TW201303025A - 光毒性試驗法 - Google Patents

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Abstract

本發明是，提供使用人視網膜色素上皮細胞的光毒性試驗法等。

Description

光毒性試驗法
本發明是關於使用人視網膜色素上皮細胞的光毒性試驗法等。
要評估醫藥品，農藥，化粧品，工業製品等的化學物質對人的安全性時，通常，進行使用動物個體的許多毒性試驗。這些毒性試驗中，在進入體內的化學物質對光反應而產生刺激性等的急性毒性試驗被總稱為光毒性試驗。
做為光毒性試驗法而最廣汎受利用的方法，例如，有對動物皮膚的局部施用的森川法。該光毒性試驗法是使用天竺鼠或白兔，在該動物的背部皮膚塗佈被驗物的化學物質後，將對該塗佈部位紫外線照射的前述背部皮膚的生體反應，依照預先規定的評估基準以肉眼判定所得的判定結果，與將前述塗佈部位對非紫外線照射的前述背部皮膚的生體反應，依照前述評估基準同樣以肉眼判定所得的判定結果比較，而評估被驗物的化學物質所具有光毒性的存在有無或其程度的試驗法。
但是，由於近年來動物福利的問題及在歐洲等可見到的動物實驗規制的強化，有強力要求不使用實驗動物的光毒性試驗法的代替法的開發。
另一方面，現在為止有許多的體外光毒性試驗法的開發。這種光毒性試驗法中受期待最大的，例如可舉，結締組織細胞(Connective Tissue Cell)，也是纖維母細胞 (Fibroblast)的「Balb/c 3T3細胞」的中性紅攝取試驗法(3T3 NRU PT)。該3T3 NRU PT是在1998年由ECVAM(European Center for the Validation of Alternative Methods：歐洲代替法驗證中心)以科學方法確立的光毒性試驗法的代替法而受承認，2000年以後，被採用為篩選化學物質所具有光毒性的存在有無的試驗法。又該試驗法也在OECD被提出，在2004年也做為體外光毒性試驗而受準則化的唯一的試驗法而為眾所知(例如，參照OECD guidelines for the testing of chemicals：test guideline 432“In vitro 3T3 NRU phototoxicity test”Paris：Frankreich，OECD Publication Office；2004)。
但是，近年來，累積了許多有關3T3 NRU PT的光毒性的存在有無等的評估結果，也會包含偽陽性的結果也逐漸出現，實際上關於預測對人的安全性時不一定都會經常能充分滿意的，而有開發新的體外光毒性試驗法的要求(例如參照：Experimental and Toxicologic Pathology,vol.63,p209-214；2011)。
本發明是提供一種使用人視網膜色素上皮細胞的光毒性試驗法等。
更具體而言，本發明提供：1、一種具有下述步驟(1)至(4)的光毒性試驗方法(以下，有時稱為本發明光毒性試驗方法。)： (1)將人視網膜色素上皮細胞與被驗物質接觸的第一步驟；(2)將在第一步驟中與被驗物質接觸的人視網膜色素上皮細胞，在第一步驟中接觸開始後24小時以內，一面以含有340nm至380nm的範圍的波長分佈的人工光照射一面進行培養的第二步驟；(3)將在第二步驟所培養的人視網膜色素上皮細胞回收，測定回收的培養細胞的細胞毒性或與其有相關關係的指標值的第三步驟；及(4)根據第三步驟的測定結果評估被驗物質的光毒性表現能力的有無或其程度，而檢定被驗物質的光毒性表現能力的第四步驟；2、如前項1所述的光毒性試驗方法，其中前述人工光是包含紫外光、可見光及紅外光的模擬太陽光；3、如前項1項或2所述的光毒性試驗方法，在第二步驟中的人工光的照射是以在波長360nm的測定值在3J/cm2至30J/cm2的範圍的光照射量照射；4、如前項1至3中任一項所述的光毒性試驗方法，而其前述第四步驟中，將在前述第三步驟的測定結果，與對照的人視網膜色素上皮細胞所回收的培養細胞的細胞毒性或與其有相關關係指標值的測定結果比較，根據其差異而評估被驗物質的光毒性表現能力的有無或其程度；5、如前項4所述的光毒性試驗方法中，前述對照是包含 使人視網膜色素上皮細胞與已知的光毒性表現物質接觸的陽性對照；6、如前項5所述的光毒性試驗方法，而其前述光毒性表現物質是氯丙嗪(Chlorpromazine,(CPZ))；7、如前項1至6中任一項所述的光毒性試驗方法，其中在第二步驟中的人工光的照射是具有下述光照射量的照射：與被驗物質接觸後的人視網膜色素上皮細胞與對照的人視網膜色素上皮細胞的至少一者的人視網膜色素上皮細胞中，相對於將人工光遮光條件下的前述細胞的生存細胞數，在光照射條件下的前述細胞的生存細胞數會顯著減少的光照射量；8、如前項1至7中任一項所述的光毒性試驗方法，其中在前述第二步驟中的人工光的照射是1次連續照射或包含2次以上重複照射的間歇照射；9、如前項1至8中任一項所述的光毒性試驗方法，其中前述人視網膜色素上皮細胞是源自幹細胞的視網膜色素上皮細胞；10、如前項9所述的光毒性試驗方法，其中前述幹細胞是胚性幹細胞，人工多功能性幹細胞或神經幹細胞；11、一種前項1至10中任一項所述的光毒性試驗方法中，將氯丙嗪(Chlorpromazine,(CPZ)做為陽性對照的使用；12、一種含有氯丙嗪(Chlorpromazine,(CPZ))的陽性對照試藥，係用於前項1至10中任一項所述的光毒性 試驗方法中的陽性對照試藥；13、一種前項1至10中任一項所述的光毒性試驗方法中，將盤尼西林G(Penicillin G)、奎寧(Quinine)、硫氯酚(Bithionol)或氯己定(Chlorhexidine)做為陰性對照的使用；14、一種用於前項1至10中任一項所述的光毒性試驗方法的陰性對照試藥，係含有盤尼西林G(Penicillin G)、奎寧(Quinine)、硫氯酚(Bithionol)或氯己定(Chlorhexidine)的陰性對照試藥；15、一種光毒性表現物質的探索方法(以下，有時稱為本發明光毒性表現物質探索方法。)，係使用前項1至10中任一項所述的光毒性試驗方法檢定被驗物質的光毒性表現能力，而選拔所希望的具有光毒性表現能力的物質；及16、一種模擬太陽光皮膚刺激非誘發物質的探索方法(以下，有時稱為本發明模擬太陽光皮膚刺激非誘發物質探索方法)，係使用前項1至10中任一項所述的光毒性試驗方法檢定被驗物質的光毒性表現能力，而選拔所希望的不具備光毒性表現能力的物質；等。
如依本發明光毒性試驗方法，可有效率地進行被驗物質的光毒性表現能力的檢定。再者，本發明是可提供在該試驗方法可做為陽性對照使用的光毒性表現物質。
如依本發明光毒性表現物質探索方法，可簡便地進行 所希望的光毒性表現物質或模擬太陽光皮膚刺激非誘發物質的探索。
以下，詳細說明本發明的實施形態。
在本發明中的「形質轉換體」，指以形質轉換製作的細胞等生命體的全部或一部分而言。形質轉換體而言，例如可舉，原核細胞，酵母，動物細胞，植物細胞，昆蟲細胞等。形質轉換體，依其對象而定，也稱為形質轉換細胞，形質轉換組織，形質轉換宿主等。在本發明所用的細胞，也可以是形質轉換體。
與本發明有關連的，在基因操作技術上使用的原核生物細胞而言，例如可舉屬於埃希氏桿菌(Eschericia)屬，沙雷氏菌(Serratia)屬，芽孢桿菌(Bacillus)屬，短桿菌(Brevibacterium)屬，棒狀桿菌(Corynebacterium)屬，分分枝桿菌(Microbacterium)屬，假單胞菌(Pseudomonas)屬等原核生物細胞，更具體而言，可舉Eschericia XLI-Blue，Eschericia XL2-Blue，Eschericia DHI等。這種細胞，例如，在‘Molecular Cloning(3rd edition)’by Sambrook,J and Russell,D.W.,Appendix 3(Volume3),Vectors and Bacterial strains.A3.2(Cold Spring Harbor USA 2001)中有具體的說明。
與本發明有關連的「載體(vector)」，指可將目的之多核苷酸序列移入於目的細胞的載體而言。這種載體而言，例如可舉，在原核細胞，酵母，動物細胞，植物細胞，昆 蟲細胞，動物個體或植物個體等宿主細胞中可以自行複製者，或，可組入於染色體中，在適於多核苷酸的轉錄的位置含有啟動子者等。
這種載體中，有時將適於選殖的載體稱為「選殖載體」。這種選殖載體，通常，含有具複數個限制酶部位的多重選殖部位。現在，基因的選殖可使用的載體，在該技術領域有多數存在，因供應商而有細微的差異(例如，多重選殖部位的限制酶的種類及序列)給予不同名稱而出售。例如，‘Molecular Cloning(3rd edition)’by Sambrook,J and Russell,D.W.,Appendix 3(Volume 3),Vectors and Bacterial strains.A3.2(Cold Spring Harbor USA,2001))中有其代表性的載體與其供應商一併介紹，本業者可以視目的如何而適宜選擇使用。
與本發明有關連的「載體」，包含「表現載體」，「報告載體」，及「重組載體」。「表現載體」，指調節構造基因及其表現的啟動子(promotor)之外有種種的調節元件在宿主細胞以能作用的狀態被連結的核酸序列而言。「調節元件」而言，例如可舉，包含如終止子(terminator)，藥劑耐性基因等選擇性標記(marker)，及，增強子(enhansor)。生物(例如，動物)的表現載體的型態及所使用的調節元件的種類會因宿主細胞而改變，是本業者所周知的事項。
