JP2003511064A - ヒト末梢血単核細胞由来の樹状細胞の産生および特徴付け - Google Patents
ヒト末梢血単核細胞由来の樹状細胞の産生および特徴付けInfo
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Abstract
(57)【要約】
本発明において、樹状細胞（ＤＣ）組成物が開示される。本発明においてまた、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離および培養することによってこのような組成物を得るための方法が、開示される。本発明においてさらに、異なる２つの成熟段階［ＤＣ前駆体（ＤＣＰ）段階および成熟ＤＣ段階］のＤＣを同定および単離する方法が、記載される。本発明において、このようなＤＣ組成物を利用する、Ｔ細胞を活性化する方法もまた、記載される。
Description
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、樹状細胞（ＤＣ）組成物、このようなＤＣ組成物を得るためにヒト
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離および培養する方法、異なる２つの成熟段階
［ＤＣ前駆体（ＤＣＰ）段階および成熟ＤＣ段階］のＤＣを同定および単離する
方法を提供する。本発明はさらに、ＤＣ組成物を使用してＴ細胞を活性化する方
法に関する。
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離および培養する方法、異なる２つの成熟段階
［ＤＣ前駆体（ＤＣＰ）段階および成熟ＤＣ段階］のＤＣを同定および単離する
方法を提供する。本発明はさらに、ＤＣ組成物を使用してＴ細胞を活性化する方
法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
文献報告は、異なる研究者が、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の単離およびインビト
ロでの生成についての多数の技術を使用することを示し、これらの多くは労働集
約的である。ＡＰＣと呼ばれる多くの細胞型およびインビトロ培養でこれらを単
離および活性化するためのプロトコールが、存在する。さらに、所定のＡＰＣ型
において、単離手順および活性化手順に関して変動がある。これは、ＡＰＣとし
て非常に効果的に機能するＤＣに関して特にあてはまる。
ロでの生成についての多数の技術を使用することを示し、これらの多くは労働集
約的である。ＡＰＣと呼ばれる多くの細胞型およびインビトロ培養でこれらを単
離および活性化するためのプロトコールが、存在する。さらに、所定のＡＰＣ型
において、単離手順および活性化手順に関して変動がある。これは、ＡＰＣとし
て非常に効果的に機能するＤＣに関して特にあてはまる。
【０００３】
ＤＣは、例えば、多工程密度勾配ベースの単離、モノクローナル抗体パニング
（ｐａｎｎｉｎｇ）、系統ポジティブ細胞の除去（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）および
血清補充された培養（Ｍａｃａｔｏｎｉａ，Ｓ．Ｅ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
７４：３９９−４０６，１９９１；Ｍａｒｋｏｗｉｃｚ，Ｓ．およびＥｎｇｌ
ｅｍａｎ，Ｅ．Ｇ．、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８５：９５５−９６１，１
９９０；Ｙｏｕｎｇ，Ｊ．Ｗ．およびＳｔｅｉｎｍａｎ，Ｒ．Ｍ．、Ｃｅｌｌ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１１：１６７−１８２，１９８７）を組み込む種々の方法論
を使用して単離および精製された。報告された単離手順の全てが、ヒツジ赤血球
および／またはウシ胎仔血清のいずれかを使用し、これらの両方は、潜在的に免
疫原性な外来抗原（Ａｇ）および／または精製ＤＣの有用性を防げ得る免疫原（
例えば、選択された免疫原でＴ細胞を刺激する）を含む。要約すると、先行技術
は、複雑な細胞分離方法および血清ならびにサイトカインの存在下での細胞培養
が、成熟ＤＣの生成に必要であることを教示する。
（ｐａｎｎｉｎｇ）、系統ポジティブ細胞の除去（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）および
血清補充された培養（Ｍａｃａｔｏｎｉａ，Ｓ．Ｅ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
７４：３９９−４０６，１９９１；Ｍａｒｋｏｗｉｃｚ，Ｓ．およびＥｎｇｌ
ｅｍａｎ，Ｅ．Ｇ．、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８５：９５５−９６１，１
９９０；Ｙｏｕｎｇ，Ｊ．Ｗ．およびＳｔｅｉｎｍａｎ，Ｒ．Ｍ．、Ｃｅｌｌ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１１：１６７−１８２，１９８７）を組み込む種々の方法論
を使用して単離および精製された。報告された単離手順の全てが、ヒツジ赤血球
および／またはウシ胎仔血清のいずれかを使用し、これらの両方は、潜在的に免
疫原性な外来抗原（Ａｇ）および／または精製ＤＣの有用性を防げ得る免疫原（
例えば、選択された免疫原でＴ細胞を刺激する）を含む。要約すると、先行技術
は、複雑な細胞分離方法および血清ならびにサイトカインの存在下での細胞培養
が、成熟ＤＣの生成に必要であることを教示する。
【０００４】
さらに、種々の先行技術の方法によって精製されたＤＣの特徴において、顕著
な差異（例えば、細胞表面マーカー発現における差異）があるようである。これ
らの差異を考慮して、少なくとも３つのＤＣのサブタイプが存在することが提唱
された（Ｇｒａｂｂｅ，Ｓ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １６：１１７−
１２１，１９９５；Ｔｈｏｍａｓ，Ｒ．およびＬｉｐｓｋｙ，Ｐ．Ｅ．、Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．１５３：４０１６−４０１２８，１９９４）。これらのおのおの
は、そのＡｇ提示能に関して異なる特性および特徴を有し得る。
な差異（例えば、細胞表面マーカー発現における差異）があるようである。これ
らの差異を考慮して、少なくとも３つのＤＣのサブタイプが存在することが提唱
された（Ｇｒａｂｂｅ，Ｓ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １６：１１７−
１２１，１９９５；Ｔｈｏｍａｓ，Ｒ．およびＬｉｐｓｋｙ，Ｐ．Ｅ．、Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．１５３：４０１６−４０１２８，１９９４）。これらのおのおの
は、そのＡｇ提示能に関して異なる特性および特徴を有し得る。
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、１つの局面において、ヒト血液サンプルから以下によって特徴付け
られるＤＣを得るための方法を含む：（ｉ）表面Ａｇ ＨＬＡ−ＤＲ（ヒト白血
球Ａｇ ＤＲ）についてポジティブでありかつ特定の細胞系統に対して特異的な
表面抗原についてネガティブ（すなわち、ＣＤ３ネガティブ、ＣＤ１４ネガティ
ブ、ＣＤ１６ネガティブ、ＣＤ１９ネガティブ、ＣＤ２０ネガティブおよびＣＤ
５６ネガティブ；本明細書中で「ｌｉｎ−」として示す）である表現型、ならび
に（ｉｉ）ヒト白血球と同時培養される場合に、一次免疫応答および二次免疫応
答を誘発する能力。
られるＤＣを得るための方法を含む：（ｉ）表面Ａｇ ＨＬＡ−ＤＲ（ヒト白血
球Ａｇ ＤＲ）についてポジティブでありかつ特定の細胞系統に対して特異的な
表面抗原についてネガティブ（すなわち、ＣＤ３ネガティブ、ＣＤ１４ネガティ
ブ、ＣＤ１６ネガティブ、ＣＤ１９ネガティブ、ＣＤ２０ネガティブおよびＣＤ
５６ネガティブ；本明細書中で「ｌｉｎ−」として示す）である表現型、ならび
に（ｉｉ）ヒト白血球と同時培養される場合に、一次免疫応答および二次免疫応
答を誘発する能力。
【０００６】
本発明に従って、ＤＣＰおよび／またはＤＣは、以下の工程を実施することに
よって末梢血から得られる：（１）標準的白血球搬出法；（２）１工程か連続２
工程手順のいずれかでの浮遊密度遠心分離；および（３）外因的に添加されるサ
イトカインの非存在下で、４０時間にわたる無血清培地におけるエキソビボでの
細胞の培養。ＤＲ免疫磁気ビーズまたは等価な選択方法を使用するＤＲ＋細胞の
ポジティブ選択、続いて、それぞれＣＤ３免疫磁気ビーズ、ＣＤ４免疫磁気ビー
ズおよびＣＤ１９免疫磁気ビーズまたは等価な除去方法を使用するＴリンパ球、
単球／マクロファージ、およびＢリンパ球の除去（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）によっ
て、ＤＣＰは、４０時間の培養期間の前に濃縮され得る。
よって末梢血から得られる：（１）標準的白血球搬出法；（２）１工程か連続２
工程手順のいずれかでの浮遊密度遠心分離；および（３）外因的に添加されるサ
イトカインの非存在下で、４０時間にわたる無血清培地におけるエキソビボでの
細胞の培養。ＤＲ免疫磁気ビーズまたは等価な選択方法を使用するＤＲ＋細胞の
ポジティブ選択、続いて、それぞれＣＤ３免疫磁気ビーズ、ＣＤ４免疫磁気ビー
ズおよびＣＤ１９免疫磁気ビーズまたは等価な除去方法を使用するＴリンパ球、
単球／マクロファージ、およびＢリンパ球の除去（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）によっ
て、ＤＣＰは、４０時間の培養期間の前に濃縮され得る。
【０００７】
所望される場合、ＤＣはまた、以下の方法によってさらに濃縮され得る：（４
）浮遊密度遠心分離による培養後の濃縮；および（５）ＤＲ＋細胞の事前濃縮を
行ってかまたは行わずにＣＤ１４免疫磁気ビーズおよびＣＤ１９免疫磁気ビーズ
を使用する、単球／マクロファージおよびＢリンパ球の除去。本発明は、上記の
方法によって得られるＤＣＰおよびＤＣを含む。
）浮遊密度遠心分離による培養後の濃縮；および（５）ＤＲ＋細胞の事前濃縮を
行ってかまたは行わずにＣＤ１４免疫磁気ビーズおよびＣＤ１９免疫磁気ビーズ
を使用する、単球／マクロファージおよびＢリンパ球の除去。本発明は、上記の
方法によって得られるＤＣＰおよびＤＣを含む。
【０００８】
本発明のＤＣは、ナイーブヘルパーＴリンパ球および細胞傷害性Ｔリンパ球を
プライム（ｐｒｉｍｅ）し得るとして機能的に特徴付けられ、そして、１）系統
マーカーの発現についてネガティブ（ｌｉｎ−）；（２）ＣＤ８６の発現につい
て強くポジティブ（ＣＤ８６＋＋）；および（３）ＨＬＡ−ＤＲの発現について
ポジティブ（すなわち、ＭＨＣクラスＩＩ、ＤＲ＋）、として表現型的に特徴付
けられ、本明細書中において「ｌｉｎ−／ＣＤ８６＋＋／ＤＲ＋」として示され
る。
プライム（ｐｒｉｍｅ）し得るとして機能的に特徴付けられ、そして、１）系統
マーカーの発現についてネガティブ（ｌｉｎ−）；（２）ＣＤ８６の発現につい
て強くポジティブ（ＣＤ８６＋＋）；および（３）ＨＬＡ−ＤＲの発現について
ポジティブ（すなわち、ＭＨＣクラスＩＩ、ＤＲ＋）、として表現型的に特徴付
けられ、本明細書中において「ｌｉｎ−／ＣＤ８６＋＋／ＤＲ＋」として示され
る。
【０００９】
関連の局面において、本発明は、４０時間の培養期間の間、抗原をロード（ｌ
ｏａｄ）された樹状細胞を得るために効果的な様式で、選択された抗原にインビ
トロでＤＣＰを曝露する工程を包含する。
ｏａｄ）された樹状細胞を得るために効果的な様式で、選択された抗原にインビ
トロでＤＣＰを曝露する工程を包含する。
【００１０】
このような抗原をロードされた樹状細胞を調製するための模範的な抗原として
