DE102008017990A1 - Verfahren zur Herstellung von Dendritischen Zell-ähnlichen Zellen und Einsatz dieser Zellen in in-vitro Testverfahren zur Bestimmung des Einflusses exogener Substanzen - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von Dendritischen Zell-ähnlichen Zellen und Einsatz dieser Zellen in in-vitro Testverfahren zur Bestimmung des Einflusses exogener Substanzen Download PDF

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Abstract

Das technische Gebiet der Erfindung ist die Biotechnologie. Die vorliegende Erfindung betrifft das Herstellungsverfahren eines neuen Typs dentritischer Zellen, bezeichnet als dentritische zellähnliche Zellen. Die Erfindung betrifft weiterhin den Einsatz dieser Zellen in In-vitro-Verfahren zur Bestimmung des Einflusses einer Testsubstanz, wie z.B. deren sensibilisierendes Potential. Die Generierung der dentritischen zellähnlichen Zellen erfolgt aus humanen Monozyten durch Kokultur mit allogenen Keratinozyten. Es resultieren dentritische zellähnliche Zellen, die sich bezüglich der Expression von Oberflächenproteinen, insbesondere von CD1a und CD1c, von bisher bekannten natürlichen und in-vitro hergestellten dentritischen Zellen unterscheiden. Die dentritischen zellähnlichen Zellen sind ökonomisch interessant, da bei ihrer Generierung der kostenintensive Einsatz von Cytokinen und der Zeitaufwand erheblich reduziert sind.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft das Verfahren zur Herstellung eines neuen Typs Dendritischer Zellen, bezeichnet als Dendritische Zell-ähnliche Zellen (Dendritic cell-related cell, DCrc), charakterisiert als CD11c+, HLA-DR+, CD86+, CD14–, CD1a–, CD1c–, Langerin– Zellen (+-positiv, –-negativ). Diese Zellen werden in-vitro generiert aus geeigneten Vorläuferzellen, wie Monozyten, mittels einer Kokultur mit Keratinozyten und bevorzugt unter Zugabe der Cytokine IL-4 und TGF-β, mindestens von TGF-β. Exogenes GM-CSF muss nicht zugegeben werden. Die Erfindung betrifft weiterhin den Einsatz der Dendritischen Zell-ähnlichen Zellen in in-vitro Testkits zur Bestimmung des Einflusses exogener Substanzen sowie das Herstellungsverfahren der Testkits.
  • Stand der Technik
  • Dendritische Zellen sind vorwiegend in umweltzugewandten körperlichen Regionen, wie der Haut, den Schleimhäuten oder dem Bronchialepithel lokalisiert. Ihre Aufgabe besteht im Aufspüren von eingedrungenen körperfremden Stoffen und der Aktivierung einer geeigneten Immunantwort dagegen. Im Lauf der Evolution haben sich auf der Oberfläche und im Zellinneren der Dendritischen Zellen Rezeptoren ausgebildet, die typische Merkmale pathogener Organismen, wie Bakterien, Pilzen oder Viren, erkennen. Der Kontakt mit solchen gefahrsignalisierenden Molekülen aktiviert die Dendritische Zelle. Sie wandert zu einem nahegelegenen Lymphknoten und durchläuft dabei einen Reifeprozess, der sie zur Antigenpräsentierenden Zelle macht. Im Lymphknoten kontaktiert sie diejenigen T Zellen, die zum präsentierten Antigen passen und aktiviert sie. Dieser Prozess wird als Sensibilisierung bezeichnet. Er ist Vorraussetzung für die Einleitung einer spezifischen Immunantwort. Eine Sensibilisierung kann aber nicht nur gegen pathogene Moleküle von Mikroorganismen erfolgen. Eine Sensibilisierung gegen allergene Substanzen, körpereigene Moleküle oder transplantierte allogene Zellbestandteile ist möglich.
