JP2004222582A - 感作性評価方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】取扱いが容易であり安定して入手可能な培養細胞を用いて、被検物質の感作性をより簡便に且つ精度良く評価できる方法を提供する。
【解決手段】ヒト又は哺乳類動物の皮膚ランゲルハンス細胞、単核球細胞及び樹状細胞から選ばれる抗原提示細胞を被検物質と共にインキュベートし、当該細胞内に発現されたCD86又はCD54をコードする遺伝子を検出することを特徴とする被検物質の感作性の評価方法。
【選択図】 なし
【解決手段】ヒト又は哺乳類動物の皮膚ランゲルハンス細胞、単核球細胞及び樹状細胞から選ばれる抗原提示細胞を被検物質と共にインキュベートし、当該細胞内に発現されたCD86又はCD54をコードする遺伝子を検出することを特徴とする被検物質の感作性の評価方法。
【選択図】 なし
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明は、インビトロでの被検物質の感作性を評価する方法に関する。
【0002】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
従来、生体においてアレルギー等を誘発する物質(感作性物質)を評価する方法としては、例えば、Magnusson BとKligman AMが報告したモルモットMaximizationテスト(非特許文献1参照)のように、実験動物に被検物質を適用し(感作処理し)、後日当該被検物質を当該実験動物の皮膚等に、感作処理を行っていない動物には炎症反応が生じない濃度で適用したときに生ずる炎症反応を視察する方法が行われていた。しかしながら、実験動物を用いた方法は、評価時間やコストがかかるものであり、また動物の愛護等の見地からも望ましくない。従って、実験動物を用いないインビトロ評価方法の開発が求められていた。
【0003】
一般に、感作とは、生体にある処置を行い何らかの反応性が増大すること(岩波書店刊、岩波生物学辞典 第2版、217頁)、具体的には過去において被曝した化学物質に対して、被曝していないヒト又は動物では炎症反応が生じない濃度で、当該化学物質に接触した場合に炎症反応が生じる現象をいう。そして、化学物質による個体の感作は、感作物質が抗原提示細胞を刺激して成熟させ、当該細胞表面に、プロセシングされた抗原を担持したMHCクラスII蛋白質を発現させ、次いで当該細胞がT細胞に接触して抗原特異的なT細胞の増殖を促すことにより起こると考えられている。
【0004】
化学物質の感作性の評価に際して重要な段階は、生体にとっての外来物質としての化学物質が生体内で感作の方向へ進むよう方向づけられる最初の段階であり、斯かる段階において役割を果たすのが皮膚ランゲルハンス細胞、単核球由来の樹状細胞、脾臓由来の樹状細胞等の抗原提示細胞である。しかしながら、これらの細胞を感作性試験に用いることは、抗原提示能という側面では優れているものの個体差や操作の煩雑さ等の問題がある。
【0005】
一方、これらの抗原提示細胞から誘導された株化細胞は、安定的に用いることができるが、このような細胞株が上記抗原提示細胞と同様に感作性物質により刺激されて成熟し、感作物質の性質を反映して抗原提示を行うか否か明らかでない。
【0006】
斯かる状況の下、感作性物質を作用させたときに単核球細胞表面に存在するCD86分子の増加量をフローサイトメトリーを用いて検出し、感作性を評価する技術が報告されている(特許文献1参照)。しかしながら、この方法では、細胞を被検物質に接触させ培養する時間が24〜48時間と長時間を必要とし、また細胞表面にはすでにCD86分子が存在しており、刺激後そのレベルが増加する程度を観察する当該方法では、S/N比が悪く精度が十分ではない。
【0007】
本発明は、化学物質の感作性をより簡便に且つ精度良く評価できる方法を提供することを目的とする。
【0008】
【特許文献1】
特開2001−221796号公報
【非特許文献1】
J Invest Dermatol,52(3),268,1969