は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕおよびＰＡ２０２４が挙げられる。
は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕおよびＰＡ２０２４が挙げられる。
【００１１】
本発明はまた、被験体における腫瘍を処置するための医薬として使用するため
の樹状細胞および／または抗原をロードされた樹状細胞を提供する。
の樹状細胞および／または抗原をロードされた樹状細胞を提供する。
【００１２】
本発明はさらに、公知の腫瘍抗原に対して被験体を免疫するための医薬を製造
するための、樹状細胞および／または抗原をロードされた樹状細胞の組成物の使
用を提供する。
するための、樹状細胞および／または抗原をロードされた樹状細胞の組成物の使
用を提供する。
【００１３】
本発明のこれらおよび他の、目的および特徴は、以下の発明の詳細な説明を、
添付の図面と組合わせて読む場合により十分に明白になる。
添付の図面と組合わせて読む場合により十分に明白になる。
【００１４】
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．定義）
他に示されない限り、以下の用語は、以下の定義を有する。
【００１５】
「樹状細胞前駆体」または「ＤＣＰ」は、適切な条件下でＤＣに成熟し得る末
梢血細胞である。ＤＣＰは、代表的には、非樹状形態を有し、そして抗原提示細
胞として一次免疫応答を誘発するために適格ではない。
梢血細胞である。ＤＣＰは、代表的には、非樹状形態を有し、そして抗原提示細
胞として一次免疫応答を誘発するために適格ではない。
【００１６】
「樹状細胞」または「ＤＣ」は、成熟したＤＣＰであり、これは、代表的には
、樹状細胞形態を有し、すなわち、インビトロで培養した場合に樹状突起を伸ば
す、大きなベール細胞である。Ａｇまたはペプチドでパルスした場合、このよう
なＤＣは、ナイーブＴ細胞にＡｇを提示し得る。
、樹状細胞形態を有し、すなわち、インビトロで培養した場合に樹状突起を伸ば
す、大きなベール細胞である。Ａｇまたはペプチドでパルスした場合、このよう
なＤＣは、ナイーブＴ細胞にＡｇを提示し得る。
【００１７】
「前駆体抗原提示細胞」は、Ａｇまたはペプチドに曝露された場合に、ＡＰＣ
になり得そしてＴ細胞に対してＡｇを提示し得る細胞である。
になり得そしてＴ細胞に対してＡｇを提示し得る細胞である。
【００１８】
「抗原提示細胞（ＡＰＣ）」は、Ａｇまたはペプチドに曝露した場合に、免疫
応答においてＣＤ８+細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）またはＣＤ４+ヘルパーＴ
リンパ球を活性化し得る細胞である。
応答においてＣＤ８+細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）またはＣＤ４+ヘルパーＴ
リンパ球を活性化し得る細胞である。
【００１９】
本明細書中で使用される場合、用語「プロフェッショナル抗原提示細胞」は、
ＤＣ、単球／マクロファージ（ＣＤ１４＋細胞）およびＢリンパ球（ＣＤ１９＋
細胞）を含む。
ＤＣ、単球／マクロファージ（ＣＤ１４＋細胞）およびＢリンパ球（ＣＤ１９＋
細胞）を含む。
【００２０】
本明細書中で使用される場合、用語「ｌｉｎ−」は、系統（ｌｉｎｅａｇｅ）
マーカー（ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ５６）
の細胞表面発現についてネガティブである細胞集団をいう。
マーカー（ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ５６）
の細胞表面発現についてネガティブである細胞集団をいう。
【００２１】
本明細書中で使用される場合、用語「同種刺激性（ａｌｌｏｓｔｉｍｕｌａｔ
ｏｒｙ）」は、細胞表面上に発現されるＭＨＣ分子における差異に起因して同種
Ｔ細胞を刺激し得ることを意味する。
ｏｒｙ）」は、細胞表面上に発現されるＭＨＣ分子における差異に起因して同種
Ｔ細胞を刺激し得ることを意味する。
【００２２】
本明細書中で使用される場合、用語「ＣＤ８６活発（ｂｒｉｇｈｔ）」「ＣＤ
８６＋＋」および「強くＣＤ８６ポジティブ」は、細胞がＣＤ８６に特異的な抗
体と強く免疫反応性であることを意味する（すなわち、蛍光で標識された抗ＣＤ
８６抗体で染色された細胞のフローサイトメトリー分析の結果が、同一の手順を
使用して、同一の抗ＣＤ８６抗体で染色された単球／マクロファージまたはＢ細
胞の蛍光強度より１対数（ｌｏｇ）大きい蛍光強度を示す）。このような細胞は
、細胞表面に高レベルでＣＤ８６を発現するといわれる。
８６＋＋」および「強くＣＤ８６ポジティブ」は、細胞がＣＤ８６に特異的な抗
体と強く免疫反応性であることを意味する（すなわち、蛍光で標識された抗ＣＤ
８６抗体で染色された細胞のフローサイトメトリー分析の結果が、同一の手順を
使用して、同一の抗ＣＤ８６抗体で染色された単球／マクロファージまたはＢ細
胞の蛍光強度より１対数（ｌｏｇ）大きい蛍光強度を示す）。このような細胞は
、細胞表面に高レベルでＣＤ８６を発現するといわれる。
【００２３】
本明細書中で使用される場合、用語「Ａｇをロードされた成熟ＤＣ」は、ＤＣ
Ｐについて濃縮され、Ａｇ（すなわち、腫瘍Ａｇ）の存在下にてエキソビボで培
養されたＰＢＭＣ由来細胞培養物をいう。このような「Ａｇをロードされた成熟
ＤＣ」は、ＤＣおよび種々の型のＰＢＭＣ（プロフェッショナルＡＰＣ（例えば
、単球／マクロファージ（ＣＤ１４の細胞表面発現についてポジティブ）および
Ｂリンパ球（ＣＤ１９の細胞表面発現についてポジティブ））を含む）を含む。
Ｐについて濃縮され、Ａｇ（すなわち、腫瘍Ａｇ）の存在下にてエキソビボで培
養されたＰＢＭＣ由来細胞培養物をいう。このような「Ａｇをロードされた成熟
ＤＣ」は、ＤＣおよび種々の型のＰＢＭＣ（プロフェッショナルＡＰＣ（例えば
、単球／マクロファージ（ＣＤ１４の細胞表面発現についてポジティブ）および
Ｂリンパ球（ＣＤ１９の細胞表面発現についてポジティブ））を含む）を含む。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、「免疫原」は、体液性抗体媒介性免疫応答およ
び／または細胞媒介性免疫応答を刺激または誘導し得る物質をいう。
び／または細胞媒介性免疫応答を刺激または誘導し得る物質をいう。
【００２５】
「抗原」または「Ａｇ」は、単独でかまたはＭＨＣ分子と関連して、特定の免
疫原によって刺激された免疫応答の産物（例えば、抗体、Ｔ細胞レセプター）と
反応する物質をいう。従って、抗原は、応答を引き起こす特定の免疫原（例えば
、抗原性ペプチド、タンパク質または多糖）、ならびに特定の免疫原を含むかま
たは発現する実体（例えば、ウイルス、細菌など）を含む。
疫原によって刺激された免疫応答の産物（例えば、抗体、Ｔ細胞レセプター）と
反応する物質をいう。従って、抗原は、応答を引き起こす特定の免疫原（例えば
、抗原性ペプチド、タンパク質または多糖）、ならびに特定の免疫原を含むかま
たは発現する実体（例えば、ウイルス、細菌など）を含む。
【００２６】
「腫瘍抗原」は、腫瘍関連Ａｇおよび腫瘍特異的Ａｇをいう。腫瘍抗原の例と
して、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、前立腺酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）および腫瘍細胞
によって発現される多くのタンパク質および多糖のいずれかが挙げられる。
して、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、前立腺酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）および腫瘍細胞
によって発現される多くのタンパク質および多糖のいずれかが挙げられる。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、用語「モックソートされた（ｍｏｃｋ ｓｏｒ
ｔｅｄ）」は、蛍光で標識された抗体で染色され、そしてフローサイトメトリー
分析またはソーティング（ｓｏｒｔｉｎｇ）手順の工程全てを経験したがソート
されなかった（ｕｎｓｏｒｔｅｄ）細胞をいう。
ｔｅｄ）」は、蛍光で標識された抗体で染色され、そしてフローサイトメトリー
分析またはソーティング（ｓｏｒｔｉｎｇ）手順の工程全てを経験したがソート
されなかった（ｕｎｓｏｒｔｅｄ）細胞をいう。
【００２８】
（ＩＩ．ＤＣについて濃縮された細胞の単離および培養）
本発明は、ＤＣＰおよびＤＣの単離、培養および特徴付けに関する。
【００２９】
本発明のＤＣは、新鮮に単離されたＰＢＭＣまたはＤＣＰについて濃縮された
画分において検出されないが、ＤＣＰの４０時間のエキソビボでの培養の間に現
れる。
画分において検出されないが、ＤＣＰの４０時間のエキソビボでの培養の間に現
れる。
【００３０】
本発明のＤＣは、同種刺激性でありかつ自己Ｔ細胞に対して癌ＡｇのようなＡ
ｇを提示し得る。
ｇを提示し得る。
【００３１】
本発明の方法に従って、このようなＤＣ集団は、以下によって得られ得る：（
１）末梢血の白血球搬出法；（２）１工程または連続２工程手段のいずれかで（
それぞれ浮遊密度溶液ＢＤＳ７７またはＢＤＳ７７および６５（Ｄｅｎｄｒｅｏ
ｎ Ｃｏｒｐ．）を使用して）、ＤＣＰについて濃縮するための浮遊密度遠心分
離；ならびに（３）Ａｇ存在下および外因的に添加されるサイトカインの非存在
下で、４０時間にわたる無血清培地におけるエキソビボでのＤＣＰの培養。
１）末梢血の白血球搬出法；（２）１工程または連続２工程手段のいずれかで（
それぞれ浮遊密度溶液ＢＤＳ７７またはＢＤＳ７７および６５（Ｄｅｎｄｒｅｏ
ｎ Ｃｏｒｐ．）を使用して）、ＤＣＰについて濃縮するための浮遊密度遠心分
離；ならびに（３）Ａｇ存在下および外因的に添加されるサイトカインの非存在
下で、４０時間にわたる無血清培地におけるエキソビボでのＤＣＰの培養。
【００３２】
ＤＣＰは、４０時間の培養の前に、ＤＲ免疫磁気ビーズまたは等価な選択方法
を使用するＤＲ＋細胞のポジティブ選択、引き続いて、それぞれＣＤ３免疫磁気
ビーズ、ＣＤ４免疫磁気ビーズおよびＣＤ１９免疫磁気ビーズまたは等価な除去
方法を使用するＴリンパ球、単球／マクロファージおよびＢリンパ球の除去によ
って濃縮され得る。
を使用するＤＲ＋細胞のポジティブ選択、引き続いて、それぞれＣＤ３免疫磁気
ビーズ、ＣＤ４免疫磁気ビーズおよびＣＤ１９免疫磁気ビーズまたは等価な除去
方法を使用するＴリンパ球、単球／マクロファージおよびＢリンパ球の除去によ
って濃縮され得る。
【００３３】
所望される場合、ＤＣはまた、以下の方法でさらに濃縮され得る：（４）浮遊
密度遠心分離による培養後の濃縮；および（５）ＤＲ＋細胞についての事前濃縮
を伴うかまたは伴わないＣＤ４免疫磁気ビーズおよびＣＤ１９免疫磁気ビーズを
使用する単球／マクロファージおよびＢリンパ球の除去。
密度遠心分離による培養後の濃縮；および（５）ＤＲ＋細胞についての事前濃縮
を伴うかまたは伴わないＣＤ４免疫磁気ビーズおよびＣＤ１９免疫磁気ビーズを
使用する単球／マクロファージおよびＢリンパ球の除去。
【００３４】
当業者に公知の種々の勾配物質のいずれかを使用して、ＤＣＰの濃縮を達成し
得ることが留意されるべきである（例は、上記に提供される）。
得ることが留意されるべきである（例は、上記に提供される）。
【００３５】
ＤＣＰを含む細胞集団を培養するための無血清培地の例としては、ダルベッコ
変法最小必須培地（ＤＭＥＭ）：Ｆ−１２（１：１）、ＡＩＭ−Ｖ、ＸＶＩＶＯ
１０、ＸＶＩＶＯ１５、ＸＶＩＶＯ２０、マクロファージ無血清培地、栄養補充
されたＡＩＭ−Ｖまたは濃縮された単球ＳＦＭ（例えば、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ
Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤより入
