CN109679903A - T淋巴细胞的分离纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种T淋巴细胞的分离纯化方法，该方法采用如下四个步骤：1)血浆分离；2)淋巴细胞的分离；3)淋巴细胞的洗涤；4)T淋巴细胞的纯化。本发明技术方案优化了T淋巴细胞的提取条件，有利于T淋巴细胞的有效利用。
Description
技术领域
本发明涉及细胞提取和分离技术领域，特别涉及一种T淋巴细胞的分离纯化方法。
背景技术
T细胞是人体两大淋巴细胞之一，在特异性细胞免疫中发挥着极为重要的作用。成熟T细胞在人体外周免疫器官的胸腺依赖区定居，并可经淋巴管、外周血和组织液等进行循环，发挥细胞免疫及免疫调节等功能。由于T细胞在细胞免疫中具有极强的特异性和很好的杀伤效果，因此，在免疫学基础研究中以及与免疫治疗相关的生物制药工业中，T细胞都有着广泛的应用前景。通常为获得较好的提取效果，T细胞通过采集脐带血进行分离提取。由于脐带血的来源有限，且因个体差异导致使用受限，不利于T淋巴细胞的有效利用。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种T淋巴细胞的分离纯化方法，旨在优化T淋巴细胞的提取条件，有利于T淋巴细胞的有效应用。
为实现上述目的，本发明提出的T淋巴细胞的分离纯化方法，包括如下步骤：
1)血浆分离：取全血加入一离心管，加入抗凝剂，在800g、4℃下离心15min后，吸取血浆至另一离心管中，于56℃灭火30min，相同条件下离心30min，去除沉淀，收集上清液；
2)淋巴细胞的分离：于一洁净试管中用0.9％NaCl注射液稀释全血，混合均匀；将上清液吸取至另一洁净离心管中，加入分离液，将稀释过的全血平铺至分离液液面上方，在300～500g、20℃下离心30min，出现白膜层；
3)淋巴细胞的洗涤：吸取白膜层至一离心管中，加入0.9％NaCl注射液稀释，混合均匀后在400～500g、20℃下离心10min，弃上清液，重复操作一次；
4)T淋巴细胞的纯化：细胞转移至离心管，加入磁珠分离液重悬，根据每107个细胞对应2μl～20μl CD3reagent的比例加入所需CD3Reagent，混合均匀，在4℃环境下静置15min；取出混匀，在300g、20℃下离心10min，弃上清液，加入磁珠分离液重悬，采用层析柱分离即可。
优选地，所述步骤2)淋巴细胞的分离中，采用的离心力为400g。
优选地，所述步骤4)T淋巴细胞的纯化中，细胞数对应CD3reagent的比例为每107个细胞对应5μl CD3reagent。
本发明技术方案通过直接采用全血，依次通过对血浆的分离，对淋巴细胞的分离、洗涤和纯化获得T淋巴细胞，优化了T淋巴细胞的提取条件。同时，利用CD3Reagent中CD3抗体的特异性，使CD3抗体通过特异性识别T淋巴细胞并与T淋巴细胞结合，以对T淋巴细胞进行标记。并采用层析柱分离，使未被标记的淋巴细胞通过磁珠分离液洗脱，被标记的T淋巴细胞留置于洗脱液中。从而使得T淋巴细胞的纯化效率能够达到99％以上，有利于T淋巴细胞的有效应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明在采用不同离心力条件下得到的细胞数及细胞活率数据图；
图2为本发明在CD3Reagent与细胞数采用不同用量比条件下得到的T淋巴细胞数及T淋巴细胞活率数据图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
另外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。
以下实施例中所采用的试剂，如无特别说明，则为市售。
实施例一
一种T淋巴细胞的分离纯化方法，包括如下步骤：
1)血浆分离：取全血加入一离心管，加入抗凝剂，在800g、4℃下离心15min后，吸取血浆至另一离心管中，于56℃灭火30min，相同条件下离心30min，去除沉淀，收集上清液；
2)淋巴细胞的分离：于一洁净试管中用0.9％NaCl注射液稀释全血，混合均匀；将5ml上清液吸取至另一洁净离心管中，加入分离液，将稀释过的全血平铺至分离液液面上方，在300g、20℃下离心30min，出现白膜层；
3)淋巴细胞的洗涤：吸取白膜层至一离心管中，加入0.9％NaCl注射液稀释，混合均匀后在400g、20℃下离心10min，弃上清液，重复操作一次；