  • Natürliche Dendritische Zellen differenzieren aus Vorläuferzellen des Knochenmarks. Peripher werden zwei Haupttypen Dendritischer Zellen voneinander unterschieden: die myeloiden und die plasmacytoiden Dendritischen Zellen. Diese unterscheiden sich hinsichtlich ihrer Lokalisation im Körper, ihrer spezifischen Aufgaben und der entsprechenden Proteinausstattung. Die typischen myeloiden Dendritischen Zellen der Epidermis werden als Langerhans-Zellen bezeichnet, die in der Dermis als Dermale Dendritische Zellen.
  • Dendritische Zellen exprimieren MHC II-Moleküle (HLA-DR+). Plasmacytoide Dendritische Zellen exprimieren das Antigen CD11c nicht (CD11c–), myeloide Dendritische Zellen sind CD11c+. Plasmacytoide Dendritische Zellen exprimieren das Antigen CD123 auffallend stark (CD123high). Langerhans Zellen exprimieren das Protein Langerin (CD207+). Dermale Dendritische Zellen dagegen exprimieren das Protein DC-SIGN (CD209+). Langerhans Zellen und Dermale Dendritische Zellen exprimieren die Antigene CD1a und CD1c (CD1a+; CD1c+) [1; 2].
  • Es ist bislang kein Verfahren bekannt, mit dem sich natürliche ex-vivo isolierte Dendritische Zellen in einer Zellkultur länger als 3 Tage vital halten lassen. Dadurch entziehen sich diese Zellen einer eingehenderen zellbiologischen Erforschung und biotechnologischen Anwendungsmöglichkeiten. Daher wurden Anstrengungen unternommen, Zellen in-vitro zu generieren, die in Ausstattung und Leistung physiologischen Dendritischen Zellen nahe kommen. Für die Generierung solcher Ersatzzellen für myeloide Dendritische Zellen (CD11c+) werden als Vorläuferzellen Monozyten aus dem peripheren Blut oder CD34+-Stammzellen in Zellkultur genommen, wobei den Zellkulturmedien Cytokine beigefügt werden.
  • Dabei wurden als Cytokine unterschiedliche Mischungen von IL-4, TGF-β, TNF-α und/oder IL-3 zugegeben, bei Generierung aus CD34+-Zellen auch zur Anreicherung IL-1 und IL-6. Gemeinsam ist das Einbeziehen des Cytokins GM-CSF in definierten Konzentrationen (angegeben in IU/ml oder ng/ml), so dass die generierten Zellen das Oberflächenantigen CD14 nicht weiter aufweisen (CD14–) und das Oberflächenantigen CD1a aufweisen (CD1a+) [3–9].
  • Im Patent DE4412794 wird beschrieben, mit welchen Wachstumsfaktoren und Cytokinen CD34+-Zellen in Kultur zunächst vermehrt und dann zu Dendritischen Zellen differenziert werden. Der Schritt der Differenzierung schließt die Zugabe von GM-CSF ein. Es entstehen CD1a+, CD1c+ Dendritische Zellen.
  • Im Patent EP 1259592 werden zwei Subtypen Dendritischer Zellen beschrieben, die sich aus Monozyten ableiten. Bei der Generierung wird GM-CSF eingesetzt. Einer der beschriebenen Subtypen ist CD1a–, der andere CD1a+. Beide sind CD1c+.
  • Im Patent EP1280889 wird zur Generierung eine Kombination aus dem Cytokin IL-15 angegeben und einem hier als Wachstumsfaktor bezeichneten Stoff, der bevorzugt GM-CSF ist. In Beispiel 7 des Patents wird dargestellt, dass das Weglassen von GM-CSF bewirkt, dass keine funktionellen Dendritischen Zellen entstehen, sondern dass es bei CD14+-Vorläuferzellen bleibt.