手可能）が挙げられる。好ましくは、ＤＣは、無血清かつ無タンパク質の培地で
培養される。
変法最小必須培地（ＤＭＥＭ）：Ｆ−１２（１：１）、ＡＩＭ−Ｖ、ＸＶＩＶＯ
１０、ＸＶＩＶＯ１５、ＸＶＩＶＯ２０、マクロファージ無血清培地、栄養補充
されたＡＩＭ−Ｖまたは濃縮された単球ＳＦＭ（例えば、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ
Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤより入
手可能）が挙げられる。好ましくは、ＤＣは、無血清かつ無タンパク質の培地で
培養される。
【００３６】
ＤＣＰ細胞集団は、系統ネガティブとして表現型的に特徴付けられる。すなわ
ち、細胞表面系統マーカーＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、
およびＣＤ５６の発現についてネガティブ；細胞表面マーカーＣＤ８６について
弱くポジティブ（すなわち、強くはなくポジティブ）；ならびにＨＬＡ ＤＲの
細胞表面発現についてポジティブ（Ｌｉｎ−／ＣＤ８６±／ＤＲ＋）。同様に、
ＤＣ集団は、系統ネガティブ、ＣＤ８６について強くポジティブ（「ＣＤ−８６
活発（ｂｒｉｇｈｔ）」）；およびＨＬＡ ＤＲの細胞表面発現についてポジテ
ィブ（Ｌｉｎ−／ＣＤ８６＋＋／ＤＲ＋）。このＬｉｎ−／８６＋＋／ＤＲ＋集
団は、新鮮に単離されたＰＢＭＣまたはＤＣＰについて濃縮された細胞核分にお
いて検出されない。
ち、細胞表面系統マーカーＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、
およびＣＤ５６の発現についてネガティブ；細胞表面マーカーＣＤ８６について
弱くポジティブ（すなわち、強くはなくポジティブ）；ならびにＨＬＡ ＤＲの
細胞表面発現についてポジティブ（Ｌｉｎ−／ＣＤ８６±／ＤＲ＋）。同様に、
ＤＣ集団は、系統ネガティブ、ＣＤ８６について強くポジティブ（「ＣＤ−８６
活発（ｂｒｉｇｈｔ）」）；およびＨＬＡ ＤＲの細胞表面発現についてポジテ
ィブ（Ｌｉｎ−／ＣＤ８６＋＋／ＤＲ＋）。このＬｉｎ−／８６＋＋／ＤＲ＋集
団は、新鮮に単離されたＰＢＭＣまたはＤＣＰについて濃縮された細胞核分にお
いて検出されない。
【００３７】
４０時間培養期間の間に、ＤＣＰは、ＤＣ関連の副刺激性および接着分子（例
えば、ＣＤ１ａ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４０、ＣＤ５４、およびＣＤ８０）を含む、
樹状細胞画分に関するものとして公知のさらなる表現型的マーカーを発現する、
細胞集団へ成熟する。表現型の獲得は、ＤＣＰが、同種刺激性であるだけでなく
自己Ｔ細胞に対して前立腺癌Ａｇおよび乳癌Ａｇによって例示されるＡｇを提示
し得る、強力なＡＰＣとなるという点で、ＤＣの機能的成熟に相関する。
えば、ＣＤ１ａ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４０、ＣＤ５４、およびＣＤ８０）を含む、
樹状細胞画分に関するものとして公知のさらなる表現型的マーカーを発現する、
細胞集団へ成熟する。表現型の獲得は、ＤＣＰが、同種刺激性であるだけでなく
自己Ｔ細胞に対して前立腺癌Ａｇおよび乳癌Ａｇによって例示されるＡｇを提示
し得る、強力なＡＰＣとなるという点で、ＤＣの機能的成熟に相関する。
【００３８】
ＦＡＣＳソート（ｓｏｒｔ）されたＬｉｎ−／８６＋＋／ＤＲ＋細胞は、同種
混合白血球反応（ＭＬＲ）およびＡｇ提示アッセイ（実施例３）において、培養
されたＢ細胞および単球／マクロファージより強力な応答を示した。これらの結
果は、エキソビボでの培養の間のＬｉｎ−／８６＋＋／ＤＲ＋表現型の獲得は、
Ａｇ特異的免疫応答を誘導し得る適格なＤＣへのＤＣＰの成熟を合図することを
示す。
混合白血球反応（ＭＬＲ）およびＡｇ提示アッセイ（実施例３）において、培養
されたＢ細胞および単球／マクロファージより強力な応答を示した。これらの結
果は、エキソビボでの培養の間のＬｉｎ−／８６＋＋／ＤＲ＋表現型の獲得は、
Ａｇ特異的免疫応答を誘導し得る適格なＤＣへのＤＣＰの成熟を合図することを
示す。
【００３９】
この画分におけるＤＣの純度は、例えば、フローサイトメトリー（すなわち、
ＦＡＣＳ）分析を、機能的アッセイとともに使用して定量化され得る。
ＦＡＣＳ）分析を、機能的アッセイとともに使用して定量化され得る。
【００４０】
例示的な機能的アッセイは、以下に記載される。しかし、当業者によって慣用
的に利用される多くのアッセイプロトコールのいずれかを使用してこのような分
析を完了し得ることが理解される。
的に利用される多くのアッセイプロトコールのいずれかを使用してこのような分
析を完了し得ることが理解される。
【００４１】
（ＩＩＩ．濃縮された細胞画分の特徴付け）
歴史的にＤＣは、細胞表面マーカーＣＤ３（Ｔ細胞）、ＣＤ１４（単球／マク
ロファージ）、ＣＤ１９／２０（Ｂ細胞）、ＣＤ５６（ＮＫ細胞）についてネガ
ティブ、そしてＨＬＡクラスＩＩ発現についてポジティブであるとして特徴付け
られた（Ｍａｃａｔｏｎｉａら、１９９１；ＭａｒｋｏｗｉｃｚおよびＥｎｇｌ
ｅｍａｎ、１９９０；ＹｏｕｎｇおよびＳｔｅｉｎｍａｎ、１９８７）。
ロファージ）、ＣＤ１９／２０（Ｂ細胞）、ＣＤ５６（ＮＫ細胞）についてネガ
ティブ、そしてＨＬＡクラスＩＩ発現についてポジティブであるとして特徴付け
られた（Ｍａｃａｔｏｎｉａら、１９９１；ＭａｒｋｏｗｉｃｚおよびＥｎｇｌ
ｅｍａｎ、１９９０；ＹｏｕｎｇおよびＳｔｅｉｎｍａｎ、１９８７）。
【００４２】
ＤＣは、最も強力なＡＰＣであるとして当業者に公知である。これらは、ナイ
ーブなヘルパーＴ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞をプライムし得る唯一のＡＰＣで
ある。この独特な能力のために、ＤＣの治療的適用は、癌患者の処置において見
込みがあるとして認められた。
ーブなヘルパーＴ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞をプライムし得る唯一のＡＰＣで
ある。この独特な能力のために、ＤＣの治療的適用は、癌患者の処置において見
込みがあるとして認められた。
【００４３】
ＤＣは、異なる分化／成熟段階で種々のリンパ器官および非リンパ器官におい
て見出される白血球の小さな、不均質集団を示す。ＤＣおよびＤＣ系統細胞の同
定は、末梢血でのそれらの不均質性、稀少性およびＤＣ特異的細胞表面マーカー
の欠如のために、困難であった。ＤＣは、それらの特徴的な樹状形態、強力なＡ
ｇ提示能、およびいくつかの多系統マーカー（例えば、ＣＤ１ａ、ＣＤ１１ｂ、
ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４０、ＣＤ５４、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ１２３
）およびアップレギュレートされたＭＨＣ分子に対するモノクローナル抗体（ｍ
Ａｂ）の集団によって特徴付けられたそれらの細胞表面表現型によって代表的に
は同定されている（Ｇｒａｂｂｅ，Ｓら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １６：
１１７−１２１，１９９５）。
て見出される白血球の小さな、不均質集団を示す。ＤＣおよびＤＣ系統細胞の同
定は、末梢血でのそれらの不均質性、稀少性およびＤＣ特異的細胞表面マーカー
の欠如のために、困難であった。ＤＣは、それらの特徴的な樹状形態、強力なＡ
ｇ提示能、およびいくつかの多系統マーカー（例えば、ＣＤ１ａ、ＣＤ１１ｂ、
ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４０、ＣＤ５４、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ１２３
）およびアップレギュレートされたＭＨＣ分子に対するモノクローナル抗体（ｍ
Ａｂ）の集団によって特徴付けられたそれらの細胞表面表現型によって代表的に
は同定されている（Ｇｒａｂｂｅ，Ｓら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １６：
１１７−１２１，１９９５）。
【００４４】
ＤＣは大きなＣＤ５４＋細胞の集団に含まれるが、このような細胞集団の主要
構成要素は、単球およびマクロファージである（実施例１）。
構成要素は、単球およびマクロファージである（実施例１）。
【００４５】
本明細書中に記載されるように、癌Ａｇの存在下でエキソビボにて培養される
場合、患者の末梢血より収集されたＤＣＰは、本明細書中で「Ｌｉｎ−／８６＋
＋／ＤＲ＋」として示されるＡｇをロードされた成熟ＤＣに分化する。このよう
なＡｇをロードされた成熟ＤＣは、患者に再度導入され得、癌Ａｇに対して指向
されるインビボ免疫応答を誘導し得る。
場合、患者の末梢血より収集されたＤＣＰは、本明細書中で「Ｌｉｎ−／８６＋
＋／ＤＲ＋」として示されるＡｇをロードされた成熟ＤＣに分化する。このよう
なＡｇをロードされた成熟ＤＣは、患者に再度導入され得、癌Ａｇに対して指向
されるインビボ免疫応答を誘導し得る。
【００４６】
本発明の方法において、ＡｇをロードされたＤＣ画分におけるＤＣは、インビ
トロで培養された場合、代表的に、樹状形態を有する。さらに、これらの細胞は
、代表的に、ＣＤ３、ＣＤ１４、Ｃｄ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ５６
のような系統特異的細胞表面マーカーについてネガティブであり；ＨＬＡ−ＤＲ
によって明示されるようなＭＨＣクラスＩＩについてポジティブであり；そして
細胞表面マーカーＣＤ８６の高発現レベルを示す。
トロで培養された場合、代表的に、樹状形態を有する。さらに、これらの細胞は
、代表的に、ＣＤ３、ＣＤ１４、Ｃｄ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ５６
のような系統特異的細胞表面マーカーについてネガティブであり；ＨＬＡ−ＤＲ
によって明示されるようなＭＨＣクラスＩＩについてポジティブであり；そして
細胞表面マーカーＣＤ８６の高発現レベルを示す。
【００４７】
ＣＤ８６（「Ｂ７−２」としてもまた公知）は、Ｂ細胞および単球／マクロフ
ァージのようなＡＰＣ上に発現される。ＡＰＣ上での副刺激分子Ｂ７．１（ＣＤ
８０）およびＢ７．２（ＣＤ８６）の発現は、ＡＰＣ上に発現するＣＤ４０とＴ
細胞上に発現するＣＤ４０Ｌとの間の相互作用によってアップレギュレートされ
る。ＣＤ８０およびＣＤ８６は、Ｔ細胞上のＣＤ２８に結合しＴ細胞活性化に必
要な同時刺激シグナルを提供することが示された。一次応答におけるＴリンパ球
の活性化は、Ａｇ特異的シグナルに加えて、さらなる様式で働くいくつかの同時
刺激シグナルをＡＰＣが送達することを必要とする。これらの間で、ＣＤ８０／
ＣＤ８６−ＣＤ２８を介する同時刺激は、決定的に重要である。
ァージのようなＡＰＣ上に発現される。ＡＰＣ上での副刺激分子Ｂ７．１（ＣＤ
８０）およびＢ７．２（ＣＤ８６）の発現は、ＡＰＣ上に発現するＣＤ４０とＴ
細胞上に発現するＣＤ４０Ｌとの間の相互作用によってアップレギュレートされ
る。ＣＤ８０およびＣＤ８６は、Ｔ細胞上のＣＤ２８に結合しＴ細胞活性化に必
要な同時刺激シグナルを提供することが示された。一次応答におけるＴリンパ球
の活性化は、Ａｇ特異的シグナルに加えて、さらなる様式で働くいくつかの同時
刺激シグナルをＡＰＣが送達することを必要とする。これらの間で、ＣＤ８０／
ＣＤ８６−ＣＤ２８を介する同時刺激は、決定的に重要である。
【００４８】
（Ａ．生物学的活性）
種々の細胞集団の生物学的活性を、ＤＣを特徴付けるために当業者によって使
用されるアッセイにおいて評価した。このようなアッセイは、混合白血球反応ま
たはＭＬＲを含み、ここで照射された刺激細胞（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ ｃｅｌ
