KR20140034865A - 광독성 시험법 - Google Patents

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KR20140034865A
KR20140034865A KR1020137034499A KR20137034499A KR20140034865A KR 20140034865 A KR20140034865 A KR 20140034865A KR 1020137034499 A KR1020137034499 A KR 1020137034499A KR 20137034499 A KR20137034499 A KR 20137034499A KR 20140034865 A KR20140034865 A KR 20140034865A
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retinal pigment
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KR1020137034499A
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사토시 안도
고이치 사이토
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수미토모 케미칼 컴퍼니 리미티드
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Abstract

본 발명은, 인간 망막 색소 상피세포를 이용한 광독성 시험법 등을 제공한다.

Description

광독성 시험법{PHOTOTOXICITY TEST METHOD}
본 발명은, 인간 망막 색소 상피세포를 이용한 광독성 시험법 등에 관한 것이다.
의약품, 농약, 화장품, 공업제품 등의 화학물질의 인간에 대한 안전성을 평가하기 위해서는, 통상, 동물 개체를 이용한 많은 독성 시험이 행해진다. 이들 독성 시험 중, 체내로 들어간 화학물질이 광에 반응하여 발생하는 자극성 등의 급성 독성 시험은, 일반적으로 광독성 시험이라고 칭해진다.
광독성 시험법으로서 가장 널리 이용되고 있는 것으로는, 예를 들면, 동물 피부로의 국소 투여에 의한 모리가와법이 알려져 있다. 상기 광독성 시험법은, 모르모트 또는 백색 토끼를 이용하여, 상기 동물의 등 부분 피부에 피험물인 화학물질을 도포한 후, 상기 도포 부위로의 자외선 조사에 대한 상기 등 부분 피부에 있어서의 생체 반응을 미리 정한 평가 기준에 따라서 육안 판정하여 얻어진 판정 결과와, 상기 도포 부위로의 비자외선 조사에 대한 상기 등 부분 피부에 있어서의 생체 반응을 상기 평가 기준에 따라 동일하게 육안 판정하여 얻어진 판정 결과와 비교함으로써, 피험물인 화학물질이 갖는 광독성의 존재 유무 또는 그 정도를 평가하는 시험법이다.
그러나, 근년의 동물 복지의 문제나 유럽 등에서 보여지는 동물 실험 규제 강화로 인하여, 실험 동물을 사용하지 않는 광독성 시험법을 위한 대체법의 개발이 강하게 요구되고 있다.
한편, 현재까지 많은 in vitro 광독성 시험법이 개발되고 있다. 이러한 광독성 시험법 중에서도 가장 기대되고 있는 것으로는, 예를 들면, 결합 조직 세포(Connective Tissue Cell)이며, 섬유아세포(Fibroblast)인 「Balb/c 3T3 세포」에 의한 뉴트럴레드 도입 시험법(3T3 NRU PT)을 들 수 있다. 상기 3T3 NRU PT는, 1998년에 ECVAM(European Center for the Validation of Alternative Methods:유럽 대체법 검증 센터)에 의해 과학적으로 확립된 광독성 시험법의 대체법으로서 인정되어, 2000년 이후, 화학물질이 갖는 광독성의 존재 유무를 스크리닝하기 위한 시험법으로서 채용되고 있다. 또 상기 시험법은, OECD에도 제출되어, 2004년에 in vitro 광독성 시험으로서 가이드라인화되어 있는 유일한 시험법으로도 알려져 있다(예를 들면, OECD guidelines for the testing of chemicals:test guideline 432 "In vitro 3T3 NRU phototoxicity test" Paris:Frankreich, OECD Publication Office;2004 참조).
그러나, 근년, 3T3 NRU PT에 의한 광독성의 존재 유무 등의 평가 결과가 많이 축적되게 된 바, 위양성(僞陽性)과 같은 결과를 포함하는 일도 밝혀지고 있으며, 실제 인간에 대한 안전성을 예측하는 것에 관해서는 반드시 항상 충분히 만족할 수 있는 것은 아니며, 새로운 in vitro 광독성 시험법의 개발이 요망되고 있다(예를 들면, Experimental and Toxicologic Pathology, vol.63, p209-214;2011 참조).
본 발명은, 인간 망막 색소 상피세포를 이용한 광독성 시험법 등을 제공한다.
보다 구체적으로는, 본 발명은
1. 하기 공정 (1)~(4)를 갖는 광독성 시험 방법(이하, 본 발명 광독성 시험 방법이라고 기재하기도 함):
(1) 인간 망막 색소 상피세포에 피험물질을 접촉시키는 제1 공정;
(2) 제1 공정에서 피험물질을 접촉시킨 인간 망막 색소 상피세포를, 제1 공정에 있어서의 접촉 개시 후 24시간 이내에, 340nm에서 380nm까지의 범위의 파장 분포를 포함하는 인공광을 조사하면서 배양하는 제2 공정;
(3) 제2 공정에서 배양된 인간 망막 색소 상피세포를 회수하고, 회수된 배양 세포에서의 세포 독성 혹은 그에 상관관계를 갖는 지표치를 측정하는 제3 공정;및
(4) 제3 공정의 측정 결과에 의해서 피험물질의 광독성 발현 능력의 유무 또는 그 정도를 평가하여, 피험물질의 광독성 발현 능력을 검정하는 제4 공정;
2. 상기 인공광이, 자외광, 가시광 및 적외광으로 이루어지는 의사(擬似) 태양광인 전항 1에 기재된 광독성 시험 방법;
3. 제2 공정에 있어서의 인공광의 조사가, 파장 360nm에서의 측정치로서 3J/cm2에서 30J/cm2까지의 범위인 광조사량이 되는 조사인, 전항 1 또는 2 기재된 광독성 시험 방법;
4. 상기 제4 공정에 있어서, 상기 제3 공정의 측정 결과와, 대조의 인간 망막 색소 상피세포에 있어서의 회수된 배양 세포에서의 세포 독성 혹은 그에 상관관계를 갖는 지표치의 측정 결과를 비교하고, 그 차이에 의거하여 피험물질의 광독성 발현 능력의 유무 또는 그 정도를 평가하는, 전항 1~3 중 어느 한 항에 기재된 광독성 시험 방법;
5. 상기 대조가, 인간 망막 색소 상피세포에 기지의 광독성 발현 물질을 접촉시킨 양성 대조를 포함하는, 전항 4에 기재된 광독성 시험 방법;
6. 상기 광독성 발현 물질이 클로르프로마진(CPZ)인, 전항 5에 기재된 광독성 시험 방법;
7. 제2 공정에 있어서의 인공광의 조사가, 피험물질을 접촉시킨 인간 망막 색소 상피세포와 대조의 인간 망막 색소 상피세포 중 적어도 어느 한쪽의 인간 망막 색소 상피세포에 있어서, 인공광을 차광한 조건 하에서의 상기 세포의 생존 세포수에 대해, 광조사 조건 하에서의 상기 세포의 생존 세포수가 유의적으로 감소하는 광조사량을 갖는 조사인, 전항 1~6 중 어느 한에 기재된 광독성 시험 방법;
8. 상기 제2 공정에 있어서의 인공광의 조사가, 1회의 연속적 조사 또는 2회 이상의 반복 조사로 이루어지는 간헐적 조사인, 전항 1~7 중 어느 한에 기재된 광독성 시험 방법;
9. 상기 인간 망막 색소 상피세포가 줄기세포 유래의 망막 색소 상피세포인, 전항 1~8 중 어느 한에 기재된 광독성 시험 방법;
10. 상기 줄기세포가, 배아줄기세포, 인공다능성줄기세포 또는 신경줄기세포인 전항 9 기재된 광독성 시험 방법;
11. 전항 1~10 중 어느 한 항에 기재된 광독성 시험 방법을 위한, 양성 대조로서의 클로르프로마진(CPZ)의 사용;
12. 전항 1~10 중 어느 한 항에 기재된 광독성 시험 방법에 이용하기 위한 양성 대조 시약으로서, 클로르프로마진(CPZ)을 함유하는 양성 대조 시약;
13. 전항 1~10 중 어느 한 항에 기재된 광독성 시험 방법을 위한, 음성 대조로서의 페니실린 G(Penicillin G), 퀴닌(Quinine), 비티오놀(Bithionol) 또는 클로르헥시딘(Chlorhexidine)의 사용;
14. 전항 1~10 중 어느 한 항에 기재된 광독성 시험 방법에 이용하기 위한 음성 대조 시약으로서, 페니실린 G(Penicillin G), 퀴닌(Quinine), 비티오놀(Bithionol) 또는 클로르헥시딘(Chlorhexidine)을 함유하는 양성 대조 시약;
15. 전항 1~10 중 어느 한 항에 기재된 광독성 시험 방법에 의해서, 피험물질의 광독성 발현 능력을 검정하여, 원하는 광독성 발현 능력을 갖는 물질을 선발하는 광독성 발현 물질의 탐색 방법(이하, 본 발명 광독성 발현 물질 탐색 방법이라고 기재하기도 함); 및
16. 전항 1~10 중 어느 한 항에 기재된 광독성 시험 방법에 의해서, 피험물질의 광독성 발현 능력을 검정하여, 원하는 광독성 발현 능력을 갖지 않는 물질을 선발하는 의사 태양광 피부 자극 비유발 물질의 탐색 방법(이하, 본 발명 의사 태양광 피부 자극 비유발 물질 탐색 방법이라고 기재하기도 함); 등을 제공하는 것이다.
본 발명 광독성 시험 방법에 의하면, 피험물질의 광독성 발현 능력의 검정을 효과적으로 행할 수 있다. 또한, 본 발명에서는, 상기 시험 방법에 양성 대조로서 이용할 수 있는 광독성 발현 물질을 제공할 수 있다.
본 발명 광독성 발현 물질 탐색 방법에 의하면, 원하는 광독성 발현 물질 또는 의사 태양광 피부 자극 비유발 물질의 탐색을 간편하게 행할 수 있다
도 1은, 인간 배아줄기세포(즉, ES세포)로부터 분화 유도하여 얻어진 인간 망막 색소 상피세포의 명시야상을 나타내는 도면이다.
도 2는, 인간 배아줄기세포(즉, ES세포)로부터 분화 유도하여 얻어진 인간 망막 색소 상피세포를 면역 염색한 결과(빨강은 ZO-1, 파랑은 핵)를 나타내는 도면이다.
도 3은, 광세포 독성이 양성인 화합물 「클로르프로마진(CPZ))」을 피험물질로서 이용한 본 발명 광독성 시험 방법에 의해, 실시예 3에 있어서, 비광조사를 위한 (차광)대조로서 측정된 세포 독성 혹은 그에 상관관계를 갖는 지표치에 관한 결과를 나타내는 도면이다.
도 4는, 광세포 독성이 음성인 화합물 「페니실린 G(Penicillin G)」를 피험물질로서 이용한 본 발명 광독성 시험 방법에 의해, 실시예 3에 있어서, 비광조사를 위한 (차광)대조로서 측정된 세포 독성 혹은 그에 상관관계를 갖는 지표치에 관한 결과를 나타내는 도면이다.
도 5는, 광세포 독성이 음성인 화합물 「퀴닌(Quinine)」을 피험물질로서 이용한 본 발명 광독성 시험 방법에 의해, 실시예 3에 있어서, 비광조사를 위한 (차광)대조로서 측정된 세포 독성 혹은 그에 상관관계를 갖는 지표치에 관한 결과를 나타내는 도면이다.
도 6은, 광세포 독성이 음성인 화합물 「비티오놀(Bithionol)」을 피험물질로서 이용한 본 발명 광독성 시험 방법에 의해, 실시예 3에 있어서, 비광조사를 위한 (차광)대조로서 측정된 세포 독성 혹은 그에 상관관계를 갖는 지표치에 관한 결과를 나타내는 도면이다.
도 7은, 광세포 독성이 음성인 화합물 「클로르헥시딘(Chlorhexidine)」피험물질로서를 이용한 본 발명 광독성 시험 방법에 의해, 실시예 3에 있어서, 비광조사를 위한 (차광)대조로서 측정된 세포 독성 혹은 그에 상관관계를 갖는 지표치에 관한 결과를 나타내는 도면이다.
도 8은, 광세포 독성이 양성인 화합물 「클로르프로마진(CPZ))」을 피험물질로서 이용한 본 발명 광독성 시험 방법에 의해, 실시예 4에 있어서, 광조사 조건 하에서 측정된 세포 독성 혹은 그에 상관관계를 갖는 지표치에 관한 결과를 나타내는 도면이다.
도 9는, 광세포 독성이 음성인 화합물 「페니실린 G(Penicillin G)」를 피험물질로서 이용한 본 발명 광독성 시험 방법에 의해, 실시예 4에 있어서, 광조사 조건 하에서 측정된 세포 독성 혹은 그에 상관관계를 갖는 지표치에 관한 결과를 나타내는 도면이다.
도 10은, 광세포 독성이 음성인 화합물 「퀴닌(Quinine)」을 피험물질로서 이용한 본 발명 광독성 시험 방법에 의해, 실시예 4에 있어서, 광조사 조건 하에서 측정된 세포 독성 혹은 그에 상관관계를 갖는 지표치에 관한 결과를 나타내는 도면이다.
도 11은, 광세포 독성이 음성인 화합물 「비티오놀(Bithionol)」을 피험물질로서 이용한 본 발명 광독성 시험 방법에 의해, 실시예 4에 있어서, 광조사 조건 하에서 측정된 세포 독성 혹은 그에 상관관계를 갖는 지표치에 관한 결과를 나타내는 도면이다.
도 12는, 광세포 독성이 음성인 화합물 「클로르헥시딘(Chlorhexidine)」을 피험물질로서 이용한 본 발명 광독성 시험 방법에 의해, 실시예 4에 있어서, 광조사 조건 하에서 측정된 세포 독성 혹은 그에 상관관계를 갖는 지표치에 관한 결과를 나타내는 도면이다.
