cultivées avec GM/IL-4/TNF ** p< 0,05 par comparaison aux cellules cultivées avec GM/IL-4/TNF *** moyenne des % = moyenne des % de cellules positives GM = facteur GM-CSF
Tableau III Profil des récepteurs des DC
Conditions de culture Moyenne des % de cellules positives (IFM) MR CP36 αvb3 αvb5
XV-HA GM/IL-4 98 (233) 88 (89) 0 87 (43) XV-HA GM/IL-4/TNF 80 (95)* 37 (47)** 0 68 (32)* XV-HA GM/IL-4/TNF /PGE2 74 (91 )* 25 (33)** 0 58 (36)*
XV-HA = milieu X-VIVO 15 - 2 % HA
* p < 0,01 par comparaison aux cellules cultivées avec GM/IL-4
** p < 0,05 par comparaison aux cellules cultivées avec GM/IL-4
Tableau IV : CCR5
Figure imgf000028_0001
Tableau V Production de cytokines par les DC
Conditions de culture Production de cytokines (pg/ml) sans stimulation stimulation avec CP40 stimulation avec CD 40 + IFN-γ
IL-10 IL-12 IL-10 IL-12 IL-10 IL-12
XV-HA GM/IL-4 25 ±9 1619 ±529 5,5 ±6,3 50 ±57 158 ±274
(16-35) (1105-2360) (0-11) (14-115) (0-476)
XV-HA GM/IL-4/TNF 0 137 ± 104 84 ±23 7±7 299 ±518
(62-285) (55-105) (0-21) (0-898)
XV-HA GM/IL-4/TNF/PGE2 64 ±61 7,2 ±8,8 0 16 ±29
(0-145) (0-18) (0-50)

Claims

REVENDICATIONS
Procédé pour l'obtention de cellules dendritiques, caractérisé en ce qu'il consiste
1 ) à cultiver, pendant 4 à 6 jours, des cellules mononuclées issues de cytaphérèse après mobilisation, dans un milieu exempt de sérum complémenté avec de l'albumine humaine en présence d'un facteur stimulant les colonies de granulocytes-macrophages (GM-CSF) et d'une interleukme (IL) bloquant la différentiation vers la voie macrophagique ,
2) à ajouter au milieu de culture du TNF-α et éventuellement un médiateur inflammatoire et à poursuivre la culture pendant environ 1 à 4 jours supplémentaires ,
3) à récupérer les cellules dendritiques ainsi formées Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que la culture de l'étape
1 ) est réalisée pendant 5 jours et celle de l'étape 2) pendant 2 jours , Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que l'mterleukine est l'ιnterleukιne-4 ou I'ιnterleukιne-13 Procédé selon l'une quelconque des revendication 1 à 3, caractérisé en ce que le médiateur inflammatoire est le facteur de nécrose tumorale alpha
(TNF-α) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le médiateur inflammatoire est le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α) et la prostaglandme E2 (PGE2) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que les cellules mononuclées sont des cellules mononuclées obtenues par cytaphérèse après mobilisation par chimiothérapie et/ou par au moins un facteur de croissance cellulaire Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le GM-CSF, l'mterleukine et le TNF-α sont chacun utilisés à raison de 1 à 1000 ng/ml de milieu Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que l'albumine humaine est utilisée à raison de 1 à 2 % (poids/volume de milieu) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que l'albumine humaine est utilisée à raison de 2 % (poids/volume de milieu) Cellules dendritiques irréversibles caractérisées en ce qu'elles sont αvβ3", αvβ5+, CCR5" et CCR7+ Utilisation des cellules dendritiques irréversibles αvβ3", αvβ5+, CCR5" et CCR7+ pour la préparation d'un agent d'immunothérapie utile pour le traitement de toute maladie impliquant le système immunitaire Procédé de traitement immunothérapeutique, caractérisé en ce qu'il consiste
1 ) à prélever à un patient à traiter des cellules mononuclées par cytaphérèse après mobilisation par chimiothérapie et/ou avec un facteur de croissance cellulaire et éventuellement congélation/décongélation ,
2) à cultiver, pendant 4 à 6 jours, des cellules mononuclées issues de cytaphérèse après mobilisation, dans un milieu exempt de sérum complémenté avec de l'albumine humaine en présence d'un facteur stimulant les colonies de granulocytes-macrophages (GM-CSF) et d'une interleukme (IL) bloquant la différentiation vers la voie macrophagique ,
3) à ajouter au milieu de culture du TNF-α et éventuellement un médiateur inflammatoire et à poursuivre la culture pendant environ 1 à 4 jours supplémentaires en les activant par des antigènes spécifiques ,
4) à récupérer les cellules dendritiques ainsi formées et activées
5) à réinjecter lesdites cellules dendritiques audit patient Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que lesdites cellules dendritiques sont congelées/décongelées avant d'être réinjectées audit patient
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AT412145B (de) * 2002-09-13 2004-10-25 Forsch Krebskranke Kinder Verfahren zur herstellung eines zellulären immuntherapeutikums auf basis von il-12-freisetzenden dendritischen zellen
EP1517740A1 (fr) * 2002-06-19 2005-03-30 NorthWest Biotherapeutics, Inc. Dispositifs de filtration tangentielle et methodes d'enrichissement des leucocytes
DE102008017990A1 (de) 2007-02-07 2009-10-08 Dagmar Briechle Verfahren zur Herstellung von Dendritischen Zell-ähnlichen Zellen und Einsatz dieser Zellen in in-vitro Testverfahren zur Bestimmung des Einflusses exogener Substanzen
CN115433714A (zh) * 2022-04-15 2022-12-06 广东汉氏干细胞生物科技有限公司 一种免疫细胞在治疗疾病中的应用及其制备方法