ｌ）を同種Ｔ細胞（応答因子（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ））と培養する。これらの細
胞を、3Ｈ−チミジンを含有する培地中で、６日のインキュベーション期間の最
後の１８時間培養し、3Ｈ−チミジン取り込みを応答細胞増殖の指標として測定
する。第二のアッセイは、同種Ｔ細胞を刺激する照射された細胞の能力に基づい
て、ＭＬＲについて上記したように測定したＡｇをロードされた細胞のＡｇ提示
能を示す。
用されるアッセイにおいて評価した。このようなアッセイは、混合白血球反応ま
たはＭＬＲを含み、ここで照射された刺激細胞（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ ｃｅｌ
ｌ）を同種Ｔ細胞（応答因子（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ））と培養する。これらの細
胞を、3Ｈ−チミジンを含有する培地中で、６日のインキュベーション期間の最
後の１８時間培養し、3Ｈ−チミジン取り込みを応答細胞増殖の指標として測定
する。第二のアッセイは、同種Ｔ細胞を刺激する照射された細胞の能力に基づい
て、ＭＬＲについて上記したように測定したＡｇをロードされた細胞のＡｇ提示
能を示す。
【００４９】
これらの研究の結果は：（１）本明細書中で「Ｌｉｎ−／８６＋＋／ＤＲ＋」
として記載されるＤＣ集団は、同種ＭＬＲにおいて単球／マクロファージおよび
Ｂ細胞より約２０倍刺激性であり；そして（２）Ｌｉｎ−／８６＋＋／ＤＲ＋細
胞は、単球／マクロファージおよびＢ細胞のＡｇ提示能の少なくとも２０倍のＡ
ｇ提示能を有して、同種Ｔ細胞に対して腫瘍Ａｇを提示し得ることを示す。
として記載されるＤＣ集団は、同種ＭＬＲにおいて単球／マクロファージおよび
Ｂ細胞より約２０倍刺激性であり；そして（２）Ｌｉｎ−／８６＋＋／ＤＲ＋細
胞は、単球／マクロファージおよびＢ細胞のＡｇ提示能の少なくとも２０倍のＡ
ｇ提示能を有して、同種Ｔ細胞に対して腫瘍Ａｇを提示し得ることを示す。
【００５０】
まとめると、これらの結果は、Ｌｉｎ−／８６＋＋／ＤＲ＋集団が成熟した適
格なＤＣに代表的な表現型的特徴および機能的特徴を示すことを示し、Ｌｉｎ−
／８６＋＋／ＤＲ＋表現型は、成熟ＤＣを同定するために使用され得ることを示
唆する。
格なＤＣに代表的な表現型的特徴および機能的特徴を示すことを示し、Ｌｉｎ−
／８６＋＋／ＤＲ＋表現型は、成熟ＤＣを同定するために使用され得ることを示
唆する。
【００５１】
（ＩＶ．有用性）
ＤＣＰとして本明細書中に記載される細胞の集団は、Ｌｉｎ−／８６±／ＤＲ
＋として表現型的に特徴付けられ得る。ＤＣとして本明細書中に記載される細胞
の集団は、Ｌｉｎ−／８６＋＋／ＤＲ＋として表現型的に特徴付けられ得、これ
らの細胞表面上に、ＤＣと代表的に関連する全ての関連分子を発現する。これら
の細胞は、強力な同種刺激性であり、そしてＡｇ提示細胞である。
＋として表現型的に特徴付けられ得る。ＤＣとして本明細書中に記載される細胞
の集団は、Ｌｉｎ−／８６＋＋／ＤＲ＋として表現型的に特徴付けられ得、これ
らの細胞表面上に、ＤＣと代表的に関連する全ての関連分子を発現する。これら
の細胞は、強力な同種刺激性であり、そしてＡｇ提示細胞である。
【００５２】
本明細書中で記載されるＤＣＰ表現型およびＤＣ表現型は、以下を含むがこれ
らに限定されない多くの適用における有用性を認める：（１）骨髄、ＰＢＭＣ、
他の組織および細胞株由来のＤＣのエキソビボでの産生における細胞のプロセシ
ングおよび製造の品質管理；（２）細胞性免疫治療；（３）ＤＣＰおよび／また
はＤＣの動因、ＤＣ免疫治療および他のワクチン接種プロトコールに続く臨床的
モニタリング；（４）診断道具および予防道具としての有用性；（５）ＤＣ−１
、ＤＣ−２およびＤＣ−３サブ表現型（ｓｕｂ−ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）の同定に
おける有用性；（６）ナイーブなＡｇまたは弱いＡｇに特異的なＴ細胞のエキソ
ビボおよびインビボでの産生における有用性；（７）疾患状態（例えば、慢性リ
ウマチ関節炎、多発性骨髄腫、自己免疫、癌、ウイルス、細菌、および真菌の感
染）のインビボおよびインビトロのモデルにおける有用性；（８）同種移植およ
び異種移植のための免疫キメラの産生における役割；（９）移植片対白血病につ
いてのＨＳＣ救助治療または移植片対宿主疾患の抑制の補助としての有用性；（
１０）遺伝子治療における有用性；ならびに（１１）種々の研究および発生活性
における有用性。
らに限定されない多くの適用における有用性を認める：（１）骨髄、ＰＢＭＣ、
他の組織および細胞株由来のＤＣのエキソビボでの産生における細胞のプロセシ
ングおよび製造の品質管理；（２）細胞性免疫治療；（３）ＤＣＰおよび／また
はＤＣの動因、ＤＣ免疫治療および他のワクチン接種プロトコールに続く臨床的
モニタリング；（４）診断道具および予防道具としての有用性；（５）ＤＣ−１
、ＤＣ−２およびＤＣ−３サブ表現型（ｓｕｂ−ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）の同定に
おける有用性；（６）ナイーブなＡｇまたは弱いＡｇに特異的なＴ細胞のエキソ
ビボおよびインビボでの産生における有用性；（７）疾患状態（例えば、慢性リ
ウマチ関節炎、多発性骨髄腫、自己免疫、癌、ウイルス、細菌、および真菌の感
染）のインビボおよびインビトロのモデルにおける有用性；（８）同種移植およ
び異種移植のための免疫キメラの産生における役割；（９）移植片対白血病につ
いてのＨＳＣ救助治療または移植片対宿主疾患の抑制の補助としての有用性；（
１０）遺伝子治療における有用性；ならびに（１１）種々の研究および発生活性
における有用性。
【００５３】
以下の実施例は、本発明を例示し、決して本発明を限定することを意図されな
い。
い。
【００５４】
（材料および方法）
（１．細胞）
ＰＢＭＣを、標準的な白血球搬出法によって患者および健康なドナーから収集
した。ＤＣＰを、１工程（浮遊密度溶液（ＢＤＳ）７７（Ｄｅｎｄｒｅｏｎ Ｃ
ｏｒｐ．））手順または連続２工程（ＢＤＳ７７および６５（Ｄｅｎｄｒｅｏｎ
））手順のいずれかを用いる浮遊密度遠心分離によって単離した。
した。ＤＣＰを、１工程（浮遊密度溶液（ＢＤＳ）７７（Ｄｅｎｄｒｅｏｎ Ｃ
ｏｒｐ．））手順または連続２工程（ＢＤＳ７７および６５（Ｄｅｎｄｒｅｏｎ
））手順のいずれかを用いる浮遊密度遠心分離によって単離した。
【００５５】
同種Ｔ細胞を、健康な９人のドナー由来のバフィコート調製物より、２工程浮
遊密度遠心分離手順、次いで、親和性ネガティブ選択カラムクロマトグラフィー
（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して濃縮した。同種Ｔ細胞を、同一の方法を
使用してアフェレーシス産物より濃縮した。
遊密度遠心分離手順、次いで、親和性ネガティブ選択カラムクロマトグラフィー
（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して濃縮した。同種Ｔ細胞を、同一の方法を
使用してアフェレーシス産物より濃縮した。
【００５６】
（２．モノクローナル抗体（ｍＡｂ））
フローサイトメトリーのためにＤＣおよびＤＣＰを染色するために使用される
市販のｍＡｂは、（１）フルオレセイン（ＦＩＴＣ）結合体化Ｌｉｎ１（ＢＤ）
、ＣＤ３（ＢＤ）、ＣＤ１４（ＢＤ）、ＣＤ１９（ＢＤ）、およびＩｇＧ１（Ｂ
Ｄ）；（２）ＰＥ結合体化抗体ＣＤ１１ｃ（ＢＤ）、ＣＤ４０（Ｉｍｍｕｎｏｔ
ｅｃｈ）、ＣＤ５４（ＢＤ）、ＣＤ８０（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＣＤ８３（
Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＣＤ８６（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＩｇＧ１（ＢＤ
）；ならびに（３）ＰｅｒＣＰ結合体化抗体ＨＬＡ−ＤＲ（ＢＤ）およびＩｇＧ
２ａ（ＢＤ）（ここで、ＢＤは、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎをいう）。
市販のｍＡｂは、（１）フルオレセイン（ＦＩＴＣ）結合体化Ｌｉｎ１（ＢＤ）
、ＣＤ３（ＢＤ）、ＣＤ１４（ＢＤ）、ＣＤ１９（ＢＤ）、およびＩｇＧ１（Ｂ
Ｄ）；（２）ＰＥ結合体化抗体ＣＤ１１ｃ（ＢＤ）、ＣＤ４０（Ｉｍｍｕｎｏｔ
ｅｃｈ）、ＣＤ５４（ＢＤ）、ＣＤ８０（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＣＤ８３（
Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＣＤ８６（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＩｇＧ１（ＢＤ
）；ならびに（３）ＰｅｒＣＰ結合体化抗体ＨＬＡ−ＤＲ（ＢＤ）およびＩｇＧ
２ａ（ＢＤ）（ここで、ＢＤは、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎをいう）。
【００５７】
（３．抗原（Ａｇ））
本明細書中で評価される２つの例示的組換え腫瘍Ａｇ（Ａｇ）は、（１）組換
えＨＥＲ−２／ｎｅｕ（ＨＥＲ−２／ｎｅｕのＮ末端細胞外ドメインの一部およ
びＣ末端細胞内ドメインの小部分、ならびに顆粒球マクロファージコロニー刺激
因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を含む融合タンパク質）、そして（２）ＰＡ２０２４（前
立腺酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）およびＧＭ−ＣＳＦからなる融合タンパク質）
であった。
えＨＥＲ−２／ｎｅｕ（ＨＥＲ−２／ｎｅｕのＮ末端細胞外ドメインの一部およ
びＣ末端細胞内ドメインの小部分、ならびに顆粒球マクロファージコロニー刺激
因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を含む融合タンパク質）、そして（２）ＰＡ２０２４（前
立腺酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）およびＧＭ−ＣＳＦからなる融合タンパク質）
であった。
【００５８】
（４．エキソビボでのＤＣＰの培養）
ＤＣＰを、テフロン（登録商標）バッグ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｆｌｕｏｒｏｓ
ｅａｌ）中にて、２ｍＭ グルタミンを補充したＡＩＭ−Ｖ培地中において１×
１０7／ｍｌの密度で、３７℃で５％ＣＯ２の加湿インキュベーター中で４０時
間培養した。培養期間の間に、ＤＣＰを、Ａｇ、組換えＨＥＲ−２／ｎｅｕ（２
０μｇ／ｍｌ）またはＰＡ２０２４（１０μｇ／ｍｌ）でパルスした。
ｅａｌ）中にて、２ｍＭ グルタミンを補充したＡＩＭ−Ｖ培地中において１×
１０7／ｍｌの密度で、３７℃で５％ＣＯ２の加湿インキュベーター中で４０時
間培養した。培養期間の間に、ＤＣＰを、Ａｇ、組換えＨＥＲ−２／ｎｅｕ（２
０μｇ／ｍｌ）またはＰＡ２０２４（１０μｇ／ｍｌ）でパルスした。
【００５９】
（５．培養後のＤＣの濃縮）
４０時間のエキソビボでの培養後に収集した細胞を、ＢＤＳ５６（Ｄｅｎｄｒ
ｅｏｎ Ｃｏｒｐ．）を使用する浮遊密度遠心分離によって、ＤＣについてさら
に濃縮した。
ｅｏｎ Ｃｏｒｐ．）を使用する浮遊密度遠心分離によって、ＤＣについてさら
に濃縮した。
【００６０】
（６．フローサイトメトリー）
細胞表面表現型分析を、１０％ 正常マウス血清を含むＰＢＳ中で１０分間イ
ンキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、そして２５０〜７５０μｌのＰＢＳ中で再懸
濁した約１〜３×１０7細胞からなるサンプルを使用して実施した。次いで、細
胞懸濁液を、３０μｌ／ウェルで丸底９６ウェルプレートに分配した。ＦＩＴＣ