도 13은, 광세포 독성이 양성인 화합물 「클로르프로마진(CPZ))」을 피험물질로서 이용한 비교 광독성 시험 방법에 의해, 비교예 1에 있어서, 비광조사를 위한 (차광)대조로서 측정된 세포 독성 혹은 그에 상관관계를 갖는 지표치에 관한 결과를 나타내는 도면이다.
도 14는, 광세포 독성이 음성인 화합물 「페니실린 G(Penicillin G)」를 피험물질로서 이용한 비교 광독성 시험 방법에 의해, 비교예 1에 있어서, 비광조사를 위한 (차광)대조로서 측정된 세포 독성 혹은 그에 상관관계를 갖는 지표치에 관한 결과를 나타내는 도면이다.
도 15는, 광세포 독성이 음성인 화합물 「퀴닌(Quinine)」을 피험물질로서 이용한 비교 광독성 시험 방법에 의해, 비교예 1에 있어서, 비광조사를 위한 (차광)대조로서 측정된 세포 독성 혹은 그에 상관관계를 갖는 지표치에 관한 결과를 나타내는 도면이다.
도 16은, 광세포 독성이 음성인 화합물 「비티오놀(Bithionol)」을 피험물질로서 이용한 본 발명 광독성 시험 방법에 의해, 비교예 1에 있어서, 비광조사를 위한 (차광)대조)으로서 측정된 세포 독성 혹은 그에 상관관계를 갖는 지표치에 관한 결과를 나타내는 도면이다.
도 17은, 피험물질로서 광세포 독성이 음성인 화합물 「클로르헥시딘(Chlorhexidine)」을 이용한 본 발명 광독성 시험 방법(비교예 1:비광조사를 위한 (차광)대조)으로 측정된 세포 독성 혹은 그에 상관관계를 갖는 지표치에 관한 결과를 나타내는 도면이다.
도 18은, 광세포 독성이 양성인 화합물 「클로르프로마진(CPZ)」을 피험물질로서 이용한 비교 광독성 시험 방법에 의해, 비교예 2에 있어서, 광조사하에서 측정된 세포 독성 혹은 그에 상관관계를 갖는 지표치에 관한 결과를 나타내는 도면이다.
도 19는, 광세포 독성이 음성인 화합물 「페니실린 G(Penicillin G)」를 피험물질로서 이용한 비교 광독성 시험 방법에 의해, 비교예 2에 있어서, 광조사 조건 하에서 측정된 세포 독성 혹은 그에 상관관계를 갖는 지표치에 관한 결과를 나타내는 도면이다.
도 20은, 광세포 독성이 음성인 화합물 「퀴닌(Quinine)」을 피험물질로서 이용한 비교 광독성 시험 방법에 의해, 비교예 2에 있어서, 광조사 조건 하에서 측정된 세포 독성 혹은 그에 상관관계를 갖는 지표치에 관한 결과를 나타내는 도면이다.
도 21은, 광세포 독성이 음성인 화합물 「비티오놀(Bithionol)」을 피험물질로서 이용한 비교 광독성 시험 방법에 의해, 비교예 2에 있어서, 광조사 조건 하에서 측정된 세포 독성 혹은 그에 상관관계를 갖는 지표치에 관한 결과를 나타내는 도면이다.
도 22는, 광세포 독성이 음성인 화합물 「클로르헥시딘(Chlorhexidine)」을 피험물질로서 이용한 비교 광독성 시험 방법에 의해, 비교예 2에 있어서, 광조사 조건 하에서 측정된 세포 독성 혹은 그에 상관관계를 갖는 지표치에 관한 결과를 나타내는 도면이다.
도 23은, 광조사량의 설정을 위한 예비 시험(실시예 6)에서의 결과를 나타내는 도면이다. OECD 가이드라인에서 양성 대조로서 이용되고 있는 클로르프로마진(CPZ)을 이용하여, 광조사량과 상술한 PIF치(즉, 피험물질을 접촉시킨 인간 망막 색소 상피세포에 있어서의 세포 독성 IC50치(비광조사를 위한 (차광)대조)를, 피험물질의 접촉 후에 의사 태양광의 조사하에서 배양된 인간 망막 색소 상피세포에 있어서의 세포 독성 IC50치로 나누어 얻어진 값)과의 관계를 검토한 것이다.
도 24는, 광조사량의 설정을 위한 예비 시험(실시예 6)에서의 결과를 나타내는 도면이다. 광조사량과 상술한 PIF치의 관계를 검토한 예비 시험에 관련하여, 의사 태양광의 조사가, 클로르프로마진(CPZ) 10μg/ml를 접촉시킨 인간 망막 색소 상피세포에 있어서, 의사 태양광을 차광한 조건 하에서의 상기 세포의 생존 세포수에 대해, 상기 의사 태양광 조사 조건 하에서의 상기 세포의 생존 세포수가 유의적으로 감소하는 광조사량을 갖는 조사임을 확인한 것이다. 세로축은, 의사 태양광을 차광한 조건 하에서의 생존 세포수를 1로 했을 때의, 생존 세포수의 상대 비교치를 나타낸다. 각 광조사량마다, 좌측의 막대 그래프는 의사 태양광을 차광한 조건 하에서의 생존 세포수의 상대 비교치를 나타내고, 우측의 막대 그래프는 광조사 조건 하에서의 생존 세포수의 상대 비교치를 나타낸다.
이하, 본 발명을 실시하기 위한 형태에 대해서 상세하게 설명한다.
본 발명에 있어서의 「형질전환체」란, 형질전환에 의해 제작된 세포 등의 생명체의 전부 또는 일부를 의미한다. 형질전환체로는, 예를 들면, 원핵세포, 효모, 동물세포, 식물세포, 곤충세포 등을 들 수 있다. 형질전환체는, 그 대상에 의존하여, 형질전환세포, 형질전환 조직, 형질전환숙주 등이라고도 불리는 경우가 있다. 본 발명에서 이용되는 세포는, 형질전환체여도 된다.
본 발명에 관련된, 유전자 조작 기술에서 사용되는 원핵생물 세포로는, 예를 들면, Eschericia속, Serratia속, Bacillus속, Brevibacterium속, Corynebacterium속, Microbacterium속, Pseudomonas속 등에 속하는 원핵생물 세포, 보다 구체적으로는, Eschericia XL1-Blue, Eschericia XL2-Blue, Eschericia DH1 등을 들 수 있다. 이러한 세포는, 예를 들면, 'Molecular Cloning(3rd edition)' by Sambrook, J and Russell, D.W., Appendix 3(Volume3), Vectors and Bacterial strains. A3.2(Cold Spring Harbor USA 2001)에 구체적으로 기재되어 있다.
본 발명에 관련된 「벡터」란, 목적의 폴리뉴클레오티드 배열을 목적의 세포로 이입시킬 수 있는 벡터를 의미한다. 이러한 벡터로는, 예를 들면, 원핵세포, 효모, 동물세포, 식물세포, 곤충세포, 동물 개체 혹은 식물 개체 등의 숙주세포에 있어서 자립 복제가 가능하고, 또는, 염색체중으로의 도입 가능한, 폴리뉴클레오티드의 전사(轉寫)에 적절한 위치에 프로모터를 함유하고 있는 것 등을 들 수 있다.
이러한 벡터 중, 클로닝에 적절한 벡터를 「클로닝 벡터」라고 기재하기도 한다. 이러한 클로닝 벡터는, 통상, 제한효소 부위를 복수 포함하는 멀티플 클로닝 부위를 포함한다. 현재, 유전자의 클로닝에 사용 가능한 벡터는, 상기 기술 분야에서 다수 존재하고 있으며, 판매원에 의해, 미묘한 차이(예를 들면, 멀티 클로닝사이트의 제한효소의 종류나 배열)로부터 이름을 바꾸어 판매되고 있다. 예를 들면, Molecular Cloning(3rd edition)' by Sambrook, J and Russell, D.W., Appendix 3(Volume 3), Vectors and Bacterial strains. A3.2(Cold Spring Harbor USA, 2001))에 그 대표적인 것이 발매원과 함께 기재되어 있으며, 이러한 것을 당업자는 적절하게 목적에 따라 사용할 수 있다.
본 발명에 관련된 「벡터」는, 「발현 벡터」, 「리포터 벡터」, 「재조합 벡터」도 포함한다. 「발현 벡터」란, 구조 유전자 및 그 발현을 조절하는 프로모터에 추가해 다양한 조절 엘리먼트가 숙주세포 중에서 작동할 수 있는 상태로 연결되어 있는 핵산 배열을 의미한다. 「조절 엘리먼트」로는, 예를 들면, 터미네이터, 약제 내성 유전자와 같은 선택 마커, 및, 인핸서를 포함하는 것 등을 들 수 있다. 생물(예를 들면, 동물)의 발현 벡터의 타입 및 사용되는 조절 엘리먼트의 종류가 숙주세포에 따라 바뀔 수 있는 것은, 당업자에게 있어서 주지의 사항이다.
본 발명에 관련하여 「재조합 벡터」로는, 예를 들면, (a) 게놈 라이브러리의 스크리닝을 위해서는, 람다 FIX 벡터(파지 벡터), (b) cDNA의 스크리닝을 위해서는, 람다 ZAP 벡터(파지 벡터), (c) 게놈 DNA의 클로닝을 위해서는, 예를 들면, pBluescript II SK+／-, pGEM, pCR2.1 벡터(플라스미드 벡터) 등을 들 수 있다. 또 「발현 벡터」로는, 예를 들면, pSV2/neo 벡터, pcDNA 벡터, pUC18 벡터, pUC19 벡터, pRc/RSV 벡터, pLenti6/V5-Dest 벡터, pAd/CMV/V5-DEST 벡터, pDON-AI-2/neo 벡터, pMEI-5/neo 벡터 등(플라스미드 벡터) 등을 들 수 있다. 또 「리포터 벡터」로는, 예를 들면, pGL2 벡터, pGL3 벡터, pGL4.10 벡터, pGL4.11 벡터, pGL4.12 벡터, pGL4.70 벡터, pGL4.71 벡터, pGL4.72 벡터, pSLG 벡터, pSLO 벡터, pSLR 벡터, pEGFP 벡터, pAcGFP 벡터, pDsRed 벡터 등을 들 수 있다. 이러한 벡터는, 상술한 Molecular Cloning지를 참고하여 적절히 이용하면 된다.
본 발명에 관련하여, 핵산 분자를 세포 내에 도입하는 기술로는, 예를 들면, 형질전환, 형질 도입, 트랜스펙션 등을 들 수 있다. 이러한 도입 기술로는, 구체적으로는 예를 들면, Ausubel F. A. et al.편(1988), Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, New York, NY;Sambrook J. 등(1987), Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2nd Ed. 및 그 제3판, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 별책 실험 의학 「유전자 도입＆발현 해석 실험법」요도샤(1997) 등에 기재되는 방법 등을 들 수 있다. 유전자가 세포 내에 도입된 것을 확인하는 기술로는, 예를 들면, 노던블롯(northern blot) 분석, 웨스턴블롯(Western blot) 분석 또는 다른 주지 관용 기술 등을 들 수 있다.
또, 본 발명에 관련하여, 벡터의 도입 방법으로는, 예를 들면, 트랜스펙션, 형질 도입, 형질전환 등(예를 들면, 인산칼슘법, 리포솜법, DEAE Dextran법, 일렉트로포레이션법, 입자총법(particle gun method) (유전자총)을 이용하는 방법 등)을 들 수 있다.
본 발명 광독성 시험 방법은, 하기 공정 (1)~(4)를 갖는 광독성 시험 방법이다:
(1) 인간 망막 색소 상피세포에 피험물질을 접촉시키는 제1 공정;
(2) 제1 공정에서 피험물질을 접촉시킨 인간 망막 색소 상피세포를, 제1 공정에 있어서의 접촉 개시 후 24시간 이내에, 340nm에서 380nm까지의 범위의 파장 분포를 포함하는 인공광을 조사하면서 배양하는 제2 공정;
(3) 제2 공정에서 배양된 인간 망막 색소 상피세포를 회수하고, 회수된 배양 세포에서의 세포 독성 혹은 그에 상관관계를 갖는 지표치를 측정하는 제3 공정; 및
(4) 제3 공정의 측정 결과에 의해서 피험물질의 광독성 발현 능력의 유무 또는 그 정도를 평가하고, 피험물질의 광독성 발현 능력을 검정하는 제4 공정.
