CN103597091A - 光毒性试验方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供使用人视网膜色素上皮细胞的光毒性试验方法等。

Description

光毒性试验方法
技术领域
本发明涉及使用人视网膜色素上皮细胞的光毒性试验方法等。
背景技术
为了评价药品、农药、化妆品、工业产品等化学物质对人的安全性，通常使用动物个体进行大量的毒性试验。这些毒性试验中，将进入到体内的化学物质与光反应产生的刺激性等的急性毒性试验统称为光毒性试验。
作为光毒性试验方法中应用最广的方法，已知的有例如对动物皮肤局部给药的森川法。该光毒性试验方法如下：使用豚鼠或白兔，在该动物的背部皮肤上涂布作为受试物质的化学物质，之后，对该涂布部位进行紫外线照射，并对上述背部皮肤对该照射的生理反应根据预先规定的评价标准用进行肉眼判断，将所得的判断结果与对上述涂布部位不进行紫外线照射时的上述背部皮肤的生理反应根据上述评价标准同样用肉眼进行判断，对所得的判断结果进行比较，由此评价作为受试物质的化学物质有无光毒性或光毒性的程度。
然而，由于近年来的动物福利问题、欧洲等出现的强化动物实验规范，对开发不使用实验动物的光毒性试验方法用的替代法的要求强烈。
另一发面，至今，已经开发了大量的体外（in vitro）光毒性试验方法。作为这些光毒性试验方法中最值得期待的方法，可以列举利用为结缔组织细胞（ConnectiveTissue Cell）、并为成纤维细胞（Fibroblast）的“Balb/c3T3细胞”的中性红摄取试验法（3T3NRU PT）。该3T3NRU PT被认可为1998年由ECVAM（European Center forthe Valildation of Alternative Methods：欧洲替代方法验证中心）科学地确立的光毒性试验方法的替代法，2000年以后，作为筛选化学物质是否具有光毒性用的试验方法而被采用。此外，该试验方法还被提交给OECD，并在2004年作为体外光毒性试验而被指南化的唯一指导方法而广为人知（例如，可参见OECD guidelines for the testingof chemicals:test guideline432〝In vitro3T3NRU phototoxicity test〞Paris:Frankreich,OECD Publication Office;2004）。
然而，近年来，逐渐积累了大量利用3T3NRU PT评价有无光毒性等的评价结果，也不断发现其中包含假阳性结果，而且在实际预测对人的安全性方面，这种方法也并不是总能充分令人满意，人们期望开发新的体外光毒性试验方法（例如，可参见Experimental and Toxicologic Pathology vol.63,p209-214;2011）。
发明内容
本发明提供使用人视网膜色素上皮细胞的光毒性试验方法等。
更具体地，本发明提供：
1.包括下述步骤（1）～（4）的光毒性试验方法（下面有时也记作本发明的光毒性试验方法）：
（1）第一步骤：使受试物质与人视网膜色素上皮细胞接触；
（2）第二步骤：对在第一步骤中接触过受试物质的人视网膜色素上皮细胞，在第一步骤的接触开始后24小时以内，边照射包含340nm～380nm范围内的波长分布的人工光边进行培养；
（3）第三步骤：回收在第二步骤中培养的人视网膜色素上皮细胞，测定回收的培养细胞中的细胞毒性或与细胞毒性具有相关关系的指标值；和
（4）第四步骤：根据第三步骤的测定结果评价受试物质有无光毒性显现能力或其程度，鉴定受试物质的光毒性显现能力；
2.上述第1项所述的光毒性试验方法，其中，上述人工光为由紫外光、可见光和红外光构成的模拟日光；
3.上述第1或2项所述的光毒性试验方法，其中，在第二步骤中的人工光照射中，在波长360nm下的光照射量测定值在3J/cm2～30J/cm2的范围内；
4.上述第1～3项中任一项所述的光毒性试验方法，其中，在上述第四步骤中，将上述第三步骤的测定结果和在对照的人视网膜色素上皮细胞中回收的培养细胞中的细胞毒性或与细胞毒性具有相关关系的指标值的测定结果进行比较，根据其差异评价受试物质有无光毒性显现能力或光毒性显现能力的程度；
5.上述第4项所述的光毒性试验方法，其中，上述对照包含使已知的致光毒性物质与人视网膜色素上皮细胞接触了的阳性对照；
6.上述第5项所述的光毒性试验方法，其中，上述光毒性显现物质为氯丙嗪（CPZ）；
7.上述第1～6项中任一项所述的光毒性试验方法，其中，在第二步骤中的人工光照射中，对于具有在接触过受试物质的人视网膜色素上皮细胞和对照的人视网膜色素上皮细胞中的至少任一方的人视网膜色素上皮细胞中，相对于在遮蔽人工光的条件下的上述细胞的活细胞数，光照射量使得光照射条件下的上述细胞的活细胞数有意义地减少；
8.上述第1～7项中任一项所述的光毒性试验方法，其中，上述第二步骤中的人工光照射为1次连续照射或由2次以上的反复照射构成的间歇照射；
9.上述第1～8项中任一项所述的光毒性试验方法，其中,上述人视网膜色素上皮细胞是来自干细胞的视网膜色素上皮细胞；
10.上述第9项所述的光毒性试验方法，其中，上述干细胞为胚胎干细胞、人工多能干细胞或神经干细胞；
11.氯丙嗪（CPZ）在上述第1～10项中任一项所述的光毒性试验方法中作为阳性对照的应用；
12.阳性对照试剂，其用于上述第1～10项中任一项所述的光毒性试验方法中，含有氯丙嗪（CPZ）；
13.青霉素G（Penicillin G）、奎宁（Quinine）、硫氯酚（Bithionol）或氯己定（Chlorhexidine）在上述第1～10项中任一项所述的光毒性试验方法中作为阴性对照的应用；
14.阳性对照试剂，其为用于上述第1～10项中任一项所述的光毒性试验方法的阴性对照试剂，含有青霉素G（Penicillin G）、奎宁（Quinine）、硫氯酚（Bithionol）或氯己定（Chlorhexidine）；
15.光毒性显现物质的查找方法（下面有时也会记作本发明的光毒性显现物质的查找方法），在该方法中，通过上述第1～10项中任一项所述的光毒性试验方法鉴定受试物质的光毒性显现能力，从而选出所希望的具有光毒性显现能力的物质；和
16.模拟日光皮肤刺激非诱导物质的查找方法（下面有时也会记作本发明的模拟日光皮肤刺激非诱导物质的查找方法），在该方法中，通过上述第1～10项中任一项所述的光毒性试验方法鉴定受试物质的光毒性显现能力，从而选出所希望的不具有光毒性显现能力的物质；等。
根据本发明的光毒性试验方法，能有效地鉴定受试物质的光毒性显现能力。此外，在本发明中，能提供在该试验方法中可用作阳性对照的光毒性显现物质。
根据本发明的光毒性显现物质的查找方法，能简便地查找所希望的光毒性显现物质或模拟日光皮肤刺激非诱发物质。
附图说明
图1是显示由人胚胎干细胞（即SE细胞）分化诱导所得的人视网膜色素上皮细胞的明场像的图。
图2是显示对由人胚胎干细胞（即SE细胞）分化诱导所得的人视网膜色素上皮细胞进行免疫染色后的结果（红色为ZO－1，蓝色为细胞核）的图。
图3是显示通过使用光细胞毒性为阳性的化合物“氯丙嗪（CPZ）”作为受试物质的本发明的光毒性试验方法，在实施例3中，作为非光照射用的（遮光）对照而测得的细胞毒性或与细胞毒性具有相关关系的指标值所相关的结果的图。
图4是显示通过使用光细胞毒性为阴性的化合物“青霉素G（Penicillin G）”作为受试物质的本发明的光毒性试验方法，在实施例3中，作为非光照射用的（遮光）对照而测得的细胞毒性或与细胞毒性具有相关关系的指标值所相关的结果的图。
图5是显示通过使用光细胞毒性为阴性的化合物“奎宁（Quinine）”作为受试物质的本发明的光毒性试验方法，在实施例3中，作为非光照射用的（遮光）对照而测得的细胞毒性或与细胞毒性具有相关关系的指标值所相关的结果的图。
图6是显示通过使用光细胞毒性为阴性的化合物“硫氯酚（Bithionol）”作为受试物质的本发明的光毒性试验方法，在实施例3中，作为非光照射用的（遮光）对照而测得的细胞毒性或与细胞毒性具有相关关系的指标值所相关的结果的图。
图7是显示通过使用光细胞毒性为阴性的化合物“氯己定（Chlorhexidine）”作为受试物质的本发明的光毒性试验方法，在实施例3中，作为非光照射用的（遮光）对照而测得的细胞毒性或与细胞毒性具有相关关系的指标值所相关的结果的图。
图8是显示通过使用光细胞毒性为阳性的化合物“氯丙嗪（CPZ）”作为受试物质的本发明的光毒性试验方法，在实施例4中，在光照条件下测得的细胞毒性或与细胞毒性具有相关关系的指标值所相关的结果的图。
图9是显示通过使用光细胞毒性为阴性的化合物“青霉素G（Penicillin G）”作为受试物质的本发明的光毒性试验方法，在实施例4中，在光照条件下测得的细胞毒性或与细胞毒性具有相关关系的指标值所相关的结果的图。
图10是显示通过使用光细胞毒性为阴性的化合物“奎宁（Quinine）”作为受试物质的本发明的光毒性试验方法，在实施例4中，在光照条件下测得的细胞毒性或与细胞毒性具有相关关系的指标值所相关的结果的图。
图11是显示通过使用光细胞毒性为阴性的化合物“硫氯酚（Bithionol）”作为受试物质的本发明的光毒性试验方法，在实施例4中，在光照条件下测得的细胞毒性或与细胞毒性具有相关关系的指标值所相关的结果的图。
图12是显示通过使用光细胞毒性为阴性的化合物“氯己定（Chlorhexidine）”作为受试物质的本发明的光毒性试验方法，在实施例4中，在光照条件下测得的细胞毒性或与细胞毒性具有相关关系的指标值所相关的结果的图。
图13是显示通过使用光细胞毒性为阳性的化合物“氯丙嗪（CPZ）”为受试物质的比较光毒性试验方法，在比较例1中，作为非光照射用的（遮光）对照而测得的细胞毒性或与细胞毒性具有相关关系的指标值所相关的结果的图。
图14是显示通过使用光细胞毒性为阴性的化合物“青霉素G（Penicillin G）”为受试物质的比较光毒性试验方法，在比较例1中，作为非光照射用的（遮光）对照而测得的细胞毒性或与细胞毒性具有相关关系的指标值所相关的结果的图。
