KR101349249B1 - 시험관내 피부 감작성 평가 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 사람 유래 세포 표면 및 세포배양액에서 발현되는 지표를 측정하여 화장품 원료 또는 기타 물질의 피부 감작성을 평가하는 시험관내 피부 감작성 평가방법과 이 평가방법을 통해 도출된 데이터로부터 물질의 감작성 유발 가능성을 등급화하는 방법에 관한 것이다.
피부 감작성, CD86, CD54, CD83

Description

시험관내 피부 감작성 평가 방법{In vitro skin sensitization test method}
본 발명은 사람 유래 세포 표면 및 세포배양액에서 발현되는 지표를 측정하여 화장품 원료 또는 기타 물질의 피부 감작성을 평가하는 시험관내 피부 감작성 평가방법과 이 평가방법을 통해 도출된 데이터로부터 물질의 감작성 유발 가능성을 등급화하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 평가하고자 하는 물질을 처리할 농도를 설정하는 단계; 얻어진 시험 농도에서 이 물질이 세포에 미치는 영향을 평가하는 시험 단계; 각 지표에 대한 영향 정도를 값으로 산출하는 단계; 및 이 값을 기준으로 어떤 물질의 감작성 유발 가능성 여부를 판정하는 단계;를 포함하고, 상기 과정을 함수화하여 판정 및 차기 시험 단계를 손쉽게 제시하는 것을 특징으로 한다.
생체 특히 인체에 있어 알레르기(감작성)를 유발하는 물질을 평가하는 종래의 방법으로는 기니아 피그에 시료를 반복적으로 적용하고, 그에 대한 동물의 피부 반응을 관찰, 평가하는 방법(Guinea pig maximization test : GPMT)이 가장 많이 사용되었다. 그러나 이는 동물 보호 등의 관점에서 그 사용을 제한받고 있다. 또한 마우스를 이용하여 감작유발 물질에 의해 림프절의 세포 증가를 판정하는 국소 림프절 시험법(local lymph node assay; LLNA)이 십 수년 간에 걸쳐 많은 연구가 되었으나, 이 역시 동물을 사용하며 방사선동위원소의 사용 등으로 시험 적용에 제약을 가지고 있다.
가장 최근에 개발된 방법은 알레르기 반응의 처음 단계에서 중요한 항원제시세포를 이용하는 방법으로 말초혈액단핵구나 조혈모세포를 얻어 시험하는 방법이다. 그러나 이는 말초혈액단핵구나 조혈모세포를 생체로부터 직접 얻어야 하며, 수율이 낮고, 그 기원(공여자, 공여동물)에 따라 많은 차이가 있어 활성화되지 못하고 있다.
생체 외래의 물질에 의해 알레르기 반응이 생기는 처음 단계에서는 항원제시세포(antigen presenting cell, APC)를 이런 물질이 자극하여 활성화하고, 항원은 이 세포 내에서 프로세싱되어 표면으로 제시되면 T-cell과 항원제시세포가 상호작용하여 면역반응을 유도하게 된다. 이 과정에서 항원제시세포는 표면에 MHC 분자, 즉, 여러 가지 공동자극 분자(costimulatory molecule)를 발현하게 되어 여러 가지 사이토카인을 분비하게 된다. 이런 항원제시세포로 가장 대표적인 세포가 수지상세포이며, 피부에는 특별히 랑게르한스 세포가 있다. 이들 세포는 조혈모세포나 말초혈액단핵세포에서 분화되어 생성된다.
그러나 이런 세포는 얻기가 쉽지 않으므로, 기원이 비슷하며 수지상 세포로 분화 가능한 사람 단핵구 유래 백혈병 세포(leukemia cell)를 이용하면 상대적으로 안정적인 방법으로 세포를 입수할 수 있고, 결과의 균일성이 기대된다. 이에 해당하는 대표적인 세포는 THP-1, U937, KG-1, MUTZ-3 등이 있으며, 특히 THP-1, U937 등은 미국세포주 은행을 통해 용이하게 구입할 수 있다.