【0009】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、抗原提示細胞に感作性物質又は非感作性物質を作用させたときに生じる現象を詳細に検討したところ、特定の抗原提示細胞に感作性物質を作用させた場合に、当該細胞の内部に感作性物質の量や特性を反映してCD86分子又はCD54分子をコードしたmRNAが新たに発現され、斯かる遺伝子を検出することにより当該物質の感作性を簡易に且つ精度良く評価できることを見出した。
【0010】
すなわち、本発明は、ヒト又は哺乳類動物の皮膚ランゲルハンス細胞、単核球細胞及び樹状細胞から選ばれる抗原提示細胞を被検物質と共にインキュベートし、当該細胞内に発現されたCD86又はCD54をコードする遺伝子を検出することを特徴とする被検物質の感作性の評価方法を提供するものである。
【0011】
また本発明は、ヒト又は哺乳類動物の皮膚ランゲルハンス細胞、単核球細胞及び樹状細胞から選ばれる抗原提示細胞を、感作性物質及び被検物質と共にインキュベートし、当該細胞内に発現されたCD86又はCD54をコードする遺伝子を検出することを特徴とする該感作性物質に対する活性化剤又は抑制剤のスクリーニング方法を提供するものである。
【0012】
【発明の実施の形態】
本発明において用いる抗原提示細胞は、ヒト又は哺乳類動物の皮膚ランゲルハンス細胞、単核球細胞及び樹状細胞から選ばれるものである。斯かる細胞は、感作性物質の特性を反映してその内部にCD86分子又はCD54分子をコードするmRNAを新たに発現する。
【0013】
本発明において、皮膚ランゲルハンス細胞、単核球細胞及び樹状細胞は、いずれもヒト又は哺乳動物由来のものが用いられるが、特にヒト又はマウス由来のものを用いるのが好ましい。中でもヒト又はマウスの骨髄細胞や末梢血単球を、サイトカイン類を用いて樹状細胞に誘導して用いるのが好ましく、樹立された培養細胞を用いることが更に好ましい。樹立された培養細胞としては、ヒト末梢血由来HL−60細胞、ヒト組織球由来U937細胞、ヒト骨髄由来KG−1細胞、ヒト末梢血単球由来THP−1細胞等が挙げられ、更にマウス表皮由来XS−52細胞を挙げることができる。特に、樹立されたヒト培養細胞であって、公的な細胞バンク又は民間企業より容易に入手することができるTHP−1細胞は好適である。
【0014】
斯かる抗原提示細胞を培養するための培地としては、これらの細胞を培養できる常用の任意の培地を使用することができるが、例えばRPMI1640培地、DMEM培地、ダルベッコ改変イーグル培地等が挙げられる。これらの培地にはおよそ10%程度のウシ胎児血清を添加することができるが、適宜適当な増殖因子等のホルモン類を含有させて培養することができる。
尚、抗原提示細胞の初期濃度は、例えば1×102〜1×108細胞/mLとするのが好ましく、特に1×105〜5×106細胞/mLとするのが好ましい。
【0015】
インキュベーションは、培地中の上記細胞に被検物質を加えて、例えばCO2インキュベーター中で、約37℃にて少なくとも30秒間〜24時間、好ましくは約37℃にて30分間〜10時間、更に好ましくは約37℃にて1時間〜4時間行えば良く、特開2001−221796号公報に記載のように、必ずしも24から48時間の培養は必要としない。例えば、被検物質を加えて4時間インキュベーションした後、被検物質を含まない培地で更に6時間培養する方法で好適に実施することができ、これによれば、被検物質との接触は4時間であり、トータルの培養時間は10時間である。被検物質との接触時間を短くできることにより、被検物質の細胞に対する毒性からの影響を最小限に抑えることができ、またトータルの培養時間を短縮できることからその利点は大きい。
【0016】
本発明の評価方法は、抗原提示細胞内に発現されたCD86又はCD54をコードする遺伝子を検出し、その発現量を測定するものである。
CD86分子又はCD54分子は、細胞表面に常時表現されているため、フローサイトメトリー等で表面抗原として検出する場合、ベースが高くなり、被検物質による増加分に対するS/N比が悪くなり検出精度に問題が残るが、CD86分子又はCD54分子のmRNAレベルは低く、刺激を受けてはじめていずれの分子もmRNAの合成が亢進するので、被検物質による増加分はベースに比べ著しく高いシグナルとして検出でき、良好なS/N比を得ることができる。
【0017】