본 발명에 있어서의 「피험물질」로는, 특별히 한정은 없고, 모든 화학물질이 대상이 되지만, 예를 들면, 의약품, 농약, 화장품, 공업제품 등의 용도에 사용되는 물질, 향후 사용될 가능성이 있는 개발 도상의 물질 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서의 「광독성」으로는, 예를 들면, 의사 태양광 조사가 관여하고 있는 독성 반응에 의해 야기되는 독성 등을 들 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면, 눈이나 피부 등에 발생하는 1차 자극 반응으로서의 광자극성, 알러지 반응인 광감작성(光感作性)(광알러지성), 광발암성, 또한 광유전독성(photogenotoxicity) 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서의 「세포 독성」으로는, 예를 들면, 세포사나 세포 증식 저해 등 세포의 생존에 영향을 주는 독성 등을 들 수 있다. 세포 독성 혹은 그에 상관관계를 갖는 지표치는, 예를 들면, 혈구 계산반을 이용하는 방법, 셀카운터에 의한 방법, 3H티미딘 등의 방사성 동위체를 이용하는 방법(3H티미딘 등의 방사성 동위체를 세포 배양액에 추가해 인큐베이팅하는 것만으로, 생세포만을 측정하는 간편한 방법), LDH(유산탈수소효소)법, 뉴트럴레드(NR)를 이용하는 방법(적색색소뉴트럴레드가 생세포의 리소좀에 도입되어 축적되는 성질을 이용한 방법으로, 생세포만을 측정하는 간편한 방법), 크리스탈 바이올렛(CR)을 이용하는 방법(크리스탈바이올렛이 생세포의 세포막에 들어가 염색하는 성질을 이용한 방법으로, 생세포만을 측정하는 간편한 방법), 테트라졸륨염을 이용하는 방법(테트라졸륨염이 세포내 미토콘드리아의 탈수소효소의 기질이며, 생존능이 높은 세포일수록 환원되는 테트라졸륨염의 양이 많아, 그 결과 발생하는 포르마잔량이 생존 세포수와 제대로 대응하므로, 생세포만을 측정하는 간편한 방법), 마커 유전자(예를 들면, RPE65, Mitf, ZO1)의 발현량을 측정하는 방법, ATP량을 측정하는 방법, 멜라닌량을 측정하는 방법, 미토콘드리아의 활성을 MTT법에 의해 측정하는 방법 등의 통상 이용되는 방법에 의해 측정하면 된다. 피험물질의 「접촉」과「세정·배지교환」의 반복 등에 의해 피험물질의 반복 접촉을 행할 때는, 각 사이클에서 회수된 배양 세포에서의 세포 독성 혹은 그에 상관관계를 갖는 지표치를 측정하는 것이 바람직하다.
상기와 같은, 세포 독성 혹은 그에 상관관계를 갖는 지표치를 측정하는 경우에는, 일반적으로 입수 가능한 측정 킷을 이용하여 측정해도 된다. 미토콘드리아의 활성, ATP량, 유산탈수소효소 활성 등의 측정 킷으로는, 예를 들면, CellTiter-Glo(등록상표) Luminescent Cell Viability Assay, Dual-Glo(등록상표) Luciferase Assay System, Bright-Glo(등록상표) Luciferase Assay System, Steady-Glo(등록상표) Luciferase Assay System, Luciferase Assay Systems, ApoTox-Glo(등록상표) Triplex Assay, Cell Titer-Fluor(등록상표) Cell Viability Assay, CytoTox 96(등록상표) Non-Radioactive Cytotoxicity Assay(프로메가사), ATP Bioluminescence Assay Kit HS II Cell Proliferation Kit I(MTT), Cell Proliferation Kit II(XTT)(로슈사), LDH Cytotoxicity Assay Kit(Cayman Chemical사), ADP Assay Kit, EnzyLight(BioAssay Systems사) 등을 들 수 있다.
본 발명 광독성 시험 방법에 있어서, 세포 독성 혹은 그에 상관관계를 갖는 지표치로서 마커 유전자(예를 들면, RPE65, Mitf, ZO1)의 발현량을 측정하는 방법을 채용하는 경우에 대해서 더욱 상세하게 설명한다.
우선 「마커 유전자의 발현」이란, 마커 유전자에 따라 발현된 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 혹은 핵산, 또는, 단백질, 폴리펩티드, 올리고펩티드 혹은 펩티드 등의 발현을 포함한다.
마커 유전자의 발현량을 측정하는 방법으로는, 목적의 세포 등에 있어서, 예를 들면, mRNA의 전사 산물량이나 폴리펩티드의 번역 산물량을 측정하는 방법 등을 들 수 있다. mRNA의 발현량(전사 산물량)을 측정하는 방법으로는, 예를 들면, 노던블롯법, 도트블롯법, PCR법, 리얼타임PCR법, 리포터 유전자를 이용한 방법 등의 분자생물학적 측정 방법을 포함하는 임의의 적절한 방법 등을 들 수 있다. 또 폴리펩티드의 발현량(번역 산물량)을 측정하는 방법으로는, 예를 들면, ELISA법, RIA법, 형광항체법, 웨스턴블롯법, 면역조직 염색법 등의 면역학적 측정 방법을 포함하는 임의의 적절한 방법 등을 들 수 있다. 유전자의 발현 변동은, 통상의 분자생물학적 측정 방법 또는 면역 학문적 측정 방법을 포함하는 임의의 적절한 방법에 의해 평가되는 mRNA 레벨 또는 폴리펩티드의 단백질 레벨에서의 발현량이 증가 또는 감소하는 것을 의미한다. 또, 다른 방법으로서, 어레이(예를 들면, DNA 어레이, 단백질 어레이)를 이용한 유전자 해석 방법 등도 들 수 있다. DNA 어레이에 대해서는, 예를 들면, 슈준사편, 세포 공학 별책 「DNA 마이크로 어레이와 최신 PCR법」등 , 단백질 어레이에 대해서는, Nat Genet. 2002 Dec;32 Suppl:526-32 등에 기재되어 있다. 또한, RT-PCR, RACE법, SSCP법, 면역 침강법, two-hybrid 시스템, 인비트로 번역 등도 들 수 있다. 이러한 방법에 대해서는, 예를 들면, 게놈 해석 실험·나카무라 유스케 실험실·매뉴얼, 편집·나카무라 유스케 요도샤(2002) 등에 기재되어 있다.
리포터 유전자를 이용한 방법으로는, 마커 유전자의 프로모터 배열에 작동 가능하도록 연결되는 리포터 유전자를 도입한 벡터를 제작하고, 그것을 인간 망막 색소 상피세포에 유전자 도입함으로써, 안정 형질전환체를 제작하는 방법 등을 들 수 있다. 제작된 안정 형질전환체는, 리포터 유전자를 세포 내에서 발현하기 위해서, 리포터 유전자의 활성이나 발현량을 측정하면, 상기 측정치를 생존하는 인간 망막 색소 상피세포의 양에 상관관계를 갖는 지표치로서 이용할 수 있다.
여기서 「리포터 유전자」로는, 예를 들면, 반딧불 루시퍼라아제 유전자(firefly luc), 레닐라 루시퍼라아제 유전자(renillaluc), β-갈락토시다아제 유전자, 클로람페니콜아세틸트랜스퍼라아제 유전자, 또는, 핵산 구축물이 도입되는 숙주세포에서의 시각으로의 선택을 가능하게 하는 선택 마커 유전자를 들 수 있다. 이러한 선택 마커 유전자로는, 예를 들면, 녹색형광단백질(GFP) 유전자, 청색형광단백질(CFP) 유전자, 황색형광단백질(YFP) 유전자, 적색형광단백질(dsRed) 유전자 등의 생세포에서의 관찰이 가능한 형광색소 마커 유전자 또는 색소 마커 유전자 등을 들 수 있다. 상기 선택 마커 유전자 및 선택 마커 단백질은, 숙주세포에 대해 실질적으로 독성을 나타내지 않는 것이 바람직하다. 또, 리포터 유전자의 발현 유무 또는 그 정도를 검출하는 방법으로는, 선택 마커 단백질이 효소인 경우에도, 형광단백질인 경우에도, 공지의 검출 방법 등을 이용하면 된다.
「프로모터」란, 유전자의 전사의 개시 부위를 결정하고, 또 그 빈도를 직접적으로 조절하는 DNA상의 영역을 의미한다. 통상, RNA 폴리메라아제가 결합하여 전사를 시작하는 염기 배열이다. 「프로모터 배열」이란, 어떤 유전자의 프로모터의 기능을 갖는 부분을 말한다. 프로모터 배열은, 통상, 추정 단백질 코드 영역의 제1 엑손 또는 전사 개시점의 상류 약 5kbp 이내의 영역인 것이 많기 때문에, DNA 해석용 소프트웨어를 이용하여 게놈 염기 배열중의 단백질 코드 영역을 예측하면, 프로모터 배열을 추정할 수 있다. 이러한 DNA 해석용 소프트웨어로는, 예를 들면, DNASIS 소프트웨어(히타치 소프트웨어), GENETYX(주식회사 제네틱스) 등을 들 수 있다. 추정 프로모터 배열은, 구조 유전자마다 상이하며, 통상, 구조 유전자의 상류에 존재하는데, 이들에 한정되지 않고, 구조 유전자의 하류에 존재하기도 한다.
상기 영역에는, Sp1 및 AP-2 등의 기지의 전사 조절 인자의 결합 가능 배열이 존재하고, 상기 영역이 발현 제어에 중요한 기능을 하는 것이 예상된다. 이것으로부터 적어도 상기 영역에 전사를 유도하기 위해서 필요 충분한 염기 배열(프로모터 배열)을 포함한다고 추측된다. 정확한 위치는, 상기 기술 분야에서 주지 관용의 기술을 이용하여 조사하면 된다.
프로모터 배열이라고 예측되는 DNA 배열을, NCBI 데이터 베이스로부터 입수하는 방법을 설명한다.
인간 ZO-1(TJP1) 유전자의 프로모터 배열을 포함한다고 예측되는 전사 개시점 상류의 게놈 DNA 배열에 관해서는, 인터넷상의 MCSC Genome Browser 홈 페이지에서, human reference sequence를 검색 대상 데이터 베이스로서 설정하고, 「TJP1」을 키워드로서 검색함으로써, TJP1 유전자에 관한 Sequence and Links to Tools and Databases의 링크 일람이 표시된다. 이 링크처로부터, 「Genomic Sequence Near Gene」페이지로 이동한다. 다음에, Sequence Retrieval Region Options의 체크 박스에 체크한 후, 「Promoter/Upstream by」를 5000bases로 설정하고, 또한 「5' UTR Exons」의 체크 박스에 체크한 후, submit 버튼을 클릭함으로써, 전사 개시점 상류 5kb와 제1 엑손을 포함하는 5' UTR의 게놈 DNA 배열을 취득할 수 있다. 또, NCBI 홈 페이지상에서 「TJP1」를 키워드로서 검색함으로써, nm_003257.3인 등록 번호를 취득할 수 있어 TJP1의 mRNA 배열을 입수할 수 있다. 이들 게놈 배열과 mRNA 배열을, DNA 해석용 소프트웨어를 이용하여 분석함으로써, 전사 개시점부터 상류의 약 5kbp의 DNA 배열을 입수할 수 있다. DNA 해석용 소프트웨어로는, 상술한 바와 같이, 예를 들면, DNASIS 소프트웨어(히타치 소프트웨어), GENETYX(주식회사 제네틱스) 등을 들 수 있다.
「프로모터 배열에 작동 가능하게 연결된다」라는 것은, 원하는 유전자의 발현(작동)이 있는 프로모터 배열의 제어하에 배치되는 것을 의미한다. 프로모터가 유전자에 작동 가능하게 연결되기 위해서는, 통상, 그 유전자의 바로 상류에 프로모터가 배치되는데, 반드시 인접해서 배치될 필요는 없다.
본 발명에 있어서의 「인간 망막 색소 상피세포」란, 예를 들면, 인간 유래의 세포이며, 망막의 외층에 위치하는 상피세포이다. 상기 세포는, 시세포의 유지에 중요한 기능을 갖는 세포이다. 형상은 단층의 입방 상피세포이며, 상호간은 tight junction으로 결합되고, 흑색의 색소를 갖는 세포이다.
상기 인간 망막 색소 상피세포로는, 배양 가능하면 특별히 제한은 없다. 바람직한 실시형태에서는, 구체적으로는 예를 들면, 줄기세포 유래의 망막 색소 상피세포(즉, 예를 들면, 배아줄기세포(즉, ES세포), 인공다능성줄기세포(즉, iPS 세포), 신경줄기세포 등의 줄기세포로부터 분화 유도시킨 배양이 용이한 인간 망막 색소 상피세포 등), 생체 조직으로부터 직접 취득한 배양이 용이한 인간 망막 색소 상피세포 등을 들 수 있다. 또, 배양 세포화된 암세포 유래의 인간 망막 색소 상피세포, 인위적인 조작에 의해 불사화된 배양이 용이한 인간 망막 색소 상피세포 등도 들 수 있다.
여기서 「줄기세포」란, 세포 분열을 거쳐도 같은 분화능을 유지하는 세포를 의미하며, 조직이 상해를 받았을 때에 그 조직을 재생할 수 있다. 상기 「줄기세포」로는, 예를 들면, 배아줄기세포 혹은 조직줄기세포(조직성줄기세포, 조직 특이적줄기세포 또는 체질줄기세포라고도 불림) 또는 인공다능성줄기세포(iPS 세포:induced pluripotent stem cell) 등을 들 수 있다.
본 발명 광독성 시험 방법에서 사용되는 바람직한 줄기세포로는, 예를 들면, 배아줄기세포(즉, ES세포), 인공다능성줄기세포(즉, iPS 세포), 신경줄기세포 등을 들 수 있다.
「배아줄기세포」(즉, ES세포)는, 자기 복제능을 갖고, 다분화능(즉, 다능성 「pluripotency」)을 갖는 줄기세포이며, 초기배아에 유래하는 다능성줄기세포를 의미한다. 배아줄기세포는, 1981년에 처음으로 수립되고, 1989년 이후 녹아웃 마우스 제작에도 응용되고 있다. 1998년에는 인간 배아줄기세포가 수립되어, 재생 의학에도 이용되고 있다. 신경줄기세포 등을 포함하는 조직줄기세포는, 배아줄기세포와는 달리, 분화의 방향이 한정되어 있는 세포이며, 조직중의 특정의 위치에 존재하고, 미분화의 세포 내 구조를 하고 있다. 따라서, 조직줄기세포는 다능성의 레벨이 낮다. 조직줄기세포는, 핵/세포질비가 높고, 세포 내 소기관이 부족하다. 조직줄기세포는, 대체로, 다분화능을 갖고, 세포 주기가 늦고, 개체의 일생 이상으로 증식능을 유지한다. 인공다능성줄기세포는 섬유아세포 등 분화한 세포를 Oct3/4, Sox2, Klr4, Myc 등 수 종류의 유전자의 발현에 의해 직접 초기화하여 다분화능을 유도한 세포이며, 2006년, 야마나카 등에 의해 마우스세포로 수립되었다(Takahashi K, Yamanaka S. Cell.2006, 126(4), p663-676). 2007년, 인간 섬유아세포로도 수립되고, 배아줄기세포와 동일하게 다분화능을 갖는다(Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, Ichisaka T, Tomoda K, Yamanaka S.Cell.2007, 131(5), p861-872., Yu J, Vodyanik MA, Smuga-Otto K, Antosiewicz-Bourget J, Frane JL, Tian S, Nie J, Jonsdottir GA, Ruotti V, Stewart R, Slukvin II, Thomson JA., Science. 2007, 318(5858), p1917-1920., Nakagawa M, Koyanagi M, Tanabe K, Takahashi K, Ichisaka T, Aoi T, Okita K, Mochiduki Y, Takizawa N, Yamanaka S. Nat Biotechnol., 2008, 26(1), p101-106).