與本發明有關連的「重組載體」而言，例如可舉，(a)對基因體庫的篩選，有λ FIX載體(噬菌體載體)，(b)對cDNA的篩選，有λ ZAP載體(噬菌體載體(phage vector))， (c)對基因體DNA(genome DNA)的選殖，例如可舉，pBluescript II SK+/-，pGEM，pCR2.1載體(質體載體(plasmid vector))等。又「表現載體」而言，例如可舉，pSV2/neo載體，pcDNA載體，pUC18載體，pUC19載體，pRc/RSV載體，pLenti6/V5-Dest載體，pAd/CMV/V5-DEST載體，pDON-AI-2/neo載體，pMEI-5/neo載體等(質體載體)等。又「報告載體」而言，例如可舉，pGL2載體，pGL3載體，pGL4.10載體，pGL4.11載體，pGL4.12載體，pGL4.70載體，pGL4.71載體，pGL4.72載體，pSLG載體，pSL0載體，pSLR載體，pEGFP載體，pAcGFP載體，pDsRed載體等。這種載體，可參考前述的Molecular Cloning雜誌適宜利用即可。
與本發明有關連的，將核酸分子導入於細胞內的技術而言，例如可舉形質轉換，形質導入，轉染(transfection)等。這種導入技術而言，具體而言例如可舉，Ausubel F.A.等編(1988)，Current Protocols in Molecular Biology.Wiley,New York,NY；Sambrook J.等(1987)，Molecular Cloning：A Laboratory Manual,2nd Ed.及其第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，附錄實驗醫學「基因導入及表現解析實驗法」羊土公司(1997)等所說明的方法等。確認基因在細胞內的導入的技術而言，例如可舉北方印漬(Northern blot)分析，西方印漬(Western blot)分析或其他周知的慣用技術等。
又，與本發明有關連的，載體的導入方法而言，例如 可舉轉染(transfection)，形質導入，形質轉換等(例如，磷酸鈣法，脂質體(liposome)法，DEAE聚葡萄糖(dextran)法，電穿孔(electroporation)法，使用基因槍(particle gun)的方法等)。
本發明光毒性試驗方法是具有下述步驟(1)至(4)的光毒性試驗方法：(1)將人視網膜色素上皮細胞與被驗物質接觸的第一步驟；(2)將在第一步驟與被驗物質接觸的人視網膜色素上皮細胞，在第一步驟中接觸開始後24小時以內，一面以含有自340nm至380nm止的範圍的波長分布的人工光在照射一面進行培養的第二步驟；(3)將在第二步驟所培養的人視網膜色素上皮細胞回收，測定所回收的培養細胞的細胞毒性或與其有相關關係的指標值的第三步驟；及(4)根據第三步驟的測定結果評估被驗物質的光毒性表現能力之有無或其程度，而檢定被驗物質的光毒性表現能力的第四步驟。
在本發明中的「被驗物質」而言，並無特別的限定，所有的化學物質可成為對象，但例如可舉，在醫藥品，農藥，化粧品，工業製品等的用途上使用的物質，今後有使用可能性的開發中的物質等。
在本發明中的「光毒性」而言，例如可舉，由模擬太陽光照射所關與的毒性反應引起的毒性等。具體而言，例 如可舉，在眼或皮膚等產生的一次刺激反應的光刺激性，過敏反應的光感作性(光過敏性)，光致癌性，進一步的光遺傳毒性(photogenotoxici ty)等。
在本發明中的「細胞毒性」而言，例如可舉，細胞死亡及細胞増殖抑制等影響細胞生存的毒性等。細胞毒性或與其有相關關係的指標值，例如可舉，使用血球計的方法，使用血球計數器的方法，使用3H胸苷(thymidine)等放射性同位素的方法(只是將3H胸苷等放射性同位素加入於細胞培養液培育，只測定活細胞的簡便方法)，LDH(乳酸脫氫酶)法，使用中性紅(NR)的方法(利用紅色色素中性紅被活細胞的溶體(lysosome)攝取蓄積的性質的方法，只測定活細胞的簡便方法)，使用結晶紫(C R)的方法(利用結晶紫進入活細胞的細胞膜而染色的性質的方法，只測定活細胞的簡便的方法)，使用四唑鎓鹽(tetrazolium salt)的方法(四唑鎓鹽是細胞內粒線體(mitochondria)的脫氫酶的基質，生存能力越高的細胞被還原的四唑鎓鹽的量越多，其結果產生的甲(formazan)量與生存細胞數有相關，因而是只測定活細胞的簡便的方法)，測定標記基因(例如，RPE65，Mitf，ZO1)的表現量的方法，測定ATP量的方法，測定黑色素(melanin)量的方法，將粒線體(mitochonria)的活性以MTT法測定的方法等通常使用的方法測定即可。被驗物質的重複「接觸」與「清洗‧培養基交換」等而進行被驗物質的重複接觸時，測定各循環中所回收的培養細胞的細胞毒性或與其有相關關係的指標值為理想。
要測定如上述的細胞毒性或與其有相關關係的指標值時，一般也可使用可取得的測定套組而測定。粒線體(mitochonria)的活性，ATP量，乳酸脫氫酶活性等的測定套組而言，例如可舉，CellTiter-Glo(註冊商標)Luminescent Cell Viability Assay，Dual-Glo(註冊商標)Luciferase Assay System，Bright-Glo(註冊商標)Luciferase Assay System，Steady-Glo(註冊商標)Luciferase Assay System，Luciferase Assay Systems，ApoTox-Glo(註冊商標)Triplex Assay，CellTiter-Fluor(註冊商標)Cell Viability Assay，CytoTox 96(註冊商標)Non-Radioactive Cytotoxicity Assay(Promega公司)，ATP Bioluminescence Assay Kit HSII Cell Proliferation Kit I(MTT)，Cell Proliferation Kit II(XTT)(Roche公司)，LDH Cytotoxicity Assay Kit(Cayman Chemical公司)，ADP Assay Kit，EnzyLight(BioAssay Systems公司)等。
在本發明光毒性試驗方法中，做為細胞毒性或與其有相關關係的指標值，而採用將標記基因(例如，RPE65，Mitf，Z01)的表現量加以測定的方法的情況，更詳細加以說明。
首先「標記基因的表現」，包含因應標記基因而表現的多核苷酸，低聚核苷酸或核酸，或，蛋白質，多肽，寡肽或肽等的表現。
測定標記基因的表現量的方法而言，對目的之細胞 等，例如可舉，測定mRNA的轉錄產物量或多肽的轉譯產物(translation product)量的方法等。測定mRNA的表現量(轉錄產物量)的方法而言，例如可舉，北方印漬法，點印漬法，PCR法，即時PCR法，利用報告基因的方法等包含分子生物學測定方法的任意的適切的方法等。又測定多肽的表現量(轉譯產物量)的方法而言，例如可舉，ELI SA法，RIA法，螢光抗體法，西方印漬法，免疫組織染色法等包含免疫學的測定方法的任意的適切的方法等。基因的表現變動，表示含通常的分子生物學的測定方法或免疫學的測定方法的任意的適切的方法所評估的mRNA水平或多肽的蛋白質水平的表現量會増加或減少。又，其他方法而言，也可舉使用陣列(array)(例如可舉，DNA陣列，蛋白質陣列)的基因解析方法等。對DNA陣列而言，例如可舉，秀潤公司編，細胞工學別冊「DNA微陣列與最新PCR法」等，對蛋白質陣列而言，在Nat Genet.2002 Dec；32 Supp 1：526-32等揭示說明。再者，也可舉RT-PCR，RACE法，SSCP法，免疫沉降法，雙雜交系統(two-hybrid system)，體外轉譯等。關於這種方法，例如，在基因體解析實驗法‧中村祐輔實驗手冊，編輯‧中村祐輔羊土公司(2002)等有說明。
利用報告基因的方法而言，可舉製作安定形質轉換體的方法等，係製作攝入以可作用的方式連結於標記基因的啟動子序列的報告基因的載體，將該載體基因導入於人視網膜色素上皮細胞而製作的方法。所製作的安定形質轉換 體，會將報告基因在細胞內表現，所以測定報告基因的活性及表現量，則可將該測定值做為與生存的人視網膜色素上皮細胞的量有相關關係的指標值而利用。
這裏的「報告基因」而言，例如可舉，螢火蟲冷光酶基因(firefly luciferase,firefly luc)，水母冷光酶基因(Renilla luciferase,renilla luc)，β-半乳糖苷酶基因，氯黴素乙醯轉移酶基因，或，在導入核酸構築物的宿主細胞可以用視覺選擇的選擇性標記基因。這種選擇標記基因而言，例如可舉，綠色螢光蛋白(GFP)基因，藍色螢光蛋白(CFP)基因，黄色螢光蛋白(YFP)基因，紅色螢光蛋白(dsRed)基因等在活細胞可觀察的螢光色素標記基因或色素標記基因等。上述選擇性標記基因及選擇性標記蛋白質，對宿主細胞實質上不顯示毒性為理想。又，檢出報告基因的有無表現或其程度的方法而言，選擇性標記蛋白質是酶時，或螢光蛋白時，都可利用公知的檢出方法等。
「啟動子」就是，指決定基因的轉錄的開始部位，又直接調節其頻度的DNA上的領域而言。通常為鍵結RNA聚合酶而開始轉錄的鹼基序列。「啟動子序列」是指具有某基因的啟動子作用的部分而言。啟動子序列，通常在推定蛋白質編碼領域的第1外顯子(exon)或轉錄開始點的上游約5kbp以內的領域為多，所以使用DNA解析用軟體預測基因體鹼基序列中的蛋白編碼領域，則可推定啟動子序列。這種DNA解析用軟體而言，例如可舉，DNASIS軟體(目立軟體)，GENETYX(股份有限公司GENETICS)等。推定啟動子序 列，因構造基因而有不同，通常存在於構造基因的上游，但並不受其限定，也會在構造基因的下游存在。
上述的領域中，有Sp1及AP-2等已知轉錄調節因子的鍵結可能序列的存在，可預料該領域對表現調控有重要的作用。由此可推測至少在該領域含有誘導轉錄所需的充分的鹼基序列(啟動子序列)。正確的位置，可以使用在該技術領域中周知慣用的技術調查即可。
啟動子序列與所預測的DNA序列，由NCBI數據庫取得的方法加以說明。
