CN114196627A - 一种牛血液cd4+t淋巴细胞的分离方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的一种牛血液CD4+T淋巴细胞的分离方法，涉及生物工程领域，所述的分离方法，包括以下步骤：采集牛尾静脉血液；利用商品化淋巴细胞分离试剂盒中分离淋巴细胞；离心后收集沉淀，加入红细胞裂解液裂解红细胞；加入培养基洗涤，离心后收集沉淀；细胞计数后加入CD4+T淋巴细胞的一抗孵育；再加入磁珠二抗孵育；最后磁柱分选CD4+T淋巴细胞。本申请首次介绍了牛CD4+T淋巴细胞分离方法，补充了该领域试验方法技术的空白。以该方法获得的牛CD4+T淋巴细胞活性好，数量多，纯度高。除应用于科学研究外还可广泛应用于临床诊断，具有良好的市场前景。

Description

一种牛血液CD4+T淋巴细胞的分离方法
技术领域：
本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种牛血液CD4+ T淋巴细胞的分离方法。
背景技术：
淋巴细胞作为一种效应细胞，广泛存在于动物外周血液、骨髓、脐带血或免疫器官中。高纯度的淋巴细胞的获取对于疾病的细胞学诊断、成分输血、治疗用细胞产品的制备等具有非常重要的意义。T细胞是淋巴细胞的子集，包括CD8+和CD4+（T辅助细胞，Th）T细胞。Th细胞的进一步分裂包括Th1，Th2，Th17和T调节细胞（Treg）。促炎性Th17细胞和抗炎性Treg细胞之间的平衡决定了免疫反应的程度，这对于生物体内的稳态和健康至关重要。在临床检验中，针对特定细胞功能和生物学特性的检查常常涉及到细胞的分离技术，从外周血液中分离单个核细胞是体外进行淋巴细胞免疫学研究和细胞学实验的重要前处理步骤，分离的目的细胞的质和量是保证后续实验可靠性的重要环节，发展牛血液CD4+ T淋巴细胞分离技术显得尤为重要。
目前，牛后天免疫功能的研究仅局限于对淋巴细胞层面的报道，但对牛血液CD4+T淋巴细胞尚无报道。探索一种能获取牛血液CD4+ T淋巴细胞方法，更深入的了解牛免疫系统功能已成为本领域技术人员急需解决的技术问题。
因此，有必要提供一种既能保证细胞活性又能保证分离效率、纯度的牛血液CD4+T淋巴细胞分离方法。
发明内容：
本发明旨在解决上述问题，提供了一种牛血液CD4+ T淋巴细胞的分离方法，该方法简单易行，具有较高的经济价值和市场推广应用价值；制备得到的CD4+ T淋巴细胞既能保证安全性又能保证分离效率、纯度，无细胞毒性，分离的淋巴细胞状态好，活力高，为科研领域提供一种全新的分离方法。除应用于科学研究外还可广泛应用于临床诊断，具有良好的市场前景。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种牛血液CD4+ T淋巴细胞的分离方法，包括以下步骤：
步骤（1）、牛尾静脉采取新鲜抗凝全血15-20 mL（市场上常规的抗凝采血管即可），用等体积的全血及组织稀释液（索莱宝牛外周血淋巴细胞分离试剂盒中包含的稀释液）稀释全血，得到全血稀释液；
步骤（2）、在15 mL离心管中加入5 mL分离液（索莱宝牛外周血淋巴细胞分离试剂盒中包含的分离液）以及5 mL步骤（1）得到的全血稀释液，将所述的全血稀释液平铺到分离液液面上（注意保持两液面界面清晰）；室温下，水平转子950g，离心30 min后，吸取白膜层得到含有红细胞的淋巴细胞（离心后将出现明显的分层：最上层是稀释的血浆层，中间是透明的分离液层，血浆与分离液之间的白膜层即为淋巴细胞层，红细胞与粒细胞由于密度大而沉积于离心管底部）；
步骤（3）、将步骤（2）得到的含有红细胞的淋巴细胞移入15ml洁净的离心管中，10mL 磷酸盐缓冲液（PBS）或细胞洗涤液（索莱宝牛外周血淋巴细胞分离试剂盒包含的细胞洗涤液）洗涤含有红细胞的淋巴细胞，室温下，水平转子300g，离心10 min后，弃上清，获得淋巴细胞，继续此步骤两次；
步骤（4）、将步骤（3）得到的淋巴细胞中加入2 mL红细胞裂解液，37℃水浴2 min后，加入5 mL细胞洗涤液（与上述洗涤液相同）终止裂解，得到不含有红细胞的纯净淋巴细胞悬液；
步骤（5）、将步骤（4）得到的纯净的淋巴细胞弃上清，加100 μL Buffer（pH=7.2，磷酸缓冲盐溶液PBS、2mM EDTA、0.5% BSA和1%蔗糖）重悬，避光加入10 μL荧光单克隆CD4一抗（公司及货号：CD4 Monoclonal Antibody （CC8）, PE, Invitrogen, MA1-80176），4℃孵育25 min，后补加1 mL Buffer 1300r离心5 min，弃上清，得到被标记上CD4一抗的淋巴细胞悬液；