입수가능한 수지상세포 중에는 그 기원이 사람이 아닌 것도 있으나 종간 생물학적 반응성의 차이가 분명 존재하므로 마우스나 랫트, 기타 다른 동물 유래의 세포 보다는 인체 유래 세포의 사용이 바람직할 것으로 사료된다. 궁극적으로는 외부 알레르기 물질에 반응하여 수지상세포의 특징적인 분자와 사이토카인을 발현, 분비할 수 있는 세포를 사용한다. 외부 알레르기 유발 물질에 반응하여 수지상세포에서 발현 변화를 관찰 가능한 것은 HLA-DR, MHC II, CD54, CD86, CD80, 여러가지 사이토카인 등 다양한 분자들이 있다.
본 발명에서는 항원제시세포로 분화 가능한 특징을 가지면서 비교적 동일성을 가질 수 있는 수립 세포주를 이용하여 이들이 항원과 접촉하였을 때 나타내는 특징을 평가하였으며, 그 결과로부터 감작성 유발 가능성을 판정할 수 있는 시험 및 평가 방법을 모색하였다.
연구 결과, 본 발명자들은 여러 분자들 중 CD54, CD86 및 CD83이 기지의 감작성 물질에 대해 농도나 그 유발 강도를 반영하는 것을 발견하였고, 이들 마커나 사이토카인의 발현 결과 조합을 통해 감작성을 판단할 수 있음을 확인하였다.
본 발명은 동물을 전혀 사용하지 않으면서 인체 유래의 세포를 통해 좀더 빠르고 편리하게 물질의 피부 감작성 유발 가능성을 분석할 수 있고, 특히 감작성 유발 가능성 정도를 분류하고 차기에 필요한 절차를 쉽게 알아볼 수 있도록 하기 위하여 CD54, CD86 및 CD83를 이용하여 피부 감작성 유발 가능성을 등급화하여 평가하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 목적은 동물을 사용하지 않고 시험 물질의 피부 감작성 유발 가능성 정도를 판정할 수 있도록 감작성 유발 가능성을 등급화하여 피부 감작성을 평가하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에서는
1) 피부 감작성 유발정도의 평가 대상 물질의 처리할 농도를 설정하는 단계;
2) 사람 유래 주화세포에 상기 1) 단계에서 설정된 처리농도로 평가대상 물질을 접촉시키고, 세포를 배양하는 단계;
3) 상기 배양된 사람 유래 주화세포에서 발현되는 공동자극분자(costimulatory molecule)인 CD86, CD54 및 CD83을 검출하는 단계;
4) 상기 검출된 공동자극분자의 검출량을 지표화하는 단계;
5) 상기 지표화된 검출량을 등급화하여 분류하는 단계; 및
6) 상기 분류된 검출량이 위험등급이면 평가대상 물질이 피부 감작성 유발 물질인 것으로 판정하는 단계;
를 거쳐 시험관 내에서 피부 감작성 유발 물질을 평가하는 방법을 제공한다.
본 발명에서는 동물을 전혀 사용하지 않으면서, 인체 유래의 세포를 통해 좀더 빠르고 편리하게 물질의 피부 감작성 유발 가능성을 분석하였으며, 특히 감작성 유발 가능성 정도를 분류하고 이를 등급화함으로써 차기에 필요한 절차를 쉽게 알아볼 수 있도록 하였다.
본 발명은 인체에서 면역반응 유발에 중요한 세포인 수지상세포로 분화 가능한 사람 유래 주화세포(established cell)와 감작성 유발 여부가 궁금한 시료를 함 께 처리하고, 이 물질이 세포에 미치는 영향에 대해 세포 표면에 발현되는 공동자극 분자(costimulatory molecule)인 CD86, CD54 및 CD83을 검출하여, 이 결과로부터 감작성 유발 가능성 정도를 등급화하여 평가하는 방법 또는 감작성 판정 프로세스를 제공한다.
본 발명에 의한 시험관내(in vitro) 감작성 유발 가능성의 등급화 방법은 하기의 단계들을 거쳐 완성되며, 이를 도 1에 도식화하여 나타내었다:
1) 피부 감작성 유발 정도의 평가 대상 물질의 처리할 농도를 설정하는 단계;
2) 사람 유래 주화세포에 상기 1) 단계에서 설정된 처리농도로 평가대상 물질을 접촉시키고, 세포를 배양하는 단계;
3) 상기 배양된 사람 유래 주화세포에서 발현되는 공동자극분자(costimulatory molecule)인 CD86, CD54 및 CD83을 검출하는 단계;
4) 상기 검출된 공동자극분자의 검출량을 지표화하는 단계;
5) 상기 지표화된 검출량을 등급화하여 분류하는 단계; 및
6) 상기 분류된 검출량이 위험등급이면 평가대상 물질이 피부 감작성 유발 물질인 것으로 판정하는 단계.