關於預料含有人ZO-1(TJP1)基因的啟動子序列的轉錄開始點上游的基因體DNA序列，可在網路上的MCSC Genome Browser首頁，以human reference sequence設定為探索對象數據庫，「TJP1」做為關鍵語而探索，則會有關於TJP1基因的Sequence and Links toTools and Databases的連結的顯示。由此連結，進入「GenomicSequence Near Gene」網頁。其次，點選Sequence Retrieval RegionOptions的選項，將「Promoter/Upstream by」設定為5000bases，再點選「5’UTR Exons」後，點選submit按鈕，則可取得含轉錄開始點上游5kb與第一外顯子(exon)的5’UTR的基因體DNA序列。又，在NCBI首頁上以「TJPI」做為關鍵語而探索，則可取得NM_003257.3的登錄號碼，而可取得TJP1的mRNA序列。將這些基因體序列與mRNA序列，使用DNA解析用軟體加以分析，則可取得比轉錄開始點上游的約5kbp的DNA序列。DNA解析用軟體而言，如前述，例如可 舉，DNASIS軟體(日立軟體)，GENETYX(股份有限公司GENETYX)等。
「以可以作用的方式連結於啟動子序列」就是配置於有所希望的基因的表現(作用)的啟動子序列的調控下的意思。啟動子要以可作用的方式連結於基因，則通常將啟動子靠近於該基因的上游配置，但並不一定要鄰接而配置。
在本發明中的「人視網膜色素上皮細胞」，例如，一種源自人的細胞，而位置於視網膜的外層的上皮細胞。該細胞是視細胞的維持上有重要功能的細胞。形狀是單層的立方上皮細胞，相互間以tight junction結合，是具有黒色的色素的細胞。
該人視網膜色素上皮細胞而言，只要可以培養則無特別的限制。理想的實施形態，具體而言，例如可舉，源1幹細胞的視網膜色素上皮細胞(即，例如，胚性幹細胞(即，ES細胞)，人工多功能性幹細胞(即，iPS細胞)，由神經幹細胞等幹細胞分化誘導的容易培養的人視網膜色素上皮細胞等)，由生體組織直接取得的容易培養的人視網膜色素上皮細胞等。又，也可舉培養細胞化的源自癌細胞的人視網膜色素上皮細胞，以人為的操作而不死化的容易培養的人視網膜色素上皮細胞等。
這裏的「幹細胞」是指經細胞分裂也維持相同分化能力的細胞而言，在組織受傷害時能將該組織再生。該「幹細胞」而言，例如可舉，胚性幹細胞或組織幹細胞(也稱為組織性幹細胞，組織特異性幹細胞或體性幹細胞。)或人工 多功能性幹細胞(iPS細胞：inducedpluripotent stem cell)等。
在本發明光毒性試驗方法中使用的理想的幹細胞而言，例如可舉，胚性幹細胞(即，ES細胞)，人工多功能性幹細胞(即，iPS細胞)，神經幹細胞等。
「胚性幹細胞」(即，ES細胞)是指有自行複製能力，多分化能力(即，多功能性「pluripotency」)的幹細胞，為源自初期胚的多功能性幹細胞。胚性幹細胞在1981年首次建立，在1989年以後也被應用於基因剔除鼠(knockout mice)的製作。在1998年有人胚性幹細胞的建立，也為再生醫學所利用。含神經幹細胞等組織幹細胞是與胚性幹細胞不同，是分化方向被限定的細胞，存在於組織中的特定的位置，有未分化的細胞內構造。因此，組織幹細胞是多功能性的水平低。組織幹細胞是核/細胞質比高，細胞內小器言少。組織幹細胞，一般而言，具有多分化能力，細胞周期長，維持個體的一生以上的増殖能力。人工多功能性幹細胞是將纖維母細胞等經分化的細胞由Oct3/4，Sox2，Klf4，Myc等數種類的基因的表現而直接起始化誘導多分化能力的細胞，在2006年，由山中等人以小鼠細胞建立(Takahashi K,Yamanaka S.Cell.2006,126(4),p663-676)。在2007年，也以人纖維母細胞建立，與胚性幹細胞同樣具有多分化能力(Takahashi K,Tanabe K,Ohnuki M,Narita M,Ichisaka T,Tomoda K,Yamanaka S.Cell.2007,131(5),p861-872.,Yu J,Vodyanik MA, Smuga-Otto K,Antosiewicz-Bourget J,Frane JL,Tian S,Nie J,Jonsdottir GA,Ruotti V,Stewart R,Slukvin II,Thomson JA.,Science.2007,318(5858),p1917-1920.,Nakagawa M,Koyanagi M,Tanabe K,Takahashi K,Ichisaka T,Aoi T,Okita K,Mochiduki Y,Takizawa N,Yamanaka S.Nat Biotechnol.,2008,26(1),p101-106)。
在本發明光毒性試驗方法中的第一步驟是將人視網膜色素上皮細胞與被驗物質接觸的步驟。
在上述第一步驟中，將人視網膜色素上皮細胞與被驗物質接觸。將人視網膜色素上皮細胞與被驗物質的接觸時間而言，例如可舉1分鐘以上，理想是5分鐘以上3日以內，更理想是10分鐘以上24小時以內等。該接觸時的保溫溫度而言，例如可舉15℃至42℃左右，理想是35℃至42℃左右，更理想是35℃至37℃左右，特別理想是37℃左右等。又，前述接觸是在培養液中的接觸時，該培養液的pH而言，例如可舉，pH5至pH9左右，理想是pH6.5至pH7.8左右。
在上述第一步驟中的被驗物質接觸時的二氧化碳濃度而言，例如可舉0%至25%左右等。
在上述第一步驟中的被驗物質接觸時的理想的濕度而言，例如可舉95±5%rh左右，更理想是100%rh左右等。
關於與人視網膜色素上皮細胞接觸的被驗物質的濃度及適用量，並無特別的限定，視被驗物質的種類，所預想的被驗物質的光毒性表現能力，可適宜決定在第一步驟的 人視網膜色素上皮細胞與被驗物質的接觸時間，在第二步驟中的培養時間，在第二步驟中的光照射量等。例如可舉，0.001μM至10mM左右，理想是0.01μM至5mM左右等。
在上述第一步驟中的接觸系內中的人視網膜色素上皮細胞的密度而言，例如可舉1×104cell/cm2至4×106cell/cm2左右，理想是4×104cell/cm2至4×105cell/cm2左右等。
在本發明光毒性試驗方法中的第二步驟是將在第一步驟中與被驗物質接觸的人視網膜色素上皮細胞，在第一步驟中的接觸開始後24小時以內，以含340nm至380nm止的範圍的波長分佈的人工光照射下培養的步驟。
在上述第二步驟中，將在第一步驟中與被驗物質接觸的人視網膜色素上皮細胞，在第一步驟中的接觸開始後24小時以內，以含340nm至380nm止的範圍的波長分佈人工光照射下培養。然後，被驗物質有光毒性表現能力時，在本步驟中可使該光毒性表現能力表現出來。此時，使用不含會吸收前述人工光的色素，及有可能吸附被驗物質的血清等的蛋白成分的培養液為理想。
在理想的實施形態中，在第一步驟中的接觸開始後12小時以內，更理想是在6小時以內，特別理想是在10分鐘至2小時左右以內，以含340nm至380nm止的範圍的波長分佈的人工光照射下培養。
在本發明檢定方法中的理想的實施形態中，上述第一步驟(即，與被驗物質的接觸)與上述第二步驟(即，人工光照射下的培養)併行而進行實施也可以。更具體的而言，將 在第一步驟中接觸的被驗物質除去的狀態下實施第二步驟也可以，在被驗物質的存在的狀態下實施第二步驟也可以。
在第一步驟中的接觸開始後起在第二步驟中的人工光的照射開始前為止的期間，在第一步驟與被驗物質接觸的人視網膜色素上皮細胞，例如在15℃至42℃左右，理想是35℃至42℃左右，更理想是35℃至37℃左右，特別理想是37℃左右等培養溫度下，且人工光的非照射下培養即可。又第一步驟中的被驗物質對人視網膜色素上皮細胞的24小時以內的接觸後，將該培養細胞清洗‧交換培養基後提供在第二步驟中的人工光的照射，排除細胞外的被驗物質的影響，只評估在第一步驟中攝入於細胞內的被驗物質的作用也可以。
上述第二步驟中的培養時的二氧化碳濃度而言，例如可舉0%至25%左右等。
上述第二步驟中的培養時的濕度而言，例如可舉95±5%rh左右，理想是100%rh左右等。
照射的人工光是含340nm至380nm止的範圍的波長分佈的人工光。理想地，例如可舉由紫外光，可見光及紅外光所成的模擬太陽光的人工光等。更理想，例如可舉不含未達305nm波長的紫外光及850nm以上的波長的紅外光，並且，含有315nm至800nm止的範圍的波長分佈的光的模擬太陽光等。
前述人工光而言，例如可舉紫外線燈，水銀燈，鹵素燈，LED，氙燈，金屬鹵化物燈，鈉燈等為光源的光等。理 想地，例如可舉氙燈，水銀燈等為光源的紫外光及模擬太陽光等。更理想地，例如可舉氙燈，水銀燈等為光源的模擬太陽光等。視需要而使用只通過特定波長的濾光片或遮斷特定波長的濾光片等，調整為具有所希望的波長分佈的人工光而使用即可。
順帶而言，要照射模擬太陽光的具體的光照射裝置而言，例如可舉，SOL500，SOL1200，SOL2000(Dr.K.Honle Medizintechnik公司)，SUNTEST CPS/CPS+，SUNTEST XLS+(Atlas Material Testing Technology公司)，SXL-2500V2，XI-01B140KB1(SERIC公司)。
關於上述第二步驟，在被驗物質存在的狀態下實施第二步驟時，也可以調節被驗物質的「人工光照射下中的接觸時間」。即經由培養時間及人工光的光照射量的適宜設定，而可實現所希望的「人工光照射下的接觸時間」。人工光的照射可以是連續性的或間歇性的照射。人工光的照射要連續性的實施時，培養時間相當於「人工光照射下的接觸時間」。例如，在連續性的人工光照射下，培養15分鐘，30分鐘，1小時或2小時，可實現15分鐘，30分鐘，1小時或2小時的「人工光照射下的接觸時間」。另一方面，人工光的照射以間歇性的實施時，人工光的照射時間相當於「人工光照射下的接觸時間」。例如，24小時的培養期間中，起初的12時間在人工光的照射下培養，其餘的12小時在遮斷人工光的狀態下培養，而可實現12小時的「人工光照射下的接觸時間」。