mRNAの検出は、通常遺伝子操作で用いられる方法のいずれの方法も用いることができる。すなわち、抽出した全RNA又はオリゴdTカラム等を用いてmRNAにまで精製したRNAのノーザンブロット、逆転写反応(RT)を実施した後に得られたcDNAを鋳型にしたPCR法で得られた産物の電気泳動、又は定量的PCR法等を用いることができるが、このうち定量的PCR法が好ましい。
【0018】
斯くして検出されたCD86分子又はCD54分子をコードするmRNAの発現量は、後述実施例2に示すように強感作性物質2,4−ジニトロクロルベンゼン(DNCB)との4時間培養によって相対発現量として、CD86で約30倍、CD54で約15倍と、高いシグナルとして示されるが、非感作性物質ジメチルスルホキシド(DMSO)の場合、実施例3に示すように、DMSO 1mg/mL存在下で培養した場合、CD86が1.83倍、CD54が1.21倍といずれも2倍弱でありほとんど変化しない。更に、水に溶けにくい物質、例えば実施例4に記載の如く中程度の感作性を有するヘキシルシンナムアルデヒド(HCA)でも相対発現量5.13と十分なシグナルとして観察できる。このようにCD86分子又はCD54分子をコードするmRNAの発現量は、感作性物質の量や特性を忠実に反映している。従って、本発明の方法によれば、DNCB、DMSO、HCA等の化学物質や、感作性を調べることが必要な化粧品原料、香粧品原料、医薬品原料(化学物質、動植物エキス等)等、様々な被検物質の感作性を精度よく評価することができる。
【0019】
また、上記評価方法において、抗原提示細胞を、既知の感作性物質及び被検物質と共にインキュベートして、当該細胞内に発現されたCD86又はCD54をコードする遺伝子を検出することにより、該感作性物質に対する活性化剤又は抑制剤をスクリーニングすることができる。
【0020】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。
実施例1
THP−1細胞(大塚製薬株式会社より購入)を細胞培養液としてRPMI1640(含10% FBS)培地を用いて終濃度2×106細胞/mLに調製した。更にDNCBを終濃度が6μg/mLとなるように細胞培養液を用いて溶解した。細胞懸濁液とDNCB溶液を1:1に混合し、24穴プレートに1mL/wellずつ分注した。DNCBを培地に加えた細胞は、CO2インキュベーター中で培養し、24時間まで適宜回収した。
培養後の細胞から、RNA抽出試薬(ISOGEN(ニッポンジーン(株)社製))を添付のプロトコールに従って全RNAを取得した。すなわち、クロロホルムを加え、攪拌遠心して水層を回収した。次にイソプロパノールを加え、攪拌遠心して沈殿の全RNAを回収した。このように調製した全RNAを用いて、CD54及びCD86遺伝子の発現量をABI PRISM7700による定量的PCRにより解析した。尚、プライマーはABI社が提供する専用プライマーを用いた。鋳型には、全RNAよりオリゴdT(12〜18mer)をプライマーとして42℃で50分間逆転写反応を行って合成したcDNAを用いた。また、試料中のcDNA濃度の差を補正するため、補正用内部標準としてβ−アクチン(β−actin)遺伝子について同様の定量解析を行った。
【0021】
結果を図1及び図2に示す。両図からわかるように24時間の培養で、相対発現量がCD86で約25倍、CD54で約14倍と、高いシグナルが得られた。更に10時間の培養でシグナルの増加を観察できる。また、図1及び図2は同一の実験を、時期を別にして実施した結果であるが、良好な再現性が存在する。
【0022】
実施例2
実施例1で示した方法によりTHP−1細胞培養液(終濃度:2×106細胞/mL)を調製し、更にDNCBを終濃度が6μg/mLとなるように細胞培養液を用いて溶解した。細胞懸濁液とDNCB溶液を1:1に混合し、24穴プレートに1mL/wellずつ分注した。
DNCBを培地に加えた細胞は、CO2インキュベーター中で4時間培養し、その後被検物質を含有しない培地に交換し更に培養を続け、適宜細胞を回収した。
【0023】
結果を図3に示す。図からわかるようにDNCBと4時間の培養であっても図1及び図2と同等の結果が得られ、被検物質との培養時間を短くすることが可能である。