상기 각 과정을 보다 상세히 살펴보면, 먼저, 피부 감작성 유발 정도를 평가하고자 하는 평가 대상 물질의 처리 농도를 설정한다. 본 발명에서 사용하는 평가 대상 물질은 화장품과 같이 사람의 피부에 적용하는 제품이나 제형 등에 구성성분으로 적용하고자 하는 모든 물질을 대상으로 할 수 있다. 상기 평가 대상 물질의 처리 농도를 설정하기 위하여, 우선 평가대상 물질을 시험 세포주에 처리했을 때 무처치 대조군에 비해 세포 증식이 50% 감소하는 IC50 (50% Inhibitory concentration of cell proliferation)(μg/mL)을 구하였다. IC50을 구하기 위해서는 의 적정 농도를 찾기 위하여 테트라졸리움 염(Tetrazolium salt (WST-1))에서 포마잔(formazan) 색소로 변화하는 원리를 이용하여 세포 증식 능력이나 세포 생존 능력을 알 수 있는 Premix WST-1 세포 성장 분석법; 살아있는 세포에서 물에 녹지 않는 포마잔결정(formazan crystal)으로 환원되는 노란색 테트라졸리움 염인 MTT 분석법; 및 손상된 세포막에 침투하여 세포내 DNA 와 결합하여 밝은 적색을 발하는 요오드화 프로피디엄(Propidium iodide) 분석법 등을 사용할 수 있다.
그 다음에는 구해진 IC50의 1배, 0.5배, 0.1배에 해당하는 농도를 구하고, 6공 플레이트에 배양된 세포에 24시간 처리한다. 이 때, 본 발명에서 사용하는 사람 유래 주화세포는 수지상 세포로 분화 가능한 사람 단핵구 세포를 의미하며, 예를 들어, 사람 유래 백혈병 세포(leukemia cell)인 말초혈단구 유래 THP-1 세포, 인간조직구 유래 U937 세포, 골수 유래 KG-1 세포 및 MUTZ-3 세포 등을 사용할 수 있으나 반드시 이에만 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용하는 사람 유래 주화세포를 배양하기 위해서는 RPMI1640 배양액을 사용하고, 적정량의 당, 항생제 및 아미노산 등을 첨가할 수 있으며, 바람 직하게는 2mM L-글루타민, 10mM HEPES, 1mM 소듐 피루베이트(sodium pyruvate), 4500 mg/L 글루코오스 및 1500 mg/L 소듐 비카보네이트(sodium bicarbonate) 및 1% 항생제-항진균제(antimycotic) 혼합물로 이루어질 수 있다. 또한 통상적으로 10%의 우태아혈청을 더 첨가하지만, 세포 분화를 촉진하기 위해 별도의 사이토카인 등을 처리할 필요는 없다.
상기에서 배양한 세포를 회수하여 0.1% 아지드화 나트륨을 포함한 인산완충액(PBS)으로 세척한 후 5% 소혈청 알부민과 0.1% 아지드화 나트륨을 포함하는 인산완충액에 부유시킨다. FITC로 형광표지한 항-CD86 항체, 항-CD54 항체 및 항-CD83 항체를 이용하여 4℃에서 30분간 염색한 다음 0.1% 아지드화 나트륨을 포함한 인산완충액으로 세척하고 5% 소혈청 알부민과 0.01% 아지드화 나트륨을 포함하는 인산완충액에 다시 부유시킨다. 1μg 요오드화 프로피디엄(propidium iodide)로 4℃ 에서 30분간 염색시킨 후 위와 같은 방법으로 세포를 세척한다. 세척한 세포를 유세포분류기(Flow cytometry)로 형광강도를 측정하여 주화세포에서 발현되는 공동자극 분자(costimulatory molecule)인 CD86, CD54 및 CD83을 검출하여 지표화한다.
상기 공동자극 분자의 검출량을 지표화한 다음 이를 등급화하여 분류하며, 이러한 등급화 과정을 도 2에 도시하였다. 이들 지표의 증가 정도는 RFI(Relative Fluorescence Index)로 표현할 수 있으며. 하기 수학식 1을 통해 산출한다:
Figure 112007061509136-pat00001
상기 식에서 MFI(mean fluorescence intensity)는 평균형광강도이며 FACS 분석 기기를 통해 얻어지는 값이다.