人視網膜色素上皮細胞的培養溫度而言，例如可舉，15℃至42℃左右。
關於上述第二步驟，以含340nm至380nm止的範圍的波長分佈的人工光照射時的理想的光照射量而言，例如可舉，在波長360nm的測定值是3J/cm2至30J/cm2止的範圍的光照射量等。要得這種所希望的「光照射量」，則例如適宜設定人工光的光照射強度及人工光的光照射時間等即可。光照射量(J/cm2)，例如由時間(分鐘)×光照射強度(mW/cm2)×60÷1000的公式算出即可。具體的而言例如，以約2.08mW/cm2之光照射強度的人工光照射40分鐘在波長360nm的測定值，可知為約5J/cm2的光照射量。
在理想的實施形態中，人工光的照射，例如可舉與被驗物質接觸的人視網膜色素上皮細胞與對照的人視網膜色素上皮細胞的至少其一方的人視網膜色素上皮細胞，對人工光遮光的條件下的前述細胞的生存細胞數，光照射條件下的前述細胞的生存細胞數顯著減少的光照射量的照射等。這種理想的光照射量的設定，例如可舉遵照後述的實施例6所述方法等實施預備試驗即可，可容易確認為理想的光照射量。
更具體的實施形態中，做為人工光的照射，例如可舉光照射量在波長360nm的測定值成為3J/cm2至30J/cm2止的範圍的模擬太陽光的光照射等。更理想地，例如可舉光照射量在波長360nm的測定值成為3.5J/cm2至20J/cm2止的範圍的模擬太陽光的照射等。特別理想地，例如可舉光 照射量在波長360 nm的測定值成為在5J/cm2至10J/cm2止的範圍的模擬太陽光的照射等。
由以上的光的照射，更確實將被驗物質的光毒性表現能力表現出來。
本發明光毒性試驗方法中的第三步驟是回收第二步驟中培養的人視網膜色素上皮細胞，測定所回收的培養細胞的細胞毒性或與其有相關關係的指標值的步驟。
在上述第三步驟中，測定將在第二步驟所培養的人視網膜色素上皮細胞的回收培養細胞的細胞毒性或與其有相關關係的指標值。
培養細胞的細胞毒性或與其有相關關係的指標值，如前述，例如可舉使用血球計的方法，使用血球計數器的方法，使用3H胸苷(thymidine)等放射性同位素的方法(只是將3H胸苷等放射性同位素加入於細胞培養液而孵育，而只測定活細胞的簡便方法)，LDH(乳酸脫氫酶)法，使用中性紅(NR)的方法(利用紅色色素中性紅被活細胞的溶體(lysosome)攝取蓄積的性質的方法，只測定活細胞的簡便方法)，使用結晶紫(C R)的方法(利用結晶紫進入活細胞的細胞膜而染色的性質的方法，只測定活細胞的簡便的方法)，使用四唑鎓鹽的方法(四唑鎓鹽是在細胞內粒線體(mitochonria)的脫氫酶的基質，生存能越高的細胞被還原的四唑鎓鹽的量越多，其結果產生的甲(formazan)量與生存細胞數有相關，所以只測定活細胞的簡便的方法)，測定標記基因(例如，RPE65，Mitf，ZO1)的表現量的方法， 測定ATP量的方法，測定黑色素(melanin)量的方法，將粒線體(mitochonria)的活性以MTT法測定的方法等通常使用的方法測定即可。被驗物質的重複「接觸」與「清洗‧培養基交換」等而進行被驗物質的重複接觸時，測定各循環中所回收的培養細胞的細胞毒性或與其有相關關係的指標值為理想。
本發明光毒性試驗方法中的第四步驟是藉由第三步驟的測定結果評估被驗物質的光毒性表現能力的有無或其程度，而檢定被驗物質的光毒性表現能力的步驟。
在上述第四步驟中，由第三步驟的測定結果評估被驗物質的光毒性表現能力的有無或其程度，檢定被驗物質的光毒性表現能力。評估被驗物質的光毒性發現能力的有無或其程度時，不設定對照而以第三步驟的測定結果的絶對值而評估也可以，設定對照，由其測定結果的比較而評估也可以。
在理想的實施形態中，將上述第三步驟的測定結果，與對照的人視網膜色素上皮細胞回收的培養細胞的細胞毒性或與其有相關關係的指標值測定結果相比較，根據其差異而評估被驗物質的光毒性表現能力的有無或程度。這裏的「對照」是可設定陰性對照及陽性對照的雙方。陰性對照的例而言，可舉不照射人工光而培養的人視網膜色素上皮細胞群，光照射量弱的人工光照射下培養的人視網膜色素上皮細胞群，與預先知道無光毒性表現能力的物質(例如，只有溶媒)接觸的人視網膜色素上皮細胞群，等。使用 這種陰性對照時，可以有以下的檢定。即，將在被驗物質中所回收的培養細胞的細胞毒性或與其有相關關係的指標值的測定結果，與在陰性對照中所回收的培養細胞的細胞毒性或與其有相關關係的指標值的測定結果加以比較。然後，在被驗物質中所回收的培養細胞的細胞毒性或與其有相關關係的指標值較低時，也可評估、檢定為該被驗物質有光毒性表現能力。
更理想的實施形態中，前述對照是包含在人視網膜色素上皮細胞與已知的光毒性表現物質接觸的陽性對照。陽性對照的例而言，可舉與預先已知有光毒性表現能力的基準物質接觸，在人工光的照射下培養人視網膜色素上皮細胞群。使用這種陽性對照時，可以有如下的檢定。即，將被驗物質中所回收的培養細胞的細胞毒性或與其有相關關係的指標值的測定結果，與陽性對照中所回收的培養細胞的細胞毒性或與其有相關關係的指標值的測定結果相比較。然後，在被驗物質中所回收的培養細胞的細胞毒性或與其有相關關係的指標值較低時，也可將該被驗物質評估、檢定為比陽性對照所使用的基準物質有較高的光毒性表現能力。再者，由以該基準物質的各濃度或各適用量同樣評估、檢定，可將該被驗物質的光毒性表現能力做定量性的評估、檢定。這時，併用陽性對照與上述的陰性對照而設定也可以。又，以陽性對照所回收的培養細胞的細胞毒性或與其有相關關係的指標值比陰性對照低，也可顯示人工光的照射有正確被實行，試驗可成立。
在更理想的實施形態中，以氯丙嗪Chlorpromazine(CPZ)為基準物質而用於陽性對照。
用於本發明光毒性試驗方法之目的，而將氯丙嗪Chlorpromazine(CPZ)做為陽性對照而使用，也是本發明之一。再者，用於本發明光毒性試驗方法之目的，而將氯丙嗪ChlorpromazineCCPZ)做為陽性對照而使用，也是本發明之一。
本發明的陽性對照試藥的一種態樣是用於本發明光毒性試驗方法之目的之陽性對照試藥，而含有氯丙嗪Chlorpromazine(CPZ)。試藥的形狀而言，可直接使用氯丙嗪Chlorpromazine(CPZ)，溶解於溶媒而成為溶液狀也可以。再者，含在適宜的基劑中或分散形狀也可以。
更理想的實施形態中，將盤尼西林G(Penicillin G)，奎寧(Quinine)，硫氯酚(Biothionol)或氯己定(Chlorhexidine)做為基準物質而用於陰性對照。
用於本發明光毒性試驗方法之目的，而將盤尼西林G(Penicillin G)，奎寧(Quinine)，硫氯酚(Bi thionol)或氯己定(Chlorhexidine)做為陰性對照的使用，也是本發明之一。再者，用於本發明光毒性試驗方法之目的，而將盤尼西林G(Penicillin G)，奎寧(Quinine)，硫氯酚(Bi thionol)或氯己定(Chlorhexidine)做為陰性對照的使用，也是本發明之一。
本發明的陰性對照試藥的一種態樣是用於本發明光毒性試驗方法之目的之陰性對照試藥，而含有盤尼西林G (Penicillin G)，奎寧(Quinine)，硫氯酚(Bithionol)或氯己定(Chlorhexidine)。試藥的形狀而言，直接使用盤尼西林G(Penicillin G)，奎寧(Quinine)，硫氯酚(Bithionol)或氯己定(Chlorhexidine)也可以，溶解於溶媒成為溶液狀也可以。再者，含在適宜的基劑或分散的形狀也可以。
再者，更具體的理想的關於比較及評估的實施形態，也可以舉下述的方法。例如，求出將與被驗物質接觸的人視網膜色素上皮細胞的細胞毒性IC50值(用於非光照射的(遮光)對照)，與被驗物質接觸開始後24小時以內在人工光的照射下培養的人視網膜色素上皮細胞細胞毒性IC50值相除而得的值(PIF值：Photo Irritation Factor值)，該值(PIP值)比2大，比5小時評估為擬陽性，5以上時則將被驗物質評估為光毒性陽性。
本發明光毒性表現物質探索方法是以本發明光毒性試驗方法，檢定被驗物質的光毒性表現能力，而選拔所希望的有光毒性表現能力的物質。在本發明光毒性表現物質探索方法中，也可採取與上述本發明光毒性試驗方法同樣的實施形態。例如，使用上述的陰性對照時，將被驗物質中所回收的培養細胞的細胞毒性或與其有相關關係的指標值的測定結果，與陰性對照中所回收的培養細胞的細胞毒性或與其有相關關係的指標值的測定結果相比較。然後，選拔所回收的培養細胞的細胞毒性或與其有相關關係的指標值，比陰性對照在統計學上顯著低的被驗物質，或，選拔 所回收的培養細胞的細胞毒性或與其有相關關係的指標值在陰性對照的50%以下的值的被驗物質即可。
另一方面，使用氯丙嗪Chlorpromazine(CPZ)等的陽性對照時，將被驗物質中所回收的培養細胞的細胞毒性或與其有相關關係的指標值的測定結果，與陽性對照中所回收的培養細胞的細胞毒性或與其有相關關係的指標值的測定結果相比較。然後，選拔所回收的培養細胞的細胞毒性或與其有相關關係的指標值比陽性對照在統計學上顯著低的被驗物質，或，選拔所回收的培養細胞的細胞毒性或與其有相關關係的指標值與陽性對照同值時的被驗物質的濃度比陽性對照的濃度較低的被驗物質，而可選拔比用於陽性對照的基準物質有較高的光毒性表現能力的物質。又，使用陽性對照時，也可由所回收的培養細胞的細胞毒性或與其有相關關係的指標值做定量性的評估、檢定。具體而言，在氯丙嗪Chlorpromazine(CPZ)等的基準物質的各濃度或各適用量下，對被驗物質做同樣的評估、檢定，而可定量性地將被驗物質的光毒性表現能力加以評估、檢定。然後，選拔具有所希望的光毒性表現能力的物質。