图15是显示通过使用光细胞毒性为阴性的化合物“奎宁（Quinine）”为受试物质的比较光毒性试验方法，在比较例1中，作为非光照射用的（遮光）对照而测得的细胞毒性或与细胞毒性具有相关关系的指标值所相关的结果的图。
图16是显示通过使用光细胞毒性为阴性的化合物“硫氯酚（Bithionol）”为受试物质的本发明的光毒性试验方法，在比较例1中，作为非光照射用的（遮光）对照而测得的细胞毒性或与细胞毒性具有相关关系的指标值所相关的结果的图。
图17是显示通过使用光细胞毒性为阴性的化合物“氯己定（Chlorhexidine）”为受试物质的本发明的光毒性试验方法（比较例1：作为非光照射用的（遮光）对照）而测得的细胞毒性或与细胞毒性具有相关关系的指标值所相关的结果的图。
图18是显示通过使用光细胞毒性为阳性的化合物“氯丙嗪（CPZ）”为受试物质的比较光毒性试验方法，在比较例2中，在光照射下测得的细胞毒性或与细胞毒性具有相关关系的指标值所相关的结果的图。
图19是显示通过使用光细胞毒性为阴性的化合物“青霉素G（Penicillin G）”为受试物质的比较光毒性试验方法，在比较例2中，在光照射下测得的细胞毒性或与细胞毒性具有相关关系的指标值所相关的结果的图。
图20是显示通过使用光细胞毒性为阴性的化合物“奎宁（Quinine）”为受试物质的比较光毒性试验方法，在比较例2中，在光照射下测得的细胞毒性或与细胞毒性具有相关关系的指标值所相关的结果的图。
图21是显示通过使用光细胞毒性为阴性的化合物“硫氯酚（Bithionol）”为受试物质的比较光毒性试验方法，在比较例2中，在光照射下测得的细胞毒性或与细胞毒性具有相关关系的指标值所相关的结果的图。
图22是显示通过使用光细胞毒性为阴性的化合物“氯己定（Chlorhexidine）”为受试物质的比较光毒性试验方法，在比较例2中，在光照射下测得的细胞毒性或与细胞毒性具有相关关系的指标值所相关的结果的图。
图23是显示用于设定光照射量的预试验（实施例6）中的结果的图。使用在OECD指南中用作阳性对照的氯丙嗪（CPZ），对光照射量与上述PIF值（即，接触过受试物质的人视网膜色素上皮细胞中的细胞毒性IC50值（非光照射用的（遮光）对照）除以接触受试物质后在模拟日光照射下培养的人视网膜色素上皮细胞中的IC50值后所得的值）的关系进行了研讨。
图24是显示用于设定光照射量的预试验（实施例6）中的结果的图。与研讨了光照射量与上述PIF值的关系的预试验相关联，确认了模拟日光照射的情况如下：在接触了10μg/ml的氯丙嗪（CPZ）的人视网膜色素上皮细胞中，，相对于在遮住模拟日光的条件下的上述细胞的活细胞数，光照射量使得在该模拟日光条件下的上述细胞的活细胞数有意义地减少。纵轴显示以在遮住模拟日光的条件下的活细胞数为1时的活细胞数的相对比较值（比对值）。各光照射量下，左侧的棒状图显示在遮住模拟日光的条件下的活细胞数的相对比较值，右侧的棒状图显示在光照条件下的活细胞数的相对比较值。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行详细说明。
本发明中的“转化体”是指通过转化制得的细胞等生命体的全部或一部分。作为转化体，例如可以是原核细胞、酵母、动物细胞、植物细胞、昆虫细胞等。转化体根据其对象，有时也称为转化细胞、转化组织、转化宿主等。本发明中所使用的细胞可以是转化体。
作为与本发明有关的、在基因工程技术中使用的原核生物细胞，例如可以是属于埃希氏菌属（Eschericia属）、沙雷氏菌属（Serratia属）、芽孢杆菌属（Bacillus属）、短杆菌属（Brevibacterium属）、棒状杆菌属（Corynebacterium属）、微杆菌属（Microbacterium属）、假单胞菌属（Pseudomonas属）等的原核生物细胞，更具体地，可以是Eschericia XL1－Blue、Eschericia XL2－Blue、Eschericia DH1等。这种细胞例如在‘Molecular Cloning(3rd edition)’by Sambrook,J and Russell,D.W.,Appendix3(Volume3),Vectors and Bacterial strains.A3.2(Cold Spring Harbor USA2001)中有具体说明。
与本发明有关的“载体”是指能将目标多核苷酸序列转入目标细胞的载体。作为这种载体，例如可以是在原核细胞、酵母、动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、动物个体或植物个体等宿主细胞中可自主复制、或者可组入染色体中的、在适合多核苷酸转录的位置上含有启动子的载体等。
这种载体中，有时也将适合克隆的载体记作“克隆载体”。这种克隆载体通常包含具有多个限制酶（切）位点的多克隆位点。现在，可用于基因克隆的载体在该技术领域中大量存在，由销售商根据细微的差异（例如多克隆位点的限制酶的种类或序列）改变名称进行销售。例如在‘Molecular Cloning(3rd edition)’by Sambrook,J andRussell,D.W.,Appendix3(Volume3),Vectors and Bacterial strains.A3.2(Cold SpringHarbor USA2001)中，同时记录了其代表性的载体和销售商，对于这些载体，本领域的技术人员可视目的而适当地选择使用。
与本发明关连的“载体”还包含“表达载体”、“报告载体”、“重组载体”。“表达载体”是在指结构基因和调剂其表达的启动子，以及各种调节因子以能在宿主细胞中起作用的状态连接的核酸序列。作为“调节因子”，例如可以是包含终止子、耐药性基因之类的选择标记和增强子的因子等。生物（例如动物）的表达载体的类型和所使用的调节因子的种类可根据宿主细胞而改变是本领域的技术人员周知的事项。
作为与本发明关联的“重组载体”，例如可以列举：（a）用于筛选基因组文库的，可以是λFIX载体（噬菌体载体）；（b）用于筛选cDNA的，可以是λZAP载体（噬菌体载体）；（c）用于筛选基因组DNA的，例如可以是pBluescript II SK+/－、pGEM、pCR2.1载体（质粒载体）等。此外，作为“表达载体”，例如可以是pSV2/neo载体、pcDNA载体、pUC18载体、pUC19载体、pRc/RSV载体、pLenti6/V5－Dest载体、pAd/CMV/V5－DEST载体、pDON－AI－2/neo载体、pMEI－5/neo载体等（质粒载体）等。此外，作为“报告载体”，例如可以是pGL2载体、pGL3载体、pGL4.10载体、pGL4.11载体、pGL4.12载体、pGL4.70载体、pGL4.71载体、pGL4.72载体、pSLG载体、pSLO载体、pSLR载体、pEGFP载体、pAcGFP载体、pDsRed载体等。这些载体可参考上述Molecular Cloning杂志适当利用即可。
作为与本发明关联的将核酸分子导入细胞内的技术，例如可以是转化、转导、转染等。作为这种导入技术，具体地，例如可以在Ausubel F.A等编著（1988）的Current Protocols in Molecular Biology,Wiley,New York,NY;Sambrook J.等（1987）,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,2nd Ed.和其第三版，Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,NY;实验医学增刊“基因导入＆表达解析实验法”羊土社（1997）等中记载的方法等。作为确认基因被导入细胞内的技术，例如可以是Northern印迹分析、Western印迹分析或其他周知的常用技术等。
此外，作为与本发明关联的载体的导入方法，例如可以是转染、转导、转化等（例如磷酸钙法、脂质体法、DEAE－葡聚糖法、电穿孔法、使用基因枪的方法等）。
本发明的光毒性试验方法具有下述步骤（1）～（4）：
（1）第一步骤：使受试物质与人视网膜色素上皮细胞接触；
（2）第二步骤：对在第一步骤中接触过受试物质的人视网膜色素上皮细胞，在第一步骤的接触开始后24小时以内，边照射包含340nm～380nm范围内的波长分布的人工光边进行培养；
（3）第三步骤：回收在第二步骤中培养的人视网膜色素上皮细胞，测定回收的培养细胞中的细胞毒性或与细胞毒性具有相关关系的指标值；和
（4）第四步骤：根据第三步骤的测定结果评价受试物质有无光毒性显现能力或光毒性显现能力的程度，从而鉴定受试物质的光毒性显现能力。
作为本发明中的“受试物质”，无特殊限制，所有化学物质均为受试对象，例如可以是用于药品、农药、化妆品、工业产品等用途的物质、今后可能会使用的正在开发的物质等。
作为本发明中的“光毒性”，例如可以是有模拟日光照射参与的由毒性反应引起的毒性等。具体地，例如可以是在眼、皮肤等处出现的作为一次刺激反应的光刺激性、属于过敏反应的光敏性（光变应性）、光致癌性、还有光遗传毒性（photogenotoxicity）等。
作为本发明中的“细胞毒性”，例如可以是细胞死亡、细胞增殖抑制等影响细胞生存的毒性等。细胞毒性或与细胞毒性具有相关关系的指标值例如可通过以下常用的方法测定即可：使用血细胞计数盘的方法、利用细胞计数器的方法、使用3H胸苷等放射性同位素的方法（只要将3H胸苷等放射性同位素加入到细胞培养液中进行培养，就可只测定活细胞的简便方法）、LDH（乳酸脱氢酶）法、使用中性红（NR）的方法（通过利用红色色素中性红被摄取到活细胞的溶酶体中而蓄积的性质的方法，是只测定活细胞的简便方法）、使用结晶紫（CR）的方法（通过利用结晶紫进入活细胞的细胞膜内而染色的性质的方法，是只测定活细胞的简便方法）、使用四唑鎓盐的方法（四唑鎓盐是细胞内线粒体的脱氢酶的底物，越是生存能力高的细胞，被还原的四唑鎓盐的量越多，其结果，产生的甲臜量与活细胞数良好地对应，因而是只测定活细胞的简便方法）、测定标记基因（例如RPE65、Mitf、ZO1）的表达量的方法、测定ATP量的方法、测定黑色素量的方法、用MTT法测定线粒体活性的方法等。在通过反复进行受试物质的“接触”和“清洗—更换培养基”等而使受试物质反复接触时，优选测定在各循环中回收的培养细胞中的细胞毒性或与细胞毒性具有相关关系的指标值。