본 발명에 의한 등급화 기준은 RFI 수치를 기준으로 하였으며, 보다 상세하게는
① RFI 수치가 CD54>120이고 CD86>200인 경우에는 ++ 등급이며,
② RFI 수치가 CD54>120이고 CD86<200인 경우에는 + 등급이고,
③ RFI 수치가 CD54<120이고 CD86>200인 경우에는 + 등급이며,
④ RFI 수치가 CD54<120이고 CD83>300인 경우에는 + 등급이고,
⑤ RFI 수치가 CD54<120이고 CD86>200인 경우에는 - 등급이며,
⑥ - 등급이나 RFI 수치가 CD54<110 이면서 CD86<180인 경우 재시험을 실시한다.
이러한 등급 기준은 하기 표 1과 같이 정리할 수 있다
공동자극 분자의 RFI 수치 등급
CD54<110 CD86<180 - 재시험
CD54<120 CD86<200 CD83<300 -
CD54<120 CD86<200 CD83>300 +
CD54<120 CD86>200 CD83<300 +
CD54>120 CD86<200 CD83<300 +
CD54>120 CD86>200 CD83<300 ++
CD54>120 CD86>200 CD83>300 ++
상기 분류된 검출량이 위험등급(++)이면 평가대상 물질이 피부 감작성 유발 물질인 것으로 판정하여 감작성 유발 물질로 분류한다.
이하, 실시예를 들어 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 하기의 실시예는 본 발명을 구체적으로 설명하려는 것이며, 하기의 실시예에 의하여 본 발명의 범위가 제한되지는 않는다.
[실시예 1]
다이니트로클로로벤젠(Dinitrochlorobenzene; DNCB), α-헥실시남알데히드(α-hexylcinnamaldehyde; HCA), 유로퓸(europium; Eu), 니켈(Ni), 백금(Pt), 코발트(Co), 2-메르캅토벤조티아졸(2-mercaptobenzothiazole; 2-MBT), 소듐 라우릴 설페이트(sodium lauryl sulfate; SLS), 염화벤잘코늄(benzalkonium chloride; BKC) 및 디메틸술폭시드(Dimethyl Sulfoxide; DMSO)의 감작성을 평가 또는 스크리닝하기 위해서 배양 중인 사람 유래 단핵구 세포 THP-1(Human monocytic leukemia cell line)을 6공 플레이트에 2x106개/2ml/well 로 분주하여 4시간 안정화한 후 상기 시험 물질을 첨가하고 CO2 항온배양기에서 24시간 배양하였다. 이때 시험물질을 처리하지 않은 군을 대조군으로 하였다. 이 시험에 앞서 시험 물질의 적정 농도를 찾기 위해 테트라졸리움 염(Tetrazolium salt; WST-1)에서 포마잔 색소로 분해하는 원리를 이용하여 세포 증식 능력이나 세포 생존 능력을 알 수 있는 Premix WST-1 세포 증식 분석 시스템(Takara, Kusatsu, Japan)을 사용하여 각 물질의 각 물질의 IC50 (50% Inhibitory concentration of cell proliferation)(μg/mL)을 찾았다. THP-1 세포를 96 공 플레이트에 1×105 cells/100μl/well 가 되도록 배양하고 각 물질을 다양한 농도로 24시간 동안 처리하였다. 처리 후 WST-1을 10㎕/well 씩 첨가한 다음 4시간 후에 약 440nm에서 측정한다. 적어도 두 번 이상의 실험이 반복되었다. Premix WST-1 세포 증식 분석 시스템을 통해 얻어진 IC50 (μg/mL) 의 0.1×, 0.5×, 1× 세가지 농도로 화학 물질을 처리하였다.
