WO2012169658A1 - 光毒性試験法 - Google Patents

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WO2012169658A1
WO2012169658A1 PCT/JP2012/065064 JP2012065064W WO2012169658A1 WO 2012169658 A1 WO2012169658 A1 WO 2012169658A1 JP 2012065064 W JP2012065064 W JP 2012065064W WO 2012169658 A1 WO2012169658 A1 WO 2012169658A1
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phototoxicity
cells
test method
test
substance
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覚 安藤
斉藤　幸一
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住友化学株式会社
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    • C12N5/0602—Vertebrate cells
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types

Definitions

  • the present invention relates to a phototoxicity test method using human retinal pigment epithelial cells.
  • phototoxicity tests In order to evaluate the safety of chemical substances such as pharmaceuticals, agricultural chemicals, cosmetics, and industrial products to humans, many toxicity tests using individual animals are usually performed. Among these toxicity tests, acute toxicity tests such as irritation caused by chemical substances entering the body in response to light are generally referred to as phototoxicity tests. As the most widely used phototoxicity test method, for example, the Morikawa method by local administration to animal skin is known. The phototoxicity test method uses a guinea pig or a white rabbit, applies a chemical substance to be tested to the back skin of the animal, and then evaluates the biological reaction in the back skin in response to ultraviolet irradiation to the application site.
  • 3T3 NRU PT An uptake test method (3T3 NRU PT) can be mentioned.
  • the 3T3 NRU PT was recognized as an alternative to the phototoxicity test method scientifically established in 1998 by ECVAM (European Center for the Validation of Alternative Methods). Has been adopted as a test method for screening for the presence or absence of phototoxicity.
  • the test method is also known as the only test method submitted to the OECD and established as a guideline in 2004 as an in vitro phototoxicity test (for example, OECD guidelines for the testing of chemicals: test guideline 432). “In Vitro 3T3 NRU phototoxicity test”, Paris: Ohio, OECD Publication Office; see 2004).
  • the present invention provides a phototoxicity test method using human retinal pigment epithelial cells. More specifically, the present invention relates to 1.
  • Phototoxicity test method having the following steps (1) to (4) (hereinafter sometimes referred to as the phototoxicity test method of the present invention): (1) a first step of bringing a test substance into contact with human retinal pigment epithelial cells; (2) Human retinal pigment epithelial cells contacted with a test substance in the first step are cultured within 24 hours after the start of contact in the first step while irradiating artificial light including a wavelength distribution ranging from 340 nm to 380 nm.
  • phototoxicity test method for a light irradiation amount to become irradiation ranges from 3J / cm 2 to 30 J / cm 2 as measured value is above 1 or 2, wherein the wavelength 360 nm; 4).
  • the measurement result of the third step is compared with the measurement result of the index value having the correlation with or related to the cytotoxicity of the collected cultured cells in the control human retinal pigment epithelial cells, and the difference
  • the phototoxicity test method according to any one of the preceding items 1 to 3, wherein the presence or absence of the phototoxicity of the test substance based on the test substance is evaluated; 5. 5.
  • CPZ chlorpromazine
  • Artificial light irradiation in the second step is performed under conditions in which artificial light is shielded in at least one of the human retinal pigment epithelial cells contacted with the test substance and the control human retinal pigment epithelial cells.
  • the phototoxicity test method according to any one of 1 to 7 above, wherein the artificial light irradiation in the second step is intermittent irradiation consisting of one continuous irradiation or two or more repeated irradiations; 9.
  • the phototoxicity test method according to any one of 1 to 8 above, wherein the human retinal pigment epithelial cells are stem cell-derived retinal pigment epithelial cells; 10.
  • the phototoxicity test method according to item 9 above, wherein the stem cell is an embryonic stem cell, an induced pluripotent stem cell or a neural stem cell; 11.
  • chlorpromazine (CPZ) as a positive control for the phototoxicity test method according to any one of 1 to 10 above
  • 12 A positive control reagent for use in the phototoxicity test method according to any one of 1 to 10 above, which contains chlorpromazine (CPZ);
  • 14 A negative control reagent for use in the phototoxicity test method according to any one of 1 to 10 above, which contains penicillin G, quinine, bithionol, or chlorhexidine Control reagent; 15.
  • the phototoxicity test method according to any one of 1 to 10 above, wherein the test substance is tested for its phototoxicity development ability, and a substance having the desired phototoxicity development ability is selected (hereinafter referred to as this phototoxicity expression substance). And may also be referred to as the invention phototoxicity-expressing substance search method); and 16.
  • a simulated solar skin irritation non-inducing substance that tests the phototoxicity of a test substance according to the phototoxicity test method described in any one of 1 to 10 above and selects a substance that does not have the desired phototoxicity development ability.
  • Search method hereinafter, also referred to as the present invention simulated solar skin irritation non-inducing substance search method
  • Etc. are provided.
  • the phototoxicity test method of the present invention it is possible to effectively test the test substance's ability to develop phototoxicity. Furthermore, the present invention can provide a phototoxic substance that can be used as a positive control in the test method. According to the phototoxicity-expressing substance searching method of the present invention, it is possible to easily search for a desired phototoxicity-expressing substance or a pseudo-sun skin irritation non-inducing substance.
  • FIG. 1 is a diagram showing a bright-field image of human retinal pigment epithelial cells obtained by inducing differentiation from human embryonic stem cells (ie, ES cells).
  • FIG. 2 shows the results of immunostaining human retinal pigment epithelial cells obtained by inducing differentiation from human embryonic stem cells (ie, ES cells) (red is ZO-1, blue is nucleus).
  • FIG. 3 shows the measurement according to the phototoxicity test method of the present invention using a compound “chlorpromazine (CPZ)” having a positive photocytotoxicity as a test substance in Example 3 as a (non-light) control for non-light irradiation. It is a figure which shows the result regarding the index value which was made cytotoxic or has a correlation with it.
  • CPZ chlorpromazine
  • FIG. 4 shows the phototoxicity test method of the present invention using the compound “Penicillin G”, which is negative for photocytotoxicity, as a test substance in Example 3, as a (light-shielding) control for non-light irradiation. It is a figure which shows the result regarding the measured cytotoxicity or the index value which has a correlation with it.
  • FIG. 5 shows the phototoxicity test method of the present invention using the compound “Quineine”, which is negative for photocytotoxicity, as a test substance in Example 3, and was measured as a (non-light) control for non-light irradiation. It is a figure which shows the result regarding the index value which has the cytotoxicity or it has a correlation with it.
  • FIG. 5 shows the phototoxicity test method of the present invention using the compound “Quineine”, which is negative for photocytotoxicity, as a test substance in Example 3, and was measured as a (non-light) control for non-light irradiation. It is a figure which shows the result regarding the index value which has
  • FIG. 6 shows the measurement according to the phototoxicity test method of the present invention using the compound “Bithionol”, which is negative for photocytotoxicity, as a test substance in Example 3 as a (non-light) control for non-light irradiation. It is a figure which shows the result regarding the index value which has the cytotoxicity or it has a correlation with it.
  • FIG. 7 shows the phototoxicity test method of the present invention using the compound “Chlorhexidine”, which is negative for photocytotoxicity, as a test substance in Example 3, measured as a (non-light) control for non-light irradiation. It is a figure which shows the result regarding the index value which has the cytotoxicity or it has a correlation with it.
  • FIG. 7 shows the phototoxicity test method of the present invention using the compound “Chlorhexidine”, which is negative for photocytotoxicity, as a test substance in Example 3, measured as a (non-light) control for non-light irradiation. It is a figure which shows the result regarding
  • FIG. 8 shows the results of cytotoxicity measured under light irradiation conditions in Example 4 according to the phototoxicity test method of the present invention using a compound “chlorpromazine (CPZ)” positive in photocytotoxicity as a test substance. It is a figure which shows the result regarding the index value which has correlation.
  • FIG. 9 shows the results of the cytotoxicity measured under light irradiation conditions in Example 4 according to the phototoxicity test method of the present invention using the compound “Penicillin G” having negative photocytotoxicity as a test substance. It is a figure which shows the result regarding the index value which has a correlation with it.
  • FIG. 10 shows the cytotoxicity measured in Example 4 under the light irradiation condition or the correlation with the phototoxicity test method of the present invention using the compound “Quinine” having a negative photocytotoxicity as a test substance. It is a figure which shows the result regarding the index value which has a relationship.
  • FIG. 11 shows the results of cytotoxicity measured under light irradiation conditions in Example 4 according to the phototoxicity test method of the present invention using a compound “Bithionol” having negative photocytotoxicity as a test substance. It is a figure which shows the result regarding the index value which has correlation.
  • FIG. 11 shows the results of cytotoxicity measured under light irradiation conditions in Example 4 according to the phototoxicity test method of the present invention using a compound “Bithionol” having negative photocytotoxicity as a test substance. It is a figure which shows the result regarding the index value which has correlation.
  • FIG. 12 shows the cytotoxicity measured in Example 4 under the light irradiation condition or the correlation with the phototoxicity test method of the present invention using the compound “chlorhexidine” having negative photocytotoxicity as a test substance. It is a figure which shows the result regarding the index value which has a relationship.
  • FIG. 13 is a comparative phototoxicity test method using a compound “chlorpromazine (CPZ)), which is positive for photocytotoxicity, as a test substance, and measured in Comparative Example 1 as a (non-light) control for non-light irradiation. It is a figure which shows the result regarding the index value which has the cytotoxicity or it has a correlation with it.
  • CPZ chlorpromazine
  • FIG. 14 shows a comparative phototoxicity test method using a compound “Penicillin G”, which is negative in photocytotoxicity, as a test substance, and measured in Comparative Example 1 as a (non-light) control for non-light irradiation. It is a figure which shows the result regarding the index value which was made cytotoxic or has a correlation with it.
  • FIG. 15 is a comparative phototoxicity test method using the compound “Quinine”, which is negative in photocytotoxicity, as a test substance, and measured in Comparative Example 1 as a (non-light) control for non-light irradiation. It is a figure which shows the result regarding the index value which has cytotoxicity or it has a correlation.
  • FIG. 15 is a comparative phototoxicity test method using the compound “Quinine”, which is negative in photocytotoxicity, as a test substance, and measured in Comparative Example 1 as a (non-light) control for non-light irradiation. It is a figure which shows the result regarding the index value
  • FIG. 16 shows the measurement according to the phototoxicity test method of the present invention using the compound “Bithionol” having a negative photocytotoxicity as a test substance in Comparative Example 1 as a (non-light irradiation) control). It is a figure which shows the result regarding the index value which was made cytotoxic or has a correlation with it.
  • FIG. 17 shows the measurement by the phototoxicity test method of the present invention (Comparative Example 1: (Light-shielding) control for non-light irradiation) using a compound “chlorhexidine” having negative photocytotoxicity as a test substance. It is a figure which shows the result regarding the index value which has the cytotoxicity or it has a correlation with it.
  • FIG. 17 shows the measurement by the phototoxicity test method of the present invention (Comparative Example 1: (Light-shielding) control for non-light irradiation) using a compound “chlorhexidine” having negative photocytotoxicity as a test substance. It is a
  • FIG. 18 shows the cytotoxicity measured under light irradiation or its correlation in Comparative Example 2 by a comparative phototoxicity test method using a compound “chlorpromazine (CPZ)” having positive photocytotoxicity as a test substance. It is a figure which shows the result regarding the index value which has.
  • FIG. 19 shows cytotoxicity measured under light irradiation conditions in Comparative Example 2 by the comparative phototoxicity test method using a compound “Penicillin G” having negative photocytotoxicity as a test substance. It is a figure which shows the result regarding the index value which has correlation.
  • FIG. 19 shows cytotoxicity measured under light irradiation conditions in Comparative Example 2 by the comparative phototoxicity test method using a compound “Penicillin G” having negative photocytotoxicity as a test substance. It is a figure which shows the result regarding the index value which has correlation.
  • FIG. 20 is a graph showing cytotoxicity measured under light irradiation conditions in Comparative Example 2 or a correlation thereof, according to a comparative phototoxicity test method using a compound “Quinine” having a negative photocytotoxicity as a test substance. It is a figure which shows the result regarding the index value which has.
  • FIG. 21 is a graph showing cytotoxicity measured under light irradiation conditions in Comparative Example 2 or its correlation by Comparative Phototoxicity Test Method using a compound “Bithionol” having negative photocytotoxicity as a test substance. It is a figure which shows the result regarding the index value which has.
  • FIG. 21 is a graph showing cytotoxicity measured under light irradiation conditions in Comparative Example 2 or its correlation by Comparative Phototoxicity Test Method using a compound “Bithionol” having negative photocytotoxicity as a test substance. It is a figure which shows the result regarding the index value which has.
  • FIG. 22 shows cytotoxicity measured in Comparative Example 2 under light irradiation conditions or its correlation by a comparative phototoxicity test method using a compound “chlorhexidine” having negative photocytotoxicity as a test substance. It is a figure which shows the result regarding the index value which has.
  • FIG. 23 is a diagram showing the results of a preliminary test (Example 6) for setting the light irradiation amount.
  • FIG. 24 is a diagram showing the results of a preliminary test (Example 6) for setting the light irradiation amount.
  • simulated sunlight was irradiated in human retinal pigment epithelial cells contacted with 10 ⁇ g / ml of chlorpromazine (CPZ). It was confirmed that the number of living cells of the cells under the light-shielded condition was irradiated with a light irradiation amount that significantly reduced the number of viable cells of the cells under the simulated sunlight irradiation condition. is there.
  • shaft shows the relative comparison value of the number of living cells when the number of living cells on the conditions which shielded simulated sunlight is set to 1.
  • the left bar graph shows the relative comparison value of the number of viable cells under the condition where the artificial sunlight is shielded
  • the right bar graph shows the relative comparison value of the number of viable cells under the light irradiation condition.
  • the “transformant” in the present invention means all or part of a living organism such as a cell produced by transformation.
  • the transformant include prokaryotic cells, yeast, animal cells, plant cells, insect cells and the like.
  • a transformant may be referred to as a transformed cell, a transformed tissue, a transformed host, or the like depending on the subject.
  • the cell used in the present invention may be a transformant.
  • prokaryotic cells used in the genetic manipulation technique related to the present invention include, for example, prokaryotic cells belonging to the genus Escherichia, Serratia, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Pseudomonas, and the like. Specifically, Escherichia XL1-Blue, Escherichia XL2-Blue, Escherichia DH1, etc. can be mentioned. Such cells are, for example, 'Molecular Cloning (3 rd edition) 'by Sambrook, J and Russell, D.C. W. Appendix 3 (Volume 3), Vectors and Bacterial strains. A3.2 (Cold Spring Harbor USA 2001).
  • a “vector” in connection with the present invention means a vector capable of transferring a target polynucleotide sequence to a target cell.
  • vectors include autonomous replication in host cells such as prokaryotic cells, yeast, animal cells, plant cells, insect cells, animal individuals or plant individuals, or integration into chromosomes. Examples thereof include those containing a promoter at a position suitable for polynucleotide transcription.
  • a vector suitable for cloning may be referred to as a “cloning vector”.
  • Such cloning vectors usually contain multiple cloning sites containing multiple restriction enzyme sites.
  • vectors that can be used for gene cloning in the technical field, and they are sold by vendors with different names (for example, types and sequences of restriction enzymes at multiple cloning sites). ing. For example, 'Molecular Cloning (3 rd edition) 'by Sambrook, J and Russell, D. et al. W. Appendix 3 (Volume 3), Vectors and Bacterial strains. A3.2 (Cold Spring Harbor USA, 2001)) is representatively described together with the distributor, and those skilled in the art can appropriately use these according to the purpose.
  • the “vector” related to the present invention also includes “expression vector”, “reporter vector”, “recombinant vector”.
  • expression vector is meant a nucleic acid sequence in which various regulatory elements are operably linked in a host cell in addition to a structural gene and a promoter that regulates its expression.
  • regulatory element include those containing a terminator, a selection marker such as a drug resistance gene, and an enhancer. It is well known to those skilled in the art that the type of expression vector of an organism (eg, animal) and the type of regulatory element used can vary depending on the host cell.
  • “recombinant vectors” include, for example, (a) a lambda FIX vector (phage vector) for screening genomic libraries, and (b) a lambda ZAP for screening cDNA.
  • genomic DNA for example, pBluescript II SK +/ ⁇ , pGEM, pCR2.1 vector (plasmid vector) and the like
  • expression vector examples include pSV2 / neo vector, pcDNA vector, pUC18 vector, pUC19 vector, pRc / RSV vector, pLenti6 / V5-Dest vector, pAd / CMV / V5-DEST vector, pDON-AI-2.
  • Neo vector pMEI-5 / neo vector (plasmid vector) and the like.
  • reporter vector examples include pGL2 vector, pGL3 vector, pGL4.10 vector, pGL4.11 vector, pGL4.12 vector, pGL4.70 vector, pGL4.71 vector, pGL4.72 vector, pSLO vector, pSLO vector.
  • a vector, a pSLR vector, a pEGFP vector, a pAcGFP vector, a pDsRed vector, etc. can be mentioned.
  • Such a vector may be appropriately used with reference to the aforementioned Molecular Cloning magazine.
  • techniques for introducing nucleic acid molecules into cells include transformation, transduction, transfection, and the like. As such an introduction technique, for example, Ausubel F.
  • vector introduction methods include, for example, transfection, transduction, transformation and the like (for example, calcium phosphate method, liposome method, DEAE dextran method, electroporation method, particle gun (gene gun ) And the like.
  • the phototoxicity test method of the present invention is a phototoxicity test method having the following steps (1) to (4): (1) a first step of bringing a test substance into contact with human retinal pigment epithelial cells; (2) Human retinal pigment epithelial cells contacted with a test substance in the first step are cultured within 24 hours after the start of contact in the first step while irradiating artificial light including a wavelength distribution ranging from 340 nm to 380 nm.
  • test substance in the present invention is not particularly limited and covers all chemical substances. For example, substances used for pharmaceuticals, agricultural chemicals, cosmetics, industrial products, etc. There are some developing substances.
  • Phototoxicity in the present invention includes, for example, toxicity caused by a toxic reaction involving simulated sunlight irradiation.
  • photoirritability as a primary stimulation reaction occurring in eyes, skin, etc.
  • photosensitization photoallergenicity
  • photocarcinogenicity an allergic reaction
  • photogenotoxicity etc.
  • cytotoxicity examples include toxicity that affects cell survival such as cell death and cell growth inhibition.
  • Cytotoxicity or an index value correlated therewith is, for example, a method using a hemocytometer, a method using a cell counter, 3 Method using a radioisotope such as H thymidine ( 3 A simple method of measuring only living cells by adding a radioisotope such as H thymidine to the cell culture and incubating), LDH (lactate dehydrogenase) method, method using neutral red (NR) (red dye) A method that uses the property that neutral red is taken up and accumulated in the lysosomes of living cells and is a simple method that measures only living cells), a method that uses crystal violet (CR) (crystal violet enters the cell membrane of living cells and stains it) A simple method of measuring only living cells), a method using tetrazolium salt (tetrazolium salt is a substrate for intracellular mitochondrial dehydrogenase, and the more viable cells are reduced tetrazolium) Because the amount of salt is high and the resulting amount of formazan corresponds
  • kits for measuring mitochondrial activity, ATP amount, lactate dehydrogenase activity and the like include CellTiter-Glo (registered trademark) Luminescent Cell Viability Assay, Dual-Glo (registered trademark) Luciferase Assay System, Bright registered trademark (Gloregistered trademark).
  • Luciferase Assay System Steady-Glo (TM) Luciferase Assay System, Luciferase Assay Systems, ApoTox-Glo (TM) Triplex Assay, CellTiter-Fluor (TM) Cell Viability Assay, CytoTox 96 (R) Non-Radioactive C Toxicity Assay (Promega), ATP Bioluminescence Assay Kit HS II Cell Proliferation Kit I (MTT), Cell Proliferation Kit II (XTT) (Roche), LDH Cytotoxicity Assay (Systems)).