在测定上述细胞毒性或与细胞毒性具有相关关系的指标值时，可以使用通常可获得的测定试剂盒进行测定。作为线粒体的活性、ATP量、乳酸脱氢酶活性等的测定试剂盒，例如可以是CellTiter－Glo（注册商标）Luminescent Cell Viability Assay、Dual－Glo（注册商标）Luciferase Assay System、Bright－Glo（注册商标）LuciferaseAssay System、Steady－Glo（注册商标）Luciferase Assay System、Luciferase AssaySystem、ApoTox－Glo（注册商标）Triplex Assay、CellTiter－Fluor（注册商标）CellViability Assay、CytoTox96（注册商标）Non－Radioactive Cytotoxicity Assay（Promega公司）、ATP Bioluminescence Assay Kit HS II Cell Proliferation Kit I（MTT）、CellProliferation Kit II（XTT）（Roche公司）、LDH Cytotoxicity Assay Kit（Cayman Chemical公司）、ADP Assay Kit、EnzyLight（BioAssay Systems公司）等。
下面，对在本发明的光毒性试验方法中采用测定标记基因（例如RPE65、Mitf、ZO1）表达量作为细胞毒性或与其具有相关关系的指标值的方法的情况进行更详细的说明。
首先，“标记基因的表达”包含根据标记基因表达出的多核苷酸、寡核苷酸或核酸、或者蛋白质、多肽、寡肽或肽等的表达。
作为测定标记基因表达量的方法，对于目标细胞等，可以列举例如测定mRNA转录产物量、多肽翻译产物量的方法等。作为测定mRNA表达量（转录产物量）的方法，可以列举例如Northern印迹法、斑点印迹法、PCR法、实时PCR法、利用报告基因的方法等的包含分子生物学测定方法的任何合适的方法等。此外，作为测定多肽表达量（翻译产物量）的方法，可以列举例如ELISA法、RIA法、荧光抗体法、Western印迹法、免疫组织染色法等的包含免疫学测定方法的任何合适的方法等。基因的表达变动是指，通过通常的包含分子生物学测定方法或免疫学测定方法的任何合适的方法进行评价的mRNA水平或多肽的蛋白质水平上的表达量增加或减少。此外，作为其他方法，可以列举使用阵列（例如DNA阵列、蛋白阵列）的基因解析方法等。关于DNA阵列，例如在秀润社编的《细胞工学》增刊“DNA微阵列和最新的PCR法”等中有记载，关于蛋白阵列，例如在Nat Genet.2002Dec;32Suppl:526－32等中有记载。此外，还可列举RT－PCR、RACE法、SSCP法、免疫沉降法、双杂交系统（two－hybrid system）、体外翻译等。关于这些方法，例如在《基因组解析实验法·中村祐辅实验手册》，中村祐辅编辑，羊土社出版（2002）等中有记载。
作为利用报告基因的方法，可以列举通过制作组入了可作用地与标记基因的启动子序列连接的报告基因的载体、将该载体基因导入到人视网膜色素上皮细胞中而制作稳定的转化体的方法等。制成的稳定的转化体要使报告基因在细胞内表达，只要测定报告基因的活性、表达量，就可将该测定值作为与存活的人视网膜色素上皮细胞的量具有相关关系的指标值而利用。
这里，作为“报告基因”，例如可以是萤火虫荧光素酶基因（firefly luc）、海肾荧光素酶基因（Renilla luc）、β－半乳糖苷酶基因、氯霉素乙酰转移酶基因、或者使得在核酸构建物所导入的宿主细胞中用视觉进行选择成为可能的选择标记基因。作为这种选择标记基因，例如可以是绿色荧光蛋白（GFP）基因、蓝色荧光蛋白（CFP）基因、黄色荧光蛋白（YFP）基因、红色荧光蛋白（dsRed）基因等可在活细胞内观察的荧光色素标记基因或色素标记基因等。优选上述选择标记基因和选择标记蛋白质对宿主细胞基本上不显示毒性。此外，作为检测报告基因是否表达或表达的程度的方法，即使选择标记蛋白质为酶的情况下，或者为荧光蛋白的情况下，都只要利用公知的检测方法等即可。
“启动子”是指确定基因转录的起始位置、且直接调节基因转录频率的DNA上的区域。通常是RNA聚合酶结合、开始转录的碱基序列。“启动子序列”是指某一基因的具有启动子功能的部分。启动子序列通常多为推定的蛋白质编码区域的第1外显子或转录开始点的上游约5kbp以内的区域，因而，使用DNA解析用软件预测基因组碱基序列中的蛋白质编码区域，就能推定启动子序列。作为这种DNA解析用软件，例如可以是DNASIS软件（日立软件）、GENETYX（GENETICS公司）等。推定的启动子序列在各结构基因是不同的，通常存在于结构基因的上游，但并不局限于此，有时也会存在于结构基因的下游。
上述区域中存在Sp1和AP－2等已知的转录调节因子的可结合序列，该区域被预测在调控表达上会起重要作用。由此可以推测，至少在该区域中含有诱导转录所必需的充分的碱基序列（启动子序列）。准确的位置只要使用该技术领域公知惯用的技术进行调查即可。
对利用NCBI数据库获得启动子序列和预测的DNA序列的方法进行说明。
关于据预测含有人ZO－1（TJP1）基因的启动子序列的转录起始点上游的基因组DNA序列，在因特网上的MCSC Genome Browser主页上，将human referencesequence设定为检索对象数据库，以“TJP1”为关键词进行检索，会出现关于TJP1的Sequence and Links to Tools and Database的链接一览。由该链接地址转入“GenomicSequence Near Gene”页面。接着，选择Sequence Retrieval Region Options的复选框，将“Promoter/Upstream by”设定为5000bases，再选择“5’UTR Exons”的复选框，然后点击submit按钮，能获得含有转录起始点上游5kb和第一外显子的5’UTR的基因组DNA序列。此外，通过在NCBI主页上以“TJP1”为关键词进行检索，能获得NM_003257.3的注册编号，从而可得到TJP1的mRNA序列。将这些基因组序列和mRNA序列使用DNA解析用软件进行分析，能获得转录起始点上游的约5kbp的DNA序列。作为DNA解析用软件，如上所述，例如可以是DNASIS软件（日立软件）、GENETYX（GENETYX公司）等。
“可作用地与启动子序列连接”是指所希望的基因的表达（作用）在某一启动子序列的控制下进行配置。要将启动子可作用地与基因连接，通常在该基因的紧上游配置启动子，但并非必须邻接配置。
本发明中的“人视网膜色素上皮细胞”例如是来源于人的细胞，是位于视网膜外层的上皮细胞。该细胞对维持感光细胞具有重要作用。就形状而言，是单层立方上皮细胞，彼此间以紧密连接结合，具有黑色色素。
作为该人视网膜色素上皮细胞，无特殊限制，只要可以培养即可。在优选的实施方式中，具体而言，例如可以是干细胞衍生的视网膜色素上皮细胞（即，由例如胚胎干细胞（即SE细胞））、人工多能干细胞（即，iPS细胞）、神经干细胞等干细胞分化诱导而来的、容易培养的人视网膜色素上皮细胞等）、从生物组织直接取得的、容易培养的人视网膜色素上皮细胞等。此外，还可以是培养细胞化而得的癌细胞衍生的人视网膜色素上皮细胞、通过人为操作而无限增殖化的、容易培养的人视网膜色素上皮细胞等。
这里，“干细胞”是指即使经过细胞分裂仍能维持同样的分化能的细胞，在组织受到伤害时能再生该组织。作为该“干细胞”，例如可以是胚胎干细胞或组织干细胞（又称组织性干细胞、组织特异性干细胞或成体干细胞）或人工多能干细胞（iPS细胞：induced pluripotent stem cell）等。
作为在本发明的光毒性试验方法中使用的优选的干细胞，例如可以是胚胎干细胞（即，ES细胞）、人工多能干细胞（即，iPS细胞）、神经干细胞等。
胚胎干细胞（即，ES细胞）是一种具有自我复制能力、多分化能力（即，多能性“pluripotency”）的干细胞，是一种由早期胚胎衍生的多能干细胞。胚胎干细胞在1981年首次建立，1989年以后还被应用于基因敲除小鼠的制作。1998年建立了人胚胎干细胞，在再生医学中也正在被利用。包含神经干细胞等的组织干细胞与胚胎干细胞不同，是分化方向受限的细胞，存在于组织中的特定位置，构成未分化的细胞内结构。因此，组织干细胞的多能性水平低。组织干细胞的核/细胞质比高，细胞器少。总体上，组织干细胞具有多分化能力，细胞周期长，在个体一生以上的时间内维持增殖能力。人工多能干细胞是将成纤维细胞等已分化的细胞通过Oct3/4、Sox2、K1r4、Myc等多种基因的表达而直接起始化、诱导出多分化能力的细胞，在2006年由中山等人用小鼠细胞建立（Takahashi K,Yamanaka S.Cell.2006,126(4),p663－676）。2007年，还用人成纤维细胞建立，与胚胎干细胞一样具有多分化能力（TakahashiK,Tanabe K,Ohnuki M,Narita M,Ichisaka T,Tomoda K,Yamanaka S.Cell.2007,131(5),p861－872；Yu J,Vodyanik MA,Smuga－Otto K,Antosiewicz－Bourget J,FraneJL,Tian S,Nie J,Jonsdottir GA,Ruotti V,Stewart R,Slukvin II,Thomson JA.,Science.2007,318(5858),p1917－1920.;Nakagawa M,Koyanagi M,Tanabe K,Takahashi K,Ichisaka T,Aoi T,Okita K,Mochiduki Y,Takizawa N,Yamanaka S.Nat Biotechnol.,2008,26(1),p101－106）。