시험물질 처리 후 감작성 유발 가능성을 평가하기 위하여 유세포분류기(Flow cytometry)법으로 세포 표면에 발현되는 공동자극 분자인 CD86, CD54 및 CD83의 검출량을 RFI(Relative Fluorescence Index)로 지표화하였고, 도 2에 기재된 등급화 과정을 통하여 감작성 유발 가능성을 등급화하였고, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
[비교예 1] 국소 림프절 시험법(local lymph node assay; LLNA)
상기 실시예 1에서 감작성 유발 가능성을 검사한 시험물질에 대한 국소 림프절 시험법을 통한 감작성 평가 결과를 하기 표 2에 나타내었다. 마우스를 이용하는 국소림프절 시험법은 가장 대표적인 감작성 동물대체시험법으로서 OECD 가이드라인(OECD Guidelines for Testing of Chemicals, Updated Guideline 429: Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay (adopted 24 April 2002))에 준하여 실시하였다. 시험물질 1가지당 3개 농도에 대해 시험하였고, 시험물질 25㎕를 귀외측 피부에 연속 3일간 하루 1회 도포하였으며, 처음 도포일로부터 5일 후에 꼬리 정맥을 통해 250μl의 80.1μCi/ml 3H-메틸 티미딘(3HTdR)(마우스 마리당 20.0μCi 3HTdR에 해당)을 주사하였다. 주사 후 5시간에 동물을 희생시킨 다음 배수(draining) 림프절을 취해 세척한 후 트리콜로아세트산에서 18시간 동안 둔 다음 침전물로부터 방사선동위원소의 양을 측정하였다. 측정된 방사선 동위원소량을 대조군과 비교하여 3배 이상 증가한 경우를 양성으로 판정하였다.
[비교예 2] 기니아 피그를 통한 감작성 평가 방법(GPMT)
상기 실시예 1에서 감작성 유발 가능성을 검사한 시험물질들에 대해 기니아 피그를 통한 감작성 평가 결과를 하기 표 2에 나타내었다. 통상적으로 기니아 피그를 이용한 감작성 평가법 중 GPMT법(Guinea Pig Maximization Test)은 동물감작성시험법 중 가장 널리 사용되는 방법이다. 그 과정을 살펴보면, 하트레이 알비노(Hartley Albino) 기니아 피그를 이용하며, 1차 유도 때는 FCA(Freund's Complete Adjuvant)와 혼합한 시험물질을 피내주사하며, 7일 후 2차 유도 때는 SLS를 24시간 첩포한 후에 그 자리에 시험물질을 48시간 첩포하였다. 첩포 2주 후에 제모를 하고 시험물질을 첩포하여 피부에 나타난 반응을 관찰하게 되며, 양성율로부터 감작성 유발 정도를 판정하였다.
시험
물질		 농도 RFI 감작성 평가 결과
CD54 CD86 CD83 실시예1 비교예1 비교예2
DNCB 0.1x 127.8±32.8 164.4±104.4 122.7±123.6 ++ Extreme Strong
0.5x 649.6±69.9 508.8±414.8 117.8±114
1x 88.8±26 244.9±269.8 216.9±257.6
HCA 0.1x 92.1±19.3 79.6±68.1 879.5±1105 + Moderate Strong
0.5x 102.4±39.1 151.6±131.2 304.9±269.6
1x 52.2±41.3 357.7±463.6 443.9±215
Eu 0.1x 95.1±15.4 138.9±54.9 599.2±563.2 ++ Weak Moderate
0.5x 130.7±36.8 162±97.7 240.6±258.5
1x 71.3±38.6 290.7±352.9 127.2±165.1
Ni 0.1x 105.8±46.9 55.6±34.5 142.4±260.7 + Negative Moderate
0.5x 198.2±53.2 74.5±62.1 133.4±151.1
1x 177.9±83.1 147.1±120.8 372.3±318.6
Pt 0.1x 214.4±41.9 153.3±118 249.9±203.1 + positive Extreme
0.5x 777.2±225.3 59.8±45.4 413.7±476.3
1x 667±187 166.8±249.6 670±780.5
Co 0.1x 149.2±50.3 71.8±54.6 156.5±187.5 + Strong Extreme
0.5x 260.2±62.3 63±39.9 138.9±239.2
1x 248.7±130 47.2±31 568.9±578.5
2-MBT 0.1x 97.3±9.8 99.3±62.1 678.5±913.2 + Moderate Strong
0.5x 69.2±11.6 161.2±137.5 984.7±1759.7
1x 39.4±35.2 315.5±213.2 331.6±358
SLS 0.1x 99.3±13.7 186.4±282.2 811.1±901.5 ++ Positive Negative
0.5x 150.2±42.8 84.8±44.3 267.6±249.3
1x 241.6±75.7 239.7±283.2 194.4±197.3
BKC 0.1x 56.6±28.3 65±53.8 236.6±220.7 - Negative Negative
0.5x 51±26.5 49.1±50.3 72.9±64.2
1x 50.9±39 41.7±28.2 213.4±358.5
DMSO 0.1x 95.3±31.6 91.4±74.5 109.7±191.9 - Negative Negative
0.5x 74.8±13.4 116.5±62.8 225±217
1x 78.4±6.4 129.7±119.7 228.4±226.1
상기 표 2의 결과에서, DNCB는 실험된 농도 범위에서 CD54의 최대 발현량이 200을 넘고, CD86에 대한 최대 발현량 역시 200을 넘으므로, ++ 등급이 되었다. 따라서 별도의 동물 시험을 통한 확인이나 인체시험 없이 사용할 수 없는 물질로 탈락시킬 수 있었다. 또 다른 물질인 2-MBT는 CD54의 최대 발현량은 120을 넘지 않으나 CD86의 발현은 200을 넘으므로 + 등급이 되었다. BKC는 C54는 120을 넘지 않으며, CD86은 200을 넘지 않고, CD83도 300을 넘지 않아 - 등급으로 분류되었으며, 동물시험 및 인체시험을 통해 확인 절차를 거칠 수 있게 된다.