본 발명 광독성 시험 방법에 있어서의 제1 공정은, 인간 망막 색소 상피세포에 피험물질을 접촉시키는 공정이다.
상기 제1 공정에서는, 인간 망막 색소 상피세포에 피험물질을 접촉시킨다. 인간 망막 색소 상피세포와 피험물질의 접촉 시간으로서, 예를 들면, 1분간 이상을, 바람직하게는 5분간 이상 3일간 이내, 보다 바람직하게는 10분간 이상 24시간 이내 등을 들 수 있다. 상기 접촉시의 보온 온도로는, 예를 들면, 15℃~42℃ 정도를, 바람직하게는 35℃~42℃ 정도, 보다 바람직하게는 35℃~37℃ 정도, 특히 바람직하게는 37℃ 정도 등을 들 수 있다. 또, 상기 접촉이 배양액 중에서의 접촉인 경우에는, 상기 배양액의 pH로는, 예를 들면, pH5~pH9 정도를, 바람직하게는 pH6.5~pH7.8 정도를 들 수 있다.
상기 제1 공정에 있어서의 피험물질 접촉시의 탄산 가스 농도로는, 예를 들면, 0%~25% 정도 등을 들 수 있다.
상기 제1 공정에 있어서의 피험물질 접촉시의 바람직한 습도로는, 예를 들면, 95±5%rh 정도, 보다 바람직하게는 100%rh 정도 등을 들 수 있다.
인간 망막 색소 상피세포에 접촉시키는 피험물질의 농도 및 적용량에 대해서는, 특별히 한정은 없고, 피험물질의 종류, 예상되는 피험물질의 광독성 발현 능력, 제1 공정에서의 인간 망막 색소 상피세포와 피험물질의 접촉 시간, 제2 공정에서의 배양 시간, 제2 공정에서의 광조사량 등에 의해서 적당히 결정하면 된다. 예를 들면, 0.001μM~10mM정도이며, 바람직하게는 0.01μM~5mM 정도 등을 들 수 있다.
상기 제1 공정에 있어서의 접촉계 내에서의 인간 망막 색소 상피세포의 밀도로는, 예를 들면, 1×104cell/cm2~4×106cell/cm2 정도이며, 바람직하게는 4×104cell/cm2~4×105cell/cm2 정도 등을 들 수 있다.
본 발명 광독성 시험 방법에 있어서의 제2 공정은, 제1 공정에서 피험물질을 접촉시킨 인간 망막 색소 상피세포를, 제1 공정에 있어서의 접촉 개시 후 24시간 이내에, 340nm에서 380nm까지의 범위의 파장 분포를 포함하는 인공광을 조사하면서 배양하는 공정이다.
상기 제2 공정에서는, 제1 공정에서 피험물질을 접촉시킨 인간 망막 색소 상피세포를, 제1 공정에 있어서의 접촉 개시 후 24시간 이내에, 340nm에서 380nm까지의 범위의 파장 분포를 포함하는 인공광을 조사하면서 배양한다. 그리고, 피험물질이 광독성 발현 능력을 갖는 경우에는, 본 공정에서 그 광독성 발현 능력을 발현시킬 수 있다. 이 때, 상기 인공광을 흡수하는 색소나, 피험물질을 흡착할 가능성이 있는 혈청 등의 단백질 성분을 포함하지 않는 배양액을 사용하는 것이 바람직하다.
바람직한 실시형태에서는, 제1 공정에 있어서의 접촉 개시 후 12시간 이내, 보다 바람직하게는 6시간 이내, 특히 바람직하게는 10분간~2시간 정도 이내에, 340nm에서 380nm까지의 범위의 파장 분포를 포함하는 인공광을 조사하면서 배양한다.
본 발명 검정 방법에 있어서의 바람직한 실시형태에서는, 상기 제1 공정(즉, 피험물질과의 접촉)과 상기 제2 공정(즉, 인공 광조사하에서의 배양)이 병행하여 진행하면서 실시되어도 된다. 보다 구체적으로는, 제1 공정에서 접촉시킨 피험물질을 제거한 상태로 제2 공정을 실시해도 되고, 피험물질이 존재한 상태로 제2 공정을 실시해도 된다.
제1 공정에 있어서의 접촉 개시 후부터 제2 공정에 있어서의 인공광의 조사 개시전까지의 기간에 있어서, 제1 공정에서 피험물질을 접촉시킨 인간 망막 색소 상피세포는, 예를 들면, 15℃~42℃ 정도를, 바람직하게는 35℃~42℃ 정도, 보다 바람직하게는 35℃~37℃ 정도, 특히 바람직하게는 37℃ 정도 등의 배양 온도하에서 한편 인공광의 비조사하에서 배양해두면 된다. 또 제1 공정에 있어서의 피험물질의 인간 망막 색소 상피세포에 대한 24시간 이내의 접촉 후, 상기 배양 세포를 세정·배지교환하고 나서 제2 공정에 있어서의 인공광의 조사에 제공함으로써, 세포 밖에 있는 피험물질의 영향을 배제하여, 제1 공정에서 세포 내에 도입된 피험물질의 작용만을 평가할 수도 있다.
상기 제2 공정에 있어서의 배양시의 탄산 가스 농도로는, 예를 들면, 0%~25%정도 등을 들 수 있다.
상기 제2 공정에 있어서의 배양시의 습도로는, 예를 들면, 95±5%rh 정도, 바람직하게는 100%rh 정도 등을 들 수 있다.
조사하는 인공광은, 340nm에서 380nm까지의 범위의 파장 분포를 포함하는 인공광이다. 바람직하게는, 예를 들면, 자외광, 가시광 및 적외광으로 이루어지는 의사 태양광인 인공광 등을 들 수 있다. 보다 바람직하게는, 예를 들면, 305nm 미만의 파장의 자외광과 850nm 이상의 파장의 적외광을 포함하지 않고, 또한, 315nm에서 800nm까지의 범위의 파장 분포를 갖는 광을 포함하는 유사 태양광 등을 들 수 있다.
상기 인공광으로는, 예를 들면, 자외선램프, 수은램프, 할로겐램프, LED, 크세논램프, 메탈할라이드램프, 나트륨램프 등을 광원으로 한 광 등을 들 수 있다. 바람직하게는, 예를 들면, 크세논램프, 수은램프 등을 광원으로 한 자외광이나 의사 태양광 등을 들 수 있다. 보다 바람직하게는, 예를 들면, 크세논램프, 수은램프 등을 광원으로 한 의사 태양광 등을 들 수 있다. 필요에 따라서 특정의 파장만을 통과시키는 필터나 특정의 파장을 차단하는 필터 등을 이용하여, 원하는 파장 분포를 갖는 인공광으로 조정하고 나서 사용하면 된다.
덧붙여서, 의사 태양광을 조사하기 위한 구체적인 광조사 장치로서 예를 들면, SOL500, SOL1200, SOL2000(Dr. K. Honle Medizintechnik사), SUNTEST CPS/CPS+, SUNTEST XLS+(Atlas Material Testing Technology사), SXL-2500V2, XI-01B140KB1(세릭사)를 들 수 있다.
상기 제2 공정에 관하여, 피험물질이 존재한 상태로 제2 공정을 실시하는 경우에는, 피험물질의 「인공 광조사하에서의 접촉 시간」을 조절할 수도 있다. 즉, 배양 시간 및 인공광의 광조사량을 적절히 설정함으로써, 원하는 「인공 광조사하에서의 접촉 시간」을 실현할 수 있다. 인공광의 조사는, 연속적 또는 간헐적으로 행할 수 있다. 인공광의 조사를 연속적으로 행하는 경우에는, 배양 시간이 「인공 광조사하에서의 접촉 시간」에 상당한다. 예를 들면, 연속적인 인공 광조사하에서, 15분간, 30분간, 1시간 또는 2시간 배양함으로써, 15분간, 30분간, 1시간 또는 2시간의 「인공 광조사하에서의 접촉 시간」을 실현할 수 있다. 한편, 인공광의 조사를 간헐적으로 행하는 경우에는, 인공광의 조사 시간이 「인공 광조사하에서의 접촉 시간」에 상당한다. 예를 들면, 24시간의 배양 기간중, 최초의 12시간을 인공광의 조사하에서 배양하고, 나머지 12시간을 인공광을 차단한 상태로 배양함으로써, 12시간의 「인공 광조사하에서의 접촉 시간」을 실현할 수 있다.
인간 망막 색소 상피세포의 배양 온도로는, 예를 들면, 15℃~42℃ 정도를 들 수 있다.
상기 제2 공정에 관하여, 340nm에서 380nm까지의 범위의 파장 분포를 포함하는 인공광을 조사할 때의 바람직한 광조사량으로는, 예를 들면, 파장 360nm에서의 측정치로서 3J/cm2로부터 30J/cm2까지의 범위인 광조사량 등을 들 수 있다. 이러한 원하는 「광조사량」을 얻으려면, 예를 들면, 인공광의 광조사 강도 및 인공광의 광조사 시간 등을 적절히 설정하면 된다. 광조사량(J/cm2)은, 예를 들면, 시간(분 )×광조사 강도(mW/cm2)×60÷1000이라는 수식에 의해 산출하면 된다. 구체적으로는 예를 들면, 파장 360nm에서의 측정치로 약 2.08mW인 광조사 강도의 인공광을 40분간 조사함으로써, 약 5J/cm2의 광조사량이 된다고 판명된다.
바람직한 실시형태에서는, 인공광의 조사로서, 예를 들면, 피험물질을 접촉시킨 인간 망막 색소 상피세포와 대조의 인간 망막 색소 상피세포 중 적어도 어느 한쪽의 인간 망막 색소 상피세포에 있어서, 인공광을 차광한 조건 하에서의 상기 세포의 생존 세포수에 대해, 광조사 조건 하에서의 상기 세포의 생존 세포수가 유의적으로 감소하는 광조사량을 갖는 조사 등을 들 수 있다. 이러한 바람직한 광조사량의 설정에는, 예를 들면, 후술하는 실시예 6에 기재되는 방법 등에 준거하여 예비 시험을 실시하면 되고, 바람직한 광조사량임을 용이하게 확인할 수 있다.
보다 구체적인 실시형태에서는, 인공광의 조사로서, 예를 들면, 파장 360nm에서의 측정치로서 3J/cm2로부터 30J/cm2까지의 범위인 의사 태양광의 광조사량이 되는 광조사 등을 들 수 있다. 보다 바람직하게는, 예를 들면, 파장 360nm에서의 측정치로서 3.5J/cm2에서 20J/cm2까지의 범위인 의사 태양광의 광조사량이 되는 조사 등을 들 수 있다. 특히 바람직하게는, 예를 들면, 파장 360nm에서의 측정치로서 5J/cm2로부터 10J/cm2까지의 범위인 의사 태양광의 광조사량이 되는 조사 등을 들 수 있다.
이상의 광을 조사함으로써, 보다 확실하게 피험물질의 광독성 발현 능력을 발현시킬 수 있다.
본 발명 광독성 시험 방법에 있어서의 제3 공정은, 제2 공정에서 배양된 인간 망막 색소 상피세포를 회수하고, 회수된 배양 세포에서의 세포 독성 혹은 그에 상관관계를 갖는 지표치를 측정하는 공정이다.
상기 제3 공정에서는, 제2 공정에서 배양된 인간 망막 색소 상피세포에 있어서의 회수된 배양 세포에서의 세포 독성 혹은 그에 상관관계를 갖는 지표치를 측정한다.
배양 세포에서의 세포 독성 혹은 그에 상관관계를 갖는 지표치는, 상술한 바와 같이, 예를 들면, 혈구 계산반을 이용하는 방법, 셀 카운터에 의한 방법, 3H티미딘 등의 방사성 동위체를 이용하는 방법(3H티미딘 등의 방사성 동위체를 세포 배양액에 추가해 인큐베이팅하는 것만으로, 생세포만을 측정하는 간편한 방법), LDH(유산탈수소효소)법, 뉴트럴레드(NR)를 이용하는 방법(적색색소뉴트럴레드가 생세포의 리소좀에 도입되어 축적되는 성질을 이용한 방법으로, 생세포만을 측정하는 간편한 방법), 크리스탈바이올렛(CR)을 이용하는 방법(크리스탈바이올렛이 생세포의 세포막에 들어가 염색하는 성질을 이용한 방법으로, 생세포만을 측정하는 간편한 방법), 테트라졸륨염을 이용하는 방법(테트라졸륨염이 세포 내 미토콘드리아의 탈수소효소의 기질이며, 생존능이 높은 세포일수록 환원되는 테트라졸륨염의 양이 많아, 그 결과 발생하는 포르마잔량이 생존 세포수와 잘 대응하므로, 생세포만을 측정하는 간편한 방법), 마커 유전자(예를 들면, RPE65, Mitf, ZO1)의 발현량을 측정하는 방법, ATP량을 측정하는 방법, 멜라닌량을 측정하는 방법, 미토콘드리아의 활성을 MTT법에 의해 측정하는 방법 등의 통상 이용되는 방법에 의해 측정하면 된다. 피험물질의 「접촉」과「세정·배지교환」의 반복 등에 의해 피험물질의 반복 접촉을 행할 때에는, 각 사이클에서 회수된 배양 세포에서의 세포 독성 혹은 그에 상관관계를 갖는 지표치를 측정하는 것이 바람직하다.