  • expression of a marker gene includes expression of a polynucleotide, an oligonucleotide or a nucleic acid, a protein, a polypeptide, an oligopeptide or a peptide, etc. expressed according to the marker gene.
  • the method for measuring the expression level of the marker gene include a method for measuring the amount of mRNA transcription product and the amount of polypeptide translation product in the target cell and the like.
  • Examples of methods for measuring the expression level (transcription product amount) of mRNA include any molecular biological measurement method such as Northern blot method, dot blot method, PCR method, real-time PCR method, reporter gene method, etc. Can be mentioned as appropriate methods.
  • any appropriate method including immunological measurement methods such as ELISA method, RIA method, fluorescent antibody method, Western blot method, immunohistochemical staining method, etc. The method etc. can be mentioned.
  • Gene expression fluctuations indicate that the expression level at the mRNA level or the protein level of a polypeptide is increased or decreased as assessed by any suitable method, including conventional molecular biological or immunological methods. means.
  • a gene analysis method using an array for example, a DNA array or a protein array
  • DNA arrays for example, Shujunsha, edited by Cell Engineering, “DNA microarray and latest PCR method”, etc.
  • protein arrays see Nat Genet. 2002 Dec; 32 Suppl: 526-32 and the like.
  • RT-PCR, RACE method, SSCP method, immunoprecipitation method, two-hybrid system, in vitro translation, etc. can be mentioned.
  • Such a method is described in, for example, Genome Analysis Experimental Method / Yusuke Nakamura Lab Manual, Editing / Yusuke Nakamura Yodosha (2002).
  • a stable transformant can be obtained by preparing a vector incorporating a reporter gene operably linked to a promoter sequence of a marker gene and introducing the gene into human retinal pigment epithelial cells. Examples thereof include a method of manufacturing. Since the produced stable transformant expresses the reporter gene in the cell, if the activity or expression level of the reporter gene is measured, the measured value is correlated with the amount of surviving human retinal pigment epithelial cells. It can be used as an index value.
  • examples of the “reporter gene” include a host into which a firefly luciferase gene (firefly luc), a Renilla luciferase gene (renilla luc), a ⁇ -galactosidase gene, a chloramphenicol acetyltransferase gene, or a nucleic acid construct is introduced.
  • a firefly luciferase gene firefly luc
  • Renilla luciferase gene Renilla luciferase gene
  • a ⁇ -galactosidase gene a chloramphenicol acetyltransferase gene
  • a nucleic acid construct a nucleic acid construct
  • selectable marker genes that allow visual selection in cells. Examples of such selectable marker genes include observation in living cells such as a green fluorescent protein (GFP) gene, a blue fluorescent protein (CFP) gene, a yellow fluorescent protein (YFP) gene, and a red fluorescent protein (
  • the selectable marker gene and the selectable marker protein are not substantially toxic to the host cell.
  • a known detection method or the like may be used regardless of whether the selection marker protein is an enzyme or a fluorescent protein.
  • Promoter means a region on DNA that determines the start site of transcription of a gene and directly regulates its frequency. Usually, it is a base sequence in which RNA polymerase binds and starts transcription. “Promoter sequence” refers to a portion having a promoter function of a gene.
  • the promoter sequence is usually a region within about 5 kbp upstream of the first exon of the putative protein coding region or the transcription start site, the protein coding region in the genomic nucleotide sequence should be predicted using DNA analysis software.
  • DNA analysis software include DNASIS software (Hitachi Software) and GENETYX (Genetics Co., Ltd.).
  • the putative promoter sequence differs for each structural gene, and is usually present upstream of the structural gene, but is not limited thereto, and may be present downstream of the structural gene.
  • binding sequences of known transcriptional regulatory factors such as Sp1 and AP-2 exist, and it is expected that the region plays an important role in expression control.
  • the region contains a necessary and sufficient base sequence (promoter sequence) for inducing transcription.
  • the exact position may be determined using a technique well known in the art.
  • a method for obtaining the promoter sequence and the predicted DNA sequence from the NCBI database will be described.
  • the genomic DNA sequence upstream of the transcription start site predicted to contain the promoter sequence of the human ZO-1 (TJP1) gene the human reference sequence is set as a search target database on the MCSC Genome Browser homepage on the Internet, and “TJP1 ”As a keyword, a link list of“ Sequence and Links to Tools and Databases ”related to the TJP1 gene is displayed. From this link destination, the user moves to the “Genomic Sequence Near Gene” page.
  • DNA analysis software examples include DNASIS software (Hitachi Software) and GENETYX (Genetics Co., Ltd.) as described above.
  • “Operably linked to a promoter sequence” means that the desired gene is expressed (operated) under the control of a promoter sequence. In order for a promoter to be operably linked to a gene, the promoter is usually placed immediately upstream of the gene, but need not necessarily be adjacent.
  • the “human retinal pigment epithelial cell” in the present invention is, for example, a human-derived cell that is located in the outer layer of the retina. The cell is a cell that plays an important role in maintaining photoreceptor cells.
  • the shape is a single-layered cubic epithelial cell, and cells having a black pigment are connected to each other by a high junction.
  • the human retinal pigment epithelial cells are not particularly limited as long as they can be cultured.
  • stem cells such as stem cell-derived retinal pigment epithelial cells (ie, embryonic stem cells (ie, ES cells), induced pluripotent stem cells (ie, iPS cells), neural stem cells, etc.)
  • stem cells such as stem cell-derived retinal pigment epithelial cells (ie, embryonic stem cells (ie, ES cells), induced pluripotent stem cells (ie, iPS cells), neural stem cells, etc.)
  • human retinal pigment epithelial cells that are easily induced to differentiate, and human retinal pigment epithelial cells that are obtained directly from living tissue and that can be easily cultured.
  • human retinal pigment epithelial cells derived from cancer cells that have been cultured and human retinal pigment epithelial cells that have been immortalized by artificial manipulation and that can be easily cultured can be used.
  • stem cell means a cell that maintains the same differentiation ability even after cell division, and can be regenerated when the tissue is damaged.
  • Examples of the “stem cell” include embryonic stem cells or tissue stem cells (also referred to as tissue stem cells, tissue-specific stem cells or somatic stem cells), or induced pluripotent stem cells (iPS cells: induced pluripotent stem cells). be able to.
  • Preferred stem cells used in the phototoxicity test method of the present invention include, for example, embryonic stem cells (ie, ES cells), induced pluripotent stem cells (ie, iPS cells), neural stem cells and the like.
  • An “embryonic stem cell” ie, ES cell
  • ES cell is a stem cell having self-renewal ability and pluripotency (ie, pluripotency “pluripotency”), and is a pluripotent stem cell derived from an early embryo. means. Embryonic stem cells were first established in 1981, and have been applied since 1989 to the production of knockout mice. In 1998, human embryonic stem cells were established and are being used in regenerative medicine.
  • tissue stem cells including neural stem cells and the like are cells that have a limited direction of differentiation, exist at specific positions in the tissue, and have an undifferentiated intracellular structure. Therefore, tissue stem cells have a low level of pluripotency.
  • Tissue stem cells have a high nucleus / cytoplasm ratio and poor intracellular organelles.
  • Tissue stem cells generally have pluripotency, have a slow cell cycle, and maintain proliferative ability over the life of the individual.
  • Artificial pluripotent stem cells are cells in which differentiated cells such as fibroblasts are directly initialized by the expression of several kinds of genes such as Oct3 / 4, Sox2, Klr4, Myc, etc., and in 2006, Yamanaka et al.
  • the first step in the phototoxicity test method of the present invention is a step of bringing a test substance into contact with human retinal pigment epithelial cells. In the first step, a test substance is brought into contact with human retinal pigment epithelial cells.
  • Examples of the contact time between the human retinal pigment epithelial cells and the test substance include 1 minute or more, preferably 5 minutes or more and 3 days or less, more preferably 10 minutes or more and 24 hours or less.
  • Examples of the heat retention temperature at the time of contact include about 15 ° C. to 42 ° C., preferably about 35 ° C. to 42 ° C., more preferably about 35 ° C. to 37 ° C., and particularly preferably about 37 ° C. .
  • the pH of the culture solution is, for example, about pH 5 to pH 9, and preferably about pH 6.5 to pH 7.8.
  • Examples of the carbon dioxide gas concentration when contacting the test substance in the first step include about 0% to 25%.
  • the preferable humidity at the time of contact with the test substance in the first step can be, for example, about 95 ⁇ 5% rh, more preferably about 100% rh.
  • the concentration and application amount of the test substance to be contacted with human retinal pigment epithelial cells are not particularly limited, and the type of test substance, the expected phototoxic expression ability of the test substance, human retinal pigment epithelial cells in the first step, and What is necessary is just to determine suitably by the contact time with a test substance, the culture
  • the density of human retinal pigment epithelial cells in the contact system in the first step is, for example, 1 ⁇ 10 4 cell / cm 2 ⁇ 4 ⁇ 10 6 cell / cm 2 Degree, preferably 4 ⁇ 10 4 cell / cm 2 ⁇ 4 ⁇ 10 5 cell / cm 2 A degree etc. can be mentioned.
  • the human retinal pigment epithelial cells contacted with the test substance in the first step are subjected to a wavelength distribution ranging from 340 nm to 380 nm within 24 hours after the start of contact in the first step. It is the process of culturing while irradiating artificial light containing.
  • the human retinal pigment epithelial cells contacted with the test substance in the first step are irradiated with artificial light having a wavelength distribution ranging from 340 nm to 380 nm within 24 hours after the start of contact in the first step. Incubate while culturing. And when a test substance has phototoxicity expression capability, the phototoxicity expression capability can be expressed at this process. At this time, it is preferable to use a culture medium that does not contain a dye component that absorbs the artificial light or a protein component such as serum that may adsorb a test substance.
  • irradiation with artificial light having a wavelength distribution ranging from 340 nm to 380 nm is performed within 12 hours, more preferably within 6 hours, particularly preferably within about 10 minutes to 2 hours after the start of contact in the first step. Incubate while culturing.
  • the first step that is, contact with the test substance
  • the second step that is, culture under artificial light irradiation
  • the second step may be performed with the test substance contacted in the first step removed, or the second process may be performed with the test substance present.
  • the human retinal pigment epithelial cells contacted with the test substance in the first step are, for example, about 15 ° C. to 42 ° C.
  • the culture is preferably performed at a culture temperature of about 35 ° C. to 42 ° C., more preferably about 35 ° C. to 37 ° C., particularly preferably about 37 ° C., and without irradiation with artificial light.
  • the cultured cells are washed and replaced, and then subjected to artificial light irradiation in the second step, thereby being extracellular.
  • the artificial light to be irradiated is artificial light including a wavelength distribution in the range from 340 nm to 380 nm. Preferable examples include artificial light that is pseudo-sunlight composed of ultraviolet light, visible light, and infrared light.
  • pseudo-sunlight including light having a wavelength distribution in the range from 315 nm to 800 nm and not including ultraviolet light having a wavelength of less than 305 nm and infrared light having a wavelength of 850 nm or more is included.
  • the artificial light include light using an ultraviolet lamp, a mercury lamp, a halogen lamp, an LED, a xenon lamp, a metal halide lamp, a sodium lamp, or the like as a light source.
  • Preferable examples include ultraviolet light and pseudo-sunlight using a xenon lamp, a mercury lamp or the like as a light source.
  • pseudo sunlight using a xenon lamp, a mercury lamp or the like as a light source. It may be used after adjusting to artificial light having a desired wavelength distribution by using, for example, a filter that allows only a specific wavelength to pass or a filter that blocks a specific wavelength.
  • a specific light irradiation device for irradiating simulated sunlight for example, SOL500, SOL1200, SOL2000 (Dr. K. Honle Medizintechnik), SUNTEST CPS / CPS +, SUNTEST XLS + (Atlas Material Testing, Inc.) SXL-2500V2, XI-01B140KB1 (Ceric) can be mentioned.
  • the “contact time under artificial light irradiation” of the test substance can also be adjusted. That is, the desired “contact time under artificial light irradiation” can be realized by appropriately setting the culture time and the light irradiation amount of artificial light.
  • the artificial light irradiation can be performed continuously or intermittently.
  • the culture time corresponds to the “contact time under artificial light irradiation”. For example, by culturing for 15 minutes, 30 minutes, 1 hour or 2 hours under continuous artificial light irradiation, “contact time under artificial light irradiation” of 15 minutes, 30 minutes, 1 hour or 2 hours Can be realized.
  • the artificial light irradiation time corresponds to the “contact time under artificial light irradiation”.
  • the first 12 hours are cultured under artificial light irradiation, and the remaining 12 hours are cultured in a state where artificial light is cut off.
  • Contact time can be realized.
  • Examples of the culture temperature of human retinal pigment epithelial cells include about 15 ° C to 42 ° C.
  • a preferable light irradiation amount when irradiating artificial light having a wavelength distribution in the range from 340 nm to 380 nm is, for example, 3 J / cm as a measurement value at a wavelength of 360 nm. 2 To 30 J / cm 2
  • the light irradiation amount etc. which are the range up to can be mentioned.
  • the light irradiation intensity of artificial light, the light irradiation time of artificial light, and the like may be appropriately set.
  • Light irradiation Is, for example, time (minutes) ⁇ light irradiation intensity (mW / cm 2 ) ⁇ 60 ⁇ 1000.
  • a light irradiation intensity of about 2.08 mW measured at a wavelength of 360 nm for about 40 minutes, about 5 J / cm 2 It turns out that it becomes the light irradiation amount of.
  • artificial light irradiation for example, artificial light is shielded in at least one of human retinal pigment epithelial cells contacted with a test substance and control human retinal pigment epithelial cells.
  • Irradiation having a light irradiation amount that significantly reduces the number of viable cells under the light irradiation condition relative to the number of viable cells under the lighted condition can be exemplified.
  • a preliminary test may be performed in accordance with the method described in Example 6 to be described later, and it is easily confirmed that the light irradiation amount is preferable. Can do.
  • the artificial light irradiation for example, 3 J / cm as a measurement value at a wavelength of 360 nm. 2 To 30 J / cm 2 The light irradiation etc.
  • the measured value at a wavelength of 360 nm is 3.5 J / cm. 2 To 20 J / cm 2
  • the irradiation etc. which become the light irradiation amount of the pseudo-sunlight which is the range until are mentioned.
  • the measured value at a wavelength of 360 nm is 5 J / cm. 2 To 10 J / cm 2
  • the irradiation etc. which become the light irradiation amount of the pseudo-sunlight which is the range up to can be mentioned.
  • the third step in the phototoxicity test method of the present invention is a step of collecting the human retinal pigment epithelial cells cultured in the second step and measuring the cytotoxicity in the collected cultured cells or an index value correlated therewith. is there. In the third step, the cytotoxicity of the collected cultured cells in the human retinal pigment epithelial cells cultured in the second step or an index value having a correlation therewith is measured.
  • the cytotoxicity in cultured cells or the index value correlated therewith is, for example, a method using a hemocytometer, a method using a cell counter, 3 Method using a radioisotope such as H thymidine ( 3 A simple method of measuring only living cells by adding a radioisotope such as H thymidine to the cell culture and incubating), LDH (lactate dehydrogenase) method, method using neutral red (NR) (red dye) A method that uses the property that neutral red is taken up and accumulated in the lysosomes of living cells and is a simple method that measures only living cells), a method that uses crystal violet (CR) (crystal violet enters the cell membrane of living cells and stains it) A simple method of measuring only living cells), a method using tetrazolium salt (tetrazolium salt is a substrate for intracellular mitochondrial dehydrogenase, and the more viable cells are reduced tetrazolium) Because the amount of salt is high and the amount of salt
  • the fourth step in the phototoxicity test method of the present invention is a step of evaluating the presence or degree of the phototoxicity of the test substance based on the measurement result of the third step and examining the phototoxicity of the test substance. In the fourth step, the presence or degree of the phototoxicity of the test substance is evaluated based on the measurement result of the third step, and the phototoxicity of the test substance is tested.
  • the absolute value of the measurement result of the third step may be evaluated without setting a control, or a control may be set and You may evaluate by comparison.
  • the measurement result of the third step is compared with the measurement result of the cytotoxicity or the index value correlated therewith in the collected cultured cells of the control human retinal pigment epithelial cells. Based on this, the presence or absence of the phototoxicity of the test substance or its extent is evaluated.
  • both a negative control and a positive control can be set as the “control”.
  • Examples of negative controls include human retinal pigment epithelial cell groups cultured without artificial light irradiation, human retinal pigment epithelial cell groups cultured under low artificial light irradiation, and has phototoxicity expression ability.
  • Examples thereof include a group of human retinal pigment epithelial cells that are brought into contact with a substance (for example, only a solvent) that is known not to exist.
  • a substance for example, only a solvent
  • the following assay is possible. That is, the measurement results of the cytotoxicity of the collected cultured cells in the test substance or the index value correlated therewith, and the measured results of the cytotoxicity of the collected cultured cells in the negative control or the correlated index value thereof And compare.
  • the test substance can be evaluated and tested as having the ability to develop phototoxicity.
  • the control includes a positive control in which a known phototoxic substance is contacted with human retinal pigment epithelial cells.
  • positive controls include a group of human retinal pigment epithelial cells that are brought into contact with a reference substance that is known in advance to have phototoxic expression ability and are cultured under irradiation of artificial light. When such a positive control is used, the following assay is possible.
  • the test substance has a higher phototoxicity-producing ability than the reference substance used in the positive control. Then you can evaluate and test.
  • the ability to develop phototoxicity of the test substance can be quantitatively evaluated and tested by similarly evaluating and testing at each concentration or each applied amount of the reference substance.
  • the positive control and the negative control described above may be used in combination.
  • chlorpromazine (CPZ) is used as a reference substance for the positive control.
  • the use of chlorpromazine (CPZ) as a positive control for the phototoxicity test method of the present invention is also one aspect of the present invention.
  • the use of chlorpromazine (CPZ) as a positive control for the phototoxicity test method of the present invention is one of the present inventions.
  • One aspect of the positive control reagent of the present invention is a positive control reagent for use in the phototoxicity test method of the present invention and contains chlorpromazine (CPZ).
  • chlorpromazine (CPZ) may be used as it is, or it may be dissolved in a solvent to form a solution. Furthermore, the shape contained or disperse
  • penicillin G, quinine, bithionol or chlorhexidine is used as a reference for negative controls.
  • the use of penicillin G, quinine, bithionol or chlorhexidine as a negative control for the phototoxicity test method of the present invention is also one aspect of the present invention.
  • penicillin G, quinine, bitionol or chlorhexidine as a negative control for the phototoxicity test method of the present invention is also one aspect of the present invention.
  • One aspect of the negative control reagent of the present invention is a negative control reagent for use in the phototoxicity test method of the present invention, which is penicillin G, quinine, bithionol, or chlorhexidine. Containing.
  • penicillin G, quinine, bithionol, or chlorhexidine may be used as it is, or it may be dissolved in a solvent to form a solution.
  • distributed to the appropriate base may be sufficient.
  • cytotoxic IC50 values in human retinal pigment epithelial cells contacted with a test substance are cultured under artificial light irradiation within 24 hours after the start of contact with the test substance.
  • a value obtained by dividing by the cytotoxic IC50 value in human retinal pigment epithelial cells was determined, and when the value (PIF value) was larger than 2 and smaller than 5, it was false positive. In these cases, the test substance is evaluated as being positive for phototoxicity.
  • the phototoxicity expression ability of a test substance is tested by the phototoxicity test method of the present invention, and a substance having a desired phototoxicity expression ability is selected.
  • the same embodiment as the above-described phototoxicity test method of the present invention can be employed.
  • the measurement result of the cytotoxicity of the collected cultured cells in the test substance or an index value correlated therewith, and the cytotoxicity of the collected cultured cells in the negative control or The measurement result of the index value having a correlation is compared with it.
  • test substance having a statistically significantly lower index value having a cytotoxicity or correlation with the collected cultured cells than that of the negative control is selected, or cytotoxicity with the collected cultured cells is selected.
  • a test substance whose index value having a correlation with it is 50% or less of the negative control may be selected.