本發明的模擬太陽光皮膚刺激非誘發物質探索方法是以本發明光毒性試驗方法，檢定被驗物質的光毒性表現能力，而用於選拔所希望的不具有光毒性表現能力的物質的方法。在本發明模擬太陽光皮膚刺激非誘發物質探索方法中，可採取與上述的本發明光毒性試驗方法同樣的實施形態。成為探索的對象的被驗物質是，所希望的不具有光毒 性表現能力的物質則甚麼化合物都可以，例如可舉低分子化合物，蛋白質，肽等。
使用根據本發明光毒性試驗方法的系統步驟的裝置，則可更有效率地進行被驗物質的光毒性表現能力的檢定，也可將所希望的光毒性表現物質或模擬太陽光皮膚刺激非誘發物質更簡便加以探索。又，由本發明光毒性試驗方法所得的關於模擬太陽光皮膚刺激性的毒性情報記錄在電子情報記錄媒體，則可製作包含毒性情報的有用的電子情報記錄媒體。
實施例
以下，將本發明以實施例更詳細說明。
實施例1(將人ES細胞分化誘導為人視網膜色素上皮細胞)
人胚性幹細胞(即，ES細胞)是，使用京都大學建立株的KhES-1株。
將前述KhES-1株，在添加bFGF(鹼性纖維母細胞増殖因子：basic fibroblast growth factor)的人ES細胞維持培養用培養基(含DMEM/F12，KSR(Knockout Serum replacement)，非必需胺酸，L-麩醯胺酸，2-巰乙醇等)中，絲裂黴素C(mitomycinC)處理過的小鼠胚性纖維母細胞(mouse embryonicfibroblast：MEF)飼養細胞(feeder cell)上做未分化維持培養。培養後，以含胰蛋白酶/膠原蛋白酶IV的解離液由培養皿回收，得人胚性幹細胞(即，ES細胞)的聚落。
將所得的聚落，用微吸管吸取，搗碎成每1細胞塊數 十細胞左右的大小後，在預先以0.1%明膠液塗覆的10cm培養皿中，含有1μM至10μM SB431542，1μM至10μM CKI-7，1μM至10μM Y27632的人ES細胞維持培養用培養基10ml中，播種數百至數千個細胞塊左右的人胚性幹細胞(即，ES細胞)的聚落，繼而，將其在37℃，5% CO2培養箱內培養。
翌日(培養1日)，避免吸到浮遊的細胞塊，除去半量(5 ml)的培養基後，將含1μM至10μM Y27632的SDIA培養基(GMEM，KSR，含非必需胺酸，丙酮酸鈉，2-巰乙醇等)5ml添加於前述培養皿，與上述同樣繼續培養。
培養5日後，避免吸取未附著的細胞塊，除去5ml的培養基後，將含1μM至10μM Y27632的SDIA培養基5ml添加於前述培養皿，再與上述同樣繼續培養。
培養8日後，將培養基全量除去後，將PA6調整培養基(PA6 conditioned medium，匯聚狀態(confluent)的PA6細胞以SDIA培養基培養1日後的培養上澄液)10ml添加於前述培養皿。以後每隔3日至4日，以PA6調整培養基做培養基交換。由該操作，分化誘導出有黒色色素的人視網膜色素上皮細胞(參照第1圖及第2圖)。
實施例2(人視網膜色素上皮細胞的培養)
將有在實施例1分化誘導的有黒色色素的人視網膜色素上皮細胞存在的聚落以微吸管吸取，繼而以0.05%胰蛋白酶處理，使細胞分散。
在預先塗覆MatrigelTM的60mm培養皿中，將在含N2 添加物的DMEM/F12培養液中添加2至20ng/ml的bFGF的培養基加入，在該培養基播種所得的分散細胞。如此播種的分散細胞，也含有人視網膜色素上皮細胞以外的不特定的細胞。
將細胞在37℃，5% CO2培養箱內培養而達到匯聚狀態後，以0.25%胰蛋白酶處理，由培養皿回收細胞。將所回收的細胞，在以預先塗覆MatrigelTM的10cm培養皿播種後，在37℃，5% CO2培養箱內培養至細胞成為匯聚狀態。細胞成為匯聚時，存在於培養血的細胞大多數是人視網膜色素上皮細胞。
再者，將細胞以不含bFGF的含有N2添加物的DMEM/F12培養液培養1週以上後，在下面的實驗中使用。
實施例3(非光照射用的對照的遮光條件下的本發明光毒性試驗方法的第一步驟，第二步驟及第三步驟)
將在實施例2調製的人視網膜色素上皮細胞，以0.25%胰蛋白酶處理，由培養皿回收細胞。將所回收的細胞，在預先塗覆MatrigelTM的96孔培養皿每孔播種10萬或12萬個細胞後，在37℃，5% CO2培養箱內培養。
培養2小時至4小時後，由96孔培養皿以吸引器除去培養基，繼而將Earle’s Balanced Salt Solution(EBSS)在前述96孔培養皿中每孔添加150μl的分量，而清洗細胞。
其次，在前述培養皿，將預先以EBSS調製的下述濃度的被驗物質的溶液或溶媒對照液每孔添加100μl的分量。
<被驗物質的溶液>
(a)氯丙嗪Chlorpromazine(CPZ))：濃度0.1，1，3，10，30，100(μg/ml)
(b)盤尼西林G(Penicillin G)：濃度1，3，10，30，100，300，1000(μg/ml)
(c)奎寧(Quinine)：濃度0.1，0.3，1，3，10，30，100(μg/ml)
(d)硫氯酚(Bithionol)：濃度0.01，0.03，0.1，0.3，1，3，10(μg/ml)
(e)氯己定(Chlorhexidine)：濃度0.1，0.3，1，3，10，30，100(μg/ml)
將96孔培養皿以鋁箔包裹遮光後，在以鋁箔遮光下的培養皿，用光照射裝置(模擬太陽光照射裝置SXL-2500V2；SERIC公司)光照射40分鐘(光照射量約5J/cm2)。在光照射後即時，將前述96孔培養皿以DMEM/F12培養液150μl清洗2次後，在該96孔培養皿，將含有N2添加物的DMEM/F12培養液每孔添加100μl的分量，培養一夜。
培養後，由96孔培養皿除去培養基，繼而，將預先調製的DMEM/F12培養液及Cell titer Glo反應液的等量混合液在該96孔培養皿每孔添加100μl的分量。
將所得的96孔培養皿在以鋁箔遮光的狀態下振盪中在室溫放置30分鐘後，將前述96孔培養皿所含的培養物95μl，移入於白色96孔試驗皿。繼而，將該96孔試驗皿所含的培養物的發光量(該發光量是與細胞生存率有相關 關係。)以EnVision多層次測定器(Perkin Elmer公司)測定。由所測定的值算出被驗物質對人視網膜色素上皮細胞的50%抑制濃度(IC50)，該算出值當做表示細胞毒性(與其有相關關係的指標值)的值。
依從上述的算出方法，而有了以下的結果。
<被驗物質的細胞毒性>
(a)氯丙嗪Chlorpromazine(CPZ))：IC50=37.6(μg/ml)(參照第3圖)
(b)盤尼西林G(PenicillinG)：IC50>1000(μg/ml)(在1000μg/ml以下沒有觀察到細胞毒性)(參照第4圖)
(c)奎寧(Quinine)：IC50=147.1(μg/ml)(參照第5圖)
(d)硫氯酚(Bithionol)：IC50>10(μg/ml)(在10μg/ml以下沒有觀察到細胞毒性)(參照第6圖)
(e)氯己定(Chlerhexidine)：IC50=42.7(μg/ml)(參照第7圖)
實施例4(本發明光毒性試驗方法的第一步驟，第二步驟，及第三步驟)
將在實施例2調製的人視網膜色素上皮細胞，以0.25%胰蛋白酶處理，由培養皿回收細胞。將所回收的細胞，在預先以MatrigelTM塗覆的96孔培養皿每孔播種10萬或12萬個細胞後，在37℃，5% CO2培養箱內培養。
培養2小時至4小時後，由前述96孔培養皿以吸引器 除去培養基，繼而將Earle’s Balanced Salt Solution(EBSS)在前述96孔培養皿每孔添加150μl的分量，清洗細胞。
繼而，在前述培養皿，預先以EBSS調製成下述的濃度被驗物質的溶液或溶媒對照液每孔添加100μl的分量。
<被驗物質的溶液>
(a)氯丙嗪(Chlorpromazine(CPZ))：濃度0.1，1，3，10，30，100(30μg/ml)
(b)盤尼西林G(Penicillin G)：濃度1，3，10，30，100，300，1000(μg/ml)
(c)奎寧(Quinine)：濃度0.1，0.3，1，3，10，30，100(μg/ml)
(d)硫氯酚(Bithionol)：濃度0.01，0.03，0.1，0.3，1，3，10(μg/ml)
(e)氯己定(Chlorhexidine)：濃度0.1，0.3，1，10，30，100(μg/ml)
與實施例3不同，96孔培養皿沒有以鋁箔包裹，用光照射裝置(模擬太陽光照射裝置SXL-2500V2；SERIC公司)做光照射40分鐘(以360nm的光照射強度為基準計算，則為光照射量約5J/cm2)。光照射後即時，將前述96孔培養皿以DMEM/F12培養液150μl清洗2次後，在該96孔培養皿，將含有N2添加物的DMEM/F12培養液每孔添加100μl的分量，培養一夜。
培養後，由96孔培養皿除去培養基，繼而將預先調製 的DMEM/F12培養液及Cell titer Glo反應液的等量混合液在該96孔培養皿每孔添加100μl的分量。
所得的96孔培養皿以鋁箔遮光的狀態下在振盪中在室溫放置30分鐘後，將在前述96孔培養皿所含的培養物的95μl，移到白色96孔試驗皿。繼而，將該96孔試驗皿所含的培養物的發光量(該發光量是與細胞生存率的有相關關係)，用EnVision多層次測定器(Perkin Elmer公司)測定。由所測定的值算出被驗物質對人視網膜色素上皮細胞的50%抑制濃度(IC50)，將該算出值當做表示細胞毒性(與其有相關關係的指標值)的值。
依照上述算出方法，成為如下的結果。
<被驗物質的細胞毒性>
(a)Chlorpromazine(丙嗪Chlorpromazine(CPZ))：IC50=5.8(μg/ml)(參照第8圖)
(b)盤尼西林G(Penicillin G)：IC50>1000(μg/ml)(在1000μg/ml以下沒有觀察到細胞毒性)(參照第9圖)
(c)奎寧(Quinine)：IC50=88.9(μg/ml)(參照第10圖)
(d)硫氯酚(Bithionol)：IC50>10(μg/ml)(在10μg/ml以下沒有觀察到細胞毒性)(參照第11圖)
(e)氯己定(Chlorhexidine)：IC50=43.7(μg/ml)(參照第12圖)