結合体化ｍＡｂ、ＰＥ結合体化ｍＡｂ、およびＰｅｒＣＰ結合体化ｍＡｂを、１
０μｌ／ウェルで添加し、そしてこれらの細胞を、暗所にて氷上で２０分間イン
キュベートした。次いで、これらの細胞を、２００μｌ／ウェルのＰＢＳで洗浄
し、そして４００μｌサンプルのＰＢＳ中で再懸濁し、次いで、アイソタイプ一
致コントロールＡｂで標識した細胞をネガティブコントロールとして用いて、Ｆ
ＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｓｏｎ）によって分析した。
ンキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、そして２５０〜７５０μｌのＰＢＳ中で再懸
濁した約１〜３×１０7細胞からなるサンプルを使用して実施した。次いで、細
胞懸濁液を、３０μｌ／ウェルで丸底９６ウェルプレートに分配した。ＦＩＴＣ
結合体化ｍＡｂ、ＰＥ結合体化ｍＡｂ、およびＰｅｒＣＰ結合体化ｍＡｂを、１
０μｌ／ウェルで添加し、そしてこれらの細胞を、暗所にて氷上で２０分間イン
キュベートした。次いで、これらの細胞を、２００μｌ／ウェルのＰＢＳで洗浄
し、そして４００μｌサンプルのＰＢＳ中で再懸濁し、次いで、アイソタイプ一
致コントロールＡｂで標識した細胞をネガティブコントロールとして用いて、Ｆ
ＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｓｏｎ）によって分析した。
【００６１】
（７．細胞ソーティング（ｓｏｒｔｉｎｇ））
細胞ソーティングを、滅菌条件下でＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅ Ｉ（Ｂｅｃｔ
ｏｎ Ｄｉｃｋｓｏｎ）を用いて実施した。ＦＩＴＣ−Ｌｉｎ１、ＰＥ−ＣＤ８
６、およびＰｅｒＣＰ−ＨＬＡ ＤＲで標識した細胞を、２％ヒト血清を含有す
るＰＢＳ中で再懸濁し、５，０００〜１０，０００細胞／秒の流速でバルクをソ
ートした。ソーティングゲート（ｓｏｒｔｉｎｇ ｇａｔｅ）を、アイソタイプ
一致コントロールＡｂで標識した細胞を使用して決定した。
ｏｎ Ｄｉｃｋｓｏｎ）を用いて実施した。ＦＩＴＣ−Ｌｉｎ１、ＰＥ−ＣＤ８
６、およびＰｅｒＣＰ−ＨＬＡ ＤＲで標識した細胞を、２％ヒト血清を含有す
るＰＢＳ中で再懸濁し、５，０００〜１０，０００細胞／秒の流速でバルクをソ
ートした。ソーティングゲート（ｓｏｒｔｉｎｇ ｇａｔｅ）を、アイソタイプ
一致コントロールＡｂで標識した細胞を使用して決定した。
【００６２】
（８．免疫磁気精製）
ＤＣＰおよび／またはＤＣを、ＤＲ免疫磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使
用してＤＲポジティブ細胞（ＤＲ＋）について濃縮した。これらの細胞を、２ｍ
Ｍ ＥＤＴＡを含むかまたは含まない、０．５％ヒト血清を含有するＰＢＳ中で
再懸濁し、そして細胞／ビーズ比（ｖ／ｖ）４：１でビーズ懸濁物と混合した。
４℃で１５分間のインキュベートの後、ＤＲ＋細胞をカラム分離（Ｍｉｌｔｅｎ
ｙｉ）を使用して回収する。
用してＤＲポジティブ細胞（ＤＲ＋）について濃縮した。これらの細胞を、２ｍ
Ｍ ＥＤＴＡを含むかまたは含まない、０．５％ヒト血清を含有するＰＢＳ中で
再懸濁し、そして細胞／ビーズ比（ｖ／ｖ）４：１でビーズ懸濁物と混合した。
４℃で１５分間のインキュベートの後、ＤＲ＋細胞をカラム分離（Ｍｉｌｔｅｎ
ｙｉ）を使用して回収する。
【００６３】
（９．免疫磁気除去）
Ｔリンパ球、単球／マクロファージおよびＢリンパ球を、それぞれＣＤ３免疫
磁気ビーズ、ＣＤ４免疫磁気ビーズおよびＣＤ１９免疫磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ
）を使用して、培養前および培養後の細胞から除去した。細胞およびビーズを、
２％ヒト血清を含有するＰＢＳ中で再懸濁し、そして細胞：ビーズ比１：５で混
合した。穏やかに混合しながらの４℃で２０分間のインキュベートの後、吸着し
なかった細胞を回収し、そしてＡＩＭ−Ｖ中で一度洗浄した。
磁気ビーズ、ＣＤ４免疫磁気ビーズおよびＣＤ１９免疫磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ
）を使用して、培養前および培養後の細胞から除去した。細胞およびビーズを、
２％ヒト血清を含有するＰＢＳ中で再懸濁し、そして細胞：ビーズ比１：５で混
合した。穏やかに混合しながらの４℃で２０分間のインキュベートの後、吸着し
なかった細胞を回収し、そしてＡＩＭ−Ｖ中で一度洗浄した。
【００６４】
（１０．ＭＬＲ）
細胞を３，０００ラドで照射し、丸底９６ウェルプレートの３連のウェルにて
１３〜８×１０5細胞／ウェルで刺激因子（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）として使用
した。応答因子（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）として、５×１０4同種Ｔ細胞を、各ウ
ェルに添加した。１μＣｉの3Ｈ−チミジンを、６日のインキュベーション期間
の最後の１８時間にわたって各ウェルに添加した。インキュベートの最後に、細
胞を収集し、そして3Ｈ−チミジン取り込みを測定した。刺激因子単独または応
答因子単独のいずれかを含むウェルは、コントロールとして役立った。
１３〜８×１０5細胞／ウェルで刺激因子（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）として使用
した。応答因子（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）として、５×１０4同種Ｔ細胞を、各ウ
ェルに添加した。１μＣｉの3Ｈ−チミジンを、６日のインキュベーション期間
の最後の１８時間にわたって各ウェルに添加した。インキュベートの最後に、細
胞を収集し、そして3Ｈ−チミジン取り込みを測定した。刺激因子単独または応
答因子単独のいずれかを含むウェルは、コントロールとして役立った。
【００６５】
（１１．Ａｇ提示アッセイ）
ＤＣＰを、Ａｇの存在下または非存在下にてエキソビボで４０時間培養した。
次いで、細胞をＦＡＣＳソートしたか、またはＴリンパ球、単球／マクロファー
ジおよびＢ細胞の免疫磁気除去によってＤＣについて濃縮した。次いで、細胞を
、３，０００ラドで照射し、そしてこれらのＴ細胞刺激活性を、丸底９６ウェル
プレートの３連のウェルにて１３〜８×１０5／ウェルのＤＣを１×１０5／ウェ
ルの自己Ｔ細胞とインキュベートすることによって測定した。Ｔ細胞の増殖を、
上記のように測定した。
次いで、細胞をＦＡＣＳソートしたか、またはＴリンパ球、単球／マクロファー
ジおよびＢ細胞の免疫磁気除去によってＤＣについて濃縮した。次いで、細胞を
、３，０００ラドで照射し、そしてこれらのＴ細胞刺激活性を、丸底９６ウェル
プレートの３連のウェルにて１３〜８×１０5／ウェルのＤＣを１×１０5／ウェ
ルの自己Ｔ細胞とインキュベートすることによって測定した。Ｔ細胞の増殖を、
上記のように測定した。
【００６６】
（実施例１：ＡｇをロードされたＤＣの培養および特徴付け）
Ａｇをロードされた成熟ＤＣの調製は、ＰＢＭＣ由来のＤＣＰの濃縮および外
因的に添加されるサイトカインの非存在下で無血清培地中での前駆体の４０時間
のエキソビボ培養を含む。刺激細胞として働くＡｇをロードされた成熟ＤＣの培
養物中に見出される種々の細胞型の相対能力を、この培養物からの種々の細胞型
を除去すること、そしてＭＬＲにおける除去された細胞およびコントロール細胞
の効果ならびに自己Ｔ細胞に対してＡｇを提示するこれらの能力を決定すること
によって評価した。それぞれＣＤ１４免疫磁気ビーズおよび／またはＣＤ１９免
疫磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ）を使用して、単球／マクロファージおよび／または
Ｂリンパ球を、成熟ＤＣ培養物から除去した。
因的に添加されるサイトカインの非存在下で無血清培地中での前駆体の４０時間
のエキソビボ培養を含む。刺激細胞として働くＡｇをロードされた成熟ＤＣの培
養物中に見出される種々の細胞型の相対能力を、この培養物からの種々の細胞型
を除去すること、そしてＭＬＲにおける除去された細胞およびコントロール細胞
の効果ならびに自己Ｔ細胞に対してＡｇを提示するこれらの能力を決定すること
によって評価した。それぞれＣＤ１４免疫磁気ビーズおよび／またはＣＤ１９免
疫磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ）を使用して、単球／マクロファージおよび／または
Ｂリンパ球を、成熟ＤＣ培養物から除去した。
【００６７】
次いで、生じた細胞の同種刺激活性を、除去しなかったＤＣ培養物の同種刺激
活性と比較した。免疫磁気除去の結果を、表１に要約する。これは、ＣＤ１４細
胞およびＣＤ１９細胞の両方の広範な除去を示す。
活性と比較した。免疫磁気除去の結果を、表１に要約する。これは、ＣＤ１４細
胞およびＣＤ１９細胞の両方の広範な除去を示す。
【００６８】
（表１）
【００６９】
【表１】
図１に示すように、ＣＤ１４細胞およびＣＤ１９細胞の除去は、ＤＣ培養物の
同種刺激活性に中程度に影響した。これは、成熟ＤＣ培養物の主要な同種刺激活
性が単球／マクロファージでもＢリンパ球でもない細胞に存在することを示す。
Ａｇをロードされた成熟ＤＣ由来の種々の細胞型が、自己Ｔ細胞にＡｇを提示す
る能力を試験した場合、同様の結果が得られた（図２）。
同種刺激活性に中程度に影響した。これは、成熟ＤＣ培養物の主要な同種刺激活
性が単球／マクロファージでもＢリンパ球でもない細胞に存在することを示す。
Ａｇをロードされた成熟ＤＣ由来の種々の細胞型が、自己Ｔ細胞にＡｇを提示す
る能力を試験した場合、同様の結果が得られた（図２）。
【００７０】
単球／マクロファージおよびＢ細胞が系統ポジティブ細胞の中で唯一のプロフ
ェッショナルＡＰＣである場合、これらの結果はさらに、Ａｇをロードされた成
熟ＤＣの培養物における同種刺激性でありそして抗原を提示する主要な細胞は、
系統ネガティブ（ｌｉｎ−）細胞であることを示唆する。
ェッショナルＡＰＣである場合、これらの結果はさらに、Ａｇをロードされた成
熟ＤＣの培養物における同種刺激性でありそして抗原を提示する主要な細胞は、
系統ネガティブ（ｌｉｎ−）細胞であることを示唆する。
【００７１】
（実施例２：成熟ＤＣでのＣＤ８６発現）
ＡＰＣの表面上のＣＤ８６発現のパターンを、４０時間にわたる培養期間の間
に評価した。
に評価した。
【００７２】
上記のように、免疫磁気ビーズを使用するさらなる濃縮を伴うかまたは伴わな
い浮遊密度遠心分離によってＰＢＭＣより濃縮したＤＣＰを、ＨＥＲ−２／ｎｅ
ｕまたはＰＡ２０２４腫瘍Ａｇの存在下で、外因的に添加されるサイトカインの
非存在下で無血清培地中で４０時間培養した。培養期間の間に、ＣＤ８６の中程
度のアップレギュレーションを、培養物中のＬｉｎ＋／ＤＲ＋細胞集団（主要構
成成分が単球／マクロファージ（ＣＤ１４＋細胞）およびＢ細胞（ＣＤ１９＋細
胞）である）において観察した。
い浮遊密度遠心分離によってＰＢＭＣより濃縮したＤＣＰを、ＨＥＲ−２／ｎｅ
ｕまたはＰＡ２０２４腫瘍Ａｇの存在下で、外因的に添加されるサイトカインの
非存在下で無血清培地中で４０時間培養した。培養期間の間に、ＣＤ８６の中程
度のアップレギュレーションを、培養物中のＬｉｎ＋／ＤＲ＋細胞集団（主要構
成成分が単球／マクロファージ（ＣＤ１４＋細胞）およびＢ細胞（ＣＤ１９＋細
胞）である）において観察した。
【００７３】
ＣＤ８６の最強の発現を、培養後の細胞のＬｉｎ−／ＤＲ＋集団において観察
した。このＬｉｎ−／ＣＤ８６＋＋／ＤＲ＋集団は、新鮮に単離されたＰＢＭＣ
またはＤＣＰについて濃縮された画分においては検出されなかった（図３Ａ〜Ｂ
）。これらの結果は、Ｌｉｎ−／ＣＤ８６＋＋／ＤＲ＋集団は、ＤＣが成熟する
４０時間の培養期間の間に現れることを示す（図３Ｃ〜Ｄ）。さらなるフローサ
イトメトリー分析は、Ｌｉｎ−／ＣＤ８６＋＋／ＤＲ＋集団はまた、他のＤＣ関