  • a positive control such as chlorpromazine (CPZ)
  • CPZ chlorpromazine
  • the measurement result of the cytotoxicity of the collected cultured cells in the test substance or an index value correlated therewith, and the collected cultured cells in the positive control And the measurement result of the index value having a correlation with the toxicity in
  • a test substance having a statistically significantly lower index value than that of the positive control is selected for the cytotoxicity in the collected cultured cells or the index value correlated therewith, or the cytotoxicity in the collected cultured cells or Higher phototoxicity than the reference substance used in the positive control by selecting a test substance whose test substance concentration is lower than that of the positive control when the correlated index value is the same as the positive control
  • a substance having an expression ability can be selected.
  • the cytotoxicity in the collected cultured cells or an index value correlated therewith can be quantitatively evaluated and tested.
  • the phototoxicity expression ability of the test substance is quantitatively evaluated by similarly evaluating and testing the test substance at each concentration or each applied amount of a reference substance such as chlorpromazine (CPZ).
  • CPZ chlorpromazine
  • a substance capable of being assayed and having a desired phototoxic expression ability is selected.
  • the method for searching for pseudo-sun skin irritation non-inducing substance of the present invention is to test the phototoxicity expression ability of a test substance by the phototoxicity test method of the present invention and select a substance that does not have the desired phototoxicity expression ability. .
  • the same embodiment as the above-described phototoxicity test method of the present invention can be taken.
  • the test substance to be searched may be any substance as long as it does not have the desired phototoxicity expression ability, and examples thereof include low molecular weight compounds, proteins, peptides, and the like.
  • the test substance can be more efficiently tested for the phototoxicity expression ability, and the desired phototoxicity expression substance or simulated solar skin irritation is not induced.
  • Substances can also be searched for more easily.
  • a useful electronic information recording medium including toxicity information can be produced by recording the toxicity information on the simulated sunlight skin irritation obtained by the phototoxicity test method of the present invention on the electronic information recording medium.
  • Example 1 Induction of differentiation of human ES cells into human retinal pigment epithelial cells
  • KhES-1 strain As a human embryonic stem cell (ie, ES cell), KhES-1 strain, which is a Kyoto University established strain, was used.
  • the KhES-1 strain was transformed into human ES cell maintenance culture medium added with bFGF (basic fibroblast growth factor) (DMEM / F12, KSR (Knockout serum replacement), non-essential amino acids, L -Including glutamine, 2-mercaptoethanol, etc.), undifferentiated maintenance culture was performed on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells treated with mitomycin C.
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • colonies of human embryonic stem cells were obtained by recovering from the culture dish using a dissociation solution containing trypsin / collagenase IV.
  • the obtained colony is crushed into a size of about several tens of cells per cell mass by pipetting with a micropipette, and then placed on a 10 cm culture dish that has been coated with a 0.1% gelatin solution in advance.
  • Colonies of human embryonic stem cells ie, ES cells
  • 10 ml of human ES cell maintenance culture medium containing 1 ⁇ M to 10 ⁇ M SB431542, 1 ⁇ M to 10 ⁇ M CKI-7, 1 ⁇ M to 10 ⁇ M Y27632.
  • Example 2 (Culture of human retinal pigment epithelial cells) Colonies containing human retinal pigment epithelial cells having the black pigment induced to differentiate according to Example 1 were scraped using a micropipette, and then dispersed by 0.05% trypsin treatment. A medium in which 2 to 20 ng / ml of bFGF was added to a DMEM / F12 culture medium containing an N2 additive was added to a 60 mm culture dish that had been previously coated with Matrigel, and the dispersed cells obtained on the medium were seeded. Dispersed cells seeded in this manner included unspecified cells other than human retinal pigment epithelial cells.
  • Cells are incubated at 37 ° C, 5% CO 2 After culturing in an incubator to become confluent, it was treated with 0.25% trypsin, and the cells were collected from the culture dish. The collected cells are seeded on a 10 cm culture dish that has been pre-coated with Matrigel, and then at 37 ° C., 5% CO 2 until the cells become confluent. 2 The cells were cultured in an incubator. When the cells became confluent, the majority of the cells present in the culture dish were human retinal pigment epithelial cells. Further, the cells were cultured in a DMEM / F12 culture solution containing N2 additive not containing bFGF for one week or more, and then used in the following experiments.
  • Example 3 (First step, second step and third step of the phototoxicity test method of the present invention under light-shielding conditions as a control for non-light irradiation) Human retinal pigment epithelial cells prepared in Example 2 were treated with 0.25% trypsin, and the cells were collected from the culture dish. The collected cells were seeded in a 96-well culture dish that had been pre-coated with Matrigel at a rate of 100,000 or 120,000 cells per well. 2 The cells were cultured in an incubator. After 2 to 4 hours of culture, the medium was removed from the 96-well culture dish using an aspirator, and then Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) was added to the 96-well culture dish at a rate of 150 ⁇ l per well.
  • EBSS Earle's Balanced Salt Solution
  • Chlorpromazine Chlorpromazine (CPZ)): concentrations 0.1, 1, 3, 10, 30, 100 ( ⁇ g / ml)
  • Penicillin G concentrations 1, 3, 10, 30, 100, 300, 1000 ( ⁇ g / ml)
  • C Quinine: concentrations 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30, 100 ( ⁇ g / ml)
  • Bitionol concentrations 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3, 10 ( ⁇ g / ml)
  • Chlorhexidine concentrations 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30, 100 ( ⁇ g / ml)
  • the 96-well culture dish was washed twice with 150 ⁇ l of DMEM / F12 culture medium, and then the DMEM / F12 culture medium containing N2 additive was added to the 96-well culture dish at a rate of 100 ⁇ l per well. And cultured overnight. After culturing, the medium is removed from the 96-well culture dish, and then an equal volume mixture of DMEM / F12 culture solution and Cell titer Glo reaction solution prepared in advance is added to the 96-well culture dish at a rate of 100 ⁇ l per well. Added.
  • the obtained 96-well culture dish was allowed to stand at room temperature for 30 minutes while shaking with light shielding with aluminum foil, and 95 ⁇ l of the culture contained in the 96-well culture dish was transferred to a white 96-well test dish.
  • the amount of luminescence of the culture contained in the 96-well test dish was measured using an EnVision multilabel reader (Perkin Elmer).
  • IC50 50% inhibitory concentration of the test substance for human retinal pigment epithelial cells was calculated from the measured value, and the calculated value was used as a value indicating cytotoxicity (an index value correlated therewith). According to the above calculation method, the following results were obtained.
  • Example 4 (First Step, Second Step, and Third Step of the Phototoxicity Test Method of the Present Invention) Human retinal pigment epithelial cells prepared in Example 2 were treated with 0.25% trypsin, and the cells were collected from the culture dish. The collected cells were seeded in a 96-well culture dish that had been pre-coated with Matrigel at a rate of 100,000 or 120,000 cells per well. 2 Cultured in an incubator.
  • EBSS Earle's Balanced Salt Solution
  • Chlorpromazine Chlorpromazine (CPZ): concentrations 0.1, 1, 3, 10, 30, 100 ( ⁇ g / ml)
  • Chlorhexidine concentrations 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30, 100 ( ⁇ g / ml)
  • a 96-well culture dish is not wrapped with aluminum foil, and light irradiation (simulated sunlight irradiation device SXL-2500V2: Celic) is used for 40 minutes (based on light irradiation intensity at 360 nm).
  • the 96-well culture dish was washed twice with 150 ⁇ l of DMEM / F12 culture medium, and then the DMEM / F12 culture medium containing N2 additive was added to the 96-well culture dish at a rate of 100 ⁇ l per well. And cultured overnight. After culturing, the medium is removed from the 96-well culture dish, and then an equal volume mixture of DMEM / F12 culture solution and Cell titer Glo reaction solution prepared in advance is added to the 96-well culture dish at a rate of 100 ⁇ l per well. Added.
  • the obtained 96-well culture dish was allowed to stand at room temperature for 30 minutes while shaking with light shielding with aluminum foil, and 95 ⁇ l of the culture contained in the 96-well culture dish was transferred to a white 96-well test dish.
  • the amount of luminescence of the culture contained in the 96-well test dish was measured using an EnVision multilabel reader (Perkin Elmer).
  • IC50 50% inhibitory concentration of the test substance for human retinal pigment epithelial cells was calculated from the measured value, and the calculated value was used as a value indicating cytotoxicity (an index value correlated therewith). According to the above calculation method, the following results were obtained.
  • “Balb / c 3T3 cells” cultured in DMEM medium containing 10% bovine serum and L-glutamine were treated with 0.25% trypsin, and the cells were collected from the culture dish.
  • the collected cells were seeded at a rate of 10,000 cells per well in a 96-well culture dish that had been coated with a 0.1% gelatin solution in advance, and then a DMEM medium containing 10% bovine serum and L-glutamine at 37 ° C. 5% CO 2 The cells were cultured overnight in an incubator.
  • the medium was removed from the 96-well culture dish using an aspirator, and then Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) was added to the 96-well culture dish at a rate of 150 ⁇ l per well to wash the cells.
  • EBSS Earle's Balanced Salt Solution
  • a test substance solution or a solvent control solution prepared in advance to the following concentration using EBSS was added to the culture dish at a rate of 100 ⁇ l per well.
  • Chlorpromazine Chlorpromazine (CPZ): concentrations 0.1, 1, 3, 10, 30, 100 ( ⁇ g / ml)
  • Chlorhexidine concentrations 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30, 100 ( ⁇ g / ml)
  • the culture dish that has been shielded from light with aluminum foil is irradiated with light (at 360 nm) using a light irradiation device (pseudo-sunlight irradiation device SXL-2500V2: Celic).
  • the light irradiation amount is about 5 J / cm. 2 ).
  • the 96-well culture dish was washed twice with 150 ⁇ l of DMEM / F12 culture medium, and then the DMEM / F12 culture medium containing N2 additive was added to the 96-well culture dish at a rate of 100 ⁇ l per well. And cultured overnight. After culturing, the medium is removed from the 96-well culture dish, and then an equal volume mixture of DMEM / F12 culture solution and Cell titer Glo reaction solution prepared in advance is added to the 96-well culture dish at a rate of 100 ⁇ l per well. Added.
  • the obtained 96-well culture dish was allowed to stand at room temperature for 30 minutes while shaking with light shielding with aluminum foil, and 95 ⁇ l of the culture contained in the 96-well culture dish was transferred to a white 96-well test dish.
  • the amount of luminescence of the culture contained in the 96-well test dish was measured using an EnVision multilabel reader (Perkin Elmer).
  • IC50 50% inhibitory concentration of the test substance for human retinal pigment epithelial cells was calculated from the measured value, and the calculated value was used as a value indicating cytotoxicity (an index value correlated therewith). According to the above calculation method, the following results were obtained.
  • the medium was removed from the 96-well culture dish using an aspirator, and then Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) was added to the 96-well culture dish at a rate of 150 ⁇ l per well to wash the cells.
  • EBSS Earle's Balanced Salt Solution
  • a test substance solution or a solvent control solution prepared in advance to the following concentration using EBSS was added to the culture dish at a rate of 100 ⁇ l per well.
  • Chlorpromazine Chlorpromazine (CPZ): concentrations 0.1, 1, 3, 10, 30, 100 ( ⁇ g / ml)
  • Chlorhexidine concentrations 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30, 100 ( ⁇ g / ml)
  • 40 minutes of light irradiation (based on irradiation intensity at 360 nm) using a light irradiation device (pseudo-sunlight irradiation device SXL-2500V2: Celic)
  • the light irradiation based on irradiation intensity at 360 nm
  • SXL-2500V2 a light ir
  • the 96-well culture dish was washed twice with 150 ⁇ l of DMEM / F12 culture medium, and then the DMEM / F12 culture medium containing N2 additive was added to the 96-well culture dish at a rate of 100 ⁇ l per well. And cultured overnight. After culturing, the medium is removed from the 96-well culture dish, and then an equal volume mixture of DMEM / F12 culture solution and Cell titer Glo reaction solution prepared in advance is added to the 96-well culture dish at a rate of 100 ⁇ l per well. Added.
  • the obtained 96-well culture dish was allowed to stand at room temperature for 30 minutes while shaking with light shielding with aluminum foil, and 95 ⁇ l of the culture contained in the 96-well culture dish was transferred to a white 96-well test dish. Subsequently, the amount of luminescence of the culture contained in the 96-well test dish (the amount of luminescence has a correlation with the cell viability) was measured using an EnVision multilabel reader (Perkin Elmer). . A 50% inhibitory concentration (IC50) of the test substance for human retinal pigment epithelial cells was calculated from the measured value, and the calculated value was used as a value indicating cytotoxicity (an index value correlated therewith). According to the above calculation method, the following results were obtained.
  • IC50 50% inhibitory concentration
  • Example 6 (Preliminary test for setting light irradiation amount) Using chlorpromazine (CPZ), which is used as a positive control in the OECD guidelines, the amount of light irradiation and the PIF value described above (ie, the cytotoxic IC50 value in human retinal pigment epithelial cells contacted with the test substance (non-light irradiation) (The value obtained by dividing the control (shading) control) by the cytotoxic IC50 value in human retinal pigment epithelial cells cultured under simulated sunlight irradiation within 24 hours after the start of contact with the test substance) It was investigated.
  • CPZ chlorpromazine
  • the phototoxicity test method was implemented by the method similar to the phototoxicity test method by the said light irradiation except light-shielding.
  • IC50 50% inhibitory concentration
  • Example 7 phototoxicity test method of the present invention using a transformant
  • a method for producing human embryonic stem cells (ie, ES cells) transformed with a vector containing a reporter gene under the control of promoter expression of genes (Mitf, RPE65, ZO1, etc.) expressed in human retinal pigment epithelial cells Describe. (1) Gene promoter cloning and reporter plasmid preparation The promoter region of ZO-1 is cloned by the method shown below.
  • the obtained PCR product is purified using a PCR purification kit (QIAGEN), the end of the PCR product is digested with a restriction enzyme, and then purified by performing agarose gel electrophoresis.
  • the purified DNA fragment was purified using pGL4.17 [Luc2 / Neo] vector (Promega) and dephosphorylated with Alkaline phosphatase (Takara Bio) and Ligation kit (Takara Bio). Link.
  • the obtained DNA fragment is transformed into Escherichia coli DH5 ⁇ competence cell (Takara Bio Inc.) and then cultured overnight at 37 ° C. in LB / ampicillin medium.
  • plasmid DNA is extracted from Escherichia coli obtained by culturing the appearing colonies in LB / ampicillin liquid medium.
  • the sequence of the inserted fragment is determined, and the presence or absence of mutation or the like is confirmed.
  • Each plasmid is extracted again with a Qiafilter plasmid extraction kit (Qiagen) for use in transfection into human embryonic stem cells (ie, ES cells).
  • Qiafilter plasmid extraction kit Qiagen
  • the obtained plasmid DNA (20 ⁇ g) is linearized by restriction enzyme treatment and then purified to obtain linearized DNA.
  • Human embryonic stem cells (ie, ES cells) colonies are collected from the culture dish by treating the human embryonic stem cells (ie, ES cells) that have been cultured undifferentiated with a dissociation solution. The collected colonies are suspended in a human embryonic stem cell (ie, ES cell) undifferentiated maintenance medium, transferred to a 10 cm culture dish coated with 0.1% gelatin, and then incubated at 37 ° C., 5% CO 2. 2 The feeder cells are allowed to adhere by allowing to stand for 2 hours in an incubator.
  • the supernatant containing the floating human embryonic stem cell (ie, ES cell) colonies is transferred to a 15 ml tube, and the colonies are sedimented by centrifugation.
  • the colonies collected in this manner are treated with a trypsin solution and then pipetted using a micropipette to make human embryonic stem cells (ie, ES cells) into single cells.
  • the resulting cells are then centrifuged to sediment.
  • the cells are suspended in a solution in which Opti-MEM medium, 2 ⁇ g of linearized DNA, and 8 ⁇ L of FuGENE HD (Promega) are mixed in advance, and the cell suspension is allowed to react at room temperature for 5 minutes.
  • the cells are suspended in an undifferentiated maintenance medium containing 1 ⁇ M to 10 ⁇ M Y27632.
  • the resulting cell suspension was seeded onto neomycin resistant feeder cells and 5% CO at 37 ° C. 2 Incubate overnight in incubator.
  • Drug selection culture is performed by adding 100 ⁇ g / mL G418 (Invitrogen) to the medium.
  • G418 Invitrogen
  • Ten to fifteen days after addition of G418, human embryonic stem cell (ie, ES cell) colonies formed in a petri dish are isolated under a microscope and seeded in a 96-well plate. After continuing the drug selective culture, cells grown after 10 to 15 days are subcultured and seeded in a 48-well plate.
  • a drug-resistant stable transformed cell line is obtained.
  • Recombinant human embryonic stem cells (ie, ES cells) are induced to differentiate into human retinal pigment epithelial cells according to the method described in Example 1.
  • the test substance is exposed to the cells according to the method described in Example 3.
  • the medium is removed from the 96-well culture dish, and then 100 ⁇ l of an equal volume mixture of DMEM / F12 culture solution and Steady Glo reaction solution prepared in advance is added per well. After left standing at room temperature for 30 minutes while shaking with light shielding with aluminum foil, 95 ⁇ l is transferred to a white 96-well culture dish, and the amount of luminescence is measured with an EnVision multilabel reader (Perkin Elmer).
  • the 50% inhibitory concentration (IC50) of the test substance for human retinal pigment epithelial cells is calculated from the measured value of the luminescence at each test concentration of the solvent control and the test substance, and this is used as the toxicity value.
  • IC50 50% inhibitory concentration
  • the phototoxicity test method of the present invention it is possible to effectively test the test substance's ability to develop phototoxicity. Furthermore, the present invention can provide a phototoxic substance that can be used as a positive control in the test method.