  • Im Patent WO0240646 werden Vorläuferzellen durch Zugabe von IFN-β/IL-3 zu Dendritischen Zellen differenziert. Im Patent WO03 038072 wird als zusätzlicher Differenzierungsfaktor eine Kokultur mit γδ-T Zellen beschrieben. Beide Methoden, die auf Zugabe von GM-CSF verzichten, generieren Dendritische Zellen, die weiterhin das für Monozyten typische Oberflächenprotein CD14 exprimieren und denen das Oberflächenprotein CD1a fehlt (CD14+, CD1a–).
  • Im Patent US2005112762 bezieht sich die Beschreibung von Zellkulturbedingungen ohne Zugabe exogener Cytokine nicht auf das Generieren von Denditischen Zellen aus Vorläuferzellen, sondern darauf, die Vitaltät der wenigen im Blut bzw. in PBMC-Präparationen bereits enthaltenen physiologischen Dendritischen Zellen kurzfristig zu erhalten.
  • Im Patent FR2853905 werden Monozyten zur Generierung Dendritischer Zellen in einem Medium kultviert, in dem vorab mesenchymale Stammzellen kultiviert wurden. Die Erfinder vermuten, dass die mesenchymalen Stammzellen unter anderem das Medium mit GM-CSF konditionieren. Es resultieren Dendritische Zellen, deren Phänotyp typischen für 6 Tage mit GM-CSF und IL-4 aus Monozyten generierten Dendritischen Zellen gleichkommt (damit CD1a+, CD1c+).
  • Im Patent EP0857971 werden Bedingungen von Kokulturen aus Keratinozyten und Vorläuferzellen Dendritischer Zellen, bevorzugt CD34+, beschrieben. Ohne Zugabe von Cytokinen entstehen hierbei CD1a+-Zellen, die Charakteristika von Langerhans Zellen (Birbeck-Granuli, damit Langerin+) aufweisen.
  • Im Patent DE10297513 werden Bedingungen von Kokulturen aus Keratinozyten und Vorläuferzellen Dendritischer Zellen, bevorzugt Monozyten, beschrieben, wobei GM-CSF exogen zugegeben wird.
  • Da Dendritische Zellen unter anderem an der Entwicklung von Allergien beteiligt sind, bietet sich die Verwendung dieser Zellen in tierversuchsfreien Testverfahren zur Bestimmung des sensibilisierenden Potentials einer Substanz an. LCSA (loose-fit coculture-based sensitization assay) ist ein solches in-vitro Testverfahren [10]. In diesem Test werden normale humane Keratinozyten und allogene Monozyten in einem serumfreien Medium bevorzugt für 6 Tage kokultiviert, wobei dreimalig die Cytokine IL-4, GM-CSF und TGF-β zugegeben werden. Dabei werden die Keratinozyten aktiviert und die Monozyten in Richtung Dendritische Zellen generiert mit dem resultierenden Phänotyp CD14–, HLA-DR+, CD86+, CD1a–, CD1c+, Langerin–. Die Testsubstanzen werden zu diesen Zellen zugegeben und bevorzugt nach 2 Tagen wird die Veränderung in der CD86-Expression als Parameter für erfolgte Sensibilisierung bestimmt.