連の副刺激性の接着分子（例えば、ＣＤ１ａ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４０、ＣＤ５４
、およびＣＤ８０）を発現することを示した。系統マーカーの非存在およびＤＣ
と関連することが公知のマーカーの同時発現は、成熟ＤＣについてのマーカーと
してＬｉｎ−／ＣＤ８６＋＋／ＤＲ＋表現型を確認した。
した。このＬｉｎ−／ＣＤ８６＋＋／ＤＲ＋集団は、新鮮に単離されたＰＢＭＣ
またはＤＣＰについて濃縮された画分においては検出されなかった（図３Ａ〜Ｂ
）。これらの結果は、Ｌｉｎ−／ＣＤ８６＋＋／ＤＲ＋集団は、ＤＣが成熟する
４０時間の培養期間の間に現れることを示す（図３Ｃ〜Ｄ）。さらなるフローサ
イトメトリー分析は、Ｌｉｎ−／ＣＤ８６＋＋／ＤＲ＋集団はまた、他のＤＣ関
連の副刺激性の接着分子（例えば、ＣＤ１ａ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４０、ＣＤ５４
、およびＣＤ８０）を発現することを示した。系統マーカーの非存在およびＤＣ
と関連することが公知のマーカーの同時発現は、成熟ＤＣについてのマーカーと
してＬｉｎ−／ＣＤ８６＋＋／ＤＲ＋表現型を確認した。
【００７４】
（実施例３：成熟ＤＣの生物学的活性）
ＤＣは、最も強力なＡＰＣであることが当該分野において公知であり、これは
、同種刺激性であり、ナイーブＴ細胞にＡｇを提示し得る。
、同種刺激性であり、ナイーブＴ細胞にＡｇを提示し得る。
【００７５】
Ｌｉｎ−／ＣＤ８６＋＋／ＤＲ＋集団の機能的能力を、同種刺激およびＡｇ提
示に関してＬｉｎ＋／ＤＲ＋細胞の機能的能力と比較した。Ｌｉｎ＋／ＤＲ＋集
団は、プロフェッショナルＡＰＣの２つの型である単球／マクロファージ（ＣＤ
１４＋細胞）およびＢリンパ球（ＣＤ１９＋細胞）を含む。
示に関してＬｉｎ＋／ＤＲ＋細胞の機能的能力と比較した。Ｌｉｎ＋／ＤＲ＋集
団は、プロフェッショナルＡＰＣの２つの型である単球／マクロファージ（ＣＤ
１４＋細胞）およびＢリンパ球（ＣＤ１９＋細胞）を含む。
【００７６】
ＤＣＰを、上記のように組換えＨＥＲ−２／ｎｅｕまたはＰＡ２０２４のいず
れかの存在下で培養し、そして、Ｌｉｎ−／ＣＤ８６＋＋／ＤＲ＋集団を。ＢＤ
Ｓ５６（Ｄｅｎｄｒｅｏｎ Ｃｏｒｐ．）を使用する浮遊密度遠心分離によって
濃縮した。界面から収集した細胞を、ＦＡＣＳによってソートして、Ｌｉｎ−／
ＣＤ８６＋＋／ＤＲ＋細胞集団およびＬｉｎ＋／ＤＲ＋細胞集団を収集した。
れかの存在下で培養し、そして、Ｌｉｎ−／ＣＤ８６＋＋／ＤＲ＋集団を。ＢＤ
Ｓ５６（Ｄｅｎｄｒｅｏｎ Ｃｏｒｐ．）を使用する浮遊密度遠心分離によって
濃縮した。界面から収集した細胞を、ＦＡＣＳによってソートして、Ｌｉｎ−／
ＣＤ８６＋＋／ＤＲ＋細胞集団およびＬｉｎ＋／ＤＲ＋細胞集団を収集した。
【００７７】
各ＦＡＣＳソートされた集団を、同種Ｔ細胞を応答因子として使用して、ＭＬ
Ｒにおける同種刺激活性について、そして同種Ｔ細胞に腫瘍Ａｇを提示する能力
について試験した。モックソートされた細胞およびＡｇの非存在下で培養された
細胞を、アッセイにおけるコントロールＡＰＣとして含んだ。
Ｒにおける同種刺激活性について、そして同種Ｔ細胞に腫瘍Ａｇを提示する能力
について試験した。モックソートされた細胞およびＡｇの非存在下で培養された
細胞を、アッセイにおけるコントロールＡＰＣとして含んだ。
【００７８】
組換えＨＥＲ−２／ｎｅｕまたはＰＡ２０２４のいずれかとともに培養した後
にソートされたＬｉｎ−／ＣＤ８６＋＋／ＤＲ＋細胞は、同種刺激活性を示した
。これは、１００刺激因子／ウェル未満で検出され得た。同種刺激活性の能力を
、ＥＣ50（半最大Ｔ細胞増殖（ｈａｌｆ−ｍａｚｉｍａｌ Ｔ ｃｅｌｌ ｐｒ
ｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）を誘発するために必要とされる刺激因子またはＡＰＣ
の数であり、低いＥＣ50は強力なＡＰＣを示す）として算出した。
にソートされたＬｉｎ−／ＣＤ８６＋＋／ＤＲ＋細胞は、同種刺激活性を示した
。これは、１００刺激因子／ウェル未満で検出され得た。同種刺激活性の能力を
、ＥＣ50（半最大Ｔ細胞増殖（ｈａｌｆ−ｍａｚｉｍａｌ Ｔ ｃｅｌｌ ｐｒ
ｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）を誘発するために必要とされる刺激因子またはＡＰＣ
の数であり、低いＥＣ50は強力なＡＰＣを示す）として算出した。
【００７９】
Ｌｉｎ−／ＣＤ８６＋＋／ＤＲ＋表現型を有する細胞は、Ｌｉｎ＋／ＤＲ＋細
胞、モックソートされた細胞またはソートされなかったＢＤＳ５６界面の細胞よ
り約２０倍高い同種刺激活性を有した（図４および５）。表２は、ＢＡ（ＨＥＲ
−２／ｎｅｕ−ＧＭ−ＣＳＦ）融合タンパク質またはＰＡ２０２４（前立腺酸ホ
スファターゼ−ＧＭ−ＣＳＦ）融合タンパク質とのインキュベーション後の、Ｌ
ｉｎ−／ＣＤ８６＋＋／ＤＲ＋表現型またはＬｉｎ＋／ＤＲ＋表現型を有する細
胞によるＭＬＲにおける同種刺激についてのおよそのＥＣ50値を示す。
胞、モックソートされた細胞またはソートされなかったＢＤＳ５６界面の細胞よ
り約２０倍高い同種刺激活性を有した（図４および５）。表２は、ＢＡ（ＨＥＲ
−２／ｎｅｕ−ＧＭ−ＣＳＦ）融合タンパク質またはＰＡ２０２４（前立腺酸ホ
スファターゼ−ＧＭ−ＣＳＦ）融合タンパク質とのインキュベーション後の、Ｌ
ｉｎ−／ＣＤ８６＋＋／ＤＲ＋表現型またはＬｉｎ＋／ＤＲ＋表現型を有する細
胞によるＭＬＲにおける同種刺激についてのおよそのＥＣ50値を示す。
【００８０】
（表２）
【００８１】
【表２】
Ｌｉｎ−／ＣＤ８６＋＋／ＤＲ＋集団の機能的能力をまた、自己Ｔ細胞に関し
てＬｉｎ＋／ＤＲ＋細胞の機能的能力と比較した。ＦＡＣＳソートされたＬｉｎ
−／ＣＤ８６＋＋／ＤＲ＋集団はまた、ナイーブＡｇを提示する強力な能力を示
した。ＥＣ50について比較した場合、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕをロードされたＬｉｎ
−／ＣＤ８６＋＋／ＤＲ＋細胞およびＰＡ２０２４をロードされたＬｉｎ−／Ｃ
Ｄ８６＋＋／ＤＲ＋細胞は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕをロードされたＬｉｎ＋／ＤＲ
＋細胞またはＰＡ２０２４をロードされたＬｉｎ＋／ＤＲ＋細胞よりも少なくと
も２０倍Ｔ細胞に対してより刺激性であった（図６および図７、表３）。
てＬｉｎ＋／ＤＲ＋細胞の機能的能力と比較した。ＦＡＣＳソートされたＬｉｎ
−／ＣＤ８６＋＋／ＤＲ＋集団はまた、ナイーブＡｇを提示する強力な能力を示
した。ＥＣ50について比較した場合、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕをロードされたＬｉｎ
−／ＣＤ８６＋＋／ＤＲ＋細胞およびＰＡ２０２４をロードされたＬｉｎ−／Ｃ
Ｄ８６＋＋／ＤＲ＋細胞は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕをロードされたＬｉｎ＋／ＤＲ
＋細胞またはＰＡ２０２４をロードされたＬｉｎ＋／ＤＲ＋細胞よりも少なくと
も２０倍Ｔ細胞に対してより刺激性であった（図６および図７、表３）。
【００８２】
（表３）
【００８３】
【表３】
まとめると、これらの結果は、Ｌｉｎ−／ＣＤ８６＋＋／ＤＲ＋集団が、強力
な同種刺激性だけでなくナイーブ腫瘍関連Ａｇを提示し得るＡＰＣを示すことを
示す。
な同種刺激性だけでなくナイーブ腫瘍関連Ａｇを提示し得るＡＰＣを示すことを
示す。
【００８４】
（実施例４：ＤＣＰの濃縮およびＤＣへのこれらの成熟）
ＤＣＰを、浮遊密度遠心分離によって白血球搬出法産物から濃縮した。細胞を
さらに、ＤＲ＋細胞の選択のためのＤＲ免疫磁気ビーズを使用してＬｉｎ−／Ｄ
Ｒ＋細胞について濃縮し、次いで、それぞれＣＤ３ビーズ、ＣＤ１４ビーズおよ
びＣＤ１９ビーズを用いてＴリンパ球、単球／マクロファージおよびＢ細胞を免
疫磁気除去した。図８は、培養前のＬｉｎ−／ＤＲ＋細胞がＣＤ８６について弱
くポジティブ（強くはなくポジティブ）であることを示し、そしてＤＣＰ集団が
、免疫磁気選択／除去に続いて代表的には約０．５〜１．０％（図８Ａ、Ｂ）か
ら約５０％（８Ｃ、Ｄ）まで濃縮されることを示す。濃縮されたＤＣＰは、バル
クの（分離していない）ＤＣＰとの４０時間にわたる同時培養後に、ＤＣに成熟
する（図８Ｅ、Ｆ）。成熟ＤＣのこの集団は、分化した樹状細胞の機能に関連す
る関連副刺激性分子（ＣＤ１ａ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４０、ＣＤ５４およびＣＤ８
０を含む）の全てを発現する。
さらに、ＤＲ＋細胞の選択のためのＤＲ免疫磁気ビーズを使用してＬｉｎ−／Ｄ
Ｒ＋細胞について濃縮し、次いで、それぞれＣＤ３ビーズ、ＣＤ１４ビーズおよ
びＣＤ１９ビーズを用いてＴリンパ球、単球／マクロファージおよびＢ細胞を免
疫磁気除去した。図８は、培養前のＬｉｎ−／ＤＲ＋細胞がＣＤ８６について弱
くポジティブ（強くはなくポジティブ）であることを示し、そしてＤＣＰ集団が
、免疫磁気選択／除去に続いて代表的には約０．５〜１．０％（図８Ａ、Ｂ）か
ら約５０％（８Ｃ、Ｄ）まで濃縮されることを示す。濃縮されたＤＣＰは、バル
クの（分離していない）ＤＣＰとの４０時間にわたる同時培養後に、ＤＣに成熟
する（図８Ｅ、Ｆ）。成熟ＤＣのこの集団は、分化した樹状細胞の機能に関連す
る関連副刺激性分子（ＣＤ１ａ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４０、ＣＤ５４およびＣＤ８
０を含む）の全てを発現する。
【００８５】
（実施例５：ＣＤ５４＋細胞の生物学的活性）
接着分子ＣＤ５４は、ＤＣを含むＡＰＣ上に発現され、そしてＡＰＣによるＴ
細胞の活性化において役割を担う。
細胞の活性化において役割を担う。
【００８６】
ＣＤ５４＋集団の機能的能力を、同種刺激性およびＡｇ提示に関してＣＤ５４
−集団の機能的能力と比較した。ＤＣＰを、１０μｇ／ｍｌでのＰＡ２０２４の
存在下で（上記のように）培養し、そして細胞を、ＦＡＣＳによってソートして
、ＣＤ５４＋集団およびＣＤ５４−集団を収集した。各ソートされた集団を、Ｍ
ＬＲにおける同種刺激活性について（図９）、および自己Ｔ細胞にＡｇを提示す
る能力について（図１０）試験した。モックソートされた細胞およびＡｇの非存
在下で培養された細胞を、アッセイにおいてコントロールＡＰＣとして含めた。
−集団の機能的能力と比較した。ＤＣＰを、１０μｇ／ｍｌでのＰＡ２０２４の
存在下で（上記のように）培養し、そして細胞を、ＦＡＣＳによってソートして
、ＣＤ５４＋集団およびＣＤ５４−集団を収集した。各ソートされた集団を、Ｍ
ＬＲにおける同種刺激活性について（図９）、および自己Ｔ細胞にＡｇを提示す
る能力について（図１０）試験した。モックソートされた細胞およびＡｇの非存
在下で培養された細胞を、アッセイにおいてコントロールＡＰＣとして含めた。
【００８７】
ＰＡ２０２４をロードされたＣＤ５４＋（ＰＡ２０２４ ＣＤ５４＋）は、モ
ックソートされた細胞（ＰＡ２０２４ モックソート（Ｍｏｃｋ−ｓｏｒｔ））
の同種刺激性およびＡｇ提示活性より約４倍高い同種刺激性およびＡｇ提示活性
を示した。ＰＡ２０２４をロードされたＣＤ５４−細胞（ＰＡ２０２４ ＣＤ５
４−）は、ＭＬＲまたはＡｇ提示活性のいずれにおいても活性ではなかった。同
様に、Ａｇの非存在下（Ａｇなし）で培養されたソートされなかった細胞は、Ａ
ｇ提示活性において活性ではなかった。これらの結果は、ＣＤ５４＋集団が同種
刺激性であるだけではなくナイーブ腫瘍関連Ａｇを提示し得るＡＰＣを示すこと
を示す。
ックソートされた細胞（ＰＡ２０２４ モックソート（Ｍｏｃｋ−ｓｏｒｔ））
の同種刺激性およびＡｇ提示活性より約４倍高い同種刺激性およびＡｇ提示活性
を示した。ＰＡ２０２４をロードされたＣＤ５４−細胞（ＰＡ２０２４ ＣＤ５
４−）は、ＭＬＲまたはＡｇ提示活性のいずれにおいても活性ではなかった。同