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Abstract

本発明は、ヒト網膜色素上皮細胞を用いた光毒性試験法等を提供する。

Description

光毒性試験法
　本発明は、ヒト網膜色素上皮細胞を用いた光毒性試験法等に関するものである。
　医薬品、農薬、化粧品、工業製品等の化学物質のヒトに対する安全性を評価するためには、通常、動物個体を用いた多くの毒性試験が行われる。これらの毒性試験のうち、体内に入った化学物質が光に反応して生じる刺激性等の急性毒性試験は、総じて光毒性試験と称される。
　光毒性試験法として最も広く利用されているものとしては、例えば、動物皮膚への局所投与による森川法が知られている。当該光毒性試験法は、モルモット又は白色ウサギを用い、当該動物の背部皮膚に被験物である化学物質を塗布した後、当該塗布部位への紫外線照射に対する前記背部皮膚における生体反応を予め定めた評価基準に従って肉眼判定して得られた判定結果と、前記塗布部位への非紫外線照射に対する前記背部皮膚における生体反応を前記評価基準に従って同様に肉眼判定して得られた判定結果と比較することにより、被験物である化学物質が有する光毒性の存在有無又はその程度を評価する試験法である。
　しかしながら、近年の動物福祉の問題や欧州等に見られる動物実験規制強化から、実験動物を使用しない光毒性試験法のための代替法の開発が強く求められている。
　一方、現在までに多くのｉｎ　ｖｉｔｒｏ光毒性試験法が開発されている。このような光毒性試験法のなかで最も期待されているものとしては、例えば、結合組織細胞（Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｃｅｌｌ）であり、線維芽細胞（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）である「Ｂａｌｂ／ｃ　３Ｔ３細胞」によるニュートラルレッド取り込み試験法（３Ｔ３　ＮＲＵ　ＰＴ）を挙げることができる。当該３Ｔ３　ＮＲＵ　ＰＴは、１９９８年にＥＣＶＡＭ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ　Ｍｅｔｈｏｄｓ：ヨーロッパ代替法検証センター）により科学的に確立された光毒性試験法の代替法として認められ、２０００年以降、化学物質が有する光毒性の存在有無をスクリーニングするための試験法として採用されている。また当該試験法は、ＯＥＣＤにも提出され、２００４年にｉｎ　ｖｉｔｒｏ光毒性試験としてガイドライン化されている唯一の試験法としても知られている（例えば、ＯＥＣＤ　ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｔｅｓｔｉｎｇ　ｏｆ　ｃｈｅｍｉｃａｌｓ：ｔｅｓｔ　ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ　４３２”Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　３Ｔ３　ＮＲＵ　ｐｈｏｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｔｅｓｔ”Ｐａｒｉｓ：Ｆｒａｎｋｒｅｉｃｈ，ＯＥＣＤ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｏｆｆｉｃｅ；２００４参照）。
　しかしながら、近年、３Ｔ３　ＮＲＵ　ＰＴによる光毒性の存在有無等の評価結果が多く蓄積されるようになったところ、偽陽性という結果を含むことも明らかになりつつあり、実際のヒトへの安全性を予測することに関しては必ずしも常に充分満足できるものではなく、新たなｉｎ　ｖｉｔｒｏ光毒性試験法の開発が望まれている（例えば、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ａｎｄ　Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．６３，ｐ２０９−２１４；２０１１参照）。
　本発明は、ヒト網膜色素上皮細胞を用いた光毒性試験法等を提供する。
　より具体的には、本発明は
１．下記工程（１）~（４）を有する光毒性試験方法（以下、本発明光毒性試験方法と記すこともある。）：
（１）ヒト網膜色素上皮細胞に被験物質を接触させる第一工程；
（２）第一工程で被験物質を接触させたヒト網膜色素上皮細胞を、第一工程における接触開始後２４時間以内に、３４０ｎｍから３８０ｎｍまでの範囲の波長分布を含む人工光を照射しながら培養する第二工程；
（３）第二工程で培養されたヒト網膜色素上皮細胞を回収し、回収された培養細胞での細胞毒性若しくはそれに相関関係を有する指標値を測定する第三工程；及び
（４）第三工程の測定結果によって被験物質の光毒性発現能力の有無又はその程度を評価し、被験物質の光毒性発現能力を検定する第四工程；
２．前記人工光が、紫外光、可視光及び赤外光からなる擬似太陽光である前項１記載の光毒性試験方法；
３．第二工程における人工光の照射が、波長３６０ｎｍでの測定値として３Ｊ／ｃｍ２から３０Ｊ／ｃｍ２までの範囲である光照射量となる照射である前項１又は２記載の光毒性試験方法；
４．前記第四工程において、前記第三工程の測定結果と、対照のヒト網膜色素上皮細胞における回収された培養細胞での細胞毒性若しくはそれに相関関係を有する指標値の測定結果とを比較し、その差異に基づいて被験物質の光毒性発現能力の有無又はその程度を評価する前項１~３のいずれかに記載の光毒性試験方法；
５．前記対照が、ヒト網膜色素上皮細胞に既知の光毒性発現物質を接触させた陽性対照を含む前項４記載の光毒性試験方法；
６．前記光毒性発現物質が、クロルプロマジン（ＣＰＺ）である前項５記載の光毒性試験方法；
７．第二工程における人工光の照射が、被験物質を接触させたヒト網膜色素上皮細胞と対照のヒト網膜色素上皮細胞との少なくともいずれか一方のヒト網膜色素上皮細胞において、人工光を遮光した条件下での前記細胞の生存細胞数に対して、光照射条件下での前記細胞の生存細胞数が有意に減少する光照射量を有する照射である前項１~６のいずれかに記載の光毒性試験方法；
８．前記第二工程における人工光の照射が、１回の連続的照射又は２回以上の繰り返し照射からなる間欠的照射である前項１~７のいずれかに記載の光毒性試験方法；
９．前記ヒト網膜色素上皮細胞が、幹細胞由来の網膜色素上皮細胞である前項１~８のいずれかに記載の光毒性試験方法；
１０．前記幹細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞又は神経幹細胞である前項９記載の光毒性試験方法；
１１．前項１~１０のいずれかに記載の光毒性試験方法のための、陽性対照としてのクロルプロマジン（ＣＰＺ）の使用；
１２．前項１~１０のいずれかに記載の光毒性試験方法に用いるための陽性対照試薬であって、クロルプロマジン（ＣＰＺ）を含有する陽性対照試薬；
１３．前項１~１０のいずれかに記載の光毒性試験方法のための、陰性対照としてのペニシリンＧ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ　Ｇ）、キニーネ（Ｑｕｉｎｉｎｅ）、ビチオノール（Ｂｉｔｈｉｏｎｏｌ）又はクロルヘキシジン（Ｃｈｌｏｒｈｅｘｉｄｉｎｅ）の使用；
１４．前項１~１０のいずれかに記載の光毒性試験方法に用いるための陰性対照試薬であって、ペニシリンＧ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ　Ｇ）、キニーネ（Ｑｕｉｎｉｎｅ）、ビチオノール（Ｂｉｔｈｉｏｎｏｌ）又はクロルヘキシジン（Ｃｈｌｏｒｈｅｘｉｄｉｎｅ）を含有する陽性対照試薬；
１５．前項１~１０のいずれかに記載の光毒性試験方法によって、被験物質の光毒性発現能力を検定し、所望の光毒性発現能力を有する物質を選抜する光毒性発現物質の探索方法（以下、本発明光毒性発現物質探索方法と記すこともある。）；及び
１６．前項１~１０のいずれかに記載の光毒性試験方法によって、被験物質の光毒性発現能力を検定し、所望の光毒性発現能力を有さない物質を選抜する擬似太陽光皮膚刺激非誘発物質の探索方法（以下、本発明擬似太陽光皮膚刺激非誘発物質探索方法と記すこともある。）；
等を提供するものである。
　本発明光毒性試験方法によれば、被験物質の光毒性発現能力の検定を効果的に行なうことができる。さらに、本発明では、当該試験方法に陽性対照として用いることができる光毒性発現物質を提供することができる。
　本発明光毒性発現物質探索方法によれば、所望の光毒性発現物質又は擬似太陽光皮膚刺激非誘発物質の探索を簡便に行うことができる。
　図１は、ヒト胚性幹細胞（即ち、ＥＳ細胞）から分化誘導して得られたヒト網膜色素上皮細胞の明視野像を示す図である。
　図２は、ヒト胚性幹細胞（即ち、ＥＳ細胞）から分化誘導して得られたヒト網膜色素上皮細胞を免疫染色した結果（赤はＺＯ−１、青は核）を示す図である。
　図３は、光細胞毒性が陽性である化合物「クロルプロマジン（ＣＰＺ））」を被験物質として用いた本発明光毒性試験方法により、実施例３において、非光照射のための（遮光）対照として測定された細胞毒性若しくはそれに相関関係を有する指標値に関する結果を示す図である。
　図４は、光細胞毒性が陰性である化合物「ペニシリンＧ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ　Ｇ）」を被験物質として用いた本発明光毒性試験方法により、実施例３において、非光照射のための（遮光）対照として測定された細胞毒性若しくはそれに相関関係を有する指標値に関する結果を示す図である。
　図５は、光細胞毒性が陰性である化合物「キニーネ（Ｑｕｉｎｉｎｅ）」を被験物質として用いた本発明光毒性試験方法により、実施例３において、非光照射のための（遮光）対照として測定された細胞毒性若しくはそれに相関関係を有する指標値に関する結果を示す図である。
　図６は、光細胞毒性が陰性である化合物「ビチオノール（Ｂｉｔｈｉｏｎｏｌ）」を被験物質として用いた本発明光毒性試験方法により、実施例３において、非光照射のための（遮光）対照として測定された細胞毒性若しくはそれに相関関係を有する指標値に関する結果を示す図である。
　図７は、光細胞毒性が陰性である化合物「クロルヘキシジン（Ｃｈｌｏｒｈｅｘｉｄｉｎｅ）」被験物質としてを用いた本発明光毒性試験方法により、実施例３において、非光照射のための（遮光）対照として測定された細胞毒性若しくはそれに相関関係を有する指標値に関する結果を示す図である。
　図８は、光細胞毒性が陽性である化合物「クロルプロマジン（ＣＰＺ））」を被験物質として用いた本発明光毒性試験方法により、実施例４において、光照射条件下に測定された細胞毒性若しくはそれに相関関係を有する指標値に関する結果を示す図である。
　図９は、光細胞毒性が陰性である化合物「ペニシリンＧ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ　Ｇ）」を被験物質として用いた本発明光毒性試験方法により、実施例４において、光照射条件下に測定された細胞毒性若しくはそれに相関関係を有する指標値に関する結果を示す図である。
　図１０は、光細胞毒性が陰性である化合物「キニーネ（Ｑｕｉｎｉｎｅ）」を被験物質として用いた本発明光毒性試験方法により、実施例４において、光照射条件下に測定された細胞毒性若しくはそれに相関関係を有する指標値に関する結果を示す図である。
　図１１は、光細胞毒性が陰性である化合物「ビチオノール（Ｂｉｔｈｉｏｎｏｌ）」を被験物質として用いた本発明光毒性試験方法により、実施例４において、光照射条件下にで測定された細胞毒性若しくはそれに相関関係を有する指標値に関する結果を示す図である。
　図１２は、光細胞毒性が陰性である化合物「クロルヘキシジン（Ｃｈｌｏｒｈｅｘｉｄｉｎｅ）」を被験物質として用いた本発明光毒性試験方法により、実施例４において、光照射条件下に測定された細胞毒性若しくはそれに相関関係を有する指標値に関する結果を示す図である。
　図１３は、光細胞毒性が陽性である化合物「クロルプロマジン（ＣＰＺ））」を被験物質として用いた比較光毒性試験方法により、比較例１において、非光照射のための（遮光）対照として測定された細胞毒性若しくはそれに相関関係を有する指標値に関する結果を示す図である。
　図１４は、光細胞毒性が陰性である化合物「ペニシリンＧ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ　Ｇ）」を被験物質として用いた比較光毒性試験方法により、比較例１において、非光照射のための（遮光）対照として測定された細胞毒性若しくはそれに相関関係を有する指標値に関する結果を示す図である。
　図１５は、光細胞毒性が陰性である化合物「キニーネ（Ｑｕｉｎｉｎｅ）」を被験物質として用いた比較光毒性試験方法により、比較例１において、非光照射のための（遮光）対照として測定された細胞毒性若しくはそれに相関関係を有する指標値に関する結果を示す図である。
　図１６は、光細胞毒性が陰性である化合物「ビチオノール（Ｂｉｔｈｉｏｎｏｌ）」を被験物質として用いた本発明光毒性試験方法により、比較例１において、非光照射のための（遮光）対照）として測定された細胞毒性若しくはそれに相関関係を有する指標値に関する結果を示す図である。
　図１７は、被験物質として、光細胞毒性が陰性である化合物「クロルヘキシジン（Ｃｈｌｏｒｈｅｘｉｄｉｎｅ）」を用いた本発明光毒性試験方法（比較例１：非光照射のための（遮光）対照）で測定された細胞毒性若しくはそれに相関関係を有する指標値に関する結果を示す図である。
　図１８は、光細胞毒性が陽性である化合物「クロルプロマジン（ＣＰＺ）」を被験物質として用いた比較光毒性試験方法により、比較例２において、光照射下に測定された細胞毒性若しくはそれに相関関係を有する指標値に関する結果を示す図である。
　図１９は、光細胞毒性が陰性である化合物「ペニシリンＧ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ　Ｇ）」を被験物質として用いた比較光毒性試験方法により、比較例２において、光照射条件下に測定された細胞毒性若しくはそれに相関関係を有する指標値に関する結果を示す図である。
　図２０は、光細胞毒性が陰性である化合物「キニーネ（Ｑｕｉｎｉｎｅ）」を被験物質として用いた比較光毒性試験方法により、比較例２において、光照射条件下に測定された細胞毒性若しくはそれに相関関係を有する指標値に関する結果を示す図である。
　図２１は、光細胞毒性が陰性である化合物「ビチオノール（Ｂｉｔｈｉｏｎｏｌ）」を被験物質として用いた比較光毒性試験方法により、比較例２において、光照射条件下に測定された細胞毒性若しくはそれに相関関係を有する指標値に関する結果を示す図である。
　図２２は、光細胞毒性が陰性である化合物「クロルヘキシジン（Ｃｈｌｏｒｈｅｘｉｄｉｎｅ）」を被験物質として用いた比較光毒性試験方法により、比較例２において、光照射条件下に測定された細胞毒性若しくはそれに相関関係を有する指標値に関する結果を示す図である。
　図２３は、光照射量の設定のための予備試験（実施例６）での結果を示す図である。ＯＥＣＤガイドラインで陽性対照として用いられているクロルプロマジン（ＣＰＺ）を用いて、光照射量と前述のＰＩＦ値（即ち、被験物質を接触させたヒト網膜色素上皮細胞における細胞毒性ＩＣ５０値（非光照射のための（遮光）対照）を、被験物質の接触後に擬似太陽光の照射下で培養されたヒト網膜色素上皮細胞における細胞毒性ＩＣ５０値で割って得られた値）との関係を検討したものである。
　図２４は、光照射量の設定のための予備試験（実施例６）での結果を示す図である。光照射量と前述のＰＩＦ値との関係を検討した予備試験に関連して、擬似太陽光の照射が、クロルプロマジン（ＣＰＺ）１０μｇ／ｍｌを接触させたヒト網膜色素上皮細胞において、擬似太陽光を遮光した条件下での前記細胞の生存細胞数に対して、当該擬似太陽光照射条件下での前記細胞の生存細胞数が有意に減少する光照射量を有する照射であることを確認したものである。縦軸は、擬似太陽光を遮光した条件下での生存細胞数を１としたときの、生存細胞数の相対比較値を示す。各光照射量ごとに、左側の棒グラフは擬似太陽光を遮光した条件下での生存細胞数の相対比較値を示し、右側の棒グラフは光照射条件下での生存細胞数の相対比較値を示す。
　以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。
　本発明における「形質転換体」とは、形質転換により作製された細胞等の生命体の全部又は一部を意味する。形質転換体としては、例えば、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞等を挙げることができる。形質転換体は、その対象に依存して、形質転換細胞、形質転換組織、形質転換宿主等とも呼ばれることがある。本発明において用いられる細胞は、形質転換体であってもよい。
　本発明に関連した、遺伝子操作技術で使用される原核生物細胞としては、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属等に属する原核生物細胞、より具体的には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ　ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ　ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ　ＤＨ１等を挙げることができる。このような細胞は、例えば、‘Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（３ｒｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ）’ｂｙ　Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ　ａｎｄ　Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．，Ａｐｐｅｎｄｉｘ　３（Ｖｏｌｕｍｅ３），Ｖｅｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｓｔｒａｉｎｓ．Ａ３．２（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　ＵＳＡ　２００１）に具体的に記載されている。
　本発明に関連した「ベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるベクターを意味する。このようなベクターとしては、例えば、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体若しくは植物個体等の宿主細胞において自立複製が可能であり、又は、染色体中への組込みが可能である、ポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているもの等を挙げることができる。
　このようなベクターのうち、クローニングに適したベクターを「クローニングベクター」と記すこともある。このようなクローニングベクターは、通常、制限酵素部位を複数含むマルチプルクローニング部位を含む。現在、遺伝子のクローニングに使用可能なベクターは、当該技術分野において多数存在しており、販売元により、微妙な違い（例えば、マルチクローニングサイトの制限酵素の種類や配列）から名前を代えて販売されている。例えば、‘Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（３ｒｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ）’　ｂｙ　Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ　ａｎｄ　Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．，Ａｐｐｅｎｄｉｘ　３（Ｖｏｌｕｍｅ　３），Ｖｅｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｓｔｒａｉｎｓ．Ａ３．２（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　ＵＳＡ，２００１））にその代表的なものが発売元とともに記載されており、このようなものを当業者は適宜目的に応じて使用することができる。
　本発明に関連した「ベクター」は、「発現ベクター」、「レポーターベクター」、「組換えベクター」も含む。「発現ベクター」とは、構造遺伝子及びその発現を調節するプロモーターに加えて種々の調節エレメントが宿主細胞の中で作動し得る状態で連結されている核酸配列を意味する。「調節エレメント」としては、例えば、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子のような選択マーカー、及び、エンハンサーを含むもの等を挙げることができる。生物（例えば、動物）の発現ベクターのタイプ及び使用される調節エレメントの種類が宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