본 발명 광독성 시험 방법에 있어서의 제4 공정은, 제3 공정의 측정 결과에 의해서 피험물질의 광독성 발현 능력의 유무 또는 그 정도를 평가하고, 피험물질의 광독성 발현 능력을 검정하는 공정이다.
상기 제4 공정에서는, 제3 공정의 측정 결과에 의해서 피험물질의 광독성 발현 능력의 유무 또는 그 정도를 평가하고, 피험물질의 광독성 발현 능력을 검정한다. 피험물질의 광독성 발현 능력의 유무 또는 그 정도를 평가할 때, 대조를 설정하지 않고 제3 공정의 측정 결과의 절대치로 평가해도 되고, 대조를 설정하고, 그 측정 결과와의 비교로 평가해도 된다.
바람직한 실시형태에서는, 상기 제3 공정의 측정 결과와, 대조의 인간 망막 색소 상피세포에 있어서의 회수된 배양 세포에서의 세포 독성 혹은 그에 상관관계를 갖는 지표치의 측정 결과를 비교하고, 그 차이에 의거하여 피험물질의 광독성 발현 능력의 유무 또는 그 정도를 평가한다. 여기서, 「대조」에는 음성 대조 및 양성 대조를 둘 다 설정 가능하다. 음성 대조의 예로는, 인공광을 조사하지 않고 배양하는 인간 망막 색소 상피세포군, 광조사량이 약한 인공광의 조사하에서 배양하는 인간 망막 색소 상피세포군, 광독성 발현 능력을 갖지 않는다고 미리 알고 있는 물질(예를 들면, 용매만)을 접촉시키는 인간 망막 색소 상피세포군, 등을 들 수 있다. 이러한 음성 대조를 이용하는 경우에는, 이하와 같은 검정이 가능해진다. 즉, 피험물질에 있어서의 회수된 배양 세포에서의 세포 독성 혹은 그에 상관관계를 갖는 지표치의 측정 결과와, 음성 대조에 있어서의 회수된 배양 세포에서의 세포 독성 혹은 그에 상관관계를 갖는 지표치의 측정 결과를 비교한다. 그리고, 피험물질에 있어서의 회수된 배양 세포에서의 세포 독성 혹은 그에 상관관계를 갖는 지표치가 낮은 경우에는, 상기 피험물질은 광독성 발현 능력을 갖는다고 평가하여, 검정할 수도 있다.
또한 바람직한 실시형태에서는, 상기 대조는, 인간 망막 색소 상피세포에 기지의 광독성 발현 물질을 접촉시킨 양성 대조를 포함한다. 양성 대조의 예로는, 광독성 발현 능력을 갖는 것을 미리 알고 있는 기준 물질을 접촉시키고, 인공광의 조사하에서 배양하는 인간 망막 색소 상피세포군을 들 수 있다. 이러한 양성 대조를 이용하는 경우에는, 이하와 같은 검정이 가능해진다. 즉, 피험물질에 있어서의 회수된 배양 세포에서의 세포 독성 혹은 그에 상관관계를 갖는 지표치의 측정 결과와, 양성 대조에 있어서의 회수된 배양 세포에서의 세포 독성 혹은 그에 상관관계를 갖는 지표치의 측정 결과를 비교한다. 그리고, 피험물질에 있어서의 회수된 배양 세포에서의 세포 독성 혹은 그에 상관관계를 갖는 지표치가 낮은 경우에는, 상기 피험물질은 양성 대조에서 이용한 기준 물질보다도 높은 광독성 발현 능력을 갖는다고 평가하여, 검정할 수도 있다. 또한, 상기 기준 물질의 각 농도 또는 각 적용량에 있어서 동일하게 평가하여, 검정함으로써, 상기 피험물질의 광독성 발현 능력을 정량적으로 평가하여, 검정할 수 있다. 이 때, 양성 대조와 상기의 음성 대조를 병용하여 설정해도 된다. 또, 양성 대조의 회수된 배양 세포에서의 세포 독성 혹은 그에 상관관계를 갖는 지표치가 음성 대조의 그것보다도 낮다는 것으로써, 인공광의 조사가 제대로 행해지고, 시험이 성립했음을 나타낼 수도 있다.
한층 더 바람직한 실시형태에서는, 클로르프로마진(CPZ)을 기준 물질로서 양성 대조에 이용한다.
본 발명 광독성 시험 방법을 위한, 클로르프로마진(CPZ)의 양성 대조로서의 사용도, 본 발명의 하나이다. 또한, 본 발명 광독성 시험 방법을 위한, 클로르프로마진(CPZ)의 양성 대조로서의 사용도, 본 발명의 하나이다.
본 발명의 양성 대조 시약의 하나의 양상은, 본 발명 광독성 시험 방법에 이용하기 위한 양성 대조 시약으로서, 클로르프로마진(CPZ)을 함유한다. 시약의 형상으로는, 클로르프로마진(CPZ)을 그대로 이용해도 되고, 용매에 녹여 용액상으로 해도 된다. 또한, 적절한 기제(基劑)에 함유 또는 분산시킨 형상이어도 된다.
또한 바람직한 실시형태에서는, 페니실린 G(Penicillin G), 퀴닌(Quinine), 비티오놀(Bithionol) 또는 클로르헥시딘(Chlorhexidine)을 기준 물질로서 음성 대조에 이용한다.
본 발명 광독성 시험 방법을 위한, 페니실린 G(Penicillin G), 퀴닌(Quinine), 비티오놀(Bithionol) 또는 클로르헥시딘(Chlorhexidine)의 음성 대조로서의 사용도, 본 발명의 하나이다. 또한, 본 발명 광독성 시험 방법을 위한, 페니실린 G(Penicillin G), 퀴닌(Quinine), 비티오놀(Bithionol) 또는 클로르헥시딘(Chlorhexidine)의 음성 대조로서의 사용도, 본 발명의 하나이다.
본 발명의 음성 대조 시약의 하나의 양상은, 본 발명 광독성 시험 방법에 이용하기 위한 음성 대조 시약이며, 페니실린 G(Penicillin G), 퀴닌(Quinine), 비티오놀(Bithionol) 또는 클로르헥시딘(Chlorhexidine)을 함유한다. 시약의 형상으로는, 페니실린 G(Penicillin G), 퀴닌(Quinine), 비티오놀(Bithionol) 또는 클로르헥시딘(Chlorhexidine)을 그대로 이용해도 되고, 용매에 녹여 용액상으로 해도 된다. 또한, 적절한 기제에 함유 또는 분산시킨 형상이어도 된다.
또한, 보다 구체적인 바람직한 비교 및 평가에 관한 실시형태로서 하기의 방법도 들 수 있다. 예를 들면, 피험물질을 접촉시킨 인간 망막 색소 상피세포에 있어서의 세포 독성 IC50치(비광조사를 위한 (차광)대조)를, 피험물질의 접촉 개시 후 24시간 이내에 인공광의 조사하에서 배양된 인간 망막 색소 상피세포에 있어서의 세포 독성 IC50치로 나누어 얻어진 값(PIF치:Photo Irritation Facor치)을 구하고, 상기 값(PIF치)이 2보다 크고, 5보다 작은 경우에는 의양성(擬陽性), 5 이상인 경우에는, 피험물질은 광독성 양성이라고 평가한다.
본 발명 광독성 발현 물질 탐색 방법은, 본 발명 광독성 시험 방법에 의해서, 피험물질의 광독성 발현 능력을 검정하여, 원하는 광독성 발현 능력을 갖는 물질을 선발하는 것이다. 본 발명 광독성 발현 물질 탐색 방법에 있어서도, 상기한 본 발명 광독성 시험 방법과 동일한 실시형태를 취할 수 있다. 예를 들면, 상기 음성 대조를 이용하는 경우에는, 피험물질에 있어서의 회수된 배양 세포에서의 세포 독성 혹은 그에 상관관계를 갖는 지표치의 측정 결과와, 음성 대조에 있어서의 회수된 배양 세포에서의 세포 독성 혹은 그에 상관관계를 갖는 지표치의 측정 결과를 비교한다. 그리고, 회수된 배양 세포에서의 세포 독성 혹은 그에 상관관계를 갖는 지표치가, 음성 대조보다도 통계학적으로 유의적으로 낮은 피험물질을 선발하거나, 또는, 회수된 배양 세포에서의 세포 독성 혹은 그에 상관관계를 갖는 지표치가 음성 대조의 50% 이하의 값이 되는 피험물질을 선발하면 된다.
한편, 클로르프로마진(CPZ) 등의 양성 대조가 이용되는 경우에는, 피험물질에 있어서의 회수된 배양 세포에서의 세포 독성 혹은 그에 상관관계를 갖는 지표치의 측정 결과와, 양성 대조에 있어서의 회수된 배양 세포에서의 세포 독성 혹은 그에 상관관계를 갖는 지표치의 측정 결과를 비교한다. 그리고, 회수된 배양 세포에서의 세포 독성 혹은 그에 상관관계를 갖는 지표치가 양성 대조보다도 통계학적으로 유의적으로 낮은 피험물질을 선발하거나, 또는, 회수된 배양 세포에서의 세포 독성 혹은 그에 상관관계를 갖는 지표치가 양성 대조와 같은 값일 때의 피험물질의 농도가 양성 대조의 농도보다도 낮은 피험물질을 선발함으로써, 양성 대조에서 이용된 기준 물질보다도 높은 광독성 발현 능력을 갖는 물질을 선발할 수 있다. 또, 양성 대조가 이용되는 경우에는, 회수된 배양 세포에서의 세포 독성 혹은 그에 상관관계를 갖는 지표치를 정량적으로 평가하여, 검정할 수도 있다. 구체적으로는, 클로르프로마진(CPZ) 등의 기준 물질의 각 농도 또는 각 적용량에 있어서, 피험물질에 대해 동일하게 평가하고, 검정함으로써, 피험물질의 광독성 발현 능력을 정량적으로 평가하고, 검정할 수 있다. 그리고, 원하는 광독성 발현 능력을 갖는 물질을 선발한다.
본 발명 의사 태양광 피부 자극 비유발 물질 탐색 방법은, 본 발명 광독성 시험 방법에 의해서, 피험물질의 광독성 발현 능력을 검정하여, 원하는 광독성 발현 능력을 갖지 않는 물질을 선발하는 것이다. 본 발명 의사 태양광 피부 자극 비유발 물질 탐색 방법에 있어서도, 상기한 본 발명 광독성 시험 방법과 동일한 실시형태를 취할 수 있다. 탐색의 대상이 되는 피험물질은, 원하는 광독성 발현 능력을 갖지 않는 물질이면 어떤 것이든 되며, 예를 들면, 저분자화합물, 단백질, 펩티드 등을 들 수 있다.
본 발명 광독성 시험 방법에 의거하는 시스템 공정을 갖는 장치에 의하면, 피험물질의 광독성 발현 능력의 검정을 보다 효율적으로 행할 수 있어, 원하는 광독성 발현 물질 또는 의사 태양광 피부 자극 비유발 물질을 보다 간편하게 탐색할 수도 있다. 또, 본 발명 광독성 시험 방법에 의해 얻어진 의사 태양광 피부 자극성에 관한 독성 정보를 전자 정보 기록 매체에 기록함으로써, 독성 정보를 포함하는 유용한 전자 정보 기록 매체를 제작할 수 있다.
실시예
이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세하게 설명한다.
실시예 1(인간 ES세포의 인간 망막 색소 상피세포로의 분화 유도)
인간 배아줄기세포(즉, ES세포)로서, 교토 대학 수립주인 KhES-1주를 이용했다.
상기 KhES-1주를, bFGF(염기성 섬유아세포 증식 인자:basic fibroblast growth factor)가 첨가된 인간 ES세포 유지 배양용 배지(DMEM/F12, KSR(Knockout serum replacement), 비필수아미노산, L-글루타민, 2-메르캅토에탄올 등을 포함함)에 있어서, 마이트마이신C 처리한 배아섬유아세포(mouse embryonic fibroblast:MEF) 피더 세포상에서 미분화 유지 배양했다. 배양 후, 트립신/콜라게나아제 IV를 포함하는 해리액을 이용하여 배양 플레이트로부터 회수함으로써, 인간 배아줄기세포(즉, ES세포)의 콜로니를 얻었다.
얻어진 콜로니를, 마이크로피펫을 이용하여 피페팅함으로써, 1세포덩어리당 수십 세포 정도의 크기로 분쇄한 후, 미리 0.1% 젤라틴액으로 코팅해둔 10cm 배양 플레이트에, 1μM~10μM SB431542, 1μM~10μM CKI-7, 1μM~10μM Y27632를 포함하는 인간 ES세포 유지 배양용 배지 10ml에, 수백에서 수천 세포덩어리 정도의 인간 배아줄기세포(즉, ES세포)의 콜로니를 파종하고, 그 다음에, 이것을 37℃, 5% CO2 인큐베이터 내에서 배양했다.
다음날(배양 1일간), 부유해 있는 세포덩어리를 빨아들이지 않도록, 반분량(5ml)의 배지를 제거한 후, 1μM~10μM Y27632를 포함하는 SDIA 배지(GMEM, KSR, 비필수아미노산, 피루브산나트륨, 2-메르캅토에탄올 등을 포함함) 5ml를 상기 배양 플레이트에 첨가하고, 배양을 상기와 같이 계속했다.
배양 5일 후에, 미접착된 세포덩어리를 빨아들이지지 않도록, 5ml의 배지를 제거한 후, 1μM~10μM Y27632를 포함하는 SDIA 배지 5ml를 상기 배양 플레이트에 첨가하고, 또한 배양을 상기와 같이 계속했다.