實施例5(本發明光毒性試驗方法：第四步驟)
根據在實施例3及實施例4中所算出的50%抑制濃度(IC50)，求前述的PIF值(Photo Irritation Facor值)(即，將與被驗物質接觸的人視網膜色素上皮細胞的細胞毒性IC50值(非光照射的(遮光)對照)，以與被驗物質的接觸開始後24小時以內在模擬太陽光的照射下培養的人視網膜色素上皮細胞的細胞毒性IC50值除而得的值)。將其結果示於下面。該值(PIF值)比5大時，評估被驗物質為光毒性陽性。
<被驗物質的PIF值(Photo Irritation Facor值)>
(a)氯丙嗪Chlorpromazine(CPZ))：6.5
在本發明光毒性試驗方法的評估，判定是光細胞毒性陽性。這是與過去的體內試驗結果一致。
(b)盤尼西林G(Penicillin G：沒有看到光細胞毒性。
在本發明光毒性試驗方法的評估，判定是光細胞毒性陰性。這是與過去的體內試驗結果一致。
(c)奎寧(Quinine)：1.7
在本發明光毒性試驗方法的評估，判定為光細胞毒性陰性。這是與Ljunggren B.等，Phototoxic properties of quinine and quinidine：two quinoline methanol isomer.；Photodermatology 5 133-138(1988)所述的的體內試驗(鼠尾試驗)結果一致。
(d)硫氯酚(Bithionol)：沒有看到光細胞毒性。
在本發明光毒性試驗方法的評估，判定光細胞毒性陰性。這是與本來正確的陰性結果一致。在光毒性試驗驗證 研究實行委員會(委員長吉村功)，光毒性試驗代替法驗證研究報告書(2004年8月27日)的4設施中的酵母-紅血球試驗是偽陽性結果，確認本發明光毒性執驗方法為優異的方法。
(e)氯己定(Chlorhexidine)：0.98
在本發明光毒性試驗方法的評估，判定光細胞毒性陰性。這是與本來正確的陰性結果一致。光毒性試驗驗證研究實行委員會(委員長吉村功)，光毒性試驗代替法驗證研究報告書(2004年8月27日)的4設施中的酵母-紅血球試驗是偽陽性結果，確認本發明光毒性試驗方法為優異的方法。
比較例1(使用人視網膜色素上皮細胞以外的人細胞的比較實驗)
「Balb/c 3T3細胞」是結締組織細胞(Connective Tissue Cell)，是纖維母細胞(Fibroblast)。
將以含10%牛血清，L-麩醯胺酸的DMEM培養基培養的「Balb/c 3T3細胞」以0.25%胰蛋白酶處理，由培養皿回收細胞。將所回收的細胞，在預先0.1%明膠溶液塗覆的96孔培養皿每孔播種1萬個細胞後，以含10%牛血清，L麩醯胺酸DMEM培養基，在37℃，5% CO2培養箱內培養一夜。
培養後，由96孔培養皿以吸引器除去培養基，繼而，將Earle’s Balanced Salt Solution(EBSS)在前述96孔培養皿每孔添加150μl的分量，清洗細胞。
其次，在前述培養皿，將預先以EBSS調製成為下述濃 度的被驗物質的溶液或溶媒對照液每孔添加100μl的分量。
<被驗物質的溶液>
(a)氯丙嗪Chlorpromazine((CPZ)))：濃度0.1，1，3，10，30，100(μg/ml)
(b)盤尼西林G(Penicillin G)：濃度1，3，10，30，100，300，1000(μg/ml)
(c)奎寧(Quinine)：濃度0.1，0.3，1，3，10，30，100(μg/ml)
(d)硫氯酚(Bithionol)：濃度0.01，0.03，0.1，0.3，1，3，10(μg/ml)
(e)氯己定(Chlorhexidine)：濃度0.1，0.3，1，3，10，30，100(μg/ml)
將96孔培養皿以鋁箔包裹遮光後，在以鋁箔遮光的狀態的培養皿，用光照射裝置(模擬太陽光照射裝置SXL-2500V2；SERIC公司)光照射40分鐘(在360nm的照射強度為基準計算則為光照射量約5J/cm2)。光照射後即時，將前述96孔培養皿以DMEM/F12培養液150μl清洗2次後，在該96孔培養皿，將含有N2添加物的DMEM/F12培養液每孔添加100μl的分量，培養一夜。
培養後，由96孔培養皿除去培養基，繼而，將預先調製的DMEM/F12培養液及Cell titer Glo反應液的等量混合液在該96孔培養皿每孔添加100μl的分量。
所得的96孔培養皿以鋁箔遮光的狀態下振盪中在室 溫放置30分鐘後，將在前述96孔培養皿所含的培養物95μl，移入於白色96孔試驗血。
繼而，將該96孔試驗皿所含的培養物的發光量(該發光量是與細胞生存率有相關關係。)，用EnVision多層次測定器(Perkin Elmer公司)測定。由所測定的值算出被驗物質對人視網膜色素上皮細胞的50%抑制濃度(IC50)，將該算出值當做表示細胞毒性(與其有相關關係的指標值)的值。
由上述的算出方法，成為以下的結果。
<被驗物質的細胞毒性>
(a)氯丙嗪Chlorpromazine(CPZ))：IC50=19.4(μg/ml)(參照第13圖)
(b)盤尼西林G(Penici 11 in G)：IC50>1000(μg/ml)(在1000μg/ml以下沒有觀察到細胞毒性)(參照第14圖)
(c)奎寧(Quinine)：IC50=292.2(μg/ml)(參照第15圖)
(d)硫氯酚(Bithionol)：IC50=11.4(μg/ml)(在3μg/ml以下沒有觀察到細胞毒性)(參照第16圖)
(e)氯己定(Chlorhexidine)：IC50=13.7(μg/ml)(參照第17圖)
比較例2(比較光毒性試驗方法：第一步驟，第二步驟，第三步驟)
將以含10%牛血清，L-麩醯胺酸的DMEM培養基培養的 「Balb/c 3T3細胞」以0.25%胰蛋白酶處理，由培養皿回收細胞。將所回收的細胞，在預先以0.1%明膠溶液塗覆的96孔培養皿每孔播種1萬個細胞後，以含10%牛血清，L-麩醯胺酸的DMEM培養基，在37℃，5% CO2培養箱內培養一夜。
培養後，由96孔培養血用吸引器除去培養基，繼而，將Earle’s Balanced SaltSolution(EBSS)在前述96孔培養皿每孔添加150μl的分量，清洗細胞。
繼而，在前述培養皿，將預先以EBSS調製成為下述濃度的被驗物質的溶液或溶媒對照液每孔添加100μl的分量。
<被驗物質的溶液>
(a)氯丙嗪(Chlorpromazine(CPZ))：濃度0.1，1，3，10，30，100(μg/ml)
(b)盤尼西林G(Penicillin G)：濃度1，3，10，30，100，300，1000(μg/ml)
(c)奎寧(Quinine)：濃度0.1，0.3，1，3，10，30，100(μg/ml)
(d)硫氯酚(Bithionol)：濃度0.01，0.03，0.1，0.3，1，3，10(μg/ml)
(e)氯己定(Chlorhexidine)：濃度0.1，0.3，1，3，10，30，100(μg/ml)
與比較例1不同，將96孔培養皿不用鋁箔包裹，用光照射裝置(模擬太陽光照射裝置SXL-2500V2；SERIC公司) 光照射40分鐘(在360nm的照射強度為基準計算則為光照射量約5J/cm2)。光照射後即時，將前述96孔培養皿以DMEM/F12培養液150μl清洗2次後，在該96孔培養皿，將含有N2添加物的DMEM/F12培養液每孔添加100μl的分量，培養一夜。
培養後，由96孔培養皿除去培養基，繼而，將預先調製的DMEM/F12培養液及Cell titer Glo反應液的等量混合液在該96孔培養皿每孔添加100μl的分量。
所得的96孔培養皿以鋁箔遮光的狀態下振盪中在室溫放置30分鐘後，將在前述96孔培養皿所含的培養物95μl，移入於白色96孔試驗血。繼而，將該96孔試驗皿所含的培養物的發光量(該發光量是與細胞生存率有相關關係。)，用EnVision多層次測定器(Perkin Elmer公司)測定。由所測定的值算出被驗物質對人視網膜色素上皮細胞的50%抑制濃度(IC50)，將該算出值當做表示細胞毒性(與其有相關關係的指標值)的值。
由上述的算出方法，成為以下的結果。
<被驗物質的細胞毒性>
(a)氯丙嗪(Chlorpromazine(CPZ))：IC50=0.82(μg/ml)(參照第18圖)
(b)盤尼西林G CPenicillin G)：IC50>1000(μg/ml)(在1000μg/ml以下，沒有觀察到細胞毒性)(參照第19圖)
(c)奎寧(Quinine)：IC50=2.3(μg/ml)(μg/ml)(參 照第20圖)
(d)硫氯酚(Bithionol)：IC50=0.93(μg/ml)(在10μg/ml以下，沒有觀察到細胞毒性)(參照第21圖)
(e)氯己定(Chlorhexidine)：IC50=10.1(μg/ml)(參照第22圖)
比較例3(比較光毒性試驗方法：第四步驟)
根據在比較例1及比較例2算出的50%抑制濃度(IC50)，求前述的PIF值(Photo Irritation Facor值)(即，與被驗物質接觸的人視網膜色素上皮細胞的細胞毒性IC50值(非光照射的(遮光)對照)，以與被驗物質接觸開始後24時間以內在模擬太陽光的照射下培養的人視網膜色素上皮細胞的細胞毒性IC50值相除，所得的值)。將其結果示於下面。該值(PIF值)比5大時，評估被驗物質為光毒性陽性。
<被驗物質的PIF值(Photo Irritation Facor值)>
(a)氯丙嗪(Chlorpromazine(CPZ))：23.7
在比較光毒性試驗的評估，判定是光細胞毒性陽性。這是與過去的體內試驗結果一致。
(b)盤尼西林G(Penicillin G)：沒有看到光細胞毒性。
在比較光毒性試驗的評估，判定是光細胞毒性陽性。這是與過去的體內試驗結果一致。
(c)奎寧(Quinine)：128.8