　本発明に関連して「組換えベクター」としては、例えば、（ａ）ゲノムライブラリーのスクリーニングのためには、ラムダＦＩＸベクター（ファージベクター）、（ｂ）ｃＤＮＡのスクリーニングのためには、ラムダＺＡＰベクター（ファージベクター）、（ｃ）ゲノムＤＮＡのクローニングするためには、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ＋／−，ｐＧＥＭ，ｐＣＲ２．１ベクター（プラスミドベクター）等を挙げることができる。また「発現ベクター」としては、例えば、ｐＳＶ２／ｎｅｏベクター、ｐｃＤＮＡベクター、ｐＵＣ１８ベクター、ｐＵＣ１９ベクター、ｐＲｃ／ＲＳＶベクター、ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−Ｄｅｓｔベクター、ｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＤＥＳＴベクター、ｐＤＯＮ−ＡＩ−２／ｎｅｏベクター、ｐＭＥＩ−５／ｎｅｏベクター等（プラスミドベクター）等を挙げることができる。また「レポーターベクター」としては、例えば、ｐＧＬ２ベクター、ｐＧＬ３ベクター、ｐＧＬ４．１０ベクター、ｐＧＬ４．１１ベクター、ｐＧＬ４．１２ベクター、ｐＧＬ４．７０ベクター、ｐＧＬ４．７１ベクター、ｐＧＬ４．７２ベクター、ｐＳＬＧベクター、ｐＳＬＯベクター、ｐＳＬＲベクター、ｐＥＧＦＰベクター、ｐＡｃＧＦＰベクター、ｐＤｓＲｅｄベクター等を挙げることができる。このようなベクターは、前述のＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ誌を参考にして適宜利用すればよい。
　本発明に関連して、核酸分子を細胞内に導入する技術としては、例えば、形質転換、形質導入、トランスフェクション等を挙げることができる。このような導入技術としては、具体的には例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ　Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ．ら（１９８７）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ　Ｅｄ．及びその第三版，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社（１９９７）等に記載される方法等を挙げることができる。遺伝子が細胞内に導入されたことを確認する技術としては、例えば、ノーザンブロット分析、ウェスタンブロット分析又は他の周知慣用技術等を挙げることができる。
　また、本発明に関連して、ベクターの導入方法としては、例えば、トランスフェクション、形質導入、形質転換等（例えば、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法等）を挙げることができる。
　本発明光毒性試験方法は、下記工程（１）~（４）を有する光毒性試験方法である：
（１）ヒト網膜色素上皮細胞に被験物質を接触させる第一工程；
（２）第一工程で被験物質を接触させたヒト網膜色素上皮細胞を、第一工程における接触開始後２４時間以内に、３４０ｎｍから３８０ｎｍまでの範囲の波長分布を含む人工光を照射しながら培養する第二工程；
（３）第二工程で培養されたヒト網膜色素上皮細胞を回収し、回収された培養細胞での細胞毒性若しくはそれに相関関係を有する指標値を測定する第三工程；及び
（４）第三工程の測定結果によって被験物質の光毒性発現能力の有無又はその程度を評価し、被験物質の光毒性発現能力を検定する第四工程。
　本発明における「被験物質」としては、特に限定はなく、全ての化学物質が対象となるが、例えば、医薬品、農薬、化粧品、工業製品等の用途に使用される物質、今後使用される可能性がある開発途上の物質等を挙げることができる。
　本発明における「光毒性」としては、例えば、擬似太陽光照射が関与している毒性反応により惹起される毒性等を挙げることができる。具体的には、例えば、眼や皮膚等に生じる一次刺激反応としての光刺激性、アレルギー反応である光感作性（光アレルギー性）、光がん原性、更に光遺伝毒性（ｐｈｏｔｏｇｅｎｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）等を挙げることができる。
　本発明における「細胞毒性」としては、例えば、細胞死や細胞増殖阻害等細胞の生存に影響を与える毒性等を挙げることができる。細胞毒性若しくはそれに相関関係を有する指標値は、例えば、血球計算盤を用いる方法、セルカウンターによる方法、３Ｈチミジン等の放射性同位体を用いる方法（３Ｈチミジン等の放射性同位体を細胞培養液に加えてインキュベートするだけで、生細胞のみを測定する簡便な方法）、ＬＤＨ（乳酸脱水素酵素）法、ニュートラルレッド（ＮＲ）を用いる方法（赤色色素ニュートラルレッドが生細胞のリソゾームに取り込まれ蓄積する性質を利用した方法で、生細胞のみを測定する簡便な方法）、クリスタルバイオレット（ＣＲ）を用いる方法（クリスタルバイオレットが生細胞の細胞膜に入り込んで染色する性質を利用した方法で、生細胞のみを測定する簡便な方法）、テトラゾリウム塩を用いる方法（テトラゾリウム塩が細胞内ミトコンドリアの脱水素酵素の基質であり、生存能の高い細胞ほど還元されるテトラゾリウム塩の量が多く、その結果生じるホルマザン量が生存細胞数とよく対応するために、生細胞のみを測定する簡便な方法）、マーカー遺伝子（例えば、ＲＰＥ６５、Ｍｉｔｆ、ＺＯ１）の発現量を測定する方法、ＡＴＰ量を測定する方法、メラニン量を測定する方法、ミトコンドリアの活性をＭＴＴ法により測定する方法等の通常用いられる方法により測定すればよい。被験物質の「接触」と「洗浄・培地交換」との繰り返し等により被験物質の反復接触を行なうときには、各サイクルで回収された培養細胞での細胞毒性若しくはそれに相関関係を有する指標値を測定することが好ましい。
　上記のような、細胞毒性若しくはそれに相関関係を有する指標値を測定する場合には、一般的に入手可能な測定キットを用いて測定してもよい。ミトコンドリアの活性、ＡＴＰ量、乳酸脱水素酵素活性等の測定キットとしては、例えば、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）　Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ａｓｓａｙ、Ｄｕａｌ−Ｇｌｏ（登録商標）　Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍ、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（登録商標）　Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍ、Ｓｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ（登録商標）　Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍ、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＡｐｏＴｏｘ−Ｇｌｏ（登録商標）　Ｔｒｉｐｌｅｘ　Ａｓｓａｙ、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｆｌｕｏｒ（登録商標）　Ｃｅｌｌ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ａｓｓａｙ、ＣｙｔｏＴｏｘ　９６（登録商標）　Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　Ａｓｓａｙ（プロメガ社）、ＡＴＰ　Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ　ＨＳ　ＩＩ　Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　Ｉ（ＭＴＴ）、Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　ＩＩ（ＸＴＴ）（ロシュ社）、ＬＤＨ　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（Ｃａｙｍａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）、ＡＤＰ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ、ＥｎｚｙＬｉｇｈｔ（ＢｉｏＡｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社）等を挙げることができる。
　本発明光毒性試験方法において、細胞毒性若しくはそれに相関関係を有する指標値として、マーカー遺伝子（例えば、ＲＰＥ６５、Ｍｉｔｆ、ＺＯ１）の発現量を測定する方法を採用する場合について更に詳細に説明する。
　まず「マーカー遺伝子の発現」とは、マーカー遺伝子に応じて発現されたポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド若しくは核酸、又は、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド若しくはペプチド等の発現を包含する。
　マーカー遺伝子の発現量を測定する方法としては、目的の細胞等において、例えば、ｍＲＮＡの転写産物量やポリペプチドの翻訳産物量を測定する方法等を挙げることができる。ｍＲＮＡの発現量（転写産物量）を測定する方法としては、例えば、ノーザンブロット法、ドットブロット法、ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、レポーター遺伝子を利用した方法等の分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法等を挙げることができる。またポリペプチドの発現量（翻訳産物量）を測定する方法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法等の免疫学的測定方法を含む任意の適切な方法等を挙げることができる。遺伝子の発現変動は、通常の分子生物学的測定方法又は免疫学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価されるｍＲＮＡレベル又はポリペプチドのタンパク質レベルでの発現量が増加又は減少することを意味する。また、他の方法として、アレイ（例えば、ＤＮＡアレイ、プロテインアレイ）を用いた遺伝子解析方法等も挙げることができる。ＤＮＡアレイについては、例えば、秀潤社編、細胞工学別冊「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」等、プロテインアレイについては、Ｎａｔ　Ｇｅｎｅｔ．２００２　Ｄｅｃ；３２　Ｓｕｐｐｌ：５２６−３２等に記載されている。更に、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＡＣＥ法、ＳＳＣＰ法、免疫沈降法、ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄシステム、インビトロ翻訳等も挙げることできる。このような方法については、例えば、ゲノム解析実験法・中村祐輔ラボ・マニュアル、編集・中村祐輔　羊土社（２００２）等に記載されている。
　レポーター遺伝子を利用した方法としては、マーカー遺伝子のプロモーター配列に作動可能に連結されるレポーター遺伝子を組み込んだベクターを作製し、それをヒト網膜色素上皮細胞に遺伝子導入することにより、安定形質転換体を作製する方法等を挙げることができる。作製された安定形質転換体は、レポーター遺伝子を細胞内で発現するため、レポーター遺伝子の活性や発現量を測定すれば、当該測定値を生存しているヒト網膜色素上皮細胞の量に相関関係を有する指標値として利用することができる。
　ここで「レポーター遺伝子」としては、例えば、ホタルルシフェラーゼ遺伝子（ｆｉｒｅｆｌｙ　ｌｕｃ）、ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子（ｒｅｎｉｌｌａ　ｌｕｃ）、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、又は、核酸構築物が導入される宿主細胞での視覚での選択を可能にする選択マーカー遺伝子を挙げることができる。このような選択マーカー遺伝子としては、例えば、緑色蛍光プロテイン（ＧＦＰ）遺伝子、青色蛍光プロテイン（ＣＦＰ）遺伝子、黄色蛍光プロテイン（ＹＦＰ）遺伝子、赤色蛍光プロテイン（ｄｓＲｅｄ）遺伝子等の生細胞での観察が可能な蛍光色素マーカー遺伝子又は色素マーカー遺伝子等を挙げることができる。上記選択マーカー遺伝子及び選択マーカータンパク質は、宿主細胞に対して実質的に毒性を示さないことが好ましい。また、レポーター遺伝子の発現有無又はその程度を検出する方法としては、選択マーカータンパク質が酵素である場合も、蛍光プロテインである場合も、公知の検出方法等を利用すればよい。
　「プロモーター」とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節するＤＮＡ上の領域を意味する。通常、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を始める塩基配列である。「プロモーター配列」とは、ある遺伝子のプロモーターの働きを有する部分をいう。プロモーター配列は、通常、推定タンパク質コード領域の第１エクソン又は転写開始点の上流約５ｋｂｐ以内の領域であることが多いので、ＤＮＡ解析用ソフトウェアを用いてゲノム塩基配列中のタンパク質コード領域を予測すれば、プロモーター配列を推定することができる。このようなＤＮＡ解析用ソフトウェアとしては、例えば、ＤＮＡＳＩＳソフトウェア（日立ソフトウェア）、ＧＥＮＥＴＹＸ（株式会社ゼネティックス）等を挙げることができる。推定プロモーター配列は、構造遺伝子毎に異なり、通常、構造遺伝子の上流に存在するが、これらに限定されず、構造遺伝子の下流に存在することもある。
　上記の領域には、Ｓｐ１及びＡＰ−２等の既知転写調節因子の結合可能配列が存在し、当該領域が発現制御に重要な働きをすることが予想される。このことから少なくとも当該領域に転写を誘導するために必要十分な塩基配列（プロモーター配列）を含むと推測される。正確な位置は、当該技術分野において周知慣用な技術を用いて調べればよい。
　プロモーター配列と予測されるＤＮＡ配列とを、ＮＣＢＩデータベースより入手する方法を説明する。
　ヒトＺＯ−１（ＴＪＰ１）遺伝子のプロモーター配列を含むと予測される転写開始点上流のゲノムＤＮＡ配列に関しては、インターネット上のＭＣＳＣ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｂｒｏｗｓｅｒホームページで、ｈｕｍａｎ　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅを検索対象データベースとして設定し、「ＴＪＰ１」をキーワードとして検索することにより、ＴＪＰ１遺伝子に関するＳｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｌｉｎｋｓ　ｔｏ　Ｔｏｏｌｓ　ａｎｄ　Ｄａｔａｂａｓｅｓのリンク一覧が表示される。このリンク先から、「Ｇｅｎｏｍｉｃ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｎｅａｒ　Ｇｅｎｅ」ページへ移動する。次に、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ　Ｒｅｇｉｏｎ　Ｏｐｔｉｏｎｓのチェックボックスにチェックを入れ、「Ｐｒｏｍｏｔｅｒ／Ｕｐｓｔｒｅａｍ　ｂｙ」を５０００ｂａｓｅｓに設定し、更に「５’ＵＴＲ　Ｅｘｏｎｓ」のチェックボックスにチェックを入れた後、ｓｕｂｍｉｔボタンをクリックすることにより、転写開始点上流５ｋｂと第一エクソンを含む５’ＵＴＲのゲノムＤＮＡ配列を取得することができる。また、ＮＣＢＩホームページ上で「ＴＪＰ１」をキーワードとして検索することにより、ＮＭ＿００３２５７．３なる登録番号を取得することができ、ＴＪＰ１のｍＲＮＡ配列を入手することができる。これらのゲノム配列とｍＲＮＡ配列とを、ＤＮＡ解析用ソフトウェアを用いて分析することにより、転写開始点より上流の約５ｋｂｐのＤＮＡ配列を入手することができる。ＤＮＡ解析用ソフトウェアとしては、前述のように、例えば、ＤＮＡＳＩＳソフトウェア（日立ソフトウェア）、ＧＥＮＥＴＹＸ（株式会社ゼネティックス）等を挙げることができる。
　「プロモーター配列に作動可能に連結される」とは、所望の遺伝子の発現（作動）があるプロモーター配列の制御下に配置されることを意味する。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、必ずしも隣接して配置される必要はない。
　本発明における「ヒト網膜色素上皮細胞」とは、例えば、ヒト由来の細胞であって、網膜の外層に位置する上皮細胞である。当該細胞は、視細胞の維持に重要な働きをもつ細胞である。形状は単層の立方上皮細胞であり、相互間はｔｉｇｈｔ　ｊｕｎｃｔｉｏｎで結合され、黒色の色素を有する細胞である。
　当該ヒト網膜色素上皮細胞としては、培養可能であれば特に制限はない。好ましい実施形態では、具体的には例えば、幹細胞由来の網膜色素上皮細胞（即ち、例えば、胚性幹細胞（即ち、ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（即ち、ｉＰＳ細胞）、神経幹細胞等の幹細胞から分化誘導させた培養が容易なヒト網膜色素上皮細胞等）、生体組織から直接取得した培養が容易なヒト網膜色素上皮細胞等を挙げることができる。また、培養細胞化されたがん細胞由来のヒト網膜色素上皮細胞、人為的な操作により不死化された培養が容易なヒト網膜色素上皮細胞等も挙げることができる。
　ここで「幹細胞」とは、細胞分裂を経ても同じ分化能を維持する細胞を意味し、組織が傷害を受けたときにその組織を再生することができる。当該「幹細胞」としては、例えば、胚性幹細胞若しくは組織幹細胞（組織性幹細胞、組織特異的幹細胞又は体性幹細胞とも呼ばれる。）又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞：ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ）等を挙げることができる。
　本発明光毒性試験方法において使用される好ましい幹細胞としては、例えば、胚性幹細胞（即ち、ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（即ち、ｉＰＳ細胞）、神経幹細胞等を挙げることができる。
　「胚性幹細胞」（即ち、ＥＳ細胞）とは、自己複製能を有し、多分化能（即ち、多能性「ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ」）を有する幹細胞であり、初期胚に由来する多能性幹細胞を意味する。胚性幹細胞は、１９８１年に初めて樹立され、１９８９年以降ノックアウトマウス作製にも応用されている。１９９８年にはヒト胚性幹細胞が樹立されており、再生医学にも利用されつつある。神経幹細胞等を含む組織幹細胞は、胚性幹細胞とは異なり、分化の方向が限定されている細胞であり、組織中の特定の位置に存在し、未分化な細胞内構造をしている。従って、組織幹細胞は多能性のレベルが低い。組織幹細胞は、核／細胞質比が高く、細胞内小器官が乏しい。組織幹細胞は、概して、多分化能を有し、細胞周期が遅く、個体の一生以上に増殖能を維持する。人工多能性幹細胞は繊維芽細胞等分化した細胞をＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｒ４、Ｍｙｃ等数種類の遺伝子の発現により直接初期化して多分化能を誘導した細胞であり、２００６年、山中らによりマウス細胞で樹立された（Ｔａｋａｈａｓｈｉ　Ｋ，Ｙａｍａｎａｋａ　Ｓ．Ｃｅｌｌ．２００６，１２６（４），ｐ６６３−６７６）。２００７年、ヒト繊維芽細胞でも樹立され、胚性幹細胞と同様に多分化能を有する（Ｔａｋａｈａｓｈｉ　Ｋ，Ｔａｎａｂｅ　Ｋ，Ｏｈｎｕｋｉ　Ｍ，Ｎａｒｉｔａ　Ｍ，Ｉｃｈｉｓａｋａ　Ｔ，Ｔｏｍｏｄａ　Ｋ，Ｙａｍａｎａｋａ　Ｓ．Ｃｅｌｌ．２００７，１３１（５），ｐ８６１−８７２．、Ｙｕ　Ｊ，Ｖｏｄｙａｎｉｋ　ＭＡ，Ｓｍｕｇａ−Ｏｔｔｏ　Ｋ，Ａｎｔｏｓｉｅｗｉｃｚ−Ｂｏｕｒｇｅｔ　Ｊ，Ｆｒａｎｅ　ＪＬ，Ｔｉａｎ　Ｓ，Ｎｉｅ　Ｊ，Ｊｏｎｓｄｏｔｔｉｒ　ＧＡ，Ｒｕｏｔｔｉ　Ｖ，Ｓｔｅｗａｒｔ　Ｒ，Ｓｌｕｋｖｉｎ　ＩＩ，Ｔｈｏｍｓｏｎ　ＪＡ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００７，３１８（５８５８），ｐ１９１７−１９２０．、Ｎａｋａｇａｗａ　Ｍ，Ｋｏｙａｎａｇｉ　Ｍ，Ｔａｎａｂｅ　Ｋ，Ｔａｋａｈａｓｈｉ　Ｋ，Ｉｃｈｉｓａｋａ　Ｔ，Ａｏｉ　Ｔ，Ｏｋｉｔａ　Ｋ，Ｍｏｃｈｉｄｕｋｉ　Ｙ，Ｔａｋｉｚａｗａ　Ｎ，Ｙａｍａｎａｋａ　Ｓ．Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００８，２６（１），ｐ１０１−１０６）。