様に、Ａｇの非存在下（Ａｇなし）で培養されたソートされなかった細胞は、Ａ
ｇ提示活性において活性ではなかった。これらの結果は、ＣＤ５４＋集団が同種
刺激性であるだけではなくナイーブ腫瘍関連Ａｇを提示し得るＡＰＣを示すこと
を示す。
【図１】
図１は、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）の結果を示す。ここで、Ａｇをロードさ
れた成熟ＤＣの培養物中の種々の細胞型を、刺激細胞（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ
ｃｅｌｌ）としてのこれらの相対的効力について評価した。分析した細胞集団は
以下を含む：ＰＡ（除去せず）（ＰＡ２０２４をロードされ、除去されなかった
成熟ＤＣ）；ＰＡ−ＣＤ１４（ＣＤ１４細胞が除去されたＰＡ２０２４をロード
された成熟ＤＣ培養物）；ＰＡ−ＣＤ１９（ＣＤ１９細胞が除去されたＰＡ２０
２４をロードされた成熟ＤＣ培養物）；およびＰＡ−ＣＤ１４／ＣＤ１９（ＣＤ
１４細胞およびＣＤ１９細胞が除去されたＰＡ２０２４をロードされた成熟ＤＣ
培養物）。Ａｇをロードされた成熟ＤＣ培養物（刺激因子（ｓｔｉｍｕｌａｔｏ
ｒ））由来の種々の細胞集団の、同種Ｔ細胞（応答因子（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）
）とのインキュベーション後の3Ｈ−ＴｄＲ取り込みの結果を、示す。
れた成熟ＤＣの培養物中の種々の細胞型を、刺激細胞（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ
ｃｅｌｌ）としてのこれらの相対的効力について評価した。分析した細胞集団は
以下を含む：ＰＡ（除去せず）（ＰＡ２０２４をロードされ、除去されなかった
成熟ＤＣ）；ＰＡ−ＣＤ１４（ＣＤ１４細胞が除去されたＰＡ２０２４をロード
された成熟ＤＣ培養物）；ＰＡ−ＣＤ１９（ＣＤ１９細胞が除去されたＰＡ２０
２４をロードされた成熟ＤＣ培養物）；およびＰＡ−ＣＤ１４／ＣＤ１９（ＣＤ
１４細胞およびＣＤ１９細胞が除去されたＰＡ２０２４をロードされた成熟ＤＣ
培養物）。Ａｇをロードされた成熟ＤＣ培養物（刺激因子（ｓｔｉｍｕｌａｔｏ
ｒ））由来の種々の細胞集団の、同種Ｔ細胞（応答因子（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）
）とのインキュベーション後の3Ｈ−ＴｄＲ取り込みの結果を、示す。
【図２】
図２は、Ａｇをロードされた成熟ＤＣの種々の集団のＡｇ提示能を示す。分析
した細胞集団を、図１に示し、各細胞集団（ＡＰＣ）と同種Ｔ細胞とのインキュ
ベーション後の3Ｈ−ＴｄＲ取り込みの結果を、示す。
した細胞集団を、図１に示し、各細胞集団（ＡＰＣ）と同種Ｔ細胞とのインキュ
ベーション後の3Ｈ−ＴｄＲ取り込みの結果を、示す。
【図３Ａ】
図３Ａは、ＰｅｒＣＰ−ＤＲ抗体、ＦＩＴＣ−系統（ｌｉｎｅａｇｅ）抗体お
よびＰＥ−ＣＤ８６抗体での染色に続く、０時間でのＤＣＰの３色ＦＡＣＳ分析
の結果を示す。Ａにおいて選択される（ｇａｔｅｄ）ような示される０時間での
Ｌｉｎ−／ＤＲ＋細胞は、Ｂにおいて示されるようにＣＤ８６について弱くポジ
ティブである。このことは、Ｌｉｎ−／ＣＤ８６＋＋／ＤＲ＋表現型は、０時間
では存在しないことを示す。
よびＰＥ−ＣＤ８６抗体での染色に続く、０時間でのＤＣＰの３色ＦＡＣＳ分析
の結果を示す。Ａにおいて選択される（ｇａｔｅｄ）ような示される０時間での
Ｌｉｎ−／ＤＲ＋細胞は、Ｂにおいて示されるようにＣＤ８６について弱くポジ
ティブである。このことは、Ｌｉｎ−／ＣＤ８６＋＋／ＤＲ＋表現型は、０時間
では存在しないことを示す。
【図３Ｂ】
図３Ｂは、ＰｅｒＣＰ−ＤＲ抗体、ＦＩＴＣ−系統（ｌｉｎｅａｇｅ）抗体お
よびＰＥ−ＣＤ８６抗体での染色に続く、０時間でのＤＣＰの３色ＦＡＣＳ分析
の結果を示す。Ａにおいて選択されるような示される０時間でのＬｉｎ−／ＤＲ
＋細胞は、Ｂにおいて示されるようにＣＤ８６について弱くポジティブである。
このことは、Ｌｉｎ−／ＣＤ８６＋＋／ＤＲ＋表現型は、０時間では存在しない
ことを示す。
よびＰＥ−ＣＤ８６抗体での染色に続く、０時間でのＤＣＰの３色ＦＡＣＳ分析
の結果を示す。Ａにおいて選択されるような示される０時間でのＬｉｎ−／ＤＲ
＋細胞は、Ｂにおいて示されるようにＣＤ８６について弱くポジティブである。
このことは、Ｌｉｎ−／ＣＤ８６＋＋／ＤＲ＋表現型は、０時間では存在しない
ことを示す。
【図３Ｃ】
図３Ｃは、ＰｅｒＣＰ−ＤＲ抗体、ＦＩＴＣ−系統（ｌｉｎｅａｇｅ）抗体お
よびＰＥ−ＣＤ８６抗体での染色に続く、４０時間でのＤＣＰの３色ＦＡＣＳ分
析の結果を示す。Ｃにおいて選択されるような示される４０時間でのＬｉｎ−／
ＤＲ＋細胞は、Ｄに示されるようにＣＤ８６を強く発現する。このことは、Ｌｉ
ｎ−／ＣＤ８６＋＋／ＤＲ＋表現型は、４０時間培養後ではＣＤ８６で明るく色
づくことを示す。
よびＰＥ−ＣＤ８６抗体での染色に続く、４０時間でのＤＣＰの３色ＦＡＣＳ分
析の結果を示す。Ｃにおいて選択されるような示される４０時間でのＬｉｎ−／
ＤＲ＋細胞は、Ｄに示されるようにＣＤ８６を強く発現する。このことは、Ｌｉ
ｎ−／ＣＤ８６＋＋／ＤＲ＋表現型は、４０時間培養後ではＣＤ８６で明るく色
づくことを示す。
【図３Ｄ】
図３Ｄは、ＰｅｒＣＰ−ＤＲ抗体、ＦＩＴＣ−系統（ｌｉｎｅａｇｅ）抗体お
よびＰＥ−ＣＤ８６抗体での染色に続く、４０時間でのＤＣＰの３色ＦＡＣＳ分
析の結果を示す。Ｃにおいて選択されるような示される４０時間でのＬｉｎ−／
ＤＲ＋細胞は、Ｄに示されるようにＣＤ８６を強く発現する。このことは、Ｌｉ
ｎ−／ＣＤ８６＋＋／ＤＲ＋表現型は、４０時間培養後ではＣＤ８６で明るく色
づくことを示す。
よびＰＥ−ＣＤ８６抗体での染色に続く、４０時間でのＤＣＰの３色ＦＡＣＳ分
析の結果を示す。Ｃにおいて選択されるような示される４０時間でのＬｉｎ−／
ＤＲ＋細胞は、Ｄに示されるようにＣＤ８６を強く発現する。このことは、Ｌｉ
ｎ−／ＣＤ８６＋＋／ＤＲ＋表現型は、４０時間培養後ではＣＤ８６で明るく色
づくことを示す。
【図４】
図４は、ＭＬＲの結果を示し、ここで、ＨＥＲ−２／ｎｅｕをロードされた成
熟で、モック（ｍｏｃｋ）ソートされたＤＣ（「ＢＡモックソート」）、ＨＥＲ
−２／ｎｅｕをロードされたＡＰＣ（伝統的なＡＰＣ表現型を有する）（「ＢＡ Ｌｉｎ＋／ＤＲ＋」）、およびＨＥＲ−２／ｎｅｕをロードされたＤＣ（本明
細書中に記載された表現型を有する）（「ＢＡ Ｌｉｎ−／８６＋＋／ＤＲ＋」
）を、刺激細胞としてのこれらの相対効力について評価した。各細胞集団と同種
Ｔ細胞とのインキュベーション後の3Ｈ−ＴｄＲ取り込みの結果を、示す。
熟で、モック（ｍｏｃｋ）ソートされたＤＣ（「ＢＡモックソート」）、ＨＥＲ
−２／ｎｅｕをロードされたＡＰＣ（伝統的なＡＰＣ表現型を有する）（「ＢＡ Ｌｉｎ＋／ＤＲ＋」）、およびＨＥＲ−２／ｎｅｕをロードされたＤＣ（本明
細書中に記載された表現型を有する）（「ＢＡ Ｌｉｎ−／８６＋＋／ＤＲ＋」
）を、刺激細胞としてのこれらの相対効力について評価した。各細胞集団と同種
Ｔ細胞とのインキュベーション後の3Ｈ−ＴｄＲ取り込みの結果を、示す。
【図５】
図５は、ＭＬＲの結果を示し、ここで、ＢＤＳ５６で浮遊密度遠心分離によっ
て濃縮された、ＰＡ２０２４をロードされた成熟ＤＣ（「ＰＡ５６Ｉ（ソートさ
れず）」）、ＰＡ２０２４をロードされたＡＰＣ（伝統的なＡＰＣ表現型を有す
る）（「ＰＡ Ｌｉｎ＋／ＤＲ＋」）、およびＰＡ２０２４で刺激されたＤＣ（
本明細書中に記載された表現型を有する）、Ｌｉｎ−／８６＋＋／ＤＲ＋「ＰＡ Ｌｉｎ−／８６＋＋／ＤＲ＋」を、刺激細胞としてのこれらの相対効力につい
て評価した。各細胞集団と同種Ｔ細胞とのインキュベーション後に3Ｈ−ＴｄＲ
取り込みの結果を、示す。
て濃縮された、ＰＡ２０２４をロードされた成熟ＤＣ（「ＰＡ５６Ｉ（ソートさ
れず）」）、ＰＡ２０２４をロードされたＡＰＣ（伝統的なＡＰＣ表現型を有す
る）（「ＰＡ Ｌｉｎ＋／ＤＲ＋」）、およびＰＡ２０２４で刺激されたＤＣ（
本明細書中に記載された表現型を有する）、Ｌｉｎ−／８６＋＋／ＤＲ＋「ＰＡ Ｌｉｎ−／８６＋＋／ＤＲ＋」を、刺激細胞としてのこれらの相対効力につい
て評価した。各細胞集団と同種Ｔ細胞とのインキュベーション後に3Ｈ−ＴｄＲ
取り込みの結果を、示す。
【図６】
図６は、図４について記載される種々の細胞集団のＡｇ提示能、およびＡｇの
非存在下で培養された細胞のＡｇ提示能を、各細胞集団と同種Ｔ細胞とのインキ
ュベーション後の3Ｈ−ＴｄＲ取り込みの結果とともに示す。
非存在下で培養された細胞のＡｇ提示能を、各細胞集団と同種Ｔ細胞とのインキ
ュベーション後の3Ｈ−ＴｄＲ取り込みの結果とともに示す。
【図７】
図７は、図５について記載される種々の細胞集団のＡｇ提示能、およびＡｇの
非存在下で培養された細胞のＡｇ提示能を、各細胞集団と同種Ｔ細胞とのインキ
ュベーション後の3Ｈ−ＴｄＲ取り込みの結果とともに示す。
非存在下で培養された細胞のＡｇ提示能を、各細胞集団と同種Ｔ細胞とのインキ
ュベーション後の3Ｈ−ＴｄＲ取り込みの結果とともに示す。
【図８】
図８は、ＤＣＰのフローサイトメトリー分析の結果を示す。ＤＲ免疫磁気ビー
ズを使用してＬｉｎ−／ＤＲ＋細胞についてＤＣＰを濃縮し、次いで、それぞれ
ＣＤ３、ＣＤ４およびＣＤ１９の免疫原性ビーズを使用して、Ｔリンパ球、単球
／マクロファージおよびＢリンパ球を除去した。ＤＣＰを、系統ネガティブ、Ｃ
Ｄ８６について弱くポジティブ（強くはなくポジティブ）およびＤＲポジティブ
として表現型的に特徴付け得た（Ｌｉｎ−／８６±／ＤＲ＋）。免疫磁気選択お
よび上記の除去工程を実施することによって、集団を、約０．５〜１．０％（図
８Ａ、Ｂ）から約５０％（図８Ｃ、Ｄ）まで濃縮し得る。適切な条件下で、ＤＣ
Ｐは、Ｌｉｎ−／８６＋＋／ＤＲ＋の表現型を有する成熟ＤＣに分化し（図８Ｅ
、Ｆ）、次いで、それを上記の分離工程に供されなかったＰＢＭＣと４０時間同
時培養する。図８Ａ、ＣおよびＥのＬｉｎ−／ＤＲ＋細胞について選択された（
ｇａｔｅｄ）集団を、ＣＤ８６発現についてそれぞれ図８Ｂ、ＤおよびＦに示す
。
ズを使用してＬｉｎ−／ＤＲ＋細胞についてＤＣＰを濃縮し、次いで、それぞれ
ＣＤ３、ＣＤ４およびＣＤ１９の免疫原性ビーズを使用して、Ｔリンパ球、単球
／マクロファージおよびＢリンパ球を除去した。ＤＣＰを、系統ネガティブ、Ｃ
Ｄ８６について弱くポジティブ（強くはなくポジティブ）およびＤＲポジティブ
として表現型的に特徴付け得た（Ｌｉｎ−／８６±／ＤＲ＋）。免疫磁気選択お
よび上記の除去工程を実施することによって、集団を、約０．５〜１．０％（図
８Ａ、Ｂ）から約５０％（図８Ｃ、Ｄ）まで濃縮し得る。適切な条件下で、ＤＣ
Ｐは、Ｌｉｎ−／８６＋＋／ＤＲ＋の表現型を有する成熟ＤＣに分化し（図８Ｅ
、Ｆ）、次いで、それを上記の分離工程に供されなかったＰＢＭＣと４０時間同
時培養する。図８Ａ、ＣおよびＥのＬｉｎ−／ＤＲ＋細胞について選択された（
ｇａｔｅｄ）集団を、ＣＤ８６発現についてそれぞれ図８Ｂ、ＤおよびＦに示す
。
【図９】
図９は、ＭＬＲの結果を示し、ここで、ＰＡ２０２４をロードされた成熟で、
モックソートされたＤＣ（ＰＡ２０２４モックソート）、ＰＡ２０２４をロード
された、ＦＡＣＳソートされたＣＤ５４＋細胞（ＰＡ２０２４ ＣＤ５４＋）、
およびＰＡ２０２４をロードされたＣＤ５４−細胞（ＰＡ２０２４ ＣＤ５４−
）を、刺激細胞としてのこれらの相対効力について評価した。各細胞集団と同種
Ｔ細胞とのインキュベーション後の3Ｈ−ＴｄＲ取り込みの結果を、示す。
モックソートされたＤＣ（ＰＡ２０２４モックソート）、ＰＡ２０２４をロード
された、ＦＡＣＳソートされたＣＤ５４＋細胞（ＰＡ２０２４ ＣＤ５４＋）、
およびＰＡ２０２４をロードされたＣＤ５４−細胞（ＰＡ２０２４ ＣＤ５４−
）を、刺激細胞としてのこれらの相対効力について評価した。各細胞集団と同種
Ｔ細胞とのインキュベーション後の3Ｈ−ＴｄＲ取り込みの結果を、示す。
【図１０】
図１０は、図９について記載される種々の細胞集団のＡｇ提示能、およびＡｇ