배양 8일간 후에, 배지 전량을 제거한 후, PA6 conditioned medium(컨플루언트(confluent) 상태의 PA6 세포를 SDIA 배지에서 1일간 배양한 후의 배양상청) 10ml를 상기 배양 플레이트에 첨가했다. 이후 3일~4일간마다, PA6 conditioned medium을 이용하여 배지 교환했다. 상기 조작에 의해, 흑색 색소를 갖는 인간 망막 색소 상피세포가 분화 유도되었다(도 1 및 도 2 참조).
실시예 2(인간 망막 색소 상피세포의 배양)
실시예 1에 의해 분화 유도된 흑색 색소를 갖는 인간 망막 색소 상피세포가 존재하는 콜로니를 마이크로피펫을 이용하여 채취하고, 그 다음에 0.05% 트립신 처리에 의해, 세포 분산시켰다.
미리 마트리겔(Matrigel) 코팅해둔 60mm 배양 플레이트에, N2 첨가물을 포함하는 DMEM/F12 배양액에 2~20ng/ml의 bFGF가 첨가된 배지를 추가하여, 상기 배지에 얻어진 분산세포를 파종했다. 이와 같이 하여 파종된 분산세포에는, 인간 망막 색소 상피세포 이외의 불특정 세포도 포함되어 있었다.
세포를 37℃, 5% CO2 인큐베이터 내에서 배양하여 컨플루언트하게 된 후, 0.25% 트립신 처리하고, 배양 플레이트로부터 세포를 회수했다. 회수된 세포를, 미리 마트리겔코팅해둔 10cm 배양 플레이트에 파종한 후, 세포가 컨플루언트하게 될 때까지 37℃, 5% CO2 인큐베이터 내에서 배양했다. 세포가 컨플루언트하게 되었을 때, 배양 플레이트에 존재하는 세포 중 대다수가 인간 망막 색소 상피세포였다.
또한, 세포를, bFGF를 포함하지 않는 N2첨가물 함유 DMEM/F12 배양액으로 1주일간 이상 배양한 후, 이하의 실험에서 사용했다.
실시예 3(비광조사를 위한 대조인 차광 조건 하에서의, 본 발명 광독성 시험 방법의 제1 공정, 제2 공정 및 제3 공정)
실시예 2에서 조제된 인간 망막 색소 상피세포를, 0.25% 트립신 처리하고, 배양 플레이트로부터 세포를 회수했다. 회수된 세포를, 미리 마트리겔 코팅해둔 96웰 배양 플레이트에 1well당 10만 또는 12만 세포씩 파종한 후, 37℃, 5% CO2 인큐베이터 내에서 배양했다.
배양 2시간~4시간 후, 96웰 배양 플레이트로부터 아스피레이터를 이용하여 배지를 제거하고, 그 다음에, Earle's Balanced Salt Solution(EBSS)을 상기 96웰 배양 플레이트에 1well당 150μl의 비율로 첨가하고, 세포를 세정했다.
다음에, 상기 배양 플레이트에, 미리 EBSS를 이용하여 하기의 농도로 조제된 피험물질의 용액 또는 용매 대조액을 1well당 100μl의 비율로 첨가했다.
<피험물질의 용액>
(a) Chlorpromazine(클로르프로마진(CPZ)):농도 0.1, 1, 3, 10, 30, 100(μg/ml)
(b) 페니실린 G(Penicillin G):농도 1, 3, 10, 30, 100, 300, 1000(μg/ml)
(c) 퀴닌(Quinine):농도 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30, 100(μg/ml)
(d) 비티오놀(Bithionol):농도 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3, 10(μg/ml)
(e) 클로르헥시딘(Chlorhexidine):농도 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30, 100(μg/ml)
96웰 배양 플레이트를 알루미늄 박으로 싸서 차광한 후, 알루미늄 박으로 차광한 채로의 배양 플레이트에, 광조사 장치(의사 태양광 조사 장치 SXL-2500V2:세릭사)를 이용하여 40분간 광조사(광조사량 약 5J/cm2)를 행했다. 광조사 후 즉시, 상기 96웰 배양 플레이트를 DMEM/F12 배양액 150μl를 이용하여 2회 세정한 후, 상기 96웰 배양 플레이트에, N2 첨가물 함유 DMEM/F12 배양액을 1well당 100μl의 비율로 첨가하고, 하룻밤 배양했다.
배양 후, 96웰 배양 플레이트로부터 배지를 제거하고, 그 다음에, 미리 조제해둔 DMEM/F12 배양액 및 Cell titer Glo 반응액의 등량 혼합액을 상기 96웰 배양 플레이트에 1well당 100μl의 비율로 첨가했다.
얻어진 96웰 배양 플레이트를 알루미늄 박으로 차광한 상태로 진탕시키면서 실온에서 30분간 방치한 후, 상기 96웰 배양 플레이트에 포함되는 배양물 95μl를, 백색 96웰 시험 플레이트로 옮겼다. 그 다음에, 상기 96웰 시험 플레이트에 포함되는 배양물의 발광량(상기 발광량은, 세포 생존률에 상관관계를 갖는 것임)을, EnVision 멀티 라벨 리더(Perkin Elmer사)를 이용하여 측정했다. 측정된 값으로부터 피험물질의 인간 망막 색소 상피세포에 대한 50% 저해 농도(IC50)를 산출하고, 상기 산출치를, 세포 독성(그에 상관관계를 갖는 지표치)을 나타내는 값으로 했다.
상기 산출 방법에 따르면, 이하와 같은 결과가 되었다.
<피험물질의 세포 독성>
(a) Chlorpromazine(클로르프로마진(CPZ)):IC50=37.6(μg/ml)(도 3 참조)
(b) 페니실린 G(Penicillin G):IC50>1000(μg/ml)(1000μg/ml 이하에서는 세포 독성은 관찰되지 않았다)(도 4 참조)
(c) 퀴닌(Quinine):IC50=147.1(μg/ml)(도 5 참조)
(d) 비티오놀(Bithionol):IC50>10(μg/ml)(10μg/ml 이하에서는 세포 독성은 관찰되지 않았다)(도 6 참조)
(e) 클로르헥시딘(Chlorhexidine):IC50=42.7(μg/ml)(도 7 참조)
실시예 4(본 발명 광독성 시험 방법의 제1 공정, 제2 공정, 및 제3 공정)
실시예 2에서 조제된 인간 망막 색소 상피세포를, 0.25% 트립신 처리하고, 배양 플레이트로부터 세포를 회수했다. 회수된 세포를, 미리 마트리겔 코팅해둔 96웰 배양 플레이트에 1well당 10만 또는 12만 세포씩 파종한 후, 37℃, 5% CO2 인큐베이터 내에서 배양했다.
배양 2시간~4시간 후, 상기 96웰 배양 플레이트로부터 아스피레이터를 이용하여 배지를 제거하고, 그 다음에, Earle's Balanced Salt Solution(EBSS)을 상기 96웰 배양 플레이트에 1well당 150μl의 비율로 첨가하고, 세포를 세정했다.
다음에, 상기 배양 플레이트에, 미리 EBSS를 이용하여 하기 농도로 조제된 피험물질의 용액 또는 용매 대조액을 1well당 100μl의 비율로 첨가했다.
<피험물질의 용액>
(a) Chlorpromazine(클로르프로마진(CPZ)):농도 0.1, 1, 3, 10, 30, 100(μg/ml)
(b) 페니실린 G(Penicillin G):농도 1, 3, 10, 30, 100, 300, 1000(μg/ml)
(c) 퀴닌(Quinine):농도 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30, 100(μg/ml)
(d) 비티오놀(Bithionol): 농도 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3, 10(μg/ml)
(e) 클로르헥시딘(Chlorhexidine): 농도 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30, 100(μg/ml)
실시예 3과는 달리, 96웰 배양 플레이트를 알루미늄 박으로 싸지 않고, 광조사 장치(의사 태양광 조사 장치 SXL-2500V2:세릭사)를 이용하여 40분간 광조사(360nm에 있어서의 광조사 강도를 토대로 계산하면 광조사량 약 5J/cm2가 됨)를 행했다. 광조사 후 즉시, 상기 96웰 배양 플레이트를 DMEM/F12 배양액 150μl를 이용하여 2회 세정한 후, 상기 96웰 배양 플레이트에, N2 첨가물 함유 DMEM/F12 배양액을 1well당 100μl의 비율로 첨가하고, 하룻밤 배양했다.
배양 후, 96웰 배양 플레이트로부터 배지를 제거하고, 그 다음에, 미리 조제해둔 DMEM/F12 배양액 및 Cell titer Glo 반응액의 등량 혼합액을 상기 96웰 배양 플레이트에 1well당 100μl의 비율로 첨가했다.
얻어진 96웰 배양 플레이트를 알루미늄 박으로 차광한 상태로 진탕하면서 실온에서 30분간 방치한 후, 상기 96웰 배양 플레이트에 포함되는 배양물 95μl를, 백색 96웰 시험 플레이트로 옮겼다. 이어서, 상기 96웰 시험 플레이트에 포함되는 배양물의 발광량(상기 발광량은, 세포 생존률에 상관관계를 갖는 것임)을, EnVision 멀티 라벨 리더(Perkin Elmer사)를 이용하여 측정했다. 측정된 값으로부터 피험물질의 인간 망막 색소 상피세포에 대한 50% 저해 농도(IC50)를 산출하고, 상기 산출치를, 세포 독성(그에 상관관계를 갖는 지표치)을 나타내는 값으로 했다.
상기 산출 방법에 따르면, 이하와 같은 결과가 되었다.
<피험물질의 세포 독성>
(a) Chlorpromazine(클로르프로마진(CPZ)):IC50=5.8(μg/ml)(도 8 참조)
(b) 페니실린 G(Penicillin G):IC50>1000(μg/ml)(1000μg/ml 이하에서는 세포 독성은 관찰되지 않았음)(도 9 참조)
(c) 퀴닌(Quinine):IC50=88.9(μg/ml)(도 10 참조)
(d) 비티오놀(Bithionol):IC50>10(μg/ml)(10μg/ml 이하에서는 세포 독성은 관찰되지 않았음)(도 11 참조)
(e) 클로르헥시딘(Chlorhexidine):IC50=43.7(μg/ml)(도 12 참조)
실시예 5(본 발명 광독성 시험 방법:제4 공정)
실시예 3 및 실시예 4에서 산출된 50% 저해 농도(IC50)에 의거하여, 상술한 PIF치(Photo Irritation Facor치)(즉, 피험물질을 접촉시킨 인간 망막 색소 상피세포에 있어서의 세포 독성 IC50치(비광조사를 위한 (차광)대조)를, 피험물질의 접촉 개시 후 24시간 이내에 의사 태양광의 조사하에서 배양된 인간 망막 색소 상피세포에 있어서의 세포 독성 IC50치로 나누어 얻어진 값)을 구했다. 그 결과를 이하에 나타낸다. 상기 값(PIF치)이 5보다 큰 경우에는, 피험물질은 광독성 양성이라고 평가했다.
<피험물질의 PIF치(Photo Irritation Facor치)>
(a) Chlorpromazine(클로르프로마진(CPZ)):6.5
본 발명 광독성 시험 방법에 따른 평가에서는, 광세포 독성 양성 판정이었다. 이는, 과거의 in vivo 시험 결과와 일치하고 있다.
(b) 페니실린 G(Penicillin G):광세포 독성이 나타나지 않음.
본 발명 광독성 시험 방법에 따른 평가에서는, 광세포 독성 음성 판정이었다. 이는, 과거의 in vivo 시험 결과와 일치하고 있다.
(c) 퀴닌(Quinine):1.7
본 발명 광독성 시험 방법에 따른 평가에서는, 광세포 독성 음성 판정이었다. 이는, Ljunggren B. 등 , Phototoxic properties of quinine and quinidine:two quinoline methanol isomer.;Photodermatology 5 133-138(1988)에 기재되는 in vivo시험(mouse tail 시험) 결과와 일치하고 있다.
(d) 비티오놀(Bithionol):광세포 독성이 나타나지 않음.
본 발명 광독성 시험 방법에 따른 평가에서는, 광세포 독성 음성 판정이었다. 이는, 본래 올바른 음성 결과와 일치하고 있다. 광독성 시험 밸리데이션 연구 실행 위원회(위원장 요시무라 이사오), 광독성 시험 대체법 밸리데이션 연구 보고서(2004년 8월 27일)에 의한 4시설에서의 효모-적혈구 시험에서는 위양성 결과이며, 본 발명 광독성 시험 방법이 뛰어난 것임이 확인되었다.
(e) 클로르헥시딘(Chlorhexidine):0.98
본 발명 광독성 시험 방법에 따른 평가에서는, 광세포 독성 음성 판정이었다. 이는, 본래 올바른 음성 결과와 일치하고 있다. 광독성 시험 밸리데이션 연구 실행 위원회(위원장 요시무라 이사오), 광독성 시험 대체법 밸리데이션 연구 보고서(2004년 8월 27일)에 의한 4시설에서의 효모-적혈구 시험에서는 위양성 결과이며, 본 발명 광독성 시험 방법이 뛰어난 것임이 확인되었다.
비교예 1(인간 망막 색소 상피세포 이외의 인간 세포를 이용한 비교 실험)
「Balb/c 3T3 세포」는, 결합 조직 세포(Connective Tissue Cell)이며, 섬유아세포(Fibroblast)이다.
10% 소 혈청, L글루타민을 포함하는 DMEM 배지에서 배양된 「Balb/c 3T3 세포」를 0.25% 트립신 처리하고, 배양 플레이트로부터 세포를 회수했다. 회수된 세포를, 미리 0.1% 젤라틴 용액으로 코팅해둔 96웰 배양 플레이트에 1well당 1만 세포씩 파종한 후, 10% 소 혈청, L글루타민을 포함하는 DMEM 배지에서, 37℃, 5% CO2 인큐베이터 내에서 하룻밤 배양했다.