　本発明光毒性試験方法における第一工程は、ヒト網膜色素上皮細胞に被験物質を接触させる工程である。
　上記第一工程では、ヒト網膜色素上皮細胞に被験物質を接触させる。ヒト網膜色素上皮細胞と被験物質との接触時間として、例えば、１分間以上を、好ましくは５分間以上３日間以内、より好ましくは１０分間以上２４時間以内等を挙げることができる。当該接触時の保温温度としては、例えば、１５℃~４２℃程度を、好ましくは３５℃~４２℃程度、より好ましくは３５℃~３７℃程度、特に好ましくは３７℃程度等を挙げることができる。また、前記接触が培養液中での接触である場合には、当該培養液のｐＨとしては、例えば、ｐＨ５~ｐＨ９程度を、好ましくはｐＨ６．５~ｐＨ７．８程度を挙げることができる。
　上記第一工程における被験物質接触時の炭酸ガス濃度としては、例えば、０％~２５％程度等を挙げることができる。
　上記第一工程における被験物質接触時の好ましい湿度としては、例えば、９５±５％ｒｈ程度、より好ましくは１００％ｒｈ程度等を挙げることができる。
　ヒト網膜色素上皮細胞に接触させる被験物質の濃度及び適用量については、特に限定はなく、被験物質の種類、予想される被験物質の光毒性発現能力、第一工程でのヒト網膜色素上皮細胞と被験物質との接触時間、第二工程での培養時間、第二工程での光照射量等によって適宜決定すればよい。例えば、０．００１μＭ~１０ｍＭ程度で、好ましくは０．０１μＭ~５ｍＭ程度等を挙げることができる。
　上記第一工程における接触系内でのヒト網膜色素上皮細胞の密度としては、例えば、１×１０４ｃｅｌｌ／ｃｍ２~４×１０６ｃｅｌｌ／ｃｍ２程度で、好ましくは４×１０４ｃｅｌｌ／ｃｍ２~４×１０５ｃｅｌｌ／ｃｍ２程度等を挙げることができる。
　本発明光毒性試験方法における第二工程は、第一工程で被験物質を接触させたヒト網膜色素上皮細胞を、第一工程における接触開始後２４時間以内に、３４０ｎｍから３８０ｎｍまでの範囲の波長分布を含む人工光を照射しながら培養する工程である。
　上記第二工程では、第一工程で被験物質を接触させたヒト網膜色素上皮細胞を、第一工程における接触開始後２４時間以内に、３４０ｎｍから３８０ｎｍまでの範囲の波長分布を含む人工光を照射しながら培養する。そして、被験物質が光毒性発現能力を有する場合には、本工程でその光毒性発現能力を発現させることができる。このとき、前記人工光を吸収する色素や、被験物質を吸着する可能性がある血清等のタンパク質成分を含まない培養液を使用することが好ましい。
　好ましい実施形態では、第一工程における接触開始後１２時間以内、より好ましくは６時間以内、特に好ましくは１０分間~２時間程度以内に、３４０ｎｍから３８０ｎｍまでの範囲の波長分布を含む人工光を照射しながら培養する。
　本発明検定方法における好ましい実施形態では、上記第一工程（即ち、被験物質との接触）と上記第二工程（即ち、人工光照射下での培養）とが併行して進行しながら実施されてもよい。より具体的には、第一工程で接触させた被験物質を除去した状態で第二工程を実施してもよいし、被験物質が存在した状態で第二工程を実施してもよい。
　第一工程における接触開始後から第二工程における人工光の照射開始前までの期間において、第一工程で被験物質を接触させたヒト網膜色素上皮細胞は、例えば、１５℃~４２℃程度を、好ましくは３５℃~４２℃程度、より好ましくは３５℃~３７℃程度、特に好ましくは３７℃程度等の培養温度下でかつ人工光の非照射下で培養しておけばよい。また第一工程における被験物質のヒト網膜色素上皮細胞に対する２４時間以内の接触の後、当該培養細胞を洗浄・培地交換してから第二工程における人工光の照射に供することによって、細胞外にある被験物質の影響を排除し、第一工程において細胞内にとりこまれた被験物質の作用のみを評価することもできる。
　上記第二工程における培養時の炭酸ガス濃度としては、例えば、０％~２５％程度等を挙げることができる。
　上記第二工程における培養時の湿度としては、例えば、９５±５％ｒｈ程度、好ましくは１００％ｒｈ程度等を挙げることができる。
　照射する人工光は、３４０ｎｍから３８０ｎｍまでの範囲の波長分布を含む人工光である。好ましくは、例えば、紫外光、可視光及び赤外光からなる擬似太陽光である人工光等を挙げることができる。より好ましくは、例えば、３０５ｎｍ未満の波長の紫外光と８５０ｎｍ以上の波長の赤外光とを含まず、且つ、３１５ｎｍから８００ｎｍまでの範囲の波長分布を有する光を含む疑似太陽光等が挙げられる。
　前記人工光としては、例えば、紫外線ランプ、水銀ランプ、ハロゲンランプ、ＬＥＤ、キセノンランプ、メタルハライドランプ、ナトリウムランプ等を光源とした光等が挙げられる。好ましくは、例えば、キセノンランプ、水銀ランプ等を光源とした紫外光や擬似太陽光等を挙げることができる。より好ましくは、例えば、キセノンランプ、水銀ランプ等を光源とした擬似太陽光等が挙げられる。必要に応じて特定の波長のみを通過させるフィルタや特定の波長を遮断するフィルタ等を用いて、所望の波長分布を有する人工光に調整してから使用すればよい。
　因みに、擬似太陽光を照射するための具体的な光照射装置として、例えば、ＳＯＬ５００、ＳＯＬ１２００、ＳＯＬ２０００（Ｄｒ．Ｋ．Ｈｏｎｌｅ　Ｍｅｄｉｚｉｎｔｅｃｈｎｉｋ社）、ＳＵＮＴＥＳＴ　ＣＰＳ／ＣＰＳ＋、ＳＵＮＴＥＳＴ　ＸＬＳ＋（Ａｔｌａｓ　Ｍａｔｅｒｉａｌ　Ｔｅｓｔｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、ＳＸＬ−２５００Ｖ２、ＸＩ−０１Ｂ１４０ＫＢ１（セリック社）を挙げることができる。
　上記第二工程に関して、被験物質が存在した状態で第二工程を実施する場合には、被験物質の「人工光照射下での接触時間」を調節することもできる。即ち、培養時間及び人工光の光照射量を適宜設定することにより、所望の「人工光照射下での接触時間」を実現することができる。人工光の照射は、連続的又は間欠的に行なうことができる。人工光の照射を連続的に行なう場合には、培養時間が「人工光照射下での接触時間」に相当する。例えば、連続的な人工光照射の下で、１５分間、３０分間、１時間又は２時間培養することにより、１５分間、３０分間、１時間又は２時間の「人工光照射下での接触時間」を実現することができる。一方、人工光の照射を間欠的に行なう場合には、人工光の照射時間が「人工光照射下での接触時間」に相当する。例えば、２４時間の培養期間中、最初の１２時間を人工光の照射下で培養し、残りの１２時間を人工光を遮断した状態で培養することにより、１２時間の「人工光照射下での接触時間」を実現することができる。
　ヒト網膜色素上皮細胞の培養温度としては、例えば、１５℃~４２℃程度を挙げることができる。
　上記第二工程に関して、３４０ｎｍから３８０ｎｍまでの範囲の波長分布を含む人工光を照射する際の好ましい光照射量としては、例えば、波長３６０ｎｍでの測定値として３Ｊ／ｃｍ２から３０Ｊ／ｃｍ２までの範囲である光照射量等を挙げることができる。このような所望の「光照射量」を得るには、例えば、人工光の光照射強度及び人工光の光照射時間等を適宜設定すればよい。光照射量（Ｊ／ｃｍ２）は、例えば、時間（分）×光照射強度（ｍＷ／ｃｍ２）×６０÷１０００という数式により算出すればよい。具体的には例えば、波長３６０ｎｍでの測定値で約２．０８ｍＷである光照射強度の人工光を４０分間照射することにより、約５Ｊ／ｃｍ２の光照射量になることが判る。
　好ましい実施形態では、人工光の照射として、例えば、被験物質を接触させたヒト網膜色素上皮細胞と対照のヒト網膜色素上皮細胞との少なくともいずれか一方のヒト網膜色素上皮細胞において、人工光を遮光した条件下での前記細胞の生存細胞数に対して、光照射条件下での前記細胞の生存細胞数が有意に減少する光照射量を有する照射等を挙げることができる。このような好ましい光照射量の設定には、例えば、後述する実施例６に記載される方法等に順じて予備試験を実施すればよく、好ましい光照射量であることを容易に確認することができる。
　より具体的な実施形態では、人工光の照射として、例えば、波長３６０ｎｍでの測定値として３Ｊ／ｃｍ２から３０Ｊ／ｃｍ２までの範囲である擬似太陽光の光照射量となるような光照射等を挙げることができる。より好ましくは、例えば、波長３６０ｎｍでの測定値として３．５Ｊ／ｃｍ２から２０Ｊ／ｃｍ２までの範囲である擬似太陽光の光照射量となるような照射等が挙げられる。特に好ましくは、例えば、波長３６０ｎｍでの測定値として５Ｊ／ｃｍ２から１０Ｊ／ｃｍ２までの範囲である擬似太陽光の光照射量となるような照射等を挙げることができる。
　以上の光を照射することにより、より確実に被験物質の光毒性発現能力を発現させることができる。
　本発明光毒性試験方法における第三工程は、第二工程で培養されたヒト網膜色素上皮細胞を回収し、回収された培養細胞での細胞毒性若しくはそれに相関関係を有する指標値を測定する工程である。
　上記第三工程では、第二工程で培養されたヒト網膜色素上皮細胞における回収された培養細胞での細胞毒性若しくはそれに相関関係を有する指標値を測定する。
　培養細胞での細胞毒性若しくはそれに相関関係を有する指標値は、前述の通り、例えば、血球計算盤を用いる方法、セルカウンターによる方法、３Ｈチミジン等の放射性同位体を用いる方法（３Ｈチミジン等の放射性同位体を細胞培養液に加えてインキュベートするだけで、生細胞のみを測定する簡便な方法）、ＬＤＨ（乳酸脱水素酵素）法、ニュートラルレッド（ＮＲ）を用いる方法（赤色色素ニュートラルレッドが生細胞のリソゾームに取り込まれ蓄積する性質を利用した方法で、生細胞のみを測定する簡便な方法）、クリスタルバイオレット（ＣＲ）を用いる方法（クリスタルバイオレットが生細胞の細胞膜に入り込んで染色する性質を利用した方法で、生細胞のみを測定する簡便な方法）、テトラゾリウム塩を用いる方法（テトラゾリウム塩が細胞内ミトコンドリアの脱水素酵素の基質であり、生存能の高い細胞ほど還元されるテトラゾリウム塩の量が多く、その結果生じるホルマザン量が生存細胞数とよく対応するために、生細胞のみを測定する簡便な方法）、マーカー遺伝子（例えば、ＲＰＥ６５、Ｍｉｔｆ、ＺＯ１）の発現量を測定する方法、ＡＴＰ量を測定する方法、メラニン量を測定する方法、ミトコンドリアの活性をＭＴＴ法により測定する方法等の通常用いられる方法により測定すればよい。被験物質の「接触」と「洗浄・培地交換」との繰り返し等により被験物質の反復接触を行なうときには、各サイクルで回収された培養細胞での細胞毒性若しくはそれに相関関係を有する指標値を測定することが好ましい。
　本発明光毒性試験方法における第四工程は、第三工程の測定結果によって被験物質の光毒性発現能力の有無又はその程度を評価し、被験物質の光毒性発現能力を検定する工程である。
　上記第四工程では、第三工程の測定結果によって被験物質の光毒性発現能力の有無又はその程度を評価し、被験物質の光毒性発現能力を検定する。被験物質の光毒性発現能力の有無又はその程度を評価する際、対照を設定せずに第三工程の測定結果の絶対値で評価してもよいし、対照を設定し、その測定結果との比較で評価してもよい。
　好ましい実施形態では、上記第三工程の測定結果と、対照のヒト網膜色素上皮細胞における回収された培養細胞での細胞毒性若しくはそれに相関関係を有する指標値の測定結果とを比較し、その差異に基づいて被験物質の光毒性発現能力の有無又はその程度を評価する。ここで、「対照」には陰性対照及び陽性対照の両方が設定可能である。陰性対照の例としては、人工光を照射せずに培養するヒト網膜色素上皮細胞群、光照射量が弱い人工光の照射下で培養するヒト網膜色素上皮細胞群、光毒性発現能力を有さないことが予め分かっている物質（例えば、溶媒のみ）を接触させるヒト網膜色素上皮細胞群、等が挙げられる。このような陰性対照を用いる場合には、以下のような検定が可能となる。すなわち、被験物質における回収された培養細胞での細胞毒性若しくはそれに相関関係を有する指標値の測定結果と、陰性対照における回収された培養細胞での細胞毒性若しくはそれに相関関係を有する指標値の測定結果とを比較する。そして、被験物質における回収された培養細胞での細胞毒性若しくはそれに相関関係を有する指標値の方が低い場合には、当該被験物質は光毒性発現能力を有すると評価し、検定することもできる。
　さらに好ましい実施形態では、前記対照は、ヒト網膜色素上皮細胞に既知の光毒性発現物質を接触させた陽性対照を含む。陽性対照の例としては、光毒性発現能力を有することが予め分かっている基準物質を接触させて、人工光の照射下で培養するヒト網膜色素上皮細胞群が挙げられる。このような陽性対照を用いる場合には、以下のような検定が可能となる。すなわち、被験物質における回収された培養細胞での細胞毒性若しくはそれに相関関係を有する指標値の測定結果と、陽性対照における回収された培養細胞での細胞毒性若しくはそれに相関関係を有する指標値の測定結果とを比較する。そして、被験物質における回収された培養細胞での細胞毒性若しくはそれに相関関係を有する指標値の方が低い場合には、当該被験物質は陽性対照で用いた基準物質よりも高い光毒性発現能力を有すると評価し、検定することもできる。さらに、当該基準物質の各濃度又は各適用量において同様に評価し、検定することにより、当該被験物質の光毒性発現能力を定量的に評価し、検定することができる。この際、陽性対照と上記の陰性対照とを併用して設定してもよい。また、陽性対照の回収された培養細胞での細胞毒性若しくはそれに相関関係を有する指標値が陰性対照のそれよりも低いことをもって、人工光の照射が正しく行われ、試験が成立したことを示すこともできる。
　さらに好ましい実施形態では、クロルプロマジン（ＣＰＺ）を基準物質として陽性対照に用いる。
　本発明光毒性試験方法のための、クロルプロマジン（ＣＰＺ）の陽性対照としての使用も、本発明の１つである。さらに、本発明光毒性試験方法のための、クロルプロマジン（ＣＰＺ）の陽性対照としての使用も、本発明の１つである。
　本発明の陽性対照試薬の１つの様相は、本発明光毒性試験方法に用いるための陽性対照試薬であって、クロルプロマジン（ＣＰＺ）を含有する。試薬の形状としては、クロルプロマジン（ＣＰＺ）をそのまま用いてもよいし、溶媒に溶かして溶液状としてもよい。さらに、適宜の基剤に含有又は分散させた形状でもよい。
　さらに好ましい実施形態では、ペニシリンＧ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ　Ｇ）、キニーネ（Ｑｕｉｎｉｎｅ）、ビチオノール（Ｂｉｔｈｉｏｎｏｌ）又はクロルヘキシジン（Ｃｈｌｏｒｈｅｘｉｄｉｎｅ）を基準物質として陰性対照に用いる。
　本発明光毒性試験方法のための、ペニシリンＧ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ　Ｇ）、キニーネ（Ｑｕｉｎｉｎｅ）、ビチオノール（Ｂｉｔｈｉｏｎｏｌ）又はクロルヘキシジン（Ｃｈｌｏｒｈｅｘｉｄｉｎｅ）の陰性対照としての使用も、本発明の１つである。さらに、本発明光毒性試験方法のための、ペニシリンＧ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ　Ｇ）、キニーネ（Ｑｕｉｎｉｎｅ）、ビチオノール（Ｂｉｔｈｉｏｎｏｌ）又はクロルヘキシジン（Ｃｈｌｏｒｈｅｘｉｄｉｎｅ）の陰性対照としての使用も、本発明の１つである。
　本発明の陰性対照試薬の１つの様相は、本発明光毒性試験方法に用いるための陰性対照試薬であって、ペニシリンＧ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ　Ｇ）、キニーネ（Ｑｕｉｎｉｎｅ）、ビチオノール（Ｂｉｔｈｉｏｎｏｌ）又はクロルヘキシジン（Ｃｈｌｏｒｈｅｘｉｄｉｎｅ）を含有する。試薬の形状としては、ペニシリンＧ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ　Ｇ）、キニーネ（Ｑｕｉｎｉｎｅ）、ビチオノール（Ｂｉｔｈｉｏｎｏｌ）又はクロルヘキシジン（Ｃｈｌｏｒｈｅｘｉｄｉｎｅ）をそのまま用いてもよいし、溶媒に溶かして溶液状としてもよい。さらに、適宜の基剤に含有又は分散させた形状でもよい。
　さらに、より具体的な好ましい比較及び評価に関する実施形態として下記の方法も挙げることができる。例えば、被験物質を接触させたヒト網膜色素上皮細胞における細胞毒性ＩＣ５０値（非光照射のための（遮光）対照）を、被験物質の接触開始後２４時間以内に人工光の照射下で培養されたヒト網膜色素上皮細胞における細胞毒性ＩＣ５０値で割って得られた値（ＰＩＦ値：Ｐｈｏｔｏ　Ｉｒｒｉｔａｔｉｏｎ　Ｆａｃｏｒ値）を求め、当該値（ＰＩＦ値）が２より大きく、５より小さい場合には擬陽性、５以上の場合には、被験物質は光毒性陽性であると評価する。
　本発明光毒性発現物質探索方法は、本発明光毒性試験方法によって、被験物質の光毒性発現能力を検定し、所望の光毒性発現能力を有する物質を選抜するものである。本発明光毒性発現物質探索方法においても、上記した本発明光毒性試験方法と同様の実施形態をとることができる。例えば、上記の陰性対照を用いる場合には、被験物質における回収された培養細胞での細胞毒性若しくはそれに相関関係を有する指標値の測定結果と、陰性対照における回収された培養細胞での細胞毒性若しくはそれに相関関係を有する指標値の測定結果とを比較する。そして、回収された培養細胞での細胞毒性若しくはそれに相関関係を有する指標値が、陰性対照よりも統計学的に有意に低い被験物質を選抜するか、又は、回収された培養細胞での細胞毒性若しくはそれに相関関係を有する指標値が陰性対照の５０％以下の値となる被験物質を選抜すればよい。
　一方、クロルプロマジン（ＣＰＺ）等の陽性対照が用いられる場合には、被験物質における回収された培養細胞での細胞毒性若しくはそれに相関関係を有する指標値の測定結果と、陽性対照における回収された培養細胞での細胞毒性若しくはそれに相関関係を有する指標値の測定結果とを比較する。そして、回収された培養細胞での細胞毒性若しくはそれに相関関係を有する指標値が陽性対照よりも統計学的に有意に低い被験物質を選抜するか、又は、回収された培養細胞での細胞毒性若しくはそれに相関関係を有する指標値が陽性対照と同じ値である時の被験物質の濃度が陽性対照の濃度よりも低い被験物質を選抜することにより、陽性対照で用いられた基準物質よりも高い光毒性発現能力を有する物質を選抜することができる。また、陽性対照が用いられる場合には、回収された培養細胞での細胞毒性若しくはそれに相関関係を有する指標値を定量的に評価し、検定することもできる。具体的には、クロルプロマジン（ＣＰＺ）等の基準物質の各濃度又は各適用量において、被験物質に対して同様に評価し、検定することにより、被験物質の光毒性発現能力を定量的に評価し、検定することができる、そして、所望の光毒性発現能力をする物質を選抜する。
　本発明擬似太陽光皮膚刺激非誘発物質探索方法は、本発明光毒性試験方法によって、被験物質の光毒性発現能力を検定し、所望の光毒性発現能力を有さない物質を選抜するものである。本発明擬似太陽光皮膚刺激非誘発物質探索方法においても、上記した本発明光毒性試験方法と同様の実施形態をとることができる。探索の対象となる被験物質は、所望の光毒性発現能力を有さない物質であれば何でもよく、例えば、低分子化合物、蛋白質、ペプチド等が挙げられる。
　本発明光毒性試験方法に基づくシステム工程を有する装置によれば、被験物質の光毒性発現能力の検定をより効率的に行なうことができ、所望の光毒性発現物質又は擬似太陽光皮膚刺激非誘発物質をより簡便に探索することもできる。また、本発明光毒性試験方法によって得られた擬似太陽光皮膚刺激性に関する毒性情報を電子情報記録媒体に記録することにより、毒性情報を包含する有用な電子情報記録媒体を作製することができる。
　以下、本発明を実施例によりさらに詳しく説明する。
実施例１　（ヒトＥＳ細胞のヒト網膜色素上皮細胞への分化誘導）
　ヒト胚性幹細胞（即ち、ＥＳ細胞）として、京都大学樹立株であるＫｈＥＳ−１株を用いた。
　前記ＫｈＥＳ−１株を、ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子：ｂａｓｉｃ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）が添加されたヒトＥＳ細胞維持培養用培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＫＳＲ（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ　ｓｅｒｕｍ　ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）、非必須アミノ酸、Ｌ−グルタミン、２−メルカプトエタノール等を含む）において、マイトマイシンＣ処理したマウス胚性線維芽細胞（ｍｏｕｓｅ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ：ＭＥＦ）フィーダー細胞上で未分化維持培養した。培養後、トリプシン／コラゲナーゼＩＶを含む解離液を用いて培養皿から回収することにより、ヒト胚性幹細胞（即ち、ＥＳ細胞）のコロニーを得た。