4)T淋巴细胞的纯化：细胞转移至离心管，加入磁珠分离液重悬，根据每107个细胞对应2μl CD3reagent的比例加入所需CD3Reagent，混合均匀，在4℃环境下静置15min；取出混匀，在300g、20℃下离心10min，弃上清液，加入磁珠分离液重悬，采用层析柱分离即可。
实施例二
一种T淋巴细胞的分离纯化方法，包括如下步骤：
1)血浆分离：取全血加入一离心管，加入抗凝剂，在800g、4℃下离心15min后，吸取血浆至另一离心管中，于56℃灭火30min，相同条件下离心30min，去除沉淀，收集上清液；
2)淋巴细胞的分离：于一洁净试管中用0.9％NaCl注射液稀释全血，混合均匀；将5ml上清液吸取至另一洁净离心管中，加入分离液，将稀释过的全血平铺至分离液液面上方，在400g、20℃下离心30min，出现白膜层；
3)淋巴细胞的洗涤：吸取白膜层至一离心管中，加入0.9％NaCl注射液稀释，混合均匀后在450g、20℃下离心10min，弃上清液，重复操作一次；
4)T淋巴细胞的纯化：细胞转移至离心管，加入磁珠分离液重悬，根据每107个细胞对应2μl CD3reagent的比例加入所需CD3Reagent，混合均匀，在4℃环境下静置15min；取出混匀，在300g、20℃下离心10min，弃上清液，加入磁珠分离液重悬，采用层析柱分离即可。
实施例三
一种T淋巴细胞的分离纯化方法，包括如下步骤：
1)血浆分离：取全血加入一离心管，加入抗凝剂，在800g、4℃下离心15min后，吸取血浆至另一离心管中，于56℃灭火30min，相同条件下离心30min，去除沉淀，收集上清液；
2)淋巴细胞的分离：于一洁净试管中用0.9％NaCl注射液稀释全血，混合均匀；将5ml上清液吸取至另一洁净离心管中，加入分离液，将稀释过的全血平铺至分离液液面上方，在500g、20℃下离心30min，出现白膜层；
3)淋巴细胞的洗涤：吸取白膜层至一离心管中，加入0.9％NaCl注射液稀释，混合均匀后在500g、20℃下离心10min，弃上清液，重复操作一次；
4)T淋巴细胞的纯化：细胞转移至离心管，加入磁珠分离液重悬，根据每107个细胞对应2μl CD3reagent的比例加入所需CD3Reagent，混合均匀，在4℃环境下静置15min；取出混匀，在300g、20℃下离心10min，弃上清液，加入磁珠分离液重悬，采用层析柱分离即可。
实施例四
一种T淋巴细胞的分离纯化方法，包括如下步骤：
1)血浆分离：取全血加入一离心管，加入抗凝剂，在800g、4℃下离心15min后，吸取血浆至另一离心管中，于56℃灭火30min，相同条件下离心30min，去除沉淀，收集上清液；
2)淋巴细胞的分离：于一洁净试管中用0.9％NaCl注射液稀释全血，混合均匀；将5ml上清液吸取至另一洁净离心管中，加入分离液，将稀释过的全血平铺至分离液液面上方，在400g、20℃下离心30min，出现白膜层；
3)淋巴细胞的洗涤：吸取白膜层至一离心管中，加入0.9％NaCl注射液稀释，混合均匀后在450g、20℃下离心10min，弃上清液，重复操作一次；
4)T淋巴细胞的纯化：细胞转移至离心管，加入磁珠分离液重悬，根据每107个细胞对应5μl CD3reagent的比例加入所需CD3Reagent，混合均匀，在4℃环境下静置15min；取出混匀，在300g、20℃下离心10min，弃上清液，加入磁珠分离液重悬，采用层析柱分离即可。
实施例五
一种T淋巴细胞的分离纯化方法，包括如下步骤：
1)血浆分离：取全血加入一离心管，加入抗凝剂，在800g、4℃下离心15min后，吸取血浆至另一离心管中，于56℃灭火30min，相同条件下离心30min，去除沉淀，收集上清液；
2)淋巴细胞的分离：于一洁净试管中用0.9％NaCl注射液稀释全血，混合均匀；将5ml上清液吸取至另一洁净离心管中，加入分离液，将稀释过的全血平铺至分离液液面上方，在400g、20℃下离心30min，出现白膜层；
3)淋巴细胞的洗涤：吸取白膜层至一离心管中，加入0.9％NaCl注射液稀释，混合均匀后在450g、20℃下离心10min，弃上清液，重复操作一次；
4)T淋巴细胞的纯化：细胞转移至离心管，加入磁珠分离液重悬，根据每107个细胞对应10μl CD3reagent的比例加入所需CD3Reagent，混合均匀，在4℃环境下静置15min；取出混匀，在300g、20℃下离心10min，弃上清液，加入磁珠分离液重悬，采用层析柱分离即可。
实施例六
一种T淋巴细胞的分离纯化方法，包括如下步骤：
1)血浆分离：取全血加入一离心管，加入抗凝剂，在800g、4℃下离心15min后，吸取血浆至另一离心管中，于56℃灭火30min，相同条件下离心30min，去除沉淀，收集上清液；