  • Die Erfindung
  • Bei den Arbeiten zur Verfeinerung des LCSA ist den Erfindern aufgefallen, dass die mit Keratinozyten in serumfreiem Medium kokultivierten Monozyten nach einmaliger Zugabe der Cytokine IL-4, GM-CSF und TGF-β bereits nach 2 Tagen Dendriten ausbilden. Experimente mit bekannten Kontaktallergenen zeigten, dass diese Zellen zur Bestimmung des sensibilisierenden Potentials geeignet sind. Gemessen wurde mittels Durchflusszytometrie die Kontaktallergen-induzierte Zunahme der Mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) von CD86. Zellen aus 6-tägigen Kokulturen mit 3-maliger Zugabe von GM-CSF, IL-4 und TGF-β zeigten gleiche Ergebnisse hinsichtlich der Erhöhung der CD86-Expression wie Zellen aus 2-tägigen Kokulturen mit einmaliger Zugabe der Cytokine. In weiteren Experimenten wurden die Cytokine IL-4, GM-CSF und TGF-β in Kombinationen aus 2 Cytokinen oder einzeln zu den Kokulturen aus Keratinozyten und Monozyten zugegeben. Es zeigte sich, dass auch bei Zugabe von IL-4 + TGF-β und von nur TGF-β jeweils ohne Zugabe von GM-CSF ein Zelltyp entsteht, der zur Bestimmung des sensibilisierenden Potentials geeignet ist. Der Phänotyp dieses neuen Zelltyps ist CD11c+, HLA-DR+, CD86+, CD14–, CD1a–, CD1c–, Langerin–. Damit weist dieser neue Zelltyp einerseits Eigenschaften Dendritischer Zellen auf, andererseits fehlen charakteristische Merkmale bisher bekannter Dendritischer Zellen. Daher wurde für diesen neuen Zelltyp die Bezeichnung Dendritische Zell-ähnliche Zelle gewählt. In der englischsprachigen Fachliteratur werden diese Zellen als „Dendritic cell-related cell” (DCrC) bezeichnet werden.
  • Die kokultivierten normalen humanen Keratinozyten und allogenen Monozyten bilden ein komplexes System mit vielfältigen und bislang nicht erschöpfend charakterisierten Interaktionen aus, die temporäre Zellkontakte und den Einfluss wechselseitiger Signalsubstanzen einschließen. Wesentlich ist, dass die Keratinozyten in ein aktiviertes Stadium gelangen, erkennbar z. B. an einer hohen Sekretionsrate der Metalloproteinase MMP-9. Das zentrale exogene Cytokin für die Aktivierung der Keratinozyten und die Generierung der Dendritischen Zell-ähnlichen Zellen ist TGF-β. Die Keratinozyten sezernieren geringe Mengen an endogenem GM-CSF ins Kulturmedium, wobei aber sicher ist, dass in Verfahren zur Generierung Dendritischer Zellen aus Vorläuferzellen in Monokultur eine Verminderung der exogen zugegebenen Konzentration an GM-CSF auf das Niveau des von kokultivierten Keratinozyten sezernierten GM-CSF nicht zur Entstehung des neuen Zelltyps der Dendritischen Zell-ähnlichen Zellen führt.
  • Die Integration der Dendritischen Zell-ähnlichen Zellen in das LCSA-Verfahren [10] reduziert dessen Kosten durch Ersparnis an Zeit und an kostenintensiven Cytokinen. Die Erfinder haben im so verfeinerten LCSA die Kontaktallergene TNBS, PPD, Isoeugenol, Hexylcinnamaldehyd, Nickel und Cobalt, sowie das Irritans SDS, das bakterielle pathogene Antigen LPS und den Lösungsvermittler DMSO getestet. Die Schwelle zur allgemeinen Toxizität der Testsubstanzen kann über die Aufnahme von 7-AAD oder von Propidiumiodid in die Testzelle bestimmt werden. Die Suche nach Parametern zusätzlich zu CD86 zur Erfassung des sensibilisierenden Potentials führte zum Einbeziehen der Bestimmung der Sekretion des inflammatorischen Cytokins IL-6 und des Chemokins MIP-1β [11] mittels ELISA. Dabei zeigte sich, dass von den getesteten Kontaktallergenen nur die Metalle eine Induktion der Sekretion von IL-6 und MIP-1β induzieren.
  • Weitere Experimente der Erfinder zeigten, dass Messungen von T Lymphozytenproliferation integriert werden können und zusätzliche Parameter zur Beurteilung der immunologischen Aktivität von Testsubstanzen liefern können.