　得られたコロニーを、マイクロピペットを用いてピペッティングすることにより、１細胞塊あたり数十細胞程度の大きさに砕いた後、予め０．１％ゼラチン液でコートしておいた１０ｃｍ培養皿に、１μＭ~１０μＭ　ＳＢ４３１５４２，１μＭ~１０μＭ　ＣＫＩ−７、１μＭ~１０μＭ　Ｙ２７６３２を含むヒトＥＳ細胞維持培養用培地１０ｍｌに、数百から数千細胞塊程度のヒト胚性幹細胞（即ち、ＥＳ細胞）のコロニーを播種し、次いで、これを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で培養した。
　翌日（培養１日間）、浮遊している細胞塊を吸わないように、半分量（５ｍｌ）の培地を除去した後、１μＭ~１０μＭ　Ｙ２７６３２を含むＳＤＩＡ培地（ＧＭＥＭ、ＫＳＲ、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、２−メルカプトエタノール等を含む）５ｍｌを前記培養皿に添加し、培養を上記同様に継続した。
　培養５日間後、未接着の細胞塊を吸わないように、５ｍｌの培地を除去した後、１μＭ~１０μＭ　Ｙ２７６３２を含むＳＤＩＡ培地５ｍｌを前記培養皿に添加し、更に培養を上記同様に継続した。
　培養８日間後、培地全量を除去した後、ＰＡ６　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ　ｍｅｄｉｕｍ（コンフルエント状態のＰＡ６細胞をＳＤＩＡ培地で１日間培養した後の培養上清）１０ｍｌを前記培養皿に添加した。以降３日~４日間毎に、ＰＡ６　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ　ｍｅｄｉｕｍを用いて培地交換した。当該操作により、黒色色素を有するヒト網膜色素上皮細胞が分化誘導された（図１及び図２参照）。
実施例２　（ヒト網膜色素上皮細胞の培養）
　実施例１により分化誘導された黒色色素を有するヒト網膜色素上皮細胞が存在するコロニーをマイクロピペットを用いてかきとり、次いで０．０５％トリプシン処理により、細胞分散させた。
　予めマトリゲルコートしておいた６０ｍｍ培養皿に、Ｎ２添加物を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液に２~２０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦが添加された培地を加え、当該培地に得られた分散細胞を播種した。このようにして播種された分散細胞には、ヒト網膜色素上皮細胞以外の不特定の細胞も含まれていた。
　細胞を３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内にて培養してコンフルエントになった後、０．２５％トリプシン処理し、培養皿から細胞を回収した。回収された細胞を、予めマトリゲルコートしておいた１０ｃｍ培養皿に播種した後、細胞がコンフルエントになるまで３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内にて培養した。細胞がコンフルエントになった時、培養皿に存在する細胞のうち大多数がヒト網膜色素上皮細胞であった。
　更に、細胞を、ｂＦＧＦを含まないＮ２添加物含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液で１週間以上培養した後、以下の実験で使用した。
実施例３　（非光照射のための対照である遮光条件下での、本発明光毒性試験方法の第一工程、第二工程及び第三工程）
　実施例２で調製されたヒト網膜色素上皮細胞を、０．２５％トリプシン処理し、培養皿から細胞を回収した。回収された細胞を、予めマトリゲルコートしておいた９６穴培養皿に１ｗｅｌｌあたり１０万又は１２万細胞ずつ播種した後、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内にて培養した。
　培養２時間~４時間後、９６穴培養皿からアスピレータを用いて培地を除去し、次いで、Ｅａｒｌｅ’ｓ　Ｂａｌａｎｃｅｄ　Ｓａｌｔ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　（ＥＢＳＳ）を前記９６穴培養皿に１ｗｅｌｌ当り１５０μｌの割合で添加し、細胞を洗浄した。
　次に、前記培養皿に、予めＥＢＳＳを用いて下記の濃度に調製された被験物質の溶液又は溶媒対照液を１ｗｅｌｌ当り１００μｌの割合で添加した。
＜被験物質の溶液＞
（ａ）Ｃｈｌｏｒｐｒｏｍａｚｉｎｅ（クロルプロマジン（ＣＰＺ））：濃度０．１、１、３、１０、３０、１００（μｇ／ｍｌ）
（ｂ）ペニシリンＧ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ　Ｇ）：濃度１、３、１０、３０、１００、３００、１０００（μｇ／ｍｌ）
（ｃ）キニーネ（Ｑｕｉｎｉｎｅ）：濃度０．１、０．３、１、３、１０、３０、１００（μｇ／ｍｌ）
（ｄ）ビチオノール（Ｂｉｔｈｉｏｎｏｌ）：濃度０．０１、０．０３、０．１、０．３、１、３、１０（μｇ／ｍｌ）
（ｅ）クロルヘキシジン（Ｃｈｌｏｒｈｅｘｉｄｉｎｅ）：濃度０．１、０．３、１、３、１０、３０、１００（μｇ／ｍｌ）
　９６穴培養皿をアルミ箔で包み遮光した後、アルミ箔で遮光したままの培養皿に、光照射装置（擬似太陽光照射装置　ＳＸＬ−２５００Ｖ２：セリック社）を用いて４０分間光照射（光照射量約５Ｊ／ｃｍ２）を行った。光照射後直ちに、前記９６穴培養皿をＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液１５０μｌを用いて２回洗浄した後、当該９６穴培養皿に、Ｎ２添加物含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液を１ｗｅｌｌ当り１００μｌの割合で添加し、一晩培養した。
　培養後、９６穴培養皿から培地を除去し、次いで、予め調製しておいたＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液及びＣｅｌｌ　ｔｉｔｅｒ　Ｇｌｏ反応液の等量混合液を当該９６穴培養皿に１ｗｅｌｌ当り１００μｌの割合で添加した。
　得られた９６穴培養皿をアルミ箔で遮光した状態で振とうしながら室温で３０分間放置した後、前記９６穴培養皿に含まれる培養物９５μｌを、白色９６穴試験皿へ移した。次いで、当該９６穴試験皿に含まれる培養物の発光量（当該発光量は、細胞生存率に相関関係を有するものである。）を、ＥｎＶｉｓｉｏｎマルチラベルリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社）を用いて測定した。測定された値から被験物質のヒト網膜色素上皮細胞に対する５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を算出し、当該算出値を、細胞毒性（それに相関関係を有する指標値）を示す値とした。
　上記の算出方法に従うと、以下の結果になった。
＜被験物質の細胞毒性＞
（ａ）Ｃｈｌｏｒｐｒｏｍａｚｉｎｅ（クロルプロマジン（ＣＰＺ））：ＩＣ５０＝３７．６（μｇ／ｍｌ）（図３参照）
（ｂ）ペニシリンＧ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ　Ｇ）：ＩＣ５０＞１０００（μｇ／ｍｌ）（１０００μｇ／ｍｌ以下では細胞毒性は観察されなかった）（図４参照）
（ｃ）キニーネ（Ｑｕｉｎｉｎｅ）：ＩＣ５０＝１４７．１（μｇ／ｍｌ）図５参照）
（ｄ）ビチオノール（Ｂｉｔｈｉｏｎｏｌ）：ＩＣ５０＞１０（μｇ／ｍｌ）（１０μｇ／ｍｌ以下では細胞毒性は観察されなかった）（図６参照）
（ｅ）クロルヘキシジン（Ｃｈｌｏｒｈｅｘｉｄｉｎｅ）：ＩＣ５０＝４２．７（μｇ／ｍｌ）（図７参照）
実施例４　（本発明光毒性試験方法の第一工程、第二工程、及び第三工程）
　実施例２で調製されたヒト網膜色素上皮細胞を、０．２５％トリプシン処理し、培養皿から細胞を回収した。回収された細胞を、予めマトリゲルコートしておいた９６穴培養皿に１ｗｅｌｌあたり１０万又は１２万細胞ずつ播種した後、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で培養した。
　培養２時間~４時間後、前記９６穴培養皿からアスピレータを用いて培地を除去し、次いで、Ｅａｒｌｅ’ｓ　Ｂａｌａｎｃｅｄ　Ｓａｌｔ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　（ＥＢＳＳ）を前記９６穴培養皿に１ｗｅｌｌ当り１５０μｌの割合で添加し、細胞を洗浄した。
　次に、前記培養皿に、予めＥＢＳＳを用いて下記の濃度に調製された被験物質の溶液又は溶媒対照液を１ｗｅｌｌ当り１００μｌの割合で添加した。
＜被験物質の溶液＞
（ａ）Ｃｈｌｏｒｐｒｏｍａｚｉｎｅ（クロルプロマジン（ＣＰＺ））：濃度０．１、１、３、１０、３０、１００（μｇ／ｍｌ）
（ｂ）ペニシリンＧ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ　Ｇ）：濃度１、３、１０、３０、１００、３００、１０００（μｇ／ｍｌ）
（ｃ）キニーネ（Ｑｕｉｎｉｎｅ）：濃度０．１、０．３、１、３、１０、３０、１００（μｇ／ｍｌ）
（ｄ）ビチオノール（Ｂｉｔｈｉｏｎｏｌ）：濃度０．０１、０．０３、０．１、０．３、１、３、１０（μｇ／ｍｌ）
（ｅ）クロルヘキシジン（Ｃｈｌｏｒｈｅｘｉｄｉｎｅ）：濃度０．１、０．３、１、３、１０、３０、１００（μｇ／ｍｌ）
　実施例３とは異なり、９６穴培養皿をアルミ箔で包むことなく、光照射装置（擬似太陽光照射装置　ＳＸＬ−２５００Ｖ２：セリック社）を用いて４０分間光照射（３６０ｎｍにおける光照射強度を元に計算すると光照射量約５Ｊ／ｃｍ２となる）を行った。光照射後直ちに、前記９６穴培養皿をＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液１５０μｌを用いて２回洗浄した後、当該９６穴培養皿に、Ｎ２添加物含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液を１ｗｅｌｌ当り１００μｌの割合で添加し、一晩培養した。
　培養後、９６穴培養皿から培地を除去し、次いで、予め調製しておいたＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液及びＣｅｌｌ　ｔｉｔｅｒ　Ｇｌｏ反応液の等量混合液を当該９６穴培養皿に１ｗｅｌｌ当り１００μｌの割合で添加した。
　得られた９６穴培養皿をアルミ箔で遮光した状態で振とうしながら室温で３０分間放置した後、前記９６穴培養皿に含まれる培養物９５μｌを、白色９６穴試験皿へ移した。次いで、当該９６穴試験皿に含まれる培養物の発光量（当該発光量は、細胞生存率に相関関係を有するものである。）を、ＥｎＶｉｓｉｏｎマルチラベルリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社）を用いて測定した。測定された値から被験物質のヒト網膜色素上皮細胞に対する５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を算出し、当該算出値を、細胞毒性（それに相関関係を有する指標値）を示す値とした。
　上記の算出方法に従うと、以下の結果になった。
＜被験物質の細胞毒性＞
（ａ）Ｃｈｌｏｒｐｒｏｍａｚｉｎｅ（クロルプロマジン（ＣＰＺ））：ＩＣ５０＝５．８（μｇ／ｍｌ）（図８参照）
（ｂ）ペニシリンＧ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ　Ｇ）：ＩＣ５０＞１０００（μｇ／ｍｌ）（１０００μｇ／ｍｌ以下では細胞毒性は観察されなかった）（図９参照）
（ｃ）キニーネ（Ｑｕｉｎｉｎｅ）：ＩＣ５０＝８８．９（μｇ／ｍｌ）（図１０参照）
（ｄ）ビチオノール（Ｂｉｔｈｉｏｎｏｌ）：ＩＣ５０＞１０（μｇ／ｍｌ）（１０μｇ／ｍｌ以下では細胞毒性は観察されなかった）（図１１参照）
（ｅ）クロルヘキシジン（Ｃｈｌｏｒｈｅｘｉｄｉｎｅ）：ＩＣ５０＝４３．７（μｇ／ｍｌ）（図１２参照）
実施例５　（本発明光毒性試験方法：第四工程）
　実施例３及び実施例４で算出された５０％阻害濃度（ＩＣ５０）に基づき、前述のＰＩＦ値（Ｐｈｏｔｏ　Ｉｒｒｉｔａｔｉｏｎ　Ｆａｃｏｒ値）（即ち、被験物質を接触させたヒト網膜色素上皮細胞における細胞毒性ＩＣ５０値（非光照射のための（遮光）対照）を、被験物質の接触開始後２４時間以内に擬似太陽光の照射下で培養されたヒト網膜色素上皮細胞における細胞毒性ＩＣ５０値で割って得られた値）を求めた。その結果を以下に示す。当該値（ＰＩＦ値）が５より大きい場合には、被験物質は光毒性陽性であると評価した。
＜被験物質のＰＩＦ値（Ｐｈｏｔｏ　Ｉｒｒｉｔａｔｉｏｎ　Ｆａｃｏｒ値）＞
（ａ）Ｃｈｌｏｒｐｒｏｍａｚｉｎｅ（クロルプロマジン（ＣＰＺ））：６．５
　本発明光毒性試験方法による評価では、光細胞毒性陽性判定であった。これは、過去のｉｎ　ｖｉｖｏ試験結果と一致している。
（ｂ）ペニシリンＧ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ　Ｇ）：光細胞毒性が認められない。
　本発明光毒性試験方法による評価では、光細胞毒性陰性判定であった。これは、過去のｉｎ　ｖｉｖｏ試験結果と一致している。
（ｃ）キニーネ（Ｑｕｉｎｉｎｅ）：１．７
　本発明光毒性試験方法による評価では、光細胞毒性陰性判定であった。これは、Ｌｊｕｎｇｇｒｅｎ　Ｂ．ら，Ｐｈｏｔｏｔｏｘｉｃ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　ｑｕｉｎｉｎｅ　ａｎｄ　ｑｕｉｎｉｄｉｎｅ：ｔｗｏ　ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ　ｍｅｔｈａｎｏｌ　ｉｓｏｍｅｒ．；Ｐｈｏｔｏｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ　５　１３３　−　１３８（１９８８）に記載されるｉｎ　ｖｉｖｏ試験（ｍｏｕｓｅ　ｔａｉｌ試験）結果と一致している。
（ｄ）ビチオノール（Ｂｉｔｈｉｏｎｏｌ）：光細胞毒性が認められない。
　本発明光毒性試験方法による評価では、光細胞毒性陰性判定であった。これは、本来正しい陰性結果と一致している。光毒性試験バリデーション研究実行委員会（委員長　吉村功）、光毒性試験代替法バリデーション研究報告書（２００４年８月２７日）による４施設での酵母—赤血球試験では偽陽性結果であり、本発明光毒性試験方法が優れたものであることが確認された。
（ｅ）クロルヘキシジン（Ｃｈｌｏｒｈｅｘｉｄｉｎｅ）：０．９８
　本発明光毒性試験方法による評価では、光細胞毒性陰性判定であった。これは、本来正しい陰性結果と一致している。光毒性試験バリデーション研究実行委員会（委員長　吉村功）、光毒性試験代替法バリデーション研究報告書（２００４年８月２７日）による４施設での酵母—赤血球試験では偽陽性結果であり、本発明光毒性試験方法が優れたものであることが確認された。
比較例１　（ヒト網膜色素上皮細胞以外のヒト細胞を用いた比較実験）
　「Ｂａｌｂ／ｃ　３Ｔ３細胞」は、結合組織細胞（Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｃｅｌｌ）であり、線維芽細胞（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）である。
　１０％ウシ血清、Ｌグルタミンを含むＤＭＥＭ培地で培養された「Ｂａｌｂ／ｃ　３Ｔ３細胞」を０．２５％トリプシン処理し、培養皿から細胞を回収した。回収された細胞を、予め０．１％ゼラチン溶液でコートしておいた９６穴培養皿に１ｗｅｌｌあたり１万細胞ずつ播種した後、１０％ウシ血清、Ｌグルタミンを含むＤＭＥＭ培地で、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内にて一晩培養した。
　培養後、９６穴培養皿からアスピレータを用いて培地を除去し、次いで、Ｅａｒｌｅ’ｓ　Ｂａｌａｎｃｅｄ　Ｓａｌｔ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　（ＥＢＳＳ）を前記９６穴培養皿に１ｗｅｌｌ当り１５０μｌの割合で添加し、細胞を洗浄した。
　次に、前記培養皿に、予めＥＢＳＳを用いて下記の濃度に調製された被験物質の溶液又は溶媒対照液を１ｗｅｌｌ当り１００μｌの割合で添加した。
＜被験物質の溶液＞
（ａ）Ｃｈｌｏｒｐｒｏｍａｚｉｎｅ（クロルプロマジン（ＣＰＺ））：濃度０．１、１、３、１０、３０、１００（μｇ／ｍｌ）
（ｂ）ペニシリンＧ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ　Ｇ）：濃度１、３、１０、３０、１００、３００、１０００（μｇ／ｍｌ）
（ｃ）キニーネ（Ｑｕｉｎｉｎｅ）：濃度０．１、０．３、１、３、１０、３０、１００（μｇ／ｍｌ）
（ｄ）ビチオノール（Ｂｉｔｈｉｏｎｏｌ）：濃度０．０１、０．０３、０．１、０．３、１、３、１０（μｇ／ｍｌ）
（ｅ）クロルヘキシジン（Ｃｈｌｏｒｈｅｘｉｄｉｎｅ）：濃度０．１、０．３、１、３、１０、３０、１００（μｇ／ｍｌ）
　９６穴培養皿をアルミ箔で包み遮光した後、アルミ箔で遮光したままの培養皿に、光照射装置（擬似太陽光照射装置　ＳＸＬ−２５００Ｖ２：セリック社）を用いて４０分間光照射（３６０ｎｍにおける照射強度を元に計算すると光照射量約５Ｊ／ｃｍ２となる）を行った。光照射後直ちに、前記９６穴培養皿をＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液１５０μｌを用いて２回洗浄した後、当該９６穴培養皿に、Ｎ２添加物含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液を１ｗｅｌｌ当り１００μｌの割合で添加し、一晩培養した。
　培養後、９６穴培養皿から培地を除去し、次いで、予め調製しておいたＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液及びＣｅｌｌ　ｔｉｔｅｒ　Ｇｌｏ反応液の等量混合液を当該９６穴培養皿に１ｗｅｌｌ当り１００μｌの割合で添加した。
　得られた９６穴培養皿をアルミ箔で遮光した状態で振とうしながら室温で３０分間放置した後、前記９６穴培養皿に含まれる培養物９５μｌを、白色９６穴試験皿へ移した。
　次いで、当該９６穴試験皿に含まれる培養物の発光量（当該発光量は、細胞生存率に相関関係を有するものである。）を、ＥｎＶｉｓｉｏｎマルチラベルリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社）を用いて測定した。測定された値から被験物質のヒト網膜色素上皮細胞に対する５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を算出し、当該算出値を、細胞毒性（それに相関関係を有する指標値）を示す値とした。
　上記の算出方法に従うと、以下の結果になった。
＜被験物質の細胞毒性＞
（ａ）Ｃｈｌｏｒｐｒｏｍａｚｉｎｅ（クロルプロマジン（ＣＰＺ））：ＩＣ５０＝１９．４（μｇ／ｍｌ）（図１３参照）
（ｂ）ペニシリンＧ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ　Ｇ）：ＩＣ５０＞１０００（μｇ／ｍｌ）（１０００μｇ／ｍｌ以下では細胞毒性は観察されなかった）（図１４参照）
（ｃ）キニーネ（Ｑｕｉｎｉｎｅ）：ＩＣ５０＝２９２．２（μｇ／ｍｌ）（図１５参照）
（ｄ）ビチオノール（Ｂｉｔｈｉｏｎｏｌ）：ＩＣ５０＝１１．４（μｇ／ｍｌ）（３μｇ／ｍｌ以下では細胞毒性は観察されなかった）（図１６参照）
（ｅ）クロルヘキシジン（Ｃｈｌｏｒｈｅｘｉｄｉｎｅ）：ＩＣ５０＝１３．７（μｇ／ｍｌ）（図１７参照）
比較例２　（比較光毒性試験方法：第一工程、第二工程、第三工程）
　１０％ウシ血清、Ｌグルタミンを含むＤＭＥＭ培地で培養された「Ｂａｌｂ／ｃ　３Ｔ３細胞」を０．２５％トリプシン処理により、培養皿から細胞を回収した。回収された細胞を、予め０．１％ゼラチン溶液でコートしておいた９６穴培養皿に１ｗｅｌｌあたり１万細胞ずつ播種した後、１０％ウシ血清、Ｌグルタミンを含むＤＭＥＭ培地で、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内にて一晩培養した。
　培養後、９６穴培養皿からアスピレータを用いて培地を除去し、次いで、Ｅａｒｌｅ’ｓ　Ｂａｌａｎｃｅｄ　Ｓａｌｔ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　（ＥＢＳＳ）を前記９６穴培養皿に１ｗｅｌｌ当り１５０μｌの割合で添加し、細胞を洗浄した。
　次に、前記培養皿に、予めＥＢＳＳを用いて下記の濃度に調製された被験物質の溶液又は溶媒対照液を１ｗｅｌｌ当り１００μｌの割合で添加した。
＜被験物質の溶液＞