在比較光毒性試驗的評估，判定是光細胞毒性陽性。這是與Ljunggren B.等，Phototoxic properties of quinine and quinidine：two quinoline methanol isomer.；Photodermatology 5,133-138(1988)所述的體內試驗(老鼠尾試驗)結果不一致。因此，本發明光毒性試驗方法成為偽陽性結果。
(d)硫氯酚(Bithionol)：12.4
在比較光毒性試驗的評估，判定是光細胞毒性陽性。這是與本來正確的陰性結果不一致。因此，比較光毒性試驗方法成為偽陽性結果。光毒性試驗驗證研究實行委員會(委員長吉村功)，光毒性試驗代替法驗證研究報告書(2004年8月27日)的4設施中的酵母-紅血球試驗是偽陽性結果。
(e)氯己定(Chlorhexidine)：1.4
在比較光毒性試驗的評估，判定是光細胞毒性陰性。這是與本來正確的陰性結果一致。光毒性試驗驗證研究實行委員會(委員長吉村功)，光毒性試驗代替法驗證研究報告書(2004年8月27日)的4設施中的酵母-紅血球試驗是偽陽性結果。
實施例6(設定光照射量的預備試驗)
使用在OECD準則中做為陽性對照而使用的氯丙嗪(Chlorpromazine(CPZ))，將由光照射量與前述的PIF值(即，與被驗物質接觸的視網膜色素上皮細胞的細胞毒性IC50值(非光照射的(遮光)對照)，與被驗物質接觸開始後24時間以內在模擬太陽光的照射下培養的人視網膜色素上皮細胞的細胞毒性IC50值相除而得的值)的關係加以檢 討。將光照射設定為2.09mW/cm2(在TOPCON公司製UVR300配置受光部UD360，計測的光設定為15分鐘(1.87J/cm2)，20分鐘(2.50J/cm2)，25分鐘(3.13J/cm2)，30分鐘(3.75J/cm2)，40分鐘(5.00J/cm2)，60分鐘(7.51J/cm2)的各種條件，而依照實施例3及實施例4所述的方法實施光毒性試驗方法。又，有關非光照射的對照的遮光條件，則遮光以外是與上述光照射中的光毒性試驗方法同樣的方法實施光毒性試驗方法。
其結果，由所測定的值算出被驗物質對人視網膜色素上皮細胞的50%抑制濃度IC50)，再根據該算出值求PIF值，得到在15分鐘時PIF=1.70，20分鐘時PIF=1.72，25分鐘時PIF=3.35，30分鐘時PIF=4.57，40分鐘時PIF=6.53，60分鐘時PIF=10.94(參照第23圖)。
由以上，3.75J/cm2(30分鐘)以下的光照射量就不會成為PIF>5，陽性對照的氯丙嗪(Chlorpromazine(CPZ))不能被判定為陽性，所以由該預備試驗可確認設定比3.75J/cm2高的光照射量為理想。
繼而，關連於上述預備試驗，模擬太陽光的照射，在與氯丙嗪(Chlorpromazine(CPZ))接觸的人視網膜色素上皮細胞，對模擬太陽光遮光的條件下中的前述細胞的生存細胞數比較，確認其照射量是光照射條件下的前述細胞的生存細胞數有顯著減少的光照射量。
調查在15分鐘(1.87J/cm2)，20分鐘(2.50J/cm2)，25分鐘(3.13J/cm2)，30分鐘(3.75J/cm2)，40分鐘(5.00J/c m2)，60分鐘(7.51J/cm2)後的人視網膜色素上皮細胞的生存細胞數。抽出光照射時聞是40分鐘的遮光條件下沒有看到前述細胞的生存細胞數的減少的氯丙嗪(Chlorpromazine(CPZ))的接觸濃度10μg/ml的結果(參照第3圖)而比較，可確認對模擬太陽光遮光的條件下的前述細胞的生存細胞數，在光照射條件下的前述細胞的生存細胞數有顯著減少的光照射量是3.13J/cm2(25分鐘)以上(參照第24圖)。
因此，如為3.13J/cm2(25分鐘)以上的光照射量，則模擬太陽光的照射被適當正確地實施，確認使用該光照射量，則可實施理想的本發明光毒性試驗方法。
實施例7(利用形質轉換體的本發明光毒性試驗方法)
將在人視網膜色素上皮細胞表現的基因(Mitf，RPE65，ZO1等)的啟動子表現調控下以含報告基因的載體形質轉換的人胚性幹細胞(即，ES細胞)的製作方法加以具體的說明。
(1)基因的啟動子選殖及報告質體的製作
將ZO-1的啟動子領域以下面所示的方法選殖。
將含由人胚性幹細胞(即，ES細胞)抽出的基因體DNA20ng或RPE65基因的人基因體BAC DNA做為模板，使用RPE65基因的轉譯開始點及設計在轉錄開始點上游5kb的位置的引子(primer)，使用Platinum Taqpolymerase(Invitrogen公司)的PCR法，放大所希望的DNA片段。PCR反應是使用GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystem 公司)，在95℃下反應5分鐘後，將95℃ 30秒鐘，55℃ 30秒鐘，72℃ 5分鐘的循環做30次，以72℃ 7分鐘的反應條件實施。
將所得的PCR產物，以PCR精製套組(PCR purification kit；QIAGEN公司)精製，將PCR產物的末端限制酶消化後，以洋菜凝膠電泳精製。
將所精製的所希望的D.NA片段，與以鹼性磷酸酶(Alkaline phosphatase,Takara Bio公司)做脫磷酸化處理的pGL4.17[Luc2/Neo]載體(Promega公司)，使用Ligation kit(Takara Bio公司)連結。將所得的DNA片段，形質轉換成大腸菌DH5 α受容細胞(DH5 α competent cell,Takara Bio公司)後，將其在37℃以LB/安比西林(ampicillin)培養基培養一夜。培養後，由將出現的聚落以LB/安比西林液體培養基培養所得的大腸菌抽出質體DNA。對於所抽出的質體DNA，決定其所插入片段的序列，確認變異等的有無。
用於對人胚性幹細胞(即，ES細胞)的轉染(transfection)之目的，將各質體以Qiafilter質體抽出套組(Qiagen公司)再度抽出。將所得的質體DNA20μg以限制酶處理直線化後，精製，得線狀化DNA。
(2)重組人胚性幹細胞(即，ES細胞)的製作方法
將未分化維持培養的人胚性幹細胞(即，ES細胞)經解離液處理，由培養皿回收人胚性幹細胞(即，ES細胞)聚落。將所回收的聚落人胚性幹細胞(即，ES細胞)懸浮於未分化 維持培養基，將其移到0.1%明膠塗覆的10cm培養皿後，在37℃，5% CO2培養箱靜置2小時，使飼養細胞附著。含懸浮的人胚性幹細胞(即，ES細胞)聚落的上澄液移到15ml管中，將其以離心機使聚落沉降。將如此回收的聚落以胰蛋白酶液酶處理後，用微吸管吸取，將人胚性幹細胞(即，ES細胞)單一細胞化。
繼而，將所得的細胞離心沉降。以預先將Opti-MEM培養基與2μg的直線型DNA，8μl的FuGENE HD(Promega公司)混合的溶液將前述細胞懸浮，將該細胞懸浮液在室溫反應5分鐘後，以含1μM至10μM Y27632的未分化維持培養基懸浮。
將所得的細胞懸浮液在新黴素耐性飼養細胞上播種，在37℃，5% CO2培養箱中培養一夜。在培養基添加100μg/ml的G418(Invitrogen公司)，做藥劑選擇培養。添加G418的10日至I5日後，在顯微鏡下將在培養皿中形成的人胚性幹細胞(即，ES細胞)聚落單離，將其播種於96孔盤。繼續藥劑選擇培養後，再在10至15日後將増殖的細胞繼代培養而播種於48孔盤。繼續藥劑選擇培養後，取得藥劑耐性的安定形質轉換細胞株。
(3)對利用重組人胚性幹細胞(即，ES細胞)的人視網膜色素上皮細胞，非光照射的對照的遮光條件下的被驗物質的暴露及毒性值的算出
將重組人胚性幹細胞(即，ES細胞)，遵照在實施例1所述的方法分化誘導成為人視網膜色素上皮細胞。
繼而，遵照在實施例2所述的方法將人視網膜色素上皮細胞培養後，將其遵照在實施例3所述的方法暴露於被驗物質。
暴露翌日，由96孔培養皿除去培養基後，將預先調製的DMEM/F12培養液及Steady Glo反應液的等量混合液每孔添加100μl。
在以鋁箔遮光的狀態振盪中室溫放置30分鐘後，將95μl移到白色96孔培養皿，以EnVision多層次測定器(Perkin Elmer公司)測定發光量。由溶媒對照，及被驗物質的各供試濃度中的發光量的測定值算出該被驗物質對人視網膜色素上皮細胞的50%抑制濃度(IC50)，將其做為毒性值。
(4)利用重組人胚性幹細胞(即，ES細胞)的對人視網膜色素上皮細胞的，光照射條件中的被驗物質的暴露及毒性值的算出
將重組人胚性幹細胞(即，ES細胞)，遵照在實施例1所述的方法，分化誘導成為人視網膜色素上皮細胞。
繼而，遵照在實施例2所述的的方法將人視網膜色素上皮細胞培養後，將其遵照在實施例4所述的方法暴露於被驗物質。
暴露翌日，由96孔培養皿除去培養基後，將預先調製的DMEM/F1 2培養液及Steady Glo反應液的等量混合液每孔添加100μl。
以鋁箔遮光的狀態在振盪中室溫放置30分鐘後，將 95μl移到白色96孔培養皿，以EnVision多層次測定器(Perkin Elmer公司)測定發光量。由溶媒對照及被驗物質的各供試濃度中的發光量的測定值算出該被驗物質對人視網膜色素上皮細胞的50%抑制濃度(IC50)，將其做為毒性值。
(5)使用利用重組人胚性幹細胞(即，ES細胞)的人視網膜色素上皮細胞被驗物質的光毒性表現能力的評估
根據在上述(4)算出的50%抑制濃度(IC50)，求前述的PIF值(Photo Irritation Facor值)(即，與被驗物質接觸的人視網膜色素上皮細胞的細胞毒性IC50值(用於非光照射的(遮光)對照)，以與被驗物質接觸開始後24時間以內在模擬太陽光的照射下培養的人視網膜色素上皮細胞的細胞毒性IC50值相除而得的值)。其結果，該值(PIF值)比6大時，評估該被驗物質為光毒性陽性。
(產業上的利用可能性)
依照本發明光毒性試驗方法，則可有效率地實施被驗物質的光毒性表現能力的檢定。再者，本發明可提供在該試驗方法中可做為陽性對照使用的光毒性表現物質。
第1圖是表示由人胚性幹細胞(即，ES細胞)分化誘導所得的人視網膜色素上皮細胞的明視野像圖。