步骤（6）、将步骤（5）得到被标记上CD4一抗的淋巴细胞中，加入80 μL Buffer重悬，避光加入25 μL带有磁珠的二抗（公司及货号：Anti-Mouse IgG2a+b MicroBeads,Miltenyi Biotec, 130-047-202），4℃孵育15 min，后补加1 mL Buffer，1300r离心5 min，弃上清液，500 μL Buffer重悬，得到CD4一抗被标记上磁珠的淋巴细胞悬液；
步骤（7）、将步骤（6）得到的CD4一抗被标记上磁珠的淋巴细胞悬液加入到磁柱（厂家：Miltenyi Biotec 名称：MS Columns 货号：130-042-201）中，待悬液自然流尽，使CD4一抗被标记上磁珠的淋巴细胞吸附在磁柱上，得到吸附磁柱；
步骤（8）、用500 μL Buffer洗涤步骤（7）获得的吸附磁柱两次，将未被吸附的其他非目的细胞冲洗掉，得到目标细胞磁柱；
步骤（9）、向步骤（8）得到的目标细胞磁柱加入500 μL Buffer，然后迅速将磁柱塞置于目标细胞磁柱上方，注意不要用力按压，待目标细胞磁柱内外压力平衡（液体不再持续滴出），然后将带有磁柱塞的目标细胞磁柱从磁柱架上取下，按压磁柱塞使分选出的CD4淋巴细胞悬液流入1.5 mL离心管中，得到纯净的CD4淋巴细胞；
步骤（10）、将步骤（9）得到的纯净的CD4淋巴细胞加入1 mL PBS重悬，洗涤，1300r离心5 min一次，弃上清液，沉淀即为牛血液CD4+ T淋巴细胞。
作为本发明的进一步改进，步骤（4）中红细胞裂解液是由下列成分制备而成：称取3.735g氯化铵、三羟甲基氨基甲烷（Tris）1.3g加水溶解并稀释至500ml。0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存。
本发明的，分离时间短、细胞污染少以及对细胞的损伤低，以该方法获得的牛血液CD4+ T淋巴细胞活力高，数量多，纯度高，方法简单，方便操作，省时省力。经检测，牛血液中分离的CD4+ T淋巴细胞百分比提高至93.8%。
附图说明：
图1是利用本发明的方法牛血液中分离前后CD4+ T淋巴细胞含量百分比。
具体实施方式：
一种牛血液CD4+ T淋巴细胞的分离方法，包括以下步骤：
步骤（1）、牛尾静脉采取新鲜抗凝全血15-20 mL（市场上常规的抗凝采血管即可），用等体积的全血及组织稀释液（索莱宝牛外周血淋巴细胞分离试剂盒中包含的稀释液）稀释全血，得到全血稀释液；
步骤（2）、在15 mL离心管中加入5 mL分离液（索莱宝牛外周血淋巴细胞分离试剂盒中包含的分离液）以及5 mL步骤（1）得到的全血稀释液，将所述的全血稀释液平铺到分离液液面上（注意保持两液面界面清晰）；室温下，水平转子950g，离心30 min后，吸取白膜层得到含有红细胞的淋巴细胞（离心后将出现明显的分层：最上层是稀释的血浆层，中间是透明的分离液层，血浆与分离液之间的白膜层即为淋巴细胞层，红细胞与粒细胞由于密度大而沉积于离心管底部）；
步骤（3）、将步骤（2）得到的含有红细胞的淋巴细胞移入15ml洁净的离心管中，10mL 磷酸盐缓冲液（PBS）或细胞洗涤液（索莱宝牛外周血淋巴细胞分离试剂盒包含的细胞洗涤液）洗涤含有红细胞的淋巴细胞，室温下，水平转子300g，离心10 min后，弃上清，获得淋巴细胞，继续此步骤两次；
步骤（4）、将步骤（3）得到的淋巴细胞中加入2 mL红细胞裂解液，37℃水浴2 min后，加入5 mL细胞洗涤液（与上述洗涤液相同）终止裂解，得到不含有红细胞的纯净淋巴细胞悬液；所述的红细胞裂解液是由下列成分制备而成：称取3.735g氯化铵、三羟甲基氨基甲烷（Tris）1.3g加水溶解并稀释至500ml。0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存；
步骤（5）、将步骤（4）得到的纯净的淋巴细胞弃上清，加100 μL Buffer（pH=7.2，磷酸缓冲盐溶液PBS、2mM EDTA、0.5% BSA和1%蔗糖）重悬，避光加入10 μL荧光单克隆CD4一抗（公司及货号：CD4 Monoclonal Antibody （CC8）, PE, Invitrogen, MA1-80176），4℃孵育25 min，后补加1 mL Buffer 1300r离心5 min，弃上清，得到被标记上CD4一抗的淋巴细胞悬液；