도 1은 본 발명에 의한 감작성 유발 가능성 평가 과정을 보여주는 모식도이다. 우선 평가 대상 물질을 처리하는 조건을 찾기 위해 세포를 배양하여 IC50을 구한다. 그 다음에는 구해진 IC50의 1배, 0.5배, 0.1배에 해당하는 농도를 구하고, 6공 플레이트에 배양된 세포에 24시간 처리한다. 평가대상물질과 세포를 24시간 배양한 후에 공동 자극분자에 대한 항체로 세포를 염색한다. 염색된 세포에 대해 요오드화 프로피디엄으로 염색한 후 유세포 분석기를 통해 사멸세포와 생존 세포를 구별한 후 형광정도를 분석한다. 얻어진 데이터를 이용하여 상대적 형광정도 (Relative fluorescene Index)를 구하여 공동자극분자의 발현정도를 알아보고 이를 통하여 물질의 항원성을 판정한다.
도 2는 본 발명에 의한 감작성 유발 가능성 평가방법에 의한 등급화 과정을 보여주는 흐름도이다.

Claims (5)

1) 피부 감작성 유발정도의 평가 대상 물질의 처리할 농도를 설정하는 단계;
2) 사람 유래 주화세포에 상기 1) 단계에서 설정된 처리농도로 평가대상 물질을 접촉시키고, 세포를 배양하는 단계;
3) 상기 배양된 사람 유래 주화세포에서 발현되는 공동자극분자(costimulatory molecule)인 CD86, CD54 및 CD83을 검출하는 단계;
4) 상기 검출된 공동자극분자의 검출량을 지표화하는 단계;
5) 상기 지표화된 검출량을 등급화하여 분류하는 단계; 및
6) 상기 분류된 검출량이 위험등급이면 평가대상 물질이 피부 감작성 유발 물질인 것으로 판정하는 단계;
를 거쳐 시험관 내에서 피부 감작성 유발 물질을 평가하는 방법으로서,
상기 5) 단계의 등급화 과정은 RFI(Relative Fluorescence Index) 수치를 기준으로 하여 하기와 같이 분류되는 것임을 특징으로 하는 피부 감작성 유발 물질의 평가방법:
① RFI 수치가 CD54>120이고 CD86>200인 경우에는 ++ 등급이며,
② RFI 수치가 CD54>120이고 CD86<200인 경우에는 + 등급이고,
③ RFI 수치가 CD54<120이고 CD86>200인 경우에는 + 등급이며,
④ RFI 수치가 CD54<120이고 CD83>300인 경우에는 + 등급이고,
⑤ RFI 수치가 CD54<120이고 CD86>200인 경우에는 - 등급이며,
⑥ - 등급이나 RFI 수치가 CD54<110 이면서 CD86<180인 경우 재시험을 실시함.
제 1항에 있어서, 상기 사람 유래 주화세포는 백혈병 세포(leukemia cell)임을 특징으로 하는 방법.
제 2항에 있어서, 상기 백혈병 세포는 말초혈단구 유래 THP-1 세포, 인간조직구 유래 U937 세포, 골수 유래 KG-1 세포 및 MUTZ-3 세포로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
삭제
제 1항에 있어서, 상기 분류등급상 위험등급은 ++ 등급임을 특징으로 하는 방법.
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