  • Zitierte Literatur
    • 1 Steinman R. M., Banchereau J. (2007) Taking dendritic cells into medicine. Nature 449, 419–426
    • 2 Medzhitov R. (2007) Recognition of microorganisms and activation of the immune response. Nature 449, 819–826
    • 3 Sallusto F., Lanzavecchia A. (1994) Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor a. J. Exp. Med. 179: 1109–1118.
    • 4 Schuler G., Brang D., Romani N. (1995) Production and properties of large numbers of dendritic cells from human blood. In: Dendritic Cells in Fundamental and Clinical Immunology. Eds. J. Banchereau and D. Schmitt. Vol. 2, pp. 43–52. Plenum Press, New York.
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    • 7 Caux C., Vanbervliet B., Massacrier C., Dezutter-Dambuyant C., et al. (1996) CD34+ hematopoietic progenitors from human cord blood differentiate along two independent dendritic cell pathways in response to GM-CSF+TNF alpha. J. Exp. Med. 184, 695–706.
    • 8 Geissmann F., Prost C., Monnet J., Dy M., et al. (1998) Transforming growth factor b1, in the presence of granulocyte/macrophage colony-stimulating factor and interleukin 4, induces differentiation of human peripheral blood monocytes into dendritic Langerhans cells. J. Exp. Med. 187, 961–996.
    • 9 Patente KR20070101233 ; WO2007131575 ; US2007154877 ; FR2891551 ; US2005008623 ; US2003134419 ; US5849589 ; US6274378 ; WO0109288 ; WO03 050271
    • 10 Schreiner M., Peiser M., Briechle D., Stahlmann R., Zuberbier T., Wanner R. (2007) A loose-fit coculture of activated keratinocytes and dendritic cell-related cells for prediction of sensitizing potential. Allergy 62, 1419–1428.
    • 11 Hirota M., Moro O. (2006) MIP-1beta, a novel biomarker for in-vitro sensitization test using human monocytic cell line. Toxicol. In Vitro 20, 736–742; JP2005278628
  • Das Verfahren zur Generierung der Dendritischen Zell-ähnlichen Zellen wird angegeben. Zudem werden Anwendungen der Zellen in Testkits zur Bestimmung des Einflusses exogener Substanzen und das Herstellungsverfahren der Testkits angegeben. Die angegebenen Beispiele erläutern die Erfindung, ohne dass sie einschränkend zu verstehen sind.
  • Verfahren zur Generierung der Dendritischen Zell-ähnlichen Zellen
  • 1. Vorarbeiten
    • 1.1 Menschliche Haut kann in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki als übrigbleibendes Material nach plastischer Chirurgie erhalten werden. Eine Suspension von Keratinozyten kann nach üblichen Verfahren, wie z. B. in [10] beschrieben hergestellt werden. Dabei werden nach Inkubation in Dispase I (z. B. von Roche, Mannheim) epidermale Streifen von der Dermis abgezogen und dann in PBS/0.25% Trypsin (z. B. von Biochrom, Berlin) inkubiert. Zellvereinzelung wird erreicht durch Passagieren durch ein 40 μm Zellsieb (z. B. von BD, Heidelberg). Die Zellen werden mit PBS gewaschen, in ein serumfreies Zellkulturmedium, wie z. B. KGM-2 von PromoCell (Heidelberg) überführt und dann in Zellkulturflaschen, z. B. von Corning (Schiphol-Rijk, Niederlande) ausgesät. Die Keratinozytenkulturen werden bis zum Erreichen der Konfluenz bei Mediumwechsel an jedem 2. Tag kultiviert. Die Ernte erfolgt mittels Trypsinierung. Die Zellen können direkt verwendet oder für eine spätere Verwendung cryokonserviert werden, z. B. in FCS/10% DMSO (FCS z. B. von Biochrom, DMSO z. B. Hybrimax von Sigma (München)).