步骤（6）、将步骤（5）得到被标记上CD4一抗的淋巴细胞中，加入80 μL Buffer重悬，避光加入25 μL带有磁珠的二抗（公司及货号：Anti-Mouse IgG2a+b MicroBeads,Miltenyi Biotec, 130-047-202），4℃孵育15 min，后补加1 mL Buffer，1300r离心5 min，弃上清液，500 μL Buffer重悬，得到CD4一抗被标记上磁珠的淋巴细胞悬液；
步骤（7）、将步骤（6）得到的CD4一抗被标记上磁珠的淋巴细胞悬液加入到磁柱（厂家：Miltenyi Biotec 名称：MS Columns 货号：130-042-201）中，待悬液自然流尽，使CD4一抗被标记上磁珠的淋巴细胞吸附在磁柱上，得到吸附磁柱；
步骤（8）、用500 μL Buffer洗涤步骤（7）获得的吸附磁柱两次，将未被吸附的其他非目的细胞冲洗掉，得到目标细胞磁柱；
步骤（9）、向步骤（8）得到的目标细胞磁柱加入500 μL Buffer，然后迅速将磁柱塞置于目标细胞磁柱上方，注意不要用力按压，待目标细胞磁柱内外压力平衡（液体不再持续滴出），然后将带有磁柱塞的目标细胞磁柱从磁柱架上取下，按压磁柱塞使分选出的CD4淋巴细胞悬液流入1.5 mL离心管中，得到纯净的CD4淋巴细胞；
步骤（10）、将步骤（9）得到的纯净的CD4淋巴细胞加入1 mL PBS重悬，洗涤，1300r离心5 min一次，弃上清液，沉淀即为牛血液CD4+ T淋巴细胞。
利用流式细胞仪（型号：BD Accuri C6）对标记荧光染料的CD4 T细胞进行检测。
结果如图1所示，血液中提纯前的淋巴细胞占比为41.8%，提纯后CD4 T淋巴细胞占比为93.8%。

Claims (2)

1.一种牛血液CD4+ T淋巴细胞的分离方法，包括以下步骤：
步骤（1）、牛尾静脉采取新鲜抗凝全血15-20 mL，用等体积的全血及组织稀释液稀释全血，得到全血稀释液；
步骤（2）、在15 mL离心管中加入5 mL分离液以及5 mL步骤（1）得到的全血稀释液，将所述的全血稀释液平铺到分离液液面上；室温下，水平转子950g，离心30 min后，吸取白膜层得到含有红细胞的淋巴细胞；
步骤（3）、将步骤（2）得到的含有红细胞的淋巴细胞移入15ml洁净的离心管中，10 mL磷酸盐缓冲液或细胞洗涤液洗涤含有红细胞的淋巴细胞，室温下，水平转子300g，离心10min后，弃上清，获得淋巴细胞，继续此步骤两次；
步骤（4）、将步骤（3）得到的淋巴细胞中加入2 mL红细胞裂解液，37℃水浴2 min后，加入5 mL细胞洗涤液终止裂解，得到不含有红细胞的纯净淋巴细胞悬液；
步骤（5）、将步骤（4）得到的纯净的淋巴细胞弃上清，加100 μL Buffer重悬，避光加入10 μL荧光单克隆CD4一抗，4℃孵育25 min，后补加1 mL Buffer 1300r离心5 min，弃上清，得到被标记上CD4一抗的淋巴细胞悬液；
步骤（6）、将步骤（5）得到被标记上CD4一抗的淋巴细胞中，加入80 μL Buffer重悬，避光加入25 μL带有磁珠的二抗，4℃孵育15 min，后补加1 mL Buffer，1300r离心5 min，弃上清液，500 μL Buffer重悬，得到CD4一抗被标记上磁珠的淋巴细胞悬液；
步骤（7）、将步骤（6）得到的CD4一抗被标记上磁珠的淋巴细胞悬液加入到磁柱中，待悬液自然流尽，使CD4一抗被标记上磁珠的淋巴细胞吸附在磁柱上，得到吸附磁柱；
步骤（8）、用500 μL Buffer洗涤步骤（7）获得的吸附磁柱两次，将未被吸附的其他非目的细胞冲洗掉，得到目标细胞磁柱；
步骤（9）、向步骤（8）得到的目标细胞磁柱加入500 μL Buffer，然后将磁柱塞置于目标细胞磁柱上方，待目标细胞磁柱内外压力平衡，然后将带有磁柱塞的目标细胞磁柱从磁柱架上取下，按压磁柱塞使分选出的CD4淋巴细胞悬液流入1.5 mL离心管中，得到纯净的CD4淋巴细胞；
步骤（10）、将步骤（9）得到的纯净的CD4淋巴细胞加入1 mL PBS重悬，洗涤，1300r离心5min一次，弃上清液，沉淀即为牛血液CD4+ T淋巴细胞。
2.根据权利要求1所述的一种牛血液CD4+ T淋巴细胞的分离方法，其特征在于，步骤（4）中的红细胞裂解液的制备方法如下：称取3.735g氯化铵、三羟甲基氨基甲烷1.3g加水溶解并稀释至500ml后，0.22μm滤膜过滤除菌，即得所述的红细胞裂解液。
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