本发明的光毒性试验方法中的第一步骤是使受试物质与人视网膜色素上皮细胞接触的步骤。
在上述第一步骤中，使受试物质与人视网膜色素上皮细胞接触。作为人视网膜色素上皮细胞与受试物质的接触时间，例如可以在1分钟以上，优选在5分钟以上、3天以内，更优选在10分钟以上、24小时以内等。作为该接触时的保温温度，例如可以在15℃～42℃左右，优选在35℃～42℃左右，更优选在35℃～37℃左右，尤其优选在37℃左右等。此外，上述接触在培养液中进行时，作为该培养液的pH，例如可以在pH5～pH9左右，优选在pH6.5～pH7.8左右。
作为上述第一步骤中的受试物质接触时的二氧化碳浓度，例如可以在0%～25%左右等。
作为上述第一步骤中的受试物质接触时的优选湿度，例如可以在95±5%rh左右，更优选在100%rh左右等。
对于与人视网膜色素上皮细胞接触的受试物质的浓度和适用量，无特殊限制，可根据受试物质的种类、预想的受试物质的光毒性显现能力、第一步骤中的人视网膜色素上皮细胞与受试物质的接触时间、第二步骤中的培养时间、第二步骤中的光照射量等适当决定即可。例如，可以在0.001μM～10mM左右，优选在0.01μM～5mM左右等。
作为上述第一步骤中的接触体系内的人视网膜色素上皮细胞的密度，例如可以在1×104cell/cm2～4×106cell/cm2左右，优选在4×104cell/cm2～4×105cell/cm2左右等。
本发明的光毒性试验方法中的第二步骤：对在第一步骤中接触了受试物质的人视网膜色素上皮细胞，在第一步骤的接触开始后24小时以内，边照射包含340nm～380nm范围内的波长分布的人工光边进行培养。
在上述第二步骤中，对在第一步骤中接触了受试物质的人视网膜色素上皮细胞，在第一步骤的接触开始后24小时以内，边照射包含340nm～380nm范围内的波长分布的人工光边进行培养。然后，在受试物质具有光毒性显现能力的情况下，在本步骤中能使其显现光毒性显现能力。此时，优选使用不含吸收上述人工光的色素、可能吸附受试物质的血清等蛋白质成分的培养液。
在优选实施方式中，对在第一步骤中接触过受试物质的人视网膜色素上皮细胞，在第一步骤中的接触开始后12小时以内、更优选在6小时以内、尤其优选在10分钟～2小时以内边照射包含340nm～380nm范围内的波长分布的人工光边进行培养。
在本发明的鉴定方法的优选实施方式中，也可在上述第一步骤（即，与受试物质接触）和上述第二步骤（即，在人工光照射下进行培养）并行地进行的同时加以实施。更具体地，可以在除去第一步骤中接触的受试物质的状态下实施第二步骤，也可在受试物质存在的状态下实施第二步骤。
在从第一步骤中的接触开始后到第二步骤中的人工光照射开始前的这段期间，在第一步骤中接触过受试物质的人视网膜色素上皮细胞只要在例如15℃～42℃左右、优选在35℃～42℃左右、更优选在35℃～37℃左右、尤其优选在37℃左右等的培养温度下、且在人工光非照射下培养即可。此外，在第一步骤中的受试物质与人视网膜色素上皮细胞的24小时以内的接触之后，将该培养细胞清洗、更换过培养基后用于第二步骤中的人工光照射，由此，能排除细胞外的受试物质的影响，从而能只评价在第一步骤中摄入细胞内的受试物质的作用。
作为上述第二步骤中的培养时的二氧化碳浓度，例如可以在0%～25%左右等。
作为上述第二步骤中的培养时的湿度，例如可以在95±5%rh左右，优选在100%rh左右等。
照射的人工光为包含340nm～380nm范围内的波长分布的人工光。优选地，例如可以是由紫外光、可见光和红外光构成的作为模拟日光的人工光等。更优选地，例如可以是不包含小于305nm的波长的紫外光和850nm以上的波长的红外光且包含具有从315nm到800nm范围内的波长分布的光的模拟日光等。
作为上述人工光，例如可以是以紫外灯、汞灯、卤素灯、LED、氙灯、金属卤化物灯、钠灯等作为光源的光等。优选地，例如可以是以氙灯、汞灯等作为光源的紫外光、模拟日光等。更优选地，例如可以是以氙灯、汞灯等作为光源的模拟日光等。视需要而使用仅使特定波长的光通过的滤光片或阻断特定波长的滤光片等、调整为具有所希望的波长分布的人工光后使用即可。
另外，作为照射模拟日光用的具体的光照装置，例如可以是SOL500、SOL1200、SOL2000（Dr.K.Honle Medizintechnik公司）、SUNTEST CPS/CPS+、SUNTEST XLS+（Atlas Material Testing Technology公司）、SXL－2500V2、XI－01B140KB1（Seric公司）。
关于上述第二步骤，在受试物质存在的状态下实施第二步骤时，还可以调节受试物质的“在人工光照射下的接触时间”。即，通过适当设定培养时间和人工光的光照射量，能实现所希望的“在人工光照射下的接触时间”。人工光照射可以连续或间歇地进行。在连续进行人工光照射的情况下，培养时间相当于“在人工光照射下的接触时间”。例如，通过在连续的人工光照射下培养15分钟、30分钟、1小时或2小时，能实现15分钟、30分钟、1小时或2小时的“在人工光照射下的接触时间”。另一方面，在间歇地进行人工光照射的情况下，人工光的照射时间相当于“在人工光照射下的接触时间”。例如，在24小时的培养期间中，最初的12小时在人工光的照射下进行培养，剩余的12小时在遮蔽人工光的状态下进行培养，由此，能实现12小时的“在人工光照射条件下的接触”。
作为人视网膜色素上皮细胞的培养温度，例如可以在15℃～42℃左右。
关于上述第二步骤，作为照射包含340nm～380nm范围内的波长分布的人工光时的优选的光照射量，例如可以是在波长360nm下的测定值在3J/cm2～30J/cm2范围内的光照射量等。要得到这种所希望的“光照射量”，例如适当设定人工光的光照射强度和人工光的光照射时间等即可。光照射量（J/cm2）例如根据算式：时间（分钟）×光照射强度（mW/cm2）×60÷1000算出即可。具体地，例如，照射在波长360nm下的测定值约为2.08mW的光照射强度的人工光40分钟，可以发现，光照射量约为5J/cm2。
在优选实施方式中，作为人工光照射，例如可以是如下照射等：对于接触过受试物质的人视网膜色素上皮细胞和作为对照的人视网膜色素上皮细胞中的至少任一方的人视网膜色素上皮细胞，相对于在遮住人工光的条件下的上述细胞的活细胞数，光照射量使得在光照条件下的上述细胞的活细胞数有意义地减少。要设定这种优选的光照射量，例如顺着后述实施例6所记载的方法等实施预试验即可，能容易地确认优选的光照射量。
在更具体的实施方式中，作为人工光照射，例如可以是以在波长360nm下的测定值计、模拟日光的光照射量在3J/cm2～30J/cm2的范围内的光照射等。更优选地，例如可以是以在波长360nm下的测定值计、模拟日光的光照射量在3.5J/cm2～20J/cm2的范围内的光照射等。尤其优选地，例如可以是以在波长360nm下的测定值计、模拟日光的光照射量在5J/cm2～10J/cm2的范围内的光照射等。
通过照射上述光，能使受试物质的光毒性显现能力更切实地显现。
在本发明的光毒性试验方法的第三步骤中，回收在第二步骤中培养的人视网膜色素上皮细胞，测定回收的培养细胞中的细胞毒性或与细胞毒性具有相关关系的指标值。
在上述第三步骤中，测定在第二步骤中培养的人视网膜色素上皮细胞中的回收的培养细胞中的细胞毒性或与细胞毒性具有相关关系的指标值。
如上所述，培养细胞中的细胞毒性或与细胞毒性具有相关关系的指标值使用例如以下常用的方法进行测定即可：使用血细胞计数盘的方法、利用细胞计数器的方法、使用3H胸苷等放射性同位素的方法（只要将3H胸苷等放射性同位素加入到细胞培养液中进行培养就可仅测定活细胞的简便方法）、LDH（乳酸脱氢酶）法、使用中性红（NR）的方法（通过利用红色色素中性红被摄取到活细胞的溶酶体中而蓄积的性质的方法，是只测定活细胞的简便方法）、使用结晶紫（CR）的方法（通过利用结晶紫进入活细胞的细胞膜内而染色的性质的方法，是只测定活细胞的简便方法）、使用四唑鎓盐的方法（四唑鎓盐是细胞内线粒体的脱氢酶的底物，越是生存能力高的细胞，被还原的四唑鎓盐的量越多，其结果，产生的甲臜量与活细胞数良好地对应，从而是一种只测定活细胞的简便方法）、测定标记基因（例如RPE65、Mitf、ZO1）的表达量的方法、测定ATP量的方法、测定黑色素量的方法、用MTT法测定线粒体活性的方法等。在通过反复进行受试物质的“接触”和“清洗—更换培养基”等而使受试物质反复接触时，优选测定在各循环中回收的培养细胞中的细胞毒性或与细胞毒性具有相关关系的指标值。
本发明的光毒性试验方法中的第四步骤是根据第三步骤的测定结果评价受试物质有无光毒性显现能力或光毒性显现能力的程度、从而鉴定受试物质的光毒性显现能力的步骤。
在上述第四步骤中，根据第三步骤的测定结果评价受试物质有无光毒性显现能力或光毒性显现能力的程度，鉴定受试物质的光毒性显现能力。在评价受试物质有无光毒性显现能力或光毒性显现能力的程度时，可以不设定对照而通过第三步骤的测定结果的绝对值进行评价，也可以设定对照、通过与其测定结果进行比较而评价。