2)淋巴细胞的分离：于一洁净试管中用0.9％NaCl注射液稀释全血，混合均匀；将5ml上清液吸取至另一洁净离心管中，加入分离液，将稀释过的全血平铺至分离液液面上方，在400g、20℃下离心30min，出现白膜层；
3)淋巴细胞的洗涤：吸取白膜层至一离心管中，加入0.9％NaCl注射液稀释，混合均匀后在450g、20℃下离心10min，弃上清液，重复操作一次；
4)T淋巴细胞的纯化：细胞转移至离心管，加入磁珠分离液重悬，根据每107个细胞对应15μl CD3reagent的比例加入所需CD3Reagent，混合均匀，在4℃环境下静置15min；取出混匀，在300g、20℃下离心10min，弃上清液，加入磁珠分离液重悬，采用层析柱分离即可。
实施例七
一种T淋巴细胞的分离纯化方法，包括如下步骤：
1)血浆分离：取全血加入一离心管，加入抗凝剂，在800g、4℃下离心15min后，吸取血浆至另一离心管中，于56℃灭火30min，相同条件下离心30min，去除沉淀，收集上清液；
2)淋巴细胞的分离：于一洁净试管中用0.9％NaCl注射液稀释全血，混合均匀；将5ml上清液吸取至另一洁净离心管中，加入分离液，将稀释过的全血平铺至分离液液面上方，在400g、20℃下离心30min，出现白膜层；
3)淋巴细胞的洗涤：吸取白膜层至一离心管中，加入0.9％NaCl注射液稀释，混合均匀后在450g、20℃下离心10min，弃上清液，重复操作一次；
4)T淋巴细胞的纯化：细胞转移至离心管，加入磁珠分离液重悬，根据每107个细胞对应20μl CD3reagent的比例加入所需CD3Reagent，混合均匀，在4℃环境下静置15min；取出混匀，在300g、20℃下离心10min，弃上清液，加入磁珠分离液重悬，采用层析柱分离即可。
由于T淋巴细胞的分离效率受到步骤2中淋巴细胞分离的直接影响，因此，该分离过程中的离心条件是决定分离效率的直接因素。在实施例一至三中，在相同条件下选择不同的离心力，并在步骤3细胞洗涤后，加入生理盐水重悬，用细胞仪计数可直接得出分离的细胞数和细胞活率，结果参见表一和附图1。
表一 淋巴细胞的分离过程中不同离心条件下的细胞活率
结合表一及附图1可看出，相同条件下，步骤2中淋巴细胞的分离过程中，随着离心力的增大，得到的细胞数目明显增加。但是当离心力为500g时，细胞数目没有明显增长，反而细胞活率下降，因此，在此过程中离心力为400g是较佳实施条件。
在T淋巴细胞的纯化过程中(步骤4)，采用了CD3reagent，CD3reagent是CD3抗体+磁珠，CD3抗体具有特异性，通过特异性识别T淋巴细胞并与T淋巴细胞结合，以对T淋巴细胞进行标记。采用层析柱分离，使未被标记的淋巴细胞通过磁珠分离液洗脱，被标记的T淋巴细胞留置于洗脱液中。因此，CD3Reagent的用量与细胞的比例是影响纯化的重要因素。
基于步骤2中得出的离心力条件，在同样的实验条件下，选用400g离心力，并在实施例四至七中分别选择了不同比例的CD3用量与细胞数，实验中的细胞数均采用细胞计数仪直接检测得到。实验结果参见表二和附图2。
表二 以107个细胞数目为例，分别使用的CD3Reagent用量为2μl、5μl、10μl、15μl、20μl，得到的T淋巴细胞参数
从表二和附图2中可看出，采用CD3Reagent对T淋巴细胞均具有较好的纯化效果，纯化后的T细胞比例均能达到99％以上，但是在2μl用量的情况下，纯化获得的T淋巴细胞数相对偏低。随着CD3Reagent用量的增加，纯化获得的T淋巴细胞数显著增加，但在5μl～20μl的范围内，随着用量的增倍，纯化后的细胞数是略微增加。因此，5μl～10μl是CD3Reagent用量的理想范围。
综上，本发明技术方案通过直接采用全血，依次通过对血浆的分离，对淋巴细胞的分离、洗涤和纯化获得T淋巴细胞，优化了T淋巴细胞的提取条件。同时，利用CD3Reagent中CD3抗体的特异性，使CD3抗体通过特异性识别T淋巴细胞并与T淋巴细胞结合，以对T淋巴细胞进行标记。并采用层析柱分离，使未被标记的淋巴细胞通过磁珠分离液洗脱，被标记的T淋巴细胞留置于洗脱液中。从而使得T淋巴细胞的纯化效率能够达到99％以上，有利于T淋巴细胞的有效应用。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (3)
1.一种T淋巴细胞的分离纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)血浆分离：取全血加入一离心管，加入抗凝剂，在800g、4℃下离心15min后，吸取血浆至另一离心管中，于56℃灭火30min，相同条件下离心30min，去除沉淀，收集上清液；