【0024】
実施例3
実施例1で示した方法によりTHP−1細胞培養液(終濃度:2×106細胞/mL)を調製し、更にDMSOを培養終濃度が2mg/mL又は20mg/mLとなるように細胞培養液を用いて溶解した。細胞懸濁液とDMSO溶液を1:1に混合し、24穴プレートに1mL/wellずつ分注した。DMSOを培地に加えた細胞は、CO2インキュベーター中で4時間培養し、その後、DMSOを含有しない培地に交換し更に20時間培養を続け細胞を回収した。培養後の細胞から、実施例1と同様の方法によりRNAの抽出及び定量を行った。
結果は、無処理細胞の発現を1としたときの相対発現量で示すと、DMSO 1mg/mL存在下で培養した場合、CD86が1.83で、CD54が1.21であった。またDMSO 10mg/mL存在下で培養した場合、CD86が1.95で、CD54が0.86であった。この結果から、非感作性物質であるDMSOを感作物質DNCBより高い濃度で培養してもCD86及びCD54分子をコードするmRNAの新たな発現を観察することはできなかった。
【0025】
実施例4
実施例1で示した方法によりTHP−1細胞培養液(終濃度:2×106細胞/mL)を調製し、更にHCAを一旦DMSOに溶解させ、終濃度が60μg/mL(2%DMSO)となるように細胞培養液を用いて溶解した。細胞懸濁液とHCA溶液を1:1に混合し、24穴プレートに1mL/wellずつ分注した。
HCAを培地に加えた細胞は、CO2インキュベーター中で4時間培養し、その後被検物質を含有しない培地に交換し更に培養を続け、適宜細胞を回収した。培養後の細胞から、実施例1と同様の方法によりRNAの抽出及び定量を行った。
結果は、無処理細胞の発現を1としたときの相対発現量で示すと、CD86が5.13であり、十分なシグナルとして検出できた。このように水に難溶性の物質であってもDMSOに溶解させ用いることができる。
【0026】
比較例
実施例1で示した方法によりTHP−1細胞培養液(終濃度:2×106細胞/mL)を調製し、更にDNCBを終濃度が6μg/mLとなるように細胞培養液を用いて溶解した。細胞懸濁液とDNCB溶液を1:1に混合し、24穴プレートに1mL/wellずつ分注した。DNCBを培地に加えた細胞は、CO2インキュベーター中で24時間培養し回収した。
回収した細胞を、PBSを用いて洗浄し、更にFITCで蛍光標識した抗ヒトCD86抗体又は抗ヒトCD54抗体を用いて4℃で30分間染色した。染色した細胞を更にPBSを用いて洗浄し、0.1%牛血清アルブミンと0.013%ソジウムアザイドを含むPBSに浮遊させた。その細胞浮遊液を用いて生細胞1×104cellsの蛍光強度をフローサイトメトリーにより測定し、溶媒対照と比較した。生細胞の検出はPI染色により行った。
結果を図4に示す。この図から、相対発現量がCD86で約3倍、CD54で約1.7倍に過ぎなかった。
【0027】
【発明の効果】
本発明の評価方法を用いれば、インビトロで様々な物質の感作性をより簡便に且つ精度良く評価でき、また既知感作性物質に対する活性化剤又は抑制剤をスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】図1はTHP−1細胞でのCD86及びCD54mRNA発現の検出を利用した感作物質の評価の結果を示すグラフである。
【図2】図2は、THP−1細胞でのCD86及びCD54mRNA発現の検出を利用した感作物質の評価の結果を示すグラフである。
【図3】図3は、被検物質とTHP−1細胞を4時間培養し、その後更に被検物質を含まない培地で培養し、被検物質の影響を抑制した状態でCD86及びCD54mRNA発現の検出を利用した感作物質の評価の結果を示すグラフである。
【図4】図4はTHP−1細胞でのCD86及びCD54分子の細胞表面発現を、フローサイトメトリーを利用して検出した結果である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、インビトロでの被検物質の感作性を評価する方法に関する。
【0002】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