배양 후, 96웰 배양 플레이트로부터 아스피레이터를 이용하여 배지를 제거하고, 그 다음에, Earle's Balanced Salt Solution(EBSS)을 상기 96웰 배양 플레이트에 1well당 150μl의 비율로 첨가하고, 세포를 세정했다.
다음에, 상기 배양 플레이트에, 미리 EBSS를 이용하여 하기의 농도로 조제된 피험물질의 용액 또는 용매 대조액을 1well당 100μl의 비율로 첨가했다.
<피험물질의 용액>
(a) Chlorpromazine(클로르프로마진(CPZ)):농도 0.1, 1, 3, 10, 30, 100(μg/ml)
(b) 페니실린 G(Penicillin G):농도 1, 3, 10, 30, 100, 300, 1000(μg/ml)
(c) 퀴닌(Quinine):농도 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30, 100(μg/ml)
(d) 비티오놀(Bithionol):농도 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3, 10(μg/ml)
(e) 클로르헥시딘(Chlorhexidine):농도 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30, 100(μg/ml)
96웰 배양 플레이트를 알루미늄 박으로 싸서 차광한 후, 알루미늄 박으로 차광한 채로의 배양 플레이트에, 광조사 장치(의사 태양광 조사 장치 SXL-2500V2:세릭사)를 이용하여 40분간 광조사(360nm에 있어서의 조사 강도를 토대로 계산하면 광조사량 약 5J/cm2가 됨)를 행했다. 광조사 후 즉시, 상기 96웰 배양 플레이트를 DMEM/F12 배양액 150μl를 이용하여 2회 세정한 후, 상기 96웰 배양 플레이트에, N2 첨가물 함유 DMEM/F12 배양액을 1well당 100μl의 비율로 첨가하고, 하룻밤 배양했다.
배양 후, 96웰 배양 플레이트로부터 배지를 제거하고, 그 다음에, 미리 조제해둔 DMEM/F12 배양액 및 Cell titer Glo 반응액의 등량 혼합액을 상기 96웰 배양 플레이트에 1well당 100μl의 비율로 첨가했다.
얻어진 96웰 배양 플레이트를 알루미늄 박으로 차광한 상태로 진탕하면서 실온에서 30분간 방치한 후, 상기 96웰 배양 플레이트에 포함되는 배양물 95μl를, 백색 96웰 시험 플레이트로 옮겼다.
그 다음에, 상기 96웰 시험 플레이트에 포함되는 배양물의 발광량(상기 발광량은, 세포 생존률에 상관관계를 갖는 것임)을, EnVision 멀티 라벨 리더(Perkin Elmer사)를 이용하여 측정했다. 측정된 값으로부터 피험물질의 인간 망막 색소 상피세포에 대한 50% 저해 농도(IC50)를 산출하고, 상기 산출치를, 세포 독성(그에 상관관계를 갖는 지표치)을 나타내는 값으로 했다.
상기의 산출 방법에 따르면, 이하와 같은 결과가 되었다.
<피험물질의 세포 독성>
(a) Chlorpromazine(클로르프로마진(CPZ)):IC50=19.4(μg/ml)(도 13 참조)
(b) 페니실린 G(Penicillin G):IC50>1000(μg/ml)(1000μg/ml 이하에서는 세포 독성은 관찰되지 않았음)(도 14 참조)
(c) 퀴닌(Quinine):IC50=292.2(μg/ml)(도 15 참조)
(d) 비티오놀(Bithionol):IC50=11.4(μg/ml)(3μg/ml 이하에서는 세포 독성은 관찰되지 않았음)(도 16 참조)
(e) 클로르헥시딘(Chlorhexidine): IC50=13.7(μg/ml)(도 17 참조)
비교예 2(비교 광독성 시험 방법:제1 공정, 제2 공정, 제3 공정)
10% 소 혈청, L글루타민을 포함하는 DMEM 배지에서 배양된 「Balb/c 3T3 세포」를 0.25% 트립신 처리에 의해, 배양 플레이트로부터 세포를 회수했다. 회수된 세포를, 미리 0.1% 젤라틴 용액으로 코팅해둔 96웰 배양 플레이트에 1well당 1만 세포씩 파종한 후, 10% 소 혈청, L글루타민을 포함하는 DMEM 배지에서, 37℃, 5% CO2 인큐베이터 내에서 하룻밤 배양했다.
배양 후, 96웰 배양 플레이트로부터 아스피레이터를 이용하여 배지를 제거하고, 그 다음에, Earle's Balanced Salt Solution(EBSS)을 상기 96웰 배양 플레이트에 1well당 150μl의 비율로 첨가하여, 세포를 세정했다.
다음에, 상기 배양 플레이트에, 미리 EBSS를 이용하여 하기의 농도로 조제된 피험물질의 용액 또는 용매 대조액을 1well당 100μl의 비율로 첨가했다.
<피험물질의 용액>
(a) Chlorpromazine(클로르프로마진(CPZ)):농도 0.1, 1, 3, 10, 30, 100(μg/ml)
(b) 페니실린 G(Penicillin G):농도 1, 3, 10, 30, 100, 300, 1000(μg/ml)
(c) 퀴닌(Quinine):농도 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30, 100(μg/ml)
(d) 비티오놀(Bithionol):농도 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3, 10(μg/ml)
(e) 클로르헥시딘(Chlorhexidine):농도 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30, 100(μg/ml)
비교예 1과는 달리, 96웰 배양 플레이트를 알루미늄 박으로 싸지 않고, 광조사 장치(의사 태양광 조사 장치 SXL-2500V2:세릭사)를 이용하여 40분간 광조사(360nm에 있어서의 조사 강도를 토대로 계산하면 광조사량 약 5J/cm2가 됨)를 행했다. 광조사 후 즉시, 상기 96웰 배양 플레이트를 DMEM/F12 배양액 150μl를 이용하여 2회 세정한 후, 상기 96웰 배양 플레이트에, N2 첨가물 함유 DMEM/F12 배양액을 1well당 100μl의 비율로 첨가하고, 하룻밤 배양했다.
배양 후, 96웰 배양 플레이트로부터 배지를 제거하고, 그 다음에, 미리 조제해둔 DMEM/F12 배양액 및 Cell titer Glo 반응액의 등량 혼합액을 상기 96웰 배양 플레이트에 1well당 100μl의 비율로 첨가했다.
얻어진 96웰 배양 플레이트를 알루미늄 박으로 차광한 상태로 진탕하면서 실온에서 30분간 방치한 후, 상기 96웰 배양 플레이트에 포함되는 배양물 95μl를, 백색 96웰 시험 플레이트로 옮겼다. 그 다음에, 상기 96웰 시험 플레이트에 포함되는 배양물의 발광량(상기 발광량은, 세포 생존률에 상관관계를 갖는 것임)을, EnVision 멀티 라벨 리더(Perkin Elmer사)를 이용하여 측정했다. 측정된 값으로부터 피험물질의 인간 망막 색소 상피세포에 대한 50% 저해 농도(IC50)를 산출하고, 상기 산출치를, 세포 독성(그에 상관관계를 갖는 지표치)을 나타내는 값으로 했다.
상기 산출 방법에 따르면, 이하와 같은 결과가 되었다.
<피험물질의 세포 독성>
(a) Chlorpromazine(클로르프로마진(CPZ)):IC50=0.82(μg/ml)(도 18 참조)
(b) 페니실린 G(Penicillin G):IC50>1000(μg/ml)(1000μg/ml 이하에서는 세포 독성은 관찰되지 않았음)(도 19 참조)
(c) 퀴닌(Quinine):IC50=2.3(μg/ml)(μg/ml)(도 20 참조)
(d) 비티오놀(Bithionol):IC50=0.93(μg/ml)(10μg/ml 이하에서는 세포 독성은 관찰되지 않았음)(도 21 참조)
(e) 클로르헥시딘(Chlorhexidine):IC50=10.1(μg/ml)(도 22 참조)
비교예 3(비교 광독성 시험 방법:제4 공정)
비교예 1 및 비교예 2에서 산출된 50% 저해 농도(IC50)에 의거하여, 상술한 PIF치(Photo Irritation Facor치)(즉, 피험물질을 접촉시킨 인간 망막 색소 상피세포에 있어서의 세포 독성 IC50치(비광조사를 위한 (차광)대조)를, 피험물질의 접촉 개시 후 24시간 이내에 의사 태양광의 조사하에서 배양된 인간 망막 색소 상피세포에 있어서의 세포 독성 IC50치로 나누어 얻어진 값)을 구했다. 그 결과를 이하에 나타낸다. 상기 값(PIF치)이 5보다 큰 경우에는, 피험물질은 광독성 양성이라고 평가했다.
<피험물질의 PIF치(Photo Irritation Facor치)>
(a) Chlorpromazine(클로르프로마진(CPZ)):23.7
비교 광독성 시험 방법에 의한 평가에서는, 광세포 독성 양성 판정이었다. 이는, 과거의 in vivo시험 결과와 일치하고 있다.
(b) 페니실린 G(Penicillin G): 광세포 독성이 나타나지 않음.
비교 광독성 시험 방법에 의한 평가에서는, 광세포 독성 음성 판정이었다. 이는, 과거의 in vivo시험 결과와 일치하고 있다.
(c) 퀴닌(Quinine):128.8
비교 광독성 시험 방법에 의한 평가에서는, 광세포 독성 양성 판정이었다. 이는, LjunggrenB. 등, Phototoxic properties of quinine and quinidine:two quinoline methanol isomer.;Photodermatology 5, 133-138(1988)에 기재되는 in vivo시험(mousetail 시험) 결과와 일치하고 있지 않다. 따라서, 본 발명 광독성 시험 방법은 위양성 결과가 되었다.
(d) 비티오놀(Bithionol):12.4
비교 광독성 시험 방법에 의한 평가에서는, 광세포 독성 양성 판정이었다. 이는, 본래 올바른 음성 결과와 일치하고 있지 않다. 따라서, 비교 광독성 시험 방법은 위양성 결과가 되었다. 광독성 시험 밸리데이션 연구 실행 위원회(위원장 요시무라 이사오), 광독성 시험 대체법 밸리데이션 연구 보고서(2004년 8월 27일)에 의한 4시설에서의 효모-적혈구 시험에서는 위양성 결과였다.
(e) 클로르헥시딘(Chlorhexidine):1.4
비교 광독성 시험 방법에 따른 평가에서는, 광세포 독성 음성 판정이었다. 이는, 본래 올바른 음성 결과와 일치하고 있다. 광독성 시험 밸리데이션 연구 실행 위원회(위원장 요시무라 이사오), 광독성 시험 대체법 밸리데이션 연구 보고서(2004년 8월 27일)에 의한 4시설에서의 효모-적혈구 시험에서는 위양성 결과였다.
실시예 6(광조사량의 설정을 위한 예비 시험)
OECD 가이드라인에서 양성 대조로서 이용되고 있는 클로르프로마진(CPZ)을 이용하여, 광조사량과 상술한 PIF치(즉, 피험물질을 접촉시킨 인간 망막 색소 상피세포에 있어서의 세포 독성 IC50치(비광조사를 위한 (차광)대조)를, 피험물질의 접촉 개시 후 24시간 이내에 의사 태양광의 조사하에서 배양된 인간 망막 색소 상피세포에 있어서의 세포 독성 IC50치로 나누어 얻어진 값)과의 관계를 검토했다. 광조사를, 2.09mW/cm2(탑콘사 제조 UVR300에 수광부 UD360를 부착하여 계측)의 광을 15분간(1.87J/cm2), 20분간(2.50J/cm2), 25분간(3.13J/cm2), 30분간(3.75J/cm2), 40분간(5.00J/cm2), 60분간(7.51J/cm2)의 각종 조건으로 설정한 후에, 실시예 3 및 실시예 4에 기재된 방법에 준하여 광독성 시험 방법을 실시했다. 또, 비광조사를 위한 대조인 차광 조건에 대해서는, 차광하는 것 이외에는 상기 광조사로의 광독성 시험 방법과 같은 방법에 의해, 광독성 시험 방법을 실시했다.
그 결과, 측정된 값으로부터 피험물질의 인간 망막 색소 상피세포에 대한 50% 저해 농도(IC50)를 산출하고, 또한 상기 산출치에 의거하여 PIF치를 구한 바, 15분간에서는 PIF=1.70, 20분간에서는 PIF=1.72, 25분간에서는 PIF=3.35, 30분간에서는 PIF=4.57, 40분간에서는 PIF=6.53, 60분간에서는 PIF=10.94였다(도 23 참조).
이상으로부터, 3.75J/cm2(30분간) 이하의 광조사량에서는 PIF>5가 되지 않고, 양성 대조인 클로르프로마진(CPZ)이 양성으로 판정할 수 없다는 점으로부터, 3.75J/cm2보다 높은 광조사량으로 설정하는 것이 바람직하다고, 상기 예비 시험으로부터 확인할 수 있었다.
그 다음에, 상기 예비 시험에 관련하여, 의사 태양광의 조사가, 클로르프로마진(CPZ)을 접촉시킨 인간 망막 색소 상피세포에 있어서, 의사 태양광을 차광한 조건 하에서의 상기 세포의 생존 세포수에 대해, 광조사 조건 하에서의 상기 세포의 생존 세포수가 유의적으로 감소하는 광조사량을 갖는 조사임을 확인했다.