在优选实施方式中，将上述第三步骤的测定结果和在对照的人视网膜色素上皮细胞中回收的培养细胞中的细胞毒性或与细胞毒性具有相关关系的指标值的测定结果进行比较，根据其差异评价受试物质有无光毒性显现能力或光毒性显现能力的程度。这里，“对照”可以是设定阴性对照和阳性对照两方。作为阴性对照的例子，可以是在不照射人工光的情况下培养的人视网膜色素上皮细胞群、在光照射量弱的人工光照射下培养的人视网膜色素上皮细胞群、接触过预先知道不具有光毒性显现能力的物质（例如只有溶剂）的人视网膜色素上皮细胞群等。在使用这种阴性对照的情况下，可进行以下鉴定。即，将在受试物质中回收的培养细胞中的细胞毒性或与细胞毒性具有相关关系的指标值的测定结果与在阴性对照中回收的培养细胞中的细胞毒性或与细胞毒性具有相关关系的指标值的测定结果进行比较。并且，当在受试物质中回收的培养细胞中的细胞毒性或与细胞毒性具有相关关系的指标值的一方低时，也可将该受试物质评价、鉴定为具有光毒性显现能力。
在更优选的实施方式中，上述对照包含使已知的光毒性显现物质与人视网膜色素上皮细胞接触的阳性对照。作为阳性对照的例子，可以是使预先知道具有光毒性显现能力的基准物质接触、在人工光照射下进行培养的人视网膜色素上皮细胞群。在使用这种阳性对照的情况下，可进行以下鉴定。即，将在受试物质中回收的培养细胞中的细胞毒性或与细胞毒性具有相关关系的指标值的测定结果与在阳性对照中回收的培养细胞中的细胞毒性或与细胞毒性具有相关关系的指标值的测定结果进行比较。并且，当在受试物质中回收的培养细胞的细胞毒性或与细胞毒性具有相关关系的指标值的一方低时，可将该受试物质评价、鉴定为具有比作为阳性对照使用的基准物质高的光毒性显现能力。此外，通过在该基准物质的各浓度或各使用量下按同样的方法进行评价、鉴定，能定量地评价、鉴定该受试物质的光毒性显现能力。此外，从在阳性对照的回收的培养细胞中的细胞毒性或与细胞毒性具有相关关系的指标值比阴性对照的相应值低这件事也可以显示，人工光照射得到了正确实施，试验成立。
在更优选的实施方式中，将氯丙嗪（CPZ）作为基准物质用于阳性对照。
将本发明的光毒性试验方法用的氯丙嗪（CPZ）用作阳性对照也是本发明之一。此外，将本发明的光毒性试验方法用的氯丙嗪（CPZ）用作为阳性对照也是本发明之一。
本发明的阳性对照试剂的一种形式为用于本发明光毒性试验方法的阳性对照试剂，含有氯丙嗪（CPZ）。作为试剂的形态，可以直接使用氯丙嗪（CPZ），也可以将氯丙嗪溶解在溶剂中以溶液状使用。还可以是将氯丙嗪添加或分散到适宜的基质中的形态。
在更优选的实施方式中，将青霉素G（Penicillin G）、奎宁（Quinine）、硫氯酚（Bithionol）或氯己定（Chlorhexidine）作为基准物质用于阴性对照。
将用于本发明光毒性试验方法的青霉素G（Penicillin G）、奎宁（Quinine）、硫氯酚（Bithionol）或氯己定（Chlorhexidine）作为阴性对照使用也是本发明之一。此外，将用于本发明光毒性试验方法的青霉素G（Penicillin G）、奎宁（Quinine）、硫氯酚（Bithionol）或氯己定（Chlorhexidine）作为阴性对照使用方法也是本发明之一。
本发明的阴性对照试剂的一种形式为用于本发明光毒性试验方法的阴性对照试剂，含有青霉素G（Penicillin G）、奎宁（Quinine）、硫氯酚（Bithionol）或氯己定（Chlorhexidine）。作为试剂的形态，可以直接使用青霉素G（Penicillin G）、奎宁（Quinine）、硫氯酚（Bithionol）或氯己定（Chlorhexidine），也可以将这些试剂溶解在溶剂中以溶液状使用。还可以是将这些试剂添加或分散到适宜的基质中的形态。
此外，作为更具体的、优选的关于比较和评价的实施方式，也可以是以下方法。例如，求出将接触了受试物质的人视网膜色素上皮细胞的细胞毒性IC50值（非光照射用的（遮光）对照）除以在开始接触受试物质后24小时以内在人工光照射下培养的人视网膜色素上皮细胞的细胞毒性IC50值而得的值（PIF值：Photo Irritation Factor值），该值（PIF值）大于2、小于5时，评价为假阳性，该值在5以上时，评价受试物质为光毒性阳性。
在本发明的光毒性显现物质的查找方法中，通过本发明的光毒性试验方法鉴定受试物质的光毒性显现能力，选拔出所希望的具有光毒性显现能力的物质。在本发明的光毒性显现物质的查找方法中，也可以采取与上述本发明的光毒性试验方法相同的实施方式。例如，在使用上述阴性对照的情况下，将在受试物质中回收的培养细胞中的细胞毒性或与细胞毒性具有相关关系的指标值的测定结果与在阴性对照中回收的培养细胞中的细胞毒性或与细胞毒性具有相关关系的指标值的测定结果进行比较。并且，选拔出回收的培养细胞中的细胞毒性或与细胞毒性具有相关关系的指标值比阴性对照在统计学上有意义地低的受试物质即可，或者选拔出回收的培养细胞中的细胞毒性或与细胞毒性具有相关关系的指标值在阴性对照的相应值的50%以下的受试物质即可。
另一方面，在使用氯丙嗪（CPZ）等阳性对照的情况下，将在受试物质中回收的培养细胞中的细胞毒性或与细胞毒性具有相关关系的指标值的测定结果与在阳性对照中回收的培养细胞中的细胞毒性或与细胞毒性具有相关关系的指标值的测定结果进行比较。并且，通过选拔出回收的培养细胞中的细胞毒性或与细胞毒性具有相关关系的指标值比阳性对照在统计学上有意义地低的受试物质，或者通过选拔出在回收的培养细胞中的细胞毒性或与细胞毒性具有相关关系的指标值与阳性对照为相同值时的受试物质的浓度比阳性对照的浓度低的受试物质，可以选拔出具有比阳性对照中所用的基准物质高的光毒性显现能力的物质。此外，在使用阳性对照的情况下，还能定量地评价、鉴定回收的培养细胞中的细胞毒性或与细胞毒性具有相关关系的指标值。具体地，通过在氯丙嗪（CPZ）等基准物质的各浓度或各使用量下对受试物质同样地进行评价、鉴定，能定量地评价、鉴定受试物质的光毒性显现能力。并且，选拔出所希望的具有光毒性显现能力的物质。
在本发明的模拟日光皮肤刺激非诱发物质的查找方法中，通过本发明的光毒性试验方法鉴定受试物质的光毒性显现能力，选拔出所希望的不具有光毒性显现能力的物质。在本发明的模拟日光皮肤刺激非诱发物质的查找方法中，也可以采取与上述本发明的光毒性试验方法相同的实施方式。作为查找对象的受试物质，只要是所希望的不具有光毒性显现能力的物质，可以是任何物质，例如可以是低分子化合物、蛋白质、多肽等。
通过具有基于本发明光毒性试验方法的系统步骤的装置，能更高效地鉴定受试物质的光毒性显现能力，从而能更简便地查找所希望的光毒性显现物质或模拟日光皮肤刺激非诱发物质。此外，将通过本发明的光毒性试验方法所得的有关模拟日光皮肤刺激的毒性信息记录在电子信息存储介质上，能制作包含毒性信息的有用的电子信息存储介质。
实施例
下面，通过实施例对本发明进行更具体的说明。
实施例1（人ES细胞向人视网膜色素上皮细胞的分化诱导）
作为人胚胎干细胞（即，ES细胞），使用了京都大学建立株KhES－1株。
将上述KhES－1株在添加有bFGF（碱性成纤维细胞生长因子：basic fibroblastgrowth factor）的ES细胞维持培养用培养基（含有DMEM/F12、KSR(Knockout serumreplacement)、非必需氨基酸、L－谷氨酰胺、2－巯基乙醇等）中在丝裂霉素C处理过的小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast：MEF）饲养细胞上进行维持培养，维持KhES－1株的未分化状态。培养后，使用含有胰蛋白酶/胶原酶IV的解离液从培养皿中回收，得到人胚胎干细胞（即，ES细胞）的群落。
用微量吸液管吸取所得群落，捣碎成每一细胞团有数十个细胞左右的大小后，在预先用0.1%明胶液涂覆过的10cm培养皿中，向含有1μM～10μM SB431542、1μM～10μM CKI－7、1μM～10μM Y27632的人ES细胞维持培养用培养基10ml中接种数百到数千细胞团左右的人胚胎干细胞（即，ES细胞）的群落，接着，将这些群落在37℃、5%CO2的培养箱内进行培养。
次日（培养1天），以不会吸取悬浮细胞团的方式下除去一半量（5ml）培养基，然后，将含有1μM～10μM Y27632的SDIA培养基（含有GMEM、KSR、非必需氨基酸、丙酮酸钠、2－巯基乙醇等）5ml添加到上述培养皿中，按与上述相同的的方法继续培养。
培养5天后，以不会吸取未粘附的细胞团的方式除去5ml培养基，然后，将含有1μM～10μM Y27632的SDIA培养基添加到上述培养皿中，再按与上述相同的的方法继续培养。
培养8天后，除去全部培养基，然后，将PA6条件培养基（将融合状态的PA6细胞用SDIA培养基培养1天后的培养上清）10ml添加到上述培养皿中。以后，每3天～4天用PA6条件培养基进行培养基更换。通过该操作，分化诱导出具有黑色色素的人视网膜色素上皮细胞（可参见图1及图2）。
实施例2（人视网膜色素上皮细胞的培养）
将存在有由实施例1分化诱导出的具有黑色色素的人视网膜色素上皮细胞的群落用微量吸管吸取，接着，用0.05%胰蛋白酶处理，使细胞分散。
往预先用基质胶涂覆过的60mm培养皿中加入在含有N2添加物的DMEM/F12培养液中添加2～20ng/ml的bFGF而成的培养基，在该培养基上接种所得的分散细胞。这样接种的分散细胞中，还含有人视网膜色素上皮细胞以外的非特定细胞。
将细胞在37℃、5%CO2培养箱内培养、融合后，用0.25%胰蛋白酶处理，从培养皿中回收细胞。将回收的细胞接种到预先用基质胶涂覆过的10cm培养皿中，然后，在37℃、5%CO2培养箱内培养至细胞融合状态。细胞融合时，在存在于培养皿内的细胞中，大多数为人视网膜色素上皮细胞。
再将细胞用不含bFGF的含N2添加物的DMEM/F12培养液中培养1周以上，然后在以下实验中使用。
实施例3（在作为非光照射用的对照的遮光条件下的、本发明的光毒性试验方法的第一步骤、第二步骤和第三步骤）
对在实施例2中调制好的人视网膜色素上皮细胞用0.25%胰蛋白酶进行处理，从培养皿中回收细胞。将回收的细胞以每1孔各10万或12万个细胞接种在预先用基质胶涂覆过的96孔培养皿中，然后，在37℃、5%CO2培养箱内培养。
培养2小时～4小时后，使用吸液器从96孔培养皿中除去培养基，接着，将厄尔平衡盐缓冲液（EBSS）以每1孔150μl的比例添加到上述96孔培养皿中，清洗细胞。