従来、生体においてアレルギー等を誘発する物質(感作性物質)を評価する方法としては、例えば、Magnusson BとKligman AMが報告したモルモットMaximizationテスト(非特許文献1参照)のように、実験動物に被検物質を適用し(感作処理し)、後日当該被検物質を当該実験動物の皮膚等に、感作処理を行っていない動物には炎症反応が生じない濃度で適用したときに生ずる炎症反応を視察する方法が行われていた。しかしながら、実験動物を用いた方法は、評価時間やコストがかかるものであり、また動物の愛護等の見地からも望ましくない。従って、実験動物を用いないインビトロ評価方法の開発が求められていた。
【0003】
一般に、感作とは、生体にある処置を行い何らかの反応性が増大すること(岩波書店刊、岩波生物学辞典 第2版、217頁)、具体的には過去において被曝した化学物質に対して、被曝していないヒト又は動物では炎症反応が生じない濃度で、当該化学物質に接触した場合に炎症反応が生じる現象をいう。そして、化学物質による個体の感作は、感作物質が抗原提示細胞を刺激して成熟させ、当該細胞表面に、プロセシングされた抗原を担持したMHCクラスII蛋白質を発現させ、次いで当該細胞がT細胞に接触して抗原特異的なT細胞の増殖を促すことにより起こると考えられている。
【0004】
化学物質の感作性の評価に際して重要な段階は、生体にとっての外来物質としての化学物質が生体内で感作の方向へ進むよう方向づけられる最初の段階であり、斯かる段階において役割を果たすのが皮膚ランゲルハンス細胞、単核球由来の樹状細胞、脾臓由来の樹状細胞等の抗原提示細胞である。しかしながら、これらの細胞を感作性試験に用いることは、抗原提示能という側面では優れているものの個体差や操作の煩雑さ等の問題がある。
【0005】
一方、これらの抗原提示細胞から誘導された株化細胞は、安定的に用いることができるが、このような細胞株が上記抗原提示細胞と同様に感作性物質により刺激されて成熟し、感作物質の性質を反映して抗原提示を行うか否か明らかでない。
【0006】
斯かる状況の下、感作性物質を作用させたときに単核球細胞表面に存在するCD86分子の増加量をフローサイトメトリーを用いて検出し、感作性を評価する技術が報告されている(特許文献1参照)。しかしながら、この方法では、細胞を被検物質に接触させ培養する時間が24〜48時間と長時間を必要とし、また細胞表面にはすでにCD86分子が存在しており、刺激後そのレベルが増加する程度を観察する当該方法では、S/N比が悪く精度が十分ではない。
【0007】
本発明は、化学物質の感作性をより簡便に且つ精度良く評価できる方法を提供することを目的とする。
【0008】
【特許文献1】
特開2001−221796号公報
【非特許文献1】
J Invest Dermatol,52(3),268,1969
【0009】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、抗原提示細胞に感作性物質又は非感作性物質を作用させたときに生じる現象を詳細に検討したところ、特定の抗原提示細胞に感作性物質を作用させた場合に、当該細胞の内部に感作性物質の量や特性を反映してCD86分子又はCD54分子をコードしたmRNAが新たに発現され、斯かる遺伝子を検出することにより当該物質の感作性を簡易に且つ精度良く評価できることを見出した。
【0010】
すなわち、本発明は、ヒト又は哺乳類動物の皮膚ランゲルハンス細胞、単核球細胞及び樹状細胞から選ばれる抗原提示細胞を被検物質と共にインキュベートし、当該細胞内に発現されたCD86又はCD54をコードする遺伝子を検出することを特徴とする被検物質の感作性の評価方法を提供するものである。
【0011】
また本発明は、ヒト又は哺乳類動物の皮膚ランゲルハンス細胞、単核球細胞及び樹状細胞から選ばれる抗原提示細胞を、感作性物質及び被検物質と共にインキュベートし、当該細胞内に発現されたCD86又はCD54をコードする遺伝子を検出することを特徴とする該感作性物質に対する活性化剤又は抑制剤のスクリーニング方法を提供するものである。
【0012】
【発明の実施の形態】
本発明において用いる抗原提示細胞は、ヒト又は哺乳類動物の皮膚ランゲルハンス細胞、単核球細胞及び樹状細胞から選ばれるものである。斯かる細胞は、感作性物質の特性を反映してその内部にCD86分子又はCD54分子をコードするmRNAを新たに発現する。