15분간(1.87J/cm2), 20분간(2.50J/cm2), 25분간(3.13J/cm2), 30분간(3.75J/cm2), 40분간(5.00J/cm2), 60분간(7.51J/cm2)에 있어서의 인간 망막 색소 상피세포의 생존 세포수를 조사했다. 광조사 시간이 40분간인 차광 조건 하에 있어서 상기 세포의 생존 세포수의 감소가 나타나지 않았던 클로르프로마진(CPZ)의 접촉 농도 10μg/ml에서의 결과(도 3 참조)를 추출하여 비교한 바, 의사 태양광을 차광한 조건 하에서의 상기 세포의 생존 세포수에 대해, 광조사 조건 하에서의 상기 세포의 생존 세포수가 유의적으로 감소하는 광조사량은 3.13J/cm2(25분간) 이상임을 확인할 수 있었다(도 24 참조).
따라서, 3.13J/cm2(25분간) 이상의 광조사량이면, 의사 태양광의 조사가 적정하게 행해지고, 상기 광조사량을 이용하면, 바람직한 본 발명 광독성 시험 방법이 실시 가능하다고 확인되었다.
실시예 7(형질전환체를 이용하는 본 발명 광독성 시험 방법)
인간 망막 색소 상피세포에서 발현하는 유전자(Mitf, RPE65, ZO1 등)의 프로모터 발현 제어하에 리포터 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된 인간 배아줄기세포(즉, ES세포)의 제작 방법을 구체적으로 기재한다.
(1) 유전자의 프로모터 클로닝, 및, 리포터 플라스미드의 제작
ZO-1의 프로모터 영역을 이하에 나타낸 방법에 의해, 클로닝한다.
인간 배아줄기세포(즉, ES세포)로부터 추출한 게놈 DNA20ng 또는 RPE65 유전자를 포함하는 인간 게놈 BAC DNA를 주형으로 하고, RPE65 유전자의 번역 개시점 및 전사 개시점 상류 5kb의 위치에 설계한 프라이머를 이용하여, Platinum Taq polymerase(인비트로젠사)를 이용한 PCR법에 의해, 원하는 DNA 단편을 증폭한다. PCR 반응은, GeneAmp PCR System9700(어플라이드 바이오시스템사)에서, 95℃ 5분간 반응시킨 후, 95℃ 30초간, 55℃ 30초간, 72℃ 5분간을 30사이클 행하고, 72℃ 7분간의 반응 조건으로 실시한다.
얻어진 PCR 산물을, PCR purification kit(QIAGEN사)를 이용하여 정제하고, PCR 산물의 말단을 제한효소 소화한 후, 아가로스겔 전기영동을 행함으로써, 정제 한다.
정제된 원하는 DNA 단편을, Alkaline phosphatase(다까라바이오사)로 탈인산화 처리를 행한 pGL4.17［Luc2/Neo］vector(프로메가사)와, Ligation kit(다까라바이오사)를 이용하여 연결한다. 얻어진 DNA 단편을, 대장균 DH5α컴피턴트셀(다까라바이오사)로 형질전환한 후, 이것을 37℃에서 LB/암피실린 배지에서 하룻밤 배양한다. 배양 후, 출현한 콜로니를 LB/암피실린 액체 배지에서 배양하여 얻어진 대장균으로부터 플라스미드 DNA를 추출한다. 추출된 플라스미드 DNA에 대해서는, 그 삽입 단편의 시퀀스를 결정하고, 변이 등의 유무를 확인한다.
인간 배아줄기세포(즉, ES세포)로의 트랜스펙션에 이용하기 위해서, 각 플라스미드를 Qiafilter 플라스미드 추출 킷(퀴아젠사)으로 다시 추출한다. 얻어진 플라스미드 DNA 20μg를 제한효소 처리에 의해 직선화한 후, 정제를 행하고, 선상화 DNA를 얻는다.
(2) 재조합 인간 배아줄기세포(즉, ES세포)의 제작 방법
미분화 유지 배양된 인간 배아줄기세포(즉, ES세포)를 해리액 처리함으로써, 배양 플레이트로부터 인간 배아줄기세포(즉, ES세포) 콜로니를 회수한다. 회수된 콜로니를 인간 배아줄기세포(즉, ES세포) 미분화 유지 배지에 현탁하고, 이것을 0.1% 젤라틴 코팅한 10cm 배양 플레이트로 옮긴 후, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 2시간 정치(靜置)함으로써, 피더 세포를 접착시킨다. 부유해 있는 인간 배아줄기세포(즉, ES세포) 콜로니를 포함하는 상청을 15ml 튜브로 옮기고, 이것을 원심 분리에 의해 콜로니를 침강시킨다. 이와 같이 하여 회수된 콜로니를 트립신액으로 효소 처리한 후, 마이크로피펫을 이용하여 피펫팅함으로써, 인간 배아줄기세포(즉, ES세포)를 단일 세포화한다.
그 다음에, 얻어진 세포를 원심 분리하여 침강시킨다. 미리, Opti-MEM 배지와 2μg의 선상화 DNA, 8μL의 FuGENE HD(프로메가사)를 혼합해둔 액으로 상기 세포를 현탁시키고, 상기 세포 현탁액을 5분간 실온에서 반응시킨 후, 1μM~10μM Y27632를 포함하는 미분화 유지 배지에서 현탁시킨다.
얻어진 세포 현탁액을 네오마이신 내성 피더세포 상으로 파종하고, 37℃에서 5% CO2 인큐베이터에서 하룻밤 배양한다. 배지에 100μg/mL의 G418(인비트로젠사)를 첨가함으로써, 약제 선택 배양을 행한다. G418를 첨가하고 10일~15일 후, 현미경하에서 샬레 안에 형성한 인간 배아줄기세포(즉, ES세포) 콜로니를 단리하고, 이것을 96웰 플레이트에 파종한다. 약제 선택 배양을 계속한 후, 또한 10~15일 후에 증식한 세포를 계대배양하여 48웰 플레이트에 파종한다. 약제 선택 배양을 계속한 후, 약제 내성의 안정 형질전환 세포주를 취득한다.
(3) 재조합 인간 배아줄기세포(즉, ES세포)를 이용한 인간 망막 색소 상피세포로의, 비광조사를 위한 대조인 차광 조건 하에서의 피험물질의 폭로 및 독성치의 산출 재조합 인간 배아줄기세포(즉, ES세포)를, 실시예 1에 기재된 방법에 준하여, 인간 망막 색소 상피세포로 분화 유도한다.
그 다음에, 실시예 2에 기재된 방법에 준하여 인간 망막 색소 상피세포를 배양한 후, 이것에, 실시예 3에 기재된 방법에 준하여 피험물질을 폭로한다.
폭로 다음날, 96웰 배양 플레이트로부터 배지를 제거한 후, 미리 조제해둔 DMEM/F12 배양액 및 Steady Glo 반응액의 등량 혼합액을 1well당 100μl 첨가한다.
알루미늄 박으로 차광한 상태로 진탕하면서 실온에서 30분간 방치한 후, 95μl를 백색 96웰 배양 플레이트로 옮기고, 이것을 EnVision 멀티 라벨 리더(Perkin Elmer사)로 발광량을 측정한다. 용매 대조 및 피험물질의 각 공시 농도에 있어서의 발광량의 측정치로부터 상기 피험물질의 인간 망막 색소 상피세포에 대한 50% 저해 농도(IC50)를 산출하고, 이것을 독성치로 한다.
(4) 재조합 인간 배아줄기세포(즉, ES세포)를 이용한 인간 망막 색소 상피세포로의, 광조사 조건으로의 피험물질의 폭로 및 독성치의 산출
재조합 인간 배아줄기세포(즉, ES세포)를, 실시예 1에 기재된 방법에 준하여, 인간 망막 색소 상피세포로 분화 유도한다.
그 다음에, 실시예 2에 기재된 방법에 준하여 인간 망막 색소 상피세포를 배양한 후, 이것에, 실시예 4에 기재된 방법에 준하여 피험물질을 폭로한다.
폭로 다음날, 96웰 배양 플레이트로부터 배지를 제거한 후, 미리 조제해둔 DMEM/F12 배양액 및 Steady Glo 반응액의 등량 혼합액을 1well당 100μl 첨가한다.
알루미늄 박으로 차광한 상태로 진탕하면서 실온에서 30분간 방치한 후, 95μl를 백색 96웰 배양 플레이트로 옮기고, 이것을 EnVision 멀티 라벨 리더(Perkin Elmer사)로 발광량을 측정한다. 용매 대조 및 피험물질의 각 공시 농도에 있어서의 발광량의 측정치로부터 상기 피험물질의 인간 망막 색소 상피세포에 대한 50% 저해 농도(IC50)를 산출하여, 이것을 독성치로 한다.
(5) 재조합 인간 배아줄기세포(즉, ES세포)를 이용한 인간 망막 색소 상피세포를 이용한 피험물질의 광독성 발현 능력의 평가
상기 (4)에서 산출된 50% 저해 농도(IC50)에 의거하여, 상술한 PIF치(Photo Irritation Facor치)(즉, 피험물질을 접촉시킨 인간 망막 색소 상피세포에 있어서의 세포 독성 IC50치(비광조사를 위한 (차광)대조)를, 피험물질의 접촉 개시 후 24시간 이내에 의사 태양광의 조사하에서 배양된 인간 망막 색소 상피세포에 있어서의 세포 독성 IC50치로 나누어 얻어진 값)를 구한다. 그 결과, 상기 값(PIF치)이 6보다 큰 경우에는, 피험물질은 광독성 양성이라고 평가한다.
본 발명 광독성 시험 방법에 의하면, 피험물질의 광독성 발현 능력의 검정을 효과적으로 행할 수 있다. 또한, 본 발명에서는, 상기 시험 방법에 양성 대조로서 이용할 수 있는 광독성 발현 물질을 제공할 수 있다.

Claims (16)

  1. 하기 공정 (1)~(4)를 갖는 광독성 시험 방법:
    (1) 인간 망막 색소 상피세포에 피험물질을 접촉시키는 제1 공정;
    (2) 제1 공정에서 피험물질을 접촉시킨 인간 망막 색소 상피세포를, 제1 공정에 있어서의 접촉 개시 후 24시간 이내에, 340nm에서 380nm까지의 범위의 파장 분포를 포함하는 인공광을 조사하면서 배양하는 제2 공정;
    (3) 제2 공정에서 배양된 인간 망막 색소 상피세포를 회수하고, 회수된 배양 세포에서의 세포 독성 혹은 그에 상관관계를 갖는 지표치를 측정하는 제3 공정;및
    (4) 제3 공정의 측정 결과에 의해서 피험물질의 광독성 발현 능력의 유무 또는 그 정도를 평가하여, 피험물질의 광독성 발현 능력을 검정하는 제4 공정.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 인공광이, 자외광, 가시광 및 적외광으로 이루어지는 의사(擬似) 태양광인, 광독성 시험 방법.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    제2 공정에 있어서의 인공광의 조사가, 파장 360nm에서의 측정치로서 3J/cm2에서 30J/cm2까지의 범위인 광조사량이 되는 조사인, 광독성 시험 방법.
  4. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제4 공정에 있어서, 상기 제3 공정의 측정 결과와, 대조의 인간 망막 색소 상피세포에 있어서의 회수된 배양 세포에서의 세포 독성 혹은 그에 상관관계를 갖는 지표치의 측정 결과를 비교하고, 그 차이에 의거하여 피험물질의 광독성 발현 능력의 유무 또는 그 정도를 평가하는, 광독성 시험 방법.
  5. 청구항 4에 있어서,
    상기 대조가, 인간 망막 색소 상피세포에 기지의 광독성 발현 물질을 접촉시킨 양성 대조를 포함하는 광독성 시험 방법.
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 광독성 발현 물질이 클로르프로마진인, 광독성 시험 방법.
  7. 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서,
    제2 공정에 있어서의 인공광의 조사가, 피험물질을 접촉시킨 인간 망막 색소 상피세포와, 대조의 인간 망막 색소 상피세포 중 적어도 어느 한쪽의 인간 망막 색소 상피세포에 있어서, 인공광을 차광한 조건 하에서의 상기 세포의 생존 세포수에 대해, 광조사 조건 하에서의 상기 세포의 생존 세포수가 유의적으로 감소하는 광조사량을 갖는 조사인, 광독성 시험 방법.
  8. 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제2 공정에 있어서의 인공광의 조사가, 1회의 연속적 조사 또는 2회 이상의 반복 조사로 이루어지는 간헐적 조사인, 광독성 시험 방법.
  9. 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 인간 망막 색소 상피세포가, 줄기세포 유래의 망막 색소 상피세포인, 광독성 시험 방법.
  10. 청구항 9에 있어서,
    상기 줄기세포가, 배아줄기세포, 인공다능성줄기세포 또는 신경줄기세포인, 광독성 시험 방법.
  11. 청구항 1 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 기재된 광독성 시험 방법을 위한, 양성 대조로서의 클로르프로마진의 사용.
  12. 청구항 1 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 기재된 광독성 시험 방법에 이용하기 위한 양성 대조 시약으로서, 클로르프로마진을 함유하는 양성 대조 시약.
  13. 청구항 1 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 기재된 광독성 시험 방법을 위한, 음성 대조로서의 페니실린 G, 퀴닌, 비티오놀 또는 클로르헥시딘의 사용.
  14. 청구항 1 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 기재된 광독성 시험 방법에 이용하기 위한 음성 대조 시약으로서, 페니실린 G, 퀴닌, 비티오놀 또는 클로르헥시딘을 함유하는 양성 대조 시약.
  15. 청구항 1 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 기재된 광독성 시험 방법에 의해서, 피험물질의 광독성 발현 능력을 검정하여, 원하는 광독성 발현 능력을 갖는 물질을 선발하는, 광독성 발현 물질의 탐색 방법.
  16. 청구항 1 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 기재된 광독성 시험 방법에 의해서, 피험물질의 광독성 발현 능력을 검정하여, 원하는 광독성 발현 능력을 갖지 않는 물질을 선발하는, 의사 태양광 피부 자극 비유발 물질의 탐색 방법.
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