接着，向上述培养皿中以每1孔100μl的比例添加预先使用EBSS调至下述浓度的受试物质溶液或溶剂对照液。
<受试物质的溶液>
（a）氯丙嗪（Chlorpromazine（CPZ））：浓度0.1、1、3、10、30、100（μg/ml）
（b）青霉素G（Penicillin G）：浓度1、3、10、30、100、300、1000（μg/ml）
（c）奎宁（Quinine）：浓度0.1、0.3、1、3、10、30、100（μg/ml）
（d）硫氯酚（Bithionol）：浓度0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10（μg/ml）
（e）氯己定（Chlorhexidine）：浓度0.1、0.3、1、3、10、30、100（μg/ml）用铝箔包覆96孔培养皿、遮光后，对于用铝箔遮光的培养皿，使用光照射装置（模拟日光照射装置SXL－2500V2：Seric公司）进行40分钟光照射（光照射量约为5J/cm2）。光照射后立即将上述96孔培养皿用DMEM/F12培养液150μl清洗2次，之后，向该96孔培养皿中以每1孔100μl的比例添加含N2添加物的DMEM/F12培养液，过夜培养。
培养后，从96孔培养皿中除去培养基，然后，将预先调制好的DMEM/F12培养液与Cell titer Glo反应液的等量混合液以每1孔100μl的比例添加到该96孔培养皿中。
将所得的96孔培养皿在用铝箔遮光的状态下边振荡边在室温下放置30分钟后，将上述96孔培养皿中所含的培养物95μl移至白色96孔试验皿中。接着，使用EnVision多标记检测仪（Perkin Elmer公司）测定该96孔试验皿中所含的培养物的发光量（该发光量与细胞生存率具有相关关系）。由测定值算出受试物质对人视网膜色素上皮细胞的50%抑制浓度（IC50），以该计算值作为表示细胞毒性（与细胞毒性具有相关关系的指标值）的值。
根据上述计算方法，得到以下结果。
<受试物质的细胞毒性>
（a）氯丙嗪（Chlorpromazine（CPZ））：IC50＝37.6（μg/ml）（参见图3）
（b）青霉素G（Penicillin G）：IC50＞1000（μg/ml）（在1000μg/ml以下未观察到细胞毒性）（参见图4）
（c）奎宁（Quinine）：IC50＝147.1（μg/ml）（参见图5）
（d）硫氯酚（Bithionol）：IC50＞10（μg/ml）（在10μg/ml以下未观察到细胞毒性）（参见图6）
（e）氯己定（Chlorhexidine）：IC50＝42.7（μg/ml）（参见图7）
实施例4（本发明的光毒性试验方法的第一步骤、第二步骤和第三步骤）
对于在实施例2中调制好的人视网膜色素上皮细胞，用0.25%胰蛋白酶进行处理，从培养皿中回收细胞。将回收的细胞以每1孔10万或12万个细胞接种在预先用基质胶涂覆过的96孔培养皿中，然后，在37℃、5%CO2培养箱内培养。
培养2小时～4小时后，使用吸液器从96孔培养皿中除去培养基，接着，将厄尔平衡盐缓冲液（EBSS）以每1孔150μl的比例添加到上述96孔培养皿中，清洗细胞。
然后，向上述培养皿中、以每1孔100μl的比例添加预先使用EBSS调至下述浓度的受试物质溶液或溶剂对照液。
<受试物质的溶液>
（a）氯丙嗪（Chlorpromazine（CPZ））：浓度0.1、1、3、10、30、100（μg/ml）
（b）青霉素G（Penicillin G）：浓度1、3、10、30、100、300、1000（μg/ml）
（c）奎宁（Quinine）：浓度0.1、0.3、1、3、10、30、100（μg/ml）
（d）硫氯酚（Bithionol）：浓度0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10（μg/ml）
（e）氯己定（Chlorhexidine）：浓度0.1、0.3、1、3、10、30、100（μg/ml）与实施例3不同，对96孔培养皿在不用铝箔包覆的情况下使用光照射装置（模拟日光照射装置SXL－2500V2：Seric公司）进行40分钟光照射（以在360nm下的光照射强度为基础进行计算，光照射量约为5J/cm2）。光照射后立即将上述96孔培养皿用DMEM/F12培养液150μl清洗2次，之后，向该96孔培养皿中、以每1孔100μl的比例添加含N2添加物的DMEM/F12培养液，过夜培养。
培养后，从96孔培养皿中除去培养基，然后，将预先调制好的DMEM/F12培养液与Cell titer Glo反应液的等量混合液以每1孔100μl的比例添加到该96孔培养皿中。
将所得的96孔培养皿在用铝箔遮光的状态下边振荡边在室温下放置30分钟，之后，将上述96孔培养皿中所含的培养物95μl移至白色96孔试验皿中。接着，使用EnVision多标记检测仪（Perkin Elmer公司）测定该96孔试验皿中所含的培养物的发光量（该发光量与细胞生存率具有相关关系）。由测定值算出受试物质对人视网膜色素上皮细胞的50%抑制浓度（IC50），以该计算值作为表示细胞毒性（与细胞毒性具有相关关系的指标值）的值。
根据上述计算方法，得到以下结果。
<受试物质的细胞毒性>
（a）氯丙嗪（Chlorpromazine（CPZ））：IC50＝5.8（μg/ml）（参见图8）
（b）青霉素G（Penicillin G）：IC50＞1000（μg/ml）（在1000μg/ml以下未观察到细胞毒性）（参见图9）
（c）奎宁（Quinine）：IC50＝88.9（μg/ml）（参见图10）
（d）硫氯酚（Bithionol）：IC50＞10（μg/ml）（在10μg/ml以下未观察到细胞毒性）（参见图11）
（e）氯己定（Chlorhexidine）：IC50＝43.7（μg/ml）（参见图12）
实施例5（本发明的光毒性试验方法：第四步骤）
根据在实施例3和实施例4中算出的50%抑制浓度（IC50），求出上述PIF值（Photo Irritation Factor值）（即，将接触了受试物质的人视网膜色素上皮细胞中的细胞毒性IC50值（非光照射用的（遮光）对照）除以在开始接触受试物质后24小时以内在模拟日光照射下培养的人视网膜色素上皮细胞中的IC50值而得的值）。其结果示于下面。该值（PIF值）大于5时，评价该受试物质为光毒性阳性。
<受试物质的PIF（Photo Irritation Factor值）>
（a）氯丙嗪（Chlorpromazine（CPZ））：6.5
在用本发明的光毒性试验方法进行的评价中，判定为光细胞毒性阳性。这一结果与过去的体内（in vivo）试验结果一致。
（b）青霉素G（Penicillin G）：未发现光细胞毒性。
在用本发明的光毒性试验方法进行的评价中，判定为光细胞毒性阴性。这一结果与过去的体内（in vivo）试验结果一致。
（c）奎宁（Quinine）：1.7
在用本发明的光毒性试验方法进行的评价中，判定为光细胞毒性阴性。这一结果与Ljunggren B.et al.，Phototoxic properties of quinine and quinidine:two quinolinemethanol isomer.;Photodermatology5133－138(1988)中记载的体内（in vivo）试验（mouse tail试验）结果一致。
（d）硫氯酚（Bithionol）：未发现光细胞毒性。
在用本发明的光毒性试验方法进行的评价中，判定为光细胞毒性阴性。这一结果与本来正确的阴性结果一致。而根据光毒性试验验证研究执行委员会（委员长吉村功）的光毒性试验替代法验证研究报告书（2004年8月27日），在4个机构中进行的酵母－红细胞试验中，结果为假阳性，由此得以确认，本发明的光毒性试验方法优异。
（e）氯己定（Chlorhexidine）：0.98
在用本发明的光毒性试验方法进行的评价中，判定为光细胞毒性阴性。这一结果与本来正确的阴性结果一致。而根据光毒性试验验证研究执行委员会（委员长吉村功）的光毒性试验替代法验证研究报告书（2004年8月27日），在4个机构中进行的酵母－红细胞试验中，结果为假阳性，由此得以确认，本发明的光毒性试验方法优异。
比较例1（使用人视网膜色素上皮细胞以外的人细胞的比较实验）
“Balb/c3T3细胞”为结缔组织细胞（Connective Tissue Cell），也是成纤维细胞（Fibroblast）。
对于用含10%牛血清、L－谷氨酰胺的DMEM培养基培养的“Balb/c3T3细胞”，用0.25%胰蛋白酶进行处理，从培养皿中回收细胞。将回收的细胞以每1孔1万个细胞播种到预先用0.1%明胶溶液涂覆过的96孔培养皿中后，用含10%牛血清、L－谷氨酰胺的DMEM培养基在37℃、5%CO2培养箱内过夜培养。
培养后，使用吸液器从96孔培养皿中除去培养基，接着，将厄尔平衡盐缓冲液（EBSS）以每1孔150μl的比例添加到上述96孔培养皿中，清洗细胞。
然后，向上述培养皿中以每1孔100μl的比例添加预先使用EBSS调至下述浓度的受试物质溶液或溶剂对照液。
<受试物质的溶液>
（a）氯丙嗪（Chlorpromazine（CPZ））：浓度0.1、1、3、10、30、100（μg/ml）
（b）青霉素G（Penicillin G）：浓度1、3、10、30、100、300、1000（μg/ml）
（c）奎宁（Quinine）：浓度0.1、0.3、1、3、10、30、100（μg/ml）
（d）硫氯酚（Bithionol）：浓度0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10（μg/ml）