    • 1.2 Mononukleäre Zellen des peripheren menschlichen Blutes (PBMC) können z. B. aus buffy-coat Präparationen (erhältlich z. B. von DRK Blutspendediensten) durch Dichtegradientenzentrifugation über Ficoll-Paque (z. B. von Biochrom) angereichert werden. PBMC können direkt verwendet oder cryokonserviert werden (z. B. wie oben für Keratinozyten beschrieben). Alternativ kann aus PBMC eine weitere Anreicherung von Monozyten erreicht werden z. B. über positive Selektion CD14+-Zellen nach Markierung mit magnetisierten anti-CD14 Antikörpern (z. B. von Miltenyi Biotech, Bergisch-Gladbach). Gereinigte Monozyten können direkt verwendet oder z. B. wie oben beschrieben cryokonserviert werden.
  • 2. Ansetzen der Kokultur und Generierung der Dendritischen Zell-ähnlichen Zellen
  • Keratinozyten werden z. B. auf 12-Loch Platten (Costar) mit einer Dichte von 2–6 × 104 Zellen/cm2 z. B. in KGM-Medium ausgesät und kultiviert bis etwa eine ¼ bis ganze Konfluenz erreicht ist. PBMC werden z. B. in KGM aufgenommen und auf die Keratinozyten mit einer Dichte von 1–3 × 106 Zellen/cm2 ausgesät. Nach einer Inkubation von typischerweise 2 h werden nicht-adhärente Zellen abgespült. Alternativ zu dieser Methode der Monozytenreinigung können vorab magnetisch isolierte Monozyten auf die Keratinozyten ausgesät werden. Hierbei wird für die Monozyten eine Dichte von 2–5 × 105 Zellen/cm2 gewählt. Wahlweise kann auch hierbei zur noch weiteren Reinigung der Monozyten nach 2 h ein Abspülen nicht-adhärenter Zellen erfolgen.
  • IL-4 (z. B. von Immuntools, Friesoythe) in Konzentrationen von 10 ng/ml bis 1000 ng/ml, bevorzugt 100 ng/ml und TGF-β (z. B. TGF-β1 von R&D, Wiesbaden-Nordenstadt) in Konzentrationen von 1 ng/ml bis 100 ng/ml, bevorzugt 10 ng/ml werden zugegeben oder nur TGF-β in Konzentrationen von 1 ng/ml bis 100 ng/ml, bevorzugt 10 ng/ml wird zugegeben. Innerhalb von 2–3 Tagen generieren die Monozyten zu Dendritischen Zell-ähnlichen Zellen mit dem Phänotyp CD11c+, HLA-DR+, CD86+, CD14–, CD1a–, CD1c–, Langerin–.
  • Testkit zur in-vitro Bestimmung des Einflusses exogener Testsubstanzen auf die Dendritischen Zell-ähnlichen Zellen, bestehend aus einer lockeren Kokultur von Keratinozyten und beweglichen Dendritischen Zell-ähnlichen Zellen, die aus Monozyten durch das Cytokin TGF-β allein oder in Kombination mit dem Cytokin IL-4 in Anwesenheit der Keratinozyten generiert werden und das Herstellungsverfahren des Testkits
  • Ein Testkit wird z. B. in einer 12-Loch Testschale (z. B. Costar Cell Culture Cluster von Corning Inc.) mit Zellen hergestellt, wie im Abschnitt „Verfahren zur Generierung der Dendritischen Zell-ähnlichen Zellen”, „2. Ansetzen der Kokultur und Generierung der Dendritischen Zell-ähnlichen Zellen” beschrieben.