【0013】
本発明において、皮膚ランゲルハンス細胞、単核球細胞及び樹状細胞は、いずれもヒト又は哺乳動物由来のものが用いられるが、特にヒト又はマウス由来のものを用いるのが好ましい。中でもヒト又はマウスの骨髄細胞や末梢血単球を、サイトカイン類を用いて樹状細胞に誘導して用いるのが好ましく、樹立された培養細胞を用いることが更に好ましい。樹立された培養細胞としては、ヒト末梢血由来HL−60細胞、ヒト組織球由来U937細胞、ヒト骨髄由来KG−1細胞、ヒト末梢血単球由来THP−1細胞等が挙げられ、更にマウス表皮由来XS−52細胞を挙げることができる。特に、樹立されたヒト培養細胞であって、公的な細胞バンク又は民間企業より容易に入手することができるTHP−1細胞は好適である。
【0014】
斯かる抗原提示細胞を培養するための培地としては、これらの細胞を培養できる常用の任意の培地を使用することができるが、例えばRPMI1640培地、DMEM培地、ダルベッコ改変イーグル培地等が挙げられる。これらの培地にはおよそ10%程度のウシ胎児血清を添加することができるが、適宜適当な増殖因子等のホルモン類を含有させて培養することができる。
尚、抗原提示細胞の初期濃度は、例えば1×102〜1×108細胞/mLとするのが好ましく、特に1×105〜5×106細胞/mLとするのが好ましい。
【0015】
インキュベーションは、培地中の上記細胞に被検物質を加えて、例えばCO2インキュベーター中で、約37℃にて少なくとも30秒間〜24時間、好ましくは約37℃にて30分間〜10時間、更に好ましくは約37℃にて1時間〜4時間行えば良く、特開2001−221796号公報に記載のように、必ずしも24から48時間の培養は必要としない。例えば、被検物質を加えて4時間インキュベーションした後、被検物質を含まない培地で更に6時間培養する方法で好適に実施することができ、これによれば、被検物質との接触は4時間であり、トータルの培養時間は10時間である。被検物質との接触時間を短くできることにより、被検物質の細胞に対する毒性からの影響を最小限に抑えることができ、またトータルの培養時間を短縮できることからその利点は大きい。
【0016】
本発明の評価方法は、抗原提示細胞内に発現されたCD86又はCD54をコードする遺伝子を検出し、その発現量を測定するものである。
CD86分子又はCD54分子は、細胞表面に常時表現されているため、フローサイトメトリー等で表面抗原として検出する場合、ベースが高くなり、被検物質による増加分に対するS/N比が悪くなり検出精度に問題が残るが、CD86分子又はCD54分子のmRNAレベルは低く、刺激を受けてはじめていずれの分子もmRNAの合成が亢進するので、被検物質による増加分はベースに比べ著しく高いシグナルとして検出でき、良好なS/N比を得ることができる。
【0017】
mRNAの検出は、通常遺伝子操作で用いられる方法のいずれの方法も用いることができる。すなわち、抽出した全RNA又はオリゴdTカラム等を用いてmRNAにまで精製したRNAのノーザンブロット、逆転写反応(RT)を実施した後に得られたcDNAを鋳型にしたPCR法で得られた産物の電気泳動、又は定量的PCR法等を用いることができるが、このうち定量的PCR法が好ましい。
【0018】
斯くして検出されたCD86分子又はCD54分子をコードするmRNAの発現量は、後述実施例2に示すように強感作性物質2,4−ジニトロクロルベンゼン(DNCB)との4時間培養によって相対発現量として、CD86で約30倍、CD54で約15倍と、高いシグナルとして示されるが、非感作性物質ジメチルスルホキシド(DMSO)の場合、実施例3に示すように、DMSO 1mg/mL存在下で培養した場合、CD86が1.83倍、CD54が1.21倍といずれも2倍弱でありほとんど変化しない。更に、水に溶けにくい物質、例えば実施例4に記載の如く中程度の感作性を有するヘキシルシンナムアルデヒド(HCA)でも相対発現量5.13と十分なシグナルとして観察できる。このようにCD86分子又はCD54分子をコードするmRNAの発現量は、感作性物質の量や特性を忠実に反映している。従って、本発明の方法によれば、DNCB、DMSO、HCA等の化学物質や、感作性を調べることが必要な化粧品原料、香粧品原料、医薬品原料(化学物質、動植物エキス等)等、様々な被検物質の感作性を精度よく評価することができる。