2)淋巴细胞的分离：于一洁净试管中用0.9％NaCl注射液稀释全血，混合均匀；将上清液吸取至另一洁净离心管中，加入分离液，将稀释过的全血平铺至分离液液面上方，在300～500g、20℃下离心30min，出现白膜层；
3)淋巴细胞的洗涤：吸取白膜层至一离心管中，加入0.9％NaCl注射液稀释，混合均匀后在400～500g、20℃下离心10min，弃上清液，重复操作一次；
4)T淋巴细胞的纯化：细胞转移至离心管，加入磁珠分离液重悬，根据每107个细胞对应2μl～20μl CD3 reagent的比例加入所需CD3 Reagent，混合均匀，在4℃环境下静置15min；取出混匀，在300g、20℃下离心10min，弃上清液，加入磁珠分离液重悬，采用层析柱分离即可。
2.如权利要求1所述的T淋巴细胞的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤2)淋巴细胞的分离中，采用的离心力为400g。
3.如权利要求1所述的T淋巴细胞的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤4)T淋巴细胞的纯化中，细胞数对应CD3 reagent的比例为每107个细胞对应5μl CD3 reagent。
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| TA01 | Transfer of patent application right | ||
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Effective date of registration: 20210105 Address after: 518000 Building 402, Shenzhen Biomedical Innovation Industrial Park, No. 14 Jinhui Road, Kengzi Street, Pingshan District, Shenzhen City, Guangdong Province Applicant after: SHENZHEN PREGENE BIOPHARMA Co.,Ltd. Address before: Room 605, building 1, Shenzhen Biomedical Innovation Industrial Park, Jinhui 14, Kengzi street, Pingshan New District, Shenzhen, Guangdong 518000 Applicant before: SHENZHEN KADI BIOLOGY TECHNOLOGY Co.,Ltd. Applicant before: SHENZHEN PREGENE BIOPHARMA Co.,Ltd. |
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| CB02 | Change of applicant information | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: Room 605, building 1, Shenzhen Biomedical Innovation Industrial Park, 14 Jinhui Road, Jinsha community, Kengzi street, Pingshan District, Shenzhen, Guangdong 518000 Applicant after: Shenzhen prijin biopharmaceutical Co.,Ltd. Address before: 518000 Building 402, Shenzhen Biomedical Innovation Industrial Park, No. 14 Jinhui Road, Kengzi Street, Pingshan District, Shenzhen City, Guangdong Province Applicant before: SHENZHEN PREGENE BIOPHARMA Co.,Ltd. |
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20190426 |