  • Anwendungsbeispiel 1
  • Bestimmung der Konzentration, bei der eine möglicherweise sensibilisierende Testsubstanz eine halbmaximale Erhöhung der CD86-Expression auf den im Testkit enthaltenen Dendritischen Zell-ähnlichen Zellen induziert
  • Ein Testkit wird wie im oben angegebenen Verfahren zur Herstellung eines Testkits hergestellt. Die zu testende Substanz wird in einem geeigneten Lösungsmittel (wie Wasser, DMSO, Ethanol, Ölgemische) in maximal möglicher Konzentration gelöst. Den Vertiefungen der Testschale mit den Kokulturen wird zu jeweils 2 ml Zellkulturmedium KGM-2 mit Supplement Mix (PromoCell) [als Beispiel für mögliche serumfreie Zellkulturmedien] die Testsubstanz in einer Verdünnungsreihe zugegeben. Dabei wird die Testsubstanz vor Zugabe zum Testkit so verdünnt, dass in den Kokulturen gleiche Endkonzentrationen des Lösungsmittels vorliegen. Es werden mindestens Doppelwerte angelegt.
  • Das Testkit wird nach Zugabe der Testsubstanz 12–72 h lang in einem Brutschrank inkubiert, wobei eine Inkubationszeit von 24 h bevorzugt wird. Danach werden die nicht-adhärenten Zellen mit dem Zellkulturmedium abgezogen und in FACS-Röhrchen überführt (z. B. 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube, BD Falcon, Heidelberg, Deutschland). Nach einer Zentrifugation (bevorzugt 330 rpm, 4 min., 20°C) werden für spätere ELISA-Assays die Medien abgenommen, ihr exaktes Volumen bestimmt und bei –80°C gelagert. Die Zellen werden 2× in PBS gewaschen und mit je 5 μl der Antikörperlösungen CD11c:FITC (z. B. von Serotec) und CD86-PE (z. B. von BD) für die FACS-Analyse gefärbt. 10 Minuten vor der Messung im FACS wird mit 20 μl 7-AAD (z. B. Cell Viability Solution von BD) gefärbt. Es werden nur Proben mit mehr als 85% vitalen Zellen hinsichtlich ihrer CD86-Expression ausgewertet. Die mittleren Fluoreszenzintensitäten (MFI) für CD86 werden für CD11c-positive Zellen bestimmt. Die MFI-Werte der Testsubstanz-Proben werden durch den MFI-Mittelwert der entsprechenden Lösungsmittel-Proben dividiert. Die resultierenden Faktoren werden gegen die Konzentration der Testsubstanz aufgetragen, und aus der Kurve wird die Konzentration der Testsubstanz bestimmt, die zu halbmaximaler Erhöhung der MFI-Werte für CD86 führt. Nach Durchführung unabhängiger Tests unter Verwendung von Zellen, die von jeweils verschiedenen Spender für die Keratinozyten und für die Monozyten stammen, ergibt sich die Konzentration, die eine mittlere halbmaximale CD86-MFI-Erhöhung bewirkt.
  • Anwendungsbeispiel 2
  • Bestimmung der immunstimulatorischen oder immunsupprimierenden Eigenschaften einer Testsubstanz
  • In diesem Beispiel wird die Testsubstanz-abhängige Reifung der Dendritischen Zell-ähnlichen Zellen mit einem anschließenden T Lymphozyten-Proliferationstest verbunden. Das Testkit wird angesetzt, wie in Anwendungsbeispiel 1 beschrieben. Ebenso werden die Testsubstanzen zugegeben und deren Einfluss z. B. 24 h nach Zugabe der Testsubstanz auf die Expression von CD86 bestimmt. Zusätzlich werden aus den Kulturmedien durch ELISA die sekretierten Mengen von IL-6 (z. B. IL-6 DuoSet, R&D Systems, Wiesbaden-Nordenstadt) und MIP-1β (z. B. CCL4/MIP-1 beta DuoSet, R&D Systems) untersucht. Ein Aliquot der Dendritischen Zell-ähnlichen Zellen wird mit frischen allogenen T Lymphozyten z. B. im Verhältnis 1:10 gemischt und erneut in Kultur genommen. Als Medium kann z. B. KGM-2 dienen. Die T-Lymphozyten können z. B. aus buffy coat Präparationen (z. B. von DRK Blutspendediensten) durch Dichtegradientenzentrifugation über Ficoll-Paque (z. B. von Biochrom) angereichert und durch magnetisches Sortieren (MACS, magnetically activated cell sorting) (Pan T Cell Isolation Kit II, human, Miltenyi, Bergisch Gladbach) weiter gereinigt worden sein. Vor dem Mischen mit den Dendritischen Zell-ähnlichen Zellen werden die gereinigten T Lymphozyten mit dem Farbstoff CFSE (z. B. CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit, Invitrogen-Molecular Probes, Karlsruhe) angefärbt. Nach einer Inkubationszeit der Kokulturen aus T Zellen und Dendritischen Zell-ähnlichen Zellen von z. B. 6 Tagen wird die Proliferationsrate der T Zellen im FACS über die Verdünnung des ursprünglich inkorporierten CFSE bestimmt. Wahlweise können auch autologe T Zellen eingesetzt werden.