【0019】
また、上記評価方法において、抗原提示細胞を、既知の感作性物質及び被検物質と共にインキュベートして、当該細胞内に発現されたCD86又はCD54をコードする遺伝子を検出することにより、該感作性物質に対する活性化剤又は抑制剤をスクリーニングすることができる。
【0020】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。
実施例1
THP−1細胞(大塚製薬株式会社より購入)を細胞培養液としてRPMI1640(含10% FBS)培地を用いて終濃度2×106細胞/mLに調製した。更にDNCBを終濃度が6μg/mLとなるように細胞培養液を用いて溶解した。細胞懸濁液とDNCB溶液を1:1に混合し、24穴プレートに1mL/wellずつ分注した。DNCBを培地に加えた細胞は、CO2インキュベーター中で培養し、24時間まで適宜回収した。
培養後の細胞から、RNA抽出試薬(ISOGEN(ニッポンジーン(株)社製))を添付のプロトコールに従って全RNAを取得した。すなわち、クロロホルムを加え、攪拌遠心して水層を回収した。次にイソプロパノールを加え、攪拌遠心して沈殿の全RNAを回収した。このように調製した全RNAを用いて、CD54及びCD86遺伝子の発現量をABI PRISM7700による定量的PCRにより解析した。尚、プライマーはABI社が提供する専用プライマーを用いた。鋳型には、全RNAよりオリゴdT(12〜18mer)をプライマーとして42℃で50分間逆転写反応を行って合成したcDNAを用いた。また、試料中のcDNA濃度の差を補正するため、補正用内部標準としてβ−アクチン(β−actin)遺伝子について同様の定量解析を行った。
【0021】
結果を図1及び図2に示す。両図からわかるように24時間の培養で、相対発現量がCD86で約25倍、CD54で約14倍と、高いシグナルが得られた。更に10時間の培養でシグナルの増加を観察できる。また、図1及び図2は同一の実験を、時期を別にして実施した結果であるが、良好な再現性が存在する。
【0022】
実施例2
実施例1で示した方法によりTHP−1細胞培養液(終濃度:2×106細胞/mL)を調製し、更にDNCBを終濃度が6μg/mLとなるように細胞培養液を用いて溶解した。細胞懸濁液とDNCB溶液を1:1に混合し、24穴プレートに1mL/wellずつ分注した。
DNCBを培地に加えた細胞は、CO2インキュベーター中で4時間培養し、その後被検物質を含有しない培地に交換し更に培養を続け、適宜細胞を回収した。
【0023】
結果を図3に示す。図からわかるようにDNCBと4時間の培養であっても図1及び図2と同等の結果が得られ、被検物質との培養時間を短くすることが可能である。
【0024】
実施例3
実施例1で示した方法によりTHP−1細胞培養液(終濃度:2×106細胞/mL)を調製し、更にDMSOを培養終濃度が2mg/mL又は20mg/mLとなるように細胞培養液を用いて溶解した。細胞懸濁液とDMSO溶液を1:1に混合し、24穴プレートに1mL/wellずつ分注した。DMSOを培地に加えた細胞は、CO2インキュベーター中で4時間培養し、その後、DMSOを含有しない培地に交換し更に20時間培養を続け細胞を回収した。培養後の細胞から、実施例1と同様の方法によりRNAの抽出及び定量を行った。
結果は、無処理細胞の発現を1としたときの相対発現量で示すと、DMSO 1mg/mL存在下で培養した場合、CD86が1.83で、CD54が1.21であった。またDMSO 10mg/mL存在下で培養した場合、CD86が1.95で、CD54が0.86であった。この結果から、非感作性物質であるDMSOを感作物質DNCBより高い濃度で培養してもCD86及びCD54分子をコードするmRNAの新たな発現を観察することはできなかった。
【0025】
実施例4
実施例1で示した方法によりTHP−1細胞培養液(終濃度:2×106細胞/mL)を調製し、更にHCAを一旦DMSOに溶解させ、終濃度が60μg/mL(2%DMSO)となるように細胞培養液を用いて溶解した。細胞懸濁液とHCA溶液を1:1に混合し、24穴プレートに1mL/wellずつ分注した。