（e）氯己定（Chlorhexidine）：浓度0.1、0.3、1、3、10、30、100（μg/ml）用铝箔包覆96孔培养皿、遮光后，对于用铝箔遮光的培养皿，使用光照射装置（模拟日光照射装置SXL－2500V2：Seric公司）进行40分钟光照射（以在360nm下的光照射强度为基础进行计算，光照射量约为5J/cm2）。光照射后立即将上述96孔培养皿用DMEM/F12培养液150μl清洗2次，之后，向该96孔培养皿中以每1孔100μl的比例添加含N2添加物的DMEM/F12培养液，过夜培养。
培养后，从96孔培养皿中除去培养基，然后，将预先调制好的DMEM/F12培养液与Cell titer Glo反应液的等量混合液以每1孔100μl的比例添加到该96孔培养皿中。
将所得的96孔培养皿在用铝箔遮光的状态下边振荡边在室温下放置30分钟，之后，将上述96孔培养皿中所含的培养物95μl移至白色96孔试验皿中。
接着，使用EnVision多标记检测仪（Perkin Elmer公司）测定该96孔试验皿中所含的培养物的发光量（该发光量与细胞生存率具有相关关系）。由测定值算出受试物质对人视网膜色素上皮细胞的50%抑制浓度（IC50），以该计算值作为表示细胞毒性（与细胞毒性具有相关关系的指标值）的值。
根据上述计算方法，得到以下结果。
<受试物质的细胞毒性>
（a）氯丙嗪（Chlorpromazine（CPZ））：IC50＝19.4（μg/ml）（参见图13）
（b）青霉素G（Penicillin G）：IC50＞1000（μg/ml）（在1000μg/ml以下未观察到细胞毒性）（参见图14）
（c）奎宁（Quinine）：IC50＝292.2（μg/ml）（参见图15）
（d）硫氯酚（Bithionol）：IC50＝11.4（μg/ml）（在3μg/ml以下未观察到细胞毒性）（参见图16）
（e）氯己定（Chlorhexidine）：IC50＝13.7（μg/ml）（参见图17）
比较例2（比较光毒性试验方法：第一步骤、第二步骤、第三步骤）
对于用含10%牛血清、L－谷氨酰胺的DMEM培养基培养的“Balb/c3T3细胞”，用0.25%胰蛋白酶进行处理，由此从培养皿中回收细胞。将回收的细胞以每1孔1万个细胞播种到预先用0.1%明胶溶液涂覆过的96孔培养皿中后，用含10%牛血清、L－谷氨酰胺的DMEM培养基在37℃、5%CO2培养箱内过夜培养。
培养后，使用吸液器从96孔培养皿中除去培养基，接着，将厄尔平衡盐缓冲液（EBSS）以每1孔150μl的比例添加到上述96孔培养皿中，清洗细胞。
然后，向上述培养皿中、以每1孔100μl的比例添加预先使用EBSS调至下述浓度的受试物质溶液或溶剂对照液。
<受试物质的溶液>
（a）氯丙嗪（Chlorpromazine（CPZ））：浓度0.1、1、3、10、30、100（μg/ml）
（b）青霉素G（Penicillin G）：浓度1、3、10、30、100、300、1000（μg/ml）
（c）奎宁（Quinine）：浓度0.1、0.3、1、3、10、30、100（μg/ml）
（d）硫氯酚（Bithionol）：浓度0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10（μg/ml）
（e）氯己定（Chlorhexidine）：浓度0.1、0.3、1、3、10、30、100（μg/ml）与比较例1不同，对96孔培养皿在不用铝箔包覆的情况下使用光照射装置（模拟日光照射装置SXL－2500V2：Seric公司）进行40分钟光照射（以在360nm下的光照射强度为基础进行计算，光照射量约为5J/cm2）。光照射后立即将上述96孔培养皿用DMEM/F12培养液150μl清洗2次，之后，向该96孔培养皿中以每1孔100μl的比例添加含N2添加物的DMEM/F12培养液，过夜培养。
培养后，从96孔培养皿中除去培养基，然后，将预先调制好的DMEM/F12培养液与Cell titer Glo反应液的等量混合液以每1孔100μl的比例添加到该96孔培养皿中。
将所得的96孔培养皿在用铝箔遮光的状态下边振荡边在室温下放置30分钟，之后，将上述96孔培养皿中所含的培养物95μl移至白色96孔试验皿中。接着，使用EnVision多标记检测仪（Perkin Elmer公司）测定该96孔试验皿中所含的培养物的发光量（该发光量与细胞生存率具有相关关系）。由测定值算出受试物质对人视网膜色素上皮细胞的50%抑制浓度（IC50），以该计算值作为表示细胞毒性（与细胞毒性具有相关关系的指标值）的值。
根据上述计算方法，得到以下结果。
<受试物质的细胞毒性>
（a）氯丙嗪（Chlorpromazine（CPZ））：IC50＝0.82（μg/ml）（参见图18）
（b）青霉素G（Penicillin G）：IC50＞1000（μg/ml）（在1000μg/ml以下未观察到细胞毒性）（参见图19）
（c）奎宁（Quinine）：IC50＝2.3（μg/ml）（参见图20）
（d）硫氯酚（Bithionol）：IC50＝0.93（μg/ml）（在10μg/ml以下未观察到细胞毒性）（参见图21）
（e）氯己定（Chlorhexidine）：IC50＝10.1（μg/ml）（参见图22）
比较例3（比较光毒性试验方法：第四步骤）
根据在比较例1和比较例2中算出的50%抑制浓度（IC50），求出上述PIF值（Photo Irritation Factor值）（即，将接触了受试物质的人视网膜色素上皮细胞中的细胞毒性IC50值（非光照射用的（遮光）对照）除以在开始接触受试物质后24小时以内在模拟日光照射下培养的人视网膜色素上皮细胞中的IC50值而得的值）。其结果示于下面。该值（PIF值）大于5时，评价该受试物质为光毒性阳性。
<受试物质的PIF（Photo Irritation Factor值）>
（a）氯丙嗪（Chlorpromazine（CPZ））：23.7
在用比较光毒性试验方法进行的评价中，判定为光细胞毒性阳性。这一结果与过去的体内试验结果一致。
（b）青霉素G（Penicillin G）：未发现光细胞毒性。
在用比较光毒性试验方法进行的评价中，判定为光细胞毒性阴性。这一结果与过去的体内试验结果一致。
（c）奎宁（Quinine）：128.8
在用比较光毒性试验方法进行的评价中，判定为光细胞毒性阳性。这一结果与Ljunggren B.et al.,Phototoxic properties of quinine and quinidine:two quinolinemethanol isomer;Photodermatology5133－138(1988)中记载的体内试验（mouse tail试验）结果不一致。因此，在本发明的光毒性试验方法中，结果为假阳性。
（d）硫氯酚（Bithionol）：12.4
在用比较光毒性试验方法进行的评价中，判定为光细胞毒性阳性。这一结果与本来正确的阴性结果不一致。因此，在比较光毒性试验方法中，结果为假阳性。而根据光毒性试验验证研究执行委员会（委员长吉村功）的光毒性试验替代法验证研究报告书（2004年8月27日），在4个机构中进行的酵母－红细胞试验中，结果为假阳性。
（e）氯己定（Chlorhexidine）：1.4
在用比较光毒性试验方法进行的评价中，判定为光细胞毒性阴性。这一结果与本来正确的阴性结果一致。而根据光毒性试验验证研究执行委员会（委员长吉村功）的光毒性试验替代法验证研究报告书（2004年8月27日），在4个机构中进行的酵母－红细胞试验中，结果为假阳性。
实施例6（用于设定光照射量的预试验）
使用在OECD指南中作为阳性对照使用的氯丙嗪（CPZ），对光照射量与上述PIF值（即，将接触了受试物质的人视网膜色素上皮细胞中的细胞毒性IC50值（非光照射用的（遮光）对照）除以在开始接触受试物质后24小时以内在模拟日光照射下培养的人视网膜色素上皮细胞中的IC50值而得的值）的关系进行了研究。在将光照射设定为照射2.09mW/cm2（在Topcon公司生产的UVR300上安装受光部UD360进行测定）的光15分钟（1.87J/cm2）、20分钟（2.50J/cm2）、25分钟（3.13J/cm2）、30分钟（3.75J/cm2）、40分钟（5.00J/cm2）、60分钟（7.51J/cm2）的各种条件后，根据实施例3和实施例4中记载的方法实施光毒性试验方法。此外，关于作为非光照射用的对照的遮光条件，除了进行遮光以外，按与上述光照射中的光毒性试验方法相同的方法实施了光毒性试验方法。
其结果，由测得的值算出受试物质对人视网膜色素上皮细胞的50%抑制浓度（IC50），再根据该计算值求出PIF值，结果是，15分钟时，PIF值＝1.70；20分钟时，PIF值＝1.72；25分钟时，PIF值＝3.35；30分钟时，PIF值＝4.57；40分钟时，PIF值＝6.53；60分钟时，PIF值＝10.94（参见图23）。
根据上述情况，光照射量在3.75J/cm2（30分钟）以下时，PIF不会＞5，由此无法判定作为阳性对照的氯丙嗪（CPZ）为阳性，因此，由该预试验可以确认，将光照射量设定为高于3.75J/cm2是适宜的。
接着，与上述预试验相关联，模拟日光的照射对于接触了氯丙嗪（CPZ）的人视网膜色素上皮细胞，相对于在遮蔽模拟日光的条件下的上述细胞的活细胞数，其光照射量使得光照条件下的上述细胞的活细胞数有意义地减少。
对光照射15分钟（1.87J/cm2）、20分钟（2.50J/cm2）、25分钟（3.13J/cm2）、30分钟（3.75J/cm2）、40分钟（5.00J/cm2）、60分钟（7.51J/cm2）时的人视网膜色素上皮细胞的活细胞数进行了调查。抽出在光照射时间为40分钟的遮光条件下未见上述细胞的活细胞数减少的、氯丙嗪（CPZ）的接触浓度为10μg/ml的结果（参见图3）进行了比较，可以确认，对于在遮蔽模拟日光的条件下的上述细胞的活细胞数，光照条件下的上述细胞的活细胞数会有意义地减少的光照射量在3.13J/cm2（25分钟）以上（参加图24）。
因此，得以确认，当光照射量在3.13J/cm2（25分钟）以上时，若模拟日光的照射适宜地进行、使用该光照射量，就可实施优选的本法明的光毒性试验方法。