  • Für die Bestimmung immunsupprimierender Eigenschaften einer Testsubstanz wird der oben beschriebenen Kokultur aus T Lymphozyten und Dendritischen Zell-ähnlichen Zellen ein Aktivator der T Lymphozytenproliferation (z. B. Dynabeads CD3/CD8 T Cell Expander, Invitrogen-Dynal, Karlsruhe) zugegeben (z. B. 1 bead pro 10 T Zellen ohne Zugabe von exogenem IL-2) und der mögliche hemmende Einfluss der Testsubstanz durch Vergleich mit einem Kontrollansatz ohne Testsubstanz über CFSE-Verdünnung im FACS gemessen.
  • In einem weiteren Ansatz können regulatorische CD4+CD25+FoxP3+ T Zellen, gereinigt aus PBMC z. B. mittels CD4+CD24+ Regulatory T Cell Isolation Kit (Miltenyi) in die Kokultur aus T Lymphozyten und Dendritischen Zell-ähnlichen Zellen integriert werden, z. B. in einem Verhältnis von T Zellen/regulatorischen T Zellen von 1/1 (wie beschrieben in Peiser M., Recht A., Wanner R. (2007) Allergy 62, 773–780).
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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  • Zitierte Nicht-Patentliteratur
    • - Peiser M., Recht A., Wanner R. (2007) Allergy 62, 773–780 [0028]

Claims (3)

  1. Verfahren zur Herstellung von Dendritischen Zell-ähnlichen Zellen, wobei diese aus Vorläuferzellen wie Monozyten in Kokultur mit Keratinozyten unter Zugabe von TGF-β allein oder in Kombination mit IL-4 in serumfreiem Medium generiert werden, und wobei IL-4 in einer Konzentration von 10 ng/ml bis 1000 ng/ml zugegeben werden kann, und wobei TGF-β in einer Konzentration von 1 ng/ml bis 100 ng/ml zugegeben wird, und wobei die resultierenden Dendritischen Zell-ähnlichen Zellen charakterisiert sind durch den Phänotyp CD11c+, HLA-DR+, CD86+, CD14-, CD1a-, CD1c-, Langerin-.
  2. In-vitro Testkit zur Bestimmung des Einflusses exogener Testsubstanzen auf die Dendritischen Zell-ähnlichen Zellen, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Kokultur von Keratinozyten und Dendritischen Zell-ähnlichen Zellen hergestellt nach Anspruch 1 enthält.
  3. Verwendung von in-vitro Testkits zur Bestimmung des Einflusses exogener Testsubstanzen auf die Dendritischen Zell-ähnlichen Zellen, dadurch gekennzeichnet, dass die Testkits eine Kokultur von Keratinozyten und Dendritischen Zell-ähnlichen Zellen hergestellt nach Anspruch 1 enthalten.
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