HCAを培地に加えた細胞は、CO2インキュベーター中で4時間培養し、その後被検物質を含有しない培地に交換し更に培養を続け、適宜細胞を回収した。培養後の細胞から、実施例1と同様の方法によりRNAの抽出及び定量を行った。
結果は、無処理細胞の発現を1としたときの相対発現量で示すと、CD86が5.13であり、十分なシグナルとして検出できた。このように水に難溶性の物質であってもDMSOに溶解させ用いることができる。
【0026】
比較例
実施例1で示した方法によりTHP−1細胞培養液(終濃度:2×106細胞/mL)を調製し、更にDNCBを終濃度が6μg/mLとなるように細胞培養液を用いて溶解した。細胞懸濁液とDNCB溶液を1:1に混合し、24穴プレートに1mL/wellずつ分注した。DNCBを培地に加えた細胞は、CO2インキュベーター中で24時間培養し回収した。
回収した細胞を、PBSを用いて洗浄し、更にFITCで蛍光標識した抗ヒトCD86抗体又は抗ヒトCD54抗体を用いて4℃で30分間染色した。染色した細胞を更にPBSを用いて洗浄し、0.1%牛血清アルブミンと0.013%ソジウムアザイドを含むPBSに浮遊させた。その細胞浮遊液を用いて生細胞1×104cellsの蛍光強度をフローサイトメトリーにより測定し、溶媒対照と比較した。生細胞の検出はPI染色により行った。
結果を図4に示す。この図から、相対発現量がCD86で約3倍、CD54で約1.7倍に過ぎなかった。
【0027】
【発明の効果】
本発明の評価方法を用いれば、インビトロで様々な物質の感作性をより簡便に且つ精度良く評価でき、また既知感作性物質に対する活性化剤又は抑制剤をスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】図1はTHP−1細胞でのCD86及びCD54mRNA発現の検出を利用した感作物質の評価の結果を示すグラフである。
【図2】図2は、THP−1細胞でのCD86及びCD54mRNA発現の検出を利用した感作物質の評価の結果を示すグラフである。
【図3】図3は、被検物質とTHP−1細胞を4時間培養し、その後更に被検物質を含まない培地で培養し、被検物質の影響を抑制した状態でCD86及びCD54mRNA発現の検出を利用した感作物質の評価の結果を示すグラフである。
【図4】図4はTHP−1細胞でのCD86及びCD54分子の細胞表面発現を、フローサイトメトリーを利用して検出した結果である。
Claims (4)
- ヒト又は哺乳類動物の皮膚ランゲルハンス細胞、単核球細胞及び樹状細胞から選ばれる抗原提示細胞を被検物質と共にインキュベートし、当該細胞内に発現されたCD86又はCD54をコードする遺伝子を検出することを特徴とする被検物質の感作性の評価方法。
- 抗原提示細胞が株化された培養細胞である請求項1記載の評価方法。
- 抗原提示細胞がTHP−1細胞である請求項1又は2記載の評価方法。
- ヒト又は哺乳類動物の皮膚ランゲルハンス細胞、単核球細胞及び樹状細胞から選ばれる抗原提示細胞を、感作性物質及び被検物質と共にインキュベートし、当該細胞内に発現されたCD86又はCD54をコードする遺伝子を検出することを特徴とする該感作性物質に対する活性化剤又は抑制剤のスクリーニング方法。
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JP2012223200A (ja) * | 2012-08-10 | 2012-11-15 | Nippon Menaade Keshohin Kk | 感作性物質評価方法 |
JP2019045493A (ja) * | 2017-08-30 | 2019-03-22 | 大正製薬株式会社 | 植物エキスの皮膚感作性インビトロ評価法 |
CN114903930A (zh) * | 2022-06-17 | 2022-08-16 | 诺斯贝尔化妆品股份有限公司 | 抗炎舒缓的苦参提取物及苦参碱类化合物的制备及应用 |
-
2003
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