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1484064A1 (fr) * 2003-06-04 2004-12-08 Gesellschaft für Biotechnologische Forschung Composition thérapeutique contenant des cellules dendritiques et son utilisation

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998053048A1 (fr) * 1997-05-21 1998-11-26 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Procedes et compositions permettant d'obtenir des cellules dendritiques a partir de populations amplifiees de monocytes, et d'activer les cellules t

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998053048A1 (fr) * 1997-05-21 1998-11-26 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Procedes et compositions permettant d'obtenir des cellules dendritiques a partir de populations amplifiees de monocytes, et d'activer les cellules t

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALBERT M ET AL: "Immature dendritic cells phagocytose apoptotic cells via alphaVbeta5 and CD36, and cross-present antigens to cytotoxic T lymphocytes.", JOURNAL OF EXPERIMENTAL MEDICINE, (1998 OCT 15) 188 1359-68, XP000906793 *
FRESHNEY R.: "Culture of animal cells", 1987, ALAN R. LISS, INC., NEW YORK,US, XP002136509, 154920 *
KALINSKI P ET AL: "Prostaglandin E2 induces the final maturation of IL-12-deficient CD1a+ CD83+ dendritic cells: the levels of IL-12 are determined during the final dendritic cell maturation and are resistant to further modulation.", JOURNAL OF IMMUNOLOGY, (1998) 161 (6) 2804-9, XP002136508 *
SALLUSTO F ET AL: "Rapid and coordinated switch in chemokine receptor expression during dendritic cell maturation.", EUROPEAN JOURNAL OF IMMUNOLOGY, (1998) 28 2760-9, XP000906788 *
TARTE K ET AL: "Clinical-grade functional dendritic cells from patients with multiple myeloma are not infected with Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus.", BLOOD, (15 MAR 1998) 91 1852-7, XP000906761 *
TARTE K ET AL: "Generation of virtually pure and potentially proliferating dendritic cells from non-cd34 apheresis cells from patients with multiple myeloma.", BLOOD, (1997) 90 3482-95, XP000906762 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1517740A1 (fr) * 2002-06-19 2005-03-30 NorthWest Biotherapeutics, Inc. Dispositifs de filtration tangentielle et methodes d'enrichissement des leucocytes
EP1517740A4 (fr) * 2002-06-19 2006-05-03 Northwest Biotherapeutics Inc Dispositifs de filtration tangentielle et methodes d'enrichissement des leucocytes
US7695627B2 (en) 2002-06-19 2010-04-13 Northwest Biotherapeutics, Inc. Tangential flow filtration devices and methods for leukocyte enrichment
EP2298436A1 (fr) * 2002-06-19 2011-03-23 NorthWest Biotherapeutics, Inc. Dispositifs de filtration à flux tangentiel et procédés pour l'enrichissement des leucocytes
US8518636B2 (en) 2002-06-19 2013-08-27 Northwest Biotherapeutics, Inc. Tangential flow filtration devices and methods for leukocyte enrichment
EP3650110A1 (fr) * 2002-06-19 2020-05-13 NorthWest Biotherapeutics, Inc. Dispositif de filtration à flux tangentiel et procédés pour l'enrichissement des leucocytes
AT412145B (de) * 2002-09-13 2004-10-25 Forsch Krebskranke Kinder Verfahren zur herstellung eines zellulären immuntherapeutikums auf basis von il-12-freisetzenden dendritischen zellen
DE102008017990A1 (de) 2007-02-07 2009-10-08 Dagmar Briechle Verfahren zur Herstellung von Dendritischen Zell-ähnlichen Zellen und Einsatz dieser Zellen in in-vitro Testverfahren zur Bestimmung des Einflusses exogener Substanzen
CN115433714A (zh) * 2022-04-15 2022-12-06 广东汉氏干细胞生物科技有限公司 一种免疫细胞在治疗疾病中的应用及其制备方法

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