の非存在下（Ａｇなし）で培養された細胞のＡｇ提示能を、各細胞集団と同種Ｔ
細胞とのインキュベーション後の3Ｈ−ＴｄＲ取り込みの結果とともに示す。
の非存在下（Ａｇなし）で培養された細胞のＡｇ提示能を、各細胞集団と同種Ｔ
細胞とのインキュベーション後の3Ｈ−ＴｄＲ取り込みの結果とともに示す。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
Ｆターム(参考） 4B065 AA93 BB32 BD15 CA44
4C087 AA01 AA02 BB34 BB63 DA27
NA14 ZB09 ZB26
Claims (18)
- 【請求項１】 樹状細胞（ＤＣ）組成物であって、以下： 系統ネガティブ、ＣＤ８６について強いポジティブかつＤＲポジティブ（Ｌｉ
ｎ−／ＣＤ８６＋＋／ＤＲ＋）として特徴付けられる細胞型に関して実質的に純
粋な、末梢血単核細胞、 を含む、組成物。 - 【請求項２】 樹状細胞前駆体（ＤＣＰ）組成物であって、以下： 系統ネガティブ、ＣＤ８６について強くはないポジティブかつＤＲポジティブ
（Ｌｉｎ−／ＣＤ８６±／ＤＲ＋）として特徴付けられる細胞型に関して実質的
に純粋な、末梢血単核細胞、 を含む、組成物。 - 【請求項３】 前記細胞がさらに、ＣＤ１ａネガティブ、ＣＤ１１ｃネガテ
ィブまたはポジティブ、ＣＤ４０について強くはないポジティブ、ＣＤ５４につ
いて強くはないポジティブおよびＣＤ８０ネガティブであるとして特徴付けられ
る、請求項４に記載の細胞組成物。 - 【請求項４】 樹状細胞組成物であって、以下の工程： （ａ）被験体から血液サンプルを得る工程； （ｂ）樹状細胞前駆体（ＤＣＰ）の集団を得るために効果的な様式において、
該血液サンプルを濃縮する工程； （ｃ）樹状細胞（ＤＣ）の集団を得るために効果的な様式で該ＤＣＰをエキソ
ビボで培養する工程であって、該ＤＣはｌｉｎ−、ＣＤ８６＋＋およびＤＲ＋（
Ｌｉｎ−／ＣＤ８６＋＋／ＤＲ＋）として特徴付けられる、工程、 を包含するプロセスによって調製される、組成物。 - 【請求項５】 請求項４に記載の細胞組成物であって、ここで、前記濃縮工
程が、１以上の浮遊密度遠心分離、免疫磁気選択／除去および蛍光活性化セルソ
ーティング（ＦＡＣＳ）を含む、組成物。 - 【請求項６】 請求項４に記載の細胞組成物であって、ここで、前記培養工
程が、外因的に添加されるサイトカインの非存在下での無血清培地におけるＤＣ
Ｐのインビトロでの培養を含む、組成物。 - 【請求項７】 請求項４に記載の細胞組成物であって、ここで、前記プロセ
スはさらに以下の工程： （ｄ）さらなる浮遊密度遠心分離によって前記ＤＣを濃縮する工程；ならびに （ｅ）前記ＤＣ組成物からＣＤ１４およびＣＤ１９の細胞表面発現についてポ
ジティブである細胞を除去する工程；または （ｆ）Ｌｉｎ−／ＣＤ８６＋＋／ＤＲ＋細胞についてのＦＡＣＳ分類する工程
、 を包含する、組成物。 - 【請求項８】 請求項１または４に記載のＤＣ組成物であって、ここで、該
細胞がさらに、同種刺激性でありかつ自己Ｔ細胞に抗原を提示し得るとして特徴
付けられる、組成物。 - 【請求項９】 請求項１または４に記載のＤＣ組成物であって、ここで、該
細胞がさらに、ＣＤ１ａ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４０、ＣＤ５４およびＣＤ８０の細
胞表面発現についてポジティブであるとして特徴付けられる、組成物。 - 【請求項１０】 請求項４〜７のいずれか１項に記載の組成物であって、前
記培養工程が、抗原をロードされた樹状細胞を得るために効果的な様式で、選択
された抗原に対してインビトロで前記ＤＣＰを曝露することを含む、組成物。 - 【請求項１１】 前記抗原がＨＥＲ−２／ｎｅｕである、請求項１０に記載
の組成物。 - 【請求項１２】 前記抗原がＰＡ２０２４である、請求項１０に記載の組成
物。 - 【請求項１３】 被験体における腫瘍を処置する際の医薬として使用するた
めの、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物。 - 【請求項１４】 既知の腫瘍抗原に対して被験体を免疫するための医薬の製
造のための、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物の使用。 - 【請求項１５】 樹状細胞組成物を得るための方法であって、以下の工程： （ａ）被験体から血液サンプルを得る工程； （ｂ）樹状細胞前駆体（ＤＣＰ）の集団を得るために効果的な様式で、該血液
サンプルを濃縮する工程； （ｃ）樹状細胞（ＤＣ）の集団を得るために効果的な様式で該ＤＣＰをエキソ
ビボで培養する工程であって、該ＤＣは、ｌｉｎ−、ＣＤ８６＋＋およびＤＲ＋
（Ｌｉｎ−／ＣＤ８６＋＋／ＤＲ＋）として特徴付けられる、工程、 を包含する、方法。 - 【請求項１６】 請求項１５に記載の方法であって、前記濃縮工程が、１以
上の浮遊密度遠心分離、免疫磁気選択／除去および蛍光活性化セルソーティング
（ＦＡＣＳ）を含む、方法。 - 【請求項１７】 請求項１５に記載の方法であって、前記培養工程が、外因
的に添加されるサイトカインの非存在下での無血清培地におけるＤＣＰの培養を
含む、方法。 - 【請求項１８】 請求項１５に記載の方法であって、該方法は、さらに以下
の工程： （ｄ）さらなる浮遊密度遠心分離によって前記ＤＣを濃縮する工程； （ｅ）前記ＤＣ組成物からＣＤ１４およびＣＤ１９の細胞表面発現についてポ
ジティブである細胞を除去する工程；または （ｆ）Ｌｉｎ−／ＣＤ８６＋＋／ＤＲ＋細胞についてのＦＡＣＳ分類する工程
、 を包含する、方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US15861899P | 1999-10-08 | 1999-10-08 | |
| US60/158,618 | 1999-10-08 | ||
| PCT/US2000/027651 WO2001027245A2 (en) | 1999-10-08 | 2000-10-06 | Generation and characterization of a dendritic cell isolated from human peripheral blood mononuclear cells |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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ID=22568957
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|---|---|---|---|
| JP2001530450A Withdrawn JP2003511064A (ja) | 1999-10-08 | 2000-10-06 | ヒト末梢血単核細胞由来の樹状細胞の産生および特徴付け |
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| Country | Link |
|---|---|
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| JP (1) | JP2003511064A (ja) |
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| CA (1) | CA2385792A1 (ja) |
| HK (1) | HK1045329A1 (ja) |
| WO (1) | WO2001027245A2 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007537975A (ja) * | 2003-06-10 | 2007-12-27 | ザ ユニバーシティー オブ メルボルン | 免疫調節性組成物、それらについての使用方法およびそれらの製造のための方法 |
| JPWO2006006638A1 (ja) * | 2004-07-08 | 2008-05-01 | 株式会社メディネット | 樹状細胞、該樹状細胞を含む医薬、該樹状細胞を用いた治療方法およびγδＴ細胞の培養方法 |
| KR101349249B1 (ko) * | 2007-08-24 | 2014-01-10 | (주)아모레퍼시픽 | 시험관내 피부 감작성 평가 방법 |
| JP2017528470A (ja) * | 2014-09-10 | 2017-09-28 | ミルテニー バイオテック ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツングＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ | 免疫療法に使用するための細胞集団 |
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| AU2003254382B2 (en) * | 2002-08-15 | 2008-11-13 | The Corporation Of The Trustees Of The Order Of The Sisters Of Mercy In Queensland | A method of characterizing dendritic cells |
| AU2002950778A0 (en) * | 2002-08-15 | 2002-09-12 | The Corporation Of The Trustees Of The Order Of The Sisters Of Mercy In Queensland | A method of characterizing dendritic cells |
| WO2008118369A2 (en) * | 2007-03-22 | 2008-10-02 | Dendreon Corporation | Methods for inducing a natural killer (nk) cell-mediated immune response and for increasing nk cell activity |
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| EP2505640A1 (en) | 2011-03-29 | 2012-10-03 | Neo Virnatech, S.L. | Vaccine compositions for birnavirus-borne diseases |
| EP3268012A4 (en) | 2015-03-12 | 2018-10-31 | Health Research, Inc. | Enrichment of cd16+ monocytes to improve dendritic cell vaccine quality |
| WO2018162450A1 (en) | 2017-03-06 | 2018-09-13 | Fundación Para La Investigación Médica Aplicada | New inmunostimulatory compositions comprising an entity of cold inducible rna-binding protein with an antigen for the activation of dendritic cells |
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| CN113151169A (zh) * | 2021-05-14 | 2021-07-23 | 上海赛笠生物科技有限公司 | 一种基于磁珠阳选策略分离自然杀伤细胞的方法 |
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-
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