（ａ）Ｃｈｌｏｒｐｒｏｍａｚｉｎｅ（クロルプロマジン（ＣＰＺ））：濃度０．１、１、３、１０、３０、１００（μｇ／ｍｌ）
（ｂ）ペニシリンＧ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ　Ｇ）：濃度１、３、１０、３０、１００、３００、１０００（μｇ／ｍｌ）
（ｃ）キニーネ（Ｑｕｉｎｉｎｅ）：濃度０．１、０．３、１、３、１０、３０、１００（μｇ／ｍｌ）
（ｄ）ビチオノール（Ｂｉｔｈｉｏｎｏｌ）：濃度０．０１、０．０３、０．１、０．３、１、３、１０（μｇ／ｍｌ）
（ｅ）クロルヘキシジン（Ｃｈｌｏｒｈｅｘｉｄｉｎｅ）：濃度０．１、０．３、１、３、１０、３０、１００（μｇ／ｍｌ）
　比較例１とは異なり、９６穴培養皿をアルミ箔で包むことなく、光照射装置（擬似太陽光照射装置　ＳＸＬ−２５００Ｖ２：セリック社）を用いて４０分間光照射（３６０ｎｍにおける照射強度を元に計算すると光照射量約５Ｊ／ｃｍ２となる）を行った。光照射後直ちに、前記９６穴培養皿をＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液１５０μｌを用いて２回洗浄した後、当該９６穴培養皿に、Ｎ２添加物含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液を１ｗｅｌｌ当り１００μｌの割合で添加し、一晩培養した。
　培養後、９６穴培養皿から培地を除去し、次いで、予め調製しておいたＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液及びＣｅｌｌ　ｔｉｔｅｒ　Ｇｌｏ反応液の等量混合液を当該９６穴培養皿に１ｗｅｌｌ当り１００μｌの割合で添加した。
　得られた９６穴培養皿をアルミ箔で遮光した状態で振とうしながら室温で３０分間放置した後、前記９６穴培養皿に含まれる培養物９５μｌを、白色９６穴試験皿へ移した。次いで、当該９６穴試験皿に含まれる培養物の発光量（当該発光量は、細胞生存率に相関関係を有するものである。）を、ＥｎＶｉｓｉｏｎマルチラベルリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社）を用いて測定した。測定された値から被験物質のヒト網膜色素上皮細胞に対する５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を算出し、当該算出値を、細胞毒性（それに相関関係を有する指標値）を示す値とした。
　上記の算出方法に従うと、以下の結果になった。
＜被験物質の細胞毒性＞
（ａ）Ｃｈｌｏｒｐｒｏｍａｚｉｎｅ（クロルプロマジン（ＣＰＺ））：ＩＣ５０＝０．８２（μｇ／ｍｌ）（図１８参照）
（ｂ）ペニシリンＧ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ　Ｇ）：ＩＣ５０＞１０００（μｇ／ｍｌ）（１０００μｇ／ｍｌ以下では細胞毒性は観察されなかった）（図１９参照）
（ｃ）キニーネ（Ｑｕｉｎｉｎｅ）：ＩＣ５０＝２．３（μｇ／ｍｌ）（μｇ／ｍｌ）（図２０参照）
（ｄ）ビチオノール（Ｂｉｔｈｉｏｎｏｌ）：ＩＣ５０＝０．９３（μｇ／ｍｌ）（１０μｇ／ｍｌ以下では細胞毒性は観察されなかった）（図２１参照）
（ｅ）クロルヘキシジン（Ｃｈｌｏｒｈｅｘｉｄｉｎｅ）：ＩＣ５０＝１０．１（μｇ／ｍｌ）（図２２参照）
比較例３　（比較光毒性試験方法：第四工程）
　比較例１及び比較例２で算出された５０％阻害濃度（ＩＣ５０）に基づき、前述のＰＩＦ値（Ｐｈｏｔｏ　Ｉｒｒｉｔａｔｉｏｎ　Ｆａｃｏｒ値）（即ち、被験物質を接触させたヒト網膜色素上皮細胞における細胞毒性ＩＣ５０値（非光照射のための（遮光）対照）を、被験物質の接触開始後２４時間以内に擬似太陽光の照射下で培養されたヒト網膜色素上皮細胞における細胞毒性ＩＣ５０値で割って得られた値）を求めた。その結果を以下に示す。当該値（ＰＩＦ値）が５より大きい場合には、被験物質は光毒性陽性であると評価した。
＜被験物質のＰＩＦ値（Ｐｈｏｔｏ　Ｉｒｒｉｔａｔｉｏｎ　Ｆａｃｏｒ値）＞
（ａ）Ｃｈｌｏｒｐｒｏｍａｚｉｎｅ（クロルプロマジン（ＣＰＺ））：２３．７
　比較光毒性試験方法による評価では、光細胞毒性陽性判定であった。これは、過去のｉｎ　ｖｉｖｏ試験結果と一致している。
（ｂ）ペニシリンＧ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ　Ｇ）：光細胞毒性が認められない。
　比較光毒性試験方法による評価では、光細胞毒性陰性判定であった。これは、過去のｉｎ　ｖｉｖｏ試験結果と一致している。
（ｃ）キニーネ（Ｑｕｉｎｉｎｅ）：１２８．８
　比較光毒性試験方法による評価では、光細胞毒性陽性判定であった。これは、Ｌｊｕｎｇｇｒｅｎ　Ｂ．ら，Ｐｈｏｔｏｔｏｘｉｃ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　ｑｕｉｎｉｎｅ　ａｎｄ　ｑｕｉｎｉｄｉｎｅ：ｔｗｏ　ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ　ｍｅｔｈａｎｏｌ　ｉｓｏｍｅｒ．；Ｐｈｏｔｏｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ　５，１３３−１３８（１９８８）に記載されるｉｎ　ｖｉｖｏ試験（ｍｏｕｓｅ　ｔａｉｌ試験）結果と一致していない。よって、本発明光毒性試験方法は偽陽性結果となった。
（ｄ）ビチオノール（Ｂｉｔｈｉｏｎｏｌ）：１２．４
　比較光毒性試験方法による評価では、光細胞毒性陽性判定であった。これは、本来正しい陰性結果と一致していない。よって、比較光毒性試験方法は偽陽性結果となった。光毒性試験バリデーション研究実行委員会（委員長　吉村功）、光毒性試験代替法バリデーション研究報告書（２００４年８月２７日）による４施設での酵母—赤血球試験では偽陽性結果であった。
（ｅ）クロルヘキシジン（Ｃｈｌｏｒｈｅｘｉｄｉｎｅ）：１．４
　比較光毒性試験方法による評価では、光細胞毒性陰性判定であった。これは、本来正しい陰性結果と一致している。光毒性試験バリデーション研究実行委員会（委員長　吉村功）、光毒性試験代替法バリデーション研究報告書（２００４年８月２７日）による４施設での酵母—赤血球試験では偽陽性結果であった。
実施例６　（光照射量の設定のための予備試験）
　ＯＥＣＤガイドラインで陽性対照として用いられているクロルプロマジン（ＣＰＺ）を用いて、光照射量と前述のＰＩＦ値（即ち、被験物質を接触させたヒト網膜色素上皮細胞における細胞毒性ＩＣ５０値（非光照射のための（遮光）対照）を、被験物質の接触開始後２４時間以内に擬似太陽光の照射下で培養されたヒト網膜色素上皮細胞における細胞毒性ＩＣ５０値で割って得られた値）との関係を検討した。光照射を、２．０９ｍＷ／ｃｍ２（トプコン社製ＵＶＲ３００に受光部ＵＤ３６０を取り付けて計測）の光を１５分間（１．８７Ｊ／ｃｍ２）、２０分間（２．５０Ｊ／ｃｍ２）、２５分間（３．１３Ｊ／ｃｍ２）、３０分間（３．７５Ｊ／ｃｍ２）、４０分間（５．００Ｊ／ｃｍ２）、６０分間（７．５１Ｊ／ｃｍ２）の各種条件に設定したうえで、実施例３及び実施例４に記載された方法に準じて光毒性試験方法を実施した。また、非光照射のための対照である遮光条件については、遮光すること以外は上記光照射での光毒性試験方法と同様な方法により、光毒性試験方法を実施した。
　その結果、測定された値から被験物質のヒト網膜色素上皮細胞に対する５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を算出し、更に当該算出値に基づきＰＩＦ値を求めたところ、１５分間ではＰＩＦ＝１．７０、２０分間ではＰＩＦ＝１．７２、２５分間ではＰＩＦ＝３．３５、３０分間ではＰＩＦ＝４．５７、４０分間ではＰＩＦ＝６．５３、６０分間ではＰＩＦ＝１０．９４であった（図２３参照）。
　以上より、３．７５Ｊ／ｃｍ２（３０分間）以下の光照射量ではＰＩＦ＞５とならず、陽性対照であるクロルプロマジン（ＣＰＺ）が陽性と判定できないことから、３．７５Ｊ／ｃｍ２より高い光照射量に設定することが好ましいことが、当該予備試験から確認できた。
　次いで、上記予備試験に関連して、擬似太陽光の照射が、クロルプロマジン（ＣＰＺ）を接触させたヒト網膜色素上皮細胞において、擬似太陽光を遮光した条件下での前記細胞の生存細胞数に対して、光照射条件下での前記細胞の生存細胞数が有意に減少する光照射量を有する照射であることを確認した。
　１５分間（１．８７Ｊ／ｃｍ２）、２０分間（２．５０Ｊ／ｃｍ２）、２５分間（３．１３Ｊ／ｃｍ２）、３０分間（３．７５Ｊ／ｃｍ２）、４０分間（５．００Ｊ／ｃｍ２）、６０分間（７．５１Ｊ／ｃｍ２）におけるヒト網膜色素上皮細胞の生存細胞数を調べた。光照射時間が４０分間である遮光条件下において前記細胞の生存細胞数の減少が認められなかったクロルプロマジン（ＣＰＺ）の接触濃度１０μｇ／ｍｌでの結果（図３参照）を抽出し比較したところ、擬似太陽光を遮光した条件下での前記細胞の生存細胞数に対して、光照射条件下での前記細胞の生存細胞数が有意に減少する光照射量は３．１３Ｊ／ｃｍ２（２５分間）以上であることが確認できた（図２４参照）。
　従って、３．１３Ｊ／ｃｍ２（２５分間）以上の光照射量であれば、擬似太陽光の照射が適正に行われ、当該光照射量を用いれば、好ましい本発明光毒性試験方法が実施可能であることが確認された。
実施例７　（形質転換体を利用する本発明光毒性試験方法）
　ヒト網膜色素上皮細胞で発現する遺伝子（Ｍｉｔｆ、ＲＰＥ６５、ＺＯ１等）のプロモーター発現制御下にレポーター遺伝子を含むベクターで形質転換されたヒト胚性幹細胞（即ち、ＥＳ細胞）の作製方法を具体的に記載する。
（１）遺伝子のプロモータークローニング、及び、レポータープラスミドの作製
　ＺＯ−１のプロモーター領域を以下に示す方法により、クローニングする。
　ヒト胚性幹細胞（即ち、ＥＳ細胞）より抽出したゲノムＤＮＡ２０ｎｇ又はＲＰＥ６５遺伝子を含むヒトゲノムＢＡＣ　ＤＮＡを鋳型とし、ＲＰＥ６５遺伝子の翻訳開始点及び転写開始点上流５ｋｂの位置に設計したプライマーを用いて、Ｐｌａｔｉｎｕｍ　Ｔａｑ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（インビトロジェン社）を用いたＰＣＲ法により、所望のＤＮＡ断片を増幅する。ＰＣＲ反応は、ＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ９７００（アプライドバイオシステム社）にて、９５℃５分間反応させた後、９５℃３０秒間、５５℃３０秒間、７２℃５分間を３０サイクル行い、７２℃７分間の反応条件で実施する。
　得られたＰＣＲ産物を、ＰＣＲ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製し、ＰＣＲ産物の末端を制限酵素消化した後、アガロースゲル電気泳動を行うことにより、精製する。
　精製された所望のＤＮＡ断片を、Ａｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（タカラバイオ社）にて脱リン酸化処理を行ったｐＧＬ４．１７［Ｌｕｃ２／Ｎｅｏ］ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社）と、Ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いて連結する。得られたＤＮＡ断片を、大腸菌ＤＨ５αコンピテンセル（タカラバイオ社）に形質転換した後、これを３７℃でＬＢ／アンピシリン培地にて一晩培養する。培養後、出現したコロニーをＬＢ／アンピシリン液体培地にて培養して得られた大腸菌からプラスミドＤＮＡを抽出する。抽出されたプラスミドＤＮＡについては、その挿入断片のシークエンスを決定し、変異等の有無を確認する。
　ヒト胚性幹細胞（即ち、ＥＳ細胞）へのトランスフェクションに用いるため、各プラスミドをＱｉａｆｉｌｔｅｒプラスミド抽出キット（キアゲン社）にて再度抽出する。得られたプラスミドＤＮＡ２０μｇを制限酵素処理により直線化した後、精製を行い、線状化ＤＮＡを得る。
（２）組換えヒト胚性幹細胞（即ち、ＥＳ細胞）の作製方法
　未分化維持培養されたヒト胚性幹細胞（即ち、ＥＳ細胞）を解離液処理することにより、培養皿からヒト胚性幹細胞（即ち、ＥＳ細胞）コロニーを回収する。回収されたコロニーをヒト胚性幹細胞（即ち、ＥＳ細胞）未分化維持培地に懸濁し、これを０．１％ゼラチンコートした１０ｃｍ培養皿に移した後、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで２時間静置することにより、フィーダー細胞を接着させる。浮遊しているヒト胚性幹細胞（即ち、ＥＳ細胞）コロニーを含む上清を１５ｍｌチューブに移し、これを遠心によりコロニーを沈降させる。このようにして回収されたコロニーをトリプシン液で酵素処理した後、マイクロピペットを用いてピペッティングすることにより、ヒト胚性幹細胞（即ち、ＥＳ細胞）を単一細胞化する。
　次いで、得られた細胞を遠心して沈降させる。予め、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地と２μｇの線状化ＤＮＡ、８μＬのＦｕＧＥＮＥ　ＨＤ（プロメガ社）とを混合しておいた液で前記細胞を懸濁し、当該細胞懸濁液を５分間室温にて反応させた後、１μＭ~１０μＭ　Ｙ２７６３２を含む未分化維持培地で懸濁する。
　得られた細胞懸濁液をネオマイシン耐性フィーダー細胞上へ播種し、３７℃にて５％ＣＯ２インキュベーターで一晩培養する。培地に１００μｇ／ｍＬのＧ４１８（インビトロジェン社）を添加することにより、薬剤選択培養を行う。Ｇ４１８添加の１０日~１５日後、顕微鏡下でシャーレ中に形成したヒト胚性幹細胞（即ち、ＥＳ細胞）コロニーを単離し、これを９６ウェルプレートに播種する。薬剤選択培養を継続した後、更に１０~１５日後に増殖した細胞を継代培養して４８ウェルプレートに播種する。薬剤選択培養を継続した後、薬剤耐性の安定形質転換細胞株を取得する。
（３）組換えヒト胚性幹細胞（即ち、ＥＳ細胞）を利用したヒト網膜色素上皮細胞への、非光照射のための対照である遮光条件下での被験物質の暴露及び毒性値の算出
　組換えヒト胚性幹細胞（即ち、ＥＳ細胞）を、実施例１に記載された方法に準じて、ヒト網膜色素上皮細胞へと分化誘導する。
　次いで、実施例２に記載された方法に準じてヒト網膜色素上皮細胞を培養した後、これに、実施例３に記載された方法に準じて被験物質を暴露する。
　暴露翌日、９６穴培養皿から培地を除去した後、予め調製しておいたＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液及びＳｔｅａｄｙ　Ｇｌｏ反応液の等量混合液を１ｗｅｌｌあたり１００μｌ添加する。
　アルミ箔で遮光した状態で振とうしながら室温で３０分間放置した後、９５μｌを白色９６穴培養皿へ移し、これをＥｎＶｉｓｉｏｎマルチラベルリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社）にて発光量を測定する。溶媒対照及び被験物質の各供試濃度における発光量の測定値から当該被験物質のヒト網膜色素上皮細胞に対する５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を算出し、これを毒性値とする。
（４）組換えヒト胚性幹細胞（即ち、ＥＳ細胞）を利用したヒト網膜色素上皮細胞への、光照射条件での被験物質の暴露及び毒性値の算出
　組換えヒト胚性幹細胞（即ち、ＥＳ細胞）を、実施例１に記載された方法に準じて、ヒト網膜色素上皮細胞へと分化誘導する。
　次いで、実施例２に記載された方法に準じてヒト網膜色素上皮細胞を培養した後、これに、実施例４に記載された方法に準じて被験物質を暴露する。
　暴露翌日、９６穴培養皿から培地を除去した後、予め調製しておいたＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液及びＳｔｅａｄｙ　Ｇｌｏ反応液の等量混合液を１ｗｅｌｌあたり１００μｌ添加する。
　アルミ箔で遮光した状態で振とうしながら室温で３０分間放置した後、９５μｌを白色９６穴培養皿へ移し、これをＥｎＶｉｓｉｏｎマルチラベルリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社）にて発光量を測定する。溶媒対照及び被験物質の各供試濃度における発光量の測定値から当該被験物質のヒト網膜色素上皮細胞に対する５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を算出し、これを毒性値とする。
（５）組換えヒト胚性幹細胞（即ち、ＥＳ細胞）を利用したヒト網膜色素上皮細胞を用いた被験物質の光毒性発現能力の評価
　上記（４）で算出された５０％阻害濃度（ＩＣ５０）に基づき、前述のＰＩＦ値（Ｐｈｏｔｏ　Ｉｒｒｉｔａｔｉｏｎ　Ｆａｃｏｒ値）（即ち、被験物質を接触させたヒト網膜色素上皮細胞における細胞毒性ＩＣ５０値（非光照射のための（遮光）対照）を、被験物質の接触開始後２４時間以内に擬似太陽光の照射下で培養されたヒト網膜色素上皮細胞における細胞毒性ＩＣ５０値で割って得られた値）を求める。その結果、当該値（ＰＩＦ値）が６より大きい場合には、被験物質は光毒性陽性であると評価する。
　本発明光毒性試験方法によれば、被験物質の光毒性発現能力の検定を効果的に行なうことができる。さらに、本発明では、当該試験方法に陽性対照として用いることができる光毒性発現物質を提供することができる。

Claims (16)

  1. 下記工程（１）~（４）を有する光毒性試験方法：
    （１）ヒト網膜色素上皮細胞に被験物質を接触させる第一工程；
    （２）第一工程で被験物質を接触させたヒト網膜色素上皮細胞を、第一工程における接触開始後２４時間以内に、３４０ｎｍから３８０ｎｍまでの範囲の波長分布を含む人工光を照射しながら培養する第二工程；
    （３）第二工程で培養されたヒト網膜色素上皮細胞を回収し、回収された培養細胞での細胞毒性若しくはそれに相関関係を有する指標値を測定する第三工程；及び
    （４）第三工程の測定結果によって被験物質の光毒性発現能力の有無又はその程度を評価し、被験物質の光毒性発現能力を検定する第四工程。
  2. 前記人工光が、紫外光、可視光及び赤外光からなる擬似太陽光である請求項１記載の光毒性試験方法。
  3. 第二工程における人工光の照射が、波長３６０ｎｍでの測定値として３Ｊ／ｃｍ２から３０Ｊ／ｃｍ２までの範囲である光照射量となる照射である請求項１又は２記載の光毒性試験方法。
  4. 前記第四工程において、前記第三工程の測定結果と、対照のヒト網膜色素上皮細胞における回収された培養細胞での細胞毒性若しくはそれに相関関係を有する指標値の測定結果とを比較し、その差異に基づいて被験物質の光毒性発現能力の有無又はその程度を評価する請求項１~３のいずれかに記載の光毒性試験方法。
  5. 前記対照が、ヒト網膜色素上皮細胞に既知の光毒性発現物質を接触させた陽性対照を含む請求項４記載の光毒性試験方法。
  6. 前記光毒性発現物質が、クロルプロマジンである請求項５記載の光毒性試験方法。
  7. 第二工程における人工光の照射が、被験物質を接触させたヒト網膜色素上皮細胞と対照のヒト網膜色素上皮細胞との少なくともいずれか一方のヒト網膜色素上皮細胞において、人工光を遮光した条件下での前記細胞の生存細胞数に対して、光照射条件下での前記細胞の生存細胞数が有意に減少する光照射量を有する照射である請求項１~６のいずれかに記載の光毒性試験方法。
  8. 前記第二工程における人工光の照射が、１回の連続的照射又は２回以上の繰り返し照射からなる間欠的照射である請求項１~７のいずれかに記載の光毒性試験方法。
  9. 前記ヒト網膜色素上皮細胞が、幹細胞由来の網膜色素上皮細胞である請求項１~８のいずれかに記載の光毒性試験方法。
  10. 前記幹細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞又は神経幹細胞である請求項９記載の光毒性試験方法。
  11. 請求項１~１０のいずれかに記載の光毒性試験方法のための、陽性対照としてのクロルプロマジンの使用。
  12. 請求項１~１０のいずれかに記載の光毒性試験方法に用いるための陽性対照試薬であって、クロルプロマジンを含有する陽性対照試薬。
  13. 請求項１~１０のいずれかに記載の光毒性試験方法のための、陰性対照としてのペニシリンＧ、キニーネ、ビチオノール又はクロルヘキシジンの使用。
  14. 請求項１~１０のいずれかに記載の光毒性試験方法に用いるための陰性対照試薬であって、ペニシリンＧ、キニーネ、ビチオノール又はクロルヘキシジンを含有する陽性対照試薬。
  15. 請求項１~１０のいずれかに記載の光毒性試験方法によって、被験物質の光毒性発現能力を検定し、所望の光毒性発現能力を有する物質を選抜する光毒性発現物質の探索方法。
  16. 請求項１~１０のいずれかに記載の光毒性試験方法によって、被験物質の光毒性発現能力を検定し、所望の光毒性発現能力を有さない物質を選抜する擬似太陽光皮膚刺激非誘発物質の探索方法。
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