第2圖是表示由人胚性幹細胞(即，ES細胞)分化誘導所得的人視網膜色素上皮細胞經免疫染色的結果(紅是ZO-1，藍是核)圖。
第3圖是表示關於依使用光細胞毒性為陽性的化合物「氯丙嗪(Chlorpromazine,(CPZ))」為被驗物質的本發明光毒性試驗方法，在實施例3中，做為非光照射的(遮光)對照而測定的細胞毒性或與其有相關關係的指標值的結果圖。
第4圖是表示關於依將光細胞毒性為陰性化合物「盤尼西林G(Penicillin G)」做為被驗物質而使用的本發明光毒性試驗方法，在實施例3中，做為非光照射的(遮光)對照而測定的細胞毒性或與其有相關關係的指標值的結果圖。
第5圖是表示關於依將光細胞毒性為陰性的化合物「奎寧(Quinine)」做為被驗物質而使用本發明光毒性試驗方法，在實施例3中，做為非光照射(遮光)的對照而測定的細胞毒性或與其有相關關係的指標值的結果圖。
第6圖是表示關於依使用光細胞毒性為陰性的化合物「硫氯酚(Bithionol)」做為被驗物質的本發明光毒性試驗方法，在實施例3中，做為非光照射的(遮光)的對照而測定的細胞毒性或與其有相關關係的指標值的結果圖。
第7圖是表示關於依光細胞毒性為陰性的化合物「氯己定(Chlorhexidine)」做為被驗物質的本發明光毒性試驗方法，在實施例3中，做為非光照射的(遮光)對照而測定的細胞毒性或與其有相關關係的指標值的結果圖。
第8圖是表示關於依使用光細胞毒性為陽性的化合物「氯丙嗪Chlorpromazine,(CPZ)」」被驗物質的本發明光 毒性試驗方法，在實施例4中，在光照射條件下所測定的細胞毒性或與其有相關關係的指標值的結果圖。
第9圖是表示關於依使用光細胞毒性為陰性的化合物「盤尼西林G(Penicillin G)」做為被驗物質的本發明光毒性試驗方法，在實施例4中，在光照射條件下測定的細胞毒性或與其有相關關係的指標值的結果圖。
第10圖是表示關於依使用光細胞毒性為陰性的化合物「奎寧(Quinine)」做為被驗物質的本發明光毒性試驗方法，在實施例4中，在光照射條件下測定的細胞毒性或與其有相關關係指標值的結果圖。
第11圖是表示關於依使用光細胞毒性為陰性的化合物「硫氯酚(Bithionol)」做為被驗物質的本發明光毒性試驗方法，在實施例4中，在光照射條件下測定的細胞毒性或與其有相關關係的指標值的結果。
第12圖是表示關於依使用光細胞毒性為陰性的化合物「氯己定(Chlorhexidine)」做為被驗物質的本發明光毒性試驗方法，在實施例4中，在光照射條件下測定的細胞毒性或與其有相關關係的指標值的結果圖。
第13圖是表示關於依使用光細胞毒性為陽性的化合物「氯丙嗪(Chlorpromazine,(CPZ))」做為被驗物質的比較光毒性試驗方法，在比較例1中，做為非光照射的(遮光)對照而測定的細胞毒性或與其有相關關係的指標值的結果圖。
第14圖是表示關於依使用光細胞毒性為陰性的化合 物「盤尼西林G(Penicillin G)」做為被驗物質的比較光毒性試驗方法，在比較例1中，做為非光照射的(遮光)對照而測定的細胞毒性或與其有相關關係的指標值的結果圖。
第15圖是表示關於依使用光細胞毒性為陰性的化合物「奎寧(Quinine)」做為被驗物質而比較光毒性試驗方法，在比較例1中，做為非光照射的(遮光)對照而測定的細胞毒性或與其有相關關係指標值的結果圖。
第16圖是表示關於依使用光細胞毒性為陰性的化合物「硫氯酚(Bithionol)」做為被驗物質的本發明光毒性試驗方法，在比較例1中，做為非光照射的(遮光)的對照而測定的細胞毒性或與其有相關關係的指標值的結果圖。
第17圖是表示做為被驗物質，關於使用光細胞毒性為陰性的化合物「氯己定(Chlorhexidine)」的本發明光毒性試驗方法(比較例1：做為非光照射的(遮光))的對照而測定的細胞毒性或與其有相關關係的指標值的結果圖。
第18圖是表示關於依使用光細胞毒性為陽性的化合物「氯丙嗪(Chlorpromazine,(CPZ))」做為被驗物質的比較光毒性試驗方法，在比較例2中，在光照射下測定的細胞毒性或與其有相關關係的指標值的結果圖。
第19圖是表示關於依使用光細胞毒性為陰性的化合物「盤尼西林G(Penicillin G)」做為被驗物質的比較光毒性試驗方法，在比較例2中，在光照射條件下測定的細胞毒性或與其有相關關係的指標值的結果圖。
第20圖是表示關於依使用光細胞毒性為陰性的化合物「奎寧(Quinine)」做為被驗物質的比較光毒性試驗方法，在比較例2中，在光照射條件下測定的細胞毒性或與其有相關關係的指標值的結果圖。
第21圖是表示關於依使用光細胞毒性為陰性的化合物「硫氯酚(BithionoI)」做為被驗物質的比較光毒性試驗方法，在比較例2中，在光照射條件下測定的細胞毒性或與其有相關關係的指標值的結果圖。
第22圖是表示關於依使用光細胞毒性為陰性的化合物「氯己定(Chlorhexidine)」做為被驗物質的比較光毒性試驗方法，在比較例2中，在光照射條件下測定的細胞毒性或與其有相關關係的指標值的結果圖。
第23圖是為了光照射量的設定而做的預備試驗(實施例6)的結果圖。是在檢討使用在OECD準則中做為陽性對照而使用的氯丙嗪(Chlorpromazine,(CPZ))，將光照射量與前述的PIF值(即，與被驗物質接觸的人視網膜色素上皮細胞的細胞毒性IC50值(做為非光照射的(遮光)對照)，以與被驗物質接觸後在模擬太陽光的照射下培養的人視網膜色素上皮細胞的細胞毒性IC50值相除而得的值)的關係圖。
第24圖是為了光照射量的設定而做的預備試驗(實施例6)的結果圖。與檢討光照射量與前述的PIF值的關係的預備試驗關連，模擬太陽光的照射是在與氯丙嗪(Chlorpromazine,(CPZ))10μg/ml接觸的人視網膜色素上 皮細胞，對在將模擬太陽光遮光的條件下的前述細胞的生存細胞數，確認該模擬太陽光照射條件下的前述細胞的生存細胞數顯著減少的光照射量的照射。縱軸是表示將模擬太陽光遮光的條件下的生存細胞數做為1時，生存細胞數的相對比較值。在各分別光照射量下，左側的長條圖表示將模擬太陽光遮光的條件下的生存細胞數的相對比較值，右側的長條圖表示光照射條件下的生存細胞數的相對比較值。
由於本案的圖為試驗結果數據，並非本案的代表圖。
故本案無指定代表圖。

Claims (16)

  1. 一種光毒性試驗方法，其具有下述步驟(1)至(4)：(1)將人視網膜色素上皮細胞與被驗物質接觸的第一步驟；(2)將在第一步驟中與被驗物質接觸的人視網膜色素上皮細胞，在第一步驟中的接觸開始後24小時以內，一面以含340nm至380nm的範圍的波長分佈的人工光照射一面進行培養的第二步驟；(3)回收在第二步驟培養的人視網膜色素上皮細胞，測定所回收的培養細胞的細胞毒性或與其有相關關係的指標值的第三步驟；及(4)根據第三步驟的測定結果評估被驗物質的光毒性表現能力的有無或其程度，而檢定被驗物質的光毒性表現能力的第四步驟。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的光毒性試驗方法，其中，前述人工光是由紫外光、可見光及紅外光所構成的模擬太陽光。
  3. 如申請專利範圍第1項或第2項所述的光毒性試驗方法，其中，第二步驟中的人工光的照射是光照射量在波長360nm的測定值會在3J/cm2至30J/cm2的範圍的照射。
  4. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項所述的光毒性試驗方法，其中，前述第四步驟中，將前述第三步驟的測定結果，與對照的人視網膜色素上皮細胞所回收的培 養細胞的細胞毒性或與其有相關關係的指標值測定結果比較，根據其差異評估被驗物質的光毒性表現能力的有無或其程度。
  5. 如申請專利範圍第4項所述的光毒性試驗方法，其中，前述對照是含將人視網膜色素上皮細胞與已知的光毒性表現物質接觸的陽性對照。
  6. 如申請專利範圍第5項所述的光毒性試驗方法，其中，前述光毒性表現物質是氯丙嗪。
  7. 如申請專利範圍第1項至第6項中任一項所述的光毒性試驗方法，其中，第二步驟中的人工光的照射是具有下述照射量的照射：與被驗物質接觸後的人視網膜色素上皮細胞與對照的人視網膜色素上皮細胞的至少一方的人視網膜色素上皮細胞中，相對於在將人工光遮光的條件下的前述細胞的生存細胞數，在光照射條件下的前述細胞的生存細胞數會顯著減少的光照射量。
  8. 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項所述的光毒性試驗方法，其中，前述第二步驟中的人工光的照射是1次連續的照射或2次以上的重複照射構成的間歇的照射。
  9. 如申請專利範圍第1項至第8項中任一項所述的光毒性試驗方法，其中，前述人視網膜色素上皮細胞是源自幹細胞的視網膜色素上皮細胞。
  10. 如申請專利範圍第9項所述的光毒性試驗方法，其中，前述幹細胞是胚性幹細胞、人工多功能性幹細胞或神經 幹細胞。
  11. 一種氯丙嗪的用途，係在申請專利範圍第1項至第10項中任一項所述的光毒性試驗方法中，將氯丙嗪做為陽性對照。
  12. 一種含有氯丙嗪的陽性對照試藥，係用於申請專利範圍第1項至第10項中任一項所述的光毒性試驗方法。
  13. 一種盤尼西林G、奎寧、硫氯酚或氯己定的用途，係在申請專利範圍第1項至第10項中任一項所述的光毒性試驗方法中做為陰性對照。
  14. 一種含有盤尼西林G、奎寧、硫氯酚或氯己定的陰性對照試藥，其係用於申請專利範圍第1項至第10項中任一項所述的光毒性試驗方法的陰性對照試藥。
  15. 一種光毒性表現物質的探索方法，係使用申請專利範圍第1項至第10項中任一項所述的光毒性試驗方法，檢定被驗物質的光毒性表現能力，而選拔所希望的具有光毒性表現能力的物質。
  16. 一種模擬太陽光皮膚刺激非誘發物質的探索方法，係使用申請專利範圍第1項至第10項中任一項所述的光毒性試驗方法，檢定被驗物質的光毒性表現能力，而選拔所希望的不具有光毒性表現能力的物質。
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