实施例7（利用转化体的本发明的光毒性试验方法）
下面，具体记载在于人视网膜色素上皮细胞中表达的基因（Mitf、RPE65、ZO1等）的启动子的表达控制下用含有报告基因的载体转化的人胚胎干细胞（即，ES细胞）的制作方法。
（1）基因的启动子克隆和报告质粒的制作
通过以下所示方法克隆ZO－1的启动子区域。
以含有从胚胎干细胞（即，ES细胞）中提取出的基因组DNA20ng或RPE65基因的人基因组BAC DNA为模板，使用在RPE65基因的翻译起始位点和转录起始位点上游5kb的位置设计的引物，通过使用Platinum Taq polymerase（Invitrogen公司）的PCR法，扩增所希望的DNA片段。PCR反应通过GeneAmp PCR System9700（Applied Biosystem公司）在以下反应条件下实施：在95℃下反应5分钟后，进行95℃下30秒、55℃下30秒、72℃下5分钟的循环30次，在72℃下反应7分钟。
对所得的PCR产物用PCR purification kit（QIAGEN公司）进行精制，在将PCR产物的末端用限制酶消化后，进行琼脂糖凝胶电泳，由此进行精制。
将精制后的所希望的DNA片段与用碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，Takara Bio公司）进行脱磷酸化处理而得的pGL4.17[Luc2/Neo]载体（Promega公司）用Ligationkit（Takara Bio公司）连结。将所得的DNA片段转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞（Takara Bio公司）中后，将此转化体在37℃下用LB/氨苄西林液体培养基过夜培养。培养后，将出现的群落用LB/氨苄西林液体培养基进行培养，从培养所得的大肠杆菌中提取质粒DNA。对提取的质粒DNA，确定其插入片段的序列，确认有无变异等。
为了用于向人胚胎干细胞（即，ES细胞）中进行转染，将各质粒用Qiafilter质粒提取试剂盒（QIAGEN公司）进行再次提取。将所得的质粒DNA20μg用限制酶进行直线化后，进行纯化，得到线状化DNA。
（2）重组胚胎干细胞（即，ES细胞）的制作方法
通过对未分化维持培养而得的胚胎干细胞（即，ES细胞）用解离液进行处理，从培养皿中回收人胚胎干细胞（即，ES细胞）群落。将回收的群落悬浮到人胚胎干细胞（即，ES细胞）未分化维持培养基中，并将该细胞悬浮液移到用0.1%明胶涂覆过的10cm培养皿中，然后，在37℃、5%CO2培养箱中静置2小时，由此使饲养细胞附着。将含有悬浮的人胚胎干细胞（即，ES细胞）群落的上清移至15ml管中，对于该上清，用离心机使细胞群落沉降。将这样回收的细胞群落用胰蛋白酶液进行酶处理后，用微量吸液管吸取，由此使人胚胎干细胞（即，ES细胞）单细胞化。
接着，对所得的细胞进行离心，使其沉降。用预先将Opti－MEM培养基、2μg线状DNA和8μl FuGENE HD（Promega公司）混合而得的液体使上述细胞悬浮，并使该细胞悬浮液在室温下反应5分钟后，以含1μM～10μM Y27632的未分化维持培养基悬浮。
将所得的细胞悬浮液接种到耐新霉素饲养细胞上，在37℃、5%CO2培养箱中过夜培养。向培养基中添加100μg/mL的G418（Invitrogen公司），由此进行药剂选择培养。在添加G41810天～15天后，在显微镜下对在培养皿中形成的人胚胎干细胞（即，ES细胞）群落进行分离，并将分离出的人胚胎干细胞接种到96孔板中。继续进行药剂选择培养，然后，再在10～15天后，对增殖的细胞进行继代培养，将其接种到48孔板中。继续药剂选择培养后，取得耐药性的稳定转化细胞株。
（3）作为非光照射用的对照的遮光条件下的受试物质对利用重组人胚胎干细胞（即，ES细胞）的人视网膜色素上皮细胞的暴露和毒性值的计算
将重组人胚胎干细胞（即，ES细胞）按实施例1中记载的方法分化、诱导为人视网膜色素上皮细胞。
接着，按实施例2中记载的方法培养人视网膜色素上皮细胞，然后，按实施例3中记载的方法使上述上皮细胞暴露于受试物质。
暴露次日，从96孔培养皿中除去培养基后，将预先调制好的DMEM/F12培养液和Steady Glo反应液的等量混合液以每1孔100μl的比例添加到96孔培养皿中。
在用铝箔遮光的状态下边振荡边在室温下放置30分钟，然后，将95μl移至白色96孔培养皿中，用EnVision多标记检测仪（Perkin Elmer公司）测定其发光量。由溶剂对照和受试物质的各供试浓度下的发光量的测定值算出该受试物质对人视网膜色素上皮细胞的50%抑制浓度（IC50），以此作为毒性值。
（4）在光照条件下的受试物质对利用重组人胚胎干细胞（即，ES细胞）的人视网膜色素上皮细胞的暴露和毒性值的计算
将重组人胚胎干细胞（即，ES细胞）按实施例1中记载的方法分化、诱导为人视网膜色素上皮细胞。
接着，按实施例2中记载的方法培养人视网膜色素上皮细胞后，按实施例4中记载的方法使上述上皮细胞暴露于受试物质。
暴露次日，从96孔培养皿中除去培养基后，将预先调制好的DMEM/F12培养液和Steady Glo反应液的等量混合液以每1孔100μl的比例添加到96孔培养皿中。
在用铝箔遮光的状态下边振荡边在室温下放置30分钟，然后，将95μl移至白色96孔培养皿中，用EnVision多标记检测仪（Perkin Elmer公司）测定其发光量。由溶剂对照和受试物质的各供试浓度下的发光量的测定值算出该受试物质对人视网膜色素上皮细胞的50%抑制浓度（IC50），以此作为毒性值。
（5）使用利用重组人胚胎干细胞（即，ES细胞）的人视网膜色素上皮细胞的受试物质的光毒性显现能力的评价
根据在上述（4）中算出的50%抑制浓度（IC50），求出上述PIF值（即，将接触了受试物质的人视网膜色素上皮细胞中的细胞毒性IC50值（非光照射用的（遮光）对照）除以在开始接触受试物质后24小时以内在模拟日光照射下培养的人视网膜色素上皮细胞中的IC50值而得的值）。其结果，该值（PIF值）大于6时，评价受试物质为光毒性阳性。
根据本发明的光毒性试验方法，能有效地鉴定受试物质的光毒性显现能力。此外，本发明能提供在该试验方法中可作为阳性对照使用的光毒性显现物质。

Claims (16)

1.光毒性试验方法，包括下述步骤（1）～（4）：
（1）第一步骤：使受试物质与人视网膜色素上皮细胞接触；
（2）第二步骤：对在第一步骤中接触了受试物质的人视网膜色素上皮细胞在第一步骤中的接触开始后24小时以内边照射包含340nm～380nm范围内的波长分布的人工光边进行培养；
（3）第三步骤：回收在第二步骤中培养的人视网膜色素上皮细胞，测定回收的培养细胞中的细胞毒性或与其具有相关关系的指标值；和
（4）第四步骤：根据第三步骤的测定结果评价受试物质有无光毒性显现能力或其程度，鉴定受试物质的光毒性显现能力。
2.根据权利要求1所述的光毒性试验方法，其特征在于，所述人工光为由紫外光、可见光和红外光构成的模拟日光。
3.根据权利要求1或2所述的光毒性试验方法，其特征在于，在第二步骤中的人工光照射中，在波长360nm下的光照射量测定值在3J/cm2～30J/cm2的范围内。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的光毒性试验方法，其特征在于，在所述第四步骤中，将所述第三步骤的测定结果与在对照的人视网膜色素上皮细胞中回收的培养细胞中的细胞毒性或与其具有相关关系的指标值的测定结果进行比较，根据其差异评价受试物质有无光毒性显现能力或其程度。
5.根据权利要求4所述的光毒性试验方法，其特征在于，所述对照包含使已知的光毒性显现物质与人视网膜色素上皮细胞接触过的阳性对照。
6.根据权利要求5所述的光毒性试验方法，其特征在于，所述光毒性显现物质为氯丙嗪。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的光毒性试验方法，其特征在于，在第二步骤中的人工光照射中，对于具有接触过受试物质的人视网膜色素上皮细胞和对照的人视网膜色素上皮细胞中的至少任一方的人视网膜色素上皮细胞，相对于在遮蔽人工光的条件下的上述细胞的活细胞数，光照射量使得光照射条件下的所述细胞的活细胞数有意义地减少。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的光毒性试验方法，其特征在于，所述第二步骤的人工光照射是1次连续照射或由2次以上反复照射构成的间歇照射。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的光毒性试验方法，其特征在于，所述人视网膜色素上皮细胞为来自干细胞的视网膜色素上皮细胞。
10.根据权利要求9所述的光毒性试验方法，其特征在于，所述干细胞为胚胎干细胞、人工多能干细胞或神经干细胞。
11.氯丙嗪在权利要求1～10中任一项所述的光毒性试验方法中作为阳性对照的应用。
12.阳性对照试剂，用于权利要求1～10中任一项所述的光毒性试验方法，含有氯丙嗪。
13.青霉素G、奎宁、硫氯酚或氯己定在权利要求1～10中任一项所述的光毒性试验方法中作为阴性对照的应用。
14.阳性对照试剂，为用于权利要求1～10中任一项所述的光毒性试验方法的阴性对照试剂，含有青霉素G、奎宁、硫氯酚或氯己定。
15.光毒性显现物质的查找方法，其中，通过权利要求1～10中任一项所述的光毒性试验方法鉴定受试物质的光毒性显现能力，选出所希望的具有光毒性显现能力的物质。
16.模拟日光皮肤刺激非诱发物质的查找方法，其中，通过权利要求1～10中任一项所述的光毒性试验方法鉴定受试物质的光毒性显现能力，选出所希望的不具有光毒性显现能力的物质。
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